ES2230078T3 - Procedimientos y composiciones para alternar la secrecion de mucus. - Google Patents

Procedimientos y composiciones para alternar la secrecion de mucus.

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ES2230078T3 ES00912034T ES00912034T ES2230078T3 ES 2230078 T3 ES2230078 T3 ES 2230078T3 ES 00912034 T ES00912034 T ES 00912034T ES 00912034 T ES00912034 T ES 00912034T ES 2230078 T3 ES2230078 T3 ES 2230078T3
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Abstract

Uso de un inhibidor de la secreción de mucus relacionado con la proteína MARCKS para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad asociada con la hipersecreción de mucus, en el que dicho inhibidor es un péptido.

Description

Procedimientos y composiciones para alterar la secreción de mucus.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a medicamentos y composiciones que son útiles en la regulación de la secreción de mucus y que pueden usarse para tratar trastornos médicos cuando se desea aumentar o disminuir la secreción de mucus.
Antecedentes de la invención
El mucus es un líquido biológico que es capaz de formar geles. Es una mezcla de componentes, incluidos agua y productos de secreción de una variedad de células. El mucus expectorado de las vías aéreas humanas contiene aproximadamente el 95% de agua y el 5% de sólidos; los contenidos sólidos incluyen 2-3% de proteínas y glicoproteínas, 1% de lípidos y 1% de minerales. Véase Boat y col., Biochemistry of Mucus, en: Airway Secretion, Takshima y Shimura (eds.); Marcel Dekker, 1994. Las mucinas, también denominadas glicoproteínas mucosas o glicoproteínas epiteliales, son glicoconjugados caracterizados por numerosas cadenas laterales de oligosacáridos unidas a un núcleo peptídico a través enlaces N- y O-.
En las vías respiratorias, las mucinas se liberan en la superficie de las vías respiratorias procedentes de las células caliciformes del epitelio superficial (mucus) y de las células mucosas de las glándulas submucosas. La cantidad total de líquido de superficie (mucus) en las vías respiratorias es el resultado de la tasa de secreción de mucus junto con la tasa de aclaramiento de mucus (mediante reabsorción epitelial, evaporación, transporte ciliar y transporte por la tos). En condiciones "normales", las tasas de secreción y aclaramiento de mucus están equilibradas de forma que sólo una fina capa superficial de líquido cubre el árbol traqueobronquial. La hipersecreción de mucus (si no se acompaña de un incremento concomitante del aclaramiento de mucus) tiene como resultado la acumulación de mucus en las vías respiratorias, que puede resultar en una obstrucción del flujo respiratorio y un aumento de la retención de materia particulada y materia microbiana inhalada. Entre las estrategias existentes para reducir el mucus luminal en las vías respiratorias se incluyen la inhibición de la hipersecreción de mucus mediante el uso de acciones farmacológicas indirectas, el cambio de las características físicas del mucus para aumentar la acción ciliar y la intensificación del aclaramiento por la tos del mucus.
La hipersecreción de mucus contribuye a la patogenia de un gran número de enfermedades inflamatorias de las vías respiratorias en seres humanos y en animales no humanos. El incremento de la secreción de mucus se observa en los estados de enfermedad crónica tales como asma, EPOC y bronquitis crónica; en enfermedades genéticas tales como fibrosis quística; en trastornos alérgicos (atopia, inflamación alérgica); en bronquiectasias y en una serie de enfermedades respiratorias infecciosas agudas tales como neumonía, rinitis, gripe o el resfriado común. En consecuencia, se desean procedimientos y compuestos terapéuticos nuevos capaces de disminuir o aminorar la secreción de mucus.
La hiposecreción de mucus también tiene efectos dañinos. El mucus de las vías respiratorias actúa como una barrera física contra partículas inhaladas biológicamente activas y puede contribuir a impedir la colonización bacteriana de las vías respiratorias e inactivar los productos citotóxicos liberados por los leucocitos. King y col., Respir. Physiol. 62: 47-59 (1985); Vishwanath y Ramphal, Infect.Immun. 45: 197 (1984); Cross y col., Lancet 1: 1328 (1984). En los ojos, el mucus mantiene la película lacrimal y es importante para la salud y comodidad de los ojos. La secreción de mucus en el tracto gastrointestinal también tiene una función citoprotectora. El papel del mucus como barrea química, biológica y mecánica significa que la secreción de mucus anormalmente baja por parte de las membranas mucosas no es deseable.
En vista de lo anterior es deseable conseguir procedimientos y composiciones mejoradas capaces de alterar (es decir, incrementar o disminuir) la secreción de mucus desde las células epiteliales y las membranas mucosas.
Resumen de la invención
La presente invención proporciona el uso de un inhibidor de la secreción de mucus relacionado con la proteína MARCKS para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades asociadas con la hipersecreción de mucus, en el que dicho inhibidor es un péptido.
Preferentemente, la secuencia de dicho péptido comprende la ID SEC Nº 1.
En una forma de realización de la invención, el inhibidor comprende un fragmento activo de una proteína
MARCKS. Preferentemente, dicho inhibidor es un péptido que tiene una secuencia que comprende de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 aminoácidos contiguos de la ID SEC Nº 3.
Preferentemente, el inhibidor se une a un sitio diana seleccionado de:
(a) membranas de gránulos de mucina en el sitio unido por la proteína MARCKS; y
(b) proteína MARCKS en el sitio de unión del gránulo de mucina.
Preferentemente, el inhibidor es un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 aminoácidos contiguos de una secuencia del extremo N de una proteína MARCKS. Más preferentemente, el péptido está miristoilado.
En una forma de realización distinta de la invención, el péptido tiene una secuencia que comprende de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 aminoácidos contiguos de la ID SEC Nº 3.
La invención también proporciona el uso de un inhibidor de la secreción de mucus relacionado con la proteína MARCKS para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades asociadas con la hipersecreción de mucus, en el que dicho inhibidor es un constructo antisentido dirigido contra moléculas nucleotídicas endógenas que codifican una proteína MARCKS.
Preferentemente, el inhibidor es para la administración a las vías respiratorias o al tracto gastrointestinal de un sujeto mamífero o es para la administración mediante inhalación. El inhibidor puede introducirse en células a través de la administración por aerosol a los pulmones. En una forma de realización de la invención, el inhibidor se introduce en las células en un liposoma.
En una forma de realización de la invención el mucus se secreta desde una célula epitelial contenida en las membranas mucosas de las vías respiratorias o en las membranas mucosas gastrointestinales.
La enfermedad asociada con la hipersecreción de mucus puede ser una enfermedad de un sujeto mamífero y se selecciona de bronquitis, asma, fibrosis quística, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, enfisema, neumonía, gripe, rinitis y resfriado común.
La presente invención también proporciona el uso de una proteína MARCKS, o un fragmento de la misma, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad asociada con la baja secreción de mucus, en la que el fragmento es un fragmento intensificador de la secreción.
Preferentemente, el mucus se secreta desde una célula epitelial contenida en las membranas mucosas de las vías respiratorias, las membranas mucosas gastrointestinales, membranas genitourinarias o membranas mucosas oculares.
Preferentemente, la proteína tiene una secuencia que comprende de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 aminoácidos contiguos de la ID SEC Nº 3.
Preferentemente, dicho medicamento es para la administración en las vías respiratorias o el tracto gastrointestinal de un sujeto mamífero o para la administración mediante inhalación.
La invención también proporciona el uso de una proteína MARCKS para la fabricación de un medicamento para la administración en el ojo de un sujeto mamífero o para la administración tópica en el epitelio vaginal.
La presente invención también proporciona el uso de un compuesto que se une a un inhibidor endógeno de la proteína MARCKS el uso en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad asociada con la baja secreción de mucus, en el que el medicamento intensifica la secreción de mucus por una célula secretora de mucus.
Preferentemente, el compuesto es un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 aminoácidos contiguos de un dominio del sitio de fosforilación de una proteína MARCKS. Más preferentemente, el péptido está miristoilado.
En una forma de realización de la invención, el inhibidor endógeno es calmodulina.
La presente invención también proporciona una formulación farmacéutica que comprende un fragmento peptídico de la MARCKS inhibidor de mucus y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Preferentemente, el péptido tiene una secuencia que comprende de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 aminoácidos contiguos de la ID SEC Nº 3.
La presente invención también proporciona un oligonucleótido compuesto por aproximadamente 10 a 50 nucleótidos que tiene una secuencia nucleotídica que hibrida con moléculas nucleotídicas que codifican una proteína MARCKS en condiciones fisiológicas y en la que dicho oligonucleótido inhibe la expresión de dicha proteína MARCKS cuando se administra a una célula que contiene dichas moléculas nucleotídicas endógenas.
En una forma de realización de la invención, el oligonucleótido y un vehículo farmacéuticamente aceptable comprenden una formulación farmacéutica. Preferentemente, la composición está en forma de aerosol. Más preferentemente, el oligonucleótido se transporta en un liposoma.
La presente invención también proporciona un procedimiento in vitro de selección de un compuesto de prueba para determinar la capacidad de unirse, en una célula secretora de mucus, en un sitio seleccionado de (a) membranas de los gránulos de mucina en el sitio unido por la proteína MARCKS, y (b) una proteína MARCKS en el sitio de unión a la membrana del gránulo de mucina. El procedimiento comprende administrar dicho compuesto de prueba a una célula secretora de mucina y después detectar si dicho compuesto de prueba inhibe la unión de proteína MARCKS endógena a la membrana del gránulo de mucina.
Preferentemente, las células secretoras de mucus son células epiteliales bronquiales humanas normales.
Preferentemente, el procedimiento además comprende administrar un compuesto del que se conoce que estimula la secreción de mucus por dicha célula. Más preferentemente, el compuesto del que se conoce que estimula la secreción de mucus se selecciona de uridina5'-trifosfato (UTP), PMA y 8-bromo-GMPc.
Preferentemente, el compuesto de prueba se selecciona de un fragmento peptídico de una proteína MARCKS y análogos peptídicos de la misma. Más preferentemente, el compuesto de prueba se marca con una molécula detectable. En una forma de realización de la invención, el compuesto de prueba es un anticuerpo que específicamente se une a la proteína MARCKS.
La presente invención también proporciona una proteína MARCKS para usar como un medicamento.
Breve descripción de las figuras
La figura 1A es un gráfico de la secreción de mucina estimulada desde las células epiteliales bronquiales humanas in vitro en respuesta a cantidades variables del péptido MANS (ID SEC Nº 1). Columna 1= medios/control (no hay péptido/no hay estimulación); columna 2= PMA 100 nM y 8-Br-GMPc 1 \muM (secreción estimulada); columna 3= péptido MANS 1 \muM, PMA 100 nM y 8-Br-GMPc 1 \muM; columna 4= péptido MANS 10 \muM, PMA 100 nM y 8-Br-GMPc 1 \muM; y columna 5= péptido MANS 100 \muM, PMA 100 nM y 8-Br-GMPc 1 \muM. Un solo asterisco (*) indica que la respuesta medida fue estadísticamente diferente de del medio control (columna 1) y dos asteriscos (**) indican que la respuesta fue estadísticamente diferente a la de las células estimuladas que no se habían expuesto al péptido MANS (columna 2).
La figura 1B es un gráfico de la inhibición de la secreción de mucina basal por las células epiteliales bronquiales humanas expuestas al péptido MANS (ID SEC Nº 1) o un péptido control negativo compuesto por los mismos aminoácidos que el péptido MANS, pero en orden aleatorio (péptido RNS; secuencia aleatoria en el extremo N). Columna 1= medio control; columna 2= incubación de una hora con 100 \muM de RNS; columna 3= incubación de una hora con péptido MANS. Un solo asterisco (*) indica que la respuesta en la columna 3 fue estadísticamente diferente a la del medio control (columna 1).
La figura 2 es un gráfico de los efectos de cantidades variables del péptido MANS (ID SEC Nº 1) en la secreción de mucina inducida por UTP por parte de las células epiteliales bronquiales in vitro. La columna 1 es el medio/control; columna 2= UTP 0,1 mM; columna 3= UTP 0,1 mM y péptido MANS 1 \muM; columna 4= UTP 0,1 mM y péptido MANS 10 \muM; y columna 5= UTP 0,1 mM y péptido MANS 100 \muM. Un solo asterisco indica que la respuesta medida fue estadísticamente diferente de la del medio control (columna 1) y dos asteriscos (**) indican que la respuesta fue estadísticamente diferente de la de las células estimuladas por UTP que no se habían expuesto al péptido MANS (columna 2).
La figura 3A es un gráfico de los efectos del péptido MANS (ID SEC Nº 1) y el péptido MA-PSD (ID SEC Nº 2) sobre la secreción estimulada de mucina por parte de las células epiteliales bronquiales in vitro. La columna 1= medio/control; columna 2= PMA 100 nM; columna 3= PMA 100 nM y 8-Br-GMPc 1 \muM; columna 4= PMA 100 nM, 8-Br-GMPc 1 \muM y péptido MA-PSD 1 \muM; columna 5= PMA 100 nM, 8-Br-GMPc 1 \muM y péptido MA-PSD 10 \muM; columna 6= PMA 100 nM, 8-Br-GMPc 1 \muM y péptido MA-PSD 100 \muM; columna 7= PMA 100 nM, 8-Br-GMPc 1 \muM y péptido MANS 1 \muM; columna 8= PMA 100 nM, 8-Br-GMPc 1 \muM y péptido MANS 100 \muM y columna 9= PMA 100 nM, 8-Br-GMPc 1 \muM y péptido MANS 1 \muM. Un solo asterisco (*) indica que la respuesta fue estadísticamente diferente de la del medio control (columna 1) y dos asteriscos (**) indican que la respuesta fue estadísticamente diferente de la de las células estimuladas que no se habían expuesto al péptido MANS (columna 3).
La figura 3B es un gráfico del efecto de una hora de incubación con el péptido MA-PSD (ID SEC Nº 2) sobre la secreción basal de mucina por parte de las células epiteliales bronquiales in vitro. La columna 1= medio/control; columna 2= MA-PSD 100 \muM; columna 3= MA-PSD 10 \muM; columna 4= MA-PSD 1 \muM. Un solo asterisco (*) indica que la respuesta en la columna 3 fue estadísticamente diferente de la del medio control (columna 1).
La figura 4 es una ilustración de una vía de señalización propuesta de secreción de mucina mediada por MARCKS por parte de las células epiteliales humanas. En esta figura, PKC= proteína quinasa C; PKG= proteína quinasa dependiente de GMPc; GC-s= guanilil ciclasa soluble; PP2A= proteína fosfatasa 2A; NO= óxido nítrico; GTP= guanosín trifosfato y GMPc= guanosín monofosfato cíclico. En esta vía propuesta, los secretagogos de mucina (que se muestran en la figura como unión a un receptor) interaccionan con las células epiteliales de las vías respiratorias (caliciformes) y activan dos proteínas quinasas distintas: PKC y PKG. La PKC activada fosforila la MARCKS, lo que produce su translocación desde la membrana plasmática al citoplasma, donde se dirige a la membrana del gránulo de mucina con la ayuda de las proteínas asociadas a la MARCKS. La PKG, activada a través de la vía óxido nítrico (NO)-GMPc-PKG, a su vez activa una proteína fosfatasa 2A citoplasmática (PP2A), que defosforila la MARCKS y de este modo estabiliza su unión a la membrana del gránulo y permite el sobrecruzamiento de la MARCKS con los filamentos de actina. Esto ata el gránulo al citoesqueleto para el movimiento y la exocitosis.
La figura 5 es un gráfico de los efectos de un oligonucleótido MARCKS antisentido sobre la secreción estimulada de mucina por parte de las células epiteliales bronquiales humanas in vitro. La columna 1= medio/control; columna 2= células estimuladas con PMA 100 nM y 8-Br-GMPc 1 \muM; columna 3= oligonucleótido control 5 \muM, PMA 100 nM y 8-Br-GMPc 1 \muM; columna 4= oligonucleótido antisentido 5 \muM, PMA 100 nM y 8-Br-GMPc 1 \muM. Un solo asterisco (*) indica que la respuesta medida fue estadísticamente diferente de la del medio control (columna 1) y dos asteriscos (**) indican que la respuesta fue estadísticamente diferente a la observada en las células estimuladas que no se habían expuesto ningún oligonucleótido (columna 2).
Descripción detallada de las formas de realización preferidas
El mucus es la secreción viscosa clara de las membranas mucosas y comprende agua, mucina, lípidos y varias sales inorgánicas. La mucina es una glicoproteína rica en hidratos de carbono secretada por células epiteliales especializadas (conocidas como células caliciformes), las glándulas submaxilares y otras células glandulares mucosas. Las células caliciformes son células epiteliales especializadas en la secreción y que contienen una acumulación de gránulos secretores mucosos.
El tejido mucoso (o mucosa) reviste varias estructuras anatómicas en el cuerpo de mamíferos y de aves, incluidos los ojos el tracto respiratorio (alvéolos, bronquios, cavidad oral, laringe, cavidad nasal, faringe, tráquea), el tracto gastrointestinal (esófago, estómago, intestino delgado y grueso, recto) y el tracto genitourinario (uretra, vejiga urinaria, útero y vagina).
Las alteraciones en la cantidad de secreciones de mucus pueden deberse a varios factores subyacentes, incluidos un cambio en la cantidad de glicoproteínas mucosas secretadas por las células secretoras de mucus, un cambio en el número total de células secretoras de mucus o combinaciones de ambos. Se sabe que los mediadores liberados por la respuesta inflamatoria actúan como secretagogos de mucus, incluidos mediadores lipídicos, metabolitos de oxígeno y otros productos específicos de otras células. Larivee y col., En: Airway Secretion, Takishima y Shimura (eds.), Marcel Dekker Inc., 1994, páginas 469-511.
Como se usa en la presente memoria descriptiva, "hipersecreción" de mucus se refiere a la producción de mucus por encima de lo normal o de la cantidad basal, o a la producción de mucus en una cantidad que conduce a cambios o síntomas patológicos.
Como se usa en la presente memoria descriptiva, la "secreción inhibidora de mucus" se refiere a la disminución o la reducción de la secreción de mucus; no se pretende implicar el cese completo de la secreción de mucus. Un tratamiento que inhibe la secreción de mucus tiene como resultado una disminución de la producción de mucus en comparación con la que se produciría, o se esperaría, en ausencia de tal tratamiento.
Las cantidades de mucus secretadas por una célula en cultivo, o por un tejido in vivo, se pueden medir o valorar usando procedimientos como se conocen en la técnica.
Como se usa en la presente memoria descriptiva, la "intensificación" o "estimulación" de la secreción de mucus se refiere a un incremento en la secreción de mucus. Un tratamiento que intensifica la secreción de mucus tiene como resultado un aumento de la producción de mucus en comparación con la que se produciría, o se esperaría, en ausencia de tal tratamiento.
Como se usa en la presente memoria descriptiva, "secreción de mucus estimulada" se refiere a la secreción de mucus que se produce como respuesta a un secretagogo; esto contrasta con la "secreción basal de mucus", que se produce en condiciones fisiológicas normales.
Como se usa en la presente memoria descriptiva, un compuesto que inhibe la liberación de mucina mediada por la proteína MARCKS desde los gránulos de mucina (o mucus) incluye los compuestos que actúan tras una etapa en la vía de señalización mediada por la proteína MARCKS que tiene como resultado la secreción de mucus, lo que causa una reducción de la secreción de mucus.
Como se usa en la presente memoria descriptiva "endógeno" se refiere a compuestos que se producen de forma natural en una célula. Por tanto, la proteína MARCKS endógena se refiere a la proteína MARCKS que se encuentra en el interior celular, en oposición a la proteína MARCKS introducida en esa célula (bien administrada directamente o por técnicas de ingeniería genética).
Como se usa en la presente memoria descriptiva, un "fragmento activo" de una proteína MARCKS es uno que afecta (inhibe o intensifica) la liberación mediada por la proteína MARCKS de mucus que se produce como respuesta a un secretagogo tal como UTP (uridina 5'-trifosfato). Un fragmento peptídico activo de MARCKS comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica o sustancialmente idéntica a una secuencia contigua de aminoácidos que se encuentra en una proteína MARCKS natural. Los fragmentos activos de proteína MARCKS tiene una longitud típica de al menos aproximadamente cinco, diez, quince, veinte o veinticinco aminoácidos, pero son más cortos que la proteína MARCKS completa. Preferentemente, los fragmentos proteicos tienen menos de cincuenta, setenta y cinco, cien o doscientos aminoácidos.
Una cantidad "inhibidora de mucus" o "que inhibe el mucus" de un compuesto es la cantidad que reduce o inhibe la secreción de mucus, en comparación con la que se produciría en ausencia del compuesto. Una cantidad "intensificadora de mucus" del compuesto es la cantidad que intensifica o aumenta la secreción de mucus, en comparación con la que se produciría en ausencia del compuesto. Por ejemplo, como se ha descrito en la presente memoria descriptiva, se descubrió que péptidos de la ID SEC Nº 2 aumentaban la secreción de mucus en el epitelio de las vías respiratorias in vivo cuando se proporcionó en cierta cantidad, y que inhibían la secreción de mucus cuando se proporcionaban en cantidades mayores. La cantidad más eficaz de un péptido concreto variará en función del péptido, la vía de administración y el trastorno que se está tratando. Como se usa en la presente memoria descriptiva, el término "compuesto" debe interpretarse ampliamente para que incluya proteínas, fragmentos peptídicos, nucleótidos, oligonucleótidos y otros productos químicos no proteicos.
Como se usa en la presente memoria descriptiva, un inhibidor peptídico de la secreción de mucus (o liberación de mucina) relacionada con la MARCKS es un péptido que, cuando se proporciona a una célula secretora de mucus, inhibe o reduce la secreción de mucus en comparación con la que se produciría en ausencia de dicho péptido.
Como se usa en la presente memoria descriptiva, un intensificador peptídico de la secreción de mucus (o liberación de mucina) relacionada con la MARCKS es un péptido que, cuando se proporciona a una célula secretora de mucus, intensifica o aumenta la secreción de mucus en comparación con la que se produciría en ausencia de dicho péptido.
Como se usa en la presente memoria descriptiva, "oligonucleótido" se refiere a ADN o ARN y puede incluir hebras sentido y/o antisentido como sea adecuado para el efecto deseado.
Los oligonucleótidos útiles en la presente invención se pueden incorporar en los vectores de expresión recombinantes que incluyen un promotor y otras secuencias necesarias para la expresión de los productos de la traducción deseados (tal como un péptido). Como alternativa, se pueden liberar a células dianas oligonucleótidos "desnudos" según se conoce en la técnica (véase, por ejemplo, Flegner y col., patente de EE.UU. nº 5.580.859).
Mucosa o membranas mucosas, como se usa en la presente memoria descriptiva, se refiere a tejidos mucosos de un huésped donde sea que se localicen en el cuerpo, incluidos, pero no limitados a ellos, las vías respiratorias (nasal, oral, traqueal, bronquial), las vías genitales (vaginal, cervical, anal y peniana), las vías urinarias (uretra, vejiga) y los ojos.
La presente invención proporciona medicamentos y composiciones que son útiles en procedimientos de inhibición de la secreción mucosa por las células epiteliales. Los presentes inventores han determinado que los procesos secretores de mucina en las células epiteliales implican a la proteína MARCKS sustrato de la proteína quinasa C (PKC) (sustrato de quinasa C rico en alanina miristolada). Mediante el bloqueo o la inhibición de la función y/o la producción de proteína MARCKS en las células epiteliales secretoras, la secreción de mucina se reduce sobre la que de otro modo se produciría (es decir, la que se produciría en ausencia de tal tratamiento). La presente invención también proporciona medicamentos y composiciones que son útiles en procedimientos para intensificar la secreción de mucus de células epiteliales. Mediante la intensificación de la función y/o la producción de proteína MARCKS en las células epiteliales secretoras se aumenta la secreción de mucina por encima de la que de otro modo se produciría (es decir, la que se produciría en ausencia de dicho bloqueo).
Los presentes inventores han mostrado que el uso de un fragmento de la proteína MARCKS reduce la secreción de mucus por las células epiteliales. Además, también se ha mostrado que el uso de fragmentos antisentido dirigidos contra la secuencia del ARNm de MARCKS disminuye la producción de mucus en las células epiteliales.
A pesar de la previa identificación de numerosos secretagogos de mucus, anteriormente no se han aclarado las vías de señalización comunes y las moléculas intracelulares implicadas en la secreción de mucina. LA presente invención explota el inesperado descubrimiento de que la proteína (MARCKS) sustrato de la quinasa C rica en alanina miristolada está implicada en el proceso secretor de las células y, particularmente, en la secreción de mucus desde las células epiteliales (tales como las células caliciformes). La proteína MARCKS es un sustrato celular fundamental de la proteína quinasa C (PKC) y los estudios de los presentes inventores indican que es una molécula convergente crucial que controla la liberación de gránulos de mucina. Aunque no se desea quedarse anclado a ninguna teoría de la presente invención, la secreción de mucus relacionada con la MARCKS parece implicar la interacción de secretagogos de mucina con células epiteliales de las vías respiratorias (caliciformes) y la activación de dos proteínas quinasa distintas: PKC y PKG. La PKC activada fosforila la MARCKS, lo que produce su translocación desde la membrana plasmática al citoplasma, donde se dirige a la membrana del gránulo de mucina con la ayuda de las proteínas asociadas a la MARCKS. La PKG, activada a través de la vía óxido nítrico (NO)-GMPc-PKG, a su vez activa una proteína fosfatasa 2A citoplasmática (PP2A), que defosforila la MARCKS, estabiliza su unión a la membrana del gránulo y permite el sobrecruzamiento de la MARCKS con los filamentos de actina, lo que de este modo ata el gránulo al citoesqueleto para el movimiento y la exocitosis. Esta vía de señalización propuesta se representa de forma general en la Figura 4.
Los presentes inventores han identificado el ARNm de la MARCKS y la proteína en células epiteliales bronquiales humanas y los niveles de ARNm y de proteína aumentaron con la diferenciación de las células secretoras in vitro. En estas células se fosforiló la MARCKS con el éster de forbol PMA (forbol 12-miristato 13-acetao), mientras la posterior adición de un activador de GMPc (8-bromo-GMPc)produjo la defosforilación. La secreción de mucina provocada (es decir, estimulada) por el secretagogo patofisiológicamente relevante uridina trifosfato (UTP) (o por una combinación de PMA y 8-bromo-GMPc) se inhibió de forma dependiente de la dosis por la acción de un fragmento peptídico miristoilada de la región N terminal de la proteína MARCKS (el sitio propuesto de la unión de la proteína a las membranas granulares).
En consecuencia, este fragmento peptídico miristoilado de la región N termina de la proteína MARCKS, sí como otros fragmentos peptídicos activos, son útiles en procedimientos para inhibir la secreción de mucus. Como se describe más adelante en la presente memoria descriptiva, se ha encontrado que la administración de ciertos fragmentos activos de la proteína MARCKS es capaz de tanto aumentar como disminuir la secreción de mucus por las células epiteliales secretoras de mucus.
Los presentes inventores han descubierto que los oligonucleótidos antisentido dirigidos contra la proteína
MARCKS bloquean o inhiben la secreción de mucina, como se describe más adelante en la presente memoria descriptiva. En consecuencia, tales oligonucleótidos antisentido encuentran utilidad en procedimientos de inhibición de la secreción mucosa.
Por tanto, la presente invención proporciona medicamentos y composiciones útiles en procedimiento de regulación (aumento o disminución) de la secreción de mucus. Tales medicamentos y composiciones son útiles en el tratamiento de trastornos médicos en los que se produce hipersecreción de mucus y son particularmente útiles en el tracto respiratorio. Los medicamentos y composiciones de la presente invención pueden además ser útiles en el tratamiento de trastornos médicos en los que se desea aumentar la secreción de mucus.
Los medicamentos y composiciones de la presente invención pueden usarse para inhibir o reducir la secreción de mucus que se produce a partir de cualquier célula (como células caliciformes)o tejido (tal como las membranas mucosas de las vías respiratorias) secretores de mucus. Aunque no se desea quedarse anclado a ninguna teoría concreta, los presentes inventores también creen que los compuestos y medicamentos de la presente invención también pueden usarse para bloquear la secreción de mediadores inflamatorios a partir de células tales como macrófagos, neutrófilos y mastocitos. De este modo, los presentes compuestos inhibidores de mucus pueden tener una función doble de disminución de la secreción de mucus e inflamación.
Como se analiza más adelante, la presente invención también está dirigida a fragmentos peptídicos activos de la proteína MARCKS que exhiben un efecto bimodal cuando se liberan a células secretoras de mucus. A un cierto nivel de dosis (una cantidad intensificadora de mucus), tales péptidos incrementan o intensifican la secreción de mucus (en comparación con la que se produciría en ausencia de tal tratamiento). A un nivel de dosis diferente, esta intensificación ya no se observa. Una dosis incluso más extrema tiene como resultado la inhibición o la disminución de la secreción de mucus (en comparación con la que se produciría en ausencia de tal tratamiento)
En consecuencia, la presente invención proporciona medicamentos y composiciones para usar en procedimientos de regulación de la secreción de mucus, mediante la regulación de los efectos de la proteína MARCKS en la cía de secreción de mucus. Tal regulación se puede conseguir mediante la administración de fragmentos activos de proteína MARCKS en cantidades predeterminadas, la administración de cantidades inhibidoras de mucus de oligonucleótidos antisentido de MARCKS o la administración de estos u otros compuestos (solos o combinados) que intensifican o inhiben la vía secretora relacionada con la MARCKS. Tales compuestos incluye los que bloquean la unión de la proteína MARCKS defosforilada que conduce a la liberación de mucina. Tales compuestos pueden unirse y bloquear el sitio que está unido por la proteína MARCKS endógena o pueden unirse a la proteína MARCKS en el sitio pertinente. Se cree que el péptido MANS descrito en la presente memoria descriptiva compite con la proteína MARKCS endógena por el sitio de unión pertinente en la célula, lo que bloquea la liberación de mucina mediada por la MARCKS dentro de la célula. Como alternativa, se predeciría que un anticuerpo dirigido a la secuencia N terminal de la proteína MARCKS (por ejemplo, la secuencia MANS) se uniría a una proteína MARCKS endógena y bloquearía la unión.
Aunque no se desea quedarse anclado a ninguna teoría subyacente a la presente invención, se cree que los compuestos que aumentan la secreción de mucus relacionada con la MARCKS cuando se administran a una célula secretora de mucus (tal como el péptido MA-PSD; ID SEC Nº 2) pueden unirse a proteínas endógenas en la célula que sino se unirían a la proteína MARCKS e inhiben la terminación por parte de la MARCKS de una etapa en la vía de secreción de mucus. La calmodulina es uno de tales inhibidores endógenos de la MARCKS; la calmodulina se une a la MARCKS e impide la fosforilación, lo que por tanto impide que la MARCKS se desenganche de la membrana plasmática. Como se usa en la presente memoria descriptiva, "inhibidores endógenos de la proteína MARCKS" son compuestos presentes de forma natural en una célula que se unen a la proteína MARCKS e impiden que se complete una etapa en la vía de secreción de mucus relacionada con la MARCKS. Un péptido u otros compuesto que se une a un inhibidor de la MARCKS dejaría más proteína MARCKS endógena libre para funcionar en la vía de la secreción de mucus. Por tanto, un procedimiento para incrementar la secreción de mucus es administrar a una célula secretora de mucus un compuesto que se una a un inhibidor de la proteína MARCKS.
En muchas situaciones terapéuticas será deseable mantener algún nivel de secreción de mucus (es decir, un nivel basal o normal) para los efectos protectores del mucus. El mantenimiento de la secreción basal de mucus puede conseguirse mediante la regulación de la dosis del compuesto activo usado. Además, aunque no se desea quedarse anclado a ninguna teoría de la presente invención, los presentes inventores sugieren que, en algunas membranas mucosas, puede mantenerse un nivel basal de la secreción de mucus a través de una vía distinta de la vía relacionada con la MARCKS y estimular la secreción de mucus.
La presente invención proporciona medicamentos y composiciones capaces de disminuir o reducir la hipersecreción que se produce en muchos trastornos patológicos, incluidos los trastornos patológicos relacionados con causas inflamatorias, virales, bacterianas o genéticas. En particular, los medicamentos y composiciones pueden usarse en procedimientos para tratar enfermedades de las vías respiratorias en las que la secreción de mucus aumenta por encima de la que se produce en ausencia de la enfermedad (es decir, está aumentada por encima de los niveles basales o por encima de los niveles normales de secreción de mucus). Entre los sujetos que se pueden trata con los presentes procedimientos se incluyen seres humanos y sujetos no humanos. Entre los sujetos no humanos se incluyen animales de compañía tañes como perros y gatos así como ganado tal como ganado vacuno, caballos, ovejas y cerdos.
Los medicamentos y composiciones pueden usarse para reducir la secreción de mucus o inhibir la hipersecreción de mucus, en cualquier epitelio secretor o célula epitelial, incluidas aunque no limitadas a ellas, células epiteliales de las vías respiratorias (por ejemplo, orales, nasales, bronquiales), células epiteliales oculares, células epiteliales gástricas o intestinales y células epiteliales que revisten el tracto reproductor (por ejemplo, vaginales, cervicales). Como será evidente para los expertos en la técnica según el sujeto y el trastorno que se está tratando, puede ser deseable mantener un nivel basal de secreción de mucus mientras se reduce la hipersecreción de mucus. Como se usa en la presente memoria descriptiva, un tratamiento que reduzca o inhiba la secreción de mucus se refiere a un tratamiento que reduzca la cantidad de mucus secretado en comparación con la que se produciría en el sujeto en ausencia de tal tratamiento.
La presente invención también proporciona medicamentos y composiciones para aumentar o estimular la secreción de mucus por las células epiteliales, incluidas aunque no limitadas a ellas, células epiteliales de las vías respiratorias, células epiteliales oculares (del epitelio corneano o de la conjuntiva), células epiteliales gástricas o intestinales y células epiteliales que revisten el tracto reproductor. Como se usa en la presente memoria descriptiva, un tratamiento que aumente, intensifique o estimule la secreción de mucus se refiere a un tratamiento que aumente la cantidad de mucus secretado en comparación con la que se produciría en ausencia de tal tratamiento. En particular, los medicamentos y composiciones son útiles en aumentar la secreción de mucus por las células epiteliales oculares (para tratar los trastornos del ojo seco) y por las células epiteliales vaginales (para tratar la sequedad vaginal).
Los péptidos y compuestos de la presente invención que bloquean la secreción de mucus como respuesta a activadores conocidos de la PKC y la proteína quinasa G (Figura 1) y a estímulos fisiológicamente relevantes (por ejemplo, UTP). (Figura 2).
La presente invención proporciona de este modo medicamentos y composiciones para tratar células epiteliales o tejido epitelial cuando es deseable disminuir la cantidad de mucus secretado por las células o tejidos. La presente invención también proporciona de este modo medicamentos y composiciones para tratar células epiteliales o tejido epitelial cuando es deseable aumentar la cantidad de mucus secretado por las células o tejidos. En particular, la presente invención proporciona medicamentos y composiciones para tratar trastornos respiratorios cuando es deseable disminuir la cantidad de mucus presente en las vías respiratorias o cuando es deseable aumentar la cantidad de mucus presente en las vías respiratorias. Los trastornos adecuados para el tratamiento con los medicamentos y composiciones incluyen enfermedades de las vías respiratorias inflamatorias, virales o bacterianas humanas y animales (por ejemplo, asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, resfriado común, rinitis, bronquitis aguda o crónica, neumonía y tos canina),trastornos alérgicos (atopia, inflamación alérgica), bronquiectasia y ciertos trastornos genéticos (por ejemplo, fibrosis quística).
Secreción de mucus en las vías respiratorias
La secreción normal de mucus en los pulmones desempeña un papel importante en el aclaramiento de las vías respiratorias de partículas extrañas inhaladas y patógenos. El mucus atrapa las partículas inhaladas y después se elimina de las vías respiratorias por la acción ciliar o por la tos. Niveles por encima de lo normal de secreción de mucus (hipersecreción) en las vías respiratorias pueden conducir a la acumulación intraluminal de mucus, lo que tiene como resultado la obstrucción del flujo aéreo y un aumento de la susceptibilidad a agentes infecciosos. Las células secretoras en las vías respiratorias incluyen glándulas submucosas y células mucosas epiteliales superficiales (células caliciformes).
La secreción de mucus en las vías respiratorias es un importante determinante del pronóstico y las características clínicas de enfermedades pulmonares. En trastornos asociados con inflamación crónica de las vías aéreas a menudo se encuentran hipertrofia y/o hiperplasia de las células secretoras de las vías aéreas (glándulas bronquiales y células caliciformes epiteliales). En sujetos con bronquitis crónica y asma bronquial se ha observado hiperplasia de células caliciformes, con un incremento de dos o tres veces el número de células caliciformes en comparación con los controles. Cutz y col., Histopathology 2: 407-421 (1978). Glynn y Michaels Thorax 15:142-153 (1960). La inflamación de las vías respiratorias puede inducir hipersecreción de mucus mediante varios mecanismos, incluida la liberación de mediadores químicos desde las células y los tejidos circundantes. La hipersecreción de mucus en las vías respiratorias es un hallazgo clínico particularmente dominante en la fibrosis quística, la bronquitis, la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), el enfisema y el asma bronquial. Véase, por ejemplo, Airway Secretion, Takishima y Shimura (eds.), Marcel Dekker Inc., 1994.Lam presencia de excesivo mucus bronquial puede conducir a insuficiencia respiratoria e infección bacteriana. En la autopsia, los pulmones de pacientes asmáticos a menudo muestran la presencia de excesivo mucus bronquial y tapones mucosos. Sería útil disponer de procedimientos para reducir la secreción de mucus en las vías respiratorias para el tratamiento de tales trastornos, así como para tratar infecciones bacterianas o virales (por ejemplo, neumonía, gripe y resfriado común); en animales, tales procedimientos son más útiles en el tratamiento de la tos canina y la EPOC equina.
En la actualidad se usan varios procedimientos para reducir la secreción de mucus cuando se necesite en estados patológicos. Algunos tratamientos actúan mediante la disminución de las señales o los estímulos que aumentan la secreción de mucus. Por ejemplo, los mediadores inflamatorios pueden aumentar la secreción de mucus; a menudo se usan tratamientos con esteroides para disminuir la inflamación y, por tanto, disminuir de forma indirecta la secreción de mucus. Los antihistamínicos se usan para bloquear las respuestas a alergenos que pueden desencadenar ataques de asma alérgica. El mucus más espeso presente en los pacientes con fibrosis quística se elimina mediante tratamiento de compresión y las infecciones que se producen a causa del mucus más espeso se tratan con antibióticos. El uso de medicamentos y compuestos de la presente invención para controlar la secreción de mucus difiere de los tratamientos anteriores en que la secreción celular de mucus como respuesta a una variedad de estímulos se ve bloqueada directamente a nivel celular.
Capa mucosa ocular
La capa mucosa en la superficie ocular es importante para mantener y extender la película de lágrimas y se requiere para el funcionamiento normal de los ojos. Se ha mostrado que el epitelio de la superficie ocular expresa múltiples genes de mucina. Gipson, Adv. Exp. Med. Biol. 438: 221 (1998). Varias enfermedades y síndromes tienen como resultado trastornos patológicos del "ojo seco", incluidos la queratoconjuntivitis seca, el síndrome de Stevens-Johnson, el penfigoide ocular y el ojo seco inducido por radiación o por cirugía. El epitelio de la superficie ocular en tales enfermedades sufre cambios, que pueden incluir pérdida de células caliciformes, deficiencia de mucina y queratinización. En estos síndromes se ha demostrado la presencia de menores densidades de células caliciformes en el epitelio ocular. Ralph, Invest. Ophthalmol. 14: 299 (1975).
Además de los sujetos en los que el ojo seco causa molestias en la vida cotidiana, muchos individuos padecen ojo seco "insignificante", que puede presentar dificultades sólo ciando el sujeto intenta ponerse unas lentillas. Con frecuencia, la intolerancia a las lentillas se debe a una insuficiente película lagrimal. Jurkus y col., J. Am. Optom. Assoc. 65: 756 (1994); Toda y col., Br. J. Ophthal. 80: 604 (1996). Entre los tratamientos existentes para el ojo seco se incluyen el uso tópico de tretinoína (Tseng, J. Am. Acad. Dermatol. 15: 860 (1986)) o ácido retinoico (Driot y Bonne, Invest. Ophthalmol. 33: 190 (1992)).
El aumento de la secreción en los ojos es deseable cuando una ausencia de mucus ocular afecta a la función normal del ojo. Además, el aumento de la secreción de mucus en los ojos es deseable como ayuda para el uso de lentillas.
Administración
Los medicamentos y composiciones de la presente invención se pueden usar para reducir (es decir, disminuir o inhibir) o para intensificar (es decir, incrementar o estimular) la producción de secreciones de mucus por las membranas mucosas o las células secretoras de mucus, en un sujeto que necesite tal tratamiento por cualquier razón. Al usar los procedimientos de administración como se conocen en la técnica, los medicamentos y composiciones se pueden dirigir a las membranas mucosas o a las células secretoras de mucus de un órgano diana concreto (incluidos pero no limitados a ellos, la cavidad oral, la cavidad nasal, los pulmones, el tracto gastrointestinal, los ojos y el tracto reproductor), para reducir o incrementar la cantidad de mucus secretada por, o retenida, las superficies que se están tratando. El cambio (la reducción o el incremento) en el mucus se valora por comparación con al que estaba presente antes del tratamiento (o en ausencia del tratamiento), o con la que cabría esperar en ausencia de tal tratamiento en vista del trastorno del sujeto.
Los medicamentos y composiciones de la presente invención pueden usarse junto con otros tratamientos o compuestos, incluidas las etapas para eliminar las secreciones de mucus retenido de las vías respiratorias de los sujetos antes de la etapa de administrar los presentes compuestos. Esto facilita la aplicación del agente activo al epitelio respiratorio durante la etapa de administración. Tal eliminación de secreciones de mucus retenido se puede llevar a cabo por cualquier medio físico o médico adecuado como se conocen en la técnica.
La liberación en la mucosa de fármacos con base peptídica se analiza en Chien, Novel Drug Delivery Systems, capítulo 4 (Marcel Dekker, 1992); la liberación nasal del fármaco se analiza en Chien, supra, capítulo 5. Véase también Chang y col., Nasal Drug Delivery, "Treatise on controlled Drug Delivery", capítulo 9 (Marcel Dekker, 1992).En Sloan, capítulo 5, "Prodrugs: Topical and Ocular Drug Delivery" (Marcel Dekker, 1992) se describen agentes que se sabe que intensifican la absorción de fármacos a través de la piel. Los péptidos de la presente invención se pueden administrar directamente a las células diana, por ejemplo usando liposomas. Cabe esperar que los expertos en la técnica puedan adaptar tales técnicas y otras técnicas conocidas de liberación de fármacos para usar con los compuestos de la presente invención sin experimentación excesiva.
Entre las composiciones farmacéuticas de la presente invención se incluyen las adecuadas para administración por inhalación, oral, rectal, vaginal, tópica (incluidas las vías bucal, dérmica y ocular). Las composiciones pueden prepararse por cualquiera de los procedimientos bien conocidos en la técnica. La vía de administración más adecuada en cada caso dependerá de la localización del tejido que se va a tratar, la naturaleza y la gravedad del trastorno que se va a tratar y el compuesto activo concreto que se va a usar, como será evidente para los expertos en la técnica. L dosis de compuesto activo para el tratamiento de enfermedades del tracto respiratorio variará en función del trastorno que se va a tratar y del estado del sujeto. Un experto en la técnica sería capaz de determinar las dosis adecuadas de compuestos específicos sin experimentación excesiva usando estudios de dosis-respuesta como se conocen en la técnica.
Los compuestos activos descritos en la presente memoria descriptiva pueden administrarse en las vías respiratorias de un sujeto por cualquier medio adecuado, aunque preferentemente se administran generando un aerosol compuesto por partículas respirables, las partículas respirables compuestas por el compuesto activo, cuyas partículas inhala el sujeto. Las partículas respirables pueden ser líquidas o sólidas. Las partículas pueden contener opcionalmente otros ingredientes terapéuticos. (Véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 5.849.706 concedida a Molina y Vedia y
col.).
En los procedimientos para tratar los bronquios y/o los alvéolos, las partículas compuestas por el compuesto activo para practicar la presente invención deberían incluir partículas de tamaño respirable: es decir, partículas de un tamaño lo bastante pequeño como para que puedan pasar por la boca y la laringe tras la inhalación y llegar a los bronquios y los alvéolos de los pulmones. En general, las partículas de un tamaño variable de aproximadamente 0,5 a 10 micrómetros (más particularmente de un tamaño menor de aproximadamente 5 micrómetros) son respirables. Las partículas de un tamaño no respirable que están incluidas en el aerosol tienden a depositarse en la garganta y se tragan, por lo que preferentemente se minimiza la cantidad de partículas no respirables en los aerosoles para el tratamiento de los alvéolos y/o los bronquios. Para la administración nasal, se prefiere un tamaño de partícula en el intervalo de 10-500 micrómetros para garantizar la retención en la cavidad nasal.
Las composiciones farmacéuticas líquidas de compuesto activo para producir un aerosol se pueden preparar mediante la combinación del compuesto activo con un vehículo adecuado, tal como agua estéril sin pirógenos.
La administración de los compuestos activos puede llevarse a cabo de forma terapéutica o profiláctica (por ejemplo, antes de que se produzca un bloqueo pulmonar sustancial a causa de la retención de las secreciones de mucus o en un momento en el que tales secreciones retenidas se han eliminado, al menos en parte, como se ha analizado anteriormente).
Los aerosoles de partículas líquidas que comprenden el compuesto activo pueden producirse por cualquier medio adecuado, tal como con un nebulizador. Véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 4.501.729. Los nebulizadores son dispositivos comercialmente disponibles que transforman soluciones o suspensiones del ingrediente activo en una neblina de aerosol terapéutico bien mediante la aceleración de un gas comprimido, típicamente aire u oxígeno, a través de un estrecho orificio de venturi o bien por medio de agitación ultrasónica. Las formulaciones adecuadas para usar en nebulizadores consisten en el ingrediente activo en un vehículo líquido, típicamente agua o una solución alcohólica acuosa diluida, y preferentemente convertidas en isotónicas con fluidos corporales.
Asimismo pueden producirse aerosoles de partículas sólidas que comprenden el compuesto activo con cualquier generador de aerosoles de un medicamento particulado sólido. Un tipo ilustrativo de generador de aerosoles particulados sólidos es un insuflador.
Las formulaciones adecuadas para administración oral pueden presentarse en unidades pequeñas, tales como cápsulas, sellos, pastillas o comprimidos, cada una con una cantidad predeterminada del compuesto activo; en forma de polvos o gránulos; en forma de una solución o una suspensión en un líquido acuoso o no acuoso; o en forma de una emulsión de aceite en agua o de agua en aceite. Tales formulaciones pueden prepararse por cualquier procedimiento farmacéutico adecuado, que incluye la etapa de asociar el compuesto activo y un vehículo adecuado (que puede contener uno o más ingredientes accesorios, como se ha indicado anteriormente). Las formulaciones para administración oral pueden incluir opcionalmente recubrimientos entéricos conocidos en la técnica para prevenir la degradación de la formulación en el estómago y proporcionar la liberación del fármaco en el intestino delgado.
Las formulaciones adecuadas para la administración rectal o vaginal pueden presentarse como supositorios de monodosis. Estos pueden preparase mezclando el compuesto activo con uno o más vehículos sólidos convencionales, por ejemplo, manteca de cacao, y después dando forma a la mezcla resultante.
Las formulaciones adecuadas para la aplicación tópica en los ojos, la boca, la nariz u otras superficies pueden tomar la forma de ungüentos, cremas, lociones, pastas, geles, pulverizadores, aerosoles o aceites.
Péptidos
La proteína sustrato de la quinasa C rica en alanina miristoilada (MARCKS) es un sustrato celular fundamental de la proteína quinasa C. La MARCKS está regulada de un modo específico de célula, tejido y de la etapa del desarrollo y la expresión de MARCKS se puede estimular por la acción de varias citoquinas. La MARCKS se ha identificado en seres humanos y en especies bovinas, de roedores y de aves. Harlan y col., J. Biol. Chem. 266: 14399 (1991); Graff y col., J. Biol. Chem. 266: 14390 (1991); Graff y col., Mol. Endocrinol.3: 1903 (1989); Stumpo y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 4012-16 (junio 1989).
Los péptidos correspondientes a la proteína MARCKS están comercialmente disponibles. Un "péptido psd"
MARCKS está disponible en BIOMOL (Plymouth Meeting, Pensilvania) con la secuencia KKKKKRFSFK KSFKLS
GFSFKKNKK (ID SEC Nº 2). Véase P. Blackshear, J. Biol. Chem. 268: 1501 (1993).
Los presentes inventores han identificado dos fragmentos activos específicos de la proteína MARCKS que son capaces de afectar a la secreción de mucus. En la presente memoria descriptiva se hace referencia a un polipéptido miristoilado de 24 aminoácidos de longitud con la secuencia de ácido mirístico-GAQFSKTAAKGEAAARPGEAAVA (ID SEC Nº 1) como el péptido MANS para la secuencia N terminal miristolada. El péptido inhibe la secreción de mucus de las membranas mucosas y de las células secretoras de mucus, incluidas las células epiteliales de las vías respiratorias humanas. Los datos de los presentes inventores sugieren que este péptido bloquea la unión de la proteína MARCKS al gránulo de mucina, de este modo bloqueando o inhibiendo la liberación de los gránulos de mucina y la secreción de mucus por la célula.
También se probó un segundo péptido correspondiente al sitio PSD (de fosforilación)de la MARCKS. A algunas concentraciones este péptido estimula la secreción de mucus, mientras que a otras dosis (más elevadas) no tiene ningún efecto sobre la secreción estimulada (Figura 3) y se predice que dosis incluso mayores disminuirán la secreción estimulada de mucus. La secuencia peptídica PSD es ácido mirístico-KKKKKRFSFKKSFKLSGFSFKKNKK (ID SEC Nº 2), denominada en la presente memoria descriptiva péptido MA-PSD. Aunque no se desea quedarse anclado a ninguna teoría subyacente a la presente invención, los inventores creen que los fragmentos de la proteína MARCKS que son capaces de aumentar la secreción de mucus (tal como el péptido MA-PSD; ID SEC Nº 2) pueden unirse a proteínas endógenas en la célula que inhiben de forma competitiva la fosforilación de la MARCKS, inhibiendo de este modo la liberación de la MARCKS desde la membrana plasmática hacia el interior celular (véase la Figura 4). Uno de tales inhibidores de la fosforilación de la MARCKS es la calmodulina. Otros "inhibidores de la MARCKS" para los propósitos de la presente invención son los compuestos endógenos que impiden que la proteína MARCKS complete una etapa necesaria en la vía de la secreción de mucus. De este modo, los inhibidores de la MARCKS pueden actuar para inhibir la fosforilación o la defosforilación de la MARCKS (cada uno de los cuales es necesario en la presente vía) o unirse a la MARCKS para impedir su unión a la membrana del gránulo de mucina. Los compuestos de la presente invención que incrementan la secreción de mucus pueden actuar mediante la unión a tales inhibidores endógenos, lo que libera la proteína MARCKS endógena para que complete la vía de la secreción de mucus.
Por tanto, los fragmentos peptídicos de la proteína MARCKS pueden diseñarse, probarse y seleccionarse por su capacidad para inhibir o intensificar la secreción de mucus mediante la presente descripción y los procedimientos conocidos en la técnica.
Las secuencias nucleotídicas y aminoacídicas del ADNc de la MARCKS humana y de la proteína según lo publicado por Harlan y col., J. Biol. Chem. 266: 14399 (1991) (GenBank número de referencia M68956) se proporcionan como las ID SEC Nº 3 e ID SEC Nº 4. Las secuencias nucleotídicas y aminoacídicas del ADNc de la MARCKS humana y de la proteína según lo publicado por Sakai y col., Genomics. 14: 175 (1992) se proporcionan como las ID SEC Nº 5 y la ID SEC Nº 6. Una publicación adicional (Harlan y col., J. Biol.Chem. 266 (22): 14399 (1991) proporciona una secuencia nucleotídica para la MARCKS humana que difiere de la de Sakai y col. en los nucleótidos 619 y 724; en esta secuencia, G está sustituida por T en la posición 619 y C está sustituida por G en la posición 724. Cabría espera variantes alélicas adicionales de proteínas MARCKS humanas y otras.
Aunque no se desea quedarse anclado a ninguna teoría subyacente a la presente invención, los presentes inventores proponen que la vía para la implicación de la MARCKS en la secreción de mucus en el epitelio de las vías respiratorias es como se muestra en la Figura 4. En la actualidad se cree que los fragmentos peptídicos activos de la MARCKS afectan a la secreción de mucus a nivel de la interacción de la MARCKS con los gránulos de mucina, que contienen los principales componentes proteicos del mucus. Como se muestra en la figura 4, los presentes inventores creen que la MARCKS debe defosforilarse para unirse al gránulo de mucina, lo que desencadena la exocitosis de la mucina y tiene como resultado la secreción de mucus.
La presente invención incluye el uso de moléculas de ADN aislado que codifica péptidos que controlan la secreción de mucus. Tales moléculas de ADN aislado son útiles en la producción de péptidos terapéuticos y pueden además usarse en un vector de expresión génica adecuado para terapia génica mediante procedimientos como se conocen en la técnica para la expresión del péptido in vivo. Además pueden usarse promotores inducibles o específicos de células para controlar la expresión del péptido terapéutico in vivo. En, por ejemplo, las patentes de EE.UU. Nº 5.580.859 y 5.703.055 concedidas a Felgner y col. se describen procedimientos para liberar ADN que codifica un péptido deseado para conseguir un efecto terapéutico.
Un aspecto de la presente invención son los análogos de los péptidos terapéuticos descritos en la presente memoria descriptiva. Como se usa en la presente memoria descriptiva, un "análogo" es un compuesto químico de estructura similar a un primer compuesto y que tiene una acción fisiológica similar a la del primer compuesto. Haciendo una referencia concreta a la presente invención, los análogos peptídicos de la MARCKS son los compuestos que, aunque no tienen las exactas secuencias de aminoácidos del fragmento nativo de la MARCKS, son capaces de unirse a los mismos sitios que el fragmento nativo de la MARCKS. Tales análogos pueden ser análogos peptídicos o no peptídicos, incluidos análogos de ácidos nucleicos, como se describe más detalladamente más adelante.
En las moléculas proteicas que interaccionan con un receptor, la interacción entre la proteína y el receptor debe tener lugar en sitios accesibles en la superficie en una molécula tridimensional estable. Mediante la disposición de los residuos cruciales de los sitios de unión en una conformación adecuada, los péptidos que simulan las características esenciales de la superficie de los ligandos p20 pueden diseñarse y sintetizarse de acuerdo con técnicas conocidas.
Se conocen los procedimientos para determinar la estructura tridimensional de los péptidos y análogos de los mismos y en ocasiones se denominan "técnicas racionales del diseño de fármacos". Véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 4.833.092 concedida a Geysen; la patente de EE.UU. nº 4.859.765 concedida a Nestro; la patente de EE.UU. nº 4.853.871 concedida a Pantoliano; la patente de EE.UU. nº 4.863.857 concedida a Blalok. Véase también, Waldrop, Science, 247, 28029 (1990); Rossmann, Nature, 333, 392-393 (1988); Weis y col., Nature, 333, 426-431 (1988); James y col., Science, 260, 1937 (1993) (desarrollo de compuestos de benzodiazepinas peptidomiméticos basados en la estructura y la función de los ligandos tetrapeptídicos).
En general, los expertos en la técnica apreciarán que se pueden hacer pequeñas deleciones o sustituciones en las secuencias aminoacídicas de los péptidos de la presente invención sin que afecten de forma adversa a la actividad de los mismos. Por tanto, los péptidos que contienen tales deleciones o sustituciones son otro aspecto de la presente invención. En péptidos que contienen sustituciones o reemplazos de aminoácidos, uno o más aminoácidos de una secuencia peptídica puede reemplazarse con uno o más de otros aminoácidos en los que tal sustitución no afecta a la función de esa secuencia. Tales cambios pueden guiarse por similitudes conocidas entre aminoácidos en las características físicas tales como la densidad de carga, hidrofobicidad/hidrofilicidad, tamaño y configuración, de forma que los aminoácidos se sustituyen con otros aminoácidos que tengan esencialmente las mismas propiedades funcionales. Por ejemplo: Ala puede sustituirse con Val o Ser; Val puede sustituirse con Ala, Leu, Met o Tie, preferentemente Ala o Leu; Leu puede sustituirse con Ala, Val o Ile, preferentemente con Val o Ile; Gly puede sustituirse con Pro o Cys, preferentemente con Pro; Pro puede sustituirse con Gly, Cys, Ser o Met, preferentemente con Gly, Cys o Ser; Cys puede sustituirse con Gly, Pro, Ser o Met, preferentemente Pro o Met; Met puede sustituirse con Pro o Cys, preferentemente Cys; His puede sustituirse con Phe o Gln, preferentemente Phe; Phe puede sustituirse con His, Tyr o Trp, preferentemente con His o Tyr; Tyr puede sustituirse con His, Phe o Trp, preferentemente Phe o Trp; Trp puede sustituirse con Phe o Tyr, preferentemente con Tyr; Asn puede sustituirse con Gln o Ser, preferentemente con Gln; Gln puede sustituirse con His, Lys, Glu, Asn o Ser, preferentemente Asn o Ser; Ser puede sustituirse con Gln, Thr, Pro, Cys o Ala; Thr puede sustituirse con Gln o Ser, preferentemente Ser; Lys puede sustituirse con Gln o Arg; Arg puede sustituirse con Lys, Asp o Glu, preferentemente con Lys o Asp; Asp puede sustituirse con Lys, Arg o Glu, preferentemente con Arg o Glu y Glu puede sustituirse con Arg o Asp, preferentemente con Asp. Una vez hechos, los cambios puede detectarse de forma rutinaria para determinar sus efectos sobre la función con enzimas.
Los miméticos no peptídicos de los péptidos de la presente invención también son un aspecto de esta invención. El diseño de los fármacos no proteicos se puede llevar a cabo usando modelos gráficos por ordenador para diseñar las moléculas orgánicas no peptídicas que se unen a sitios ligados por los fragmentos nativos de la MARCKS descritos en al presente memoria descriptiva. Véase, por ejemplo, Knight, BIO/Technology, 8, 105 (1990). Itzstein y col., Nature, 363, 418 (1993); Lam y col., Science, 263, 380 (enero 1994) (diseño racional de ureas cíclicas no peptídicas biodisponibles que funcionan como inhibidores de la proteasa del VIH).También se pueden desarrollar análogos mediante la generación de una biblioteca de moléculas, la selección de las moléculas que actúan como ligandos para una diana específica y la identificación y amplificación de los ligandos seleccionados. Véase, por ejemplo, Kohl y col., Science, 260, 1934 (19993). Las técnicas para construir y seleccionar en las bibliotecas combinatorias de biomoléculas oligoméricas para identificar las que se unen específicamente a una proteína receptora dada son conocidas. Entre los oligómeros adecuados se incluyen péptidos, oligonucleótidos, hidratos de carbono, moléculas no oligonucleotídicas (por ejemplo, oligonucleótidos fosforotioatos; véase Chein y Engineering News, página 20, 7 de febrero de 1994) y polímeros no peptídicos (véase, por ejemplo, "peptoids" de Simon y col., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89, 9367 (1992). Véase también la patente de EE.UU. nº 5.270.170 concedida a Schatz; Scott y Smith, Science, 249, 386-390 (1990); Devlin y col., Science 249, 404-406 (1990); Edgington, BIO/Technology, 11, 285 (1993). Las bibliotecas de péptidos pueden sintetizarse en soportes sólidos o expresarse en la superficie de virus bacteriofagos (bibliotecas de expresión en fagos). Los expertos en la técnica pueden usar procedimientos de detección selectiva conocidos para seleccionar en bibliotecas combinatorias para identificar los análogos peptídicos adecuados. En la técnica se conocen técnicas para la detección selectiva de moléculas sintetizadas y seleccionar aquéllas con la actividad deseada y para marcar los miembros de la biblioteca de forma que las moléculas activas seleccionadas pueden identificarse. Véase, por ejemplo, Brenner y Lerner, Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 89, 5381 (1992); la patente de EE.UU. nº 5.283.173 concedida a Fields y col.
Como se usa en la presente memoria descriptiva, "bioblioteca combinatoria" se refiere a acumulaciones de diversas biomoléculas oligoméricas de secuencia diferente, que se pueden someter a detección selectiva simultáneamente para detectar actividad como ligando para una diana concreta. Las bibliotecas combinatorias también pueden denominarse "bibliotecas de forma", es decir, una población de polímeros aleatorizados que son ligandos potenciales. La forma de una molécula se refiere a las características de una molécula que gobiernan sus interacciones con otras moléculas, incluidas las fuerzas de Van der Waals, hidrófobas, electrostáticas y dinámicas.
Las moléculas de ácido nucleico también pueden actuar como ligandos para proteínas receptoras. Véase, por ejemplo, Edgington, BIO/Technology, 11, 285 (1993). La patente de EE.UU. nº 5.270.163 concedida a Gold y Tuerk describe un procedimiento para identificar ligandos ácidos nucleicos para una molécula diana mediante la selección, de una biblioteca de moléculas de ARN con secuencias aleatorizadas, las moléculas que se unen de forma específica a la molécula diana. En Tsai, Kenan y Keene, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992) y en Tsai y Keene, J. Immunology, 150, 1137 (1993) se describe un procedimiento para la selección in vitro de moléculas de ARN que presentan reacción cruzada inmunológica.
Oligonucleótidos antisentido
Los presentes inventores han demostrado que los oligonucleótidos antisentido dirigidos contra el ARNm de
MARCKS disminuye (inhibe) la secreción de mucus en las células epiteliales de las vías respiratorias. (Véase el Ejemplo 6 y la Figura 5).
Se ha demostrado que los oligonucleótidos antisentido que son complementarios a ARN específicos pueden inhibir la expresión de genes celulares como proteínas. Véase Erickson e Izant, Gene Regulation: Biology Of Antisense RNA And DNA, vol. 1, Raven Press, Nueva York, 1992. Por ejemplo, se ha comunicado la inhibición selectiva de un gen p21 que difería de un gen normal en un único nucleótido. Chang y col., Biochemistry 1991, 30: 8283-8286. Se han propuesto muchas hipótesis para explicar los mecanismos por los cuales los oligonucleótidos antisentido inhiben la expresión génica, sin embargo, el mecanismo específico implicado puede depender del tipo de célula estudiado, el ARN diana, el sitio específico en el ARN diana y la naturaleza química del oligonucleótido. Chiang y col., J. Biol. Chem. 1991, 266:18162-18171; Stein y Cohen, Cancer Res. 1988, 48: 2659-2668.
La presente invención proporciona oligonucleótidos sustancialmente complementarios a una secuencia nucleotídica de la proteína MARCKS que se produce de forma endógena en una célula secretora de mucus. Tales oligonucleótidos son útiles en la disminución de la producción de mucus por las células en las que se han introducido. "Secuencia nucleotídica" se refiere a un polinucleótido formado de una serie de unidades nucleotídicas unidas. El término "sustancialmente complementario", como se usa en la presente memoria descriptiva, se refiere a la cantidad de complementariedad de secuencia entre el oligonucleótido y una secuencia nucleotídica del gen de la MARCKS, que permite la hibridación entre hebras en condiciones fisiológicas y permite que el oligonucleótido inhiba la expresión del gen de MARCKS. La hibridación entre hebras es la interacción entre el oligonucleótido y la secuencia nucleotídica de la MARCKS. Los expertos en la técnica pueden determinar el potencial de formar un híbrido entre hebras estable mediante procedimientos conocidos en la técnica, tales como, por ejemplo, la determinación de la temperatura de fusión para el híbrido mediante modelos matemáticos o análisis empírico, o hibridaciones de ácidos nucleicos en soporte sólido. (Véase, por ejemplo, Marmur y Doty, J. Mol. Biol. 1962, 5, 113).
Los ADN antisentido usados en la presente invención son capaces de producir los correspondientes ARN antisentido. Una molécula de ARN antisentido tiene las bases nucleotídicas en el orden inverso u opuesto para la expresión. Tales ARN antisentido se conocen bien en la técnica, véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 4.801.540 concedida a Calgene Inc.
Como se usa en la presente memoria descriptiva, el término "secuencia nucleotídica de MARCKS" se refiere a cualquier secuencia nucleotídica derivada de un gen que codifica una proteína MARCKS, incluidas, por ejemplo, una secuencia de ADN o ARN, una secuencia de ADN del gen, cualquier secuencia de ARN transcrita, una secuencia de ARN del pre-ARNm o del trásncrito de ARNm y ADN o ARN unido a la proteína.
Los oligonucleótidos dirigidos a secuencias en los genes MARCKS se pueden usar para inhibir la producción de mucus en las células epiteliales. El oligonucleótido puede ser de cualquier longitud de secuencia capaz de formar un híbrido estable con la secuencia nucleotídica MARCKS endógena en condiciones fisiológicas. Se prefiere que la longitud del oligonucleótido sea de entre 5 y 200 nucleótidos. Es más preferible que el oligonucleótido tenga una longitud de entre 10 y 50 nucleótidos. Es más preferible que el oligonucleótido tenga una longitud de entre 15 y 25 nucleótidos.
Los nucleótidos de los oligonucleótidos pueden ser cualquiera conocido en la técnica, incluidos restos naturales y sintéticos. El término "oligonucleótido" como se usa en la presente memoria descriptiva se refiere a un polinucleótido formado a partir de nucleótidos unidos. Es más, el término "oligonucleótido" incluye oligonucleótidos naturales u oligonucleótidos sintéticos formados a partir de subunidades naturales o de subunidades análogas diseñadas para conferir propiedades especiales al nucleótido de forma que sea más estable en sistemas biológicos o se una de forma más estrecha a las secuencias diana. También incluye modificaciones de los oligonucleótidos tales como su unión química a otros compuestos que intensificará la liberación a células o al núcleo y a otros compartimentos de las células. Los oligonucleótidos de la invención pueden sintetizarse mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica, incluidos procedimientos químicos sintéticos. Véase, por ejemplo, Vu y Hirschebein, Tetrahedron Lett. 1991, 32: 30005-30008. Los oligonucleótidos pueden modificarse a través de procedimientos químicos conocidos para los expertos en la técnica, incluidos la encapsulación en liposomas o la unión química a esteroides, anticuerpos y receptores celulares.
Una forma de realización preferida de la invención es un oligonucleótido complementario a una secuencia nucleotídica de MARCKS endógena que se encuentra en la células que se va a tratar o con la suficiente complementariedad como para que permita una hibridación entre hebras estable entre el oligonucleótido y un nucleótido MARCKS endógeno, y que inhiba la expresión del gen de MARCKS. Un oligonucleótido preferido es uno que sea complementario a la secuencia nucleotídica de MARCKS derivado o seleccionado de un mamífero, en particular de un ser humano.
Los oligonucleótidos de la presente invención pueden ser oligodesoxirribonucleótidos y oligorribonucleótidos, incluidos oligodesoxirribonucleótidos y oligorribonucleótidos modificados. Es más, los oligonucleótidos de la invención pueden estar compuestos por combinaciones de desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos. Además, los oligonucleótidos de la invención también pueden incluir subunidades modificadas. Por ejemplo, la invención puede incluir oligodesoxirribonucleótidos fosforotioatos. Se prefiere que los oligonucleótidos de la invención se modifiquen para incrementar la estabilidad y prevenir la degradación intra y extracelular. Es más preferible que los oligonucleótidos de la invención se modifiquen para incrementar su afinidad por las secuencias diana y su transporte a las células adecuadas y a los compartimentos celulares cuando se liberen en un mamífero en una forma farmacéuticamente activa.
Se prefiere que los oligonucleótidos de la invención sean oligonucleótidos antisentido. los oligonucleótidos de la invención pueden estar dirigidos a una porción no codificadora de una MARCKS o dirigidos a secuencias codificadoras del gen, y pueden incluir una unión intrón-exón (es decir, varios nucleótidos en uno o ambos lados de la unión intrón-exón).
Los oligonucleótidos de la invención pueden administrarse por cualquier procedimiento que produzca contacto del oligonucleótido con el tejido o la célula diana en el sujeto que se está tratando, incluidas pero no limitados a ellas, la administración oral, la administración tópica y la inhalación. Las composiciones farmacéuticas que comprenden los oligonucleótidos pueden estar en formas de dosificación sólidas, tales como cápsulas, comprimidos y polvos, o en formas de dosificación líquidas, tales como elixires, jarabes y suspensiones. La dosis administrada varía en función de factores tales como: las características farmacodinámicas; su modo y vía de administración; la edad, estado de salud y peso del receptor; la naturaleza y la extensión de los síntomas; el tipo de tratamiento concurrente y la frecuencia del tratamiento y el efecto deseado. Las dosis eficaces son aquéllas que son capaces de inhibir la producción de mucus en las vías respiratorias a un nivel que alivia, reduce o elimina los síntomas o trastornos asociados con la producción de mucus.
Los oligonucleótidos puede administrarse solos o combinados con otros compuestos de la invención, otros compuestos farmacéuticos o con otros tratamientos. Preferentemente, los oligonucleótidos se administran con un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable seleccionado según la vía de administración seleccionada y la práctica farmacéutica estándar.
La inhibición de la secreción de mucus, a través de la inhibición de la función de la proteína MARCKS en las células secretoras epiteliales, es un objetivo de esta invención. Para conseguir este fin, la invención proporciona medicamentos y composiciones útiles en procedimientos de inhibición de la secreción de mucus que comprenden poner en contacto una célula secretora de mucus con una cantidad inhibidora de la expresión del gen de MARCKS de un oligonucleótido sustancialmente complementario a una secuencia nucleotídica del gen de MARCKS endógena. La lipofectina puede usarse como vehículo del oligonucleótido. Los oligonucleótidos de la invención se administran a mamíferos o aves, y preferentemente a seres humanos, en cantidades o concentraciones terapéuticamente eficaces que son eficaces para inhibir o reducir la producción de mucus en el tejido o el órgano diana.
Los oligonucleótidos de la invención serán capaces de alcanzar su diana intracelular para inhibir o reducir la expresión de la proteína MARCKS en la misma. Por tanto, la invención proporciona medicamentos y composiciones útiles en procedimientos de inhibición de la secreción de mucus que comprenden poner en contacto al menos un elemento de la maquinaria de expresión génica de la MARCKS con una cantidad inhibidora de un oligonucleótido. Para los propósitos de la invención, los elementos de la maquinaria de expresión génica pueden comprender cualquier secuencia de nucleótidos de un gen de MARCKS, la secuencia de nucleótidos de ARN empalmado transcrito de un gen, de ARN sin empalmar y de ARN parcialmente empalmados transcritos de un gen, híbridos ADN-ARN que comprenden la secuencia derivada de un gen, tal como en los genes en transcripción activa, ARN transcrito de un gen unido a proteínas, y cualquier molécula o estructura que se conozca en la técnica que está implicada en la expresión génica.
La patente de EE.UU. nº 5.858.784 concedida a Debs y col. proporciona u procedimiento para administrar ácidos nucleicos a las células pulmonares de un sujeto mediante la preparación de una mezcla ácido nucleico-liposoma adecuada para nebulización, nebulizar la mezcla y depositar la mezcla nebulizada resultante en los pulmones del sujeto. LA secuencia de ácido nucleico puede incluir secuencias de ADN que codifican polipéptidos que son directa o indirectamente responsables de un efecto terapéutico, o secuencias nucleotídicas activas tales como secuencias antisentido y ribozimas. Los constructos de ácido nucleico puede proporcionarse a las células del sujeto como cassettes de expresión; preferentemente, el constructo no se integra en el genoma de la célula huésped y se introduce en el huésped como parte de un vector de expresión que no se integra.
ARN bicatenario y ribozimas
Recientemente se ha mostrado que la introducción de ARN bicatenario (ARNdc) puede alterar específicamente la actividad de genes que contengan secuencias homólogas, posiblemente mediante efectos postranscripcionales. Montgomery y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 15502 (1998); Ngo y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 14687 (1998). En consecuencia, los procedimientos de la presente invención pueden llevarse a cabo mediante la introducción de ARNdc en una célula secretora de mucus, donde el ARNdc tiene la suficiente similitud de secuencia con el ARN de un gen de MARCKS endógena como para que resulte en una reducción de la proteína MARCKS en la célula (en comparación con la que ocurriría en ausencia del ARNdc exógeno).
La administración de ARNdc puede llevarse a cabo usando los procedimientos comentados anteriormente en relación con la administración de los oligonucleótidos antisentido y los péptidos.
En una forma alternativa de realización de la presente invención, se puede introducir en la célula diana ADN que codifica una molécula de ARN enzimático (ribozima).Las ribozimas están dirigidas contra y escinden el transcrito del ARNm de la proteína MARCKS endógena de la célula. El ADN que codifica las moléculas de ARN enzimático puede producirse según técnicas conocidas (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 4.987.071). La producción de tal molécula de ARN enzimático y la alteración de la producción de la proteína MARCKS afecta a la producción de mucus por la célula diana de esencialmente el mismo modo que lo hace la producción de una molécula de ARN antisentido.
Procedimientos de detección selectiva
La presente invención proporciona un procedimiento para detectar de forma selectiva compuestos por su capacidad para afectar (intensificar o inhibir) la producción de mucus. Se pueden usar procedimientos químicos como os conocidos en la técnica para generar un gran número de compuestos estructuralmente diversos, que después se pueden someter a detección selectiva. Tales procedimientos de detección selectiva comprenden proporcionar un cultivo de células secretoras de mucus, tales como los cultivos de células epiteliales bronquiales humanas normales descritos en el Ejemplo 1 en la presente memoria descriptiva. Se administra un compuesto de prueba a las células y las células también se pueden exponer a un compuesto conocido porque estimula la producción de mucus (por ejemplo, PMA, UTP, 8-bromo-GMPc). El compuesto de prueba y el compuesto estimulador pueden administrarse a las células mediante, por ejemplo, exposición de las células a medios que contienen los compuestos. Las células pueden, por ejemplo, incubarse previamente con el compuesto de prueba primero y después coincubarse con el compuesto estimulador y el compuesto de prueba. Como alternativa se puede omitir la etapa de preincubación. La capacidad del compuesto de prueba para unirse a la membrana del gránulo de mucina (o a un receptor relacionado con la membrana del gránulo de mucina) o a proteína MARCKS endógena en el sitio de unión de la membrana del gránulo de mucina se valora mediante la detección de si el compuesto de prueba inhibe la unión de la MARCKS endógena al gránulo de mucina. Tal detección puede llevarse a cabo mediante procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo mediante el marcaje del compuesto de prueba con una molécula detectable.
Se conocen moléculas detectables por medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmmunoquímicos, eléctricos y ópticos. Entre las moléculas detectables por medios ópticos se incluyen marcadores fluorescentes (fluoresceína, rojo Texas, Proteína Verde Fluorescente). Se conocen procedimientos para visualizar células intactas, incluidas la microscopia de gammagrafía-láser confocal en tiempo real y la microscopia de gammagrafía-láser de dos fotones.
El mucus secretado por las células también se puede medir tras un periodo de tiempo predeterminado, por ejemplo usando un ensayo de ELISA como se conoce en la técnica. Asimismo se puede comparar la secreción de mucus de las células expuestas al compuesto de prueba con la de las células control que no expusieron al compuesto de prueba. Una disminución en la secreción de mucus por las células de prueba en comparación con las células control indica que el compuesto de prueba inhibe la secreción de mucus y un incremento en la secreción de mucus por las células de prueba en comparación con las células control indica que el compuesto de prueba intensifica la secreción de mucus.
Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar de un modo más completo la presente invención y no deben interpretarse como limitantes de la misma.
Ejemplo 1 Valoración in vitro de la secreción de mucus
Sistema de cultivo celular: Expansión y crioconservación. Células epiteliales bronquiales primarias humanas normales (NHBE) (Clonetics, San Diego, CA)se cultivaron en matraces aireados T75 de cultivo tisular (500 células/cm^{2}) en medio epitelial bronquial basal (BEBM; Clonetics, San Diego, CA) con 25 ng/ml de factor de crecimiento epidérmico recombinante humano (EGF; Intergen, Purchase, NY), 65 ng/ml de extracto hipofisiario bovino (preparado mediante los procedimientos de Bertolero y col. Exp. Cell Res 155: 64, 1984), ácido todo-trans retinoico 5 x 10-8 M, 1,5 \mug/ml de seroalbúmina bovina (Intergen, Purchase, NY), 20 UI/ml de nistatina (Gibco, Grand Island, NY), 0,5 \mug/ml de hidrocortisona, 5 \mug/ml de insulina, 10 \mug/ml de transferrina, 0,5 \mug/ml de epinefrina, 6,5 ng/ml de triyodotironina, 50 \mug/ml de gentamicina y 50 \mug/ml de anfotericina B (Clonetics, San Diego, CA). Una vez que han confluido, los cultivos se disociaron con tripsina/EDTA y se congelaron como PASSAGE-2 según los procedimientos de Clonetics Corporation.
Cultivo en la interfase aire-líquido de células NHBE. Tras la expansión, las células NHBE se cultivaron en la interfase aire/líquido según los procedimientos de Gray y col. con pequeñas modificaciones (Gray y col. Am J Respir Cell Mol Biol 14: 104, 1996). El cultivo en la interfase aire/líquido se inició mediante la siembra de células NHBE (passage-2, 2 x 104 células/cm^{2}) en insertos de cultivo Transwell-clear (25,5 mm, amaño de poro 0,45 \mum; costar, Cambridge, MA) que estaban recubiertos con una fina capa de colágeno tipo I de cola de rata (Collaborative Research, Bedford MA). Las células se cultivaron sumergidas en 70% de confluencia (5-7 días) en una mezcla 1:1 de medio de crecimiento de células epiteliales bronquiales (Clonetics, San Diego, CA): medio Eagle modificado de Dulbecco con niveles elevados de glucosa (BEGM:DMEM-H) con los mismos complementos descritos antes con la excepción de EGF (0,5 ng/ml). Cuando los cultivos alcanzaron una confluencia del 70%, se creó la interfase aire-líquido mediante la eliminación del medio apical y después se cambió el medio basal (BEGM:DMEM-H) todos los días. Después, las células se cultivaron durante otros 14 días en la interfase aire-líquido, un total de 21 días de cultivo.
ELISA del mucus: El mucus secretado por las células epiteliales de las vías respiratorias in vitro tras estimulación por los activadores se valoró usando un ELISA (procedimiento de captura de anticuerpos) (E. Harlow, D. Lane. "Antibodies: A laboratory Manual" Nueva York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988), en el que el mucus recogido se une directamente a la placa de ELISA. El mucus se detectó usando un anticuerpo creado contra el mucus de las vías respiratorias de mono (Lin y col. Am J Respir Cell Mol Biol 1:41, 1989).
Ejemplo 2 ARNm de MARCKS en células epiteliales bronquiales humanas
El ARN mensajero de MARCKS se detectó en células epiteliales bronquiales humanas del cultivo en la interfase aire/líquida mediante análisis Northern (Ausubel y col., eds. "Current Protocols in Molecular Biology". Nueva York: John Wiley y Sons, 1992) usando un ADNc de MARCKS (longitud aproximada de 1kb) como sonda marcada radioactivamente. El mensaje de MARCKS se incrementa a medida que estas células se diferencian más cuando se mantienen en un cultivo de la interfase aire/líquido.
Para detectar la proteína MARCKS en estas células, las células se marcaron con ácido mirístico-^{3}H (ya que la MARCKS está miristoilada) durante 16 horas en medio. Las células se lisaron y la proteína MARCKS inmunoprecipitó según el procedimiento de Spizz & Blackshear (J Biol Chem 271: 553, 1996) usando el anticuerpo monoclonal 2F12 (regalo del laboratorio de Blackshear).
Se descubrió que el activador de la PKC, PMA (100 nM) fosforilada la MARCKS en las células epiteliales de las vías respiratorias, mientras que el 4\alpha-PMA (un éster de forbol control que no activa la PKC) no fosforilaba la MARCKS. La fosforilación de la MARCKS por el PMA se atenuó con Calfostina C (500 nM). Las células NHBE también contenían cantidades sustanciales de proteína quinasa dependiente de GMPc tipo 1\alpha (PHG-1\alpha), que se localizaba en la fracción citosólica. Las células exhibían una actividad PKG constitutiva que aumentó mediante la incubación con dibutiril GMPc 100 \muM. Además, la fosforilación de la MARCKS inducida por PMA se invirtió mediante incubación con 8-Br-GMPc (10 \muM). El ácido ocadaico (500 nM) inhibió este efecto. Estos resultados indican que el 8-Br-GMPc activa una fosfatasa (tipo 1 ó 2A), que defosforila la MARCKS.
Ejemplo 3 Bloqueo de la secreción de mucina por el péptido MANS
Se probó el efecto sobre la secreción de mucus de un péptido miristoilado que contiene los primeros 24 aminoácidos de la proteína MARCKS humana (MANS secuencia N-terminal miristoilada; ID SEC Nº 1). Se usaron células epiteliales bronquiales humanas normales cultivadas como se ha descrito anteriormente. Las células de prueba se coincubaron durante 15 minutos en medios apical y basolateral con péptido MANS 1, 10 ó 100 \muM y después se coincubaron durante 15 minutos con el péptido y PMA 100 nM más 8-Br-GMPc 1 \muM (columnas 3-5 de la figura 1A). Las células control no se expusieron al péptido MANS pero se preincubaron en medio solo (columna 1 de la figura 1A) o medio con PMA y 8-Br-GMPc (columna 2 de la figura 1A). Un solo asterisco (*) indica que la respuesta medida fue estadísticamente diferente de del medio control (columna 1) y dos asteriscos (**) indican que la respuesta fue estadísticamente diferente a la observada en las células estimuladas que no se habían expuesto al péptido MANS (columna 2).
La estimulación con PMA y 8-Br-GMPc causó un incremento de al menos el 100% de la secreción de mucus sobre los niveles control. Sin embargo, este incremento se bloqueó con la preincubación y la coincubación con el péptido MANS. Los niveles de mucus secretado disminuyeron hasta los valores control cuando se usó 10 \muM de péptido y los niveles de mucus secretado fueron muy inferiores a los valores control tras la incubación con péptido MANS 100 \muM (Figura 1A).
También se descubrió que el péptido MANS (100 \muM) disminuía la secreción constitutiva (basal) de mucus a la hora de la incubación. Las células se trataron como se ha descrito anteriormente a excepción de que no se usó PMA ni 8-Br-GMPc. Además, un péptido control negativo de la misma composición aminoacídica que el péptido MANS en orden aleatorio (RNS; secuencia aleatoria en N terminal) no afectó a la secreción constitutiva de mucus. Los resultados se representan en la Figura 1B. Un solo asterisco (*) indica que la respuesta medida fue estadísticamente diferente de del medio control (columna 1).
Ejemplo 4 El péptido MANS bloquea la secreción de mucina inducida por UTP
Estos experimentos se llevaron a cabo de forma similar a los descritos en el Ejemplo 3. Para probar la secreción estimulada, las células se expusieron apical y basolateralmente a uridina-5' trifosfato (UTP) a una concentración de 0,1 mM en medio. Las células se preincubaron durante 15 minutos con el péptido MANS y los cultivos de prueba de coincubaron después con el péptido MANS y UTP durante 45 minutos.
Los resultados se muestran en la Figura 2, donde la columna 1 es el medio/control; la columna 2= UTP 0,1 mM; columna 3= UTP 0,1 mM y péptido MANS 1 \muM; columna 4= UTP 0,1 mM y péptido MANS 10 \muM; y columna 5= UTP 0,1 mM y péptido MANS 100 \muM. Un solo asterisco indica que la respuesta medida fue estadísticamente diferente de la del medio control (columna 1) y dos asteriscos (**) indican que la respuesta fue estadísticamente diferente de la observada en las células estimuladas que no se habían expuesto al péptido MANS (columna 2). El péptido MANS a 10 y 100 \muM redujo significativamente la secreción de mucus estimulada por UTP.
Ejemplo 5 Efecto del péptido MA-PSD sobre la secreción de mucus
Estos experimentos se llevaron a cabo con células epiteliales bronquiales humanas normales in vitro como se ha descrito anteriormente. Se preparó un péptido compuesto por los 25 aminoácidos del dominio del sitio de fosforilación de MARCKS (péptido MA-PSD; ID SEC Nº 2). Las células de prueba se preincubaron durante 15 minutos en medio apical y basolateral con péptido MA-PSD (1, 10 ó 100 \muM) y después se coincubaron durante 15 minutos con el péptido y el estímulo (PMA 100 nM más 8-Br-GMPc 1 \muM). Las células control se preincubaron con medio solo (columna 1 de la figura 3A) o con PMA 100 nM solo (columna 2) o con PMA 100 nM y 8-Br-GMPc 1 \muM (columna 3).
La estimulación por PMA y 8-Br-GMPc causó un incremento de aproximadamente el 100% en la secreción de mucus por encima de los niveles control. Este incremento se vio aumentado de forma dependiente de la dosis por la preincubación y la coincubación con el péptido MA-PSD, 1 ó 10 \muM. Es interesante el hecho de que los niveles estimulados de secreción de mucus no se vieron afectados por la presencia de péptido 100 \muM. Los resultados se representan en la Figura 3A. Los resultados con péptido MANS (1, 10 y 100 \muM) se proporcionan en la columna 7-9 para comparación. Un solo asterisco (*) indica que la respuesta medida fue estadísticamente diferente de del medio control (columna 1) y dos asteriscos (**) indican que la respuesta fue estadísticamente diferente a la observada en las células estimuladas que no se habían expuesto al péptido (columna 3).
También se midió el efecto del péptido MA-PSD (1, 10 y 100 \muM) sobre la secreción basal de mucina. Las células como se han descrito anteriormente se incubaron durante una hora con el péptido MA-PSD (sin PMA ni 8-Br-GMPc). Los resultados se representan en la figura 3B. Un solo asterisco (*) indica que la respuesta al péptido MA-PSD 100 \muM fue estadísticamente diferente de del medio control (columna 1), mientras que no se observó ninguna diferencia estadísticamente significativa cuando se usaron 1 ó 10 \muM de péptido (columnas 3 y 4).
Ejemplo 6 Inhibición de la secreción de mucus por los oligonucleótidos antisentido
Al usar un oligonucleótido antisentido dirigido contra el gen de MARCKS endógeno humano, la secreción de mucus se inhibió in vitro en células epiteliales de las vías respiratorias humanas. EL ensayo in vitro como se describe e el Ejemplo 1 se usó para probar los efectos de los oligonucleótidos antisentido frente al ARNm de la MARCKS.
Un proveedor comercial (Chemicon International, Temecula, CA; junto con Biognostik GmbH, Gottingen, Alemania) construyó un oligonucleótido antisentido basado en la secuencia génica de la MARCKS humana de Sakai y col., (Genomics 14: 175 (1992); Número de referencia en GenBank D10522, D90498). También se construyó un oligonucleótido control.
Se administraron los oligonucleótidos a los cultivos diferenciados de vías respiratorias mediante la incubación en medio con los oligonucleótidos (5 \muM) durante tres días. El oligonucleótido se suministró en la superficie apical de las células en 0,4 ml de medico con reactivo de lipofectina (2 \mug/ml; Gibco BRL). Las células se incubaron con el oligonucleótido en presencia de lipofectina durante 24 horas. Tras el cambio de medio, las células se incubaron con El oligonucleótido solo durante otras 48 horas. Para probar la capacidad de los oligonucleótidos para afectar a la secreción de mucus estimulada, las células de prueba se estimularon durante 15 minutos con PMA 100 nM y 8-Br-GMPc 1 \muM (activadores de PKC y de PKG, respectivamente).
Los resultados se muestran en la figura 5, donde la columna 1= medio/control; la columna 2= células estimuladas con PMA y 8-Br-GMPc; la columna 3= células expuestas al oligonucleótido control 5 \muM y estimuladas con PMA y 8-Br-GMPc y la columna 4= células expuestas al oligonucleótido antisentido 5 \muM y estimuladas con PMA y 8-Br-GMPc. Un solo asterisco (*) indica que la respuesta medida fue estadísticamente diferente de la del medio control (columna 1) y dos asteriscos (**) indican que la respuesta fue estadísticamente diferente a la observada en las células estimuladas que no se habían expuesto a ningún oligonucleótido (columna 2).
El mucus secretado por las células epiteliales de las vías respiratorias tras la estimulación con los activadores de PKC y PKG se valoró usando un ELISA (procedimiento de captura de anticuerpos). El oligonucleótido control (columna 3) no tuvo ningún efecto sobre las secreción de mucus estimulada. Por el contrario, el oligonucleótido antisentido (columna 4) causó una disminución estadísticamente significativa en la secreción de mucus en comparación den los niveles estimulados.
Estos resultados indican que los oligonucleótidos antisentido de la MARCKS inhiben la secreción de mucus estimulada, aunque se puede mantener un nivel basal de secreción de mucus mediante la selección de las dosis adecuadas. Por el contrario, los oligonucleótidos control no tuvieron ningún efecto sobre la secreción estimulada.
Lo anterior es ilustrativo de la presente invención y no debe interpretarse como limitante de la misma. La invención se define en las siguientes reivindicaciones y en la misma deben incluirse equivalentes de las reivindicaciones.
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
1 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
2 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1885
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Homo sapiens 
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<221> CDS
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<222> (309)..(1307)
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<400> 3
3
4
5 
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<210> 4
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<211> 332
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
6
7 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
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<211> 2589
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Homo sapiens 
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<220>
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<221> CDS
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<222> (370)..(1368)
\newpage
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<400> 5
8
9
10 
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<210> 6
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<211> 332
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
11
12

Claims (38)

1. Uso de un inhibidor de la secreción de mucus relacionado con la proteína MARCKS para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad asociada con la hipersecreción de mucus, en el que dicho inhibidor es un péptido.
2. Uso según la reivindicación 1, en el que dicho péptido comprende la ID SEC Nº 1.
3. Uso según la reivindicación 1, en el que dicho inhibidor comprende un fragmento activo de una proteína MARCKS.
4. Uso según la reivindicación 3, en el que dicho inhibidor es un péptido que tiene una secuencia que comprende de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 aminoácidos contiguos de la ID SEC Nº 3.
5. Uso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho inhibidor se une a un sitio diana seleccionado de:
(a) membranas del gránulo de mucina en el sitio unido por la proteína MARCKS; y
(b) proteína MARCKS en el sitio de unión del gránulo de mucina.
6. Uso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho inhibidor es un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 aminoácidos contiguos de una secuencia en el extremo N de una proteína MARCKS.
7. Uso según la reivindicación 6, en el que dicho péptido está miristoilado.
8. Uso según la reivindicación 1, en el que dicho inhibidor es un péptido que tiene una secuencia que comprende de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 aminoácidos contiguos de la ID SEC Nº 3.
9. Uso de un inhibidor de la secreción de mucus relacionado con la proteína MARCKS para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad asociada con la hipersecreción de mucus, en el que dicho inhibidor es un constructo antisentido dirigido contra moléculas nucleotídicas endógenas que codifican una proteína MARCKS.
10. Uso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho inhibidor es para la administración a las vías respiratorias o al tracto gastrointestinal de un sujeto mamífero o es para la administración mediante inhalación.
11. Uso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho inhibidor debe introducirse en las células a través de la administración en aerosol a los pulmones.
12. Uso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho inhibidor debe introducirse en las células en un liposoma.
13. Uso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el mucus se secreta desde una célula epitelial contenida en las membranas mucosas de las vías respiratorias o las membranas mucosas del tracto gastrointestinal.
14. Uso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicha enfermedad es una enfermedad de un sujeto mamífero y se selecciona entre bronquitis, asma, fibrosis quística, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, enfisema, neumonía, gripe, rinitis y resfriado común.
15. Uso de una proteína MARCKS, o un fragmento de la misma, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad asociada con la baja secreción de mucus, en el que el fragmento es un fragmento intensificador de la secreción.
16. Uso según la reivindicación 15, en el que el mucus se secreta desde una célula epitelial contenida en las membranas mucosas de las vías respiratorias, las membranas mucosas del tracto gastrointestinal, las membranas genitourinarias o las membranas mucosas oculares.
17. Uso según la reivindicación 15 ó 16, en el que la proteína tiene una secuencia que comprende de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 aminoácidos contiguos de la ID SEC Nº 3.
18. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, en el que dicho medicamento es para la administración a las vías respiratorias o al tracto gastrointestinal de un sujeto mamífero o para la administración mediante inhalación.
19. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18 para la administración en el ojo de un sujeto mamífero o para la administración tópica en el epitelio vaginal.
20. Uso de un compuesto que se une a un inhibidor endógeno de la proteína MARCKS en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad asociada con la baja secreción de mucus, en el que el medicamento intensifica la secreción de mucus por una célula secretora de mucus.
21. Uso según la reivindicación 20, en el que dicho compuesto es un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 aminoácidos contiguos de un dominio del sitio de fosforilación de una proteína MARCKS.
22. Uso según la reivindicación 21, en el que dicho péptido está miristoilado.
23. Uso según la reivindicación 20, en el que el inhibidor endógeno es calmodulina.
24. Una formulación farmacéutica que comprende un fragmento peptídico de la MARCKS inhibidor de mucus y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
25. Una formulación farmacéutica según la reivindicación 24, en el que dicho péptido tiene una secuencia de aminoácidos que comprende la ID SEC Nº 1.
26. Una formulación farmacéutica según la reivindicación 25, en el que dicho péptido tiene una secuencia que comprende de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 aminoácidos contiguos de la ID SEC Nº 3.
27. Un oligonucleótido compuesto por aproximadamente 10 a 50 nucleótidos que tiene una secuencia nucleotídica que hibrida con moléculas nucleotídicas que codifican una proteína MARCKS en condiciones fisiológicas, y en el que dicho oligonucleótido inhibe la expresión de dicha proteína MARCKS cuando se administra a una célula que contiene dichas moléculas nucleotídicas endógenas.
28. Una formulación farmacéutica que comprende un oligonucleótido según la reivindicación 27 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
29. Una formulación farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 24 a 26 o la reivindicación 28, en la que dicha composición está en aerosol.
30. Una formulación farmacéutica de la reivindicación 27 o la reivindicación 28, en la que dicho oligonucleótido se transporta dentro de un liposoma.
31. Un procedimiento in vitro de detección selectiva de un compuesto de prueba según la capacidad para unirse, en una célula secretora de mucus, a un sitio seleccionado de (a) membranas de gránulo de mucina en el sitio unido por la proteína MARCKS y (b) una proteína MARCKS en el sitio de unión del gránulo de mucina, comprendiendo dicho procedimiento la administración de dicho compuesto de prueba a una célula secretora de mucus y después la detección de si dicho compuesto de prueba inhibe la unión de proteína MARCKS endógena a la membrana del gránulo de mucina.
32. Un procedimiento según la reivindicación 31, en el que dichas células son células epiteliales bronquiales humanas normales.
33. Un procedimiento según la reivindicación 31 o la reivindicación 32, que además comprende administrar un compuesto conocido para estimular la secreción de mucus por dicha célula.
34. Un procedimiento según la reivindicación 33, en el que dicho compuesto conocido que estimula la secreción de mucus se selecciona de entre uridina 5'-trifosfato (UTP), PMA y 8-bromo-GMPc.
35. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 31 a 34, en el que dicho compuesto de prueba se selecciona de un fragmento peptídico de una proteína MARCKS, y análogos peptídicos de la misma.
36. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 31 a 35, en el que dicho compuesto de prueba se marca con una molécula detectable.
37. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 31 a 36, en el que dicho compuesto de prueba es un anticuerpo que se une de forma específica a la proteína MARCKS.
38. Una proteína MARCKS para usar como medicamento.
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