CZ20001213A3 - Použití flunarizinu pro topickou léčbu glaukomu - Google Patents

Description

Vynález se týká použití flunarizinu pro topickou léčbu glaukomu. Specifičtěji se vynález týká použití flunarizinu, známého jako blokátoru kalciového kanálu a používaného jako «

cerebrálního a periferního vazodilatatoru v nové indikaci jako A antiglaukomatika určeného pro topickou oftalmickou léčbu.

Dosavadní stav techniky

Jak je známé, glaukom je patologické oční onemocnění jehož příčiny nejsou dosud dobře známé. Uvedený stav se obvykle projevuje progresivním zvyšováním nitroočního tlaku, což vede k vážnému poškození struktur oka a zejména vede k poškození terče zrakového nervu a k zúžení zorného pole a nakonec k atrofii zrakového nervu. Tato choroba se obvykle spojuje s nedostatečným výtokem komorové vody z oka, ale také s dalšími příčinami jako je například tvorba komorové vody a tlak v episklerálních žílách, které jsou zahrnuty v regulaci nitroočního tlaku.

. Logický základ současně užívané farmakologické terapie je proto snížení nitroočního tlaku. Léčiva obvykle používaná pro tento účel lze rozdělit podle mechanizmu jejich účinku do tříd, a zahrnují beta-blokátory (jako je timolol, betaxolol, levobunolol), sympatomimetika (jako je epinefrin a dipivefrin), parasympatomimetika nebo mictíka (jako je pilokarpin a acetylcholin) a inhibitory karbonatanhydrasy (jako je acetazolamid a dichlorfenamid. Kromě předcházejících léčiv již v terapii zavedených, výzkum směřující k nalezení léčiv majících méně vedlejších účinků a s déle trvajícím účinkem vedl v pozdějších letech k hodnocení možnosti využití další třídy léčiv, tj. blokátorů kalciového kanálu, při léčbě glaukomu. Tyto prostředky, známé také jako (blokátory vstupu kalcia) nebo (antagonisté kalcia) se obvykle používají jako vazodílatátory a při léčbě srdečních chorob. Pro tyto indikace patří mezi nejrozšířenější antagonisty kalcia například nifedipin, diltiazem a verapamil.

Úloha kalcia v dynamice komorové vody a v řízení nitroočního tlaku dosud nebyla úplně objasněna, i když je známé, že tvorba i výtok komorové vody jsou modulovány také kalciem. Pokud jde o tvorbu komorové vody je třeba nejprve uvést, že hydrostatická složka, vyvolaná arteriálním tlakem a tlakem cév zásobujících řasnaté tělísko je kalcium-dependentní jak potvrzuje známý systemický vaskulární účinek antagonistu kalcia. Dále, osmotický tlak vyvolaný iontovou sekrecí na úrovni nepigmentovaného řasinkového epitelu je pravděpodobně modulovaný kalciem podle hypotézy Abelsona a sp. (Abelson M.B., Gilbert C.M., Smith L.M., Sustained reduction of intraocular pressure in humans with calcium channel blocker verapamil, Am.J.Ophthamol. 105; 155 (1988)).

•

Pokud jde o výtok komorové tekutiny, ionty kalcia mají ^r přímou úlohu v modulaci tlaku v episklerálních žílách a podle některých studií kalcium ovlivňuje výtokovou kapacitu udržováním strukturální integrity trabekulární a vnější stěny Schlemmova kanálu.

Oproti předcházejícím závěrům však existuje několik

I • ·· · • ·

experimentálních prací jak na zvířatech tak klinických, které zahrnují jak systemické tak topické podání, a uvádějí odporující si výsledky týkající se aktivity blokátorú kalcíového kanálu v terapii glaukomu. Například Monica a sp. (Monica M.L., Hesse R.J., Messerii F.H., The effect of calcium-channel blocking agent on intraocular pressure,

Am.J.Ophthalmol. 96, 814 (1983)) uvádějí, že orální podání nitrendipinu pacientům se střední hypertenzí ale s normálním

t. nitroočním tlakem mírně snižuje nitrooční tlak, zatímco Beatty a spol. (Beatty J.F., Krupin T., Nichols P.F., Elevation of intraocular pressure by calcium-channel blockers,

Arch.Ophthalmol.102; 1072 (1984) nezjistili při orálním podání verapamilu králíkům žádný účinek , a při topickém podání uvádějí ještě zvýšení nitroočního tlaku. Z ještě novějších prací například Payene a spol. (Payene L.J., Slagle T.M., Cheeks L.T., Effect of calcium-channel blockers on intraocular pressure, Ophthalmic 'Res., 22; 337 (1990)) docílili při systemickém podání verapamilu nebo nifedipinu králíkům snížení nitroočního tlaku, ale nepozorovali žádný významnější účinek při podání stejných prostředků nebo diltiazemu topickým způsobem.

Obecně však, alespoň pokud se jedná o verapamil, lze . uvést, že podání tohoto léčiva člověku obvykle vede ke snížení nitroočního tlaku. Více konzistentní redukce při topickém * podání byla vysvětlena zejména v práci autorů Ettl a sp.' (Ettl

A., Daxer A., Hoffmann U., Calcium channel blockers in the management of low-tension and open-angle glaucoma,

Am.J.Ophthalmol.116; 778, (1993)). Uvedení autoři zjistili v králičím oku oproti systemickému podání hladiny verapamilu 200krát vyšší.

Použití verapamilu v léčbě oční hypertenze je předmětem mezinárodní PCT přihlášky č. WO 92/07563 podané Abelsonem (tj. prvním autorem výše citovaným) a sp. Pozdější publikací stejného autora je mezinárodní přihláška č.WO 96/03986, která se týká léčby zvláštní formy glaukomu, označované jako nízkotlaký glaukom, který je charakterizovaný téměř normálním nitroočním tlakem, přičemž však zahrnuje všechny ostatní symptomy glaukomu. Tato přihláška uvedený návrh terapie genericky rozšiřuje na všechny antagonisty kalcia, a více léčiv této skupiny je zahrnuto v úvodním seznamu. Nicméně jediný příklad účinné složky uvedený v dokumentu a podložený pokusnými údaji je verapamil.

Další blokátor kalciového kanálu v patentové dokumentaci specificky navržený pro léčbu nitrooční hypertenze je diltiazem (Francouský patent č. 2593395, publikovaný v r.1987) a v mezinárodní PCT přihlášce č.WO 93/23082 je uveden seznam více než jednoho sta antagonistu kalcia. Uvedená mezinárodní přihláška se týká léčby glaukomu pomocí kombinace sloučeniny která snižuje nitrooční tlak (tj. obvyklého antiglaukomatického prostředku) s blokátorem kalciového kanálu. Tato přihláška neobsahuje žádný specifický příklad výhodné kombinace ani žádné podrobné experimentální údaje o aktivitě některé kombinace.

Z některých pokusů s verapamilem lze také zjistit, že oftalmologické použití uvedeného prostředku působí nežádoucí zduření rohovky (Green K., Cheeks L., Hulí D.S., Effectš of calcium channel blockers on rabbit corneal endothelial function, Curr.Eye Res. 13; 401-408, (1994) ) . Tento jev se pak

I • · · · · jeví zvláště kritický při léčbě chronického stavu, jako je v tomto případě glaukom.

Ačkoliv u celé třídy antagonistů kalcia se již předpokládá potenciální využití při léčbě glaukomu, pravděpodobně dosud nebyla zaznamenána zvláštní aktivita specifického prostředku náležejícího do uvedené skupiny, tj. flunarizinu, vůči uvedenému typu patologií. Autoři vynálezu nyní zjistili a popsali v předloženém vynálezu, že specifický antagonista kalcia flunarizin po očním topickém podání umožňuje snížit nitrooční tlak překvapivě výrazněji než ostatní antagonisté kalcia dosud navrhovaní a testovaní pro terapii glaukomu.

V rámci studií souvisejících s předloženým vynálezem bylo rovněž zjištěno, že určité známé receptory, označované jako σ receptory, jsou lokalizovány v oblasti oka, zejména v oblasti řasnatého tělesa a duhovky, a že určité specifické ligandy, mající σ-agonístickou aktivitu, výrazně snižují oční .tlak. Protože bylo experimentálně zjištěno, že flunarizin vykazuje σ-agonistickou aktivitu, která je mnohem vyšší než je aktivita jiných antagonistů kalcia, tak tato vlastnost může vysvětlit neočekávaně větší účinnost flunarizinu při snižování nitroočního tlaku za předpokladu, že tato účinnost je založena na mechanizmech účinku, které jsou alespoň částečně odlišné od dalších prostředků blokujících kalciový kanál.

K identifikaci přítomnosti σ-receptorových míst v oku byl použit způsob vazby na receptor. Postup byl proveden s buněčnými membránami získanými z irido-ciliárního komplexu. Uvedený irido-ciliární komplex byl explantován ze samců t

• · · · o jejich usmrcení, e obohacená o albinotických králíků druhu New Zealand p Tkáň byla zhomogenizována v pufru a frakc proteiny buněčné membrány byla izolována odstředěním. Koncentrace celkového obsahu proteinů byla stanovena způsobem podle Lowryho (Lowry J., J.Biol.Chem.,193; 265 (1951))). Alikvotní podíly uvedené frakce homogenizátu obsahující 300 pig celkových proteinů byly inkubovány se skalárními podíly [ H] ( + )pentazocinu (který se používá pouze pro experimentální účely jako σ ligand). Reakce se nechala probíhat 150 minut při 37 '-'C a potom, po filtraci se změřila radioaktivita na filtru pomocí detektoru s kapalným scintilátorem. Byl stanoven celkový počet receptorú a zjevná disociační konstanta (Kd) a bylo zjištěno že [³H] (+)pentazocin se selektivně váže na receptorová místa přítomná v irido-ciliární oblasti králíka.

Na základě současných vědeckých poznatků lze usuzovat, že uvedené receptory jsou typu σ-1.

Dále bylo provedeno stanovení kompetitivní vazby” s použitím konstantního množství [^JH] ( + ) pentazocinu a skalárních podílů (+)-N-allyl-normethazocinu (NANM) (který se používá pouze pro experimentální účely jako σ-ligand) a bylo zjištěno, že sloučenina uvedená jako druhá vytěsňuje radioaktivní lígandy z receptorových míst. Analýzou Hill koeficientu bylo rovněž zjištěno, že NANM interaguje pouze s jednou třídou σ receptorových míst.

V rámci stejného výzkumu bylo zjištěno, že prostředky s σ-agonistickou aktivitou vykazují antihypertenzivní aktivitu v oku. Samcům albinotických králíků druhu New Zealand byl změřen nitrooční tlak a do spojivkové klenby pravého oka jim ·· ·ι ·· · •XJT’ Χ5” ·· 4 • 4 ·

4 4

44

4 4 4

4 4 4 4 • 4 4 4

4 4 4 byl podán přípravek obsahující 1% NANM (50 μΐ) . Po 60, 120, 180 a 240 minutách po nakapání jim byl opět změřen nitrooční tlak a bylo zjištěno, že ve srovnání s přípravkem obsahujícím samotné vehikulum došlo 60 minut po nakapání k významnému snížení (p < 0,01) nitroočního tlaku.

Konečně, jak již bylo uvedeno výše, studie vazby na receptor provedené s flunarizinem (některé z nich jsou uvedené níže) ukázaly, že flunarizin má afinitu vůči σ-l receptorúm, která není stejným způsobem srovnatelná s afinitou kterou vykazují jiné zkoušené prostředky blokující kalciový kanál.

Další nyní zjištěný výhodný aspekt odlišující flunarizin od jiných prostředků blokujících kalciový kanál, dosud navržených pro topickou léčbu glaukomu je_; že flunarizin nemá žádný vedlejší účinek pokud se týká zduření rohovky.

Podstata vynálezu

Předložený vynález se tedy specificky týká použití flunarizinu, případně ve formě farmaceuticky přijatelné sole, pro topickou léčbu glaukomu, tj. použití flunarizinu nebo jeho farmaceuticky přijatelné sole při výrobě oftalmického léčiva určeného k léčbě a/nebo k prevenci glaukomu. Obvykle se topické podávání flunarizinu provádí aplikací přípravku ve formě vodného roztoku nebo suspenze, nebo ve formě gelu, masti nebo krému s farmaceuticky přijatelným vehikulem nebo ve formě erodovatelná oční vložky nebo zásobníkového systému s polymerní membránou určených k aplikaci do spojivkového vaku.

♦ · · · < 0

0

0 ·

0« • · 0 · ·

Koncentrace flunarizinu v oftalmicky přijatelném vehikulu se může pohybovat v rozmezí od 10 μg/ml do 5 mg/ml, tj. od 0,001 do 0,500 % hmotnostních. Optimální koncentrace se nejprve zvolí na základě dávky určené k podávání: v případě aplikace například ve formě očních kapek by jedna kapka měla obsahovat takové dostatečné množství flunarizinu aby právě tato jedna kapka již byla účinná, nebo aby se účinnosti docílilo při dvojím vkápnutí (tj. dvě kapky). Další kritéria pro volbu koncentrace zahrnují oční snášenlivost ( mělo by se vzít také v úvahu, že spojivkový vak, do kterého se oftalmicky přípravek kape, má omezenou kapacitu) a stabilitu účinné složky. Výhodná koncentrace pro přípravky ve formě vodných roztoků (oční kapky) je 0,050 k hmotnostních, a výhodně je uvedený produkc obsažen ve formě odpovídající hydrochloridové soli (optimální koncentrace flunarizin-hydrochloridu : 0,052

Podle zvláště výhodného provedení vynálezu je antiglaukomická účinnost navrhovaného oftalmického přípravku dále zvýšena tím, že flunarizin je přítomen v kombinaci s účinným množstvím beta-blokátoru. Tato třída beta-blokátorů (nebo-li β-adrenergních blokátorů), popsaných výše, představuje v současnosti nejrozšířenější třídu protiglaukomových prostředků. Tyto prostředky se používají v topické léčbě chronického glaukomu s otevřeným úhlem a obecněji při léčbě nitrooční hypertenze. Mechanizmus jejich účinku převážně spočívá v redukci tvorby komorové vody a proto neočekávanou účinnost navržené kombinace flunarizinu (u kterého bylo zjištěno že podporuje zvýšení výtoku komorové vody) lze rozumně vysvětlit vzájemně se doplňujícími uvedenými účinky.

φ φ φ φ • φ φ φ • φφφ φφ φ φφφ · • Φφφ φ

Výhodně je koncentrace beta-blokátoru v kombinaci podle vynálezu od 0,1 do 2,5 % hmotnostních a nejvýhodnějším betablokátorem je timolol nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl.

Vehikulem, které lze použít pro přípravu očních kapek podle vynálezu je prostý fyziologický solný roztok obsahující 0,9 1 hmotnostních chloridu sodného. Tento roztok je isotonický se slzami a je proto v oku dobře snášen. Nicméně je také možné použít hypotonické roztoky nebo suspenze, protože je známé, že mají s očními tkáněmi dobrou snášenlivost.

Ke kompozici podle vynálezu je možné přidat i další přísady tak aby se upravila tonicita roztoků nebo suspenzí, aby se stabilizovala účinná složka (složky) a aby se zvýšila tolerance na přípravek. Konkrétně, použité pufry by měly udržovat pH v rozmezí 4-8. Například výše uvedený solný roztok lze pufrovat jakýmkoliv z pufrú používaných ve farmacii pro oftalmické použití jako je například fosforečnanový pufr nebo Trizma pufr (tj. [tris(hydroxymethyl)aminomethan] tak aby se získala fyziologická hodnota pH v rozmezí 7,0-7,4. Dále, rovněž osmolarita roztoku může být ve fyziologickém rozmezí (295-305 mOsm/1). To umožní lepší oční snášenlivost. Kromě toho uvedený přípravek může výhodně obsahovat antioxidační přísadu, jako jsou například galaty, kyselina askorbová, hyperoxid dismutasy (SOD) , BHT, disiřičitan sodný, tokoferoly, BHA, kyselina nordihydroguajaretová, estery kyseliny askorbové, dimethylthiomočovina a podobně.

Snášenlivost lze dále zvýšit pomocí dalších přísad jako jsou cyklodextriny, polysorbat 80 (nebo Tween 80), dextran (například dextran 70), polyethylenglykol (například PEG 400), • « · · φ φ φφφφ φ * φφφφ «φφφ • · φ φ φ · φ φ · · φ φφ φ φφ φφφ φφφφ φφφφ φφ · φφ φφ poloxamery a další podobné prostředky. Uvedené přípravky mohou obsahovat prostředky ovlivňující viskozitu/zahušťovací prostředky jako je methylcelulosa, polyvinylalkohol, glukosaminové glukany, polyvinylpyrrolidon a podobně, pro zvýšení oční biologické dostupnosti, stability a snášenlivosti účinné složky (složek).

Oční biologickou dostupnost flunarizinu lze dále zvýšit přídavkem prostředků které zvyšují propustnost léčiva rohovkou jako je například dimethylsulfoxid, taurocholáty, membránové fosfolipidy, benzalkoniumchlorid a další povrchově aktivní prostředky pro oftalmické použití (jako laurylsulfosukcinat sodný).

Závěrem je nutné uvést, že přípravky obsahující více dávek kompozice v lahvičce musí obsahovat konzervační prostředek mající antimikrobiální účinnost pro zabránění kontaminace produktu. Tento prostředek lze zvolit z konzervačních prostředků známých pro použiti ve farmacii.

Přípravky určené k podání ve formě suspenzí by měly obsahovat prostředky vhodné pro tento účel jako je karboxymethylcelulosa a podobně. V případě, že přípravek má být ve formě masti, gelu nebo krému pro oftalmické použití, tak flunarizin se smísí s nosiči jako jsou polyethylenglykoly, polyakrylaty, polyethylenoxidy, mastné kyseliny a alkoholy nebo lanolin, parafin a další podobné produkty. Vhodné přísady pro tvorbu emulzí nebo mikroemulzí lze zvolit ze skupiny zahrnující: diethylenglykol-monobutylether, di(ethylenglykol)butylether, ethylester kyseliny kaprylové, ethylester kyseliny olejové, sojový olej, hexadekan, tributyrin, ethylenglykolI » · • » ··· ·

·· · ·· • · · *

9 9 9 9

9 9 99· · « ·« · · 9 9 9 · · · · · · · · monomethylether, l-hexadekan,\ heptan, 1-hepten, Tween 80, PEG, poloxamery, polyoxyethylenethery.

Dávka hlavní účinné složky podle vynálezu určená k topickému podání se může pohybovat od asi 20 pg do asi 200 pg na den a pro každé oko. Předepsaná dávka oftalmíckých přípravků obsahujících flunarizin bude záviset na denní dávce, která je nutná k dosažení terapeutického účinku, a samozřejmě na specifické formě přípravku. Roztoky nebo suspenze pro oftalmické použití je zapotřebí vkapávat 1 až 4 krát denně; masti, gely a krémy je třeba aplikovat 1 až 2 krát; pevné vložky s polymerní matricí, buď degradovatelné nebo nedegradovatelné stačí aplikovat jednou denně.

Vynález se dále týká kompozic umožňujících oftalmické podávání flunarizinu topickým způsobem, a specifických oftalmíckých kompozic vhodných k léčbě a/nebo k prevenci glaukomu, které obsahují jako účinnou sloužku terapeuticky účinné množství flunarizinu. Skupina výhodných kompozic zahrnuje kompozice s následujícím složením (všechna uvedená procenta jsou procenta hmotnostní):

flunarizin-hydrochlorid	0,059 %
(odpovídá 0,05 % flunarizinu)
chlorid sodný	0,10-0,80 %
trizma pufr	0, 02-0,20 %
PEG 400	1,00-6, 00 %
Tween 80	2,00-12,00
disiřičitan sodný	0,01-0,20 %
propylgalat	0,01-0,50 %
EDTA	0,005-0,20

♦ · ···· ···· voda přečištěná

q. s. do 100 % případně s dalšími farmaceuticky přijatelnými přísadami.

Ve zvláště výhodném provedení vynálezu, kompozice pro léčbu a/nebo prevencí glukomu dále obsahují od 0,1 do 2,5 1 hmotnostních beta-blokátoru, kde tímto bíokátorem je výhodně timolol nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl jako je timolol-maleat.

Pouze pro další objasnění vynálezu jsou níže uvedeny některá jeho specifická provedení současně s výsledky experimentálních studií provedených s navrhovaným antiglaukomatikem, které zahrnují i srovnávací testy s jinými prostředky blokujícími kalciový kanál.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Oftalmický roztok obsahující flunarizin

Kompozice podle vynálezu, která se ukázala být zvláště účinná (bylo provedeno experimentální hodnocení účinnosti jak je částečně dále popsané) má následující složení (uvedená procenta jsou procenta hmotnostní):

flunarizin hydrochlorid	0,059 %
(odpovídá 0,050 '% flunarizinu	)
chlorid sodný	0,485 %
trizma pufr	0,100 %
PEG 400	2,500 %

	• 4 • 4 13 ·5·	• 444 4444 4 4444 4444 4 44 4444444 44 4 • 444 4444 • 44 4 44 44
Tween 80	5,000 %
disiřičitan sodný	0, 050 %
propylgalat	0,050 %
EDTA	0,010 %
voda přečištěná	q.s. do	100 %
Výše uvedená kompozice	je vhodná pro	bqlení do

jednodávkových obalu, v případě potřeby vícedávkového balení je nutné přidat konzervační prostředek (jako je například benzalkoniumchlorid) aby byla zachována sterilita produktu po celou dobu používání.

Příklad 2

Oftalmická mikroemulze obsahující flunarizin

Kompozice vhodná pro použití ve formě oftalmické masti se připraví s následujícím složením (hmotnostní procenta):

flunarizin hydrochlorid 0,059 % (odpovídá 0,050 % flunarizinu)

trizma pufr	(na pH 7,20)	0,100 %
PEG 400		10, 000 %
Sojový olej		2,00 %
Tween 80		20, 000 %
disiřičitan	sodný	0, 050 %
sorbitol		2,057 %
propylgalat		0,050 %

voda přečištěná q.s. do 100 %

Jako prostředku pro úpravu tonicity lze použít místo uvedeného množství sorbitolu 455 mg chloridu ·· · ·· ·· • · · · · · • · · · · · · ······· «· · • · · · · · · • · · · · · ♦

0,455 % hmotn.)

Příklad 3

Oftalmická emulze obsahující flunarizin

Oftalmický produkt podobný produktu popsanému v přecházejícím příkladu ale mající větší velikost kapiček dispergované žáze se připraví vypuštěním sojového oleje ze složení a přípravou podle následujícího složení (hmotnostní procenta):

flunarizin hydrochlorid 0,059 % (odpovídá 0,050 % flunarizinu) trizma pufr (na pH 7,20) 0,100 %

PEG 400

Tween 80 disiřičiuan sodný sorbitol propylgalat voda přečištěná

Alternativně může přípravek obsahovat jako prostředek pro úpravu tonicity místo sorbitolu 433 mg chloridu sodného na 100 ml (tj. 0,433 i hmotn.)

2,000 %

7,000 %

0, 050 %

2,014 %

0,050 % g.s. do 100 %

Příklad 4

Oftalmický roztok obsahující kombinaci flunarizinu a timololu

Zvláště výhodná kompozice podle vynálezu se připraví tak, že ke kompozici podle příkladu 1 se přidá dostatečné množství

I

99

9 9 9

9 9 9

9 9 9

Φ Φ Φ Φ «Φ ΦΦ • φ

9 9

ΦΦΦΦΦ timolol-maleatu pro dosažení obsahu 0,5 % hmotnostních timololu v celkové směsi (což odpovídá asi 0,68 % hmotnostním timolol-maleatu). Koncentrace ostatních složek se použijí stejné jako v příkladu 1.

Podobně lze t^ké modifikovat přídavkem vhodného množs-tví timolol-maleatu přípravky připravené podle příkladu 2 a 3. Rovněž v těchto případech je vhodné aby se docílilo koncentrace timololu v celkové směsi 0,5 % hmotnostních.

Experimentální výsledky

V experimentální práci, jejíž výsledky jsou uvedeny níže, se isotonický roztok pufrovaný podle příkladu las upravenou viskozitou podle příkladu 1, ale obsahující různé koncentrace flunarizinu (pohybující se v rozmezí 0,01 % až 0,1 % hmotnostních) obecně označuje jako MEG 01. Tato práce se také zabývá kombinacemi flunarizinu a beta-blokátorů jak jsou znázorněné pro timolol v příkladu 4. Kombinace flunarizinu a timololu je označována jako MEG 02. Některé z uvedených experimentálních výsledků jsou rovněž znázorněny na připojených nákresech. \ ·

Přehled obrázků na výkresech

Na obrázku 1 je znázorněno snížení nitroočního tlaku v procentech po aplikaci do. očí králíků s -hypertenzí kapáním, ve srovnání s odpovídajícím snížením tlaku po vkapání placeba nebo po vkapání jiných antagonistů kalcia;

na obrázku 2 je znázorněno snížení nitroočního tlaku • 4 · · • 4 4 ·4 ·· • 4 4 4 · 4 4 4 4 4 » 4444 4444

4 44 44444·· 44 4

4 4 4 4444

4444 44 4 44 44 v procentech po vkapání flunarizinu o různých koncentracích do očí králíků s oční hypertenzí; a na obrázku 3 je znázorněno snížení nitroočního tlaku v procentech po vkapání flunarizinu v kombinaci s různými beta-blokátory do očí králíků s oční hypertenzí.

Farmakodynamické studie

a) Studie na králících s normálním nitroočním tlakem

Účinky prostředku podle vynálezu na nitrooční tlak králíků majících nitrooční tlak v normálních mezích byly hodnoceny ve srovnání s placebem a s různými dalšími prostředky blokujícími kalciový kanál. V pokusu byly použity a

samice pigmentovaných králíku druhu Vienna Blue (dodané firmou Charles River Italiana, Calco (CO)). Věk zvířat v době zahájení pokusu byl 9 týdnů a jejich hmotnost byla .2/0-2,5 kg.

Výběr typu s pigmentovanou duhovkou byl proveden na základě skutečnosti, že tento typ představuje spolehlivý model pro hodnocení možných modifikací nitroočního tlaku vyvolaných zkoušenými produkty. Zvolený druh je geneticky definovaný, což omezuje variabilitu biologických vlastností mezi jednotlivými zvířaty na minimum.

Zvířata byla chována v místnostech s konstantními a řízenými hodnotami teploty a vlhkosti, s umělým osvětlením po dobu 12 hodin denně a s kontinuální výměnou vzduchu. Potravou byla standardní strava s konstantním a známým složením, přičemž jak potrava tak voda byly dostupné ad libitum po celou • 9919 19 9 99 99 < · · · · « 1 9 • · 19 19 119 9 • 9 99 1911111 11 1

111 9 19 9

199 1 19 9 91 91 dobu pokusu. Králíci byli ustájeni 21 dní před pokusem tak aby byli dostatečně aklimatizováni a mohl být zhodnocen jejich zdravotní stav. Zvířata byla náhodně rozmístěna do pokusných skupin, kde každá skupina zahrnovala 4 zvířata.

Jednotlivé skupiny zvířat obdržely aplikací do pravé spojivkové klenby kapáním po 50 μΐ:

a) očních kapek MEG 01 obsahujících 0,050 % hmotnostních flunarizinu (0,052 % hmotn. flunarizin-hydrochloridu);

b) roztok placeba (tj. vehikula pro MEG 01);

c) očních kapek obsahujících 0,056 % hmotnostních verapamilu ve vehikulu pro MEG 01;

d) očních kapek obsahujících 0,051 % hmotnostních diltiazemu ve vehikulu pro MEG 01;

e) očních kapek obsahujících 0,043 % hmotnostních nifedípinu ve vehikulu pro MEG 0,01.

Hmotnostní koncentrace uvedených různých prostředků zařazených do pokusu jsou voleny tak, aby odpovídaly stejné molární koncentraci.

Tlak v ošetřeném oku byl stanovován očním tonometrem (TonopenXL®, Mentor), a to 15 minut před vkapáním očních kapek (čas 0) a potom 30, 60, 90, 120, 180 a 240 minut po vkapání. 5 minut před každým měřením bylo do oka aplikováno kapáním 25 μΐ lokálního anestetika, obchodně dostupného oftalmického roztoku

I *ΦΦ· n · »· φφ ♦ Φ φ φφφ φ φ « φ

Φ Φ Φ ΦΦΦ φ Φ φ 4>

Φ Φ ΦΦΦ ΦΦΦΦ Φ φ Φ φ Φ ΦΦ « » Φ ΦΦΦΦ *·'* · φ* φ φφ ·· obsahujícího 0,4 % oxybuprokain-hydrochloridu (Novesin®, Sandoz). Při měření byli králíci umístěni do vhodně navržené klece, která jim bránila v náhlém pohybu při měření.

Tlak byl měřen každému zvířeti a v každé odečítací době uvedené výše třikrát, a z těchto hodnot byl vypočten průměr, přičemž mezi jednotlivými měřeními byl interval 1 minuty. Hodnoty nitroočního tlaku v různých časových intervalech byly srovnány s hodnotami získaným, i před ošetřením pomocí Studentova t testu. Srovnání mezi různými skupinami bylo provedeno zpracováním údajů analýzou čtverců směrodatných odchylek (ANOVA) a tam kde to bylo možné, Studentovým t testem pro srovnání dvou různých experimentálních skupin. Hodnoty p < 0,05 byly pokládány za statisticky významné.

V následující tabulce jsou uvedené hodnoty nitroočního tlaku u každého zvířete, a rovněž průměrné hodnoty zjištěné pro každou skupinu (± standardní odchylka).

I ·· · • * • ·· ·

Tabulka 1

Nitrooční tlak králíků s normálním tlakem po aplikaci zkoušených prostředků

		Nitrooční	tlak (mm Hg) v	čase (minuty)
králík	č		oko	0	30	60	90	120	180	240
	oční kapky obsahující	0,050 %	flunarizinu	(MEG 01)
01			PO	17	15	14	15	15	15	17
02			PO	16	14	13	14	14	15	16
03			PO	14	13	12	12	14	14	16
04			PO	16	12	12	14	14	14	16
průměr	+	SD 15,7+1,2	13,5+1,3	12,7+0,95	13,7+1,2	14,2+0,5	14,5+0,5	16,2+0,5
Placebo
05			PO	15	16	16	15	15	16	16
06			PO	16	15	14	16	16	17	17
07			PO	17	15	16	16	16	17	17
08			PO	15	15	16	16	16	15	17
průměr	±	SD 15,7+0,9	15,2+0,5	15,5+1,0	15,7+0,5	15,7+0,5	16,2+0,9	16,7+0,5
			oční	kapky	obsahující 0,	056 % verapamilu
09			PO	17	16	15	15	16	16	17
10			PO	15	14	14	13	13	16	15
11			PO	16	17	15	15	16	17	17
12			PO	16	15	15	15	16	16	17
průměr	±	SD 16,8+0,8	15+1,3	14,7+0,5	14+1,0	15,7+0,5	16,2+0,5	16,5+1,0

• · ·

Tabulka 1 (pokračování)

	Nitrooční	tlak (mu	1 Hg)	v čase (minuty)
Králík	č		oko	0	30	60	90	120 180	240
			oční	kapky	obsahující 0,	051 i	diltiazemu
13			PO	15	14	14	14	15	15	16
14			PO	16	15	14	14	15	16	16
15			PO	18	17	17	16	16	17	17
16			PO	18	15	13	15	16	17	17
Průměr	+	SD 16,7±1,5	15,2+1,2	14,7+0,9	14,7+0,9 15 ±0, 5 16,2+0,95	16+0,6
			oční	kapky	obsahující 0,	043 %	nifedipinu
17			PO	16	15	14	16	16	17	17
18			PO	15	15	13	15	16	15	17
19			PO	14	13	13	15	16	15	14
20			PO	18	16	15	16	16	17	18
Průměr	+	SD 15,7+1,7	14,7+1,2	13,7+0,9	15,5+0	6 16,0+1,5 16,	5+1, 7	16,+0

Jak vyplývá z výše uvedené tabulky, oční kapky MEG 01 (obsahující 0,050 % flunarizinu) poskytují za jednu hodinu po podání významné snížení nitroočního tlaku, zatímco produkt obsahující odpovídající vehikulum bez flunarizinu nevyvolává žádnou významnější změnu nitroočního tlaku. V uvedeném druhém případě není tlak měřený po podání očních kapek statisticky odlišný od hodnot získaných před vkapáním (čas 0: 15 minut před podáním).

Dále, ani přípravky obsahující verapamil a ani diltiazem, obsahující stejné vehikulum jako MEG 01 nevyvolávají žádné snížení nitroočního tlaku vzhledem k placebu. Určitá menší

I

·· · · ·· · · snížení byla zaznamenána při podání nifedipinu, ale tento účinek se zdá být zanedbatelný ve srovnání s odezvou získanou s použitím MEG 01 obsahujícím 0,050 % hmotnostních flunarizinu.

Další série zkoušek byla provedená s králíky s normálními hladinami nitroočního tlaku s cílem srovnat účinnost flunarizinu s účinností kombinace flunarizinu s beta-blokátory a účinností beta-blokátorů samotných.

Do hodnocení byly zahrnuty známé beta-blokátory: timolol (neselektivní beta-blokátor, aktivní jak na Pí tak na β_: adrenergních receptorech), betaxolol (kardioselektivní betablokátor, aktivní pouze na βι adrenergních receptorech) a karteolol (neselektivní blokátor, ale mající vlastní sympatomimetickou aktivitu). Zkoušky byly provedeny stejným způsobem jaký je popsán výše, a zvířata byla ošetřena v jednotlivých skupinách následujícími kompozicemi:

f) očními kapkami MEG 02 obsahujícími 0,50 % hmotnostních flunarizinu (0,052 % flunarizin-hydrochloridu) v kombinaci s 0,5 % hmotnostními timololu (0,68 % timolol-maleatu);

g) očními kapkami obsahujícími 0,050 % hmotnostních flunarizinu a 0,5 hmotnostní ch betaxololu've vehikulu pro

MEG 02;

h) očními kapkami obsahujícími 0,050 % hmotnostních flunarizinu a 2,0 % hmotnostních karteololu ve vehikulu pro

MEG 02.

* · · • · · · • · · · · · · • · · · · · · · · · • « · · ······· · · · • 9 · · * · · · · « · · · ·· · ·· ··

Výsledky této série stanovení, získané a zpracované stejným způsobem jako výsledky uvedené v tabulce 1, jsou uvedeny v následující tabulce. Z důvodů snazšího porovnání jsou výsledky získané s flunarizinem samotným a s placebem, tj. se skupinou zvířat a) a b) předcházejícího pokusu opět v následující tabulce uvedeny.

Tabulka 2

Nitrooční tlak králíků s normálním tlakem po aplikaci zkoušených prostředků

		Nitrooční tlak (mm Hg) v	čase (	minuty)
Králík	č.	Oko	0	30 60	90	120	180	240
	oční kapky obsahující 0,050 %	flunarizinu	(MEG 01)
01		PO	17	15 14	15	15	15	17
02		PO	16	14 13	14	14	15	16
03		PO	14	13 12	12	14	14	16
0 4		PO '	16	12 12	14	14	14	16
průměr	± SD 15,7+1,2	13,5+1,3 12,7+0,95	13,7±1,2	14,2±0,5	14,5±0,5	16,2±0,5
placebo
05		PO	15	16 16	15	15	16	16
06		PO	16	15 14	16	16.	17	17
07		PO	17	15 16	16	16	17	17
08		PO	15	15 16	16	16	15	17
průměr	± SD 15,7±0,9	15,2±0,5 15,5±l,0	15,7+0,5	15,7+0,5	16,2±0,9	16,7+0,5
		oční kapky obsahující	0,5 % timololu
101		PO	16	15 14	14 .	15	16	16 .
102		PO	16	14 13	14	15	16	17
103		PO	16	15 13	15	16	17	16
104		PO	15	15 14	15	16	15	15
průměr	± SD 15,7±0,5	14,7±0,5 13,5±0,	6 ít-jSiO, 6	15,5+0,6	16,0±0,8	16,0±0,8

I

0 0 * · ·0 00 0 · 0 0 0 0 · f 000 0 00 0 !» 000··«· 00 0 0 0 0 0 0 0 0 ·· 0 «0 0 0

Tabulka 2 (pokračování)

		Nitrooční	tlak (mm	Hg) v	čase (minuty)
Králík č	•	oko	0	30	60	90	120	180	240
Oční kapky obsahující	0,050 % flunarizinu a 0,5	% timololu
					(MEG 02)
105		PO	16	14	13	14	15	16	16
106		PO	17	13	14	14	14	15	17
107		PO	16	14	12	14	15	16	16
108		PO	16	14	12	13	14	15	15
Průměr ±	SD 16,2+0,5 13,7+0,5	12,7+1,0	13,7+0,5	14,5+0,6	15,5+0,6	16,2+0,5
Oční kapky obsahující 0	,050 % flunarizinu	a 0,5	% betaxololu
109		PO	15	14	14	14	15	16	15
110		PO	16	14	14	14	16	16	17
111		PO	17	15	15	16	16	16	17
112		PO	17	16	15	• 15	16	16	16
Průměr ±	SD 16,2+1,0 14,7+1,0	14,5+0,6	14,7 + 1,.0	15,7+0,5	16,0+0	16,2+1,0
Oční kapky obsahující 0	,050 k flunarizinu	a 2, 0	% karteololu
113		PO	17	16	14	15	16	17 .	16
114		PO	16	15	15	15	16	16	16
115		PO	16	13	14	15	16	16	17
116		PO	15	12	14	15	15	16	16
Průměr ±	SD 16,0+0,8 14,0+1,8 14,2+0,5	15,0+0,0	15,7+0,5	16,2+0,5	16,2+0,5

Z experimentálních výsledků uvedených v předcházející tabulce na jedné straně vyplývá, že za podmínek zkoušky má flunarizin samotný lepší účinnost při snižování nitroočního tlaku než samotný timolol. Na druhé straně z těchto údajů vyplývá, že účinnost flunarizinu se dále zvýší přídavkem timololu do přípravku a účinnost této kombinace je lepší než

4*4

4» 4 44 ··

4 4 *44 4 4 4 4 • · 4444 4 * 4 * « 4 44 4444444 *4 4

4» 444 4444 • 44 · 4· * 44 44 účinnost flunarizinu samotného.

b) Studie na králících s oční hypertenzí

V následujících testech byli použiti králíci stejného typu jako v předcházející studií. Králíci byli předem ošetřování stejným způsobem a za stejných podmínek ustájení.

Experimentální zvýšení nitroočního tlaku bylo indukováno podáním α-chymotrypsinu. Injekční podání tohoto enzymu do zadní komory králíků vyvolalo po jednom měsíci po podání oční hypertenzi. Tento pokusný model se značně využívá, a často se používá k hodnocení účinnosti různých antiglaukomatik.

Na konci karantény byly králíci anestezováni intramuskulárním podáním ketamin-hydrochloridu a xylazinhydrochloridu (RBI). Po vkapání 25 μιΐ Novesinu® očních kapek, obsahujících anestetikum oxybuprokain bylo.pravé oko jemně povytaženo ven; potom byl do zadní komory pravého oka pomocí sterilní jehly 30G injekčně aplikován sterilní roztok achymotrypsinu (SIGMA, Milan; 150 jednotek ve 100 μΐ fyziologického sterilního roztoku). Po podání enzymu bylo oko důkladně vyplachováno sterilním fyziologickým roztokem aby se odstranily jakékoli stopy α-chymotrypsinu, který by mohl poškodit oční tkáně. Pak byly vkapány 2 kapky obchodně dostupného oftalmického antiobiotika ve formě roztoku (Colbiocin® , DIFI S.p.A, obsahuje chloramfenikol, rolitetracyklin, kolistin-methansulfonat). Toto ošetření se pak provádělo třikrát denně (v 8.00 a 12.00 dopoledne a v 6.00 odpoledne) po dobu jednoho týdne po podání a-chymotrypsinu.

• · · · • ·

Králíci byli zařazeni do pokusu jeden měsíc po indukci oční hypertenze pomocí enzymu.

Také v tomto případě byli králíci rozděleni do skupin po 4 zvířatech a ošetřeni 50 μΐ zkoušeného produktu, který byl vkapán do pravé spojivkové klenby. V prvním pokusu byli použity stejné prostředky jako v prvním předcházejícím pokusu (MEG 01 oční kapky obsahující 0,050 % flunarizinu, placebo, oční kapky obsahující 0,056 % verapamilu, a dále kapky obsahující 0,051 % diltiazemu a 0,043 % nifedipinu).

Nitrooční tlak v ošetřeném oku byl měřen stejným postupem jako v předcházejících pokusech, 15 minut před vkapáním očních kapek a 30, 60, 90, 120, 180 a 240 minut po vkapání. Získané hodnoty byly statisticky zpracované podle kritérií popsaných výše.

V následující tabulce jsou v každé testované skupině uvedeny odezvové hodnoty nitroočního tlaku a jejich průměrné hodnoty (± standardní odchylky). Průměrné hodnoty snížení nitroočního tlaku vyjádřené v procentech jsou také graficky znázorněné na obrázku 1.

φφφ ·

φφφ φφφφ

ΦΦΦΦ φφφφ φ «ΦΦΦΦΦ· φφ φ • φ φ φφφφ « « £ φ φ φ 9

Tabulka 3

Nitrooční tlak králíků s oční hypertenzí po aplikaci zkoušených prostředků

		Nitrooční tlak (mm Hg)	v čase	(minuty)
Králík	č.	oko	0	30 60	90	120	180	240
	oční kapky obsahující 0,050 %	flunarizinu	(MEG 01)
21		PO	57	47 45	50	51	56 '	5 6
22		PO	46	38 37	38	39	44	45
23		PO	36	30 28	32	34	37	37
24		PO	52	43 41	43	45	51	51
Průměr	+ SD 41, : + 9,03 3	9,5±7,32 37,^5+7,2 5	40,7±7	6 3 4 5, 2+3,36	4 7,0±8, 2 8 4 -,	ů5±3, .1-
Placebo
25		PO	57	56 57	58	56	57	57
26		PO	47	48 46	4 7	48	48	47
27		PO	41	42 43	42	' 41	42	43
28		PO	52	50 51	51	50	53	52
Průměr	± SD 4 9, 25+6, 84 4 9, 0+5,77 4 9, 25±6,13 49,5±6,	75 48,75+6,18	50,0+6,43 49	, 3 5+6, 03
		Oční	kapky	obsahující 0,	056	1 verapamilu
29		PO	56	55 56	55	55	57	56
30		PO	47	48 49	46	47	46	48
31		PO	42	40 43	41	41	42	43
32		PO	51	52 52	50	51	50	51
průměr	± SD	4 9, 0+5, 94	48,7±6,5 59,0+5,47	4 8,0±5	, 94 4 8,5+5,97	4 8,7 5+6, 3 9 4	9,5±5,44

t ♦ » 1 • · · ·

Tabulka 3 (pokračování)

	Nitrooční	tlak	mm Hg)	v čase	(minuty)
Králík	č		Oko	0	30	60	90	120	180	240
			Oční	kapky	obsahuj ící	0,051 %	diltiazemu
33			PO	55	55	53	54	56	56	55
34			PO	52	53	51	52	52	51	52
35			PO	47	48	46	46	47	46	47
36			PO	42	42	40	41	43	43	41
Průměr	+	S D 4 9,0+5 , ' 1	49,5±5,80 4“,5+5,	80 48,2+5,9	0 4 9, 5±5,6	8 49,0+5,51	,’±6, iď
			oční	kapky	obsahuj ící	0,043 %	nifedipinu
37			PO	54	55	53	52	53	54	54
38			PO	50	52	50	50	49	48	49
39			PO	47	45	45	46	46	45	47 .
40			PO	41	39	39	38	40	41	42
Průměr	±	SD 48,	0+5,45 4'	7 5±7,1H	4 6,75+6,	3 4 6,5+6,1	) 4 7, Q±5, 4 7	48,00+4,96 4	. . + 4 , 9 6

Z tabulky 3 je zřejmé, že podání samotného- vehikula nemá za následek nějakou významnější změnu nitroočního tlaku, zatímco MEG 01 (obsahující 0,050 % flunarizinu) vyvolá snížení nitroočního tlaku významně vyšší než lze získat podáním, dalších testovaných antagonistů kalcia. Jak je z tabulky zřejmé, hodnoty nitroočního tlaku po ošetření oftalmickými roztoky obsahujícími ekvivalentní množství verapamilu, diltiazemu nebo nifedipinu ve stejném vehikulu jako MEG 01 nejsou nijak výrazněji snížené.

Ve druhé sérii pokusů byly s použitím stejných postupů hodnoceny oftalmické roztoky podle vynálezu obsahující různé koncentrace flunarizinu, tj. 0,1 % a 0,01 %.

Cílem bylo • · · 9 * Φ · Φ * Φ Φ · · • Φ · Φ 9 <« « Φ Φ ·Φ srovnat takto získané odezvy s odezvou zjištěnou s MEG 01 očními kapkami obsahujícími 0,05 % hmotnostních flunarizinu. Výsledky jsou uvedené v následující tabulce a jsou také znázorněné graficky na obrázku 2 (ve formě průměrného zjištěného procentuálního snížení nitroočního tlaku).

Tabulka 4

Nitrooční tlak králíků s oční hypertenzí ošetřených flunarizinem

	Nitrooční	tlak (mm Hg)	v čase	(minuty)
Králík	č	•	oko	0	30	60	90	120	180	240
			oční	kapky	obsahující 0,	010 %	flunarizinu
41			PC	60	58	55	53	58	60	61
42			PC	65	61	59	60	62	64	65
43			PO	53	51	49	48	52	52	52
44			PO	52	50	48	49	51	50	52
Průměr	+	SD 5	7,5+6,13	5 5,0+5,35	52,7 +5,18	52,5+5,44 55,7+5,18 56,5+6,60	57,5+6,55
			oční	kapky	obsahující 0,	050 %	flunarizinu
21			PO	57	47	45	50	51	56	56
22			PC	46	38	37	38	39	44	45
23			PO	36	30	28	32	34	37	37
24			PC	52	43	41	43	45	51	51
Průměr	±	SD 4 7,7 + 9,03	39,5+7, 3	2 37,7 ±7,	2ř 40,7±7	, 63 4 2,2±7	,36 4 7, 0±8,28	47,2+8,I*
			oční	kapky	obsahující 0,	100 %	flunarizinu
45			PO	58	48	45	49	51	56	57
46			PC	48	40	38	41	43	47	49
47			PC	42	36	34	36	38	41	43
48			PC	51	45	40	46	48	50	50
Průměr	±	SD	4 9, 7 + 6, 6	4 2,2±5,	31 8 9,2+4,5'	4 3,0±5,71 4 5,0±5,	7 1 4 8, 5±6,2 4	4 9, ±6, 0 :

I ·«· · ·» 4 «4 44 * · 4 4 t 4 « · · · ♦ 4 4 4·· 4 4 4 4 ♦· *4444 44 *4444

Zj 44 *444444 «44· «· 4 44 44

Z předcházející tabulky lze zjistit, že nejvyšší procento redukce nitroočního tlaku bylo dosaženo pomocí přípravku MEG 01 obsahujícího 0,05 % flunarizinu, přičemž přípravek o nejvyšší koncentraci (0,1 %) prokázal aktivitu srovnatelnou s aktivitou přípravku o koncentraci 0,05 %. Tato skutečnost je zřetelnější z grafu na obrázku 2.

V další sérii pokusů byly hodnoceny účinnosti kombinací flunarizinu s beta-blokátorem na hypertenzních kw<3hďch Pokusné podmínky byly přesně stejné jako ve výše uvedeném případě. Tři skupiny zvířat byly ošetřeny kompozicemi uvedenými pod body f), g) a h) uvedenými v první sekci a výsledky jsou shrnuty v následující tabulce. Pro lepší srovnání jsou také v tomto případě znovu uvedeny výsledky pro flunarizin samotný a pro placebo.

Tabulka 5

Nitrooční tlak králíků s oční hypertenzí po aplikaci zkoušených prostředků

	Nitrooční	tlak (	mm Hg)	v čase	(minuty)
Králík č.	oko	0	30		60	90	120	180	240
oční	kapky obsahující	0,	050	% flunarizinu	(MEG 01)
21		PO	57	47		45	50	51	56	56
22		PO	46	38		37	38	39	44	45
23		PO	36	30		28	32	34	37	37
24		PO	52	43		41	43	45	51	51
průměr ± SD	47,7±9,0	3 9, 5±7,3	37,	/ ±7,	2 40,7±7,	6 42,2±7,H	4 7,0±8,3 4 7	25±8,2

·· ♦ » ·

9

Tabulka 5 (pokračování)

		Nitrooční	tlak (mm	Hg) v čase (minuty)
Králík č.	oko	0	30	60	90 120	180	240
placebo
25		PO	57	56	57	58 56	57	57
26		PO	47	48	46	47 48	48	47
27		PO	41	42	43	42 41	42	'43
28		PO	52	50	51	51 50	53	52
průměr ±	SD	4 9,2+6,8 4 9,0+5	8 4 7,2+6,1 4 9	,5±6,7 48,7+6,2	50,0+6,5	4 9,7+6,1
		oční kapky	obsahující 0	,5 % timololu
117		PO	53	43	42	42 4 6	52	53
118		PO	54	45	42	42 45	48	51
119		po	46	39	39	38 39	42	45
120		PO	43	40	36	37 40	42	44
průměr ±	SD	4 9,('+5,3 41	, 7+2	' 3?,7±2,9 39, 7+2,6 42,5±3,5	6, 0±4,9	4 8,2+4,1
oční kapky obsahující	0,050 % flunarizinu a 0,5	i timololu
					(MEG 02)
121		PO	52	35	33	33 36	38	41
122		PO	58	39	36	37 41	46	48
123		PO	47	31	29	32 35	37	38
124		PO	45	32	26	30 36	36	35
průměr ±	SD	50,5+5,8 34,2±3,6 31,0+4,4 33	,0+2,9 37,0+2,7	3 9,2 + 4 , 6'	4 0,5±5,6

I • · » » «« • « • * « φ • · * · «φ ·· s « * » » 1 t > ♦ · ·

Tabulka 5 (pokračování)

	Nitroc	3Ční t	lak (mm	Hg) v	čase (	minuty)
Králík	č.	oko	0	30	60	90	120	180	240
oční	kapky obsahující	0, 05	% flunarizinu	a 0, 5	% betaxololu
125		PO	49	39	36	38	42	42	43
126		PO	45	35	37	37	39	40	41
127		PO	56	44	42	46	47	49	49
128		PO	55	45	41	43	47	46	51
průměr	± SD	51,2+5,2	4Q,7±4,6	.3 9,0±2 , 9 41	0±4,2	4 3,7 + 3,9	4 4,2±4,0	4 6, 0+4,9
oční	kapky obsahující	0, 050	% flunarizinu	a 2, 0	% karteololu
129		PO	57	53	40	42	50	54	56
130		PO	52	46	44	45	48	49	49
131		PO	47	37	39	40	44	43	43
132		PO	46	36	37	39	40	41	43
průměr	± SD	5 0, 5+5,1	43, 0±8,0	4 0,0+2,9 41	5±2 , 6	4 5, 5+4,4	4 6,7 + 5, 9	47,7+6,2

Z údajů uvedených v tabulce 5 a ještě zřetelněji s diagramu na obrázku 3 vyplývá pozoruhodná účinnost kombinaceflunarizinu s timololem a obecně dobrá účinnost kombinací flunarizinu s beta-blokátory. Také v tomto případě samotný flunarizin vykazuje ve srovnáním se samotným timololem lepší účinnost.

Hodnocení toxicity

a) Hodnocení zduření rohovky

Hodnocení tlouštky rohovky bylo provedeno echograficky

I • ·· * • 9

111

1119 1

9 ft » ♦ f ftt «

1 9 1 1

9 111 · · · · pomocí přístroje UBM Systém 840 (Humprey Instruments, San Leandro, CA, USA). Toto zařízení obsahuje 50 MHz sondu a umožňuje zobrazení na obrazovce s rozlišením asi 504 při velikosti zobrazovaného pole 5x5 mm. Programové vybavení umožňuje měnit hloubku zaměření ultrazvukového svazku a zobrazovat záznam při různých zesíleních.

Zvířata zařazená do pokusu byla stejného druhu jako zvířata popsaná v předcházejících pokusech a byla ošetřována stejným způsobem. Pokus byl zahájen anestezí zvířat (ketaminhydrochloridem a xylazin-hydrochloridem) provedenou tak, že zvířatům byly aplikovány oční pohárky naplněné kontaktními prostředky (ultrazvukový gel). Králíkům pak bylo do pravého oka aplikována jedním vkápnutím dávka (50 μΐ) stejných prostředků jaké byly použity ve farmakodynamických studiích: a) oční kapky MEG 01 obsahující 0,050 % flunarizinu; c) oční kapky obsahující 0,056 % hmotnostních verapamilu; d) oční kapky obsahující 0,051 % hmotnostních diltiazemu; e) oční kapky obsahující 0,043 % nifedípinu. Do levého oka králíků bylo vkapáním aplikováno stejné množství placeba (vehikula pro MEG 01 bez jakékoliv účinné složky).

V následující zjištěné u různých před vkápnutím a a vkápnutí.

tabulce jsou uvedeny tlouštky rohovky skupin zahrnujících vždy 4 králíky a to ve stejných časových intervalech po

Tabulka 6

Tloušťka rohovky králíků po topickém ošetření antagonisty kalcia • · * · * · » · * • · « · » • · ·· ·« » 9 9 1

I 9 9 <

I · « « ► · · 1 ·« 99

Tabulka 6

Tloušťka rohovky (mm) v čase (min)

Králík č.

oko

Zákl.hodnota hodina 2 hodiny 3 hodiny

PO: MEG 01 obsahující 0,050 % flunarizinu - LO: placebo

49	PO	0, 394	0, 394	0, 394	0,3 94
49	LO	0, 394	0, 394	0, 394	0, 394
50	PO	0, 347	0, 347	0, 347	0, 347
50	LO	0, 347	0, 347	0, 347	0, 347
51	PO	0,386	0, 386	0, 386	0, 386
51	LO	0, 386	0, 386	0, 386	0,386
52	PO	0,363	0, 363	0, 363	0, 363
52	LO	0,363	0, 363	0, 363	0, 363
PO:	oční	kapky obsahující	0,056 %	verapamilu -	LO: placebo
53	PO	0, 356	0,376	0, 385	0, 383
53	LO	0, 356	0, 358	0, 360	0, 367
54	PO	0, 384	0, 398	0, 406	0, 402
54	LO	0, 384	0, 382	0, 388	0,380
55	PO	0, 372	0,387	0, 400	0, 402
55	LO	0,372	0,374	0, 368	0, 372
56	PO	0, 392	0,401	0, 494	0, 410
56	LO	0,392	0,390	0, 396	0, 388

• »· 9 » · • 4

4444 • 4 ·· • 4 4 « β «4« • · * · 4

4 4 4

4 4 4

Tabulka 6 (pokračování)

	Tloušťka	rohovky	(mm) v čase	(min)
Králík	č.	okc	Zákl.hodnota 1	hodina 2	hodiny 3 hodiny
PO:	oční	kapky o	bsahuj ící	0,051 %	diltiazemu	- LO: placebo
57	PO	0,	377	0, 380	0, 382	0, 384
57	LO	o,	377	0,380	0, 380	0, 377
58	PO	o,	389	0, 392	0,394	0, 396
58	LO	0, 389	0,389	0, 325	0, 387
59	PO	0,	396	0, 400	0, 400	0,400
59	LO	o,	396	0, 396	0, 394	0, 398
60	PO	0,	358	0, 362	0, 364	0,364
60	LO	0,	358	0,358	0, 360	0,360
PO:	oční	kapky obsahující	0,043 %	nifedipinu	- LO: placebo
61	PO	0, 375	0, 380	0, 380	0, 380
61	LO	o,	375	0, 375	0, 376	0, 375
62	PO	0,	372	0, 380	0, 378	0,37 8
62	LO	0,372	0, 374	0,372	0, 372
63	PO	o,	396	0, 398	0,400	0, 400
63	LO	0, 396	0,396	0, 396	0, 396
64	PO	o,	384	0,388	0, 389	0,390
64	LO	o,	384	0, 382	0, 984	0, 382

Jak je z předcházejících údajů zřejmé, nebyly při použití produktu podle vynálezu zjištěné po celou dobu pokusu žádné změny v tloušťce rohovky. Oproti tomu použití oftalmického roztoku obsahujícího 0,056 % verapamilu vyvolalo zduření rohovky odpovídající tloušťce sí 15-20 μιη/1ιοάίη3. Žádný výraznější účanek nebyl zjištěn při aplikaci očních kapek obsahujících iiltiazem (jen mírné zduření) nebo nifedipin.

I ··» · ·« ·· 99 • · » « • · · · • * · · · * · · « #· ··

b) Akutní snášenlivost

K hodnocení snášenlivosti blokátorú kalcíového kanálu podle vynálezu při topické aplikaci do oka byli králíci (stejného druhu jako v předcházejících pokusech) po počáteční adaptaci ošetřeni následujícím způsobem. První den bylo vkapáno do pravé spojivkové klenby 12 dávek MEG 01 (0,05 '%) , každá objemu 0,05 ml, s intervalem mezi jednotlivými dávkami 30 minut. Druhé oko bylo ošetřeno placebem a použito jako kontrolní pokus.

Stav očních tkání byl pozorován modifikovaným testem podle Draize (Spampinato S., Marino A., Bucolo C., Canossa M., Bachetti T., Mangiafico S., Effect of sodium naproxen eye drops on rabbit ocular inflammation induced by sodium arachidonate, J.Ocular Pharm., 7(2); 125-133, (1991)).

Odečítání bylo prováděno každou hodinu od prvního podání až do 7 hodiny, a potom 24, 48 a 72 hodinu po posledním podání formou přidělení skóre hodnotícího různé aspekty týkající se paípebrální a bulbární spojivky, duhovky a rohovky.

Na spojivce žádného oka, jak očí ošetřených MEG 01 očními kapkami (0,05 % hmotn. Flunarizinu) tak očí ošetřených placebem, nebylo zjištěno po celou dobu testu žádné výraznější zrudnutí. V žádném z hodnocených očí nebyl zjištěn žádný otok. Kromě toho na žádné rohovce ošetřených očí nebyla zjištěna žádná změna a množství výtoku bylo na obvyklé úrovni. Nebylo zjištěné ani žádné poškození tkání rohovky; u dvou očí se projevila mírná deepitelizace.

Ze získaných výsledků vyplývá, že oftalmický roztok MEG ♦ ·*« ·« • · φ • · · · * ···· * · ·· • · • · • · • · obsahující 0,05 % flunarizinu je po opakovaném podání kapáním do spojivkové klenby oka králíka velmi dobře snášen.

Studie vazby

Studie vazby na receptor byla provedena s buněčnými membránami získanými z irido-ciliárního komplexu explantovaného samcům albinotických králíků druhu New Zealand po jejich usmrcení (Charles River Italiana, of Calco (CO)). Tkáň byla zhomogenizovaná v pufru a byla oddělena frakce P₂ obohacené o buněčné proteiny. Uvedená frakce byla získána odstředěním způsobem popsaným v literatuře (Mach R.H., Smith C.R., Childers S.R., Ibogaine possesses a selective affinity for sigma 2 receptors, Life Sci., 57(4); 57-62). La celková koncentrace proteinu byla stanovena způsobem podle Lowryho.

Alikvotní podíly P₂ frakce homogenizátu každá obsahující 300 μg celkových proteinů byly inkubovány v polypropylenových zkumavkách obsahující skalární podíly antagonistů kalcia zařazených do pokusu (tj. flunarizinu, verapamilu, nifedipinu a nimodipinu) a známé množství ^JH(+)-N-allyl-normethazocinu (SKF) (prostředku pokusně používaného jako σ ligand). Nespecifická vazba byla stanovena v přítomnosti haloperidolu.

Všechna stanovení byla provedena duplicitně. Reakční směs se udržovala při 37 °C po dobu 150 minut, a potom se filtrovala přes filtry Whatmann GF/B. Radioaktivita na filtrech se měřila spektrometrií s tekutými scintilátory. Byla zjištěna hodnota IC₅o a zjištěné hodnoty jsou uvedené v následující tabulce.

I v

*··«· »·>· ·· ·· ·· » · 4 · · · · • 4 4 4 4 4 9··· • 4 9 9 9 9999 99 99 9

9 9 9 9 9 9 9 9

999 9 4« « 44 4«

Tabulka 7

Účinky různých antagonistů kalcia na inhibici vazby s ^JH(+)-N-allyl-normethazocinem

Sloučenina	IC50	(nM)
flunarizin	23,	9
verapamil	>10	000
nifedipin	>10	000
nimodipin	>10	000
diltiazem	>10	000

Předcházející údaje potvrzují nálezy průzkumu který vedl k předloženému vynálezu a který byl diskutován v úvodu.

Zejména z těchto údajů vyplývá, že flunarizin má afinitu k σ-1 receptorům, na rozdíl od známějších á prostudovanějších prostředků blokujících kalciový kanál jako je verapamil, nifedipin a diltiazem. Z těchto nálezů vyplývá, že σ-1 receptory jsou zahrnuty v mechanizmu odpovědném za snížení nitroočního tlaku vyvolaném flunarizinem a že tento zvláštní jev je příčinou překvapivě vysoké účinnosti flunarizinu jako antiglaukomatika pro topické podání.

Předložený vynález byl popsán pomocí některých jeho specifických provedení, ale tento popis je zapotřebí chápat tak, že pracovníci v oboru jsou schopni tato provedení modifikovat a měnit, aniž by se odchýlili od rozsahu vynálezu definovaného v připojených patentových nárocích.

Claims (11)

1) Použití flunarizinu nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli pro výrobu oftalmického léčiva pro snížení oční hypertenze.

2) Použití podle nároku 1, při kterém je uvedené oftalmické léčivo pro topické podání ve formě vodného roztoku nebo suspenze, nebo ve formě gelu, krému nebo masti, ve farmaceuticky přijatelném vehikulu, nebo ve formě erodovatelné oční vložky, nebo zásobníkového systému s polymerní membránou, určené k aplikaci do spojivkového vaku.

3) Použití podle nároku 1 nebo 2, při kterém je koncentrace flunarizinu v uvedeném oftalmickém léčivu od 0,001 do 0,500 % hmotnostních.

4) Použití podle nároku 3, při kterém je koncentrace flunarizinu 0,050 % hmotnostních.

5) Použití podle kteréhokoli z předcházejících nároků, při kterém je flunarizin v uvedeném oftalmickém léčivu obsažen ve formě své hydrochloridové soli.

6) Použití podle kteréhokoli z nároků 1 až 5, při kterém uvedené oftalmické léčivo dále obsahuje beta-blokátor.

7) Použití podle nároku 6, při kterém je koncentrace betablokátoru v uvedeném oftalmickém léčivu od 0,1 do 2,5 % hmotnostních.

φ ·· * •o · ·· ·* « · · · · · · ο · · · · · · · • 9 9999 9 9 9 9 ·

Φ · Φ · Φ 9 9

99 9 99 99

8) Použití podle nároku 6 nebo 7, při kterém je uvedeným betablokátorem timolol nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl.

9) Použití podle kteréhokoli z nároků 1 až 8, při kterém je uvedené oftalmické léčivo pro topické podání ve formě vodného roztoku a dále obsahuje jeden nebo více prostředků pro úpravu tonicity, jeden nebo více pufrů a jeden nebo více antioxidačních prostředků.

10) Použití podle nároku 9, při kterém uvedené oftalmické léčivo dále obsahuje jeden nebo více prostředků pro zlepšení oční snášenlivosti, které jsou zvoleny ze skupiny zahrnující cyklodextriny, polysorbat 80 (nebo Tween 80), dextran, polyethylenglykol a poloxamery.

11) Použití podle nároku 10 nebo 11, při kterém uvedené oftalmické léčivo pro topické použití dále obsahuje jeden nebo více konzervačních prostředků nebo antimikrobiálních prostředků.

• ·

4494 <r

A

4 ··*·

44 «

4 4

444 4

4 4

4 4

4 4 4

4 4 4 <4 4

44 44 • 4 4 4

9 4 4 4 * 4 4 4

4 9 4 4

44 44

1/2 —♦—PLACEBO

-ů- VERAPAM1L 0,056%

-&- NIFEDIPIN 0,043%

FLUNARIZIN 0,05% (MEG 01) DILTIAZEM 0,051%

MEG 01 - 0,01% -»-MEG 01 - 0,05% —ó—MEG 01 - 0,10%

Obr .2 i

• ···· «φ · • · • φ • · • ΦΦ φ φφ » • φ φ • φφφ φ φ φ φφφφ • · ·

99 9 φφ • φ φ • · ·

9 9

9 9

2/2

-4-PLACEBO

-Λ— TIMOLOL 0,056% —4— FLUNARIZIN +CARTEOLOL

-β-FLUNARIZIN 0,05% (MEG 01)

FLUNARIZIN + TIMOLOL (MEG 02) —M—FLUNARIZIN . + BETAXOLOL