ES2232829T3 - Genes biosinteticos de la acabosa procedentes de actinoplanes sp., procedimiento para su aislamiento. asi como su uso. - Google Patents

Genes biosinteticos de la acabosa procedentes de actinoplanes sp., procedimiento para su aislamiento. asi como su uso.

Info

Publication number
ES2232829T3
ES2232829T3 ES96102398T ES96102398T ES2232829T3 ES 2232829 T3 ES2232829 T3 ES 2232829T3 ES 96102398 T ES96102398 T ES 96102398T ES 96102398 T ES96102398 T ES 96102398T ES 2232829 T3 ES2232829 T3 ES 2232829T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
acarbose
dna
baselineskip
genes
actinoplanes
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
ES96102398T
Other languages
English (en)
Inventor
Anneliese Dr. Crueger
Wolfgang Prof. Dr. Piepersberg
Jurgen Dr. Distler
Ansgar Stratmann
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bayer AG
Original Assignee
Bayer Healthcare AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bayer Healthcare AG filed Critical Bayer Healthcare AG
Application granted granted Critical
Publication of ES2232829T3 publication Critical patent/ES2232829T3/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/365—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Actinoplanes (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/14—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a carbohydrase (EC 3.2.x), e.g. by alpha-amylase, e.g. by cellulase, hemicellulase

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Plural Heterocyclic Compounds (AREA)
  • Quinoline Compounds (AREA)

Abstract

LA INVENCION TRATA DE GENES DE BIOSINTESIS DE LA ACARBOSA PROCEDENTES DE ACTINOMICETOS, PREFERENTEMENTE DE ACTINOPLANES SP. SE 50/110 Y SUS MUTANTES, UN PROCEDIMIENTO PARA AISLAR GENES DE BIOSINTESIS DE LA ACARBOSA DE ACTINOMICETES MEDIANTE UNA SONDA GENICA, QUE SE HA DERIVADO DE ZONAS MUY CONSERVADAS DE PROTEINAS DE ENZIMAS CONOCIDAS DE LA DTDP-GLUCOSA-DEHIDRATASA, PARA EL HALLAZGO DE GENES ACBA (CODIFICAN LA DTDP-GLUCOSA-SINTETASA), ACBB (CODIFICAN LA DTDP-GLUCOSA-DEHIDRATASA), Y ACBC (CODIFICAN UNA CICLASA EN PARTE IDENTICA A AROB, ACIDO-3-DEHIDROQUINICOSINTETASAS BACTERIANAS ), O UNO O VARIOS GENES DE BIOSINTESIS DE LA ACARBOSA DE ACTINOPLANES SP., ASI COMO LA UTILIZACION DE LOS GENES DE BIOSINTESIS DE LA ACARBOSA.

Description

Genes biosintéticos de la acarbosa procedentes de actinoplanes sp., procedimiento para su aislamiento, así como su uso.
La invención se refiere a genes biosintéticos de la acarbosa procedentes de actinomicetos, predominantemente de actinoplanes sp. SE 50/110 y sus mutantes, de un procedimiento para el aislamiento de los genes biosintéticos de la acarbosa a partir de actinomicetos mediante una sonda génica derivada de regiones proteicas altamente conservadas de enzimas conocidas con actividad dTDP-glucosa deshidratasa para encontrar los genes acbA (que codifica la dTDP-glucosa sintasa), acbB (que codifica la dTDP-glucosa deshidratasa) y acbC (que codifica una ciclasa que es parcialmente idéntica a AroB, las ácido 3-deshidroquínico sintasas bacterianas) o uno o varios genes biosintéticos de la acarbosa procedentes de actinoplanes sp., así como del uso de los genes biosintéticos de la acarbosa.
El objeto de las solicitudes de patente más antiguas (por ejemplo, documentos DE 2064092, DE 2209834) es el reconocimiento de que una serie de actinomicetos, sobre todo las actinoplanáceas, forman inhibidores oligosacarídicos de glucósido hidrolasas, preferentemente de enzimas disociadoras de carbohidratos del tracto digestivo. Como inhibidor más potente de este grupo se ha descrito el compuesto O-4,6-didesoxi-4-[[1S-(1S, 4R, 5S, 6S)-4,5,6-trihidroxi-3-(hidroximetil)-2-ciclohexen-1-il]amino]-\alpha-D-glucopiranosil-(1\rightarrow4)-O-\alpha-D-glucopiranosil-(1\rightarrow4)-D-glucopiranosa como acarbosa [documento DE 2347782].
La acarbosa se usa en la medicina humana para combatir la diabetes mellitus. La formación del metabolito secundario acarbosa se lleva a cabo por actinoplanes sp. SE 50 (nº CBS 961.70) y por una variante natural de esta cepa, SE 50/110 (CBS 614.71) [documento DE 2209834], así como por sus selectantes y mutantes. El aislado original procede de Kenia, cerca de Ruiru. En las solicitudes de patente mencionadas, por ejemplo en los ejemplos 1 a 4 de la solicitud de patente alemana P 2009834 mencionada, se describe la obtención de un inhibidor de la sacarasa de este tipo.
Por la estructura de la acarbosa cabía suponer que la parte desoxiglucosa de la molécula de acarbosa se forma de manera correspondiente a la biosíntesis de los restos 6-desoxiazúcar de diferentes antibióticos (por ejemplo, aminoglucósidos, tales como estreptomicina, kasugamicina; macrólidos, tales como eritromicina, tilosina; polienos, tales como anfotericina A, B, nistatina; antraciclinas, tales como daunorrubicina; glicopéptidos, tales como vancomicina).
Mediante la ingeniería genética se pueden aislar determinados genes directamente del genoma, usándose, por ejemplo, sondas génicas que se unen específicamente a la secuencia de ADN deseada. De este modo se puede "pescar" el gen que se ha de aislar de entre un gran número de secuencias desconocidas.
Asimismo se sabe de los actinomicetos, sobre todo de los estreptomicetos, que en los productores de metabolitos secundarios estudiados hasta la fecha los genes biosintéticos están dispuestos juntos en un conglomerado en el cromosoma, más raramente en un plásmido [Martin, J.F., J. Ind. Microbiol 9, 73-90 (1992), Chater, K.F., Ciba Found. Symp., 171 (Second metabolites: Their Function and Evolution) 144-62 (1992)]. De este modo, mediante la "pesca" con sondas génicas se pueden aislar genes biosintéticos adyacentes, desconocidos hasta ahora, pudiéndose esclarecer entonces su importancia para la biosíntesis deseada.
Por el documento DE-A-2347782 también es conocido para el experto que las actinoplanáceas, especialmente el actinoplanes SE 50/110, son capaces de sintetizar acarbosa. Sin embargo, no se da a conocer la manera en que se pueden aislar en este organismo los genes biosintéticos necesarios para ello.
Por Stockmann y col. (1992, FEMS Microbiology Letters, 90(2), 185-190) se conoce un procedimiento con cuya ayuda se pueden detectar genes biosintéticos de la 6-desoxihexosa en actinomicetos. Este procedimiento, sin embargo, a veces no conduce al éxito esperado. En los casos en los que el procedimiento fracasa, el experto no es capaz de obtener los genes biosintéticos deseados de los actinomicetos.
Por Urabe y col. (1995, Gene, 153(1), 99-104) se sabe que se pueden usar cebadores procedentes de regiones altamente conservadas de Ser/Thr proteína quinasas para el aislamiento de estas mismas enzimas a partir de Streptomyces coelicolor. Sin embargo, no se da a conocer qué secuencias cebadoras específicas se tendrían que usar para aplicar la técnica descrita a otras especies.
En las actinoplanáceas hasta ahora todavía no se ha logrado una aplicación correspondiente de las técnicas de biología molecular, lo que tampoco era de esperar en el caso de este grupo de organismos no caracterizados genéticamente.
Sorprendentemente se descubrió ahora que una sonda génica derivada de regiones proteicas altamente conservadas de enzimas conocidas con actividad dTDP-glucosa deshidratasa resulta adecuada en actinoplanes sp. para encontrar los genes acbA (que codifica la dTDP-glucosa sintasa) y acbB (que codifica la dTDP-glucosa deshidratasa). Resulta sorprendente también el hecho de que como gen adicional se encontrara el acbC adyacente al gen acbB, que codifica una ciclasa (parcialmente idéntica a AroB, las ácido 3-deshidroquínico sintasas bacterianas) y, por tanto, participa en la biosíntesis del ciclitol insaturado (valienamina).
La presente invención se refiere a:
La secuencia de ADN completa de acbB, así como las secuencias de ADN parciales de acbA y acbC.
La secuencia de aminoácidos completa de acbB, así como las secuencias de aminoácidos parciales de acbA y acbC.
Un procedimiento para el aislamiento de genes biosintéticos de metabolitos secundarios a partir de actinomicetos, sobre todo de actinoplanes, caracterizado porque se usa una sonda génica derivada de regiones proteicas altamente conservadas de enzimas conocidas con actividad dTDP-glucosa deshidratasa para encontrar los genes acbA (que codifica al dTDP-glucosa sintasa), acbB (que codifica la dTDP-glucosa deshidratasa) y acbC (que codifica una ciclasa parcialmente idéntica a AroB, las ácido 3-deshidroquínico sintasas bacterianas) o uno o varios genes biosintéticos de la acarbosa procedentes de actinoplanes sp.
Un procedimiento para el aislamiento de genes biosintéticos de sustancias naturales afines a la acarbosa en actinomicetos (por ejemplo para validamicina, oligoestatinas (trestatina), adiposinas).
Aumento del rendimiento de la síntesis de acarbosa en actinoplanes mediante una dosis génica mayor o promotores más eficaces, o mediante la modificación por ingeniería genética de la regulación (por ejemplo, de la expresión de proteínas reguladoras o de los sitios de reconocimiento de reguladores).
El aumento del rendimiento de la síntesis de la acarbosa en actinoplanes mediante ingeniería de proteínas en los pasos biosintéticos limitantes de la síntesis de acarbosa (enzimas de "cuello de botella") o para evitar la formación de componentes secundarios.
Una limitación del espectro de productos en actinoplanes al producto principal deseado desactivando las rutas biosintéticas no deseadas que conducen a componentes secundarios o las reacciones de degradación enzimáticas no deseadas.
La modificación de la regulación y, con ello, de la demanda de nutrientes con vistas a una productividad de acarbosa mejorada en actinoplanes.
Una expresión en cepas huésped heterólogas (por ejemplo, en Streptomyces lividans, así como en otros estreptomicetos, en bacterias de crecimiento rápido, tales como E. coli, Bacillus subtilis o Corynebacterium glutamicum, o en levaduras) para
-
lograr un aumento de la producción mediante mayores rendimientos de espacio/tiempo,
-
desarrollar un procedimiento simplificado para la purificación,
-
lograr una limitación selectiva del espectro de productos.
El uso de los genes biosintéticos de la acarbosa para la síntesis in vitro de acarbosa o de compuestos de esta clase de sustancias partiendo de precursores producidos de forma sintética o microbiana.
La invención se describe en detalle a continuación.
Todos los procedimientos de ingeniería genética se realizaron como en J. Sambrook y col. (Molecular Cloning; A laboratory manual; 2ª edición, 1989; Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., EE.UU.), salvo que se indique otra cosa.
La sonda génica usada para el cribado se obtuvo a partir de actinoplanes sp. SE 50/110 por PCR (reacción en cadena de la polimerasa) con cebadores oligonucleotídicos (véase la Tabla 1) derivados de regiones proteicas altamente conservadas de enzimas conocidas con actividad dTDP-glucosa deshidratasa. El fragmento de ADN amplificado de actinoplanes sp. SE 50/1210 se clonó en pUC18 y se transformó en E. coli DH5\alpha (Gibco BRL, Eggenstein, Alemania). El plásmido resultante (pAS1, véase la Figura 2) se aisló de E. coli con la ayuda del procedimiento de ebullición ("Boiling-Method") o por lisis alcalina (Sambrook y col., 1989).
El plásmido pAS1 de E. coli DH5\alpha se hidrolizó con las enzimas de restricción EcoRI y HindIII. El fragmento EcoRI/HindIII de 0,3 kb se aisló y se marcó mediante el denominado traslado de la mella con desoxinucleótidos marcados con ^{32}P. Este fragmento marcado radiactivamente se usó como sonda génica para el aislamiento de los genes biosintéticos de la acarbosa y en lo sucesivo se denomina sonda acb.
Los genes biosintéticos de la acarbosa se aislaron de la siguiente manera. El ADN cromosómico de actinoplanes sp. se disoció con diferentes enzimas de restricción (SstI, BglII y BamHI), se separó por cromatografía en gel y se analizó respecto a genes homólogos por hibridación tipo Southern con la sonda acb. Los fragmentos de restricción de ADN que hibridan con la sonda génica presentan los siguientes tamaños: 10 kb (SstI), 9-10 kb (BglII) y 2,2 kb (BamHI). Los diferentes fragmentos de ADN que hibridaron con la sonda acb se eluyeron del gel, se ligaron en el vector pUC y se clonaron en E. coli DH5\alpha.
Preferentemente se clonó y secuenció el fragmento de ADN BamHI de 2,2 kb. Los clones de E. coli DH5\alpha que contenían ADN de actinoplanes sp. que hibridaban con la sonda acb se identificaron por hibridación en mezcla (véase el apartado 7). Se aisló el ADN plasmídico de los clones positivos, y el resultado de la hibridación en mezcla se verificó por hibridación tipo Southern. El plásmido obtenido (véase la Figura 3) se sometió a una disociación con diferentes endonucleasas de restricción, y los fragmentos de ADN generados se subclonaron o religaron en pUC18 en E. coli DH5\alpha y se secuenciaron.
Para la determinación de la secuencia de ADN del fragmento BamHI de 2,2 kb de actinoplanes sp. se construyeron los siguientes plásmidos (véase el apartado 7) y se analizó la secuencia del ADN insertado (véanse las Figura 1, 14):
pAS 2/1 = 1,3 kb Fragmento PstI / BamHI de pAS2 (Fig. 4)
pAS 2/2 = 1,6 kb Fragmento SphI / BamHI de pAS2 (Fig. 5)
pAS 2/3 = 0,9 kb Fragmento PstI de pAS2 (Fig. 6)
pAS 2/4 = 0,6 kb Fragmento SphI de pAS2 (Fig. 7)
pAS 2/5 = 0,8 kb Fragmento HincII / HindIII de pAS2/1 (Fig. 8)
pAS 2/6 = 0,65 kb Fragmento XhoI / SalI de pAS2 (Fig. 9)
pAS 2/7 = 0,5 kb Fragmento XhoI / SalI de pAS2 (Fig. 10)
pAS 2/8 = 0,28 kb Fragmento HincII de pAS2/3 (Fig. 11)
pAS 2/9 = 0,7 kb Fragmento XhoI / BclI de pAS2/1 (Fig. 12)
pAS 2/10 = 0,3 kb Fragmento SstI / BclI de pAS2 (Fig. 13)
Para la secuenciación de ADN se usó el procedimiento de F. Sanger y col. (1977) o un procedimiento derivado de él. Se trabajó con el kit Autoread Sequencing (Pharmacia, Friburgo, Alemania) en combinación con el aparato de secuenciación automatizada de ADN por detección de fluorescencia con láser (ALF) (Pharmacia, Friburgo, Alemania). Los cebadores adecuados de secuenciación y secuenciación inversa de pUC marcados con fluoresceína se compraron (Pharmacia, Friburgo, Alemania; véase la Tabla 1).
Cebadores para la PCR:
Denominación del cebador Secuencia
AS 2 5' GCCGCCGAATCCCATGTGGAC 3'
AS 5 5' CCCGTAGTTGTTGGAGCAGCGGGT 3'
Cebadores para la reacción de secuenciación:
Denominación del cebador
Cebador universal 5' GTAAAACGACGGCCAGT 3'
Cebador inverso 5' GAAACAGCTATGACCATG 3'
Ejemplos Ejemplo 1 Cultivo de las cepas de E. coli, preparación del ADN plasmídico y aislamiento
Se incubó E. coli DH5\alpha en medio LB a 37ºC. Las bacterias que llevaban el plásmido se mantuvieron bajo presión de selección (ampicilina, 100 \mug/ml). El cultivo se llevó a cabo en un agitador circular a 270 rpm. Como cultivos realizados durante la noche (CN) se designaron las preparaciones que se incubaron durante al menos 16 h.
Para la preparación del ADN plasmídico se usaron las células procedentes de 1,5 ml de un CN incubado bajo presión de selección. El aislamiento de los plásmidos se llevó a cabo según el procedimiento de lisis alcalina con SDS (Birnboim & Doly 1979).
Para la hidrólisis selectiva del ADN del vector se usaron exclusivamente endonucleasas de restricción según las indicaciones del fabricante (Gibco BRL, Eggenstein, Alemania). Para la restricción de 10 \mug de ADN plasmídico se usaron 5 U de la endonucleasa de restricción correspondiente y se incubaron durante 2 h a 37ºC. Para garantizar una hidrólisis completa se añadió una segunda vez la misma cantidad de endonucleasa de restricción y se incubó de nuevo durante al menos 1 h.
El ADN disociado se separó electroforéticamente en función del tamaño de los fragmentos de ADN en geles de agarosa horizontales del 0,5 al 1,2%. Para la elución se cortó el trozo de gel que contenía el fragmento de ADN con un bisturí estéril y se pesó. La elución de los fragmentos de ADN de la agarosa se llevó a cabo según las indicaciones con el kit JETsorb (Genomed, Bad Oeynhausen, Alemania).
Ejemplo 2 Cultivo de actinoplanes sp., preparación, disociación del ADN cromosómico y separación por electroforesis en gel
Se incubó actinoplanes sp. SE50/110 durante 3 d a 30ºC en medio TSB en un agitador circular. El cultivo previo (5 ml) se realizó a 240 rpm en tubos de cultivo, el cultivo principal (50 ml) en matraces de cultivo a 100 rpm. Después del cultivo las células se sedimentaron por centrifugación y se lavaron dos veces en tampón TE.
La preparación del ADN total se llevó a cabo con 1,5 a 2 mg de células (peso fresco) según el procedimiento de la extracción con fenol/cloroformo (D.A. Hopwood y col. 1985).
La hidrólisis de 20 \mug de ADN cromosómico se realizó durante 2 h a 37ºC con 10 U de la enzima de restricción correspondiente (Gibco BRL, Eggenstein, Alemania) en el tampón correspondiente. Para garantizar una hidrólisis completa se añadió una segunda vez la misma cantidad de endonucleasa de restricción y se incubó de nuevo durante al menos 1 h.
El ADN disociado se separó electroforéticamente en geles de agarosa horizontales al 0,7%.
La elución de los fragmentos de ADN se realizó de nuevo con el kit JETsorb (véase el apartado 1).
Ejemplo 3 Preparación de la sonda génica acb
El fragmento de pAS1 preparado según el apartado 1 se marcó radiactivamente con el sistema del traslado de la mella del fabricante Gibco BRL, Eggenstein, Alemania, según sus indicaciones. Se usaron de 0,5 a 1,0 \mug del fragmento de ADN. Se usó [\alpha^{32}P]dCTP (3.000 Ci/mmol; Amersham, Braunschweig, Alemania). A continuación, la preparación se hirvió durante 10 minutos (desnaturalización) y se vertió inmediatamente en la solución de hibridación (véase el apartado 4).
Ejemplo 4 Transferencia de ADN a membranas, hibridación de ADN (hibridación tipo Southern) y autorradiografía
La transferencia de los fragmentos de ADN desde geles de agarosa a membranas se lleva a cabo según el procedimiento de la transferencia tipo Southern (Southern, E.M., 1975). Los geles de agarosa obtenidos según el apartado 2 se agitaron durante 20 minutos en HCl 0,25 M. Los geles se colocaron sobre 3 capas de papel Whatman absorbente 3MM (Whatman, Maidstone, Inglaterra) y se colocó sin burbujas una membrana Hybond^{TM}-N+ (Amersham, Braunschweig, Alemania). Encima se dispusieron varias capas de papel absorbente. Sobre la pila de filtros se colocó un peso de aproximadamente 1 kg. La transferencia de ADN se lleva a cabo por succión de NaOH 0,4 M. Después de un tiempo de transferencia de al menos 12 h, los filtros de nilón se lavaron durante 5 minutos con SSC 2x y se secaron al aire.
Los filtros de nilón se agitaron después en el baño de agua durante al menos 2 h a 68ºC en 50 a 100 ml de solución de prehibridación. La solución se cambió al menos dos veces. La hibridación tuvo lugar en el armario de hibridación durante al menos 12 h. Se usaron 15 ml de solución de hibridación que contenía la sonda acb (véase el apartado 3).
Los filtros de nilón se lavaron a continuación con postlavado 6x y postlavado 1x durante 15 minutos, respectivamente. Los filtros de nilón se cubrieron después, en estado todavía húmedo, con una hoja para conservación fresca. La autorradiografía se lleva a cabo con Hyperfilm-MP (Amersham, Braunschweig, Alemania) durante al menos 16 h a -80ºC en un chasis impermeable a la luz con hojas reforzadoras.
Ejemplo 5 Aislamiento y clonación de fragmentos BamHI procedentes del ADN total de actinoplanes sp
El ADN cromosómico de actinoplanes sp. SE50/110 se hidrolizó por completo con BamHI, se separó mediante electroforesis en gel de agarosa y se eluyeron de la agarosa los fragmentos de ADN con una longitud de 1,5 a 3 kb. El plásmido vector pUC18 se preparó a partir de E. coli DH5\alpha, se hidrolizó con BamHI y se trató con fosfatasa alcalina (Boehringer, Mannheim, Alemania) según las indicaciones del fabricante. La ligación tuvo lugar en un volumen de 20 \mul, ascendiendo la relación entre el fragmento y el vector a 3:1 con 0,01 a 0,1 \mug de ADN en la preparación. Se usó 1 U de la DNA ligasa de T4 con el tampón correspondiente (Gibco BRL, Eggenstein, Alemania). Las células de E. coli DH5\alpha competentes para la transformación se transformaron con preparaciones de ligación completas (según Hanahan 1983). Los transformantes resistentes a ampicilina se transfirieron a placas selectivas LB-Amp (100 \mug/ml).
Ejemplo 6 Identificación de los clones que contienen el gen de la dTDP-D-glucosa sintasa
Los transformantes resistentes a ampicilina se analizaron respecto a la presencia del gen de la dTDP-D-glucosa sintasa. Se extendieron en cada caso diez de estos clones en una placa selectiva, se incubaron durante la noche y se lavaron de la placa con 3 ml de medio LB. Después se aisló el ADN plasmídico de 20 de estos grupos de diez (según Birnboim & Doly, 1979). Para eliminar los fragmentos BamHI clonados del policonector, las 20 diferentes preparaciones plasmídicas se hidrolizaron con las endonucleasas de restricción EcoRI y HindIII. Las preparaciones de restricción se separaron después electroforéticamente en un gel de agarosa al 0,8% y el ADN se transfirió desde el gel de agarosa a un filtro de nilón mediante la transferencia tipo Southern (véase el apartado 4). La hibridación se realizó de nuevo con la sonda acb (véase el apartado 4). Uno de los conjuntos reaccionó positivamente con la sonda acb y se separó en diez clones individuales. Sus plásmidos también se aislaron y se sometieron al procedimiento antes descrito. El plásmido hibridado se denominó pAS2. Contiene un fragmento BamHI de 2,2 kb.
Ejemplo 7 Subclonación del plásmido pAS2
A partir del plásmido pAS2 se prepararon varios subclones para esclarecer la secuencia de ADN de cadena doble (Figura 1, Figuras 4-13).
pAS2/1 y pAS2/3)
El plásmido pAS2 se hidrolizó con PstI. La preparación de restricción se separó en un gel de agarosa al 1%. Se eluyeron del gel el fragmento PstI de 0,9 kb generado por la hidrólisis y la banda de plásmido con el fragmento PstI/BamHI residual de 1,3 kb (kit JETsorb; Genomed, Bad Oeynhausen, Alemania). El plásmido con el fragmento PstI/BamHI de 1,3 kb se religó al subclon pAS2/1. El fragmento PstI de 0,9 kb se clonó en el vector pUC18 (hidrolizado con PstI) y se generó el subclon pAS2/3.
pAS2/2 y pAS2/4)
El plásmido pAS2 se hidrolizó con SphI. El plásmido con el fragmento SphI/BamHI de 1,6 kb se religó al subclon pAS2/2. El fragmento SphI de 0,6 kb se clonó en pUC18 (hidrolizado con SphI) y se generó el subclon pAS2/4.
pAS2/5)
El plásmido pAS2/1 se hidrolizó con HincII/HindIII. El fragmento de 0,8 kb generado a consecuencia de ello se clonó en pUC18 (hidrolizado con HindIII/HincII) y se generó el subclon pAS2/5.
pAS2/6)
El plásmido pAS2 se hidrolizó con XhoI/SalI. El fragmento de 0,65 kb generado a consecuencia de ello se clonó en pUC18 (hidrolizado con SalI) y se generó el subclon pAS2/6.
pAS2/7)
El plásmido pAS2 se hidrolizó con XhoI/SalI. El fragmento de 0,5 kb generado a consecuencia de ello se clonó en pUC18 (hidrolizado con SalI) y se generó el subclon pAS2/7.
pAS2/8)
El plásmido pAS2/3 se hidrolizó con HincII. El fragmento de 0,3 kb generado a consecuencia de ello se clonó en pUC18 (hidrolizado con HincII) y se generó el subclon pAS2/8.
pAS2/9)
El plásmido pAS2/1 se hidrolizó con XhoI/BclI. El fragmento de 0,7 kb generado a consecuencia de ello se clonó en pUC18 (hidrolizado con SalI/BamHI) y se generó el subclon pAS2/9.
pAS2/10)
El plásmido pAS2 se hidrolizó con SstI/BclI. El fragmento de 0,3 kb generado a consecuencia de ello se clonó en pUC18 (hidrolizado con SstI/BamHI) y se generó el subclon pAS2/10.
Ejemplo 8 Secuenciación de ADN del fragmento BamHI de 2,2 kb de actinoplanes sp
Se secuenciaron los plásmidos descritos en el apartado 7. En la reacción de secuenciación se usaron de 6 a 8 \mug de ADN plasmídico de una preparación (véase el apartado 1). La reacción de secuenciación se realizó con el kit Auto-Read-Sequenzing (Pharmacia, Friburgo, Alemania). Se usó el protocolo convencional para la secuenciación de ADN de cadena doble. Para permitir la valoración de la secuencia de nucleótidos con el A.L.F. (secuenciador automatizado de ADN por detección de fluorescencia con láser), se usaron como moléculas iniciadoras para la reacción de secuenciación los cebadores de secuenciación universales e inversos marcados con fluoresceína (véase la Tabla 1). Para la preparación del gel se mezclaron 8 ml de Hydro Link Long Ranger (Serva, Heidelberg, Alemania), 33,6 g de urea, 8 ml de tampón TBE 10x y H_{2}O hasta 80 ml, se esterilizaron por filtración y se desgasificaron durante 1 minuto. La polimerización se inició mediante la adición de 350 \mul de persulfato de amonio al 10% (p/v) y 40 \mul de N,N,N',N'-tetrametiletilendiamina. La solución se vertió en un molde para geles (50 x 50 x 0,05 cm). La electroforesis se llevó a cabo a 38 W y a una temperatura constante de 45ºC. Como tampón de separación sirvió el tampón TBE 1x. El procesamiento de la fluorescencia medida para obtener una secuencia de ADN se realizó mediante un ordenador conectado (Compaq 386/20e), que también sirvió para la regulación de la unidad de electroforesis (programa A.L.F. Manager 2,5; Pharmacia).
Tampones y soluciones Medios para el cultivo de bacterias
Medio LB:
Triptona 10 g
NaCl 10 g
Extracto de levadura 5 g
H_{2}O hasta 1.000 ml
Se ajustó un pH de 7,5 con NaOH 4 M.
Medio TSB:
Caldo de triptona/soja (Oxoid) 30 g
H_{2}O hasta 1.000 ml
Tampón TE (pH 8,0)
Tris-HCl 10 mM
Na_{2}-EDTA 1 mM
Preparación convencional del ADN plasmídico
(modif. según Birnboim \textamp Doly 1979)
Mezcla I: glucosa 50 mM
Tris-HCl 50 mM (pH 8,0)
EDTA 10 mM (pH 8,0)
5 mg/ml de lisozima
Mezcla II: NaOH 200 mM
SDS (dodecilsulfato sódico) al 1% (p/v)
Mezcla III: acetato potásico 3 M
formiato 1,8 M
Hibridación de ADN-ADN
SSC 20x:
\hskip0.5cm NaCl 3 M
\hskip0.5cm citrato sódico 0,3 M
\hskip0.5cm pH 7,2
Solución de prehibridación:
SSC 6x:
\hskip0.5cm tampón fosfato sódico 0,01 M, pH 6,8
\hskip0.5cm EDTA 1 mM
\hskip0.5cm SDS al 0,5%
\hskip0.5cm leche desnatada en polvo al 0,1%
Solución de hibridación:
\hskip0.5cm La sonda acb se introduce en 15 ml de la solución de prehibridación después de la reacción de marcado.
Postlavado 6x:
\hskip0.5cm SSC 6x
\hskip0.5cm SDS al 0,5%
Secuenciación de ADN
Tampón TBE (pH 8,0):
\hskip0.5cm base Tris 1 M
\hskip0.5cm ácido bórico 0,83 M
\hskip0.5cm EDTA 10 mM
Bibliografía
1.
Birnboim H.C. & Doly J. (\underline{1979})
\quad
A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA
\quad
Nucleic Acids Res.; 7, 1513-1523
2.
Hanahan D. (\underline{1983})
\quad
Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids
\quad
J. Mol. Biol.; 166, 557-580
3.
Hopwood D.A. y col. (\underline{1985})
\quad
Genetic manipulation of Streptomyces;
\quad
A laboratory manual; The John Innes Foundation, Norwich, Inglaterra
4.
Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. (\underline{1977})
\quad
DNA sequencing with chain-terminating inhibitors
\quad
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463-5467
5.
Southern E.M. (\underline{1975})
\quad
Detection of specific sequences among DNA Fragments separated by gel electrophoresis
\quad
J. Mol. Biol., 98, 503-521
(1) DATOS GENERALES:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Bayer AG
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: Bayerwerk
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
LUGAR: Leverkusen
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: Alemania
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL: 51368
\vskip0.500000\baselineskip
(G)
TELÉFONO: 0214-3061455
\vskip0.500000\baselineskip
(H)
FAX: 0214-303482
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
DENOMINACIÓN DE LA INVENCIÓN: Genes de acarbosa
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 1
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
VERSIÓN LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
SOPORTE DE DATOS: disquete
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, versión #1.30B (EPA)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS DE LA SEC ID Nº: 1
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 2219 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
FORMA DE LA CADENA: cadena doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Actinoplanes sp. SE 50/110
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
1
2
<110> Bayer AG
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Genes biosintéticos de la acarbosa procedentes de Actinoplanes 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> LeA30515-EP
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> EP0730029
\vskip0.400000\baselineskip
<141> 1996-02-17
\vskip0.400000\baselineskip
<150> DE19507214
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 1995-03-02
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2219
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Actinoplanes 
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
3
4 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador AS2
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gccgccgaat cccatgtgga c 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador AS5
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cccgtagttg ttggagcagc gggt 
\hfill
24

Claims (11)

1. Molécula de ADN según la SEC ID 01.
2. Fragmentos de moléculas de ADN según la reivindicación 1, que contienen
(i)
la secuencia de ADN completa de acbB que codifica la dTDP-glucosa deshidratasa, y/o
(ii)
una secuencia parcial del gen acbA que codifica la dTDP-glucosa sintasa, con una secuencia según las posiciones 2081 a 2223 de la SEC ID Nº: 1, y/o
(iii)
una secuencia parcial del gen acbC que codifica una ciclasa, con una secuencia según las posiciones 1 a 929 de la SEC ID Nº:1.
3. Vectores que contienen un ADN según las reivindicaciones 1 y 2.
4. Microorganismos transformados con el vector según la reivindicación 3.
5. Polipéptidos codificados por las moléculas de ADN según las reivindicaciones 1 y 2.
6. Procedimiento para el aislamiento de uno o varios genes biosintéticos de la acarbosa a partir de actinoplanes, caracterizado porque como sonda génica sirven cebadores oligonucleotídicos de la secuencia SEC ID Nº: 2 o SEC ID Nº: 3 que hibridan con genes biosintéticos de la acarbosa.
7. Procedimiento para la preparación de acarbosa, caracterizado porque se cultivan microorganismos según la reivindicación 4 y se aísla la acarbosa del caldo de cultivo.
8. Uso de las moléculas de ADN según la reivindicación 2 para la identificación de genes estructurales y genes reguladores adicionales de la acarbosa en actinoplanes.
9. Uso de las moléculas de ADN según la reivindicación 2 para mejorar el rendimiento de la síntesis de acarbosa en microorganismos aumentando la dosis génica de dichas moléculas de ADN o usando promotores más eficaces o modificando por ingeniería genética la regulación (por ejemplo, la expresión de proteínas reguladoras o los sitios de reconocimiento de reguladores).
10. Uso de las moléculas de ADN según la reivindicación 2 para el aislamiento de genes biosintéticos de sustancias naturales afines a la acarbosa.
11. Uso de las moléculas de ADN según la reivindicación 2 para la modificación de enzimas biosintéticas mediante ingeniería de proteínas.
ES96102398T 1995-03-02 1996-02-17 Genes biosinteticos de la acabosa procedentes de actinoplanes sp., procedimiento para su aislamiento. asi como su uso. Expired - Lifetime ES2232829T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19507214A DE19507214A1 (de) 1995-03-02 1995-03-02 Acarbose-Biosynthesegene aus Actinoplanes sp., Verfahren zu ihrer Isolierung sowie ihre Verwendung
DE19507214 1995-03-02

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2232829T3 true ES2232829T3 (es) 2005-06-01

Family

ID=7755404

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES96102398T Expired - Lifetime ES2232829T3 (es) 1995-03-02 1996-02-17 Genes biosinteticos de la acabosa procedentes de actinoplanes sp., procedimiento para su aislamiento. asi como su uso.

Country Status (19)

Country Link
US (1) US5753501A (es)
EP (1) EP0730029B1 (es)
JP (1) JPH08256781A (es)
KR (1) KR960034418A (es)
CN (1) CN1144271A (es)
AT (1) ATE281523T1 (es)
AU (1) AU706116B2 (es)
CA (1) CA2170577A1 (es)
CZ (1) CZ63796A3 (es)
DE (2) DE19507214A1 (es)
ES (1) ES2232829T3 (es)
FI (1) FI960951A (es)
HU (1) HUP9600500A2 (es)
IL (1) IL117316A0 (es)
NO (1) NO960852L (es)
NZ (1) NZ286092A (es)
SK (1) SK28596A3 (es)
TW (1) TW375657B (es)
ZA (1) ZA961674B (es)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0796915A3 (de) * 1996-03-22 1999-04-14 Bayer Ag Verfahren zur Herstellung sowie zur Verwendung von Acarviosyl-Transferase bei der Umwandlung von Acarbose-Homologen in Acarbose, zur Herstellung von Acarbose-Homologen
DE19622783A1 (de) * 1996-06-07 1997-12-11 Hoechst Ag Isolierung der Biosynthesegene für Pseudo-Oligosaccharide aus Streptomyces glaucescens GLA.O und ihre Verwendung
DE19637591A1 (de) * 1996-09-13 1998-03-19 Bayer Ag Osmokontrolliertes Fermentationsverfahren zur Herstellung von Acarbose
DE19708127A1 (de) * 1997-02-28 1998-09-03 Bayer Ag Acarbose acb-Cluster: Isolierung von weiteren Genen der Acarbose Biosynthese und des Acarbose-Stoffwechsels aus Actinoplanes sp. SE 50/110 sowie deren Verwendung
CN106566796B (zh) * 2016-10-28 2020-11-10 上海交通大学 阿卡波糖生产菌Actinoplanes spp.的遗传操作体系

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2064092C2 (de) * 1970-12-28 1983-06-01 Bayer Ag, 5090 Leverkusen Inhibitoren für Glykosidhydrolasen aus Actinomyceten
DE2209834C3 (de) * 1972-03-01 1978-04-20 Bayer Ag, 5090 Leverkusen Herstellung von Saccharase-Inhibitoren
US4062950A (en) * 1973-09-22 1977-12-13 Bayer Aktiengesellschaft Amino sugar derivatives
DE2347782C3 (de) * 1973-09-22 1979-10-11 Bayer Ag, 5090 Leverkusen Aminozuckerderivate, Verfahren zu ihrer Herstellung sowie diese Verbindungen enthaltende Arzneimittel

Also Published As

Publication number Publication date
TW375657B (en) 1999-12-01
NO960852L (no) 1996-09-03
EP0730029A2 (de) 1996-09-04
IL117316A0 (en) 1996-06-18
EP0730029B1 (de) 2004-11-03
ATE281523T1 (de) 2004-11-15
DE59611131D1 (de) 2004-12-09
KR960034418A (ko) 1996-10-22
EP0730029A3 (de) 1999-04-14
FI960951A (fi) 1996-09-03
FI960951A0 (fi) 1996-02-29
HUP9600500A2 (en) 1996-11-28
CA2170577A1 (en) 1996-09-03
CN1144271A (zh) 1997-03-05
CZ63796A3 (en) 1996-09-11
DE19507214A1 (de) 1996-10-31
AU706116B2 (en) 1999-06-10
AU4568496A (en) 1996-09-12
ZA961674B (en) 1996-09-05
SK28596A3 (en) 1996-10-02
NO960852D0 (no) 1996-03-01
JPH08256781A (ja) 1996-10-08
HU9600500D0 (en) 1996-04-29
NZ286092A (en) 1997-11-24
US5753501A (en) 1998-05-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR20110118545A (ko) 새로운 카나마이신 화합물, 카나마이신 생산 스트렙토마이세스 속 미생물 및 카나마이신의 생산 방법
ES2276427T3 (es) Aislamiento de los genes de biosintesis de seudo-oligosacaridos de streptomyces glaucescens gla.o y su uso.
ES2232829T3 (es) Genes biosinteticos de la acabosa procedentes de actinoplanes sp., procedimiento para su aislamiento. asi como su uso.
Xu et al. Sequence Analysis of Plasmid pCC5. 2 from CyanobacteriumSynechocystisPCC 6803 That Replicates by a Rolling Circle Mechanism
JP7086984B2 (ja) Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓの遺伝子組換え株におけるエンデュラシジンの産生を増強するための組成物及び方法
CN110305881B (zh) 一种聚酮类化合物neoenterocins的生物合成基因簇及其应用
CZ9903054A3 (cs) Aglomerát genů biosyntesy acarbosy z Actinoplanes sp. SE 50/110
ES2334755B2 (es) Procedimiento para aislar genes implicados en la biosintesis de estreptolidigina, moleculas de adn, manipulacion genetica de la ruta y sus usos.
ES2350685T3 (es) Procedimiento de obtención de indolocarbazoles mediante la utilización de genes biosintéticos de rebecamicina.
KR20130097538A (ko) 해양 미생물 하헬라 제주엔시스의 제주엔올라이드 생합성 유전자 클러스터
MXPA97002141A (es) Procedimiento para la produccion asi como para eluso de acarviosil-transferasa en la transformacion de homologos de acarbosa en acarbosa, para la produccion de homologos de acarbosa
ES2220938T3 (es) Proceso para producir antraciclinas y sus intermedios.
CZ88097A3 (en) Acarviosyl transferase, process of its preparation and use, dna sequence encoding the acarviosyl transferase, vector in which the sequence is comprised and process of transferring side components of acarbose to acarbose
Stoytcheva et al. WD-repeat protein encoding genes among prokaryotes of the Streptomyces genus
KR101606635B1 (ko) 에포틸론 발현 카세트 및 이의 용도
Jin et al. DNA shuffling of ptr resistance gene leads to improved pristinamycin production in Streptomyces pristinaespiralis
KR101601424B1 (ko) 에포틸론 발현용 벡터 및 이의 용도
KR101736540B1 (ko) 방선균에서 에포틸론 생산을 증대시키기 위한 에포틸론의 전구체, 및 이를 이용한 에포틸론의 생산 방법
EP2247740B1 (en) Genes encoding the biosynthetic pathway for etnangien production
CN116656582A (zh) 产泰乐菌素类似物的工程菌及其构建方法与应用
CN113121545A (zh) 多环大环内酰胺类化合物及其制备方法和应用
CN102516374A (zh) 用于四霉素生物合成的蛋白系统及编码其的基因簇
JP2009502187A (ja) チオコラリンの生合成に関与する遺伝子およびその異種産生
MXPA99007728A (es) Grupo de genes de la acarbosa (acb) de actinoplanes sp.se50/110