ES2230852T3 - Canales ionicos de k+humanos y aplicaciones terapeuticas de los mismos. - Google Patents

Abstract

Una molécula de ácido nucleico comprendiendo una molécula de ácido nucleico codificando un (poli)péptido con una función del canal eag iónico K+ humano con una conductancia de canal simple en potasio asimétrico a 0 mV de alrededor de 6 pS que es (a)una molécula de ácido nucleico comprendiendo una molécula de ácido nucleico codificando el polipéptido con la secuencia de aminoácidos de ID de SEC Nº 3 ó 4; (b)una molécula de ácido nucleico comprendiendo la molécula de ácido nucleico con la secuencia de DNA de ID de SEC Nº: 13 ó 14; (c)una molécula de ácido nucleico hibridando a la cadena complementaria de una molécula de ácido nucleico de (a) ó (b); o (d)una molécula de ácido nucleico siendo degenerada a la secuencia de la molécula de ácido nucleico de (c).

Description

Canales iónicos de K^{+} humanos y aplicaciones terapéuticas de los mismos.

La presente invención se refiere a nuevos canales iónicos de K^{+} humanos, a las moléculas de ácido nucleico que codifican los mismos y a los vectores que comprenden dichas moléculas de ácidos nucleicos. La invención además se refiere a anticuerpos específicamente dirigidos a los nuevos canales iónicos de K^{+} y a composiciones farmacéuticas y a kits de diagnóstico que contienen al menos uno de los componentes anteriormente mencionados. Otras realizaciones de la invención son evidentes a partir de las reivindicaciones anexadas.

Los canales de potasio son un factor relevante en la regulación del potencial restante de las células, y éste se ha estimado como su papel principal en los tejidos excitables y no excitables. Por otro lado, la explicación de su omnipresencia y la impresionante variabilidad en sus propiedades permanece difícil de encontrar. Una hipótesis razonable es que los canales de potasio están presentes en todo tipo de células debido a que poseen además algún papel de "cuidado del hogar", por ejemplo en la proliferación celular^{1}. Su implicación en la regulación del ciclo de división celular se ha ensayado repetidamente, y se han presentado algunas evidencias experimentales^{2,3}. No obstante, especialmente desde que ambas, la despolarización y la hiperpolarización del potencial de membrana durante el ciclo celular se han presentado como dependientes del tipo de célula^{1,4}, no existe un modelo general para explicar la función de los canales de potasio en el ciclo celular. Se han propuesto dos mecanismos para explicar el papel de los canales de K^{+}: tanto influenciando la concentración intracelular de Ca^{2+}, o controlando el volumen celular (17, 18). Ambos mecanismos influenciarían indirectamente la proliferación celular. Un miembro de la familia eag se ha propuesto que se expresa preferencialmente en las células cancerosas (19). Varios bloqueadores de los canales de potasio se han ensayado para ver su capacidad en bloquear la proliferación de las células cancerosas, y algunas de éstas se han usado como coadyuvantes para la quimioterapia tumoral, especialmente en tumores resistentes a múltiples fármacos. A pesar de todo, la carencia de identificación de un canal de potasio en particular directamente implicado en el control de la proliferación celular tiene, hasta la fecha, imposibilitada la descripción de protocolos de tratamiento más específicos y efectivos.

Ludwig et al. (1994) EMBO J. 13, 4451-4458 describe la expresión funcional y la caracterización electrofisiológica de un homólogo de rata de un canal eag de potasio de Drosophila que tiene propiedades electrofisiológicas significativamente diferentes en comparación con el canal de la presente invención.

Así, el problema técnico subyacente a la presente invención fue identificar un componente biológico en el conglomerado de canales de potasio con sus varios efectos en el ciclo de división celular que permite una asignación clara a la proliferación celular, con una vista específica a la proliferación celular humana. La solución a dicho problema técnico se obtiene mediante las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones.

Por lo tanto, la presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico comprendiendo una molécula de ácido nucleico codificando un (poli)péptido con una función del canal eag iónico de K^{+} humano con una conductancia de canal simple en potasio asimétrico a 0 mV de alrededor 6 pS que es

(a) una molécula de ácido nucleico comprendiendo una molécula de ácido nucleico codificando el polipéptido con la secuencia de aminoácidos de ID de SEC No: 3 ó 4;

(b) una molécula de ácido nucleico comprendiendo la molécula de ácido nucleico con la secuencia de DNA de ID de SEC Nº 13 ó 14;

(c) una molécula de ácido nucleico hibridándose con la cadena complementaria de una molécula de ácido nucleico de (a) o (b); o

(d) una molécula de ácido nucleico siendo degenerada a la secuencia de la molécula de ácido nucleico de (c).

La molécula de ácido nucleico de la invención codifica un (poli)péptido que es o comprende los homólogos humanos del canal eag de rata. En esta estimación, el término "una molécula de ácido nucleico comprendiendo una molécula de ácido nucleico codificando un (poli)péptido con una función del canal eag iónico de K^{+} humano" pueden indicar que dicha primera molécula de ácido nucleico únicamente codifica dicho (poli)péptido. Así, ésta puede ser idéntica a dicha segunda mencionada molécula de ácido nucleico. Alternativamente, ésta puede comprender regiones reguladoras u otras regiones sin traducir. En otra realización, dicho primer mencionado ácido nucleico puede comprender un ácido nucleico heterólogo que puede codificar material proteico heterólogo proporcionando así, por ejemplo, a proteínas de fusión. Se debe además apuntar que las secuencias de DNA de ID de SEC Nº: 13 y 14 son variantes de corte y empalme de la secuencia de ácidos nucleicos codificante por el (poli)péptido de la invención. Las secuencias de aminoácidos correspondientes se describen en ID de SEC Nº: 3 y 4.

El término "con una función de un canal eag iónico humano K^{+}", tal como se usa en relación con la presente invención, tiene el siguiente significado: El canal tiene una conductancia de canal simple en potasio asimétrico, a 0mV de alrededor de 6 pS. Este valor claramente distingue el canal humano del canal de ratas para el que un valor de alrededor de 7 pS se midió. Además o de forma alternativa, el anterior término puede tener el siguiente significado: El canal tiene una CI_{50} de alrededor de 1 mM a quinidina cuando se expresan en oocitos de Xenopus laevis, en comparación a 400 \muM para reag. Además, cuando se mide la dependencia del voltaje de la activación en elevado potasio extracelular usando una prensa de sujeción de voltaje de dos electrodos se encontró que en un tramo de voltaje conductancia, el voltaje para la media activación se alcanzó mediante alrededor de 40mV o más a la derecha en el canal heag respecto al canal reag (ver Figura 13). Basándonos en las anteriores características, tanto sólo o en combinación, una diferenciación basada en la función entre el canal iónico humano de la invención y los canales anteriores, en particular del canal iónico de rata, es posible para las personas entendidas en el campo inmediatamente. Preferiblemente, el canal tiene todas las funciones descritas. Los anteriores valores se refieren a valores que son obtenibles con un procedimiento experimental descrito en esta especificación. Alteraciones de los parámetros experimentales tales como el empleo de un sistema de expresión diferente pueden, como es bien conocido por aquellas personas entendidas en el campo, también cambiar los anteriores valores. Aún, estas realizaciones están también comprendidas por el alcance de la presente invención.

El término "hibridante" tal como se usa de acuerdo con la presente invención se refiere a condiciones de hibridación astringentes o no astringentes. Preferiblemente, se refiere a condiciones astringentes. Dichas condiciones de hibridación pueden establecerse de acuerdo con los protocolos convencionales descritos, por ejemplo, en Sambrook, "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y., Ausubel, "Current Protocols in Molecular Biology", Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989), o Higgins & Hames (eds) "Nucleic acid hybridization, a practical approach" IRL Press Oxford, Washington DC, (1985). Las moléculas hibridantes o las moléculas que son parte alternativa (d), supra, también comprenden fragmentos de las moléculas identificados en (a) o (b) en donde la secuencia de nucleótidos necesitaba ser idéntica a su equivalente en la ID de SEC. Nº 13 ó 14, dichos fragmentos con una función tal como la indicada anteriormente.

Un ejemplo de una condición de hibridación astringente es la hibridación a 4XSSC a 65ºC, seguido de lavado en 0,1XSSC a 65ºC durante una hora. Alternativamente, una condición de hibridación astringente ejemplar es en 50% formamida, 4XSSC a 42ºC. Ejemplos de tales condiciones de hibridación no astringentes son 4XSSC a 50ºC o hibridación con 30-40% formamida a 42ºC. Las cadenas complementarias de las moléculas hibridantes comprenden aquellas que codifican fragmentos, análogos o derivados del polipéptido de la invención y difieren, por ejemplo, a modo de delecciones de aminoácidos y/o nucleótidos, inserciones, sustituciones, adiciones y/o recombinaciones o cualquier otra modificación conocida en el campo tanto sólo o en combinación con las secuencias de aminoácidos descritas anteriormente o sus secuencias de nucleótidos subyacentes. Usando el programa PESTFIND (Rogers, Science 234 (1986), 364-368), secuencias PEST (ricas en prolina, ácido glutámico, serina, y treonina) se pueden identificar, que están presentes característicamente en las proteínas inestables. Tales secuencias se pueden eliminar del polipéptido de la invención con el fin de aumentar la estabilidad y opcionalmente la actividad de las proteínas. Los métodos para introducir tales modificaciones en las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la invención son bien conocidas por aquellas personas entendidas en el campo. La invención también se refiere a moléculas de ácido nucleico la secuencia de las cuales difiere de la secuencia de nucleótidos de cualquiera de las moléculas de ácido nucleico descritas anteriormente debido a la degeneración del código genético. Todos estos fragmentos, análogos y derivados codificando la proteína de la invención se incluyen dentro del alcance de la presente invención, así como las propiedades biológicas y/o inmunológicas esencialmente características tal como se definen anteriormente permanecen aún de clase natural, que es que las nuevas moléculas de ácido nucleico de la invención incluyen todas las secuencias de nucleótidos codificantes por proteínas o péptidos que tienen al menos una parte de la conformación estructural primaria para uno o más epítopos capaces de reaccionar con anticuerpos a dicho polipéptido que está codificado por una molécula de ácido nucleico tal como se lista anteriormente y que tienen características comparables o idénticas en términos de actividad biológica. Parte de la invención también concierne por lo tanto a las moléculas de ácido nucleico codificando un polipéptido comprendiendo al menos una parte funcional de los polipéptidos anteriormente identificados por una secuencia de ácido nucleico comprendido en una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención.

Los presentes inventores han descrito recientemente un canal de potasio (reag) que está fuertemente regulado a la baja inmediatamente tras la activación de las quinasas ciclina dependientes (moléculas clave en la regulación del ciclo celular), en ambas transiciones^{5} G1-S y G2-M. La corriente K+ es inhibida siguiendo la activación de las quinasas dependientes de ciclina debido al bloqueo del sodio dependiente de voltaje, que no es aparente en todas las fases del ciclo celular. Los experimentos presentados aquí intentan determinar si eag, además de estar regulado por el ciclo celular, también es capaz de influenciar directamente sobre la proliferación celular y crecimiento (20). De acuerdo con la presente invención y con vista al desarrollo de un sistema apropiado para evaluar la proliferación (relacionada con la enfermedad) en células humanas, además fue un intento de estudiar si la implicación del canal en el ciclo celular va en ambas direcciones, tal que no tan sólo está regulado por sino que también es un regulador de la progresión del ciclo celular.

Los resultados obtenidos en este sistema de canal iónico derivado de rata muestran que en tres líneas celulares diferentes obtenidas de diferentes especies (hámster chino -CHO-, humana -HEK293-, y de ratón -NIH3T3-), la tasa de proliferación es más rápida cuando el canal se sobreexpresa tras la transfección de las células con un plásmido conteniendo el canal de DNA bajo el control del promotor de citomegalovirus. La Figura 1 y la Figura 18a muestran el aumento de la actividad metabólica en cultivos de células CHO en la presencia de concentraciones normales de suero de ternera fetal (10% FCS). Bajo estas condiciones normales, las células transfectadas reag crecen varias veces más rápido que las células sin transfectar (WT).

La Figura 2 muestra un experimento comparable a concentraciones muy bajas de suero de ternera fetal (0,5% o FCS). Estas bajas concentraciones de suero no permiten a las células de tipo salvaje crecer; tras pocas horas, las células empiezan a morir. No obstante, las células transfectadas reag son capaces de proliferar bajo las mismas condiciones. La capacidad para superar la parada del crecimiento inducida por la ausencia de factores de crecimiento es una de las propiedades típicas de la transformación maligna (cf Figura 18).

No sólo la actividad metabólica se puede usar para trazar la proliferación en el cultivo. La medición de la síntesis de DNA es una estimación más directa de la tasa de crecimiento celular, desde que sólo las células entran en la fase S (empiezan a dividirse) sintetizan DNA. También la síntesis de DNA llega a ser independiente del suero en las células transfectadas reag, esto es, el crecimiento se mantiene en ausencia de factores de crecimiento (mientras que éste induce la muerte programada de las células no transfectadas). Esto se describe en la Figura 3, donde la incorporación de 5-Bromo-2'-desoxiuridina^{7-10}(BrdU) se usó para monitorizar la síntesis de DNA en presencia de 10 ó 0,5% FCS en células CHO. De forma opuesta a las de tipo salvaje o las células transfectadas con un canal de potasio dependiente de voltaje inactivante del cerebro de rata (Kv1.4), no hubo diferencias significativas en la cantidad de DNA sintetizado en la presencia de concentraciones de FCS normales o bajas en células expresando reag. Se hicieron experimentos similares usando el factor de crecimiento epidérmico (EGF) en células HEK-293 o factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) en células CHO, con esencialmente el mismo resultado. Los factores de crecimiento puros se usaron para evitar la complejidad introducida por el uso del suero total.

Para ensayar los efectos de eag en la proliferación celular más directamente, la síntesis de DNA se midió a través de la incorporación de 5-Bromo-desoxiuridina (BrdU) en células sincronizadas en la fase S del ciclo celular por métodos de detención de timidina (23). En relación con los hallazgos anteriormente mencionados, cuando la fase S del ciclo celular se dejo proseguir, las células CHO expresando reag (CHOrEAG) mostraron mayor actividad metabólica (Fig. 18B) e incorporación aumentada de BrdU (Fig. 18C). Estos resultados sugieren que más células transfectadas con eag entran en la fase S durante el periodo de detención y/o la síntesis de DNA fue elevada, en cualquier caso indicando una tasa de proliferación más rápida en células CHOrEAG. En la presencia de suero bajo, la incorporación BrdU fue significativamente mayor en CHOrEAG que en las células de tipo salvaje (Fig. 18C).

Aún otra línea celular, NIH3T3, se ha usado frecuentemente para los ensayos de transformación del tumor, desde que estas células están muy fuertemente inhibidas por contacto (esto es, su crecimiento se para cuando el cultivo llega a confluencia). Esto resulta en una monocapa homogénea en las células de tipo salvaje. La transformación maligna de la línea (a través de la expresión de oncogenes) normalmente induce la pérdida de esta propiedad, y las células NIH3T3 empiezan a formar colonias compuestas de varias capas de células. Esto se puede ver tras la transfección con DNA reag, que induce la formación de tales focos en varios clones independientes (Fig. 4A y B). Otro test estándar para la actividad transformante es la capacidad de las células NfH3T3 para crecer en colonias cuando no está disponible ningún sustrato para la unión. Para ensayar esto, las células se disponen en medio que contiene agar, donde el agar prevendrá el contacto entre las células y la superficie de la placa. Bajo estas condiciones, las células NTH3T3 de tipo salvaje son incapaces de crecer, mientras que las células expresando grandes colonias formadas reag aún detectables por simple inspección visual de la placa. La Tabla I muestra las colonias formadas de células transfectadas reag (pero no rKv 1.4-) en un medio semi-sólido conteniendo 0,3% agar (24,25), independientemente del vector usado para la transfección (Fig. 14). Todos los anteriores resultados indican un potencial transformante de eag.

En conjunto, los resultados obtenidos a partir de células transfectadas indican que reag puede, al menos bajo ciertas condiciones, desarrollar propiedades oncogénicas.

Una vez se determinó la capacidad transformante de reag de acuerdo con la invención, se investigó la expresión del canal respectivo en células de cáncer humanas. Para esta investigación, se usó la línea celular MCF-7, que se obtuvo inicialmente de una efusión pleural de un adenocarcinoma de mama. La línea es positiva en el receptor de estrógenos así como sensibles a estrógenos y relativamente bien diferenciada. La estrategia seguida fue primero ensayar electrofisiológicamente y farmacológicamente para la presencia de una corriente funcional similar a eag, y entonces intentar una identificación del correspondiente canal a nivel molecular. No obstante, los logros convencionales para tal identificación fallaron.

Particularmente, en la mayoría de células, la densidad de corriente fue demasiado baja para permitir mediciones confiables de la corriente celular total. La densidad de baja corriente previene una medición exacta de las propiedades del canal usando una configuración celular total para "patch champ". Por lo tanto, debido a dichas densidades de baja corriente encontradas, se recurrió a otro logro. Debido a tal bajo número de canales por célula, es sólo posible para caracterizar las propiedades funcionales de un canal mediante un método "patch champ" especial, escindiendo parches de membranas conteniendo una (o unos pocos) canales y permitiendo la caracterización a un nivel de molécula simple. Este logro reside en mediciones de canal simple con el fin de también comparar las propiedades a un nivel molecular simple tal como una conductancia de canal simple, propiedades farmacológicas, dependencia de voltaje, y tiempos de apertura promedios. Ciertamente, un canal con varias propiedades compatibles con reag en términos de cinética, dependencia de voltaje, y farmacología en la mayoría de parches de membrana podría así ser identificado. La Figura 5 muestra las corrientes celulares totales obtenidas de una célula MCF7 bajo condiciones de parche de nistatina y corrientes de canal simples, junto con su relación corriente-voltaje. A pesar de las diferencias en la cinética a voltajes muy despolarizados, la dependencia de voltaje del canal en células humanas es altamente reminiscente a la dependencia de voltaje del canal reag. Además, las propiedades de canal simple del eag humano putativo son también muy similares a aquellos de reag.

Además, los objetivos estándar para aislar dicho canal a un nivel molecular tampoco tuvieron éxito. Otros varios grupos han intentado y/o aún intentan aislar el gen codificante por eag humano sin éxito y esto a pesar del hecho que el canal eag de rata ya se ha publicado en 1994. Por ejemplo, Warmke y Ganetzky (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (1994), 3428-3442) específicamente empezó a clonarse el gen humano eag usando tecnología convencional. Eran, no obstante, no exitosos y se clonaron a un nuevo gen eag relacionado que llaman h-erg (también referido como HERG). Además, Wymore et al., Circulation Res. 80 (1997), 261-268, dispusieron que ningunos clones específicos eag podrían ser detectables en una genoteca de cDNA a partir de corazón humano a pesar del hecho que los cebadores para la amplificación se usaron para que se conservaran a través de la superfamilia íntegra eag/erg. Así, el logro estándar con oligonucleótidos degenerados basados en la secuencia de miembros de la familia se reveló por si misma sin éxito, aunque HERG fue detectado sistemáticamente por otros investigadores en el campo. Significativamente, la mayoría de estos logros para clonar el gen eag humano se hicieron en genotecas de cerebro. La conclusión a partir de estos datos anteriores combinados fue que el gen eag humano no pudo ser clonado mediante tecnología convencional usando las fuentes más obvias, llamadas tejido cerebral. El aislamiento repetido de clones HERG en cambio es más probablemente debida a la abundancia relativa de transcritos HERG en genotecas de cerebro, y también a la elevada homología entre los dos canales. Por consiguiente, se debe idear una estrategia diferente para dirigir el cribaje más específicamente a los canales eag. Primero, tal como se describe aquí anteriormente, se identificó una línea celular que expresa un canal funcionalmente similar a reag. Entonces se diseñaron los oligonucleótidos degenerados basados en las secuencias conservadas entre eag de rata, bovino y de ratón, pero divergentes de HERG. Usando estos cebadores, el cDNA obtenido a partir de células MCF7 por PCR se amplificó, y una banda del tamaño esperado se clonó en un vector apropiado y secuenciado. El fragmento amplificado correspondiente a aproximadamente 400 pb en la región del núcleo de la proteína de canal, y compartió el 90% de identidad con la secuencia reag a nivel de DNA, y 99% a nivel de aminoácidos. No obstante, en esta etapa aún estaba por esclarecer a que correspondían los clones así identificados. Por ejemplo, fue bastante posible que otro miembro de la familia eag se hubiera identificado. Esto es una verdad particular en vista del hecho que a pesar de un número de intentos con genotecas cerebrales, nadie ha sido capaz de clonar el gen eag humano y que la línea MCF7 es una línea derivada de cáncer de mama.

Desde que las células MCF7 son células inmortales, se asume que un número de genes está mutado. Desde el inicio, se podía haber esperado que el canal humano eag, si al fin se expresa en esta línea celular, estuviera mutado. Suponiendo este hecho, fue bastante cuestionable si esta línea celular pudo al fin ser usado para el aislamiento del gen deseado.

Debido a los anteriores intentos fallidos en el campo para clonar el gen eag humano a partir de genotecas cerebrales y las incertidumbres mencionadas anteriormente con las líneas celulares inmortalizadas, se necesitó otra fuente para una genoteca. El fragmento de 440 pb fue por lo tanto usado para cribar una genoteca de cDNA de mama humano normal. Debido a la presencia de eag en las células de cáncer de mama, tal como una genoteca se esperó para comprender clones heag. Sorprendentemente, no obstante, tras el cribaje de 2x10^{6} fagos, clones eag no humanos se podrían identificar en dicha genoteca. Esto alcanza la posibilidad que el canal se exprese sólo en células tumorales, y no en tejidos normales. Los oligonucleótidos específicos, llamados 5'-CCAAACACACACACCAGC, 5'-CGTGGATGTTATCTTTTTGG para comprobar los fragmentos heag mediante amplificación por PCR directamente a partir de la anterior genoteca se diseñaron, pero no se encontró evidencia de la presencia de cualquier clon de eag. En vista de los resultados anteriormente discutidos en el campo, se hace sorprendente que los mismos cebadores detectaron heag en una genoteca de cDNA de cerebro humano normal, que por lo tanto fue cribado. Primero, la sonda obtenida de las células MCF7 se usó para comprobar 10^{6} fagos. Este procedimiento permitió aislar un fragmento de 1,6 kbp a partir de eag humano. Este fragmento entonces se usó como sonda para el cribaje de 2x10^{6} fagos a partir de la misma biblioteca. Se aislaron varios clones independientes, pero ninguno de ellos fue el clon de longitud total. Además, sólo un clon contenía el extremo 5' de la secuencia, mientras que dos de estos contenían el extremo 3' y parte de la región no codificante 3'. Es probable que la abundancia de sitios de restricción en la secuencia de ácido nucleico codifica el canal que induce esta fragmentación extensiva del cDNA. Por ejemplo, cuando se usó EcoRI para extraer los insertos de la genoteca que se clonó en fago \lambda-gt10 en el sitio EcoRI, este logro convencional sistemáticamente falló al encontrar el extremo 5' de la molécula (existe un sitio EcoRI en la posición 400 del clon). Los clones positivos agrupados fueron por lo tanto cribados de nuevo por PCR intentando amplificar el codón de inicio, y sólo por estos métodos fue posible aislar un fago que contenía este ATG. Dos variantes de corte y empalme de heag se clonaron, ambas expresadas en el tejido cerebral. La secuencia obtenida para heag 1 y heag 2 y su secuencia de aminoácidos deducida se muestra en las Figuras 10 y 11, y se compara con otros miembros de la familia.

La secuencia de aminoácidos deducida es idéntica a la secuencia publicada tras la fecha de prioridad de la presente invención por Occhidoro (27) y es 97,7% idéntica a reag. Tal como se menciona, una segunda variante de corte y empalme (81 pb de longitud) (heag 2) también se aisló de forma análoga a aquella mostrada para los canales bovinos y de ratón eag (28), la inserción de corte y empalme fue idéntica en todas las tres especies. La localización cromosomal de heag se determinó mediante detección FISH (29) para mapear el cromosoma 1q32.1-32.3 (ver también ref. 26).

Para además comprobar la posibilidad que heag no se exprese en la glándula mamaria normal, de forma opuesta a las células de cáncer MCF-7, realizamos experimentos en tubos simples RT-PCR usando RNA total de cerebro humano, glándula mamaria humana, y células MCF-7 (Fig 12), usando como cebadores dos oligonucleótidos diseñados para discriminar entre las dos variantes de corte y empalme de heag. En el cerebro humano, dos variantes de corte y empalme se detectaron, mientras que sólo el corto se expresó en células MCF-7 (esto, junto con la falta de amplificación en ausencia de transcriptasa reversa, evita una posible contaminación por DNA genómico de la preparación de RNA). Ninguna señal heag se detectó en RNA de glándula mamaria normal con esta técnica altamente sensible. Este resultado fue totalmente inesperado, debido a que los resultados preliminares habían sugerido que la expresión estaba presente en células tumorales del mismo órgano. Además, tras el análisis por Southern blot de los productos RT-PCR se identificó una banda débil hibridando con una sonda heag en la glándula mamaria. Por lo tanto, es bastante difícil hacer una afirmación segura en la ausencia total de señales heag en el pecho en vista de estos datos experimentales contradictorios.

Además, las propiedades electrofisiológicas (21, 30) de heag se ensayaron en oocitos de Xenopus. Tal como se describe anteriormente, no difirieron significativamente de aquellos de reag, con las excepciones mencionadas anteriormente, por ejemplo un cambio en la activación de 40 mV a potenciales más despolarizantes cuando ambos canales se midieron bajo condiciones idénticas. Las observaciones electrofisiológicas de canales heag expresados en oocitos de Xenopus correlacionan bien con aquellos aportados por Bijlenga et al. (31).

Moléculas de ácido nucleico hibridan específicamente con moléculas de ácido nucleico de la invención que comprenden la secuencia 5'-GGGAGGATGACCATGGCT. Es particularmente útil para terapias antisentido específicas para inhibir la proliferación celular como se discutirá en más detalle aquí posteriormente (por ejemplo en el Ejemplo 5). Además, esta realización de la molécula de ácido nucleico de la invención puede, naturalmente, también usarse como una sonda para detectar específicamente mRNA de heag en tejidos, por ejemplo, empleando la tecnología Northern Blot. El análisis de la expresión de mRNA de heag en varios tejidos por Northern blot reveló una fuerte señal de hibridación de aproximadamente 9,2 kb en el cerebro y una señal débil de tamaño similar en la placenta. El corazón, pulmón, hígado, músculo esquelético, riñón y páncreas fueron negativos aún tras exposiciones largas. Además, el RNA total de cerebro humano, corazón, tráquea, glándula adrenal, hígado, riñón, músculo esquelético, y glándulas mamarias, y medula espinal poli(A)^{+} RNA, así como el RNA total a partir de la línea 293 transformada de adenovirus (una línea celular no tumoral humana) fueron ensayados mediante una RT-PCR de tubo simple y Southern blot. Bajo estas condiciones experimentales, heag se detectó en el cerebro sólo, donde ambas variantes de corte y empalme se identificaron (Fig. 15; Ejemplo 3).

La expresión preferencial de heag en el cerebro fue una intriga desde que el primer cDNA se había aislado de una línea celular de un tumor epitelial (MCF-7) y no del tejido cerebral (ver anterior). Para elucidar la presencia de heag en otras líneas celulares tumorales, el RNA total se preparó a partir de HeLa (carcinoma de cerviz), SHSY-5Y (neuroblastoma), y líneas de tumores de glándulas mamarias: COLO-824 (carcinoma), EFM-19 (carcinoma), y BT-474 (carcinoma ductal). El RNA total a partir del cerebro, células MCF-7, células 293 y RNA a partir de cultivos de células epiteliales de glándulas mamarias (incluidas para evadir las poblaciones de células mezcladas en la glándula mamaria total) sirven como control. Todas las líneas celulares se obtuvieron de DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen) y se mantuvieron siguiendo la guía del catálogo DSMZ. Las células epiteliales mamarias humanas normales se obtuvieron de BioWhittaker. Los cebadores se diseñaron para amplificar diferentes bandas para heag 1 y heag 2, permitiéndonos así evitar falsos positivos debidos a la contaminación de DNA genómico (controles en ausencia de la transcriptasa reversa también se realizaron). HeLa, SHSY-5Y, EFM-19 y MCF-7 RNA exhibieron una banda heag, mientras que las señales COLO-824 y BT-474 fueron indistinguibles del fondo (Fig. 15B). Las células epiteliales cultivadas y las celulas 293 (Fig. 15A) fueron negativas. Tal como se revela anteriormente, se puede demostrar de acuerdo con la presente invención que las células transfectadas reag pueden desarrollar propiedades oncogénicas. Así, para determinar si la expresión de heag es ventajosa para las células tumorales in vivo, se realizaron implantes subcutáneos de células CHO expresando el canal (células CHOhEAG) en el flanco de la ratones hembras scid (inmunodeficiencia combinada severa, 32) y se pudo demostrar que la expresión de heag representa una ventaja para la proliferación de células tumorales in vivo, desde que los tumores CHOhEAG crecieron de forma más rápida y más agresiva que los tumores CHOKv.

Así, la realización de la molécula de ácido nucleico se puede emplear en el análisis cuantitativo y cualitativo del nivel de expresión de eag humana en varias enfermedades detectables en un tejido que puede ser indicativo de, por ejemplo, cáncer (en particular carcinoma de mama, neuroblastoma), psoriasis, enfermedades neurodegenerativas tales como enfermedad de Alzehimer, enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica o esclerosis múltiple.

En una realización preferida de la molécula de ácido nucleico de la invención, dicha molécula de ácido nucleico es DNA, tal como DNA genómico. Mientras que la presente invención también comprende moléculas de DNA sintéticas o semi-sintéticas o derivados de las mismas, tales como un ácido nucleico péptido, la molécula de DNA más preferida de la invención es cDNA.

En una realización preferida de la presente invención, dicha molécula de ácido nucleico es RNA, preferiblemente mRNA.

Otra realización preferida de la molécula de ácido nucleico de la invención codifica una proteína de fusión. Por ejemplo, la molécula de ácido nucleico de la invención puede fusionarse en trama a un marcador detectable como FLAG o GFP.

La invención además se refiere a un vector, particularmente un plásmido, cósmido, virus y bacteriófagos comprendiendo la molécula de ácido nucleico de la invención. Tales vectores pueden además comprender otros genes tales como genes marcadores que permiten la selección de dicho vector en una célula huésped apropiada y bajo condiciones adecuadas. Así el polinucleótido de la invención se puede unir operativamente en dicho vector para controlar la expresión de secuencias que permiten la expresión en células procariotas o eucariotas. La expresión de dicho polinucleótido comprende la trascripción del polinucleótido en un mRNA traducible. Los elementos reguladores que aseguran la expresión en las células eucariotas, preferiblemente células de mamíferos, son bien conocidos por aquellos entendidos en el campo. Éstos normalmente comprenden secuencias reguladoras que aseguran el inicio de la trascripción y opcionalmente señales poli-A que aseguran la terminación de la trascripción y la estabilización del trascrito. Elementos reguladores adicionales pueden incluir potenciadores transcripcionales así como potenciadores traduccionales. Elementos reguladores posibles permiten la expresión en células huésped procariota comprenden, por ejemplo, el promotor lac, trp o tac en E. coli, y ejemplos para elementos reguladores que permiten la expresión en células huésped eucariotas son el promotor AOX1 o GAL1 en levaduras o el promotor CMV-, SV40-, RSV-(virus de sarcoma Rous), CMV-potenciador, SV40-potenciador o un intrón de globina en células de mamíferos o de otros animales. Junto a los elementos que son responsables para la iniciación de la trascripción tales elementos reguladores pueden también comprender señales de terminación de la trascripción, tal como el sitio SV40-poli-A o el sitio tk-poli-A, corriente abajo del polinucleótido. En este contexto, los vectores de expresión apropiados son conocidos en el arte tales como el vector de expresión pcDV1 de cDNA Okayama-Berg (Pharmacia), pCDM8, pRc/CMV, pcDNAI, pcDNA3 (In-vitrogene), pSPORTI (GIBCO BRL).

Preferiblemente, dicho vector es un vector de expresión y/o un vector de marcaje de dianas o transferencia de genes. Los vectores de expresión y los vectores de transferencia o marcaje de dianas de genes son bien conocidos en el campo y se pueden adaptar para propósitos específicos de la invención por personas entendidas en el campo. Así, los vectores de expresión derivados de los virus tales como retrovirus, vaccinia virus, virus adeno-asociados, herpes virases, o virus del papiloma bovino, se pueden usar para la distribución de los polinucleótidos o vectores de la invención en poblaciones celulares diana. Los métodos que son bien conocidos por aquellos entendidos en el campo se pueden usar para construir vectores virales recombinantes, ver, por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrook, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y. y Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates y Wiley Interscience, N.Y. (1989). Alternativamente, los polinucleótidos y vectores de la invención se pueden reconstituir en liposomas para su distribución a las células diana.

La invención además se refiere a un huésped transformado con el vector de la invención. Tal huésped puede ser una célula procariota o eucariota; ver supra. El polinucleótido o vector de la invención que está presente en la célula huésped puede también integrarse en el genoma de la célula huésped o se puede mantener extracromosomalmente. En este aspecto, también se debe entender que la molécula de DNA recombinante de la invención se puede usar para "marcaje de dianas génicas" y/o "reemplazo génico", para restaurar un gen mutante o para crear un gen mutante vía una recombinación homóloga; ver por ejemplo Mouellic, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87 (1990), 4712.4716; Joyner, Gene Targeting, A Practical Approach, Oxford University Press. Preferiblemente, el huésped es una célula mamífera, una célula de hongos, una célula vegetal, una célula de insectos o una célula bacteriana. Las células fúngicas preferidas son, por ejemplo, aquellas del género Saccharomyces, en particular aquellos de las especies S.cerevisiae. El término "procariota" se entiende que incluya todas las bacterias que se pueden transformar o transfectar con un polinucleótidos para la expresión de la proteína de la presente invención. Los huéspedes procariotas pueden incluir bacterias gram negativas así como gram positivas que se pueden transformar o transfectar con un polinucleótido para la expresión de la proteína de la presente invención. Los huéspedes procariotas pueden incluir bacterias gram negativas así como gram positivas tal como, por ejemplo, E.coli, S.typhimurium, Serratia marcescens y Bacillus subtilis. Los métodos para preparar genes fusionados, operativamente unidos y expresar éstos en células bacterianas o animales son bien conocidos en el campo (Maniatis, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Coid Spring Harbor, NY, 1989). Las construcciones genéticas y métodos descritos aquí se pueden utilizar para la expresión de la proteína de la presente invención en huéspedes procariotas. En general, los vectores de expresión contienen secuencias promotoras que facilitan la trascripción eficiente de los polinucleótidos insertados usados en relación con el huésped. El vector de expresión normalmente contiene un origen de replicación, un promotor, y un terminador, así como genes específicos que son capaces de proporcionar una selección fenotípica de las células transformadas. Los huéspedes procariotas transformados pueden crecer en fermentadoras y cultivarse de acuerdo con técnicas conocidas en el campo para obtener un crecimiento celular óptimo. Los polipéptidos de la invención se pueden aislar entonces a partir del medio de crecimiento, lisados celulares, o fracciones de membrana celulares. El aislamiento y purificación de los polipéptidos expresados microbialmente o de otro modo de la invención puede ser mediante cualquier método convencional tal como, por ejemplo, separaciones cromatográficas preparativas y separaciones inmunológicas tal como aquellas implicando el uso de anticuerpos monoclonales o policlonales. Como recuerdan las células mamíferas, HEK 293, CHO, HeLa y NIH 3T3 son preferidas. Tal como se recuerda las células de insectos, es más preferido para usar células de Spodoptera frugiperda, mientras que la mayoría de células bacterianas preferidas son células de E.coli.

La invención también se refiere a un método para producir el (poli)péptido codificado por la molécula de ácido nucleico de la invención comprendiendo el cultivo del huésped de la invención y aislar el (poli)péptido producido.

Dependiendo de la construcción del vector empleada, el (poli)péptido de la invención se puede exportar al medio de cultivo o mantener con el huésped. Los protocolos apropiados para obtener el (poli)péptido producido son bien conocidas en el campo para ambas vías de producción.

La presente invención además se refiere a un (poli)péptido codificado por la molécula de ácido nucleico de la invención o producido por el método de la invención. El nuevo canal es concebido para mostrar una estructura con una región amino-terminal corta, probablemente intracelular, cinco segmentos inter-membrana, una horquilla hidrofóbica entrando en la membrana, un sexto segmento transmembrana, y una parte citoplásmica C-terminal larga comprendiendo una secuencia de consenso de unión de nucleótido cíclico, una secuencia consenso de localización nuclear, y un dominio hidrofóbico probablemente formando una estructura enrollada en espiral. El polipéptido de la invención también puede ser un fragmento funcional del canal iónico humano K^{+}. Por polipéptidos "fragmento funcional" se entiende que exhiben cualquiera de las actividades de heag descritas anteriormente. Usando homología de DNA recombinante, fragmentos del (poli)péptido de la invención se pueden producir. Estos fragmentos pueden ensayarse para la función deseada, por ejemplo, tal como se indica anteriormente, usando una variedad de sistemas de ensayo tales como aquellos descritos en la presente invención. Preferiblemente, dichos fragmentos comprenden la porción C-terminal del nuevo canal iónico.

La presente invención también se refiere a un anticuerpo específicamente dirigido al (poli)péptido de la invención. El anticuerpo de la invención discrimina específicamente entre el canal eag humano y los anteriores canales del campo tales como eag de rata y ratón y preferiblemente se une a los epítopos en la parte C-terminal del canal iónico. El término "anticuerpo", tal como se usa de acuerdo con la invención, también se refiere a fragmentos de anticuerpo o derivados tales como fragmentos F(ab)_{2}, Fab', Fv o scFv; ver, por ejemplo, Harlow y Lane, "Antibodies, A Laboratory Manual", CSH Press 1988, Cold Spring Harbor, NY: Preferiblemente, el anticuerpo de la invención es un anticuerpo monoclonal.

La invención también se refiere a una composición farmacéutica comprendiendo el vector de la invención, el polipéptido de la invención y/o el anticuerpo de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable y/o diluyente y/o excipiente.

Ejemplos de vehículos farmacéuticos apropiados y diluyentes así como de excipientes bien conocidos en el campo e incluyen soluciones de tampón de fosfatos, agua, emulsiones, tales como emulsiones oleosa/acuosa, varios tipos de agentes humectantes, soluciones estériles etc. Composiciones comprendiendo tales vehículos se pueden formular por métodos convencionales bien conocidos. Estas composiciones farmacéuticas se pueden administrar al paciente en necesidad del mismo a una dosis apropiada. La administración de las composiciones apropiadas, se puede efectuar por diferentes vías, por ejemplo, vía oral, intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, tópica o intradérmica. El régimen de dosis se podrá determinar por el médico que le atienda y por factores clínicos. Como es bien conocido en el arte médico, las dosis para cualquier paciente dependen de muchos factores, incluyendo el tamaño del paciente, el área de superficie corporal, la edad, el compuesto a administrar en particular, el sexo, tiempo y vía de administración, salud general, y los otros fármacos que se están administrando concomitantemente. Generalmente, el régimen como una administración regular de la composición farmacéutica debería estar en el rango de 1 \mug a 10 mg unidades por día. Si el régimen es una infusión continua, ésta debería estar en el rango de 1 \mug a 10 mg unidades por kilogramo de peso corporal por minuto, respectivamente. El progreso se puede monitorizar mediante asesoramiento periódico. Las dosis variarán pero una dosis preferida para administración intravenosa de DNA es desde aproximadamente 10^{6} a 10^{12} copias de la molécula de DNA. Las composiciones de la invención se pueden administrar localmente o sistemáticamente. La administración será generalmente parenteralmente, por ejemplo, intravenosamente, el DNA podrá administrarse directamente al sitio diana, por ejemplo mediante distribución biolística a un sitio diana interno o externo o mediante un catéter a un sitio en la arteria.

Se contempla mediante la presente invención que los varios polinucleótidos y vectores de la invención se administren tanto solos o en cualquier combinación usando vectores estándar y/o sistemas de distribución génica, y opcionalmente junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable o excipiente. Tras la administración, dichos polinucleótidos o vectores se pueden integrar establemente en el genoma del sujeto. Por otro lado, se pueden usar vectores virales que son específicos para ciertas células o tejidos y persisten en dichas células o tejidos. Vehículos farmacéuticos apropiados y excipientes son, tal como se ha indicado anteriormente, bien conocidos en el campo. Las composiciones farmacéuticas preparadas de acuerdo con la invención se pueden usar para la prevención o tratamiento o retraso de diferentes tipos de enfermedades, que están relacionadas con la (sobre)expresión indeseada de las moléculas de ácidos nucleicos anteriormente identificadas de la invención. En una realización preferida, la composición farmacéutica comprende oligodesoxinucleótidos antisentido, como por ejemplo el descrito en el ejemplo 5, capaz de regular, preferiblemente disminuir la expresión fuerte.

Además, es posible para usar la composición farmacéutica de la invención que comprende el polinucleótido o vector de la invención en terapia génica. Sistemas de distribución génica apropiados incluyen liposomas, sistemas de distribución mediados por receptor, DNA desnudo, y vectores virales tales como herpes virus, retrovirus, adenovirus, y virus adeno-asociados, entre otros. La terapia génica, que se basa en introducir genes terapéuticos, por ejemplo para la vacunación de células mediante técnicas ex-vivo o in-vivo es una de las aplicaciones más importantes de la transferencia génica. Vectores apropiados, métodos o sistemas de distribución génica para terapia génica in-vitro o in-vivo se describen en la literatura y son conocidos por las personas entendidas en el campo, ver, por ejemplo, Giordano, Nature Medicine 2 (1996), 534-539; Schaper, Circ. Res. 79 81996), 911-919; Anderson, Science 256 (1992), 808-813; Isner, Lancet 348 (1996), 370-374; Muhlhauser, Circ. Res. 77 (1995), 1077-1086; Onodera, Blood 91 (1998), 30-36; Verzeletti, Hum. Gene Ther. 9 (1998), 2243-2251; Verma, Nature 389 (1997), 239-242; Anderson, Nature 392 (Supp. 1998), 25-30; Wang, Gene Therapy 4 (1997), 393-400; Wang, Nature Medicine 2 (1996), 714-716; WO94/29469; WO 97/00957; US 5,580,859; US 5,589,466; US 4,394,448 o Schaper, Current Opinion Biotechnology 7 (1996), 635-640, y referencias citadas aquí. Las moléculas de ácidos nucleicos y vectores de la invención se pueden diseñar para la introducción directa o para la introducción mediante liposomas, o vectores virales (p.ej. adenoviral, retroviral) en la célula. Además, un sistema baculoviral se puede usar como sistema de expresión eucariota para las moléculas de ácido nucleico de la invención. La distribución de los ácidos nucleicos en un sitio específico en el cuerpo para terapia génica puede también conseguirse usando un sistema de distribución biolístico, tal como el descrito por Williams (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991), 2726-2729).

Los métodos estándar para transfectar células con DNA recombinante son bien conocidos por aquellos entendidos en el campo de la biología molecular, ver, por ejemplo, WO 94/29469. La terapia génica se puede llevar a cabo administrando directamente la molécula de DNA recombinante o el vector de la invención a un paciente o por transfección de las células con el polinucleótido o vector de la invención ex vivo e infundiendo las células transfectadas al paciente. Además, la investigación perteneciente a la transferencia génica a células de la línea germinal es uno de los campos en mayor y más rápido crecimiento en la biología reproductiva. La terapia génica, que se basa en introducir genes terapéuticos en las células mediante técnicas ex vivo o in vivo es una de las aplicaciones más importantes de la transferencia génica. Los vectores apropiados y los métodos para terapia génica in vitro o in vivo se describen en la literatura y son conocidos por las personas entendidas en el campo; ver, p.ej., W094/29469, WO97/00957 o Schaper (Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 635-640) y referencias citadas anteriormente. Los polinucleótidos y los vectores comprendidos en la composición farmacéutica de la invención se pueden diseñar mediante introducción directa o por introducción vía liposomas, o vectores virales (por ejemplo adenoviral, retroviral) conteniendo dicha molécula de DNA recombinante en la célula.

Se debe entender que los polinucleótidos introducidos y los vectores de la invención expresa el (poli)péptido de la invención tras la introducción de dicha célula y preferiblemente permanece en este estado durante el tiempo de vida de dicha célula. Por ejemplo, las líneas celulares que expresan establemente el polinucleótido bajo el control de las secuencias reguladoras apropiadas se pueden diseñar genéticamente de acuerdo con los métodos bien conocidos por aquellos expertos en el campo. En lugar de usar vectores de expresión que contienen orígenes de replicación víricos, células huésped se pueden transformar con el polinucleótido o vector de la invención y un marcador seleccionable, tanto en el mismo vector o separados. Siguiendo la introducción de DNA extraño, las células diseñadas genéticamente se deben permitir crecer durante 1-2 días en el medio enriquecido, y entonces se activan en medio selectivo. El marcador seleccionable en el plásmido recombinante confiere resistencia a la selección y permite la selección de células que tienen establemente integrado el plásmido en sus cromosomas y crecen para formar focos que a su vez se pueden clonar y expandir en las líneas celulares. Tales líneas celulares diseñadas genéticamente son particularmente útiles en los métodos de cribaje o métodos para la identificación de un inhibidor del polipéptido de la presente invención tal como se describe posteriormente.

Varios sistemas de selección se pueden usar, incluyendo pero no limitándose a la timidina quinasa del virus herpes simplex (Wigler, Cell 11 (1977), 223), hipoxantina-guanina fosforibosiltransferasa (Szybalska, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48 (1962), 2026), y adenina fosforibosiltransferasa (Lowy, Cell 22 (1980), 817) en células tk, hgprt o aprt, respectivamente. También, la resistencia de antimetabólitos se puede usar como la base de selección para dhfr, que confiere resistencia al metotrexato (Wigler, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980), 3567; O'Hare, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (1981), 1527), gpt, que confiere resistencia al ácido micofenólico (Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (1981), 2072), neo, que confiere resistencia al aminoglicósido G-418 (Colberre-Garapin, J.Mol.Biol. 150 (1981), 1), hygro, que confiere resistencia a la higromicina (Santerre, Gene 30 (1984), 147), Shble, que confiere resistencia a Zeocin® (Mulsant, Somat. Cell. Mol. Genet. 14 (1988), 243-252 o puromicina (pat, puromicina N-acetil transferasa). Genes seleccionables adicionales se han descrito, por ejemplo, trpB, que permite a las células utilizar el indol en lugar del triptofano; hisD, que permite a las células utilizar histinol en lugar de histidina (Hartman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 8447); y ODC (ornitina decarboxilasa) que confiere resistencia al inhibidor de la ornitina decarboxilasa, 2-(difluorometil)-DL-ornitina, DFMO (McConlogue, 1987, En: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed.). Las células a usar para terapia génica ex vivo son bien conocidas por aquellos entendidos en el campo. Por ejemplo, tales células incluyen por ejemplo células cancerosas presentes en la sangre o en un tejido.

Además, la invención se refiere a una composición de diagnóstico comprendiendo una molécula de ácido nucleico de la invención, el vector de la invención, el polipéptido de la invención y/o el anticuerpo de la invención.

La composición de diagnóstico de la invención es útil en detectar el principio o progreso de las enfermedades relacionadas con la expresión indeseada o sobre-expresión de la molécula de ácido nucleico de la invención. Tal como se ha apuntado aquí anteriormente, tales enfermedades están relacionadas o causadas por una proliferación celular aumentada o adelantada. Por lo tanto, la composición de diagnóstico de la invención se puede usar para asegurar el inicio del estado de la enfermedad de cáncer. Teniendo así un criterio temprano para la actividad tumoral, las mediciones contadas apropiadas se pueden aplicar inmediatamente. Tal acción inmediata mejorará, por supuesto, significativamente el pronóstico del paciente. Estas consideraciones igualmente se aplican al diagnóstico de metástasis y tumores recurrentes.

Por otro lado, no todos los tipos de tumores se pueden caracterizar por una expresión indeseada o sobre-expresión de la molécula de ácido nucleico de la invención. Alternativamente, dicha (sobre)expresión puede ocurrir solo en ciertas etapas, tales como etapas tempranas, del desarrollo tumoral. Por lo tanto, la composición de diagnóstico de la invención puede también o alternativamente emplearse como un método para la clasificación de tumores o del estado de desarrollo de un tumor. Naturalmente, la mayoría de aplicaciones de la composición de la invención descritas aquí para tumores también pueden aplicarse a otras enfermedades inter-relacionadas con o causadas por la (sobre)expresión deseada de la molécula de ácido nucleico de la invención.

Además, una enfermedad tal como se muestra a lo largo de esta especificación pudo ser causada por un mal funcionamiento del polipéptido de la presente invención. Dicha enfermedad podría estar inter-relacionada o causada por, por ejemplo, una dosis génica aumentada o reducida del polipéptido de la presente invención, una actividad aumentada o reducida de dicho polipéptido por ejemplo debido a la modificación en la secuencia primaria de aminoácidos en comparación con el correspondiente polipéptido de tipo salvaje en una célula o tejido o una pérdida de la regulación de la actividad de dicho polipéptido. Dicha enfermedad además puede ser causada por una expresión incorrecta del polipéptido durante la progresión en una célula o tejido o una pérdida de la regulación de la actividad de dicho polipéptido. Dicha enfermedad puede además ser causada por una expresión incorrecta del polipéptido durante la progresión del ciclo celular o desarrollo celular. Por ejemplo, los sitios de unión mutados a compuestos intracelulares o extracelulares, por ejemplo iones o segundos mensajeros o proteínas reguladoras, pueden resultar en un mal funcionamiento del polipéptido de la presente invención, así como cambios en las características de unión para dichos compuestos que regulan la actividad de dicho polipéptido. EL mal funcionamiento puede también ser causado por sitios de modificaciones defectivos, por ejemplo, sitios de fosforilación o de glicosilación. También puede ser causado por casos de corte y empalme incorrectos y por lo tanto en una expresión de polipéptidos truncados o extendidos, por ejemplo, si heag 1 se expresa en lugar de heag 2 o viceversa.

Así, en otra realización la composición de diagnóstico descrita anteriormente podría también usarse para detectar un mal funcionamiento del polipéptido de la presente invención.

En otra realización, la invención se refiere al uso de un inhibidor de la expresión de la molécula de ácido nucleico de la presente invención o un inhibidor o un agente modificante del mal funcionamiento del (poli)péptido de la presente invención o una molécula de ácido nucleico codificando por heag o un polipéptido con actividad heag para la preparación de una composición farmacéutica para prevenir o tratar una enfermedad que está causada por el mal funcionamiento del polipéptido de la invención, en donde la enfermedad es cáncer, psoriasis o una enfermedad neurodegenerativa en donde dicho inhibidor es un oligonucleótido anti-sentido, el anticuerpo de la invención o un bloqueador de canal abierto o un inhibidor del receptor de histamina H1, preferiblemente astemizol o terfenadina.

La invención también se refiere al uso de un inhibidor de la expresión de la molécula de ácido nucleico de la invención o de un inhibidor de función del polipéptido de la invención para la preparación de una composición farmacéutica para la prevención o el tratamiento del cáncer, psoriasis, o una enfermedad neurodegenerativa, en donde dicho inhibidor es un oligonucleótido antisentido que hibrida con la molécula de ácido nucleico de la invención, el anticuerpo de la invención o un bloqueador del canal abierto o un inhibidor del receptor de histamina H1, preferiblemente astemizol o terfenadina. La composición farmacéutica es para la introducción en un mamífero afectado por dicha enfermedad o siendo sospechado de ser susceptible a dicha enfermedad. Los métodos para la introducción de una molécula de ácido nucleico de la presente invención codificando por heag en una célula o sujeto, esto es terapia génica, se describen en esta especificación así como los métodos para la identificación de inhibidores de la expresión de una molécula de ácido nucleico de la presente invención. Además, los inhibidores o agentes modificantes del mal funcionamiento del polipéptido de la presente invención se pueden identificar de acuerdo con los métodos para la identificación de inhibidores inhibidores del polipéptido de la presente invención conocidos por una persona entendida en el campo (ver posteriormente). Por ejemplo, algunos cambios genéticos causantes de un mal funcionamiento del polipéptido de la presente invención llevan a un estatus conformacional de la proteína alterado. Las proteínas mutantes pueden poseer una estructura terciaria que proporciona a éstos menor capacidad lejana de facilitar el transporte iónico. Restaurando la conformación regulada o normal de las proteínas mutadas es el método más específico y elegante para corregir estos defectos moleculares. Las manipulaciones farmacológicas así pueden apuntar a la restauración de la conformación de tipo salvaje de la proteína. Así, el polinucleótido y las proteínas codificantes de la presente invención pueden también usarse para diseñar y/o identificar moléculas que son capaces de activar la función de tipo salvaje de un derivado del polipéptido de la presente invención desarrollando dicho mal funcionamiento.

Las dosis y vías de administración para el tratamiento de un paciente en necesidad del mismo ya se ha discutido aquí anteriormente en relación con la composición farmacéutica de la invención. Enfermedades que pueden ser tratadas usando el método de la presente invención comprende cualquier enfermedad que esté relacionada con la proliferación celular. Las enfermedades preferidas que entran dentro de esta categoría son enfermedades tumorales tales como cáncer (cáncer de mama, neuroblastoma etc.), psoriasis, y enfermedades degenerativas, especialmente aquellas del sistema nervioso central tales como enfermedad de Alzehimer, esclerosis múltiple, esclerosis lateral amiotrófica, y enfermedad de Parkinson.

Dicho inhibidor de la expresión o sobreexpresión de dicha molécula de ácido nucleico puede ser la molécula de ácido nucleico de la invención que hibrida a la molécula de ácido nucleico codificando el canal iónico de la invención o un fragmento del mismo. Por ejemplo, la molécula de ácido nucleico puede ser un oligodesoxinucleótido antisentido (ODN). Los inventores podrían mostrar que el tratamiento ODNs antisentido reduce significativamente la síntesis de DNA de varias células tumorales, por ejemplo células EFM, células SHSY-5Y y células HeLa (Ejemplo 5). Así, en una realización preferida la molécula de ácido nucleico comprende ODNs antisentido.

Tal como se menciona anteriormente dicho inhibidor de la función del polipéptido puede ser el anticuerpo de la invención o un fármaco. Dicho fármaco puede ser un inhibidor del receptor de histamina H1. Preferiblemente, dicho fármaco inhibe heag activo, por ejemplo, actúa como probablemente un bloqueador del canal abierto dependiente del uso, preferiblemente dicho fármaco es astemizol o terfenadina. Otros fármacos apropiados se pueden identificar o diseñar por las personas entendidas en el campo en base a los conocimientos de la presente invención. Preferiblemente, el fármaco tendrá una afinidad al canal de heag en el rango de mM, más preferiblemente en el rango nM o inferior. Preferiblemente, el fármaco no tiene efectos en otros canales, por ejemplo los canales cardíacos.

La invención además se relaciona a un método de diseñar un fármaco para el tratamiento de una enfermedad que es causada por la expresión no deseada o sobreexpresión de una molécula de un ácido nucleico de la invención que comprende:

(a)

identificación de un específico y potente fármaco;

(b)

identificación del sitio de unión de dicho fármaco por estudios de mutagénesis directa y proteína quimérica;

(c)

modelamiento molecular de ambos sitios de unión en el (poli)péptido y la estructura de dicho fármaco; y

(d)

modificaciones del fármaco para mejorar su especificidad de unión para el (poli)péptido.

El término "específico y potente fármaco" como se usa aquí se refiere a un fármaco que bloquea potencial y específicamente la función heag.

Todas las técnicas empleadas en varios pasos del método de la invención son convencionales o pueden ser derivadas por personas expertas en el campo de técnicas convencionales sin ninguna información adicional. Así, los ensayos biológicos basados en los rasgos aquí identificados del canal iónico de la invención se puede emplear para evaluar la especificidad o potencia de los fármacos en el que el descenso de una o más actividades del canal iónico puede ser usado para monitorizar dicha especificidad o potencia. Los pasos (b) y (d) pueden ser llevados a cabo según los protocolos convencionales descritos, por ejemplo, en K.L. Choi, C.Mossman, J.Aubé & G. Yellen. The International Quaternary Ammonium Receptor Site of Shaker Potassium Channels. Neuron 10, 533-541 (1993), C.-C. Shieh & G.E. Kirsch: Mutational Analysis of Ion Conduction and Drug Binding Sites in the Inner Mouth of Voltage-Gated K^{+}-Channels. Biophys. J. 67, 2316-2325 (1994), o C. Miller: The Charybdotoxin Family of K^{+}-Channel-Blocking Peptide. Neuron 15, 5-10 (1995).

Por ejemplo, la identificación del sitio de unión de dicho fármaco por estudios de mutagénesis directa y proteína quimérica se pueden alcanzar por modificaciones en la secuencia primaria del (poli)péptido que afecta la afinidad del fármaco; esto normalmente permite precisamente acotar la cavidad de unión del fármaco.

En cuanto al paso (c), los siguientes protocolos pueden ser concebidos: Una vez el sitio efector para los fármacos ha sido trazado, los precisos residuos interaccionando con diferentes partes del fármaco pueden ser identificados por combinación de la información obtenida de estudios de mutagénesis (paso(b)) y simulaciones de ordenador de la estructura del sitio de unión (desde que un canal de potasio recientemente ha sido cristalizado en el campo, este puede ahora hacerse por cualquier persona experta en el campo sin más información) proporcionando que la precisa estructura tridimensional del fármaco sea conocida (si no, puede ser predecida por simulación computacional). Si dicho fármaco es asimismo un péptido, puede ser también mutado para determinar qué residuos interactúan con otros en la molécula heag.

Finalmente, en el paso (d) el fármaco puede ser modificado para mejorar su afinidad de unión o su potencia y especificidad. Si, por ejemplo, hay interacciones electrostáticas entre un residuo en particular de "heag" y alguna región de la molécula del fármaco, el cargo global en la región puede ser modificado para incrementar la interacción particular; adicionalmente, si estas interacciones ocurren con una región de heag que no es conservada con otros canales proteicos, es concebible que una mejora de la interacción mientras otros factores de unión mejorarán la especificidad del fármaco.

La identificación de sitios de unión puede ser asistida por programas de ordenador. Así, los programas de ordenador apropiados pueden ser usados para la identificación de sitios interactivos de un inhibidor putativo y el polipéptido de la invención por búsquedas de ordenador asistidas para motivos estructurales complementarios (Fassina, Imrnunomethods 5 (1994),114-120). Además sistemas de ordenador apropiados para el diseño por medio de ordenador del diseño de proteína y péptido son descritos en el anterior campo, por ejemplo, en Berry, Biochem. Soc. Traes. 22 (1994), 1033-1036; Wodak, Ann. N. Y. Acad. Sci. 501 (1987), 1-13; Pabo, Biochemistry 25 (1986),5987-5991. Modificaciones del fármaco pueden ser producidas, por ejemplo, por peptidomiméticos y otros inhibidores pueden también ser identificados por la síntesis de genotecas combinatorias peptidomiméticas a través de sucesivas modificaciones químicas y examinando los compuestos resultantes. Métodos para la generación y uso de genotecas combinatorias peptidomiméticas son descritas en el anterior campo, por ejemplo, en Ostresh, Methods in Enzymology 267 (1996), 220-234 y Dorner, Bioorg. Med. Chem. 4 (1996), 709-715. Además, la estructura tridimensional y/o cristalográfica de inhibidores del polipéptido de la invención puede ser usada para el diseño de inhibidores peptidomiméticos, por ejemplo, en combinación con el (poli)péptido de la invención (Rose, Biochemistry 35 (1996),12933-12944; Rutenber, Bioorg. Med. Chem. 4 (1996), 1545-1558).

Una estrategia ejemplar para identificar un inhibidor específico que puede ser usado de acuerdo con la presente invención se facilita en los ejemplos adjuntos.

La invención también se refiere a un método de identificar un inhibidor de la expresión del ácido nucleico de la invención o de una función del (poli)péptido de la invención que comprende:

\newpage

(a)

examinar un compuesto para la inhibición o reducción de la traducción en el que dicho compuesto es seleccionado desde oligonucleótidos antisentido y ribozimas; o

(b)

examinar un compuesto para la inhibición de la trascripción en el que dicho compuesto se une a la región promotora del gen codificando el (poli)péptido de la invención y preferiblemente con elementos sensibles de factor de transcripción de la misma; o

(c)

examinando péptidos o anticuerpos sospechosos para bloquear la actividad proliferativa del (poli)péptido de la invención para dicha actividad bloqueante.

En cuanto a la alternativa (b) mencionada anteriormente, puede ser ventajoso caracterizar primero la región del promotor y enclavar las secuencias sensibles de factores de trascripción en ello. Entonces sería posible manipular genéticamente el promotor para darle más sensibilidad a los represores o menos sensitivos a los potenciadores. Volviendo a la alternativa (c), puede ser ventajoso localizar primero parte o partes del canal iónico de la invención implicada en la generación de proliferación de enfermedades. Compuestos que han sido positivos en uno de los sistemas de ensayo son, evidencia vista, usables como inhibidores.

Peptidomiméticos, desarrollo de fagos y técnicas de genotecas combinatorias son bien conocidas en el campo y pueden ser empleadas por personas expertas en el campo sin más información para mejorar el fármaco o inhibidor que se identifica por el método básico referido en este punto más arriba.

En otra realización, la presente invención se refiere a un método de inhibición de la proliferación celular comprendiendo aplicar un inhibidor para la expresión del ácido nucleico de la invención o el (poli)péptido de la invención. El método de la invención se debe llevar a cabo in vitro o ex vitro.

La presente invención también se refiere a un método de pronóstico de cáncer y/o de enfermedades neurodegenerativas y/o psoriasis comprendiendo la evaluación de la expresión de la molécula del ácido nucleico de la invención o la de la presencia cuantitativa del (poli)péptido de la invención. En una presentación dicho cáncer es un carcinoma de mama o neuroblastoma, en una realización más preferida dicho cáncer es el adenocarcinoma de pecho, carcinoma de pecho de tipo ductal, o carcinoma de cerviz. En otra realización dicha enfermedad neurodegenerativa es la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la esclerosis amiotrófica lateral o esclerosis múltiple.

El método de la invención puede ser llevado a cabo en vitro o ex vivo. Adecuados protocolos para llevar a cabo el método de la invención son bien conocidos en el campo e incluyen, en cuanto a técnicas en vitro, el Northern blot para la evaluación del nivel de mRNa o el análisis de tejido por el uso de técnicas microscópicas, por ejemplo, anticuerpos que específicamente reconocen el (poli)péptido de la invención. Una o más de estas técnicas pueden ser combinada con PCR basada en técnicas que también o en combinación con más técnicas (convencionales) se puede usar para la evaluación citada más arriba.

En una presentación de los métodos de invención citados anteriormente, dicho mamífero es un humano, rata o ratón.

La presente invención además se refiere al uso de las moléculas de ácido nucleico de la invención para la preparación de una composición farmacéutica para su uso en terapia génica. Como se apunta aquí anteriormente, la terapia génica puede ser diseñada para inhibir la proliferación celular y así tratar cualquier enfermedad afectada consecuentemente como el cáncer o psoriasis en un modo específico. La invención particularmente concibe dos líneas independientes llevando a cabo tales protocolos de terapia génica:

(a) Mutagénesis del canal junto con la ingeniería química de agonistas H1 (preferiblemente de astemizol) para obtener un fármaco específico para eag humano

(b) Análisis cuantitativo y cualitativo de los niveles de expresión de eag en tejido canceroso, para diseñar un método de diagnóstico y/o pronóstico. Esto también permitiría el diseño de terapias genéticas contra tumores específicos.

El kit de la invención puede, inter alia, ser empleado en un número de métodos de diagnóstico mencionados anteriormente. El kit de la invención puede además contener ingredientes tales como marcadores de selección y componentes para el medio selectivo adecuados para la generación de células huésped transformadas y células de plantas transgénicas, tejido de planta o plantas. Además, el kit debe incluir soluciones tampón y sustratos para genes reporteros que deben estar presentes en el gen recombinante o vector de la invención. El kit de la invención debe ser usado ventajosamente para llevar a cabo el método de la invención y podría ser, inter alia, empleado en una variedad de aplicaciones mencionadas aquí, por ejemplo, en el campo de diagnóstico o como herramienta de investigación. Las partes del kit de la invención pueden ser empaquetados individualmente en viales o en combinación en unidades contenedores o multi-contenedores. La confección del kit sigue preferiblemente procedimientos estándar los cuales son conocidos por las personas expertas en el campo.

Las figuras muestran:

Figura 1. Proliferación de células CHO de tipo-salvaje (círculos) y de expresión de reag en función del tiempo. Las células se dispusieron en placas de 96 pocillos y a los tiempos indicados la sal tetrazolio MTT ^{6} (50 \mug/ml) se añadió a las placas. Después de cuatro horas de incubación en atmósfera humidificada (37ºC, 5%CO_{2}), la reacción se paró por la adición de 2 volúmenes de 10% SDS en 1M HCL. Los cristales de azul de formazan producidos en células vivas se solubilizaron durante la noche, y el color resultante se midió como densidad óptica a la longitud de onda indicada. Posibles efectos inespecíficos de la transfección en la proliferación celular pueden ser desechados, porque a) los resultados fueron comparables en tres líneas de células independientes de diferentes especies (rata, hámster y humano);b) transfección con clones diferentes independientes dieron los mismos resultados, y c) transfección con un canal de potasio diferente (Kvl.4) en el mismo vector (así con una tendencia para recombinar en el mismo sitio) dio resultados comparables a WT y no reprodujo los efectos de la transfección reag.

Figura 2. Proliferación de tipo salvaje (círculo) y células CHO expresando reag (triángulos), en presencia de 0,5% FCS. Esta concentración sérica no es capaz de mantener el crecimiento de células normales, pero células transfectadas completan casi tres círculos. Métodos como para la Figura 1.

Figura 3. Síntesis de ADN en células CHO expresando diferentes canales de potasio, en presencia de concentraciones normales (10%) o bajas (0,5%) de FCS. En células control, WT o células transfectadas con Kv1.4, los niveles de síntesis de ADN cayeron significativamente en presencia de baja concentración sérica, mientras que las células de expresión reag mantuvieron los mismos niveles de replicación tanto como en altas concentraciones séricas.

Figura 4. (A) Fotografías de placas con células de tipo salvaje, Kv1.4 transfectadas o NIH3T3 reag transfectadas. Las células se sembraron a baja densidad, y permitidas para crecer bajo condiciones estándar hasta que las células salvajes alcanzaron la confluencia. Las células entonces se fijaron con metanol y se tiñeron con azul de Giemsa. Bajo estas condiciones, ambas células de tipo salvaje y células de expresión Kvl.4 crecieron en monocapa, mientras las células de expresión reag formaron focos. (B) La formación de focos de las células NIH-3T3 transfectadas reag se compararon con células ransfectadas con rKvl.4 y con células tipo salvaje. El vector control (células transfectadas pcDNa3) produjo un fenotipo similar al de células tipo salvaje (no mostrados). La transfección transitoria fue llevada a cabo usando fosfato cálcico (33).Las células se mantuvieron en medio rico hasta que las células control alcanzaron la confluencia, entonces se fijaron con metanol y se tiñeron con azul de Giemsa.

Figura 5. Corrientes se produjeron como respuesta a despolarizaciones en células MCF7 bajo condiciones de alto voltaje. Las señales de la izquierda son corrientes celulares totales, las señales de la derecha se han obtenido en un parche hacia fuera. Tanto las corrientes macroscópicas como las relaciones I-V (C y D) son reminiscencias de corrientes reag.

Figura 6. La actividad de un canal simple en un parche de membrana hacia fuera alcanzó un voltaje de 0 mV, en presencia o ausencia de 5 \muM de astemizol. La solución pipeteada contenía 140 mM KCl, 10 mM BAPTA, 10 mM HEPES pH 7.2; la solución de baño contenía 140 mM NaCl, 2 mM CaCl_{2}, 2 mM MgCl_{2}, 2,5 mM KCl, 10 HEPES pH 7,2.

Figura 7. A. Síntesis de ADN en células MCF7 bajo diferentes bloqueantes eag. B. Niveles de síntesis de ADN HEK293 en presencia de astemizol, glibenclamida y terfenadina.

Figura 8. Curva dosis-respuesta para los efectos de dos antagonistas H1 en la síntesis de ADN en células MCF7 (CI50 7 y 10 Mm para LY91241 y astemizol respectivamente.)

Figura 9. Imágenes fluorescentes de control (no tratado, A) y células MCF7 tratadas con astemizol, (B) se tiñeron con Hoechst 33342. Notar en B la superficie más pequeña de los núcleos, y una densidad de células mucho más baja (debido a la muerte celular).

Figura 10. Secuencia nucleotídica de cADN eag humano de cerebro humano comparado con secuencia de rata y secuencias bovinas. Esas posiciones mostrando un diferente nucleótido en cualquiera de las secuencias están ensombrecidas.

Figura 11. Secuencias de aminoácidos de ambas variantes de corte y empalme obtenidas de la traducción de cADN eag humano, comparado con las correspondientes secuencias bovina, de ratón y de rata. Las cajas en negro indican un residuo diferente en cualquiera de las secuencias.

Figura 12. PCR-RT de ARN total de cerebro humano, glándula mamaria humana y células MCF-7. La amplificación produjo dos fragmentos específicos correspondientes a los esperados tamaños para heag 1 y 2 en cerebro, y la banda correspondiente a heag 1 en células MCF-7, mientras ninguna amplificación fue detectada en ARN normal de pecho.

Figura 13. La activación voltaje dependiente en alto potasio extracelular, 2 electrodos de alto voltaje: En el gráfico conductancia-voltaje, el voltaje para la activación media es cambiado por 40mV a la derecha en el canal heag con respecto al canal reag.

Figura 14. La formación de colonias en medio semisólido de células NIH-3T3 transfectadas con el ADN indicado. Las células se colocaron en placas en medio regular conteniendo 0,3% de agar en una placa con un 0,55% de medio de agar. Las colonias más grandes de 0,1 mm en diámetro se contaron 14 días después de la transfección. El promedio del número de colonias en al menos diez campos de microscopio contados se expresa por \mug de ADN usado en la transfección (excepto para los carriles "Solución tampón transfección" y "No tratado", donde los números son valores absolutos), reag y Kvl.4 fueron transfectados usando vectores pcADN3 o pTracer CMV.

Figura 15. (A) Southern blot de productos de PCR-RT de RNAs de diferentes tejidos humanos y células 293. Las señales del receptor de transferrina (TRF) se muestran al final. (B) Análisis de Southern blot de productos PCR-RT de ARNs totales de diferentes líneas celulares humanas y células epiteliales mamíferas de cultivos primarios (células epiteliales). Señales TRF se muestran más abajo.

Figura 16. (A) Tratamiento de líneas celulares tumorales de expresión heag con ODNs antisentido. (B) Corriente heag en células de neuroblastoma SHSY-5Y. (C) Densidad de corriente en células SHSY-5Y tratadas con ODNs antisentido. (D) Inhibición de la síntesis de ADN en células cancerígenas humanas (EFM19, HeLa y SHSY-5Y) por ODNs antisentido orientado contra heag.

Figura 17. (A) La implantación subcutánea de células CHOhEAG causaron tumores agresivos que crecieron rápidamente y pronto rompieron la piel de los ratones vehículos. La fotografía fue tomada en la tercera semana de post-implantación de 2x10^{6} células. (B,C) El promedio de masa de tumores CHOhEAG fue significativamente más grande que el de los tumores CHOKv ambos de dos semanas (B; media \pm S.E.M.; p=0,002) o tres semanas de implantación (C; media \pm S.E.M.; p=0,003). (D) Tumores CHOhEAG y (E) tumores CHOKv fotografiados in situ. Las principales diferencias macroscópicas son el color más oscuro y la fijación a la piel del tumor CHOhEAG. (F,G) Tumores CHOhEAG (F) y CHOKv (G) fueron cortados para mostrar abiertamente la gran extensión de la necrosis (puntas de flecha) en la anterior. (H, I) El grado más grande de necrosis y la fijación a la piel son también evidentes microscópicamente después de la incrustación en parafina y la tinción eosina-hematoxilina. La histología es comparable en ambas micrografias, pero en (H) un área necrótica mucho más grande se observa (puntas de flecha), y no hay frontera entre la grasa subcutánea y el tumor. (Barras de escala, 100 \mug) (J) Como una medida cuantitativa de estas imágenes, la anchura promedio del área vital en tumores CHOKv fue significativamente más grande que la de los tumores CHOhEAG (media \pm S.E.M.; p<0,0005).

Figura 18: Ensayos de proliferación de células CHO rEAG-transfectadas (A-C). Curvas de crecimiento de células CHO transfectadas con rEAG (círculos) en comparación con células sencillas (triángulos) en 10% (símbolos rellenados) o 0,5% (símbolos abiertos) de suero de ternera fetal. Los valores se refieren a los únicos medidos después de 12 horas en cultivo (tiempo 0 en el gráfico), y representan una media \pm S.E.M. de ocho pocillos en la misma placa. Las líneas celulares se establecieron por selección a través de la resistencia G-418 codificada en el vector pcDNA3. La hidrólisis MTT (22) se usó para medir la actividad metabólica de células viables. El suero se diluyó cuidadosamente 12 horas después de la disposición en placas. (B) Incremento en la actividad metabólica durante las primeras 12 horas después de la extracción del bloque fase-S. Para la sincronización de células, 2mM de timidina se añadieron al medio de cultivo durante 12 horas. La timidina se extrajo del medio durante 12 horas adicionales, y entonces un segundo pulso de parada fue aplicado durante 12 horas. Las células fueron entonces tripsinizadas y dispuestas en placas para la determinación de la actividad metabólica y la síntesis de ADN. (C) Incorporación BrdU durante las primeras 12 horas después de la extracción del bloque de fase-S durante 12 horas de incubación en 10% de FCS, o en presencia de 0,5% de FCS (24 horas de incubación) La incorporación BrdU se midió usando "el kit de detección y marcaje BrdU" de Boehringer-Mannheim, siguiendo las indicaciones del fabricante. Las barras representan la media \pm S.D. para células CHO de tipo salvaje (barras claras), células Kvl.4 transfectadas (barras sombreadas) y células eag-transfectadas (barras oscuras). La incorporación de BrdU se cuantifica como densidad óptica a 405 nm (referencia 490 nm) producido en el sustrato ABTST^{TM}por emparejamiento peroxidasa al anticuerpo anti BrdU.

Los ejemplos ilustran la invención.

Ejemplo 1 Clonaje del canal iónico de K^{+}

El mRNA fue purificado del RNA total obtenido de células MCF-7 siguiendo procedimientos estándar. Entonces, el cADN se preparó por trascripción reversa con la transcriptasa reversa Superscript II; este cADN se usó como molde para la amplificación por PCR usando oligonucleótidos degenerados diseñados para emparejar secuencias eag altamente conservadas. Tras la amplificación, un fragmento SacII/SacII de eag de rata se usó como sonda para el análisis por Southern blot de los resultados. Estas bandas mostrando hibridación positiva fueron clonadas a continuación en el vector pGEM-T (Promega) y secuenciadas. Todas éstas dieron secuencias correspondientes a HERG.

Los oligonucleótidos específicos diseñados genéticamente para evitar la amplificación del cDNA HERG fueron entonces diseñados, tomados en consideración en eag de rata, ratón y bovino. Buscamos secuencias con alta homología entre varios clones eag pero con máxima divergencia a la secuencia HERG.

Las secuencias de los oligonucleótidos fueron las siguientes:

5'-CAGAA(T,C)AA(T,C)GTGGC(A,C,T,G,)TGGCT

5'-TCACT(G,A)AAGATCTATA(A,G)TC

Tras la amplificación por PCR, la banda del tamaño esperado se clonó en pGEMT y se secuenció. La secuencia obtenida mostró elevada homología con el eag de rata (nucleótidos 942-1108).

Esta banda se marcó y se usó como sonda para cribar una genoteca de cDNA de glándula mamaria. Tras el cribaje de 2x10^{6} fagos, no se encontraron clones positivos.

Entonces usamos oligonucleótidos específicos para analizar cDNA usando PCR a partir de corazón humano y cerebro humano (obtenidos del RNA total obtenido de Clontech). Dos productos de PCR del cerebro se secuenciaron, y aquellas secuencias correspondientes a las dos variantes de corte y empalme alternativas de eag. Para además ensayar la posibilidad de clonar la molécula de longitud total del cerebro humano, realizamos un análisis por PCR de la genoteca de cDNA humana, y comparando este resultado con el mismo experimento en la genoteca de glándula de mama humana (ambas de Clontech). Sólo la genoteca de cerebro dio resultados positivos.

A continuación, el fragmento amplificado se empleó para cribar la genoteca de cerebro humana (2 vueltas, l0^{6} fagos) y varios clones se clonaron en el vector pBSK se encontraron y secuenciaron. Todos estos correspondían a la parte central de la molécula, pero habían perdido los extremos 5' y 3'. El más largo de estos clones positivos se usó para preparar una sonda y re-cribar la genoteca (de nuevo dos vueltas, 2x10^{6} clones).

Las secuencias obtenidas en este caso corresponden a la parte de la secuencia codificante (aproximadamente 400 pb 5' se perdieron hasta el codón de inicio) y una secuencia larga sin traducir 3'. Desde que el fragmento cercano al extremo 5' de la molécula empezó en todos los casos con un sitio EcoRI, se sospechó que el sitio estaba realmente presente en la secuencia heag, y que se había perdido en la subclonación de los fragmentos en los vectores para la secuenciación.

Para obtener la secuencia de longitud total, agrupamos aquellos fagos que llevaban fragmentos cercanos al extremo 5' y los analizamos por amplificación por PCR, usando la secuencia 3' al sitio EcoRI mencionado y una secuencia desde lambda gt10 como cebadores de la PCR. Tras la fraccionación sucesiva de los agrupados, dos fagos que llevaban el extremo 5' de la secuencia codificante se obtuvieron, y uno de estos contenía una parte de la región 5' sin traducir.

Una vez conocimos la secuencia completa, nosotros ensamblamos el clon total partiendo de los dos fagos, uno de ellos conteniendo el 3' UTR y la mayoría de la secuencia codificante, y el otro conteniendo el extremo 5'. El primer fragmento se extrajo del fago mediante digestión SphI/HindIII, y se subclonó en pBKS- para producir pBKSheag 1. En éste fue, un fragmento SphI-SphI de 1,2 kbp que también se eliminó del clon, y fue necesario para reintroducirlo posteriormente. El fragmento conteniendo el extremo 5' se extrajo mediante la digestión HindIII/MunI. Este fragmento se ligó con un digerido HindIII/MunI de pBKSheag 1. Sólo usando este procedimiento fuimos capaces de obtener el clon de longitud total en un plásmido simple. Entonces necesitamos para reintroducir el fragmento SphI-SphI desde que se ha deleccionado uno de los sitios SphI. A continuación, un fragmento Eagl/Notl se subclonó en el sitio Notl del vector pCDNA3, para eliminar las secuencias de fago contaminantes y para obtener un vector apropiado para la expresión funcional del canal. Las secuencias finalmente obtenidas se describen en el listado de secuencias como ID de SEC No. 1 y ID de SEC No. 2.

Ejemplo 2 Identificación de inhibidores que específicamente bloquean la acción de eag humano

Otro miembro de la familia eag, HERG^{11-16}, se ha relacionado con su forma familiar de síndrome QT largo (LQT). Esto ha permitido identificar varios bloqueadores de HERG basándose en su capacidad para inducir arritmias de tipo LQT. Así, ciertos bloqueadores del receptor de histamina H1; tales como astemizol y terfenadina, así como fármacos antiarrítmicos de clase III (dofetilida, E-4031) son bloqueadores potentes y específicos de HERG15. No obstante, para los canales eag, aún no se han descrito bloqueadores específicos. Debido a la similitud de la secuencia entre HERG y los canales eag, ambos grupos de fármacos en reag se ensayaron de acuerdo con la presente invención. Los bloqueadores H1 también afectaron a reag, mientras que el canal es también insensible a los antiarrítmicos de clase III (dofetilida). Esto proporciona una herramienta útil para bloquear selectivamente los canales de tipo eag y para descartar posibles efectos de los canales HERG (que están también presentes en las células MCF7). El efecto de uno de estos fármacos (astemizol 5 \muM) se muestra en canales eag humanos putativos simples en la Fig. b.

Además se ensayó si varios reag y otros bloqueadores de los canales de potasio son capaces de inhibir el crecimiento de las células MCF7. Como control "positivo" glibenclamida, un bloqueador del canal de potasio ATP-sensible también se incluyó, desde que se ha descrito para inhibir la proliferación de esta línea celular^{2}. Para determinar la tasa de síntesis de DNA, las células se dispusieron en placas microtituladas de 96 pocillos a una densidad de \approx 10^{5} células/ml en la ausencia de factores de crecimiento. Tras el cultivo durante 24 horas, las células se estimularon mediante adición de 10% FCS en presencia de BrdU. La cantidad de BrdU incorporada al DNA sintetizado de nuevo se determina usando un anticuerpo comercial (Boehringer Mannheim). Los fármacos ensayados se añadieron al mismo tiempo o 12 horas antes de la estimulación. En una línea celular humana diferente, HEK293, la adición de 10 \muM de astemizol o 100 \muM de glibenclamida no redujo significativamente la síntesis de DNA, mientras que la terfenadina (14 \muM) produjo una inhibición fuerte. Por esta razón, sólo los efectos del astemizol (y su análogo íntimamente relacionado LY91241) se consideraron, y aquellos producidos por terfenadina (aunque las células MCF7 son significativamente más sensibles a la inhibición del crecimiento por terfenadina que las células control) descartadas. En las células MCF7, 5 \muM de astemizol redujeron la síntesis de DNA en un 40%, mientras que la misma concentración de dofetilida bloqueadora específica de HERG no produjo efectos significativos. Concentraciones diez veces mayores (50 \muM) de otros bloqueadores de canal de potasio (quinidina o glibenclamida) se requirieron para inducir un efecto similar. Una curva dosis-respuesta para los efectos del astemizol en la síntesis de DNA en las células MCF7 se describe en la Figura 8. La mitad del efecto máximo se obtuvo para 14 \muM astemizol.

En un intento para esclarecer el mecanismo subyacente a la inhibición de la proliferación en las células MCF7, la morfología nuclear de las células tratadas con 5 \muM de astemizol se comprobaron, usando la cepa nuclear supravital Hoechst 33342. Tras 24 horas de tratamiento, la mayoría de las células mostraron fragmentación y condensación nuclear, características típicas de la muerte celular apoptótica (Fig. 9).

En conclusión, un equivalente humano de los canales reag están presentes en las células cancerosas humanas, y éstos tienen la capacidad de inducir transformación maligna en varios tipos celulares diferentes.

Ejemplo 3 Expresión de heag en diferentes tejidos humanos

500 ng del RNA total de diferentes tejidos humanos (o 5 ng de poliA+ RNA, para la medula espinal) se transcribieron de forma reversa y se amplificaron usando un par de oligonucleótidos de las secuencias 5'-CGCATGAACTACCTGAAGACG (forward) y 5'-TCTGTGGATGGGGCGATGTTC (reversa). El DNA amplificado se analizó por Southern blot usando sondas eag humanas específicas (un fragmento de 1,5 Kb EcoRI del núcleo del canal). Entre los RNAs ensayados, sólo el RNA total de cerebro dio señales positivas. RNAs de la medula espinal, glándula adrenal, músculo esquelético, corazón, traquea, hígado, riñón y glándula mamaria fueron negativas. La integridad del RNA se comprobó usando amplificación de transferrina. Usando el mismo logro, la expresión de heag en varias líneas celulares humanas tumorales se comprobó, en: MCF-7 (adenocarcinoma de pecho), BT-474 (carcinoma ductal de pecho, de un tumor sólido), EFM-19 (carcinoma de mama, tipo ductal, del fluido pleural), COLA-824 (carcinoma de pecho, del fluido pleural), SHSY5Y (neuroblastoma).

En contraposición a los tejidos normales, todas las líneas celulares cancerosas ensayadas fueron positivas para la expresión de heag.

Además, el Southern blot de productos RT-PCR de RNAs de diferentes tejidos humanos y células 293 mostraron que sólo en el RNA de cerebro las dos bandas correspondientes a heag A y B pueden ser amplificadas e identificadas. El receptor de las señales de transferrina (TFR) se mostraron al final (Fig. 15A). Además, un análisis por Southern blot de los productos de RT-PCR de los RNAs totales de diferentes líneas celulares humanas y células epiteliales de mamíferos en cultivos primarios (células epiteliales). Las señales TRF se muestran al final. Los RNAs de las diferentes líneas celulares (34) y los RNAs comerciales de los tejidos humanos (Clontech) se sometieron a RT-PCR de tubo simple (35). El RNA total se usó a excepción de la medula espinal, donde se usó el poli(A)^{+} RNA (Las secuencias cebadoras fueron: forward: 5'-CGCATGAACTACTGAAGACG, y reverso: S'-TCTGTGGATGGGGCGATGTTC. 5'-TCAGCCCAGCAGAAGCA TTAT y reverso: 5'-CTGGCAGCGTGTGAGAGC se usaron para controlar el RNA y la realización de la PCR). Los cebadores específicos para TFR se usaron para controlar el RNA y la realización PCR. Estos ODNs se diseñaron de acuerdo con la secuencia TFR publicada (36), partiendo desde el exon 11 y extendiéndose hasta el exon 14 (37). Así, junto con la amplificación de los dos fragmentos de corte y empalme de heag y controlando la ausencia de transcriptasa reversa, se excluyó un falso positivo debido a contaminación con DNA genómico. 50 \mul (heag) o 15 \mul (TFR) de reacciones de PCR se analizaron en geles de agarosa al 2%. El DNA se transfirió a membranas y se hibridó consecutivamente a elevada astringencia con sondas cebadas al azar marcadas con [^{32}P]-dCTP consistentes de fragmentos de 980 pb heag y el fragmento TFR amplificado de RNA de cerebro.

Ejemplo 4 Expresión de heag in vivo

Para determinar si la expresión de heag es ventajosa para las células tumorales in vivo, los inventores realizaron implantes subcutáneos de células CHO expresando el canal (células CHOhEAG) en el flanco de la hembra de ratón scid (inmunodeficiencia combinada severa, 33). Las células CHOKv se usaron como control. Por lo tanto, 2x10^{6} células CHOhEAG o CHO-Kv1.4 suspendidas en 100 \mul de PBS se implantaron subcutáneamente en el flanco de hembras de ratón scid Fox Chase de 6-8 semanas de edad (C.B-17/Icr sicd/scid) obtenidas de Bomholtgard, Ry, Dinamarca. La presencia de tumores se comprobó cada segundo día mediante inspección táctil del ratón. Tras dos o tres semanas, los animales se sacrificaron mediante dislocación cervical y los tumores diseccionados y fijados en paraformaldehído para la consiguiente inclusión en parafina y tinción. La identidad de las células CHOhEAG se estableció mediante iluminación UV de los tumores para evocar fluorescencia a partir de la fluorescencia verde de la proteína codificada en el vector pTracer (Invitrogen). Una semana tras el implante, todos los ratones inyectados con CHOhEAG llevando tumores detectables por palpación, mientras que no se observaron masas mayores de 1 mm en los controles. Durante la segunda semana post-implante, los tumores expresando heag alcanzaron un exceso de 5 mm en diámetro y visibilidad emergida a través de la piel en la mayoría de los casos (Fig. 17A); los ratones se sacrificaron tras dos (N=6) o tres semanas (N=7). Sólo uno de los 11 animales control usado estaba libre de tumores visibles; todos los 13 animales inyectados con CHOhEAG mostraron tumores. La masa promedio (Fig. 17B, C) de los tumores expresando heag fue significativamente mayor que los control, especialmente dos semanas tras la implantación (Fig. 17B). A partir de las observaciones macroscópicas, los tumores parecieron friables y hemorrágicos; los tumores CHOhEAG fueron más oscuros que los control y se adhirieron a la piel (Fig. 17D, E) en cualquier ratón inyectado CHOhEAG a las dos semanas. Seis de los siete ratones exhibieron características similares a las tres semanas. En contraposición, el tumores puede diseccionarse fácilmente a partir de la piel en todos los ratones control tras dos semanas, y en cinco de los seis ratones a las tres semanas. El tejido inferior al tumor apareció sin afectarse en todos los casos. El color oscuro fue debido al gran contenido de necrosis intratumoral (Fig. 17 F, G, flechas), confirmado mediante histología (Fig. 17 H, I, puntas de las flechas), indicando un mayor crecimiento de los tumores CHOhEAG. El grosor del área vital en los tumores expresando EAG fue significativamente inferior al control (Fig. 17J). El crecimiento rápido del tumor puede explicar la necrosis intratumoral masiva en el grupo CHOhEAG. Esto puede también explicar las diferencias potenciales en la masa de los tumores dos semanas tras el implante, desde que los tumores CHOhEAG pararían de crecer debido a necrosis masivas. Estos datos apoyan fuertemente que la expresión de los tumores heag creció rápidamente y son más agresivos que los tumores CHOKv.

Ejemplo 5 Inhibición de heag

Se asume que la expresión de heag en algunas células tumorales no es la consecuencia de su crecimiento anormal, pero que este canal K^{+} es necesario para su proliferación. Por lo tanto, la inhibición de la expresión heag con oligodesoxinucleótidos antisentido (ODNs) debería disminuir la tasa de proliferación en estas células tumorales. Por lo tanto, un ODN fosforotioato de 19-meros (5'-CAGCCATGGTCATCCTCCC) abarcando el codón de inicio putativo de heag se usó para ensayar la inhibición de la proliferación. El ODN sentido y una secuencia mezclada (gtcggtaccagtaggaggg) se usaron como control. Los datos mostrados en la Figura 16A confirman la eficiencia del tratamiento ODN antisentido en la reducción del contenido de mRNA de heag en células EFM. Una reducción en las corrientes de K^{+} mediadas por heag en células SHSY-5Y por tratamiento con ODN antisentido se muestran en la Fig. 16 B y
C.

El tratamiento de las líneas celulares tumorales expresando heag con ODNs antisentido redujeron significativamente el rendimiento de los productos amplificados por PCR. Las células EFM-19 se trataron con 10 \mug/ml DAC30 (carriles "C") o 10 \mug/ml DAC30 (Eurogentec) más 1 \muM ODN antisentido (carriles "AS") durante toda la noche, el RNA total se extrajo y se ensayó y las mismas condiciones que las descritas en el Ejemplo 3, con ODNs diseñados tanto para amplificar heag o el receptor de transferrina. Las flechas en la Fig. 16A marcan los tamaños esperados de los fragmentos amplificados. Además, para diseccionar la corriente heag en células del neuroblastoma SHSY-5Y, los inventores utilizaron la dependencia de voltaje de la activación de eag (30) en presencia de Mg^{2+} extracelular. La corriente se midió tras una despolarización a +60 mV desde -120 mV (Fig. 16B, líneas grises). La primera parte de la señal restada (Fig. 16B, línea negra) corresponde a la corriente eag que aún no se ha activado cuando el potencial de mantenimiento es muy negativo (-120 mV), pero se hace evidente si el potencial de mantenimiento es -60 mV. La corriente promedio entre 19 y 21 ms se escogió para determinar la densidad de la corriente. La densidad de corriente en las células SHSY-5Y se trataron con ODNs antisentido fue significativamente reducida en comparación con las células control (Las determinaciones electrofisiológicas se realizaron usando protocolos estándar en la configuración celular total de la técnica patch-clamp (Hamill, O.P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F.J. Pflügers Arch- Eur. J. Physiol 391, 85 (1981)}, con una solución extracelular conteniendo (mM) 140 NaCl, 2,5 KCl, 2 CaCl2, 2 MgCl2, 10 Hepes/NaOH pH 7,2, 10 glucosa. La solución pipeteada fue (mM) 140 KCl, 10 BAPTA, 10 Hepes/KOH pH 7,2). Las células se trataron durante toda la noche con ODN antisentido 1 \muM conteniendo ODN marcado con fluoresceína. Las corrientes se determinaron de 1 a 3 días después en células que mostraban fluorescencia en su núcleo. Las barras en la Fig. 16C representan el promedio \pm S.E.M. para 9 células (control) o 25 células (antisentido). Sólo las corrientes hacia fuera se evaluaron en el análisis. Además, la inhibición de la síntesis de DNA en células de cáncer humano (EFM-19, HeLa y SHSY-5Y) mediante ODNs antisentido dirigidos contra heag se investigaron. La síntesis de DNA se expresó en relación a la incorporación de BrdU en ausencia de ODNs. Las condiciones de recogida en las células usando ODN antisentido marcado con fluoresceína se optimizó. Las células se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 105 células/ml. Un día tras la disposición en placas, las células se lavaron con medio de cultivo y se añadió el ODN (concentración final 10 \muM). El ODN que se había mezclado previamente con 20 \mug/ml del reactivo de transfección DAC-30 (Eurogentec) en medio libre de suero y se permitió incubar a temperatura ambiente durante 20-30 min. La mezcla entonces se añadió como una dilución 1:1 en medio de cultivo y se mantuvo en contacto con las células durante toda la noche. Tras esta incubación, las células se lavaron y se marcaron con BrdU (l00 \muM) durante 2 h. La incorporación se detectó usando el kit de Boehringer Mannheim y se midió como unidades de DO a 405 nm (referencia 490 nm) tras restar la incorporación de fondo no específica. (Fig. 16D). Las barras indican el promedio \pm S.D. para ocho pocillos por condición en un experimento
representativo.

Glosario y lista de abreviaciones Líneas celulares

CHO	CHO-K1 (ATCC CCL 61)	Ovario de hámster chino Cricetulus griseus
HEK293	293 (ATCC CRL 1573)	Riñón embrionario humano primario transformado
NIH3T3	(ATCC CRL 1658)	Fibroblasto de ratón embrión Swiss
MCF7	(ATCC HTB 22)	Adenocarcinoma de mama humano
WT	Células de tipo salvaje

Genes y productos génicos

eag	ether-á-gago canal de potasio
HERG	\begin{minipage}[t]{130mm}Gen relacionado-Eag-Humano. Codifica por un canal de potasio rectificador interiormente principalmente expresado en el corazón.\end{minipage}
Kvl.4	\begin{minipage}[t]{130mm} Canal de potasio dependiente de voltaje inactivante. Inicialmente clonado a partir de cerebro de rata, está presente en muchos otros tejidos.\end{minipage}

Otros

EGF	Factor de crecimiento epidérmico
PDGF	Factor de crecimiento derivado de plaquetas
FCS	Suero de ternera fetal
1-V relación	Relación corriente-voltaje
LQT	Largo Q-T (intervalo entre ondas Q y T en el electrocardiograma).
	Induce graves arritmias debido a los defectos de repolarización.
BrdU	5-Bromo-2'-desoxiuridina. Estructura análoga a la timidina.
IC50	Concentración que produce el 50% de la inhibición
RT-PCR	\begin{minipage}[t]{130mm} Reacción en cadena de la polimerasa de cDNA producida por trascripción reversa en el mismo tubo.\end{minipage}

Referencias

1. Moody, W. J. (1995). Critical periods of early development created by the coordínate modulation of ion channel properties. Perspect Dev Neurobiol 2, 309-315.

2. Woodfork, K. A., Wonderlin, W. F., Peterson, V. A., and Strobl, J. S. (1995). Inhibition of ATP-sensitiva potassium channels causes reversible cell-cycle arrest of human breast cancer cells in tissue cultura. J Cell Physiol 162, 163-71.

3. Lepple Wienhues, A., Berweck, S., Bohmig, M., Leo, C. P., Meyling, B., Garbe, c., and Wiederholt, M. (1996). K^{+} channels and the intracellular calcium signal in human melanoma cell proliferation. J Membr Biol 151,149-57.

4. Wonderlin, W. F., Woodfork, K. A., and Strobl, J. S. (1995). Changes in membrane potential during the progression of MCF-7 human mammary tumor celis through the cell cycle. J Cell Physio1 165,177-85.

5. Brüggemann; A. Stühmer, W., and Pardo, L.A. (1997). Mitosis-promoting factor-mediated suppression of a cloned delayed rectifier potassium channel expressed in Xenopus oocytes. Proc Nat Acad Sci USA 94, 537-542.

6. Mosmann, T. (1983). Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival application to proliferation and cytotoxicity assays. J. Immunol. Meth. 65, 55-63.

7. Muir, D., Varon, S., and Manthorpe, M. (1990). An enzyme-linked immunosorbent assay for bromodeoxyuridine incorporation using fixed microcultures. Anal. Biochem. 185, 377-82.

8. Magaud, J. P., Sargent, I., and Mason, D. Y. (1988). Detection of human white cell proliferative responses by immunoenzymatic measurement of bromodeoxy-uridine uptake. J. Immunol. Meth. 106, 95-100.

9. Huong, P.L., Kolk, A.H., Eggelte, T.A., Verstijnen, C. P., Gilis, H., and Hendriks, J. T. (1991). Measurement of amigan specific lymphocyte proliferation using 5-bromo-deoxyuridine incorporation. An easy and low cost alternative to radioactive thymidine incorporation. J. Immunol. Meth. 140, 243-8.

10. Ellwart, J., and Dormer, P. (1985). Effect of 5-fluoro-2'-deoxyuridine (FdUrd) on 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdUrd) incorporation into DNA measured with a monoclonal BrdUrd antibody and by the BrdUrdlHoechst quenching effect. Cytometry 6, 513-20.

11. Benson, D. W., MacRae, C. A., Vesely, M. R., Walsh, E. P., Serdrnan, J. G., Seidman, C. E., and Satler, C. A. (1996). Missense mutation in the pare region of HERG causes familial long QT syndrome. Circulation 93, 1791-5.

12. Curran, M.E., Splawski, I.,Timothy, K.W., Vincent, G. M., Green, E. D., and Keating, M. T. (1995). A molecular basis for cardiac arrhythmia: HERG mutations cause long QT syndrome. Cell 80, 795-803.

13. Sanguinetti, M. C., Jiang, C., Curran, M. E., and Keating, M. T. (1995). A mechanistic link between an inherited and an acquired cardiac arrhythmia: HERG encodes the IKr potassium channel. Cell 81, 299-307.

14. Spector, P. S., Curran, M. E., Keating, M. T., and Sanguinetti, M. C. (1996). Class III antiarrhythmic drugs block HERG, a human cardiac delayed rectifier K^{+} channel. Open-channel block by methanesulfonanilides. Circ Res 78, 499-503.

15. Trudeau, M. C., Warmke, J. W., Ganetzky, B., and Robertson, G. A. (1995). HERG, ahuman inward rectifier in the voltage gated potassium channel family. Science 269, 92-5.

16. Suessbrich, H., Waldegger, S., Lang, F., and Busch, A. E. (1996). Blockade of HERG channels expressed in Xenopus oocytes by the histamina receptor antagonista terfenadine and astemizole. FEBS Lett 385, 77-80.

17. Por ejemplo, ver: DeCoursey, T.E., Chandy, K.G., Gupta, S., Cahalan, M.D. Natura 307, 465 (1984); Mauro, T., Dixon, D.B., Komuves, L., Hanley, K., Pappone, P.A. J. Invest. Dermat.108, 864 (1997).

18. Rouzaire-Dubois, B. and Dubois, J.M. J. Physiol. 510, 93 (1998).

19. Arcangeli, A., L. Bianchi, et al. J. Physiol. 489, 455-471(1995). Bianchi, L. et al., Cancer Res. 58, 815-822 (1998).

20. Brüggemann, A., S '' er, W., Pardo, L.A. Proc. Natl. Atad. Sci. USA. 94, 537 (1997). Pardo, L.A., Brüggemann, A., Camacho, J., S '' er, W. J. Cell. Biol.143, 767 (1998).

21. Ludwig, J., et al., EMBO J. 13, 4451 (1994).

22. Mosmann, T. J. Immunol. Meth. 65, 55 (1983). Las células se incubaron con MTT (azul de tiazolilo) 50 \mug/ml duarnte 4h, y los cristales de formazan se solubilizaron en 10% SDS, 1O mM HCl durante 12-14 h. La densidad óptica a 570 nm se midió usando un lector ELISA, con una longitud de onda de referencia de 650 nm.

23. Stein, G.S. et al., in Cell Growth and Apoptosis. A Practical Approach, G.P. Studzinski, Ed. (IRL Press, Oxford, 1995) pp.193-203.

24. Jainchill, J.L., Aaronson, S.A., Todaro, G.J. J. Virol. 4, 549 (1969).

25. Hermouet, S., Merendino, J.J., Jr., Gutkind, S., Spiegel, A.M. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 10455 (1991).

26. Los números de acceso GenBank para las secuencias mostradas en este escrito son AF078741 (heag A) y AF078742 (heag B).

27. Occhiodoro, T. et al., FEBS Lett. 434,177 (1998).

28. Warmke, J.W. and Ganetzki, B. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91, 3438 (1994). Frings, S., et al., J. Gen. Physiol.1 l l, 583 (1998).

29. Heng, H.H.Q., Squire,J., Tsui,L.-C. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 9509 (1992); Heng,H.H.Q., and Tsui, L.-C. Chromosoma,102, 325 (1993). Agradecemos la colaboración del Dr. Henry Heng (SeeDNA Biotech, Downsview, Ontario, Canada) para el análisis FISH.

30. Terlau, H., et al., Pflügers Arch- -Eur. J. Physiol., 432, 301 (1996). Terlau, H., Heinemann, S.H., Stühmer, W., Pongs, O., Ludwig, J. J. Physiol., 502, 537-543 (1997). Meyer, R: and Heinemann, S.H. J. Physiol. 508, 49 (1998).

31. Bijlenga, P., et al. J. Physiol. 512, 317 (1998).

32. Bosma, G.C., et al. Nature 301, 527-530 (1987)

33. Chen, C. y Okayama, H. Mal. Cell Biol. 7,2745 (1987).

34. Chomczynski, P. y Sacchi, N. Anal. Biochem. 1 62, 156(1987).

35. Soto, F., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 3684 (1996).

36. McClelland, A., Kühn, L.C., Ruddle, F.H. Cell 39, 267 (1984). Schneider, C., Owen, M.J., Banville, D., Williams, J.G. Nature 311, 675 (1984).

37. Evans, P. and Kemp, J. Gene 199,123 (1997).

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i)

SOLICITANTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e. V.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: ninguna

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ESTADO: ninguno

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Berlin

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAIS: Alemania

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL (ZIP): ninguno

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Nuevos canales iónicos de K^{+} humanos y aplicaciones terapéuticas de los mismos

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 14

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

FORMA DE LECTURA POR ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE MEDIO: Disco flexible

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: PC IBM compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

PROGRAMAS: PatentIn Release #1.0, Versión #1.30 (EPO)

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:1

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 3002 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA : cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 1

\vskip1.000000\baselineskip

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(Secuencia pasa a página siguiente)

1

2

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(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:2

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 3083 PARES DE BASES

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA : cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 2

\vskip1.000000\baselineskip

3

4

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:3

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 962 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA : proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 3

\vskip1.000000\baselineskip

5

6

7

8

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:4

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 32 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA : proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 4

9

10

11

12

13

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:5

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA : otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCAAACACAC ACACCAGC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:6

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA : otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGTGGATGTT ATCTTTTTGG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:7

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA : otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGAGGATGA CCATGGCT

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:8

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 25 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA : otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 8

\vskip1.000000\baselineskip

CAGAA (T, C) AA (T, C) GTGGC (A, C, T, G,) TGGCT

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:9

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA : otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 9

\vskip1.000000\baselineskip

TCACT (G, A) AAG ATCTATA (A, G) TC

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:10

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA : otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGCATGAACT ACCTGAAGAC G

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:11

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA : otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCTGTGGATG GGGCGATGTT C

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:12

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA : otro ácido nucleico

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(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido sintético"

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 12

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\hskip-.1em\dddseqskip

GGGAGGATGA CCATGGCT

\hfill

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(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:13

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 2886 pares de bases

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(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

TIPO DE CADENA: doble

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA : cDNA

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 13

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(Secuencia pasa a página siguiente)

15

16

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(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:14

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 2967 pares de bases

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(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

TIPO DE CADENA: doble

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA : cDNA

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 14

17

18

Claims (33)

1. Una molécula de ácido nucleico comprendiendo una molécula de ácido nucleico codificando un (poli)péptido con una función del canal eag iónico K^{+} humano con una conductancia de canal simple en potasio asimétrico a 0 mV de alrededor de 6 pS que es

(a)

una molécula de ácido nucleico comprendiendo una molécula de ácido nucleico codificando el polipéptido con la secuencia de aminoácidos de ID de SEC Nº 3 ó 4;

(b)

una molécula de ácido nucleico comprendiendo la molécula de ácido nucleico con la secuencia de DNA de ID de SEC Nº: 13 ó 14;

(c)

una molécula de ácido nucleico hibridando a la cadena complementaria de una molécula de ácido nucleico de (a) o (b); o

(d)

una molécula de ácido nucleico siendo degenerada a la secuencia de la molécula de ácido nucleico de (c).

2. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1 que es DNA.

3. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1 que es RNA.

4. La molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 3 codificando una proteína de fusión.

5. Un vector comprendiendo la molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 4.

6. El vector de la reivindicación 5 que es un vector de expresión y/o un gen diana o un vector de transferencia génica.

7. Un huésped transformado con un vector de la reivindicación 5 ó 6.

8. El huésped de la reivindicación 7 que es una célula mamífera, una célula fúngica, una célula vegetal o una célula de insecto o una célula bacteriana.

9. Un método para producir el (poli)péptido codificado por la molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 comprendiendo el cultivo de un huésped de la reivindicación 7 ó 8 y aislando el (poli)péptido producido.

10. Un (poli)péptido codificado por el ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o producido por el método de la reivindicación 9.

11. Un anticuerpo específicamente dirigido al (poli)péptido de la reivindicación 10.

12. El anticuerpo de la reivindicación 11 que es un anticuerpo monoclonal.

13. Una composición farmacéutica que comprende el vector de la reivindicación 5, el (poli)péptido de la reivindicación 10 y/o el anticuerpo de la reivindicación 11 ó 12 y un vehículo farmacéuticamente aceptable y/o diluyente y/o excipiente.

14. Una composición diagnóstica comprendiendo una molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, el vector de la reivindicación 5, el (poli)péptido de la reivindicación 10 y/o el anticuerpo de la reivindicación 11 ó 12.

15. El uso de un inhibidor de la expresión o sobreexpresión de la secuencia de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 4 para la preparación de una composición farmacéutica para la prevención o tratamiento del cáncer, psoriasis, o una enfermedad neurodegenerativa en donde dicho inhibidor es un oligodesoxinucleótido antisentido.

16. El uso de la reivindicación 15 en donde dicho oligodesoxinucleótido antisentido es una molécula de ácido nucleico que se hibrida específicamente a la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1 que comprende la secuencia 5'-GGGAGGATGACCATGGCT.

17. El uso de un inhibidor de la función del (poli)péptido de la reivindicación 10 para la preparación de una composición farmacéutica para la prevención o tratamiento de cáncer, psoriasis, o una enfermedad neurodegenerativa en donde dicho inhibidor de la función del (poli)péptido es el anticuerpo de la reivindicación 11 ó 12 o un bloqueador del canal abierto o un inhibidor del receptor de histamina H1, preferiblemente astemizol o terfenadina.

\newpage

18. El uso de un inhibidor o un agente modificante del mal funcionamiento del (poli)péptido de la reivindicación 10 para la preparación de una composición farmacéutica para prevenir o tratar la psoriasis, cáncer o una enfermedad neurodegenerativa, en donde dicho inhibidor o agente modificante es el anticuerpo de la reivindicación 11 ó 12 o un bloqueador de canal abierto o un inhibidor del receptor de histamina H1, preferiblemente astemizol o terfenadina.

19. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18, en donde dicha enfermedad neurodegenerativa es enfermedad de Alzheimer, esclerosis múltiple, esclerosis lateral amiotrófica o enfermedad de Parkinson.

20. Un método para diseñar un fármaco para el tratamiento de una enfermedad que está causada por la expresión indeseada o sobreexpresión de la molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 comprendiendo

(a)

identificación de un fármaco potente y específico;

(b)

identificación del sitio de unión de dicho fármaco mediante mutagénesis dirigida a un sitio y estudios de proteína quimérica;

(c)

modelado molecular de ambos sitios de unión en el (poli)péptido y la estructura de dicho fármaco; y

(d)

modificaciones del fármaco para mejorar su especificidad de unión para el (poli)péptido.

21. Un método para identificar un inhibidor de la expresión de la molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o un inhibidor de una función del (poli)péptido de la reivindicación 10 comprendiendo:

(a)

ensayar un compuesto para la inhibición o reducción de la traducción en donde dicho compuesto se selecciona de oligonucleótidos antisentido y/o ribozimas; o

(b)

ensayar un compuesto para la inhibición de la trascripción en donde dicho compuesto se une a la región promotora del gen codificante por el (poli)péptido de la reivindicación 10 y preferiblemente con elementos de respuesta al factor de trascripción del mismo; o

(c)

ensayar péptidos o anticuerpos que se sospeche que bloquean la actividad proliferativa del (poli)péptido de la reivindicación 10 para dicha actividad bloqueante.

22. El método de la reivindicación 20 ó 21 comprendiendo además el paso de mejorar el fármaco o inhibidor mediante peptidomimética o por aplicación de técnicas de desarrollo de fago o genoteca combinatoria.

23. Un método in vitro o ex vivo para pronosticar cáncer y/o actividades neurodegenerativas y/o psoriasis comprendiendo la valoración de la expresión de la molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o evaluando la presencia cuantitativa del (poli)péptido de la reivindicación 10 en células de mamífero.

24. El método de la reivindicación 23, en donde dicho cáncer es un carcinoma de mama o neuroblastoma o carcinoma de cerviz.

25. El método de la reivindicación 24, en donde dicho carcinoma de mama es adenocarcinoma de pecho, carcinoma de pecho de tipo ductal.

26. El método de la reivindicación 23, en donde dicha enfermedad neurodegenerativa es enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrofica o esclerosis múltiple.

27. El uso de una molécula de ácido nucleico que se hibrida específicamente a la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1 que comprende la secuencia 5' GGGAGGATGACCATGGCT para la preparación de una composición de diagnóstico de cáncer, psoriasis o una enfermedad neurodegernativa.

28. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 15 a 19 y 27 o el método de cualquiera de las reivindicaciones 23 a 26 en donde el mamífero afectado por la enfermedad es un humano, rata o ratón.

29. El uso de una molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o una molécula de ácido nucleico que se hibrida específicamente a la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1 que comprende la secuencia 5'-GGGAGGATGACCATGGCT para la preparación de una composición farmacéutica para su uso en terapia génica para el tratamiento de cáncer o psoriasis.

30. El kit que comprende el vector de la reivindicación 5, el polipéptido de la reivindicación 10 y/o el anticuerpo de la reivindicación 11 ó 12.

31. El uso de un anticuerpo específicamente dirigido al (poli)péptido de la reivindicación 10 para detectar in vitro el inicio o progreso de enfermedades relacionadas con la expresión indeseada o sobreexpresión de la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1.

32. El uso de la reivindicación 31, en donde dicha expresión indeseada o sobreexpresión es indicativa de cáncer.

33. Un oligonucleótido con la secuencia de oligonucleótidos CAGCCATGGTCATCCTCCC.