ES2214744T3 - Regulacion de tejido epitelial por medio de polipeptidos tipo hedgehog (erizo) y formulaciones y usos relacionados con la misma. - Google Patents

Abstract

Método in vitro que es para modular el estado de crecimiento de una célula epitelial y comprende el paso de poner la célula epitelial ectópicamente en contacto con una cantidad de un polipéptido que comprende una parte extracelular bioactiva de una proteína hedgehog (erizo) que es efectiva para alterar la velocidad de proliferación de la célula epitelial.

Description

Regulación de tejido epitelial por medio de polipéptidos tipo Hedgehog (erizo) y formulaciones y usos relacionados con la misma.

Antecedentes de la invención

La formación de patrón es la actividad en virtud de la cual las células embrionarias forman disposiciones espaciales ordenadas de tejidos diferenciados. La complejidad física de los organismos superiores surge durante la embriogénesis a través de la interacción del linaje celular por vía intrínseca y de la señalización celular por vía extrínseca. Las interacciones inductivas son esenciales para la patronización embrionaria en el desarrollo de los vertebrados desde el más temprano establecimiento del plan del cuerpo hasta la patronización de los sistemas orgánicos, hasta la generación de los diversos tipos de células durante la diferenciación tisular (Davidson, E., (1990) Development 108: 365-389; Gurdon, J. B., (1992) Cell 68: 185-199; Jessell, T. M. et al., (1992) Cell 68: 257-270). Son variados los efectos de las interacciones celulares en el desarrollo. Típicamente, las células respondedoras son desviadas de una ruta de diferenciación celular a otra por células inductoras que difieren tanto del estado de no inducción como del estado de inducción de las células respondedoras (inducciones). A veces las células inducen a las células vecinas a las mismas a diferenciarse como ellas mismas (inducción homoiogénetica); y en otros casos una célula inhibe a las que son sus vecinas para que no se diferencien como ella. Las interacciones celulares en las etapas tempranas del desarrollo pueden ser secuenciales, de forma tal que una inducción inicial entre dos tipos de células conduce a una progresiva amplificación de diversidad. Además, las interacciones inductivas tienen lugar no solamente en los embriones, sino también en células adultas, y pueden actuar estableciendo y manteniendo patrones morfogenéticos, así como induciendo diferenciación (J.B. Gurdon (1992) Cell 68:185-199).

Miembros de la familia Hedgehog (Erizo) de moléculas señalizadoras median muchos importantes procesos de patronización a corto y a largo plazo durante el desarrollo de los invertebrados y los vertebrados. En la mosca, un solo gen hedgehog (erizo) regula la patronización de los discos imaginales y segmentales. En contraste con ello, en los vertebrados una familia de genes erizo interviene en el control de la asimetría de izquierda-derecha, de la polaridad en el sistema nervioso central, de los somitas y de los esbozos de los miembros, de la organogénesis, de la condrogénesis y de la espermatogénesis.

El primer gen erizo (hedgehog) fue identificado mediante una selección genética en la mosca de la fruta Drosophila melanogaster (Nüsslein-Volhard, C. y Wieschaus, E. (1980) Nature 287, 795-801). Esta selección identificó una serie de mutaciones que afectaban al desarrollo embrionario y larval. En 1992 y 1993 fue descrita la naturaleza molecular del gen hedgehog (hh) de Drosophila (C.F., Lee et al. (1992) Cell 71, 33-50), y desde entonces han sido aislados a partir de varias especies de vertebrados varios homólogos de hedgehog. Mientras que ha sido encontrado tan sólo un gen hedgehog (erizo) en la Drosophila y en otros invertebrados, en los vertebrados están presentes múltiples genes Hedgehog (Erizo).

Las diversas proteínas Hedgehog (Erizo) constan de un péptido señal, una región N-terminal altamente conservada, y un dominio C-terminal más divergente. Además de la separación de la secuencia señal en la vía secretoria (Lee, J.J. et al. (1992) Cell 71:33-50; Tabata, T. et al. (1992) Genes Dev. 2635-2645; Chang, D.E. et al. (1994) Development 120:3339-3353), las proteínas precursoras de Hedgehog (Erizo) experimentan una segmentación autoproteolítica interna que depende de secuencias conservadas en la parte C-terminal (Lee et al. (1994) Science 266:1528-1537; Porter et al. (1995) Nature 374:363-366). Esta autofragmentación conduce a un péptido N-terminal de 19 kD y a un péptido C-terminal de 26-28 kD (Lee et al. (1992) supra; Tabata et al. (1992) supra; Chang et al. (1994) supra; Lee et al. (1994) supra; Bumcrot, D.A., et al. (1995) Mol. Cell. Biol. 15:2294-2303; Porter et al. (1995) supra; Ekker, S.C. et al. (1995) Curr. Biol. 5:944-955; Lai, C.J. et al. (1995) Development 121:2349-2360). El péptido N-terminal se mantiene estrechamente asociado a la superficie de las células en las cuales fue sintetizado, mientras que el péptido C-terminal es libremente difusible tanto in vitro como in vivo (Lee et al. (1994) supra; Bumcrot, et al. (1995) supra; Mart', E. et al. (1995) Development 121:2537-2547; Roelink, H. et al. (1995) Cell 81:445-455). Es interesante el hecho de que la retención en la superficie celular del péptido N-terminal es dependiente de la autofragmentación, al ser una forma truncada de HH codificado por un RNA que termina precisamente en la posición normal de fragmentación interna difusible in vitro (Porter et al. (1995) supra) e in vivo (Porter, J.A. et al. (1996) Cell 86, 21-34). Estudios bioquímicos han demostrado que la fragmentación autoproteolítica de la proteína precursora de HH tiene lugar a través de un intermedio tioéster interno que a continuación es escindido en una sustitución nucleofílica. Es probable que el nucleófilo sea una pequeña molécula lipofílica que queda enlazada mediante enlace covalente al extremo C-terminal del N-péptido (Porter et al. (1996) supra), atándolo a la superficie de la célula. Las implicaciones biológicas son profundas. Como resultado de la atadura, es generada en la superficie de las células productoras de Hedgehog una alta concentración local de péptido Hedgehog (Erizo) N-terminal. Es este péptido N-terminal el que es tanto necesario como suficiente para las actividades de señalización de Hedgehog a corto y a largo plazo en la Drosophila y en los vertebrados (Porter et al. (1995) supra; Ekker et al. (1995) supra; Lai et al. (1995) supra; Roelink, H. et al. (1995) Cell 81:445-455; Porter et al. (1996) supra; Fietz, M.J. et al. (1995) Curr. Biol. 5:643-651; Fan, C.-M. et al. (1995) Cell 81:457-465; Mart', E., et al. (1995) Nature 375:322-325; Lopez-Martinez et al. (1995) Curr. Biol 5:791-795; Ekker, S.C. et al. (1995) Development 121:2337-2347; Forbes, A.J. et al. (1996) Development 122:1125-1135).

El HH (Hedgehog) ha estado implicado en procesos de patronización a corto y a largo plazo en varios sitios durante el desarrollo de la Drosophila. En el establecimiento de la polaridad de segmentos en embriones iniciales, el mismo tiene efectos a corto plazo que parecen estar mediados directamente, mientras que en la patronización de los discos imaginales, induce efectos a largo plazo por vía de la inducción de señales secundarias.

En vertebrados, han sido clonados recientemente en los últimos años varios genes hedgehog (erizo) (véase la Tabla 1). De estos genes, el Shh es el que ha recibido la mayor parte de la atención experimental, dado que el mismo es expresado en distintos centros organizadores que son las fuentes de señales que patronizan los tejidos contiguos. La evidencia reciente indica que el Shh interviene en estas interacciones.

La interacción de una proteína hedgehog (erizo) con uno de sus receptores afines, patched, pone en movimiento una cascada que supone la activación e inhibición de efectores del lado de cola, cuya última consecuencia es, en algunos casos, un cambio detectable en la transcripción o traducción de un gen. Los objetivos transcripcionales de la señalización hedgehog son el propio gen patched (Hidalgo e Ingham, 1990 Development 110, 291-301; Marigo et al., 1996) y los homólogos de vertebrados del gen cubitus interruptus (Ci) de drosophila, los genes GLI (Hui et al. (1994) Dev Biol 162:402-413). Se ha demostrado que la expresión del gen patched es inducida en células del esbozo de los miembros y de la placa neural que responden al Shh. (Marigo et al. (1996) Development 122:1225-1233). Los genes GLI codifican putativos factores de transcripción que tienen dominios dedo de cinc de fijación a DNA (Orenic et al. (1990) Genes & Dev 4:1053-1067; Kinzler et al. (1990) Mol Cell Biol 10:634-642). Se ha descrito que la transcripción del gen GLI es regulada en el sentido de un incremento en respuesta a hedgehog en esbozos de los miembros, mientras que la transcripción del gen GLI3 es regulada en el sentido de un decremento en respuesta a la inducción de hedgehog (Marigo et al. (1996) Development 122:1225-1233). Además, se ha demostrado que elevados niveles de Ci son suficientes para activar el gen patched (ptc) y otros genes objetivo hedgehog, incluso en ausencia de actividad de hedgehog.

Chemical Abstracts XP-002098623 describe el uso de dibutiril-cAMP para el tratamiento de trastornos cutáneos tales como heridas, quemaduras y congelamientos por exposición al frío en forma de un ungüento;

Chemical Abstracts XP-002098624 describe un tónico capilar que comprende dibutiril-cAMP para promover el crecimiento del cabello;

Chemical Abstracts XP-002098625 describe una loción que comprende 5-isoquinolina sulfonamidas inhibidoras de proteína quinasa como estimulador del crecimiento del cabello;

la EP-A-0 249 873 informa sobre el tratamiento de úlceras cutáneas mediante soluciones/ungüentos que comprenden (análogos de) cAMP tales como dibutiril-cAMP;

la WO 96/09806 describe la reducción del crecimiento capilar mediante composiciones tópicas que comprenden inhibidores de PKC (proteína quinasa C) tales como 1-(5-isoquinolinilsulfonil)2-metilpiperazina;

la WO 95/18856 describe composiciones farmacéuticas que comprenden proteína hedgehog (erizo) para administración tópica.

Un aspecto de la presente invención se refiere a un método in vitro que es para modular el estado de crecimiento de una célula epitelial y comprende el paso de poner a una célula epitelial ectópicamente en contacto con una cantidad de un polipéptido que comprende una parte extracelular bioactiva de una proteína hedgehog (erizo) que es efectiva para alterar la velocidad de proliferación de la célula epitelial.

Breve exposición de la invención

Una realización de la presente solicitud se refiere a un método para modular el estado de crecimiento de una célula epitelial a base de poner a la célula epitelial ectópicamente en contacto in vitro con un agente terapéutico hedgehog en una cantidad que es efectiva para alterar la velocidad de proliferación de la célula epitelial (es decir para promoverla o inhibirla), p. ej. con respecto a la ausencia de administración del polipéptido hedgehog. El método que es objeto de la presente puede ser usado, por ejemplo, para modular el estado de crecimiento de un tejido epitelial, tal como para inducir la formación de piel o de otro tejido cutáneo, o para inducir el crecimiento del pelo.

El método que es objeto de la presente es ejecutado usando un polipéptido que incluye una parte hedgehog (erizo) que comprende al menos una parte extracelular bioactiva de una proteína hedgehog (erizo), incluyendo p. ej. la parte hedgehog al menos 50, 100 ó 150 residuos de aminoácidos (contiguos) de una mitad N-terminal de una proteína hedgehog (erizo). En realizaciones preferidas, la parte hedgehog incluye al menos una parte de la proteína hedgehog (erizo) que corresponde a un fragmento de 19 kd del dominio extracelular de una proteína hedgehog (erizo).

En determinadas realizaciones preferidas, la parte hedgehog (erizo) tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos en un 60, 75, 85 ó 95 por ciento idéntica a una proteína hedgehog (erizo) de cualesquiera de las ID SEC Núms. 10-18 ó 20, si bien se contemplan también como útiles en el presente método secuencias idénticas a esas secuencias registradas en la enumeración de secuencias. La parte hedgehog (erizo) puede ser codificada por un ácido nucleico que se hibride bajo condiciones rigurosas con una secuencia de ácidos nucleicos de cualesquiera de las ID SEC Núms. 1-9 ó 19, y p. ej. la parte hedgehog (erizo) puede ser codificada por un gen hedgehog (erizo) de vertebrado, y en especial por un gen hedgehog (erizo) humano.

En ciertas realizaciones, el polipéptido hedgehog es modificado con una o varias mitades de esterol, como p. ej. de colesterol o de un derivado del mismo.

En ciertas realizaciones, el polipéptido hedgehog es modificado con una o varias mitades de ácido graso, tal como una mitad de ácido graso seleccionada de entre los miembros del grupo que consta de miristoilo, palmitoilo, estearoilo y araquidoilo.

En ciertas realizaciones, el polipéptido hedgehog es modificado con uno o varios hidrocarburos aromáticos tales como benceno, perileno, fenantreno, antraceno, naftaleno, pireno, criseno o naftaceno.

En ciertas realizaciones, el polipéptido hedgehog es modificado una o varias veces con un alquilo o cicloalquilo de C_{7}-C_{30}.

En otras realizaciones, el método que es objeto de la presente puede ser ejecutado mediante el uso de un constructo de activación génica, estando el constructo de activación génica diseñado para recombinarse con un gen hedgehog genómico del paciente para proporcionar una secuencia reguladora transcripcional heteróloga ligada operativamente a una secuencia codificante del gen hedgehog.

En otras realizaciones adicionales, el método que es objeto de la presente puede ser puesto en práctica mediante el uso de un constructo de terapia génica que codifique unpolipéptido hedgehog. Por ejemplo, el constructo de terapia génica puede preverse en una composición seleccionada de entre los miembros de un grupo que conste de una partícula viral recombinante, un liposoma y un agente de fijación de ácido nucleico policatiónico.

La invención puede ser usada para tratar, p. ej., un trastorno epitelial, tal como en el control de un proceso de curación de heridas, para parte de tratamientos tales como el tratamiento de quemaduras, la regeneración cutánea, los injertos cutáneos, el tratamiento de llagas por decúbito, el tratamiento de úlceras dérmicas, la reducción de cicatrices post-cirugía y el tratamiento de la colitis ulcerosa. En el control del crecimiento del pelo, la invención puede ser usada para parte de un tratamiento de la alopecia.

Otro aspecto adicional de la presente invención se refiere a preparaciones de un agente terapéutico hedgehog formuladas para aplicación tópica a tejido epitelial, como p. ej. a la piel, incluyendo tales formulaciones un polipéptido que comprende una secuencia de polipéptido hedgehog que incluye un fragmento bioactivo de una proteína hedgehog (erizo), siendo dicho polipéptido formulado para aplicación tópica a tejido epitelial.

Descripción detallada de la invención

Las Figuras 1A, B y C ilustran la inducción del crecimiento del pelo en ratones tratados con varias formulaciones de agente terapéutico hedgehog.

Descripción detallada de la invención

La epidermis de la piel normal es un complejo tejido epitelial que contiene queratinocitos que proliferan, se diferencian y se descaman, estando dicho tejido epitelial estratificado de forma tal que los cambios morfológicos y funcionales que se producen en los queratinocitos tienen lugar en progresión ordenada. La epidermis normal se mantiene en un estado de régimen dinámico, al compensar continuamente la proliferación de queratinocitos la pérdida de las células que se desprenden de la superficie de la piel. Dentro de la epidermis, la proliferación tiene lugar en la capa basal de queratinocitos que están unidos a la membrana basal subyacente, y las células experimentan la diferenciación terminal al migrar a través de las capas suprabasales, desprendiéndose finalmente de la superficie del tejido en forma de escamas muertas cornificadas. Han sido definidas mediante análisis de cinética celular tres subpoblaciones de queratinocitos basales, que son las de las células troncales, las células amplificadoras del tránsito y las células comprometidas. Las células troncales conservan una gran capacidad de autorenovación a lo largo de su vida adulta, y son en última instancia las responsables del mantenimiento y la reparación de la epidermis. Las descendientes de las células troncales pueden ser ellas mismas células troncales o bien células conocidas como células amplificadoras del tránsito. Las células amplificadoras del tránsito se dividen un pequeño número de veces, pero tienen una alta probabilidad de producir hijas que se retiran irreversiblemente del ciclo celular y quedan comprometidas a diferenciarse terminalmente.

I. Breve exposición

La presente solicitud está relacionada con el descubrimiento de que preparaciones de polipéptidos hedgehog pueden ser usadas para controlar la formación y/o el mantenimiento de tejido epitelial. Como se describe en los ejemplos que se adjuntan, las proteínas erizo están implicadas en la proliferación de células troncales epiteliales y pueden aportar señales iniciales que regulan la diferenciación de las células troncales para su conversión en tejidos epiteliales. En general, una célula epitelial es puesta en contacto con una cantidad de un agente terapéutico hedgehog (definido infra) que produce por parte de la célula una respuesta atóxica de (I) inducción de formación de tejido epitelial o (II) inhibición de la formación de tejido epitelial, en dependencia de si el agente terapéutico hedgehog es un suficiente agonista para hedgehog o un suficiente antagonista para hedgehog. La invención es adecuada para células epiteliales que pueden estar dispersadas en cultivo o pueden ser parte de un tejido u órgano intacto. Además, la invención puede ser usada para células que estén en cultivo (in vitro), o para células que estén en un animal intacto (in vivo).

En un aspecto, la presente invención aporta preparaciones farmacéuticas para controlar la proliferación de tejido de origen epitelial utilizando como ingrediente activo un polipéptido hedgehog o un mimético del mismo. La invención se refiere también al control de la proliferación de tejido de origen epitelial por medio de las preparaciones farmacéuticas de la invención.

Las formulaciones que contienen agente terapéutico hedgehog según la presente invención pueden ser usadas como parte de regímenes en el tratamiento de trastornos o en la reparación quirúrgica o cosmética de tejidos epiteliales tales como piel y órganos cutáneos, tejido corneal, lenticular y ocular de otro tipo, membranas mucosas y epitelio periodontal. Los métodos y composiciones que aquí se describen permiten el tratamiento o la prevención de los de una variedad de tejidos epiteliales y mucosos dañados. Por ejemplo, el presente método puede ser usado para controlar procesos de curación de heridas, como puede ser por ejemplo deseable en conexión con toda cirugía que afecte a tejido epitelial, tal como es el caso de las cirugías dermatológicas o periodontales. Los ejemplos de reparación quirúrgica para los cuales la terapia con agente terapéutico hedgehog es un tratamiento candidato incluyen la regeneración cutánea y de graves quemaduras, los injertos cutáneos, las llagas por decúbito, las úlceras dérmicas, las fisuras, la reducción de cicatrices post-cirugía y la colitis ulcerosa.

En otro aspecto de la presente invención, las preparaciones que contienen agente terapéutico hedgehog pueden ser usadas para llevar a efecto el crecimiento del cabello, como es por ejemplo el caso del tratamiento de la alopecia, con el cual es potenciado el crecimiento del cabello, o por ejemplo en la remoción cosmética de pelo (depilación), con la cual es inhibido el crecimiento del pelo.

En determinadas realizaciones, las composiciones que son objeto de la presente pueden ser usadas para inhibir el crecimiento de tejido de origen epitelial, en lugar de para promoverlo. Por ejemplo, determinadas composiciones de las aquí descritas pueden ser aplicadas al tratamiento o a la prevención de las de una variedad de afecciones hiperplásicas o neoplásicas. El método puede encontrar aplicación para el tratamiento o la profilaxis de, p. ej., la psoriasis, la queratosis, el acné, las lesiones comedogénicas, la foliculitis y la seudofoliculitis, el queratoacantoma, las callosidades, la enfermedad de Darier, la ictiosis, el liquen plano, el molusco contagioso, el melasma, la enfermedad de Fordyce y los queloides o cicatrices hipertróficas. Determinadas formulaciones de las de la presente invención pueden ser también usadas como parte de regímenes de tratamiento en enfermedades autoinmunes para afectar la curación de las manifestaciones proliferativas del trastorno, o sea por ejemplo como parte de un tratamiento para úlceras aftosas, para pénfigo tal como pénfigo vulgar, pénfigo foliáceo, pénfigo vegetante o pénfigo eritematoso, para la epidermólisis, para lesiones del tipo lupus o para lesiones descamativas.

Los tratamientos con agente terapéutico hedgehog que son objeto de la presente son eficaces en sujetos tanto humanos como animales que sufran de estas afecciones. Los sujetos animales a los cuales es aplicable la invención comprenden tanto animales domésticos como ganado, criados ya sea como animales de compañía o bien con finalidades comerciales. Son ejemplos los perros, los gatos, el ganado bovino, los caballos, el ganado ovino, los cerdos y las cabras.

Otro aspecto adicional de la presente invención está relacionado con la estimulación del crecimiento y la regulación de la diferenciación de tejido epitelial en cultivo tisular.

Sin que ésta tenga por qué ser la única teoría válida, la inducción de la proliferación de células troncales por parte de las proteínas erizo puede ser debida al menos en parte a la capacidad de estas proteínas para antagonizar (directa o indirectamente) la regulación mediada por patched de la expresión génica y otros efectos fisiológicos mediados por esa proteína. Se entiende que el producto del gen patched, que es una proteína de la superficie de la célula, señaliza por una vía que ocasiona la represión transcripcional de miembros de las familias Wnt y Dpp/BMP de morfogenes, que son proteínas que imparten información posicional. En el desarrollo del sistema nervioso central y la patronización de los miembros en los vertebrados, la introducción de hedgehog disipa (desreprime) esta inhibición conferida por patched, permitiendo la expresión de determinados programas génicos.

Se ha descrito recientemente que mutaciones en la versión humana del gen patched, que es un gen que fue primeramente identificado en una vía de desarrollo de la mosca de la fruta, ocasionan un cáncer de piel hereditario y pueden contribuir a la aparición de cánceres de piel esporádicos. Véanse, por ejemplo, Hahn et al. (1996) Cell 86:841-851, y Johnson et al. (1996) Science 272:1668-1671. La demostración de que el carcinoma nevoide de células basales (NBCC) resulta de mutaciones en el gen patched humano aportó un ejemplo de los papeles que patched desempeña en el desarrollo post-embrionario. Estas observaciones han hecho que en la técnica se entienda que una actividad de patched es la de un gen supresor de tumores que puede actuar a base de inhibir las señales proliferativas de hedgehog. Nuestras observaciones que se exponen más adelante revelan nuevos papeles potenciales para la vía hedgehog/patched en el mantenimiento de la proliferación y diferenciación de las células epiteliales. En consecuencia, la presente invención contempla el uso de otros agentes que son capaces de imitar el efecto de la proteína hedgehog (erizo) en la señalización de patched, p. ej., como puede identificarse a partir de los análisis de selección de drogas que se describen más adelante.

II. Definiciones

Para mayor comodidad se recogen aquí determinadas expresiones que son empleadas en la descripción, en los ejemplos y en las reivindicaciones adjuntas.

La expresión "agente terapéutico hedgehog" se refiere a varias formas de polipéptidos hedgehog, así como peptidomiméticos, que pueden modular el estado de proliferación/diferenciación de células epiteliales a base de, como quedará claro a la luz del contexto de los ejemplos individuales, imitar o potenciar (actuar como un agonista para) o inhibir (actuar como un antagonista para) los efectos de una proteína hedgehog (erizo) que se da de manera natural. Un agente terapéutico hedgehog que imita o potencia la actividad de una proteína hedgehog (erizo) de tipo salvaje es un "agonista para hedgehog". A la inversa, un agente terapéutico hedgehog que inhibe la actividad de una proteína hedgehog (erizo) de tipo salvaje es un "antagonista para hedgehog".

En particular, la expresión "polipéptido hedgehog" engloba preparaciones de proteínas erizo y fragmentos peptidílicos de las mismas, en formas tanto agonistas como antagonistas como quedará claro a la luz del contexto específico.

En el sentido en el que se la utiliza en la presente, la expresión "fragmento bioactivo de una proteína erizo" se refiere a un fragmento de un polipéptido hedgehog de plena longitud, actuando el fragmento específicamente como agonista o antagonista para los eventos inductivos mediados por proteínas erizo de tipo salvaje. El fragmento bioactivo hedgehog es preferiblemente una parte extracelular soluble de una proteína erizo, haciendo la solubilidad referencia a soluciones fisiológicamente compatibles. Están descritos ejemplos de fragmentos bioactivos en las publicaciones al amparo del PCT (PCT = Tratado de Cooperación en Materia de Patentes) WO 95/18856 y WO 96/17924.

El vocablo "patched" o "ptc" se refiere a una familia de proteínas transmembrana afines que han estado implicadas en la transducción de señales inducida a base de poner a una célula en contacto con una proteína erizo. Por ejemplo, la familia ptc de los mamíferos incluye ptc1 y ptc2. Además de las referencias que se exponen más adelante, véanse también Takabatake et al. (1997) FEBS Lett 410:485 y GenBank AB000847 para ejemplos de ptc2. A no ser que resulte de otro modo evidente por el contexto, se entenderá que las realizaciones descritas en el contexto de ptc1 (o de sólo ptc) se refieren también a realizaciones equivalentes que implican a otros homólogos de ptc como
ptc2.

La expresión "agente terapéutico ptc" se refiere a agentes que (I) imitan el efecto de proteínas erizo en la señalización de patched, p. ej., las cuales actúan como antagonistas para la actividad inhibitoria del ciclo celular de patched, o bien (II) activan o potencian la señalización de patched. En otras realizaciones, el agente terapéutico ptc puede ser un antagonista para hedgehog. El agente terapéutico ptc puede ser, p. ej., un péptido, un ácido nucleico, un carbohidrato, una pequeña molécula orgánica o un extracto de producto natural (o fracción del mismo).

Una forma "proliferativa" de un agente terapéutico hedgehog o ptc es una forma que induce la proliferación de células epiteliales, y en particular de células troncales epiteliales. A la inversa, una forma "antiproliferativa" de un agente terapéutico hedgehog o ptc es una forma que inhibe la proliferación de células epiteliales, preferiblemente de una manera atóxica, p. ej. a base de promover o mantener un fenotipo diferenciado o de promover de otro modo la quiescencia.

A título de ejemplo, aunque sin pretender que ésta constituya la única teoría válida, el polipéptido hedgehog proliferativo será generalmente una forma de la proteína que desreprime la detención del ciclo celular mediada por patched, imitando p. ej. el polipéptido el efecto de una proteína erizo natural en las células epiteliales. Un agente terapéutico ptc proliferativo incluye otros agentes que deprimen la detención del ciclo celular mediada por patched, y puede actuar extracelular o intracelularmente.

Un agente terapéutico ptc antiproliferativo ilustrativo puede potenciar la detención del ciclo celular mediada por patched. Tales agentes pueden ser pequeñas moléculas que inhiban, p. ej., la fijación de hedgehog a patched, así como agentes que estimulen y/o potencien una vía de transducción de señales de la proteína patched.

Los vocablos "epitelios", "epitelial" y "epitelio" se refieren a la cubierta celular de superficies corporales internas y externas (cutáneas, mucosas y serosas), incluyendo las glándulas y otras estructuras derivadas de las mismas, como p. ej. las corneales, esofágicas y epidérmicas, y las células epiteliales de los folículos pilosos. Otros ejemplos de tejido epitelial incluyen el epitelio olfatorio, que es el epitelio pseudoestratificado que reviste la región olfatoria de la cavidad nasal y contiene los receptores del sentido del olfato; el epitelio glandular, que se refiere a epitelio que se compone de células secretoras; y el epitelio escamoso, que se refiere a epitelio que se compone de células tipo placa aplanadas. El vocablo "epitelio" puede también referirse a epitelio transicional, que es el que se encuentra característicamente revistiendo órganos huecos que están sometidos a grandes cambios mecánicos debido a contracción y distensión, como es p. ej. el tejido que representa una transición entre epitelio escamoso estratificado y columnar.

El vocablo "epitelización" se refiere a la curación mediante el crecimiento de tejido epitelial sobre una superficie desnudada.

El vocablo "piel" se refiere a la cubierta protectora exterior del cuerpo, que consta del corium y de la epidermis, y se entiende que incluye las glándulas sudoríparas y sebáceas, así como las estructuras de los folículos pilosos. En toda la presente solicitud puede usarse el adjetivo "cutáneo", y se entenderá que el mismo se refiere en general a atributos de la piel, según resulte apropiado para el contexto en el cual sean usados dichos adjetivos.

El vocablo "epidermis" se refiere a la capa más exterior y no vascular de la piel, derivada del ectodermo embrionario y cuyo espesor varía entre 0,07 y 1,4 mm. En las superficies palmares y plantares, la epidermis comprende, de dentro a fuera, cinco capas que son las siguientes: la capa basal, que se compone de células columnares que están dispuestas perpendicularmente; la capa espinosa o de células espinosas, que se compone de células poliédricas aplanadas con cortos procesos o espinas; la capa granular, que se compone de células granulares aplanadas; la capa clara, que se compone de varias capas de células claras transparentes en las cuales los núcleos son indistintos o están ausentes; y la capa córnea, que se compone de células no nucleadas cornificadas aplanadas. En la epidermis de la superficie general del cuerpo, la capa clara está habitualmente ausente.

El vocablo "corium" o "dermis" se refiere a la capa de la piel que es profunda con respecto a la epidermis, consta de un denso lecho de tejido conectivo vascular y contiene los nervios y los órganos sensitivos terminales. Las raíces del pelo y las glándulas sebáceas y sudoríparas son estructuras de la epidermis que están profundamente embebidas en la dermis.

El vocablo "uña" se refiere a la placa cutánea córnea que se encuentra sobre la superficie dorsal del extremo distal de un dedo de la mano o del pie.

La expresión "glándula epidérmica" se refiere a una agregación de células asociadas a la epidermis y especializadas en secretar o excretar materiales no relacionados con sus necesidades metabólicas ordinarias. Por ejemplo, las "glándulas sebáceas" son glándulas holocrinas que están en el corium y secretan una sustancia aceitosa y sebo. La expresión "glándulas sudoríparas" se refiere a glándulas que secretan sudor, están situadas en el corium o tejido subcutáneo y desembocan por medio de un conducto en la superficie del cuerpo.

El vocablo "pelo" (o "cabello") se refiere a una estructura filar, y especialmente a la estructura epidérmica especializada que se compone de queratina y se desarrolla a partir de una papila que está hundida en el corium, siendo dicha estructura producida tan sólo por los mamíferos y característica de ese grupo de animales. El vocablo se refiere también al agregado de tales pelos (o cabellos). La expresión "folículo piloso" se refiere a una de las invaginaciones tubulares de la epidermis que encierran los pelos y desde las cuales crecen los pelos; y la expresión "células epiteliales del folículo piloso" se refiere a las células epiteliales que rodean la papila dérmica en el folículo piloso, como son p. ej. las células troncales, las células de la vaina radicular celular interna, las células matriciales y las células de la vaina radicular celular externa. Tales células pueden ser células normales no malignas, o células transformadas/inmortalizadas.

La expresión "tejido epitelial nasal" se refiere al epitelio nasal y olfatorio.

La expresión "heridas por escisión" incluye desgarramientos, abrasiones, cortes, punciones o laceraciones en la capa epitelial de la piel, que pueden llegar hasta la capa dérmica e incluso hasta la grasa subcutánea y más allá de la misma. Las heridas por escisión pueden ser resultado de procedimientos quirúrgicos o de una penetración accidental de la piel.

La expresión "heridas por quemadura" se refiere a los casos en los que grandes áreas superficiales de la piel se han perdido o han sido retiradas de un individuo debido a la acción del calor y/o de agentes químicos.

La expresión "úlceras cutáneas dérmicas" se refiere a lesiones de la piel ocasionadas por una pérdida superficial de tejido, habitualmente con inflamación. Las úlceras cutáneas dérmicas que pueden ser tratadas mediante el método de la presente invención incluyen las úlceras por decúbito, las úlceras diabéticas, las úlceras por estasis venosa y las úlceras arteriales. La expresión "heridas por decúbito" se refiere a úlceras crónicas que son el resultado de una aplicación de presión a zonas de la piel por espacio de prolongados periodos de tiempo. Las heridas de este tipo son a menudo llamadas llagas de cama o llagas por presión. Las úlceras por estasis venosa son el resultado de un estancamiento de la sangre o de otros fluidos debido a venas defectuosas. La expresión "úlceras arteriales" se refiere a piel necrótica en la zona que rodea a arterias en las que es deficiente el flujo sanguíneo.

La expresión "tejido dental" se refiere a tejido de la boca que es similar al tejido epitelial, como es por ejemplo el caso del tejido gingival. El método de la presente invención es útil para el tratamiento de la enfermedad periodontal.

La expresión "tejido epitelial interno" se refiere a tejido que se encuentra dentro del cuerpo y presenta características similares a las de la capa epidérmica de la piel. Los ejemplos incluyen el revestimiento del intestino. El método de la presente invención es útil para promover la curación de determinadas heridas internas, como son por ejemplo las heridas resultantes de cirugía.

La expresión "herida en el tejido ocular" se refiere al grave síndrome del ojo seco, a las úlceras y abrasiones corneales y a las heridas quirúrgicas oftálmicas.

En toda esta solicitud, la expresión "trastorno cutáneo proliferativo" se refiere a todo trastorno/enfermedad de la piel que esté marcado por una proliferación indeseada o aberrante de tejido cutáneo. Estas afecciones están típicamente caracterizadas por una proliferación de células epidérmicas o una diferenciación celular incompleta e incluyen, por ejemplo, la ictiosis ligada al cromosoma X, la psoriasis, la dermatitis atópica, la dermatitis alérgica por contacto, la hiperqueratosis epidermolítica y la dermatitis seborreica. Por ejemplo, la epidermodisplasia es una forma de desarrollo defectuoso de la epidermis. Otro ejemplo es la "epidermólisis", que se refiere a un estado de aflojamiento de la epidermis con formación de vesículas y ampollas ya sea espontáneamente o bien en el sitio de trauma.

El vocablo "carcinoma" se refiere a un nuevo crecimiento maligno que está constituido por células epiteliales y tiende a infiltrar los tejidos circundantes y a dar lugar a metástasis. Los ejemplos de carcinomas incluyen los siguientes: el "carcinoma de células basales", que es un tumor epitelial de la piel que, si bien raramente produce metástasis, tiene potencial de invasión y destrucción local; el "carcinoma de células escamosas", refiriéndose esta expresión a carcinomas que surgen de epitelio escamoso y tienen células cuboides; el "carcinosarcoma", que incluye tumores malignos que se componen de tejidos carcinomatosos y sarcomatosos; el "carcinoma adenoide quístico", que es un carcinoma que está marcado por cilindros o bandas de estroma hialino o mucinoso separados o rodeados por nidos o cordones de pequeñas células epiteliales, siendo éste un carcinoma que se da en las glándulas mamarias y salivales y en las glándulas mucosas del tracto respiratorio; el "carcinoma epidermoide", refiriéndose esta expresión a células cancerosas que tienden a diferenciarse de la misma manera como las de la epidermis, es decir que tienden a formar células espinosas y a experimentar cornificación; el "carcinoma nasofaríngeo", refiriéndose esta expresión a un tumor maligno que surge en el revestimiento epitelial del espacio de detrás de la nariz; y el "carcinoma de células renales", que pertenece al carcinoma del parenquima renal y se compone de células tubulares que se presentan en varias disposiciones. Otro crecimiento epitelial carcinomatoso es el consistente en los "papilomas", refiriéndose este vocablo a tumores benignos que se derivan de epitelio y tienen como agente causante un Papillomavirus; y el de los "epidermoidomas", refiriéndose este vocablo a un tumor cerebral o meníngeo que es formado por inclusión de elementos ectodérmicos al tener lugar el cierre del surco neural.

En el sentido en el que se le utiliza en la presente, el vocablo "psoriasis" se refiere a un trastorno cutáneo hiperproliferativo que altera los mecanismos reguladores de la piel. En particular, se forman lesiones que suponen alteraciones primarias y secundarias de la proliferación epidérmica, respuestas inflamatorias de la piel, y una expresión de moléculas reguladoras tales como linfocinas y factores inflamatorios. La piel psoriática está caracterizada morfológicamente por un incrementado recambio de células epidérmicas, una epidermis engrosada, una queratinización anormal, infiltrados celulares inflamatorios en la capa de la dermis e infiltración de leucocitos polimorfonucleares en la capa de la epidermis que redunda en un incremento del ciclo de las células basales. Adicionalmente están presentes células hiperqueratósicas y paraqueratósicas.

El vocablo "queratosis" se refiere a trastornos cutáneos proliferativos que están caracterizados por una hiperplasia de la capa córnea de la epidermis. Los ejemplos de trastornos queratósicos incluyen la queratosis folicular, la queratosis palmar y plantar, la queratosis faríngea, la queratosis pilosa y la queratosis actínica.

En el sentido en el que se les utiliza en la presente, los vocablos "proliferativas" y "proliferación" se refieren a células que experimentan mitosis.

En el sentido en el que se la utiliza en la presente, la expresión "células transformadas" se refiere a células que se han convertido espontáneamente adoptando un estado de crecimiento ilimitado, es decir que han adquirido la capacidad de crecer mediante un número indefinido de divisiones en cultivo. Las células transformadas pueden ser caracterizadas por vocablos tales como neoplásicas, anaplásicas y/o hiperplásicas, con respecto a su pérdida del control del crecimiento.

En el sentido en el que se la utiliza en la presente, la expresión "células inmortalizadas" se refiere a células que han sido alteradas mediante medios químicos y/o recombinantes de forma tal que las células tienen la capacidad de crecer mediante un número indefinido de divisiones en cultivo.

Los vocablos "paciente" o "sujeto" a tratar mediante el método que es objeto de la presente pueden significar un humano o un animal no humano.

La expresión "preparación cosmética" se refiere a una forma de preparación farmacéutica que está formulada para administración tópica.

La expresión "cantidad efectiva" de un agente terapéutico hedgehog, p. ej., con respecto al método de tratamiento que es objeto de la presente, se refiere a una cantidad de p. ej. un polipéptido hedgehog en una preparación que, al ser aplicada como parte de un deseado régimen de dosificación, da lugar a una variación de la velocidad de proliferación celular y/o del estado de diferenciación de una célula para así producir una cantidad de proliferación de células epiteliales acorde con normas clínicamente aceptables para el trastorno a tratar o la finalidad cosmética perseguida.

La expresión "estado de crecimiento" de una célula se refiere a la velocidad de proliferación de la célula y al estado de diferenciación de la célula.

Los vocablos "homología" e "identidad" se refieren cada uno a una similitud de secuencia entre dos secuencias polipeptídicas, siendo la identidad una comparación más estricta. La homología y la identidad pueden ser cada una determinadas a base de comparar una posición en cada secuencia, que puede estar alineada a efectos comparativos. Cuando una posición en la secuencia comparada está ocupada por el mismo residuo de aminoácido, puede decirse entonces que los polipéptidos son idénticos en esa posición; y cuando el sitio equivalente está ocupado por el mismo aminoácido (p. ej. idéntico) o por un aminoácido similar (p. ej. similar a cuanto a su naturaleza estérica y/o electrónica), puede decirse entonces que las moléculas son homólogas en esa posición. El porcentaje de homología o identidad entre secuencias es función del número de posiciones coincidentes u homólogas compartidas por las secuencias. Una secuencia "no afín" o "no homóloga" comparte menos de un 40 por ciento de identidad, aunque preferiblemente menos de un 25 por ciento de identidad, con una secuencia de residuos de aminoácidos de la presente invención.

Cuando hace referencia a una determinada secuencia de polipéptido o ácido nucleico, la expresión "corresponde a" sirve para indicar que la secuencia de interés es idéntica u homóloga a la secuencia de referencia a la cual se dice que corresponde.

Las expresiones "proteína recombinante", "proteína heteróloga" y "proteína exógena" son utilizadas de manera intercambiable dentro de toda la descripción y hacen referencia a un polipéptido que es producido mediante técnicas de DNA recombinante, en las que generalmente el DNA que codifica el polipéptido es insertado en un adecuado constructo de expresión que es a su vez usado para transformar una célula huésped para producir la proteína heteróloga. Esto quiere decir que el polipéptido es expresado desde un ácido nucleico heterólogo.

Una "proteína quimérica" o "proteína de fusión" es una fusión de una primera secuencia de aminoácidos que codifica un polipéptido hedgehog con una segunda secuencia de aminoácidos que define un dominio que es foráneo y no considerablemente homólogo con respecto a todo dominio de proteína hh. Una proteína quimérica puede presentar un dominio foráneo que se encuentra (si bien en una proteína distinta) en un organismo que expresa también la primera proteína, o bien puede ser una fusión "interespecies", "intergénica", etc. de estructuras proteicas expresadas por distintas clases de organismos. En general, una proteína de fusión puede ser representada mediante la fórmula general (X)_{n}-(hh)_{m}-(Y)_{n}, en la que hh representa toda o una parte de la proteína erizo, X e Y representan cada una independientemente una secuencia de aminoácidos que no se encuentra de manera natural como cadena polipeptídica contigua a la secuencia hedgehog, m es un entero de más de 1 o igual a 1, y cada n es independientemente 0 o un entero de más de 1 o igual a 1 (n y m son preferiblemente de no más de 5 ó 10).

III. Ejemplos de aplicaciones del método y composiciones

La invención tiene extensa aplicabilidad al tratamiento o a la profilaxis de trastornos que afectan a tejido epitelial, así como en aplicaciones cosméticas. En general, debe administrarse a un animal una cantidad de un agente terapéutico hedgehog que sea efectiva para alterar el estado proliferativo de un tejido epitelial tratado. El modo de administración y los regímenes de dosificación variarán en dependencia del tejido epitelial o de los tejidos epiteliales que deba ser tratado o que deban ser tratados. Por ejemplo, se preferirán las formulaciones tópicas cuando el tejido tratado sea tejido epidérmico, tal como tejidos dérmicos o mucosos. Análogamente, como se describe más detalladamente más adelante, el uso de un determinado agente terapéutico ptc o hedgehog, o sea p. ej. de un agonista o de un antagonista, dependerá de si se desea o si se pretende impedir la proliferación de células del tejido tratado.

Un método que "favorece la curación de una herida" hace que como resultado del tratamiento la herida se cure más rápidamente en comparación con la curación de una herida similar en ausencia del tratamiento. La expresión "favorece la curación de la herida" puede también significar que el método ocasiona la proliferación y el crecimiento de, inter alia, queratinocitos, o bien que la herida se cura con menor formación de tejido cicatrizal, menor contracción de la herida, menor deposición de colágeno y un área superficial más en superficie. En ciertos casos, la expresión "favorecer la curación de una herida" puede también significar que determinados métodos de curación de heridas presentan mejorados porcentajes de éxito (como p. ej. los porcentajes de aceptación de injertos cutáneos) al ser usados en la presente invención.

Las complicaciones son un riesgo constante con las heridas que no se han curado por completo y siguen abiertas. A pesar de que las heridas se curan en su mayoría rápidamente sin tratamiento, algunos tipos de heridas se resisten a la curación. Las heridas que abarcan grandes áreas superficiales se mantienen también abiertas por espacio de prolongados periodos de tiempo. En una realización de la presente invención, el presente método puede ser usado para favorecer la curación de heridas que afectan a tejidos epiteliales, tal como el caso de las heridas resultantes de cirugía, quemaduras, inflamación o irritación. Algunas de las formulaciones que contienen agente terapéutico hedgehog (p. ej. formas proliferativas) de la presente invención pueden ser también aplicadas profilácticamente, tal como en forma de una preparación cosmética, para activar procesos de regeneración tisular, p. ej. de la piel, del pelo y/o de las uñas.

A pesar del considerable progreso de las técnicas quirúrgicas reconstructivas, la formación de tejido cicatrizal puede constituir un importante obstáculo para la recuperación de la función y del aspecto normales de la piel curada. Esto es particularmente cierto cuando una cicatrización patológica tal como aquélla en la que se forman queloides o cicatrices hipertróficas en las manos o en la cara ocasiona una discapacidad funcional o una deformidad física. En las circunstancias más graves, una formación de tejido cicatrizal de este tipo puede precipitar sufrimiento psicosocial y una vida de privaciones económicas. La reparación de heridas incluye las etapas de hemostasia, inflamación, proliferación y remodelación. La etapa proliferativa supone la multiplicación de fibroblastos y células endoteliales y epiteliales. Mediante el uso de la invención, la velocidad de proliferación de células epiteliales en la herida y proximalmente a la misma puede ser controlada a fin de acelerar el cierre de la herida y/o minimizar la formación de tejido cicatrizal.

Las quemaduras de espesor total y de espesor parcial son un ejemplo de un tipo de herida que a menudo abarca grandes áreas superficiales y por consiguiente requiere prolongados periodos de tiempo para curarse. Como resultado de ello, a menudo surgen complicaciones que constituyen una amenaza para la vida, tales como infecciones y pérdidas de fluidos corporales. Además, en el caso de las quemaduras la curación es a menudo desordenada y redunda en cicatrización y desfiguración. En algunos casos la contracción de las heridas debida a una excesiva deposición de colágeno redunda en una reducida movilidad de los músculos en las inmediaciones de la herida. Las composiciones de la presente invención pueden ser usadas para acelerar la velocidad de curación de quemaduras y para favorecer los procesos de curación, que redundan entonces en unos resultados cosméticos más deseables y en una menor contracción y cicatrización de las heridas.

Las quemaduras graves que abarcan grandes áreas son a menudo tratadas mediante autoinjertos cutáneos tomados de zonas no dañadas del cuerpo del paciente. La invención puede ser también usada en conjunción con injertos cutáneos para mejorar las velocidades de "prendimiento" del injerto a base de acelerar el crecimiento tanto de la piel injertada como de la piel del paciente que está junto al injerto.

Las úlceras dérmicas constituyen otro ejemplo adicional de las heridas que se prestan al tratamiento mediante el método que es objeto de la presente, p. ej. para ocasionar la curación de la úlcera y/o para impedir que la úlcera se convierta en una herida crónica. Por ejemplo, uno de cada siete individuos con diabetes desarrolla en sus extremidades úlceras dérmicas que son susceptibles de experimentar infección. Los individuos con úlceras diabéticas infectadas a menudo requieren hospitalización, servicios intensivos, antibióticos caros y, en algunos casos, amputación. Las úlceras dérmicas tales como las resultantes de enfermedad venosa (úlceras por estasis venosa) o de presión excesiva (úlceras por decúbito) y las úlceras arteriales se resisten también a la curación. Los tratamientos del estado de la técnica se limitan en general a mantener la herida protegida y libre de infección y, en algunos casos, a restablecer el flujo sanguíneo mediante cirugía vascular. Según el presente método, la zona afligida de la piel puede ser tratada mediante una terapia que incluye un agente terapéutico hedgehog que favorece la epitelización de la herida, acelerando p. ej. la velocidad de curación de las úlceras cutáneas.

El presente tratamiento puede ser también efectivo como parte de un régimen terapéutico para tratar úlceras orales y paraorales resultantes p. ej. de radiación y/o quimioterapia. Tales úlceras se desarrollan comúnmente dentro de un periodo de tiempo de unos días después de la quimioterapia o radioterapia. Estas úlceras comienzan habitualmente como pequeñas lesiones dolorosas y de forma irregular que están habitualmente cubiertas por una delicada membrana necrótica gris y rodeadas por tejido inflamatorio. En muchos casos, la ausencia de tratamiento redunda en una proliferación de tejido en torno a la periferia de la lesión sobre una base inflamatoria. Por ejemplo, el epitelio que bordea la úlcera manifiesta habitualmente actividad proliferativa, redundando en una pérdida de continuidad del epitelio superficial. Debido a su tamaño y a la pérdida de la integridad epitelial, estas lesiones conducen a posibles infecciones secundarias en el cuerpo. La ingestión rutinaria de alimento y agua pasa a ser un evento muy doloroso, y, si las úlceras proliferan en todo el conducto alimentario, se evidencia habitualmente diarrea con todos sus factores de complicación. Según la presente invención, un tratamiento para tales úlceras que incluye la aplicación de un agente terapéutico hedgehog puede reducir la proliferación y diferenciación anormal del epitelio afectado, ayudando a reducir la gravedad de los subsiguientes eventos inflamatorios.

En otro ejemplo de realización, la invención permite tratar o prevenir enfermedades gastrointestinales. Dicho brevemente, las de una amplia variedad de enfermedades están asociadas a la desorganización del epitelio o las vellosidades gastrointestinales, estando incluidas entre dichas enfermedades la enteritis (es decir, toxicidad intestinal) y mucositis inducida por quimioterapia y radioterapia, la enfermedad de la úlcera péptica, la gastroenteritis y la colitis, los trastornos atróficos de la vellosidad, y enfermedades similares. Por ejemplo, los agentes quimioterapéuticos y la radioterapia que son usados en el trasplante de médula ósea y en la terapia contra el cáncer afectan las células de proliferación rápida tanto en los tejidos hematopoyéticos como en el intestino delgado, dando lugar a graves toxicidades que a menudo obligan a limitar la dosis. Los daños en la barrera mucosa del intestino delgado redundan en graves complicaciones de hemorragia y sepsis. La invención puede ser usada para favorecer la proliferación del epitelio gastrointestinal e incrementar con ello las dosis toleradas para la radiación y los agentes de quimioterapia. El eficaz tratamiento de las enfermedades gastrointestinales puede ser determinado mediante varios criterios, incluyendo una puntuación de la enteritis y otras pruebas que son perfectamente conocidas en la técnica.

Las composiciones pueden ser también usadas para tratar heridas resultantes de enfermedades dermatológicas tales como lesiones resultantes de trastornos autoinmunes tales como la psoriasis. La expresión "dermatitis atópica" se refiere a trauma cutáneo resultante de alergias asociadas a una respuesta inmune ocasionada por alergenos tales como pólenes, comestibles, caspa, venenos de insectos y toxinas vegetales.

Con la edad, la epidermis se adelgaza y los apéndices cutáneos se atrofian. El pelo escasea y las secreciones sebáceas disminuyen, siendo consecuencia de ello una susceptibilidad a la sequedad, agrietamiento y fisuración. La dermis disminuye con la pérdida de fibras elásticas y de colágeno. Además, la proliferación de queratinocitos (que es indicativa del espesor de la piel y de la capacidad proliferativa de la piel) disminuye con la edad. Se cree que un incremento de la proliferación de queratinocitos contrarresta el envejecimiento de la piel, es decir la formación de arrugas, dando lugar a un incremento del espesor y de la elasticidad de la piel y a una reparación de la misma. Según la presente invención, una forma proliferativa de un agente terapéutico hedgehog puede ser usada ya sea terapéuticamente o bien cosméticamente para contrarrestar, al menos por espacio de un periodo de tiempo, los efectos del envejecimiento en la piel.

La invención puede ser también usada en el tratamiento de una herida de tejido ocular. En general, un daño infligido a tejido corneal, ya sea por enfermedad o bien debido a cirugía o a una lesión, puede afectar a células epiteliales y/o endoteliales, en dependencia de la naturaleza de la herida. Las células epiteliales corneales son las células epiteliales no queratinizadas que revisten la superficie externa de la córnea y proporcionan una barrera protectora contra el ambiente externo. La curación de las heridas corneales ha venido preocupando tanto a los clínicos como a los investigadores. Los oftalmólogos se enfrentan frecuentemente a distrofias y problemáticas lesiones corneales que redundan en erosión epitelial persistente y recurrente, que a menudo conduce a una pérdida endotelial permanente. El uso de formas proliferativas de los agentes terapéuticos hedgehog que son objeto de la presente puede servir en estos casos para favorecer la epitelización del tejido corneal afectado.

En calidad de adicional ilustración, los trastornos específicos que van típicamente asociados a los daños de células epiteliales en el ojo y para los cuales el método que es objeto de la presente puede aportar un tratamiento beneficioso incluyen los defectos epiteliales corneales persistentes, las erosiones recurrentes, las úlceras corneales neurotróficas, la queratoconjuntivitis seca, las úlceras corneales microbianas, las úlceras corneales virales y trastornos similares. Los procedimientos quirúrgicos que típicamente ocasionan lesiones en las capas celulares epiteliales incluyen los procedimientos con láser efectuados en la superficie ocular, los procedimientos quirúrgicos refractivos de cualquier tipo tales como la queratotomía radial y la queratotomía astigmática, los colgajos conjuntivales, los trasplantes conjuntivales, la epiquetaroplastia y el raspado corneal. Además, las heridas superficiales tales como rasguños, erosión superficial, inflamación, etc. pueden ocasionar pérdida de células epiteliales. Según la presente invención, el epitelio corneal debe ser puesto en contacto con una cantidad de un agente terapéutico hedgehog que sea efectiva para ocasionar una proliferación de las células epiteliales corneales para curar adecuadamente la herida.

En otras realizaciones, preparaciones antiproliferativas de agentes terapéuticos hedgehog pueden ser usadas para inhibir la proliferación de células epiteliales lenticulares para prevenir las complicaciones post-operatorias de la extracción de cataratas extracapsulares. La catarata es una enfermedad ocular intratable, y se han hecho varios estudios sobre un tratamiento de la catarata. Sin embargo, en la actualidad el tratamiento de la catarata se logra mediante operaciones quirúrgicas. La cirugía de las cataratas ha venido siendo aplicada durante mucho tiempo, y han sido examinados varios métodos operatorios. La extracción extracapsular del cristalino ha llegado a ser el método preferido para retirar las cataratas. Las principales ventajas médicas de esta técnica en comparación con la extracción intracapsular son las consistentes en una menor incidencia de edema macular cistoide afáquico y de desprendimiento de la retina. La extracción extracapsular es también necesaria para la implantación de lentes intraoculares del tipo de las de cámara posterior, que son en la actualidad las que se considera que son preferibles en la mayoría de los casos.

Sin embargo, una desventaja de la extracción extracapsular de la catarata es la consistente en la alta incidencia de opacificación de la cápsula lenticular posterior, a la que a menudo se llama catarata secundaria, que puede producirse en hasta un 50% de casos dentro de un periodo de tres años después de la cirugía. La catarata secundaria es ocasionada por una proliferación de células epiteliales lenticulares de la cápsula ecuatorial y anterior que quedan después de la extracción extracapsular del cristalino. Estas células proliferan dando lugar a anillos de Soemmering, y junto con fibroblastos que también se depositan y se presentan en la cápsula posterior, ocasionan opacificación de la cápsula posterior, la cual interfiere en la visión. La prevención de la catarata secundaria sería preferible al tratamiento. Para inhibir la formación de la catarata secundaria, el presente método aporta unos medios para inhibir la proliferación de las células epiteliales lenticulares restantes. Por ejemplo, puede inducirse a tales células a que permanezcan quiescentes a base de instilar una solución que contenga una preparación con agente terapéutico hedgehog o ptc antiproliferativo al interior de la cámara anterior del ojo tras la remoción del cristalino. Además, la solución puede estar osmóticamente equilibrada para lograr una mínima dosificación efectiva cuando se la instile al interior de la cámara anterior del ojo, inhibiendo con ello el crecimiento epitelial subcapsular con cierta especifidad.

La invención puede ser también usada en el tratamiento de corneopatías marcadas por una proliferación de células epiteliales corneales, como sucede por ejemplo en el caso de trastornos epiteliales oculares tales como el decrecimiento epitelial o los carcinomas de las células escamosas de la superficie ocular.

Es también muy deseable el mantenimiento de tejidos y órganos ex vivo. La terapia de sustitución tisular está perfectamente establecida en el tratamiento de las enfermedades humanas. Por ejemplo, en los Estados Unidos fueron llevados a cabo en 1996 más de 40.000 trasplantes de córnea. Las células epidérmicas humanas pueden ser cultivadas in vitro y usadas para poblar sitios de quemaduras y úlceras cutáneas crónicas y otras heridas dérmicas. La invención puede ser usada para acelerar el crecimiento de tejido epitelial in vitro, así como para acelerar el injerto del tejido epitelial cultivado en un huésped animal.

La invención puede ser usada para mejorar la "velocidad de prendimiento" de un injerto cutáneo. Si la velocidad con la que prende el injerto es demasiado baja, los injertos de tejido epidérmico pueden ampollarse y cortarse, con lo cual disminuirá la probabilidad de que el autoinjerto "prenda", es decir se adhiera a la herida y forme una membrana basal con el tejido de granulación subyacente. Las velocidades con las que prenden los injertos pueden ser incrementadas mediante el presente método a base de inducir una proliferación de los queratinocitos. El método para incrementar las velocidades de prendimiento de los injertos comprende el paso de poner al autoinjerto cutáneo en contacto con una cantidad efectiva para la curación de heridas de una composición con contenido de agente terapéutico hedgehog descrita en el método para favorecer la curación de heridas y en el método para favorecer el crecimiento y la proliferación de queratinocitos, como se ha descrito anteriormente.

Los equivalentes de la piel tienen muchos usos no tan sólo como sustitutos de la piel humana o animal para los injertos cutáneos, sino también como piel de ensayo para determinar los efectos de sustancias farmacéuticas y cosméticos en la piel. Una dificultad importante en las pruebas farmacológicas, químicas y cosméticas es la consistente en las dificultades que se tienen para determinar la eficacia y la seguridad de los productos sobre la piel. Una ventaja de los equivalentes de piel de la invención es la que radica en su uso como indicador de los efectos que son producidos por tales sustancias mediante pruebas in vitro sobre piel de ensayo.

Así, en una realización la invención puede ser usada para efectuar injertos cutáneos p. ej. en zonas denudadas y en heridas y quemaduras granulantes. El uso de agentes terapéuticos hedgehog proliferativos puede servir para mejorar técnicas de injerto tales como los autoinjertos de espesor parcial y los autoinjertos epidérmicos (queratinocitos autogénicos cultivados) y los aloinjertos epidérmicos (queratinocitos alogénicos cultivados). En el caso del aloinjerto, la activación de la formación de equivalentes de piel en cultivo ayuda a procurar/mantener unas provisiones disponibles de tales injertos (p. ej. en bancos de tejidos) para que los pacientes puedan ser cubiertos en un solo procedimiento con un material que permita que se produzca una curación permanente.

A este respecto, la presente invención se refiere también a equivalentes de piel vivientes compuestos que comprenden una capa epidérmica de queratinocitos cultivados que han sido expandidos mediante tratamiento con un agente terapéutico hedgehog o con otro agente terapéutico ptc. La invención puede ser usada para la preparación de equivalentes de piel vivientes compuestos. Una realización ilustrativa comprende los pasos de obtener una muestra de piel; tratar la muestra de piel enzimáticamente para separar la epidermis de la dermis; tratar la epidermis enzimáticamente para liberar los queratinocitos; cultivar, en presencia de un agente terapéutico hedgehog, los queratinocitos epidérmicos hasta su confluencia ya sea en paralelo o bien por separado; tratar la dermis enzimáticamente para liberar los fibroblastos; cultivar los fibroblastos hasta la subconfluencia; inocular una membrana porosa de esponja de colágeno reticulado con los fibroblastos cultivados; incubar la espuma de colágeno inoculado en su superficie para permitir el crecimiento de los fibroblastos en toda la esponja de colágeno; e inocularla entonces con queratinocitos cultivados; e incubar adicionalmente el complejo equivalente de piel compuesto en presencia de un agente terapéutico hedgehog para promover el crecimiento de las células.

En otras realizaciones, láminas de piel que contienen capas tanto epiteliales como mesenquimáticas pueden ser aisladas en cultivo y expandidas con medio de cultivo suplementado con una forma proliferativa de un agente terapéutico hedgehog.

Según la presente invención puede usarse toda muestra de piel que se preste a ser sometida a las técnicas de cultivo celular. Las muestras de piel pueden ser autogénicas o alogénicas.

En otro aspecto de la invención, la misma puede ser usada en conjunción con varios procedimientos periodontales en los que se desee un control de la proliferación de células epiteliales en tejido periodontal y en torno al mismo.

En una realización, pueden usarse formas proliferativas de los agentes terapéuticos hedgehog para activar la reepitelización en torno a dientes naturales y protésicos, p. ej. para promover la formación de tejido gingival.

Con respecto al tratamiento de la enfermedad periodontal, se estima que solamente en los Estados Unidos hay más de 125 millones de adultos con enfermedad periodontal de distintas formas. La enfermedad periodontal comienza en forma de lesiones inflamatorias que se deben a bacterias específicas que se localizan en la zona en la que la encía se une al diente. Lo primero que habitualmente se produce es un cambio vascular en el tejido conectivo subyacente. La inflamación del tejido conectivo estimula los siguientes cambios en el revestimiento epitelial del sulcus y en la unión epitelial: incrementada actividad mitótica en la capa epitelial basal; incrementada producción de queratina con descamación; descamación celular junto a la superficie del diente, que tiende a hacer profunda la bolsa; células epiteliales de la capa basal en el fondo del sulcus y en la zona de unión proliferan al interior del tejido conectivo y comienza a producirse rotura de las fibras gingivales, redundando la disolución del tejido conectivo en la formación de una lesión abierta. La aplicación de preparaciones con agente terapéutico hedgehog al periodoncio puede ser usada para inhibir la proliferación de tejido epitelial e impedir así que prosiga el desarrollo de la periodontoclasia.

En otro aspecto adicional, la invención puede ser usada para ayudar a controlar la regeneración tisular guiada, tal como cuando se la usa en conjunción con materiales biorreabsorbibles. Por ejemplo, puede ser facilitada por el presente método la incorporación de implantes periodontales tales como dientes prostéticos. La nueva unión de un diente supone tanto la formación de fibras de tejido conectivo como la reepitelización de la bolsa dental. El método/tratamiento que es objeto de la presente puede ser usado para acelerar la nueva unión tisular a base de controlar la función mitótica de las células epiteliales basales en las primeras etapas de curación de la herida.

Otro aspecto adicional de la presente invención se refiere al uso de preparaciones con agente terapéutico hedgehog para la preparación de un medicamento para controlar el crecimiento del pelo. El pelo se compone básicamente de queratina, que es una proteína resistente e insoluble, radicando su principal fortaleza en su enlace disulfuro de cistina. Cada pelo individual comprende un cuerpo cilíndrico y una raíz, y está contenido en un folículo, que es una depresión tipo matraz en la piel. El fondo del folículo contiene un saliente del tipo de un dedo al que se llama papila, que consta de tejido conectivo desde el cual crece el pelo y a través del cual los vasos sanguíneos suministran nutrición a las células. El cuerpo es la parte que se extiende hacia el exterior desde la superficie de la piel, mientras que la raíz ha sido descrita como la parte enterrada del pelo. La base de la raíz se expande formando el bulbo piloso, que descansa sobre la papila. Las células a partir de las cuales el pelo es producido crecen en el bulbo del folículo y son extrusionadas en forma de fibras a medida que las células proliferan en el folículo. La expresión "crecimiento del pelo" se refiere a la formación y al alargamiento de la fibra capilar que son efectuados por las células que se dividen.

Como es perfectamente conocido en la técnica, el ciclo del pelo común se divide en las tres fases siguientes: anágeno, catágeno y telógeno. Durante la fase activa (anágeno), las células troncales epidérmicas de la papila dérmica se dividen rápidamente. Las células hijas se desplazan hacia arriba y se diferencian para formar las capas concéntricas del propio pelo. La fase de transición, llamada catágeno, está marcada por el cese de la mitosis de las células troncales en el folículo. La fase de reposo es conocida como telógeno, y en esta fase el pelo es retenido en el cuero cabelludo durante varias semanas antes de que un nuevo pelo emergente que se desarrolla debajo del mismo desaloje de su folículo al cuerpo que se encuentra en la fase de telógeno. A la luz de este modelo ha quedado claro que cuanto mayor es el conjunto de células troncales que se dividen y se diferencian en células de pelo, tanto más crecimiento del pelo se produce. En consecuencia, pueden ser ejecutados métodos para incrementar o reducir el crecimiento del pelo a base de potenciar o inhibir, respectivamente, la proliferación de estas células troncales.

En una realización, la invención aporta unos medios para alterar la dinámica del ciclo de crecimiento del pelo para inducir la proliferación de células del folículo piloso, y en particular de células troncales del folículo piloso. Las composiciones que son objeto de la presente pueden ser usadas para incrementar el tamaño del folículo piloso y la velocidad de crecimiento del pelo en los animales de sangre caliente, tales como los humanos, p. ej. a base de promover la proliferación de células troncales del folículo piloso. Esto se hace a base de administrar a la piel en la zona en la cual se desea el crecimiento del pelo una cantidad de agente terapéutico hedgehog suficiente para incrementar el tamaño del folículo piloso y/o la velocidad de crecimiento del pelo en el animal. Típicamente, la composición será administrada tópicamente en forma de crema, y será aplicada diariamente hasta que se observe crecimiento del pelo y a continuación por espacio de un periodo de tiempo suficiente para mantener la deseada cantidad de crecimiento del pelo. Este método puede tener aplicaciones en la promoción del crecimiento de nuevo cabello o en la estimulación de la velocidad de crecimiento del cabello, p. ej. a continuación de tratamiento quimioterapéutico o bien para tratar varias formas de alopecia, como p. ej. la alopecia de distribución masculina. Por ejemplo, uno de los varios trastornos bioquímicos celulares y moleculares que se producen durante la fase de anágeno o la fase de catágeno en los individuos con alopecia androgénica puede ser corregido o mejorado mediante tratamiento usando el método que es objeto de la presente, p. ej. en el funcionamiento o en la formación de las células troncales, en su proceso de migración o durante la fase de mitosis de la producción de queratina dentro de la matriz y papila folicular.

En otras realizaciones, algunos de los agentes terapéuticos hedgehog (como p. ej. formas antiproliferativas) pueden ser empleados como una manera de reducir el crecimiento del pelo humano en oposición a su remoción convencional mediante corte, afeitado o depilación. Por ejemplo, la invención puede ser usada en el tratamiento de tricosis caracterizada por un crecimiento anormalmente rápido o denso del pelo, como es p. ej. el caso de la hipertricosis. En un ejemplo de realización, pueden usarse antagonistas para hedgehog para tratar el hirsutismo, que es un trastorno que está marcado por una vellosidad anormal. El método de la invención puede también permitir prolongar la duración de la depilación.

Además, debido al hecho de que un antagonista para hedgehog será a menudo citostático para las células epiteliales, en lugar de citotóxico, tales agentes pueden ser usados para proteger las células del folículo piloso contra los agentes citotóxicos que requieren el paso a la fase S del ciclo celular para tener eficacia, como es p. ej. el caso de la muerte inducida por radiación. El tratamiento puede proporcionar protección haciendo que las células del folículo piloso devengan quiescentes, p. ej. a base de inhibir a las células para que no entren en la fase S, impidiendo con ello que las células foliculares experimenten catástrofe mitótica o muerte celular programada. Por ejemplo, los antagonistas para hedgehog pueden ser usados para pacientes sometidos a quimioterapias o radioterapias, que de ordinario redundan en una pérdida del cabello. Al inhibir la progresión del ciclo celular durante tales terapias, el tratamiento que es objeto de la presente puede proteger a las células del folículo piloso contra una muerte que podría de otro modo resultar de la activación de programas de muerte celular. Tras haber concluido la terapia, puede también retirarse el tratamiento con agente terapéutico hedgehog, con una concomitante cesación de la inhibición de la proliferación de las células foliculares.

La invención puede ser también usada en el tratamiento de foliculitis tales como la foliculitis decalvante, la foliculitis uleritematosa reticulada o la foliculitis queloidea. Por ejemplo, una preparación cosmética de un agente terapéutico hedgehog puede ser aplicada tópicamente en el tratamiento de la seudofoliculitis, que es un trastorno crónico que se produce en la mayoría de los casos en la región submandibular del cuello y está asociado al afeitado, siendo las lesiones características del mismo pústulas y pápulas eritematosas que contienen pelos enterrados.

En otro aspecto de la invención, formas antiproliferativas de los agentes terapéuticos hedgehog que son objeto de la presente pueden ser usadas para inducir la diferenciación de tejido de origen epitelial. Tales formas de estas moléculas pueden proporcionar una base para una terapia de diferenciación para el tratamiento de trastornos hiperplásicos y/o neoplásicos que afecten a tejido epitelial. Por ejemplo, tales preparaciones pueden ser usadas para el tratamiento de enfermedades cutáneas en las cuales hay una proliferación anormal o un crecimiento anormal de células de la piel.

Por ejemplo, las preparaciones farmacéuticas de la invención están destinadas al tratamiento de afecciones epidérmicas hiperplásicas tales como la queratosis, así como al tratamiento de afecciones epidérmicas neoplásicas tales como las caracterizadas por una alta velocidad de proliferación para varios cánceres cutáneos, como es por ejemplo el carcinoma de células basales o el carcinoma de células escamosas. La invención puede ser también usada en el tratamiento de enfermedades autoinmunes que afectan a la piel, y en particular de enfermedades dermatológicas que suponen una proliferación y/o queratinización mórbida de la epidermis, como es por ejemplo la ocasionada por psoriasis o dermatosis atópica.

Muchas enfermedades comunes de la piel, tales como la psoriasis, el carcinoma de células escamosas, el queratoacantoma y la queratosis actínica, están caracterizadas por una proliferación y un crecimiento anormales localizados. Por ejemplo, en la psoriasis, que está caracterizada por placas rojas escamosas elevadas sobre la piel, se sabe que los queratinocitos proliferan mucho más rápidamente de lo normal y se diferencian menos completamente.

En una realización, las preparaciones de la presente invención son adecuadas para el tratamiento de dolencias dermatológicas ligadas a trastornos de queratinización que ocasionan proliferación anormal de células cutáneas, pudiendo estar dichos trastornos marcados por componentes inflamatorios o no inflamatorios. Para ilustrar esto, preparaciones terapéuticas que promueven la quiescencia o diferenciación pueden ser usadas para tratar varias formas de psoriasis, ya sean cutáneas, mucosas o ungulares. Como se ha descrito anteriormente, la psoriasis está típicamente caracterizada por queratinocitos epidérmicos que exhiben marcada diferenciación y activación proliferativa por una vía "regenerativa". El tratamiento con una realización antiproliferativa del método que es objeto de la presente puede ser usado para invertir la activación epidérmica patológica y puede constituir una base para una remisión sostenida de la enfermedad.

Las de una variedad de otras lesiones queratósicas son también candidatas al tratamiento con las preparaciones antiproliferativas que son objeto de la presente. Las queratosis actínicas, por ejemplo, son tumores premalignos inflamatorios superficiales que surgen en piel irradiada y que ha sufrido exposición al sol. Las lesiones son de eritematosas a marrones con escamación variable. Las terapias actuales incluyen procedimientos escisionales y criocirugía. Estos tratamientos son dolorosos, sin embargo, y a menudo producen una cicatrización cosméticamente inaceptable. En consecuencia, el tratamiento de queratosis tales como la queratosis actínica puede incluir una aplicación, preferiblemente tópica, de una composición en cantidades suficientes para inhibir la hiperproliferación de células epidérmicas/epidermoides de la lesión.

El acné representa otra dolencia dermatológica adicional que puede ser tratada con una realización antiproliferativa del método que es objeto de la presente. El acné vulgar, por ejemplo, es una enfermedad multifactorial que por lo común se da en la mayoría de los casos en adolescentes y adultos jóvenes y está caracterizada por la aparición de lesiones inflamatorias y no inflamatorias en la cara y en el tronco superior. El defecto básico que da lugar a la acné vulgar es la hipercornificación del conducto de una glándula sebácea hiperactiva. La hipercornificación bloquea la movilidad normal de los microorganismos cutáneos y foliculares, y al hacerlo estimula la liberación de lipasas por bacterias Propinobacterium acnes y Staphylococcus epidermidis y por Pitrosporum ovale, que es una levadura. El tratamiento con una forma antiproliferativa de un agente terapéutico hedgehog, y particularmente con preparaciones tópicas, puede ser útil para prevenir las características transicionales de los conductos, como p. ej. la hipercornificación, que conducen a la formación de la lesión. El tratamiento puede incluir adicionalmente, por ejemplo, antibióticos, retinoides y antiandrógenos.

La presente invención permite también tratar varias formas de dermatitis. El vocablo "dermatitis" es un vocablo descriptivo que se refiere a lesiones mal demarcadas que son pruríticas, eritematosas, escamosas, vesiculadas, supurantes, fisuradas o encostradas. Estas lesiones surgen debido a cualesquiera de las de una amplia variedad de causas. Los tipos más comunes de dermatitis son la dermatitis atópica, la dermatitis por contacto y la dermatitis por pañales. Por ejemplo, la dermatitis seborreica es una dermatitis crónica habitualmente prurítica con eritema, escamación seca, húmeda o grasienta y partes amarillas encostradas en varias zonas, especialmente en el cuero cabelludo, con exfoliación de una cantidad excesiva de escamas secas, y la dermatitis por estasis es una dermatitis a menudo crónica y habitualmente eccematosa. La dermatitis actínica es la dermatitis que sobreviene debido a una exposición a radiación actínica tal como la del sol, las ondas ultravioleta o la radiación x o gamma. Según la presente invención, las preparaciones con agente terapéutico hedgehog que son objeto de la presente pueden ser usadas en el tratamiento y/o la prevención de determinados síntomas de dermatitis ocasionada por una indeseada proliferación de células epiteliales. Tales terapias para estas varias formas de dermatitis pueden también incluir corticosteroides, agentes antipruriginosos y antibióticos tópicos y sistémicos.

Están también incluidos en las dolencias que pueden ser tratadas trastornos específicos de no humanos, tales como la sarna.

IV. Ejemplos de compuestos con agentes terapéuticos hedgehog

Las composiciones con agente terapéutico hedgehog del método que es objeto de la presente pueden ser generadas mediante cualesquiera de las de una variedad de técnicas, entre las que se incluyen las de purificación de proteínas que se dan de manera natural, la producción de proteínas producidas por vía recombinante y la química sintética. Las formas polipeptídicas de los agentes terapéuticos hedgehog se sacan preferiblemente de proteínas erizo de vertebrados y tienen p. ej. secuencias que corresponden a proteínas erizo que se dan de manera natural, o a fragmentos de las mismas, de organismos vertebrados. Sin embargo, se comprenderá que el polipéptido hedgehog puede corresponder a una proteína erizo (o a un fragmento de la misma) que se dé en cualquier organismo del subreino Metazoa.

Las diversas proteínas hedgehog (erizo) que se dan de manera natural y de las cuales pueden sacarse los agentes terapéuticos que son objeto de la presente están caracterizadas por un péptido señal, una región N-terminal altamente conservada, y un dominio C-terminal más divergente. Además de la escisión de la secuencia señal en la vía secretoria (Lee, J.J. et al. (1992) Cell 71:33-50; Tabata, T. et al. (1992) Genes Dev. 2635-2645; Chang, D.E. et al. (1994) Development 120:3339-3353), las proteínas precursoras de hedgehog experimentan de manera natural una fragmentación autoproteolítica interna que depende de secuencias conservadas en la parte C-terminal (Lee et al. (1994) Science 266:1528-1537; Porter et al. (1995) Nature 374:363-36). Esta autofragmentación conduce a un péptido N-terminal de 19 kD y a un péptido C-terminal de 26-28 kD (Lee et al. (1992) supra; Tabata et al. (1992) supra; Chang et al. (1994) supra; Lee et al. (1994) supra; Bumcrot, D.A., et al. (1995) Mol. Cel. Biol. 15:2294-2303; Porter et al. (1995) supra; Ekker, S.C., et al. (1995) Curr. Biol. 5:994-955; Lai, C.J. et al. (1995) Development 121:2349-2360). El péptido N-terminal se mantiene estrechamente asociado a la superficie de las células en las cuales fue sintetizado, mientras que el péptido C-terminal es libremente difusible tanto in vitro como in vivo (Lee et al. (1994) supra; Bumcrot et al. (1995) supra; Mart', E. et al. (1995) Development 121:2537-2547; Roelink, H. et al. (1995) Cell 81:445-455). La retención en la superficie de la célula del péptido N-terminal es dependiente de la autofragmentación, al ser difusible in vitro (Porter et al. (1995) supra) e in vivo (Porter, J.A. et al. (1996) Cell 86, 21-34) una forma truncada de hedgehog codificada por un RNA que termina precisamente en la posición normal de fragmentación interna. Estudios bioquímicos han demostrado que la fragmentación autoproteolítica de la proteína precursora de hedgehog tiene lugar pasando por un intermedio tioéster interno que a continuación es fragmentado en una sustitución nucleofílica. Se sugiere que el nucleófilo es una pequeña molécula lipofílica, y más en particular colesterol, que queda fijado mediante enlace covalente al extremo C-terminal del N-péptido (Porter et al. (1996) supra), atándolo a la superficie de la célula.

La familia de los vertebrados de los genes hedgehog incluye al menos cuatro miembros p. ej. paralogos del único gen hedgehog de drosophila (ID SEC Nº 19). Tres de estos miembros, a los que aquí se alude como Desert hedgehog (Dhh), Sonic hedgehog (Shh) e Indian hedgehog (Ihh), existen aparentemente en todos los vertebrados, incluyendo los peces, los pájaros y los mamíferos. Un cuarto miembro, al que aquí se alude como tiggie-winkle hedgehog (Thh), parece ser específico de los peces. Según el listado de secuencias adjunto (véase también la Tabla 1), un polipéptido Shh de pollo es codificado por la ID SEC Nº: 1; un polipéptido Dhh de ratón es codificado por la ID SEC Nº: 2; un polipéptido Ihh de ratón es codificado por la ID SEC Nº: 3; un polipéptido Shh de ratón es codificado por la ID SEC Nº: 4; un polipéptido Shh de pez cebra es codificado por la ID SEC Nº: 5; un polipéptido Shh humano es codificado por la ID SEC Nº: 6; un polipéptido Ihh humano es codificado por la ID SEC Nº: 7; un polipéptido Dhh humano es codificado por la ID SEC Nº: 8; y un Thh de pez cebra es codificado por la ID SEC Nº: 9.

TABLA 1 Guía de las secuencias hedgehog en el listado de secuencias

	Nucleótido	Aminoácido
Shh de pollo	ID SEC Nº 1	ID SEC Nº 10
Dhh de ratón	ID SEC Nº 2	ID SEC Nº 11
Ihh de ratón	ID SEC Nº 3	ID SEC Nº 12
Shh de ratón	ID SEC Nº 4	ID SEC Nº 13
Shh de pez cebra	ID SEC Nº 5	ID SEC Nº 14
Shh humano	ID SEC Nº 6	ID SEC Nº 15
Ihh humano	ID SEC Nº 7	ID SEC Nº 16
Dhh humano	ID SEC Nº 8	ID SEC Nº 17
Thh de pez cebra	ID SEC Nº 9	ID SEC Nº 18
HH de Drosophila	ID SEC Nº 19	ID SEC Nº 20

Además de la variación de secuencia entre los varios homólogos de hedgehog, las proteínas hedgehog están al parecer presentes de manera natural en una serie de distintas formas entre las que se incluyen una pro-forma, una forma madura de plena longitud y varios fragmentos elaborados de las mismas. La pro-forma incluye un péptido señal N-terminal para la secreción dirigida del dominio extracelular, mientras que la forma madura de plena longitud carece de esta secuencia señal.

Como se ha descrito anteriormente, en algunos casos tiene lugar un adicional procesamiento de la forma madura para producir fragmentos biológicamente activos de la proteína. Por ejemplo, el sonic hedgehog experimenta procesamiento proteolítico adicional para producir dos péptidos de aproximadamente 19 kDa y 27 kDa, correspondiendo el fragmento de 19 kDa a una parte N-terminal proteolítica de la proteína madura.

Además de la fragmentación proteolítica, las proteínas hedgehog de vertebrados pueden ser también modificadas post-translacionalmente, tal como por glicosilación y/o adición de mitades lipofílicas tales como ésteres, ácidos grasos, etc., si bien las formas producidas bacterianamente (p. ej. no modificadas) de las proteínas siguen manteniendo algunas de las bioactividades de la proteína nativa. Han sido generados y están descritos en gran detalle p. ej. en las publicaciones al amparo del PCT WO 95/18856 y WO 96/17924 fragmentos bioactivos de polipéptidos hedgehog de la presente invención.

Hay una amplia gama de mitades lipofílicas con las cuales pueden ser derivatizados polipéptidos hedgehog. En el contexto de estar unido a un polipéptido hedgehog, la expresión "grupo lipofílico" se refiere a un grupo que tiene un alto contenido de hidrocarburo que le da al grupo una alta afinidad para con fases lípidas. Un grupo lipofílico puede ser, por ejemplo, un grupo alquilo o cicloalquilo (preferiblemente n-alquilo) de cadena relativamente larga que tenga aproximadamente de 7 a 30 carbonos. El grupo alquilo puede terminar con una "cola" hidroxi o amina primaria. Como adicional ilustración, las moléculas lipofílicas incluyen mitades aromáticas y no aromáticas sintéticas y naturales tales como ácidos grasos, esteroles, ésteres y alcoholes, otras moléculas lípidas, estructuras tipo jaula tales como adamantano y buckminsterfullerenos, e hidrocarburos aromáticos tales como benceno, perileno, fenantreno, antraceno, naftaleno, pireno, criseno y naftaceno.

En una realización, el polipéptido hedgehog es modificado con una o varias mitades de esterol, tal como colesterol. Véase, por ejemplo, la publicación al amparo del PCT WO 96/17924. En ciertas realizaciones, el colesterol es preferiblemente añadido a la glicina C-terminal cuando el polipéptido hedgehog corresponde al fragmento proteolítico N-terminal que se da de manera natural.

En otra realización, el polipéptido hedgehog puede ser modificado con una mitad de ácido graso tal como una mitad de miristoilo, palmitoilo, estearoilo o araquidoilo. Véase, p. ej., Pepinsky et al. (1998) J Biol. Chem 273: 14037.

Además de los efectos que se ven mediante la adición de colesterol al C-terminus o mediante la adición de ácidos grasos al N-terminus de fragmentos extracelulares de la proteína, al menos algunas de las actividades biológicas de los productos del gen hedgehog son inesperadamente potenciadas por la derivatización de la proteína con mitades lipofílicas en otros sitios en la proteína y/o por mitades que no son colesterol o ácidos grasos. Determinados aspectos de la invención se refieren al uso de preparaciones de polipéptidos hedgehog que están modificados en sitios distintos de los residuos N-terminales o C-terminales de la forma procesada natural de la proteína, y/o que están modificados en tales residuos terminales con mitades lipofílicas distintas de un esterol en el C-terminus o con ácido graso en el N-terminus.

Son particularmente útiles como moléculas lipofílicas hidrocarburos alicíclicos, ácidos grasos saturados e insaturados y otras mitades lípidas y fosfolípidas, ceras, colesterol, isoprenoides, terpenos e hidrocarburos polialicíclicos incluyendo adamantano y buckminsterfullerenos, vitaminas, polietilenglicol u oligoetilenglicol, diésteres de alquilfosfato (de C1-C18), -O-CH_{2}-CH(OH)-O-alquilo(de C12-C18), y en particular conjugados con derivados de pireno. La mitad lipofílica puede ser un colorante lipofílico adecuado para ser usado en la invención e incluye, aunque sin carácter limitativo, difenilhexatrieno, Rojo Nilo, N-fenil-1-naftilamina, Prodan, Laurodan, Pireno, Perileno, rodamina, rodamina B, tetrametilrodamina, Rojo Texas, sulforrodamina, 1,1'-didodecil-3,3,3',3'tetrametilindocarbocianina perclorato, octadecilrodamina B y los colorantes BODIPY que suministra la Molecular Probes Inc.

Otros ejemplos de mitades lipofílicas incluyen grupos radicales carbonilo alifático que incluyen 1- o 2-adamantilacetil, 3-metiladamant-1-ilacetil, 3-metil-3-bromo-1-adamantilacetil, 1-decalinacetil, canforacetil, canfanoacetil, noradamantilacetil, norbornanoacetil, biciclo[2.2.2.]-oct-5-enoacetil, 1-metoxibiciclo[2.2.2.]-oct-5-eno-2-carbonil, cis-5-norborneno-endo-2,3-dicarbonil, 5-norbornen-2-ilacetil, (1R)-( - )-mirtentanoacetil, 2-norbornanoacetil, anti-3-oxo-triciclo[2.2.1.0<2,6> ]-heptano-7-carbonil, decanoil, dodecanoil, dodecenoil, tetradecadienoil, decinoil o dodecinoil.

El polipéptido hedgehog puede ser ligado a la mitad hidrofóbica de una serie de maneras entre las que se incluyen las de utilizar medios de acoplamiento químicos o bien ingeniería genética.

Hay un gran número de agentes reticuladores químicos que son conocidos para los expertos en la materia. Para la presente invención, los agentes reticuladores preferidos son reticuladores heterobifuncionales que pueden ser usados para ligar el polipéptido hedgehog y la mitad hidrofóbica por pasos. Los reticuladores heterobifuncionales proporcionan la posibilidad de diseñar métodos de acoplamiento más específicos para una conjugación a proteínas, reduciendo con ello las apariciones de reacciones laterales indeseadas tales como las que producen polímeros homoproteicos. Son conocidos en la técnica los de una amplia variedad de reticuladores heterobifuncionales. Éstos incluyen los siguientes: succinimidil 4-(N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato (SMCC), m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida éster (MBS); N-succinimidil (4-yodoacetil) aminobenzoato (SIAB), succinimidil 4-(p-maleimidofenil) butirato (SMPB), 1-etil-3(3-dimetilaminopropil) carbodiimida hidrocloruro (EDC); 4-succinimidiloxicarbonil- a-metil-a-(2-piridilditio)-tolueno (SMPT), N-succinimidil 3-(2-piridilditio) propionato (SPDP), succinimidil 6-[3-(2-piridilditio) propionato] hexanoato (LC-SPDP). Los agentes reticuladores que tienen mitades de N-hidroxisuccinimida pueden ser obtenidos como los análogos de N-hidroxisulfosuccinimida, que tienen en general mayor solubilidad en agua. Además, los agentes reticuladores que tienen puentes disulfuro dentro de la cadena ligadora pueden ser en lugar de ello sintetizados en forma de los derivados alquílicos para reducir la cantidad de fragmentación del ligador in vivo.

Además de los reticuladores heterobifuncionales, existe una serie de otros agentes reticuladores que incluyen reticuladores homobifuncionales y fotorreactivos. El disuccinimidil suberato (DSS), el bismaleimidohexano (BMH) y el dimetilpimelimidato\cdot2 HCl (DMP) son ejemplos de útiles agentes reticuladores homobifuncionales, y el bis[\beta-(4-azidosalicilamido)etil]disulfuro (BASED) y el N-succinimidil-6(4'-azido-2'-nitrofenilamino)hexanoato (SANPAH) son ejemplos de reticuladores fotorreactivos que son útiles para ser usados en esta invención. Para un reciente estudio de técnicas de acoplamiento de proteínas, véase Means et al. (1990) Bioconjugate Chemistry 1:2-12, que queda incorporado a la presente por referencia.

Los de una clase particularmente útil de reticuladores heterobifuncionales incluidos en la enumeración anterior contienen el grupo reactivo de amina primaria N-hidroxisuccinimida (NHS) o su análogo soluble en agua N-hidroxisulfosuccinimida (sulfo-NHS). Las aminas primarias (grupos lisina épsilon) a pH's alcalinos están no protonadas y reaccionan por ataque nucleofílico sobre ésteres de NHS o sulfo-NHS. Esta reacción redunda en la formación de un enlace amida y en una liberación de NHS o sulfo-NHS como subproducto.

Otro grupo reactivo que es útil como parte de un reticulador heterobifuncional es un grupo reactivo tiol. Los grupos reactivos tiol comunes incluyen maleimidas, halógenos y disulfuros de piridilo. Las maleimidas reaccionan específicamente con sulfhidrilos libres (residuos de cisteína) en minutos, bajo condiciones que van desde las ligeramente ácidas hasta las neutras (pH 6,5-7,5). Los halógenos (funciones yodoacetil) reaccionan con grupos -SH a pH's fisiológicos. Estos grupos reactivos redundan ambos en la formación de enlaces tioéter estables.

El tercer componente del reticulador heterobifuncional es el brazo distanciador o puente. El puente es la estructura que conecta los dos extremos reactivos. El atributo más manifiesto del puente es su efecto en el impedimento estérico. En algunos casos, un puente más largo puede salvar más fácilmente la distancia necesaria para conectar dos biomoléculas complejas. Por ejemplo, el SMPB tiene una extensión de 14,5 angstroms.

La preparación de conjugados de proteína-proteína usando reactivos heterobifuncionales es un proceso de dos pasos que supone la reacción de amina y la reacción de sulfhidrilo. Para el primer paso, que es el de la reacción de amina, la proteína elegida deberá contener una amina primaria. Esto puede ser aminas épsilon de lisina o una amina alfa primaria que se encuentra en el N-terminus de la mayoría de proteínas. La proteína no deberá contener grupos sulfhidrilo libres. En los casos en los que ambas proteínas a conjugar contienen grupos sulfhidrilo libres, una proteína puede ser modificada para que queden bloqueados todos los sulfhidrilos usando, por ejemplo, N-etilmaleimida (véase Partis et al. (1983) J. Pro. Chem. 2:263, que queda incorporado a la presente por referencia). Puede usarse Reactivo de Ellman para calcular la cantidad de sulfhidrilos en una determinada proteína (véanse, por ejemplo, Ellman et al. (1958) Arch. Biochem. Biophys. 74:443, y Riddles et al. (1979) Anal. Biochem. 94:75, que quedan incorporados a la presente por referencia).

El tampón de reacción deberá estar exento de aminas y sulfhidrilos foráneos. El pH del tampón de reacción deberá ser de 7,0-7,5. Esta gama de valores pH impide que los grupos maleimida reaccionen con aminas, preservando el grupo maleimida para la segunda reacción con sulfhidrilos.

Los reticuladores con contenido de éster de NHS tienen una limitada solubilidad en agua. Dichos reticuladores deberán ser disueltos en una cantidad mínima de disolvente orgánico (DMF o DMSO) (DMF = dimetilformamida; DMSO = dimetil-sulfóxido) antes de introducir el reticulador en la mezcla de reacción. El reticulador forma con el disolvente una emulsión que permitirá que se produzca la reacción.

Los análogos de éster de sulfo-NHS son más solubles en agua, y pueden ser añadidos directamente al tampón de reacción. Deberán evitarse los tampones de alta fuerza iónica, puesto que los mismos tienen tendencia a "salificar" los ésteres de sulfo-NHS. Para evitar la pérdida de reactividad debido a la hidrólisis, el reticulador es añadido a la mezcla de reacción inmediatamente después de disolver la solución de proteína.

Las reacciones pueden ser más eficientes en soluciones concentradas de proteína. Cuanto más alcalino es el pH de la mezcla de reacción, tanto mayor es la velocidad de reacción. La velocidad de hidrólisis de los ésteres de NHS y de sulfo-NHS aumentará también al aumentar el pH. Las temperaturas más altas incrementarán las velocidades de reacción tanto para la hidrólisis como para la acilación.

Una vez concluida la reacción, la primera proteína está ahora activada, con una mitad reactiva sulfhidrilo. La proteína activada puede ser aislada de la mezcla de reacción mediante simple filtración en gel o diálisis. Para llevar a cabo el segundo paso de la reticulación, que es la reacción de sulfhidrilo, el grupo lipofílico elegido para la reacción con maleimidas, halógenos activados o disulfuros de piridilo debe contener un sulfhidrilo libre. Como alternativa, una amina primaria puede ser modificada para añadir un sulfhidrilo.

En todos los casos, el tampón deberá ser desgasificado para impedir la oxidación de los grupos sulfhidrilo. Puede añadirse EDTA (EDTA = ácido etildiaminotetracético) para quelar todos aquellos metales oxidantes que puedan estar presentes en el tampón. Los tampones deberán estar exentos de cualesquiera compuestos con contenido de sulfhidrilo.

Las maleimidas reaccionan específicamente con grupos -SH a pH's situados dentro de la gama de los que van desde los ligeramente ácidos hasta los neutros (6,5-7,5). Un pH neutro es suficiente para las reacciones en las que intervienen halógenos y disulfuros de piridilo. Bajo estas condiciones, las maleimidas reaccionan generalmente con grupos -SH en cuestión de minutos. Son necesarios tiempos de reacción más largos para halógenos y disulfuros de piridilo.

La primera proteína sulfhidril-reactiva preparada en el paso de reacción de amina es mezclada con el grupo lipofílico con contenido de sulfhidrilo bajo las adecuadas condiciones de tampón. Los conjugados pueden ser aislados de la mezcla de reacción mediante métodos tales como el de la filtración en gel o la diálisis.

Los ejemplos de mitades lipofílicas activadas para la conjugación incluyen los siguientes: N-(1-pireno)maleimida; 2,5-dimetoxistilbeno-4'-maleimida, eosin-5-maleimida; fluorescein-5-maleimida; N-(4-(6-dimetilamino-2-benzofuranil)fenil)maleimida; benzofenona-4-maleimida; 4-dimetilaminofenilazofenil-4'-maleimida (DABMI), tetrametilrodamina-5-maleimida, tetrametilrodamina-6-maleimida, maleimida C2 Rojo Rodamina^{MF} (MF = marca de fábrica), N-(5-aminopentil)maleimida, sal de ácido trifluoroacético, N-(2-aminoetil)maleimida, sal de ácido trifluoroacético, maleimida 488 Verde Oregon^{MF}, N-(2-((2-(((4-azido-2,3,5,6-tetrafluoro)benzoil)amino)etil)ditio)etil)maleimida (TFPAM-SS1), 2-(1-(3-dimetilaminopropil)-indol-3-il)-3-(indol-3-il)maleimida (bisindolilmaleimida; GF 109203X), BODIPY® FL N-(2-aminoetil)maleimida, N-(7-dimetilamino-4-metilcumarin-3-il)maleimida (DACM), Alexa^{MF} 488 maleimida C5, Alexa^{MF} 594 maleimida C5, sal sódica N-(1-pireno)maleimida, 2,5-dimetoxistilbeno-4'-maleimida, eosin-5-maleimida, fluorescein-5-maleimida, N-(4-6-dimetilamino-2-benzofuranil)fenil)maleimida, benzofenona-4-maleimida, 4-dimetilaminofenilazofenil-4'-maleimida, 1-(2-maleimidiletil)-4-(5-(4-metoxifenil)oxazol-2-il)piridinio metanosulfonato, tetrametilrodamina-5-maleimida, tetrametilrodamina-6-maleimida, Rojo Rodamina^{MF} maleimida
C2, N-(5-aminopentil)maleimida, N-(2-aminoetil)maleimida, N-(2-((2-(((4-azido-2,3,5,6-tetrafluoro)benzoil)amino)etil)ditio)etil)maleimida, 2-(1-(3-dimetilaminopropil)-indoil-3-il)-3-(indol-3-il)maleimida, N-(7-dimetilamino-4-metilcumarin-3-il)maleimida (DACM), 11H-benzo[a]fluoreno y benzo[a]pireno.

En una realización, el polipéptido hedgehog puede ser derivatizado usando pirenomaleimida, que puede ser adquirida a la Molecular Probes (de Eugene, Oreg.), como p. ej., N-(1-pireno)maleimida o yodoacetato de 1-pirenometilo (éster de PMIA).

Para aquellas realizaciones en las que la mitad hidrofóbica es un polipéptido, el polipéptido hedgehog modificado de esta invención puede ser construido como una proteína de fusión que contiene el polipéptido hedgehog y la mitad hidrofóbica como una cadena polipeptídica contigua.

En ciertas realizaciones, la mitad lipofílica es un polipéptido anfipático tal como magainina, cecropina, atacina, melitina, gramicidina S, alfa-toxina de Staph. aureus, alameticina o un polipéptido anfipático sintético. Proteínas de la envoltura fusogénica de partículas virales pueden ser también una conveniente fuente de secuencias anfipáticas para las presentes proteínas erizo.

Además, puede usarse mutagénesis para crear polipéptidos hh modificados, p. ej. con finalidades tales como las de mejorar la eficacia terapéutica o profiláctica o la estabilidad (como p. ej. la duración de conservación ex vivo y la resistencia a la degradación proteolítica in vivo). Tales péptidos modificados pueden ser producidos, por ejemplo, mediante sustitución, eliminación o adición de aminoácidos. Los polipéptidos hedgehog modificados pueden también incluir aquéllos que presentan procesamiento post-translacional alterado con respecto a una proteína erizo que se da de manera natural, como es p. ej. una glicosilación, colesterolización o prenilación alterada y similares.

En una realización, el agente terapéutico hedgehog es un polipéptido que es susceptible de ser codificado por una secuencia de nucleótidos que se hibrida bajo condiciones rigurosas con una secuencia codificante hedgehog (erizo) representada en una o varias de las ID SEC Núms.: 1-7. Son conocidas para los expertos en la materia o pueden encontrarse en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. las apropiadas condiciones rigurosas que promueven la hibridación de DNA, como son por ejemplo las de 6,0 x cloruro sódico/citrato sódico (SSC) a aproximadamente 45ºC, seguido por un lavado con 2,0 x SSC a 50ºC. Por ejemplo, la concentración de sal en el paso de lavado puede ser seleccionada para que corresponda a unas condiciones que van desde las poco rigurosas con aproximadamente 2,0 x SSC a 50ºC hasta las muy rigurosas con aproximadamente 0,2 x SSC a 50ºC. Además, la temperatura en el paso de lavado puede ser incrementada para ir desde las condiciones poco rigurosas a temperatura ambiente de aproximadamente 22ºC hasta las condiciones muy rigurosas a aproximadamente 65ºC.

Como se ha descrito en la literatura, utilizando técnicas que son perfectamente conocidas en el ramo pueden obtenerse de muestras de RNAm o de DNA genómico genes para otras proteínas erizo, p. ej. de otros animales. Por ejemplo, cDNA que codifique una proteína erizo puede ser obtenido a base de aislar RNAm total de una célula, como p. ej. una célula de mamífero, como p. ej. una célula humana, incluyendo células embrionarias. cDNAs de doble hebra pueden ser entonces preparados a partir del RNAm total, y pueden ser a continuación insertados en un adecuado vector plásmido o bacteriófago utilizando cualesquiera de las de una serie de técnicas conocidas. El gen que codifica una proteína erizo puede ser también clonado utilizando técnicas de reacción en cadena de la polimerasa acreditadas.

Los ácidos nucleicos preferidos codifican un polipéptido hedgehog que comprende una secuencia de aminoácidos que es homóloga en un 60% o idéntica, más preferiblemente homóloga en un 70% o idéntica, y con la máxima preferencia homóloga en un 80% o idéntica, con respecto a una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre los miembros del grupo que consta de las ID SEC Núms.: 8-14. Quedan también dentro del alcance de la invención los ácidos nucleicos que codifican polipéptidos que guardan una relación de homología en aproximadamente un 90%, con más preferencia en al menos aproximadamente un 95%, y con la máxima preferencia en al menos aproximadamente un 98-99%, o una relación de identidad con respecto a una secuencia de aminoácidos representada en una de las ID SEC Núms.: 8-14.

Además de las proteínas erizo nativas, los polipéptidos hedgehog que son preferidos en la presente invención son al menos homólogos en un 60% o idénticos, más preferiblemente homólogos en un 70% o idénticos, y con la máxima preferencia homólogos en un 80% o idénticos, con respecto a una secuencia de aminoácidos representada por cualquiera de las ID SEC Núms.: 8-14. Quedan también dentro del alcance de la invención los polipéptidos que guardan una relación de homología en al menos un 90%, más preferiblemente en al menos un 95%, y con la máxima preferencia en al menos aproximadamente un 98-99%, o una relación de identidad, con respecto a una secuencia seleccionada de entre los miembros del grupo que consta de las ID SEC Núms.: 8-14. El único requisito previo es el de que el polipéptido hedgehog sea capaz de modelar el crecimiento de células epiteliales.

La expresión "proteína recombinante" se refiere a un polipéptido de la presente invención que es producido mediante técnicas de DNA recombinante, en las que en general DNA que codifica un polipéptido hedgehog es insertado en un adecuado vector de expresión que es a su vez usado para transformar una célula huésped para producir la proteína heteróloga. Además, la frase "sacado de", con respecto a un gen erizo recombinante, incluye dentro del significado de "proteína recombinante" las proteínas que tienen una secuencia de aminoácidos de una proteína erizo nativa o una secuencia de aminoácidos que es similar a la misma y es generada mediante mutaciones incluyendo sustituciones y eliminaciones (incluyendo el truncamiento) de una forma natural de la proteína.

El método de la presente invención puede ser también ejecutado usando formas variantes de los polipéptidos hedgehog que se dan de manera natural, como son p. ej. las variantes mutacionales.

Como es sabido en la técnica, los polipéptidos hedgehog pueden ser producidos mediante técnicas biológicas estándar o mediante síntesis química. Por ejemplo, una célula huésped transfectada con un vector de ácido nucleico que dirija la expresión de una secuencia de nucleótidos que codifique los polipéptidos que son objeto de la presente puede ser cultivada bajo condiciones apropiadas para permitir que tenga lugar la expresión del péptido. El polipéptido hedgehog puede ser secretado y aislado de una mezcla de células y medio que contenga el polipéptido hedgehog recombinante. Como alternativa, el péptido puede ser retenido citoplásmicamente retirando la secuencia del péptido señal del gen erizo recombinante, y las células pueden ser recolectadas y lisadas y la proteína puede ser aislada. Un cultivo celular incluye células huésped, medio y otros subproductos. Son perfectamente conocidos en la técnica medios adecuados para el cultivo celular. El polipéptido hedgehog recombinante puede ser aislado del medio de cultivo celular, de las células huésped o de ambos utilizando técnicas conocidas en el ramo para purificar proteínas, entre las que se incluyen la cromatografía de intercambio iónico, la cromatografía de filtración sobre gel, la ultrafiltración, la electroforesis y la purificación por inmunoafinidad con anticuerpos específicos para tal péptido. En una realización preferida, el polipéptido hedgehog recombinante es una proteína de fusión que contiene un dominio que facilita su purificación, tal como es el caso de una proteína de fusión erizo/GST. La célula huésped puede ser cualquier célula procariótica o eucariótica.

Los genes erizo recombinantes pueden ser producidos a base de ligar ácido nucleico que codifique una proteína erizo o una parte de la misma en un vector que sea adecuado para expresión en células procarióticas o en células eucarióticas o en ambas. Los vectores de expresión para la producción de formas recombinantes de los presentes polipéptidos hedgehog incluyen plásmidos y otros vectores. Por ejemplo, los vectores adecuados para la expresión de un polipéptido hedgehog incluyen plásmidos de los tipos siguientes: plásmidos sacados de pBR322, plásmidos sacados de pEMBL, plásmidos sacados de pEX, plásmidos sacados de pBTac y plásmidos sacados de pUC para expresión en células procarióticas tales como E. coli.

Existe una serie de vectores para la expresión de proteínas recombinantes en levadura. Por ejemplo, YEP24, YIP5, YEP51, YEP52, pYES2 e YRP17 son vehículos de clonación y expresión que son útiles en la introducción de constructos genéticos en S. cerevisiae (véase, por ejemplo, Broach et al. (1983) en Experimental Manipulation of Gene Expression, ed. M. Inouye Academic Press, p. 83, que queda incorporado a la presente por referencia). Estos vectores pueden replicarse en E. coli debido a la presencia del pBR322 ori, y en S. cerevisiae debido al determinante de replicación del plásmido de 2 micras de la levadura. Además pueden usarse marcadores de la resistencia a las drogas tales como ampicilina. En una realización ilustrativa, un polipéptido hedgehog es producido por vía recombinante utilizando un vector de expresión generado a base de subclonar la secuencia codificante de uno de los genes erizo representados en las ID SEC Núms.:1-7.

Los vectores de expresión de mamíferos preferidos contienen tanto secuencias procarióticas, para facilitar la propagación del vector en las bacterias, como una o varias unidades de transcripción eucariótica que son expresadas en células eucarióticas. Los vectores sacados de pcDNAI/amp, pcDNAI/neo, pRc/CMV, pSV2gpt, pSV2neo, pSV2-dhfr, pTk2, pRSVneo, pMSG, pSVT7, pko-neo y pHyg son ejemplos de vectores de expresión de mamíferos que son adecuados para la transfección de células eucarióticas. Algunos de estos vectores son modificados con secuencias de plásmidos bacterianos, tales como pBR322, para facilitar la replicación y la selección por resistencia a las drogas en las células tanto procarióticas como eucarióticas. Como alternativa, pueden usarse para la expresión transitoria de proteínas en células eucarióticas derivados de virus tales como el papillomavirus bovino (BPV-1) o el virus de Epstein-Barr (pHEBo, sacado de pREP y p205). Los diversos métodos que son empleados en la preparación de plásmidos y en la transformación de organismos huésped son perfectamente conocidos en la técnica. Para otros adecuados sistemas de expresión para células tanto procarióticas como eucarióticas, así como para procedimientos recombinantes generales, véase Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2ª Ed., publicado por Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989), Capítulos 16 y 17.

En algunos casos, puede ser deseable expresar el polipéptido hedgehog recombinante mediante el uso de un sistema de expresión con baculovirus. Los ejemplos de tales sistemas de expresión con baculovirus incluyen vectores sacados de pVL (tales como pVL1392, pVL1393 y pVL941), vectores sacados de pAcUW (tales como pAcUWI), y vectores sacados de pBlueBac (tales como el pBlueBac III que contiene \beta-gal).

Cuando es deseable expresar solamente una parte de una proteína erizo, tal como una forma que carezca de una parte del N-terminus, es decir un mutante de truncamiento que carezca del péptido señal, puede ser necesario añadir un codón de inicio (ATG) al fragmento oligonucleotídico que contiene la deseada secuencia a expresar. Es perfectamente sabido en la técnica que una metionina en la posición N-terminal puede ser escindida enzimáticamente mediante el uso de la enzima metionina aminopeptidasa (MAP). La MAP ha sido clonada a partir de E. coli (Ben-Bassat et al. (1987) J. Bacteriol. 169:751-757) y de Salmonella typhimurium, y su actividad in vitro ha sido demostrada sobre proteínas recombinantes (Miller et al. (1987) PNAS 84: 2718-1722). Por consiguiente, si se desea, la remoción de una metionina N-terminal puede lograrse ya sea in vivo a base de expresar polipéptidos sacados de hedgehog en un huésped que produzca MAP (como p. ej. E. coli o CM89 o S. cerevisiae) o bien in vitro mediante el uso de MAP purificada (como p. ej. en el procedimiento de Miller et al., supra).

Como alternativa, las secuencias codificantes para el polipéptido pueden ser incorporadas como parte de un gen de fusión que incluya una secuencia de nucleótidos que codifique un polipéptido distinto. Es un hecho ampliamente reconocido que las proteínas de fusión pueden también facilitar la expresión de proteínas, y pueden ser en consecuencia usadas en la expresión de los polipéptidos hedgehog de la presente invención. Por ejemplo, pueden ser generados polipéptidos hedgehog como proteínas de glutatión-S-transferasa (de fusión de GST). Tales proteínas de fusión de GST pueden permitir una fácil purificación del polipéptido hedgehog, tal como por ejemplo mediante el uso de matrices derivatizadas de glutatión (véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al. (N.Y.: John Wiley & Sons, 1991)). En otra realización, un gen de fusión que codifique para una secuencia guía de purificación, tal como una secuencia de sitio de corte para poli-(His)/enterocinasa, puede ser usado para sustituir la secuencia señal que se da de manera natural en el N-terminus de la proteína erizo (p. ej. de la pro-forma, a fin de permitir la purificación de la proteína poli(His)-erizo mediante cromatografía de afinidad usando una resina metálica de Ni^{2+}). La secuencia guía de purificación puede ser entonces retirada a continuación mediante tratamiento con enterocinasa (véase, p. ej., Hochuli et al. (1987) J. Chromatography 411:177; y Janknecht et al. PNAS 88:8972).

Son conocidas para los expertos en la materia las técnicas para hacer genes de fusión. En esencia, la unión de varios fragmentos de DNA que codifican distintas secuencias polipeptídicas es llevada a cabo según técnicas convencionales, empleando termini de extremo romo o de extremo escalonado para ligación, digestión por enzimas de restricción para lograr apropiados termini, relleno de extremos cohesivos según sea adecuado, tratamiento con fosfatasa alcalina para evitar la unión indeseable, y ligación enzimática. En otra realización, el gen de fusión puede ser sintetizado mediante técnicas convencionales, incluyendo la de los sintetizadores de DNA automatizados. Como alternativa, puede efectuarse amplificación de fragmentos génicos por reacción en cadena de la polimerasa usando cebadores de anclaje que dan lugar a salientes complementarios entre dos fragmentos génicos consecutivos que pueden ser a continuación hibridados para generar una secuencia de gen quimérico (véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al. John Wiley & Sons, 1992).

Los polipéptidos hedgehog pueden ser también modificados químicamente para crear derivados de hedgehog a base de formar conjugados covalentes o agregados con otras mitades quiméricas tales como grupos glicosilo, colesterol, isoprenoides, lípidos, fosfatos, grupos acetilo y similares. Pueden prepararse derivados covalentes de proteínas erizo a base de ligar las mitades químicas a grupos funcionales en cadenas laterales de aminoácidos de la proteína en el N-terminus o en el C-terminus del polipéptido.

Por ejemplo, pueden ser generadas proteínas erizo que incluyan una mitad que no sea la secuencia que va naturalmente asociada a la proteína y se fije a un componente de la matriz extracelular y favorezca la localización del análogo en las superficies de las células. Por ejemplo, secuencias sacadas de la "pequeña duplicación en tándem tipo III" de fibronectina, tal como una secuencia tetrapeptídica R-G-D-S (Pierschbacher et al. (1984) Nature 309:30-3; y Kornblihtt et al. (1985) EMBO 4:1755-9), pueden ser añadidas al polipéptido hedgehog para sustentar la unión de la molécula quimérica a una célula a través de componentes de la matriz extracelular de fijación (Ruoslahti et al. (1987) Science 238:491-497; Pierschbacheret et al. (1987) J. Biol. Chem. 262:I7294-8.; Hynes (1987) Cell 48:549-54; y Hynes (1992) Cell 69:11-25).

En una realización preferida, el polipéptido hedgehog está aislado o está de otro modo prácticamente exento de otras proteínas celulares, y especialmente de otras proteínas extracelulares o asociadas a la superficie de las células y que puedan estar normalmente asociadas al polipéptido hedgehog, a no ser que el mismo esté previsto en forma de proteína de fusión con el polipéptido hedgehog. Las expresiones "prácticamente exento de otras proteínas celulares o extracelulares" (también aquí llamadas "proteínas contaminantes") o "preparaciones prácticamente puras" o "preparaciones purificadas" están definidas como expresiones que engloban preparaciones de polipéptidos hedgehog que tienen menos de un 20% (en peso en seco) de proteína contaminante, y tienen preferiblemente menos de un 5% de proteína contaminante. El vocablo "purificado(a)" significa que la molécula indicada está presente prácticamente en ausencia de otras macromoléculas biológicas tales como otras proteínas. En el sentido el que se le utiliza en la presente, el vocablo "purificado(a)" significa preferiblemente al menos un 80% en peso en seco, más preferiblemente una gama de porcentajes de un 95-99% en peso, y con la máxima preferencia al menos un 99,8% en peso, de macromoléculas biológicas del mismo tipo que están presentes (si bien pueden estar presentes agua, tampones y otras pequeñas moléculas, y especialmente moléculas que tengan un peso molecular de menos de 5000). En sentido en el que se le utiliza en la presente, el vocablo "puro(a)" tiene preferiblemente los mismos límites numéricos como los del vocablo "purificado(a)" que acaba de ser aclarado.

Como se ha descrito anteriormente para los polipéptidos recombinantes, los polipéptidos hedgehog aislados pueden incluir la totalidad o una parte de las secuencias de aminoácidos que están representadas en cualesquiera de las ID SEC Núms.: 10-18 ó 20, o una secuencia homóloga a las mismas. Los fragmentos preferidos de las presentes proteínas erizo corresponden a los fragmentos proteolíticos N-terminales y C-terminales de la proteína madura. Están descritos en gran detalle en las publicaciones al amparo del PCT WO 95/18856 y WO 96/17924 fragmentos bioactivos de polipéptidos hedgehog.

Con respecto a los fragmentos bioactivos de polipéptido hedgehog, los agentes terapéuticos hedgehog preferidos incluyen al menos 50 residuos de aminoácidos (contiguos) de un polipéptido hedgehog, más preferiblemente al menos 100 residuos (contiguos), y aún más preferiblemente al menos 150 residuos (contiguos).

Otro polipéptido hedgehog preferido que puede ser incluido en el agente terapéutico hedgehog es un fragmento N-terminal de la proteína madura que tiene un peso molecular de aproximadamente 19 kDa.

Las proteínas erizo humanas preferidas incluyen fragmentos N-terminales que corresponden aproximadamente a los residuos 24-197 de la ID SEC Nº 15, 28-202 de la ID SEC Nº 16, y 23-198 de la ID SEC Nº 17. La expresión "corresponden aproximadamente" significa que la secuencia de interés es a lo sumo distinta en 20 residuos de aminoácidos en cuanto a la longitud con respecto a la secuencia de referencia, siendo sin embargo más preferiblemente distinta en cuanto a la longitud a lo sumo en 5, 10 ó 15 aminoácidos.

Como se ha descrito anteriormente para los polipéptidos recombinantes, los polipéptidos hedgehog aislados pueden incluir la totalidad o una parte de las secuencias de aminoácidos que están representadas en la ID SEC Nº: 8, en la ID SEC Nº: 9, en la ID SEC Nº: 10, en la ID SEC Nº: 11, en la ID SEC Nº: 12, en la ID SEC Nº: 13 o en la ID SEC Nº: 14, o de una secuencia homóloga a las mismas. Los fragmentos preferidos de las proteínas erizo que son objeto de la presente corresponden a los fragmentos proteolíticos N-terminales y C-terminales de la proteína madura. Están descritos en gran detalle en las publicaciones al amparo del PCT WO 95/18856 y WO 96/17924 fragmentos bioactivos de polipéptidos hedgehog.

Otros adicionales polipéptidos hedgehog incluyen una secuencia de aminoácidos representada por la fórmula A-B en la que: (I) A representa la totalidad o la parte de la secuencia de aminoácidos designada por los residuos 1-168 de la ID SEC Nº: 21; y B representa al menos un residuo de aminoácido de la secuencia de aminoácidos designada por los residuos 169-221 de la ID SEC Nº: 21; (II) A representa la totalidad o la parte de la secuencia de aminoácidos designada por los residuos 24-193 de la ID SEC Nº: 15; y B representa al menos un residuo de aminoácido de la secuencia de aminoácidos designada por los residuos 194-250 de la ID SEC Nº: 15; (III) A representa la totalidad o la parte de la secuencia de aminoácidos designada por los residuos 25-193 de la ID SEC Nº: 13; y B representa al menos un residuo de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos designada por los residuos 194-250 de la ID SEC Nº: 13; (IV) A representa la totalidad o la parte de la secuencia de aminoácidos designada por los residuos 23-193 de la ID SEC Nº: 11; y B representa al menos un residuo de aminoácido de la secuencia de aminoácidos designada por los residuos 194-250 de la ID SEC Nº: 11; (V) A representa la totalidad o la parte de la secuencia de aminoácidos designada por los residuos 28-197 de la ID SEC Nº: 12; y B representa al menos un residuo de aminoácido de la secuencia de aminoácidos designada por los residuos 198-250 de la ID SEC Nº: 12; (VI) A representa la totalidad o la parte de la secuencia de aminoácidos designada por los residuos 29-197 de la ID SEC Nº: 16; y B representa al menos un residuo de aminoácido de la secuencia de aminoácidos designada por los residuos 198-250 de la ID SEC Nº: 16; o (VII) A representa la totalidad o la parte de la secuencia de aminoácidos designada por los residuos 23-193 de la ID SEC Nº: 17; y B representa al menos un residuo de aminoácido de la secuencia de aminoácidos designada por los residuos 194-250 de la ID SEC Nº: 17. En determinadas realizaciones preferidas, A y B representan juntamente una secuencia designada como secuencia polipeptídica conjunta, A representa al menos 25, 50, 75, 100, 125 o 150 aminoácidos (contiguos) de la secuencia designada, y B representa 5, 10 o 20 residuos de aminoácidos (contiguos) de la secuencia de aminoácidos designada por la correspondiente anotación en el listado de secuencias, y A y B representan juntas preferiblemente una secuencia contigua correspondiente a la anotación en el listado de secuencias. Se contemplan también similares fragmentos de otros hedgehog, como p. ej. fragmentos que correspondan a los fragmentos preferidos de las anotaciones del listado de secuencias que han sido enumeradas anteriormente. En realizaciones preferidas, el polipéptido hedgehog incluye una glicina C-terminal (u otro residuo apropiado) que está derivatizada con un colesterol.

Partes peptidílicas aisladas de proteínas erizo pueden ser obtenidas seleccionando péptidos producidos por vía recombinante a partir del correspondiente fragmento del ácido nucleico que codifica tales péptidos. Además, los fragmentos pueden ser sintetizados químicamente utilizando técnicas que son conocidas en el ramo, tales como la química del f-Moc (f-Moc = fluorenil metoxicarbonil) o del t-Boc (t-Boc = terbutil oxicarbonil) en fase sólida de Merrifield. Por ejemplo, un polipéptido hedgehog de la presente invención puede ser dividido arbitrariamente en fragmentos de longitud deseada sin superposición de los fragmentos, o puede ser preferiblemente dividido en fragmentos superpuestos de una longitud deseada. Los fragmentos pueden ser producidos (por vía recombinante o mediante síntesis química) y probados para identificar los fragmentos peptidílicos que puedan funcionar como agonistas o antagonistas de una proteína erizo (p. ej. "auténtica") de tipo salvaje. Por ejemplo, Román et al. (1994) Eur J Biochem 222:65-73 describen el uso de análisis de fijación competitiva usando cortos péptidos sintéticos superpuestos de proteínas de mayor tamaño para identificar dominios de fijación.

Los polipéptidos hedgehog recombinantes de la presente invención incluyen también homólogos de las proteínas erizo auténticas, tales como versiones de aquellas proteínas que son resistentes a la fragmentación proteolítica, debido por ejemplo a mutaciones que alteran secuencias de fragmentación potencial o inactivan una actividad enzimática asociada a la proteína. Los homólogos de hedgehog de la presente invención incluyen también proteínas que han sido modificadas post-translacionalmente de una manera distinta de la proteína auténtica. Los ejemplos de derivados de proteínas erizo incluyen polipéptidos que carecen de sitios de N-glicosilación (p. ej. para producir una proteína no glicosilada), que carecen de sitios para colesterolización, y/o que carecen de secuencias N-terminales y/o C-terminales.

La modificación de la estructura de los polipéptidos hedgehog que son objeto de la presente puede también perseguir finalidades tales como las de aumentar la eficacia terapéutica o profiláctica o la estabilidad (como p. ej. la duración de conservación ex vivo y la resistencia a la degradación proteolítica in vivo). Cuando están diseñados para conservar al menos una actividad de la forma natural de la proteína, tales polipéptidos modificados son considerados equivalentes funcionales de los polipéptidos hedgehog que se describen más detalladamente en la presente. Tales péptidos modificados pueden ser producidos, por ejemplo, mediante sustitución, eliminación o adición de aminoácidos.

Es perfectamente sabido en la técnica que puede ser razonablemente de esperar que determinadas sustituciones aisladas de aminoácidos, como es p. ej. la sustitución de un residuo de aminoácido por otro aminoácido afín (es decir las mutaciones isoestéricas y/o isoeléctricas), puedan ser efectuadas sin que se produzcan efectos importantes en la actividad biológica de la molécula resultante. Son sustituciones conservadoras aquéllas que tienen lugar dentro de una familia de aminoácidos que son afines en sus cadenas laterales. Los aminoácidos que son codificados genéticamente pueden ser divididos en cuatro familias: (1) los ácidos = aspartato, glutamato; (2) los básicos = lisina, arginina, histidina; (3) los apolares = alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano; y (4) los polares sin carga = glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina. La fenilalanina, el triptófano y la tirosina son a veces clasificados juntamente como aminoácidos aromáticos. De manera similar, los del repertorio de aminoácidos pueden ser agrupados como (1) ácidos = aspartato, glutamato; (2) básicos = lisina, arginina, histidina; (3) alifáticos = glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, serina y treonina, siendo la serina y la treonina opcionalmente agrupadas por separado como hidroxil-alifáticos; (4) aromáticos = fenilalanina, tirosina, triptófano; (5) amida = asparagina, glutamina; y (6) con contenido de azufre = cisteína y metionina. (Véase, por ejemplo, Biochemistry, 2ª ed., Ed. de L. Stryer, WH Freeman and Co.: 1981). La cuestión de si un cambio de la secuencia de aminoácidos de un péptido redunda en un homólogo funcional de hedgehog (p. ej. funcional en el sentido de que actúe imitando o antagonizando la forma de tipo salvaje) puede ser fácilmente determinada a base de valorar la capacidad del péptido variante para producir una respuesta en células de manera similar a como lo hace la proteína de tipo salvaje, o para inhibir competitivamente tal respuesta. Los polipéptidos en los cuales ha tenido lugar más de una sustitución pueden ser probados fácilmente de la misma manera.

Se contempla específicamente que los métodos de la presente invención pueden ser ejecutados usando homólogos de proteínas erizo que se dan de manera natural. En una realización, la invención contempla el uso de polipéptidos hedgehog generados por mutagénesis combinatoria. Tales métodos, como los que son conocidos en la técnica, son convenientes para generar mutantes obtenidos tanto por mutación puntiforme como por mutación por truncamiento, y pueden ser específicamente útiles para identificar potenciales secuencias variantes (p. ej. homólogos) que sean funcionales en cuanto a la fijación a un receptor para proteínas erizo. La finalidad de someter a selección a tales bibliotecas combinatorias es la de generar, por ejemplo, nuevos homólogos de hedgehog que puedan actuar como agonistas o antagonistas. A título ilustrativo, mediante el presente método pueden diseñarse homólogos de hedgehog para lograr una más eficiente fijación a un receptor afín, tal como patched, conservando sin embargo al menos una parte de una actividad asociada a hedgehog. Así, pueden ser generados homólogos obtenidos por la vía combinatoria para que tengan una potencia incrementada con respecto a una forma natural de la proteína. Análogamente, mediante el presente enfoque combinatorio pueden ser generados homólogos de hedgehog para que actúen como antagonistas siendo capaces de imitar, por ejemplo, la fijación a otros componentes de la matriz extracelular (tales como receptores) pero sin inducir respuesta biológica alguna, inhibiendo con ello la acción de los auténticos hedgehog o agonistas para hedgehog. Además, la manipulación de determinados dominios de hedgehog por el presente método puede proporcionar dominios más adecuados para su uso en proteínas de fusión, tales como uno que incorpore partes de otras proteínas que estén sacadas de la matriz extracelular y/o fijen componentes de la matriz extracelular.

Para ilustrar adicionalmente el estado de la técnica de la mutagénesis combinatoria, se señala que el artículo de revista de Gallop et al. (1994) J Med Chem 37:1233 describe el estado general de la técnica de las bibliotecas combinatorias desde los comienzos de la década de los noventa. En particular, Gallop et al. dicen en la página 1239 "el someter a selección las bibliotecas de análogos ayuda a determinar el tamaño mínimo de la secuencia activa y a identificar los residuos que son decisivos para la fijación y no toleran la sustitución". Además, la publicación de Ladner et al. al amparo del PCT WO90/02809, la Patente U.S. 5.223.408 de Goeddel et al. y la publicación al amparo del PCT WO92/15679 de Markland et al. ilustran técnicas específicas que un experto en la materia podría utilizar para generar bibliotecas de variantes de hedgehog que pueden ser sometidas rápidamente a selección para identificar las variantes/los fragmentos que conservaron una determinada actividad de los polipéptidos hedgehog. Estas técnicas constituyen ejemplos del estado de la técnica y demuestran que pueden ser generadas y analizadas grandes bibliotecas de variantes/truncantes afines para aislar variantes específicas sin una innecesaria experimentación. Gustin et al. (1993) Virology 193:653 y Bass et al. (1990) Proteins: Structure, Function and Genetics 8:309-314 describen también otros ejemplos de técnicas que se utilizan en el ramo y pueden ser adaptadas como medios para generar variantes mutagénicas de polipéptidos hedgehog.

Ciertamente, está claro a la luz de la técnica de la mutagénicas combinatoria que puede ser llevada a cabo a gran escala mutagénesis de proteínas erizo sin ideas preconcebidas de tipo alguno acerca de qué residuos fuesen decisivos para la función biológica, y pueden ser generadas amplias gamas de variantes que tengan una actividad biológica equivalente. Ciertamente, las técnicas combinatorias tienen la capacidad de someter a selección billones de distintas variantes mediante análisis de alto rendimiento que elimina toda necesidad de una comprensión o un conocimiento a priori de los residuos decisivos.

A título ilustrativo, las secuencias de aminoácidos para una población de homólogos de hedgehog o de otras proteínas afines son alineadas, preferiblemente para promover la máxima homología posible. Tal población de variantes puede incluir, por ejemplo, homólogos de hedgehog de una o varias especies. Los aminoácidos que aparecen en cada posición de las secuencias alineadas son seleccionados para crear un conjunto degenerado de secuencias combinatorias. En una realización preferida, la biblioteca diversificada de variantes de hedgehog es generada mediante mutagénesis combinatoria a nivel del ácido nucleico, y es codificada por una biblioteca de genes diversificados. Por ejemplo, los de una mezcla de oligonucleótidos sintéticos pueden ser ligados enzimáticamente para ser transformados en secuencias génicas de forma tal que las del conjunto degenerado de potenciales secuencias hedgehog sean susceptibles de ser expresadas como polipéptidos individuales, o bien como alternativa como un conjunto de mayores proteínas de fusión (p. ej. para la presentación de fagos) que contengan en las mismas el conjunto de secuencias hedgehog.

Como se ilustra en la publicación al amparo del PCT WO 95/18856, para analizar las secuencias de una población de variantes las secuencias de aminoácidos de interés pueden ser alineadas con respecto a la homología secuencial. La presencia o ausencia de aminoácidos en una secuencia alineada de una variante determinada es relativa a una longitud de consenso elegida de una secuencia de referencia que puede ser real o artificial.

En una realización ilustrativa, la alineación de los exones 1 y 2 y una parte de las secuencias codificadas por el exón 3 (como p. ej. los aproximadamente 221 residuos N-terminales de la proteína madura) de cada uno de los clones de Shh produce un conjunto degenerado de polipéptidos Shh que están representados por la fórmula general:

1

donde cada una de las posiciones degeneradas ''X'' puede ser un aminoácido que se dé en esa posición en uno de los clones de Shh de humano, de ratón, de pollo o de pez cebra, o bien, para expandir la biblioteca, cada X puede ser también seleccionado de entre residuos de aminoácidos que serían sustituciones conservadoras para los aminoácidos que aparecen de manera natural en cada una de estas posiciones. Por ejemplo, Xaa(1) representa Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr o Trp; Xaa(2) representa Arg, His o Lys; Xaa(3) representa Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser o Thr; Xaa(4) representa Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser o Thr; Xaa(5) representa Lys, Arg, His, Asn o Gln; Xaa(6) representa Lys, Arg o His; Xaa(7) representa Ser, Thr, Tyr, Trp o Phe; Xaa(8) representa Lys, Arg o His; Xaa(9) representa Met, Cys, Ser o Thr; Xaa(10) representa Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser o Thr; Xaa(11) representa Leu, Val, Met, Thr o Ser; Xaa(12) representa His, Phe, Tyr, Ser, Thr, Met o Cys; Xaa(13) representa Gln, Asn, Glu o Asp; Xaa(14) representa His, Phe, Tyr, Thr, Gln, Asn, Glu o Asp; Xaa(15) representa Gln, Asn, Glu, Asp, Thr, Ser, Met o Cys; Xaa(16) representa Ala, Gly, Cys, Leu, Val o Met; Xaa(17) representa Arg, Lys, Met, Ile, Asn, Asp, Glu, Gln, Ser, Thr o Cys; Xaa(18) representa Arg, Lys, Met o Ile; Xaa(19) representa Ala, Gly, Cys, Asp, Glu, Gln, Asn, Ser, Thr o Met; Xaa(20) representa Ala, Gly, Cys, Asp, Asn, Glu o Gln; Xaa(21) representa Arg, Lys, Met, Ile, Asn, Asp, Glu o Gln; Xaa(22) representa Leu, Val, Met o Ile; Xaa(23) representa Phe, Tyr, Thr, His o Trp; Xaa(24) representa Ile, Val, Leu o Met; Xaa(25) representa Met, Cys, Ile, Leu, Val, Thr o Ser; Xaa(26) representa Leu, Val, Met, Thr o Ser. En una biblioteca aún más expansiva, cada X puede ser seleccionado de entre cualesquiera aminoácidos.

De manera similar, la alineación de cada uno de los clones de hedgehog de humano, de ratón, de pollo y de pez cebra puede proporcionar una secuencia polipeptídica degenerada representada por la fórmula general:

2

donde, al igual como en el caso anterior, cada una de las posiciones degeneradas ''X'' puede ser un aminoácido que se dé en una posición correspondiente en uno de los clones de tipo salvaje, y puede también incluir residuos de aminoácidos que fuesen sustituciones conservadoras, o bien cada X puede ser cualquier residuo de aminoácido. En un ejemplo de realización, Xaa(1) representa Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe o Tyr; Xaa(2) representa Gly, Ala, Val, Leu o Ile; Xaa(3) representa Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Lys, His o Arg; Xaa(4) representa Lys, Arg o His; Xaa(5) representa Phe, Trp, Tyr o una laguna de aminoácido; Xaa(6) representa Gly, Ala, Val, Leu, Ile o una laguna de aminoácido; Xaa(7) representa Asn, Gln, His, Arg o Lys; Xaa(8) representa Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser o Thr; Xaa(9) representa Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser o Thr; Xaa(10) representa Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser o Thr; Xaa(11) representa Ser, Thr, Gln o Asn; Xaa(12) representa Met, Cys, Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser o Thr; Xaa(13) representa Gly, Ala, Val, Leu, Ile o Pro; Xaa(14) representa Arg, His o Lys; Xaa(15) representa Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Arg, His o Lys; Xaa(16) representa Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Phe o Tyr; Xaa(17) representa Arg, His o Lys; Xaa(18) representa Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser o Thr; Xaa(19) representa Thr o Ser; Xaa(20) representa Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Asn o Gln; Xaa(21) representa Arg, His o Lys; Xaa(22) representa Asp o Glu; Xaa(23) representa Ser o Thr; Xaa(24) representa Glu, Asp, Gln o Asn; Xaa(25) representa Glu o Asp; Xaa(26) representa Arg, His o Lys; Xaa(27) representa Gly, Ala, Val, Leu o Ile; Xaa(28) representa Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Thr o Ser; Xaa(29) representa Met, Cys, Gln, Asn, Arg, Lys o His; Xaa(30) representa Arg, His o Lys; Xaa(31) representa Trp, Phe, Tyr, Arg, His o Lys; Xaa(32) representa Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser, Thr, Tyr o Phe; Xaa(33) representa Gln, Asn, Asp o Glu; Xaa(34) representa Asp o Glu; Xaa(35) representa Gly, Ala, Val, Leu o Ile; Xaa(36) representa Arg, His o Lys; Xaa(37) representa Asn, Gln, Thr o Ser; Xaa(38) representa Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser, Thr, Met o Cys; Xaa(39) representa Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Thr o Ser; Xaa(40) representa Arg, His o Lys; Xaa(41) representa Asn, Gln, Gly, Ala, Val, Leu o Ile; Xaa(42) representa Gly, Ala, Val, Leu o Ile; Xaa(43) representa Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser, Thr o Cys; Xaa(44) representa Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Thr o Ser; y Xaa(45) representa Asp o Glu.

Hay muchas maneras de poder generar la biblioteca de potenciales homólogos de hedgehog a partir de una secuencia oligonucleotídica degenerada. La síntesis química de una secuencia génica degenerada puede ser llevada a cabo en un sintetizador de DNA automático, y los genes sintéticos pueden ser entonces ligados en un adecuado vector de expresión. La finalidad de un conjunto degenerado de genes es la de prever en una mezcla todas las secuencias que codifican el deseado conjunto de potenciales secuencias hedgehog. La síntesis de oligonucleótidos degenerados es perfectamente conocida en la técnica (véanse, por ejemplo, Narang, SA (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al. (1981) Recombinant DNA, Proc 3rd Cleveland Sympos. Macromolecules, ed. AG Walton, Amsterdam: Elsevier pp273-289; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al. (1984) Science 198:1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acid Res. 11:477). Tales técnicas han sido empleadas en la evolución dirigida de otras proteínas (véanse, por ejemplo, Scott et al. (1990) Science 249:386-390; Roberts et al. (1992) PNAS 89:2429-2433; Devlin et al. (1990) Science 249: 404-406; Cwirla et al. (1990) PNAS 87: 6378-6382; así como las Patentes U.S. Núms. 5.223.409, 5.198.346 y 5.096.815).

Son conocidas en la técnica las de una amplia gama de técnicas para someter a selección productos génicos de bibliotecas combinatorias hechas mediante mutaciones puntiformes, y para someter a selección a bibliotecas de cDNA para la localización de productos génicos que presenten una determinada propiedad. Tales técnicas serán en general adaptables para someter a una rápida selección las bibliotecas de genes generadas mediante la mutagénesis combinatoria de homólogos de hedgehog. Las técnicas que son en la mayoría de los casos utilizadas para someter a selección a grandes bibliotecas de genes comprenden típicamente los pasos de clonar la biblioteca de genes en vectores de expresión reproducibles, transformar células adecuadas con la resultante biblioteca de vectores, y expresar los genes combinatorios bajo condiciones en las cuales la detección de una actividad deseada facilite un aislamiento relativamente fácil del vector que codifique el gen cuyo producto fue detectado. Cada uno de los análisis ilustrativos que se describen más adelante se presta a efectuar un análisis con alto rendimiento según sea necesario para someter a selección a grandes números de secuencias hedgehog degeneradas creadas mediante técnicas de mutagénesis combinatoria.

En una realización, la biblioteca combinatoria es diseñada para ser secretada (p. ej. los polipéptidos de la biblioteca incluyen todos ellos una secuencia señal pero no dominios transmembrana o citoplásmicos), y es usada para transfectar una célula eucariótica que puede ser cocultivada con células troncales epiteliales. Una proteína erizo funcional secretada por las células que expresan la biblioteca combinatoria se difundirá a las células epiteliales contiguas e inducirá una determinada respuesta biológica tal como la proliferación. El patrón de detección de proliferación se asemejará a una función de gradiente y permitirá el aislamiento (generalmente después de varios ciclos de selección repetitivos) de las células que produzcan homólogos de hedgehog que sean activos como agentes proliferativos con respecto a células epiteliales. Análogamente, los antagonistas para hedgehog pueden ser seleccionados de manera similar por medio de la capacidad de la célula para producir un antagonista funcional para proteger a las células contiguas (p. ej. para inhibir la proliferación) contra el efecto de hedgehog de tipo salvaje añadido a los medios de cultivo.

A título ilustrativo, células epiteliales diana son cultivadas en placas de cultivo de microtitulación de 24 cavidades. Otras células eucarióticas son transfectadas con la biblioteca combinatoria de genes hedgehog (erizo) y son cultivadas en insertos de cultivo celular (p. ej. de la Collaborative Biomedical Products, Nº de Catálogo 40446) que son capaces de encajar en las cavidades de la placa de cultivo de microtitulación. Los insertos de cultivo celular son colocados en las cavidades de forma tal que los homólogos de hedgehog recombinantes secretados por las células en el inserto puedan difundirse en el fondo poroso del inserto y establecer contacto con las células diana en las cavidades de la placa de cultivo de microtitulación. Tras haber transcurrido un periodo de tiempo suficiente para que las formas funcionales de una proteína erizo produzcan una respuesta mensurable en las células diana, tal como la proliferación, los insertos son retirados y se determina el efecto de las proteínas erizo variantes en las células diana. Las células de los insertos correspondientes a las cavidades que han dado positivo para la actividad pueden ser divididas y cultivadas de nuevo sobre varios insertos, siendo repetido el proceso hasta haber sido identificados los clones activos.

En otro adicional análisis de selección, los productos del gen hedgehog (erizo) candidato son presentados en la superficie de una célula o partícula viral, y la capacidad de específicas células o partículas virales para asociarse a una mitad de fijación a hedgehog (tal como la proteína patched u otro receptor para hedgehog) por medio de este producto génico es detectada en un "análisis de reconocimiento y selección". Tales pasos de reconocimiento y selección pueden ser llevados a cabo sobre células cultivadas a partir de embriones. Por ejemplo, la biblioteca de genes puede ser clonada para su conversión en el gen de una proteína de membrana de superficie de una célula bacteriana, y la proteína de fusión resultante puede ser detectada mediante reconocimiento y selección (Ladner et al., WO 88/06630; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9:1370-1371; y Goward et al. (1992) TIBS 18:136-140). De manera similar, moléculas marcadas por fluorescencia que fijen hedgehog pueden ser usadas para puntuar con respecto a homólogos de hedgehog potencialmente funcionales. Las células pueden ser inspeccionadas y separadas visualmente bajo un microscopio de fluorescencia, o bien, cuando lo permita la morfología de la célula, pueden ser separadas mediante un clasificador de células activado por fluorescencia.

En una realización alternativa, la biblioteca de genes es expresada como proteína de fusión sobre la superficie de una partícula viral. Por ejemplo, en el sistema de fago filamentoso, secuencias peptídicas foráneas pueden ser expresadas sobre la superficie de fago infeccioso, con lo que se logran dos importantes ventajas. Primeramente, puesto que estos fagos pueden ser aplicados a matrices de afinidad a concentraciones muy altas, puede ser sometido a selección cada vez un gran número de fagos. En segundo lugar, puesto que cada fago infeccioso presenta el producto del gen combinatorio en su superficie, si un determinado fago es recuperado a partir de una matriz de afinidad con baja producción, el fago puede ser amplificado mediante otro ciclo de infección. Los del grupo de fagos filamentosos casi idénticos de E. coli M13, fd y f1 son los más frecuentemente usados en las bibliotecas de presentación de fagos, puesto que cualquiera de las proteínas de envoltura gIII o gVIII del fago puede ser usada para generar proteínas de fusión sin desorganizar el empaquetamiento final de la partícula viral (Ladner et al., publicación al amparo del PCT WO 90/02909; Garrard et al., publicación al amparo del PCT WO 92/09690; Marks et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:16007-16010; Griffihs et al. (1993) EMBO J 12:725-734; Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628; y Barbas et al. (1992) PNAS 89:4457-4461).

En una realización ilustrativa, el sistema de anticuerpos para fagos recombinantes (RPAS, número de Catálogo de Pharamacia 27-9400-01) puede ser modificado fácilmente para ser usado para expresar y someter a selección bibliotecas combinatorias de hedgehog. Por ejemplo, el fagémido pCANTAB 5 del conjunto de materiales y utensilios RPAS contiene el gen que codifica la proteína de envoltura fago gIII. La biblioteca de genes combinatorios hedgehog (erizo) puede ser clonada en el fagémido adyacente a la secuencia señal gIII de forma tal que será expresada como una proteína de fusión gIII. Tras ligación, el fagémido es usado para transformar células TG1 de E. coli competentes. Las células transformadas son a continuación infectadas con fago colaborador M13KO7 para rescatar el fagémido y su inserto génico hedgehog (erizo) candidato. Los fagos recombinantes resultantes contienen DNA de fagémido que codifica un específico hedgehog candidato, y exhiben una o varias copias de la correspondiente proteína de envoltura de fusión. Las proteínas hedgehog (erizo) candidatas que son exhibidas en fagos y son capaces de fijar un receptor para hedgehog son seleccionadas o enriquecidas por reconocimiento y selección. Por ejemplo, la biblioteca de fagos puede ser aplicada a células que expresen la proteína patched, y los fagos no fijados pueden ser retirados por lavado de las células. El fago fijado es entonces aislado, y si los fagos recombinantes expresan al menos una copia de la proteína de envoltura gIII de tipo salvaje, los mismos conservarán su capacidad de infectar E. coli. Así, mediante sucesivos ciclos de reinfección de E. coli y reconocimiento y selección se logrará un considerable enriquecimiento en homólogos de hedgehog, que pueden ser entonces sometidos a selección con respecto a adicionales actividades biológicas a fin de diferenciar los agonistas y los antagonistas.

La mutagénesis combinatoria tiene el potencial de generar bibliotecas muy grandes de proteínas mutantes, p. ej. del orden de 10^{26} moléculas. Las bibliotecas combinatorias de estas proporciones pueden representar un desafío técnico de cara a la selección incluso con análisis de selección de alto rendimiento tales como el de la presentación en fagos. Para superar este problema, recientemente ha sido desarrollada una nueva técnica, que es la de la mutagénesis recursiva de conjunto (REM), que permite evitar la muy alta proporción de proteínas no funcionales en una biblioteca aleatoria y aumenta simplemente la frecuencia de proteínas funcionales, reduciendo así la complejidad necesaria para lograr un útil muestreo de espacio secuencial. La REM es un algoritmo que aumenta la frecuencia de mutantes funcionales en una biblioteca cuando se emplea un adecuado método de selección (Arkin and Yourvan, 1992, PNAS USA 89:7811-7815; Yourvan et al., 1992, Parallel Problem Solving from Nature, 2, en Maenner and Manderick, eds., Elsevier Publishing Co., Amsterdam, pp. 401-410; Delgrave et al., 1993, Protein Engineering 6(3):327-331).

La invención permite también la reducción de la proteína erizo para generar miméticos, como p. ej. agentes peptídicos o no peptídicos que son capaces de desorganizar la fijación de un polipéptido hedgehog de la presente invención a un receptor para hedgehog. Así, técnicas mutagénicas tales como las anteriormente descritas son también útiles para mapear los determinantes de las proteínas hedgehog (erizo) que participan en las interacciones de proteína-proteína que intervienen en, por ejemplo, la fijación del presente polipéptido hedgehog a otros componentes de la matriz extracelular. A título ilustrativo, los residuos decisivos de un polipéptido hedgehog objeto de la presente que intervienen en el reconocimiento molecular de un receptor para hedgehog tal como patched pueden ser determinados y usados para generar peptidomiméticos sacados de hedgehog que inhiban competitivamente la fijación de la proteína hedgehog (erizo) auténtica con esa mitad. Empleando, por ejemplo, mutagénesis de barrido para mapear los residuos de aminoácidos de cada una de las proteínas erizo de interés que intervienen en la fijación de otras proteínas extracelulares, pueden ser generados compuestos peptidomiméticos que imiten aquellos residuos de la proteína erizo que facilitan la interacción. Tales miméticos pueden ser entonces usados para interferir en el funcionamiento normal de una proteína erizo. Por ejemplo, pueden ser generados análogos peptídicos no hidrolizables de tales residuos usando benzodiazepina (véase, p. ej., Freidinger et al. en Peptides: Chemistry and Biology, G.R. Marshall ed., ESCOM Publisher: Leiden, Países Bajos, 1988), azepina (véase, p. ej. Huffman et al. en Peptides: Chemistry and Biology, G.R. Marshall ed., ESCOM Publisher: Leiden, Países Bajos, 1988), anillos de gamma-lactama sustituidos (Garvey et al. en Peptides: Chemistry and Biology, G.R. Marshall ed., ESCOM Publisher, Leiden, Países Bajos, 1988), seudopéptidos de ceto-metileno (Ewenson et al. (1986) J Med Chem 29:295; y Ewenson et al. en Peptides: Structure and Function (Proceedings of the 9^{th} American Peptide Symposium) Pierce Chemical Co. Rockland, IL, 1985), núcleos de dipéptidos de vuelta \beta (Nagai et al. (1985) Tetrahedron Lett 26:647; y Sato et al. (1986) J Chem Soc Perkin Trans 1:1231), y \beta-aminoalcoholes (Gordon et al. (1985) Biochem Biophys Res Commun 126:419; y Dann et al. (1986) Biochem Biophys Res Commun 134:71).

Pueden producirse formas de las proteínas erizo producidas por vía recombinante usando, p. ej., vectores de expresión que contengan un ácido nucleico que codifique un polipéptido hedgehog y esté ligado operativamente a al menos una secuencia reguladora transcripcional. La expresión "ligado operativamente" significa que la secuencia nucleotídica está ligada a una secuencia reguladora de una manera que permite la expresión de la secuencia nucleotídica. Las secuencias reguladoras están reconocidas en la técnica y son seleccionadas para dirigir la expresión de un polipéptido hedgehog. En consecuencia, la expresión "secuencia reguladora transcripcional" incluye promotores, potenciadores y otros elementos de control de la expresión. Tales secuencias reguladoras están descritas en Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Por ejemplo, cualesquiera de las de una amplia variedad de secuencias de expresión, es decir secuencias que controlan la expresión de una secuencia de DNA al estar ligadas operativamente a la misma, pueden ser usadas en estos vectores para expresar las secuencias de DNA que codifican polipéptido hedgehog. Tales útiles secuencias de control de expresión incluyen, por ejemplo, una secuencia terminal repetida larga viral tal como la secuencia terminal repetida larga del virus de la leucemia murina de Moloney, los promotores iniciales y finales de SV40, el promotor inicial inmediato de adenovirus o citomegalovirus, el sistema LAC, el sistema TRP, el sistema TAC o TRC, el promotor T7 cuya expresión es dirigida por T7 RNA polimerasa, las principales regiones operadora y promotora del fago \lambda, las regiones de control para proteína de envoltura fd, el promotor para 3-fosfoglicerato cinasa u otras enzimas glicolíticas, los promotores de ácido fosfatasa, como p. ej. Pho5, los promotores de los factores de apareamiento \alpha de levadura, el promotor poliédrico del sistema de baculovirus y otras secuencias de las que se sabe que controlan la expresión de genes de células procarióticas o eucarióticas u otros virus, y varias combinaciones de los mismos. Deben entenderse que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la elección de la célula huésped a transformar y/o el tipo de proteína que se desee expresar. Además deberán considerarse también el número de copias del vector, la capacidad de controlar ese número de copias y la expresión de cualesquiera otras proteínas codificadas por el vector, tales como marcadores antibióticos.

Además de proporcionar una pronta fuente de polipéptidos hedgehog para purificación, los constructos génicos de la presente invención pueden ser también usados como parte de un protocolo de terapia génica para suministrar ácidos nucleicos que codifiquen una forma agonista o antagonista de un polipéptido hedgehog. Así, otro aspecto de la invención se refiere a vectores de expresión para transfección in vivo de un polipéptido hedgehog en específicos tipos de células para ocasionar una expresión ectópica de un polipéptido hedgehog en un tejido epitelial.

Las formulaciones de tales constructos de expresión pueden ser administradas en cualquier vehículo biológicamente efectivo, como p. ej. toda formulación o composición que sea capaz de suministrar efectivamente el gen recombinante a células in vivo. Las soluciones que pueden adoptarse a este respecto incluyen la inserción de la secuencia codificante de hedgehog en vectores virales entre los que se incluyen retrovirus recombinantes, adenovirus, virus adeno-asociados y virus del herpes simplex tipo 1, o plásmidos eucarióticos o bacterianos recombinantes. Los vectores virales transfectan las células directamente; pudiendo ser el DNA plasmídico suministrado con ayuda de, por ejemplo, liposomas catiónicos (lipofectina) o conjugados de polilisina (p. ej. conjugados de anticuerpos) derivatizados, gramacidina S, envolturas virales artificiales u otros vehículos intracelulares de este tipo, así como la inyección directa del constructo génico o la precipitación con CaPO_{4} llevada a cabo in vivo. Se comprenderá que debido al hecho de que la transducción de adecuadas células diana representa el primer paso decisivo en terapia génica, la elección del específico sistema de suministro de genes dependerá de factores tales como el fenotipo de la diana prevista y la ruta de administración, como es p. ej. la administración local o la administración sistémica. Además, se reconocerá que los específicos constructos génicos previstos para transducción in vivo de la expresión de hedgehog son también útiles para la transducción in vitro de células, tal como para su uso en los sistemas de cultivo de tejido ex vivo que se describen más adelante.

Un enfoque preferido para la introducción in vivo de ácido nucleico en una célula es el consistente en el uso de un vector viral que contenga ácido nucleico, como p. ej. un cDNA que codifique la forma específica del polipéptido hedgehog deseada. La infección de células con un vector viral tiene la ventaja de que las de una gran proporción de las células que constituyen la diana u objetivo pueden recibir el ácido nucleico. Adicionalmente, las moléculas codificadas dentro del vector viral, p. ej. por un cDNA contenido en el vector viral, son expresadas eficientemente en las células que han admitido el ácido nucleico del vector viral.

Se entiende en general que los vectores de retrovirus y los vectores de virus adeno-asociados son el sistema de suministro de genes recombinantes a elegir para la transferencia de genes exógenos in vivo, particularmente a los humanos. Estos vectores proporcionan un suficiente suministro de genes a las células, y los ácidos nucleicos transferidos quedan integrados de manera estable en el DNA cromosómico del huésped. Un importante requisito previo para el uso de retrovirus es el de asegurar la seguridad de su uso, particularmente con respecto a la posibilidad de difusión de virus de tipo salvaje en la población celular. El desarrollo de líneas celulares especializadas (denominadas "células empaquetadoras") que producen solamente retrovirus defectivos para la replicación ha incrementado la utilidad de los retrovirus para terapia génica, y los retrovirus defectivos están bien caracterizados para ser usados en transferencia génica a efectos de terapia génica (para un estudio al respecto, véase Miller, A.D. (1990) Blood 76:271). Así, pueden ser construidos retrovirus recombinantes en los cuales parte de la secuencia codificante retroviral (gag, pol, env) ha sido sustituida por ácido nucleico que codifica un polipéptido hedgehog y hace que sea defectiva la replicación del retrovirus. El retrovirus defectivo para la replicación es entonces empaquetado en viriones que pueden ser usados para infectar una célula diana mediante el uso de un virus colaborador por medio de técnicas estándar. En Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F.M. et al. (eds.) Greene Publishing Associates, (1989), Párrafos 9.10-9.14, y en otros manuales de laboratorio estándar pueden encontrarse protocolos para producir retrovirus recombinantes y para infectar células in vitro o in vivo con tales virus. Los ejemplos de retrovirus adecuados incluyen los pLJ, pZIP, pWE y pEM, que son perfectamente conocidos para los expertos en la materia. Los ejemplos de líneas de virus empaquetadores adecuados para preparar sistemas retrovirales tanto ecotrópicos como anfotrópicos incluyen los Crip, Cre, 2 y Am. Han sido usados retrovirus para introducir los de una variedad de genes en muchos tipos de células distintos, entre los que se incluyen los de células epiteliales, in vitro y/o in vivo (véase, por ejemplo, Eglitis, et al. (1985) Science 230:1395-1398; Danos and Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:6460-6464; Wilson et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:3014-3018; Armentano et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6141-6145; Huber et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8039-8043; Ferry et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8377-8381; Chowdhury et al. (1991) Science 254:1802-1805; van Beusechem et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7640-7644; Kay et al. (1992) Human Gene Therapy 3:641-647; Dai et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10892-10895; Hwu et al. (1993) J. Immunol. 150:4104-4115; Patente U.S. Nº 4.868.116; Patente U.S. Nº 4.980.286; Solicitud al amparo del PCT WO 89/07136; Solicitud al amparo del PCT WO 89/02468; Solicitud al amparo del PCT WO 89/05345; y Solicitud al amparo del PCT WO 92/07573).

Además, se ha demostrado que es posible limitar el espectro de infección de los retrovirus, y en consecuencia de los vectores de base retroviral, a base de modificar las proteínas empaquetadoras virales sobre la superficie de la partícula viral (véanse, por ejemplo, las publicaciones al amparo del PCT WO93/25234 y WO94/06920). Por ejemplo, las estrategias para la modificación del espectro de infección de los vectores retrovirales incluyen las siguientes: acoplar anticuerpos específicos para antígenos de la superficie de las células a la proteína env viral (Roux et al. (1989) PNAS 86:9079-9083; Julan et al. (1992) J. Gen Virol 73:3251-3255; y Goud et al. (1983) Virology 163:251-254); o acoplar ligandos de receptor de la superficie de la célula a las proteínas env virales (Neda et al. (1991) J Biol Chem 266:14143-14146). El acoplamiento puede ser en forma de la reticulación química con una proteína u otra variedad (como p. ej. lactosa para convertir la proteína env en una asialoglicoproteína), así como a base de generar proteínas de fusión (como p. ej. proteínas de fusión de anticuerpo de cadena única/env). Si bien es útil para limitar o dirigir de otra manera la infección a determinados tipos de tejido, esta técnica puede ser también usada para convertir un vector ecotrópico en un vector anfotrópico.

Además, el uso del suministro de genes retrovirales puede ser adicionalmente favorecido por el uso de secuencias reguladoras transcripcionales que sean específicas de tejidos o específicas de células y controlen la expresión del gen hedgehog (erizo) del vector retroviral.

Otro sistema de suministro de genes virales que es útil en el presente método utiliza vectores derivados de adenovirus. El genoma de un adenovirus puede ser manipulado de forma tal que codifique y exprese un producto génico de interés pero quede inactivado en cuanto a su capacidad para replicarse en un ciclo vital viral lítico normal. Véase, por ejemplo, Berkner et al. (1988) BioTechniques 6:616; Rosenfeld et al. (1991) Science 252:431-434; y Rosenfeld et al. (1992) Cell 68:143-155. Son perfectamente conocidos para los expertos en la materia adecuados vectores adenovirales derivados de la cepa de adenovirus Ad tipo 5 dl324 u otras cepas de adenovirus (como p. ej. las Ad2, Ad3, Ad7, etc.). Los adenovirus recombinantes pueden ser ventajosos en determinadas circunstancias por cuanto que los mismos pueden ser usados para infectar los de una amplia variedad de tipos de células entre los que se incluyen células epiteliales (Rosenfeld et al. (1992) citado supra). Además, la partícula viral es relativamente estable y se presta a purificación y concentración, y, como se ha indicado anteriormente, puede ser modificada para afectar al espectro de infectividad. Adicionalmente, el DNA adenoviral introducido (y el DNA foráneo contenido en el mismo) no queda integrado en el genoma de una célula huésped sino que sigue siendo episomal, evitando con ello los problemas potenciales que pueden producirse como resultado de una mutagénesis insercional en las situaciones en las que el DNA introducido queda integrado en el genoma huésped (como es p. ej. el caso del DNA retroviral). Además, la capacidad de transporte del genoma adenoviral para el DNA foráneo es considerable (de hasta 8 kilobases) en comparación con otros vectores de suministro de genes (Berkner et al. citado supra; Haj-Ahmand y Graham (1986) J. Virol. 57:267). En los de la mayoría de los vectores adenovirales defectivos para la replicación que están actualmente en uso y son por consiguiente preferidos para la presente invención están anuladas la totalidad o partes de los genes E1 y E3 virales, pero se mantiene tanto como un 80% del material genético adenoviral (véanse, p. ej., Jones et al. (1979) Cell 16:683; Berkner et al., supra; y Graham et al. in Methods in Molecular Biology, E.J. Murray, Ed. (Humana, Clifton, NJ, 1991) vol. 7. pp. 109-127). La expresión del gen hedgehog (erizo) insertado puede tener lugar bajo el control del promotor E1A, del promotor tardío principal (MLP) y de las correspondientes secuencias guía, del promotor E3, o de secuencias promotoras añadidas exógenamente, por ejemplo.

Además de los métodos de transferencia viral tales como los anteriormente ilustrados, pueden ser también empleados métodos no virales para ocasionar la expresión de un polipéptido hedgehog en el tejido de un animal. Los métodos no virales de transferencias de genes se basan en su mayoría en los mecanismos normales que son utilizados por las células de mamíferos para la captación y el transporte intracelular de macromoléculas. En realizaciones preferidas, los sistemas no virales de suministro de genes de la presente invención se basan en vías endocíticas para la captación del gen polipeptídico hedgehog (erizo) por parte de la célula establecida como diana u objetivo. Los ejemplos de sistemas de suministro de genes de este tipo incluyen sistemas de origen liposomal, conjugados de polilisina y envolturas virales artificiales.

En escenarios clínicos, los sistemas de suministro de genes para el gen hedgehog (erizo) terapéutico pueden ser introducidos en un paciente por cualesquiera de los de una serie de métodos que son todos y cada uno de ellos perfectamente conocidos en la técnica. Por ejemplo, una preparación farmacéutica del sistema de suministro de genes puede ser introducida sistémicamente, p. ej. mediante inyección intravenosa, y la transducción específica de la proteína en las células diana tiene lugar predominantemente sobre la base de la especificidad de transfección proporcionada por el vehículo de suministro de genes, o de la expresión de tipo celular o de tipo tisular debida a las secuencias reguladoras transcripcionales que controlan la expresión del gen receptor, o de una combinación de las mismas. En otras realizaciones, el suministro inicial del gen recombinante es más limitado, siendo del todo localizada la introducción en el animal. Por ejemplo, el vehículo de suministro de genes puede ser introducido mediante catéter (véase la Patente U.S. 5.328.470) o bien mediante inyección estereotáctica (véase, p. ej. Chen et al. (1994) PNAS 91: 3054-3057). Un constructo de expresión de hedgehog puede ser suministrado en un constructo de terapia génica a células dérmicas por electroporación, p. ej., utilizando técnicas descritas, por ejemplo, por Dev et al. ((1994) Cancer Treat Rev 20:105-115).

La preparación farmacéutica del constructo de terapia génica puede constar esencialmente del sistema de suministro de genes en un diluyente aceptable, o bien puede comprender una matriz de liberación lenta en la cual esté embebido el vehículo de suministro de genes. Como alternativa, cuando todo el sistema de suministro de genes pueda ser producido de manera intacta a partir de células recombinantes, como p. ej. vectores retrovirales, la preparación farmacéutica puede comprender una o varias células que produzcan el sistema de suministro de genes.

En otra realización adicional, el agente terapéutico hedgehog puede ser un constructo de "activación génica" que, por recombinación homóloga con un DNA genómico, altere las secuencias reguladoras transcripcionales de un gen endógeno. Por ejemplo, el constructo de activación génica puede sustituir al promotor endógeno de un gen hedgehog (erizo) por un promotor heterólogo, como p. ej. uno que ocasione la expresión constitutiva del gen hedgehog (erizo) o que ocasione la expresión inducible del gen bajo condiciones distintas del patrón de expresión normal del gen. Pueden ser análogamente establecidos como diana otros genes en la vía de señalización de patched. Están disponibles los de una variedad de distintos formatos para los constructos de activación génica. Véanse, por ejemplo, las publicaciones al amparo del PCT WO93/09222, WO95/31560, WO96/29411, WO95/31560 y WO94/12650 de la Transkaryotic Therapies, Inc.

En realizaciones preferidas, la secuencia de nucleótidos que es usada en calidad del constructo de activación génica puede constar de (1) DNA de alguna parte del gen hedgehog (erizo) endógeno (secuencia exón, secuencia intrón, secuencias promotoras, etc.) que dirija la recombinación, y (2) secuencia(s) reguladora(s) transcripcional(es) heteróloga(s) que debe(n) ser ligada(s) operativamente a la secuencia codificante para el gen hedgehog (erizo) genómico tras la recombinación del constructo de activación génica. Para su uso para generar cultivos de células productoras de hedgehog, el constructo puede incluir adicionalmente un gen informador para detectar la presencia del constructo de alelo nulo en la célula.

El constructo de activación génica es insertado en una célula y se integra en el DNA genómico de la célula en una posición adecuada para establecer las secuencias reguladoras heterólogas en asociación operativa con el gen hedgehog (erizo) nativo. Tal inserción tiene lugar por recombinación homóloga, es decir que las regiones de recombinación del constructo de activación que son homólogas a la secuencia génica hedgehog endógena se hibridan con el DNA genómico y se recombinan con las secuencias genómicas de tal manera que el constructo es incorporado en la correspondiente posición del DNA genómico.

Las expresiones "región de recombinación" o "secuencia de destinación" se refieren a un segmento (es decir, a una parte) de un constructo de activación génica que tiene una secuencia que es prácticamente idéntica o prácticamente complementaria a una secuencia génica genómica, p. ej. incluyendo las secuencias flanqueadoras del lado 5' del gen genómico, y puede facilitar la recombinación homóloga entre la secuencia genómica y el constructo transgénico de destinación.

En el sentido en el que se la utiliza en la presente, la expresión "región de sustitución" se refiere a una parte de un constructo de activación que queda integrada en una ubicación cromosómica endógena a continuación de la recombinación homóloga entre una región de recombinación y una secuencia genómica.

Las secuencias reguladoras heterólogas que se prevén p. ej. en la región de sustitución pueden incluir uno o varios de los de una variedad de elementos entre los que se incluyen promotores (tales como promotores constitutivos o inducibles), potenciadores, elementos reguladores negativos, regiones de control de locus, sitios de fijación para el factor de transcripción, o combinaciones de los mismos. Los promotores/potenciadores que pueden ser usados para controlar la expresión del gen objetivo in vivo incluyen, aunque sin carácter limitativo, el promotor/potenciador del citomegalovirus (CMV) (Karasuyama et al., 1989, J. Exp. Med., 169:13), el promotor de \beta-actina humano (Gunning et al. (1987) PNAS 84:4831-4835), el promotor inducible por glucocorticoides que está presente en la secuencia terminal repetida larga del virus del tumor mamario de ratón (MMTV LTR) (Klessig et al. (1984) Mol. Cell Biol. 4:1354-1362), las secuencias terminales repetidas largas del virus de la leucemia murina de Moloney (MuLV LTR (Weiss et al. (1985) RNA Tumor Viruses, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York), el promotor región temprano o tardío SV40 (Bernoist et al. (1981) Nature 290:304-310; Templeton et al. (1984) Mol. Cell Biol., 4:817; y Sprague et al. (1983) J. Virol., 45:773), el promotor que está contenido en la secuencia terminal repetida larga del lado 3' del virus del sarcoma de Rous (RSV) (Yamamoto et al., 1980, Cell, 22:787-797), el promotor/potenciador de timidina cinasa del virus del herpes simplex (HSV) (Wagner et al. (1981) PNAS 82:3567-71), y el promotor LAT del virus del herpes simplex (Wolfe et al. (1992) Nature Genetics, 1:379-384).

En un ejemplo de realización, partes de la región flanqueadora del lado 5' del gen Shh humano son amplificadas usando cebadores que añaden sitios de restricción, para generar los siguientes fragmentos

5'-gcgcgcttcgaaGCGAGGCAGCCAGCGAGGGAGAGAGCGAGCGGGCGAGCCGGAGC-GAGGAAatcgatgc
gcgc (cebador 1)

5'-gcgcgcagatctGGGAAAGCGCAAGAGAGAGCGCACACGCACACACCCGCCGCGCG-CACTCGggatccgcg
cgc (cebador 2)

Como se ha ilustrado, el cebador 1 incluye una región no codificante del lado 5' del gen Shh humano y está flanqueado por sitios de restricción para AsuII y ClaI. El cebador 2 incluye una parte de la región no codificante del lado 5' que está inmediatamente en el lado 3' con respecto a la que está presente en el cebador 1. La secuencia del gen hedgehog (erizo) está flanqueada por sitios de restricción para XhoII y BamHI. Los amplímeros purificados son cortados con cada una de las enzimas como es adecuado.

El vector pCDNA1.1 (Invitrogen) incluye un promotor de CMV. El plásmido es cortado con AsuII, que efectúa la escisión justo en el lado 3' con respecto a la secuencia promotora de CMV. El fragmento de AsuII/ClaI del cebador 1 es ligado al sitio de escisión para AsuII del vector pcDNA. La ligación de ClaI/AsuII destruye el sitio para AsuII en el extremo del lado 3' de un cebador 1 correctamente insertado.

El vector es entonces cortado con BamHI, y un fragmento de XhoII/BamHI del cebador 2 es ligado al sitio de escisión para BamHI. Como antes, la ligación de BamHI/XhoII destruye el sitio para BamHI en el extremo del lado 5' de un cebador 2 correctamente insertado.

Las colonias individuales son seleccionadas y cortadas con AsuII y con BamHI, y es determinado el tamaño del fragmento de AsuII/BamHI. Las colonias en las cuales las secuencias tanto del cebador 1 como del cebador 2 están correctamente insertadas son amplificadas adicionalmente y cortadas con AsuII y con BamHI para producir el constructo de activación génica

3

En este constructo, las secuencias flanqueadoras del cebador 1 y del cebador 2 proporcionan la región de recombinación que permite la inserción del promotor de CMV delante de la secuencia codificante para el gen Shh humano. Otros promotores heterólogos (u otras secuencias reguladoras transcripcionales) pueden ser insertados en un gen hedgehog (erizo) genómico por un método similar.

En otras realizaciones adicionales, la región de sustitución meramente anula un elemento de control transcripcional negativo del gen nativo, p. ej. para activar la expresión, o extirpa un elemento de control positivo, p. ej. para inhibir la expresión del gen objetivo.

V. Ejemplos de compuestos con agente terapéutico ptc como ejemplos comparativos

Pueden ser generadas composiciones con agente terapéutico ptc por ejemplo con compuestos que se fijen a patched y alteren su actividad de transducción de señales, compuestos que alteren la fijación y/o actividad enzimática de una proteína (p. ej. intracelular) que intervenga en la vía de señales de patched, y compuestos que alteren el nivel de expresión de una proteína hedgehog (erizo), una proteína patched o una proteína que intervenga en la vía de transducción de señales intracelulares de patched.

La disponibilidad de los polipéptidos hedgehog purificados y recombinantes facilita la generación de sistemas de análisis que pueden ser usados para seleccionar drogas, tales como pequeñas moléculas orgánicas, que sean agonistas o antagonistas para con la función celular normal de una proteína hedgehog y/o patched, y en particular para con su papel en la patogénesis de proliferación y/o diferenciación de células epiteliales. En una realización, el análisis evalúa la capacidad de un compuesto para modular la fijación entre un polipéptido hedgehog y un receptor para hedgehog tal como patched. En otras realizaciones, el análisis sirve meramente para puntuar la capacidad de un compuesto de ensayo para alterar la actividad de transducción de señales de la proteína patched. De esta manera pueden ser identificados los de una variedad de agentes terapéuticos hedgehog de actividad tanto proliferativa como antiproliferativa. Bastará con una variedad de formatos de análisis que a la luz de la presente descripción será comprendida por el experto en la materia.

En muchos programas de selección de drogas que someten a ensayo a bibliotecas de compuestos y extractos naturales, los análisis de alto rendimiento son deseables a fin de maximizar el número de compuestos estudiados en un determinado periodo de tiempo. Los análisis que son llevados a cabo en sistemas exentos de células, tales como los que pueden obtenerse con proteínas purificadas o semipurificadas, son a menudo denominados selecciones "primarias" por cuanto que pueden ser generados para permitir un rápido desarrollo y una relativamente fácil detección de una alteración en una diana molecular que es mediada por un compuesto de ensayo. Además, los efectos de toxicidad celular y/o biodisponibilidad del compuesto de ensayo pueden ser en general ignorados en el sistema in vitro, centrándose en lugar de ello el análisis principalmente en el efecto de la droga en la diana molecular según puede quedar de manifiesto en una alteración de la afinidad de fijación con proteínas receptoras.

En consecuencia, en un ejemplo de análisis de selección para la identificación de agentes terapéuticos ptc, el compuesto de interés es puesto en contacto con una mezcla que incluye una proteína receptora de hedgehog (como p. ej. una célula que exprese el receptor patched) y una proteína hedgehog (erizo) bajo condiciones en las cuales dicha proteína receptora es de ordinario capaz de fijar la proteína hedgehog (erizo). Es entonces añadida a la mezcla una composición que contiene un compuesto de ensayo. La detección y cuantificación de complejos de receptor/hedgehog proporciona unos medios para determinar la eficacia del compuesto de ensayo para inhibir (o potenciar) la formación de complejos entre la proteína receptora y el polipéptido hedgehog. La eficacia del compuesto puede ser valorada a base de generar curvas de respuesta según dosis a partir de los datos obtenidos usando varias concentraciones del compuesto de ensayo. Puede ser además llevado a cabo un análisis de control para disponer de una línea base a efectos comparativos. En el análisis de control, es añadido a la proteína receptora polipéptido hedgehog aislado y purificado, y es cuantificada en ausencia del compuesto de ensayo la formación de complejo de receptor/hedgehog.

En otros casos, un agente terapéutico ptc es un agente terapéutico que desorganiza la asociación de patched a smoothened.

Los agonistas y antagonistas para con el crecimiento de células epiteliales pueden ser distinguidos, y la eficacia del compuesto puede ser valorada, mediante la realización de subsiguientes ensayos con células epiteliales, p. ej. en cultivo.

El polipéptido utilizado como receptor de hedgehog puede ser generado a partir de la proteína patched. En consecuencia, un ejemplo de análisis de selección incluye la totalidad o una parte adecuada de la proteína patched que puede ser obtenida del gen patched humano (GenBank U43148), por ejemplo, u otras fuentes de vertebrados (véanse los números de Accesión al GenBank U40074 para patched de pollo y U46155 para patched de ratón), así como de drosophila (número de Accesión al GenBank M28999) o de otras fuentes de invertebrados. La proteína patched puede preverse en el análisis de selección en forma de proteína intacta (preferiblemente expresada en la superficie de una célula), o bien y como alternativa en forma de un fragmento de la proteína de plena longitud que se fija a polipéptidos hedgehog, en forma de uno o ambos de los considerables dominios extracelulares (p. ej. correspondientes a los residuos Asn120-Ser438 y/o Arg770-Trp1027 de la proteína patched humana, que son también potenciales antagonistas de la transducción de señales dependiente de hedgehog). Por ejemplo, la proteína patched puede preverse en forma soluble, como por ejemplo una preparación de uno de los dominios extracelulares, o una preparación de ambos dominios extracelulares que estén conectados en enlace covalente por un ligador no estructurado (véase, por ejemplo, Huston et al. (1988) PNAS 85:4879; y la Patente U.S. Nº 5.091.513). En otras realizaciones, la proteína puede preverse como parte de una preparación liposomal, o puede estar expresada en la superficie de una célula. La proteína patched puede ser obtenida de un gen recombinante, siendo p. ej. expresada ectópicamente en una célula heteróloga. Por ejemplo, la proteína puede ser expresada sobre oocitos, células de mamífero (como p. ej. COS, CHO, 3T3 o similares) o células de levadura mediante técnicas de DNA recombinante estándar. Estas células recombinantes pueden ser usadas para análisis de fijación al receptor, transducción de señales o expresión génica. Marigo et al. (1996) Development 122:1225-1233 ilustran un análisis de fijación de hedgehog humano a proteína patched de polluelo expresada ectópicamente en oocitos de Xenopus laevis. El sistema de análisis de Marigo et al. puede ser adaptado a los presentes análisis de selección de drogas. Como se ilustra en esa referencia, Shh se fija a la proteína patched de manera selectiva, saturable y dependiente de la dosis, demostrando así que patched es un receptor para Shh.

La formación de complejos entre el polipéptido hedgehog y un receptor de hedgehog puede ser detectada mediante las de una variedad de técnicas. Por ejemplo, la modulación de la formación de complejos puede ser cuantificada usando, por ejemplo, proteínas marcadas de manera detectable, tal como radiomarcadas o marcadas por fluorescencia, o polipéptidos hedgehog marcados enzimáticamente, mediante inmunoanálisis o mediante detección cromatográfica.

Típicamente, para los análisis sin células será deseable inmovilizar ya sea el receptor de hedgehog o bien el polipéptido hedgehog para facilitar la separación de los complejos de receptor/hedgehog de las formas de una de las proteínas que no han formado complejos, así como para permitir la automatización del análisis. En una realización, puede preverse una proteína de fusión que añada un dominio que permita que la proteína sea fijada a una matriz. Por ejemplo, proteínas de fusión de glutationa-S-transferasa/receptor (GST/receptor) pueden ser adsorbidas sobre perlas de glutationa sefarosa (Sigma Chemical, St. Louis, MO) o placas de cultivo de microtitulación derivatizadas con glutationa, que son entonces combinadas con el polipéptido hedgehog, como p. ej. un polipéptido hedgehog marcado con ^{35}S, y el compuesto de ensayo, y son incubadas bajo condiciones conducentes a la formación de complejos, y p. ej. en condiciones fisiológicas en cuanto a la sal y al pH, si bien pueden desearse condiciones ligeramente más rigurosas. A continuación de la incubación, las perlas son lavadas para retirar todo el polipéptido hedgehog que no se haya fijado, y la radiomarca fijada a las perlas matriz es determinada directamente (siendo p. ej. las perlas puestas en escintilante), o bien en el supernatante tras haber sido disociados los complejos de receptor/hedgehog. Como alternativa, los complejos pueden ser disociados de la perla y separados mediante gel de SDS-PAGE (SDS-PAGE = electroforesis en gel de poliacrilamida-dodecilsulfato sódico), y el nivel de polipéptido hedgehog que se encuentra en la fracción de la perla puede ser cuantificado a partir del gen utilizando técnicas de electroforesis estándar.

Están también disponibles para ser usadas en el análisis que es objeto de la presente otras técnicas para inmovilizar proteínas sobre matrices. Por ejemplo, partes solubles de la proteína receptora hedgehog pueden ser inmovilizadas utilizando una conjugación de biotina y estreptavidina. Por ejemplo, pueden prepararse moléculas receptoras biotiniladas a base de biotina-NHS (N-hidroxisuccinimida) utilizando técnicas que son perfectamente conocidas en el ramo (como p. ej. el conjunto de materiales y utensilios de biotinilización de la Pierce Chemicals, Rockford, IL), y dichas moléculas pueden ser inmovilizadas en las cavidades de placas de cultivo de 96 cavidades recubiertas con estreptavidina (Pierce Chemical). Como alternativa, anticuerpos que sean reactivos para con el receptor de hedgehog pero que no interfieran en la fijación de hedgehog pueden ser derivatizados en las cavidades de la placa de cultivo, y el receptor puede ser atrapado en las cavidades por conjugación con los anticuerpos. Como se ha indicado anteriormente, preparaciones de un polipéptido hedgehog y un compuesto de ensayo son incubadas en las cavidades de la placa de cultivo que presentan el receptor, y puede ser cuantificada la cantidad de complejo de receptor/hedgehog atrapada en la cavidad. Los ejemplos de métodos para detectar tales complejos, además de los descritos anteriormente para los complejos inmovilizados en GST, incluyen la inmunodetección de complejos usando anticuerpos que sean reactivos con el polipéptido hedgehog o que sean reactivos con la proteína receptora y compitan por la fijación con el polipéptido hedgehog; así como análisis ligados a enzimas que se basen en la detección de una actividad enzimática asociada al polipéptido hedgehog. En el caso de éstos últimos, la enzima puede estar conjugada químicamente o prevista como proteína de fusión con el polipéptido hedgehog. A título ilustrativo, el polipéptido hedgehog puede ser reticulado químicamente o fusionado genéticamente con fosfatasa alcalina, y la cantidad de polipéptido hedgehog atrapada en el complejo puede ser evaluada con un sustrato cromogénico de la enzima, como p. ej. paranitrofenilfosfato. Análogamente, puede preverse una proteína de fusión que comprenda el polipéptido hedgehog y glutationa-S-transferasa, y la formación de complejo puede ser cuantificada a base de detectar la actividad de GST usando 1-cloro-2,4-dimitrobenceno (Habig et al. (1974) J Biol Chem 249:7130).

Para los procesos que se basan en la inmunodetección para cuantificar una de las proteínas atrapadas en el complejo, pueden usarse anticuerpos contra la proteína tales como los anticuerpos anti-hedgehog que aquí se describen. Como alternativa, la proteína que debe ser detectada en el complejo puede ser "identificada con epítope" en forma de una proteína de fusión que incluya, además del polipéptido hedgehog o de la secuencia receptora de hedgehog, un segundo polipéptido para el cual estén disponibles sin problemas anticuerpos (p. ej. de fuentes comerciales). Por ejemplo, las proteínas de fusión con GST anteriormente descritas pueden ser también usadas para la cuantificación de la fijación utilizando anticuerpos contra la mitad GST. Otros útiles epítopes identificadores incluyen myc-epítopes (véase, p. ej. Ellison et al. (1991) J Biol Chem 266:21150-21157), lo cual incluye una secuencia de 10 residuos de c-myc, así como el sistema pFLAG (International Biotechnologies, Inc.) o el sistema pEZZ-proteína A (Pharamacia, NJ).

Cuando la deseada parte del receptor de hedgehog (u otra molécula de fijación a hedgehog) no pueda preverse en forma soluble, pueden usarse vesículas liposomales para disponer de fuentes manipulables y aislables del receptor. Por ejemplo, tanto formas auténticas como formas recombinantes de la proteína patched pueden ser reconstituidas en vesículas de lípidos artificiales (como p. ej. liposomas de fosfatidilcolina) o en vesículas sacadas de membranas celulares (véase, por ejemplo, Bear et al. (1992) Cell 68:809-818; Newton et al. (1983) Biochemistry 22:6110-6117; y Reber et al. (1987) J Biol Chem 262:11369-11374).

Además de los análisis sin células tales como los descritos anteriormente, la fuente de suministro sin problemas de proteínas hedgehog con que se cuenta en la técnica facilita también la generación de análisis basados en células para identificar pequeñas moléculas agonistas/antagonistas y similares. Análogamente al caso de los análisis basados en células que han sido descritos anteriormente para la selección de bibliotecas combinatorias, células que son sensibles a la inducción de hedgehog, como p. ej. células que expresan patched u otras células de origen epitelial que sean sensibles a la inducción de hedgehog, pueden ser puestas en contacto con una proteína hedgehog y un agente de ensayo de interés, puntuando el análisis todo lo que va desde la simple fijación a la célula hasta la modulación de las respuestas inductivas para hedgehog por parte de la célula diana en presencia y en ausencia del agente de ensayo. Como en el caso de los análisis sin células, pueden ser identificados los agentes que produzcan una variación estadísticamente significante de las actividades de hedgehog (ya sea la inhibición o bien la potenciación).

En otros casos, el análisis basado en células permite identificar y seleccionar los agentes que desorganizan la asociación de proteínas patched y smoothened, p. ej. en la membrana de la superficie de la célula o en una preparación liposomal.

Además de para caracterizar las células que expresan de manera natural la proteína patched, células que han sido manipuladas genéticamente para expresar ectópicamente patched pueden ser utilizadas para análisis de selección de drogas. A título de ejemplo, células que expresen bajos niveles o que carezcan de expresión de la proteína patched, como p. ej. oocitos de Xenopus laevis, células COS o células de levadura, pueden ser modificadas genéticamente utilizando técnicas estándar para expresar ectópicamente la proteína patched (véase Marigo et al., supra).

Las células recombinantes resultantes, que expresan p. ej. un receptor patched funcional, pueden ser utilizadas en análisis de fijación al receptor para identificar agonistas o antagonistas de la fijación de hedgehog. Pueden ser efectuados análisis de fijación usando células intactas. Además, las células recombinantes de la presente invención pueden ser manipuladas para que incluyan otros genes heterólogos que codifiquen proteínas que intervengan en las vías de señales dependientes de hedgehog. Por ejemplo, los productos génicos de uno o varios de los miembros del grupo que consta de smoothened, costal-2 y/o fused pueden ser coexpresados con patched en la célula reactiva, siendo los análisis sensibles a la reconstitución funcional de la cascada de transducción de señales de hedgehog.

Como alternativa, pueden ser utilizadas preparaciones liposomales usando proteína patched reconstituida. Proteína patched purificada a partir de extractos obtenidos con detergente y de orígenes tanto auténtico como recombinante puede ser reconstituida en vesículas de lípido artificial (como p. ej. liposomas de fosfatidilcolina) o en vesículas sacadas de las membranas de células (véase, por ejemplo, Bear et al. (1992) Cell 68:809-818; Newton et al. (1983) Biochemistry 22:6110-6117; y Reber et al. (1987) J Biol Chem 262:11369-11374). La estructura laminar y el tamaño de los liposomas resultantes pueden ser caracterizados utilizando microscopia electrónica. La orientación externa de la proteína patched en las membranas reconstituidas puede ser demostrada, por ejemplo, mediante microscopia inmunoelectrónica. La actividad de fijación de la proteína hedgehog de liposomas que contienen patched y liposomas sin la proteína en presencia de agentes candidatos puede ser comparada a fin de identificar los moduladores potenciales de la interacción de hedgehog-patched.

La proteína hedgehog usada en estos análisis basados en células puede preverse en forma de fuente purificada (de origen natural o recombinante) o bien en forma de células/tejido que expresan la proteína y son cocultivados con las células diana. Al igual como en el caso de los análisis sin células, en los que la simple fijación (en lugar de la inducción) es la actividad de hedgehog que es evaluada en el análisis, la proteína puede ser marcada mediante cualesquiera de las técnicas que han sido mencionadas anteriormente, como es p. ej. el caso de la marcación por fluorescencia, la marcación enzimática o la marcación radiactiva, o bien puede ser detectada por inmunoanálisis.

Además de para los estudios de fijación, los análisis funcionales pueden ser utilizados para identificar moduladores, es decir agonistas o antagonistas, de las actividades de hedgehog o patched. A base de detectar las variaciones de las señales intracelulares, tales como las alteraciones de los segundos mensajeros o de la expresión génica, en las células que expresan patched y que han sido puestas en contacto con un agente de ensayo, pueden ser identificados los agonistas y antagonistas candidatos para con la señalización de patched.

Han estado implicados en la transducción de señales mediada por patched los de una serie de productos génicos entre los que se incluyen patched, el factor de transcripción cubitus interruptus (ci), la serina/treonina cinasa fused (fu) y los productos génicos de costal-2, smoothened y suppressor of fused.

La interacción de una proteína hedgehog con patched pone en movimiento una cascada que supone la activación e inhibición de efectores del lado de cola y cuya última consecuencia es, en algunos casos, una variación detectable de la transcripción o traducción de un gen. Los potenciales objetivos o dianas transcripcionales de la señalización de patched son el propio gen patched (Hidalgo y Ingham, 1990 Development 110, 291-301; Marigo et al., 1996) y los homólogos de vertebrados del gen cubitus interruptus de drosophila, o sea los genes GLI (Hui et al. (1994) Dev Biol 162:402-413). Se ha demostrado que la expresión del gen patched es inducida en células del esbozo de los miembros y de la placa neural que responden a Shh. (Marigo et al. (1996) PNAS, en impresión; Marigo et al. (1996) Development 122:1225-1233). Los genes GLI codifican putativos factores de transcripción que tienen dominios dedo de cinc de fijación a DNA (Orenic et al. (1990) Genes & Dev 4:1053-1067; Kinzler et al. (1990) Mol Cell Biol 10:634-642). Se ha descrito que la transcripción del gen GLI es regulada en el sentido de un incremento en respuesta a hedgehog en los esbozos de los miembros, mientras que la transcripción del gen GLI3 es regulada en el sentido de un decremento en respuesta a la inducción de hedgehog (Marigo et al. (1996) Development 122:1225-1233). Seleccionando las secuencias reguladoras transcripcionales de tales genes diana, como p. ej. de los genes patched o GLI, que son responsables de la regulación en el sentido de un incremento o de un decremento de la transcripción de estos genes en respuesta a la señalización de patched, y ligando operativamente tales promotores a un gen informador, puede obtenerse un análisis basado en la transcripción que es sensible a la capacidad de un específico compuesto de ensayo para modificar las vías de señalización de patched. Así, la expresión del gen informador proporciona una valiosa herramienta de selección para el desarrollo de compuestos que actúen como agonistas o como antagonistas para con la inducción por ptc de la diferenciación/quiescencia.

Los análisis basados en genes informadores según esta invención miden la fase final de la anteriormente descrita cascada de eventos, como p. ej. la modulación transcripcional. En consecuencia, en la puesta en práctica de una realización del análisis, un constructo de gen informador es insertado en la célula reactiva a fin de generar una señal de detección que es dependiente de la señalización de ptc. Para identificar potenciales elementos reguladores que respondan a la señalización de ptc que está presente en la secuencia reguladora transcripcional de un gen diana, utilizando técnicas estándar pueden construirse deleciones anidadas de clones genómicos del gen diana. Véanse, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F.M. et al. (eds.) Greene Publishing Associates, (1989); Patente U.S. 5.266.488; Sato et al. (1995) J Biol Chem 270:10314-10322; y Kube et al. (1995) Cytokine 7:1-7. Un conjunto anidado de fragmentos de DNA de la región flanqueadora del lado 5' del gen es situado en el lado de cabeza con respecto a un gen informador tal como el gen de luciferasa, y es sometido a análisis para determinar su capacidad para dirigir la expresión del gen informador en las células que expresan patched. Las células huésped transfectadas transitoriamente con constructos del gen informador pueden ser sometidas a análisis para determinar la inducción de la expresión del gen informador en presencia y en ausencia de hedgehog para determinar las secuencias reguladoras que son responsables de la señalización dependiente de patched.

En la puesta en práctica del análisis, un constructo de gen informador es insertado en la célula reactiva a fin de generar una señal de detección dependiente de segundos mensajeros generados por inducción con proteína hedgehog (erizo). Típicamente, el constructo de gen informador incluirá un gen informador en ligación operativa con uno o varios elementos reguladores transcripcionales que responden a la actividad de hedgehog, proporcionando el nivel de expresión del gen informador la señal de detección dependiente de hedgehog. La cantidad de transcripción del gen informador puede ser medida utilizando cualesquiera de los métodos que consideren adecuados los expertos en la materia. Por ejemplo, la expresión de RNAm del gen informador puede ser detectada usando protección frente a la RNasa o la reacción en cadena de la polimerasa basada en RNA, o bien el producto proteico del gen informador puede ser identificado mediante una coloración característica o una actividad intrínseca. La cantidad de expresión del gen informador es entonces comparada con la cantidad de expresión en la misma célula en ausencia del compuesto de ensayo (o hedgehog), o bien puede ser comparada con la cantidad de transcripción en una célula prácticamente idéntica que carezca de la proteína receptora objetivo. Toda diferencia estadísticamente significante o significante de otro modo en la cantidad de transcripción indica que el compuesto de ensayo ha alterado de alguna manera la transducción de señales de la proteína patched, siendo p. ej. el compuesto de ensayo un potencial agente terapéutico ptc.

Como se describe más detalladamente a continuación, el producto génico del informador es detectado por medio de una actividad intrínseca asociada a ese producto. Por ejemplo, el gen informador puede codificar un producto génico que, mediante actividad enzimática, dé lugar a una señal de detección basada en el color, en la fluorescencia o en la luminiscencia. En otros casos, el gen informador o marcador aporta una ventaja de crecimiento selectivo, y p. ej. el gen informador puede incrementar la viabilidad de la célula, eliminar una necesidad nutricional de la célula y/o proporcionar resistencia a una droga.

Son genes informadores preferidos aquéllos que son fácilmente detectables. El gen informador puede ser también incluido en el constructo en forma de un gen de fusión con un gen que incluya deseadas secuencias reguladoras transcripcionales o presente otras propiedades deseables. Los ejemplos de genes informadores incluyen, aunque sin carácter limitativo, CAT (cloramfenicol acetil transferasa) (Alton y Vapnek (1979), Nature 282: 864-869); luciferasa y otros sistemas de detección enzimática tales como beta-galactosidasa; luciferasa de la luciérnaga (deWet et al. (1987), Mol. Cell. Biol. 7:725-737); luciferasa bacteriana (Engebrecht y Silverman (1984), PNAS 1: 4154-4158; Baldwin et al. (1984), Biochemistry 23: 3663-3667); fosfatasa alcalina (Toh et al. (1989) Eur. J. Biochem. 182: 231-238, Hall et al. (1983) J. Mol. Appl. Gen. 2: 101) y fosfatasa alcalina secretada placentaria humana (Cullen y Malim (1992) Methods in Enzymol, 216:362-368).

Los elementos de control transcripcional que pueden ser incluidos en un constructo de gen informador incluyen, aunque sin carácter limitativo, promotores, potenciadores y sitios de fijación de represores y activadores. Los adecuados elementos reguladores transcripcionales pueden sacarse de las regiones reguladoras transcripcionales de genes cuya expresión sea inducida tras la modulación de una vía de transducción de señales de patched. Las características de los genes preferidos de los cuales se sacan los elementos de control transcripcional incluyen, aunque sin carácter limitativo, una baja o indetectable expresión en las células quiescentes, una rápida inducción al nivel transcripcional a unos minutos de la estimulación extracelular, una inducción que es transitoria e independiente de la nueva síntesis de proteína, que la subsiguiente cesación de la transcripción requiera una nueva síntesis de proteína, y que los RNAms transcritos a partir de estos genes tengan una corta vida media. No es necesario que estén presentes todas estas propiedades.

La generación de segundos mensajeros puede ser medida directamente en el paso de detección, tal como por ejemplo al ser cuantificados la movilización del calcio intracelular, el metabolismo de fosfolípidos o la actividad de adenilato ciclasa, podrían ser medidos los productos de la hidrólisis de fosfolípidos IP_{3}, DAG o cAMP. Por ejemplo, recientes estudios han implicado la proteína cinasa A (PKA) como un posible componente de la señalización de hedgehog/patched (Hammerschmidt et al. (1996) Genes & Dev 10:647). Se ha demostrado que la alta actividad de PKA antagoniza la señalización de hedgehog en estos sistemas. A pesar de que no está claro si la PKA actúa directamente en el lado de cola o en paralelo con respecto a la señalización de hedgehog, es posible que la señalización de hedgehog se produzca por vía de la inhibición de la actividad de PKA. Por consiguiente, la detección de la actividad de PKA proporciona una lectura potencial para los presentes análisis.

Como ejemplo comparativo, el agente terapéutico ptc es un inhibidor de PKA. Son conocidos en la técnica los de una variedad de inhibidores de PKA entre los que se incluyen compuestos tanto peptidílicos como orgánicos. Por ejemplo, el agente terapéutico ptc puede ser una 5-isoquinolinasulfonamida tal como la representada en la fórmula general:

4

donde:

R_{1} y R_{2} pueden representar cada uno independientemente hidrógeno, y, según lo permitan la valencia y la estabilidad, un alquilo inferior, un alquenilo inferior, un alquinilo inferior, un carbonilo (tal como un carboxilo, un éster, un formiato o una cetona), un tiocarbonilo (tal como un tioéster, un tioacetato o un tioformiato), un amino, un acilamino, un amido, un ciano, un nitro, un azido, un sulfato, un sulfonato, un sulfonamido, -(CH_{2})_{m}-R_{8}, -(CH_{2})_{m}-OH, -(CH_{2})_{m}-O-
alquilo inferior, -(CH_{2})_{m}-O-alquenilo inferior_{8}, -(CH_{2})_{n}-O-(CH_{2})_{m}-R_{8}, -(CH_{2})_{m}-SH, -(CH_{2})_{m}-S-alquilo inferior,
-(CH_{2})_{m}-S-alquenilo inferior, -(CH_{2})_{n}-S-(CH_{2})_{m}-R_{8}, o bien

R_{1} y R_{2} tomados junto con N forman un heterociclo (sustituido o insustituido);

R_{3} está ausente o representa una o varias sustituciones en el anillo de isoquinolina, tales como un alquilo inferior, un alquenilo inferior, un alquinilo inferior, un carbonilo (tal como un carboxilo, un éster, un formiato o una cetona), un tiocarbonilo (tal como un tioéster, un tioacetato o un tioformiato), un amino, un acilamino, un amido, un ciano, un nitro, un azido, un sulfato, un sulfonato, un sulfonamido, -(CH_{2})_{m}-R_{8}, -(CH_{2})_{m}-OH, -(CH_{2})_{m}-O-alquilo inferior, -(CH_{2})_{m}
-O-alquenilo inferior, -(CH_{2})_{n}-O-(CH_{2})_{m}-R_{8}, -(CH_{2})_{m}-SH, -(CH_{2})_{m}-S-alquilo inferior, -(CH_{2})_{m}-S-alquenilo inferior, -(CH_{2})_{n}-S-(CH_{2})_{m}-R_{8};

R_{8} representa un arilo, aralquilo, cicloalquilo, cicloalquenilo o heterociclo sustituido o insustituido; y

n y m son independientemente para cada caso cero o un entero de 1 a 6.

En una realización comparativa, el inhibidor de PKA es N-[2-((p-bromocinamil)amino)etil]-5-isoquinolinasulfonamida (H-89; Nº de Catálogo 371963 de Calbiochem), p. ej., que tiene la fórmula:

5

En otra realización comparativa, el inhibidor de PKA es 1-(5-isoquinolinasulfonil)-2-metilpiperazina (H-7; Nº de Catálogo 371955 de Calbiochem), p. ej., que tiene la fórmula:

6

En otras realizaciones comparativas adicionales, el inhibidor de PKA es KT5720 (Nº de Catálogo 420315 de Calbiochem), que tiene la estructura:

7

Son también útiles como inhibidores de PKA los de una variedad de análogos de nucleósidos. Por ejemplo, el método que es objeto de la presente puede ser ejecutado con análogos de 3',5'-fosfato cíclico de adenosina (AMP cíclico) que inhiban la actividad de cinasa de PKA, como es por ejemplo el caso del 8-bromo-AMPc o del dibutiril-AMPc

8

Los ejemplos de inhibidores peptidílicos de la actividad de PKA incluyen el Inhibidor Termoestable de PKA (isoforma \alpha; véase, por ejemplo, el Nº de Catálogo 539488 de Calbiochem, y Wen et al. (1995) J Biol Chem 270:2041).

Determinados receptores de hedgehog pueden estimular la actividad de fosfolipasas. Los lípidos de inositol pueden ser extraídos y analizados utilizando técnicas estándar de extracción de lípidos. Los derivados solubles en agua de los tres lípidos de inositol (IP_{1}, IP_{2}, IP_{3}) pueden ser también cuantificados utilizando técnicas de radiomarcación o cromatografía de líquidos de alta resolución.

La movilización del calcio intracelular o la entrada de calcio desde el exterior de la célula puede ser una respuesta a la estimulación de hedgehog o a la ausencia de la misma. El flujo de calcio en la célula reactiva puede ser medido utilizando técnicas estándar. La elección del apropiado indicador de calcio, ya sea fluorescente, bioluminiscente, metalocrómico o microelectrodos sensibles al Ca^{++}, depende del tipo de célula y de la magnitud y la constante de tiempo del evento en estudio (Borle (1990) Environ Health Perspect 84:45-56). Como ejemplo del método de detección del Ca^{++}, las células podrían ser cargadas con el colorante fluorescente sensible al Ca^{++} fura-2 o indo-1, utilizando métodos estándar, y toda variación del Ca^{++} podría ser medida utilizando un fluorómetro.

En determinadas realizaciones del análisis, puede ser deseable detectar variaciones de la fosforilación celular. A título de ejemplo, el gen fused (fu) de drosophila, que codifica una serina/treonina cinasa, ha sido identificado como potencial objetivo del lado de cola en la señalización de hedgehog. (Preat et al., 1990 Nature 347,87-89; Therond et al. 1993, Mech. Dev. 44. 65-80). La capacidad de los compuestos para modular la activación de serina/treonina cinasa podría ser sometida a selección utilizando inmunotransferencia de colonias (Lyons and Nelson (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:7426-7430) usando anticuerpos contra residuos de serina o treonina fosforilados. Los reactivos para llevar a cabo tales análisis están disponibles comercialmente, pudiendo ser por ejemplo adquiridos a proveedores comerciales anticuerpos específicos de fosfoserina y fosfotreonina que miden los incrementos de la fosforilación de esos residuos.

En otro caso adicional, el agente terapéutico ptc es una molécula antisentido que inhibe la expresión de una proteína que interviene en una vía de transducción de señales mediada por patched. A título ilustrativo, inhibiendo la expresión de una proteína que intervenga en las señales de patched, tal como es el caso de los genes fused, costal-2, smoothened y/o Gli, puede alterarse la capacidad de la(s) vía(s) de señales de patched para inhibir la proliferación de una célula, pudiendo ser p. ej. dicha capacidad potenciada o reprimida.

En el sentido en el que se la utiliza en la presente, la expresión "terapia antisentido" se refiere a la administración o generación in situ de sondas oligonucleotídicas o de sus derivados que se hibriden (que p. ej. se fijen) específicamente bajo condiciones celulares con RNAm celular y/o DNA genómico codificando una proteína hedgehog (erizo), patched o una proteína que intervenga en la transducción de señales mediada por patched. La hibridación deberá inhibir la expresión de esa proteína, p. ej. a base de inhibir la transcripción y/o traducción. La fijación puede ser por complementariedad de pares de bases convencional, o bien, por ejemplo en el caso de la fijación a DNAs de dos hebras, a través de interacciones específicas en el surco mayor de la doble hélice. En general, la expresión "terapia antisentido" se refiere a la gama de técnicas que son empleadas en general en el ramo, e incluye toda terapia que se base en la fijación específica a secuencias oligonucleotídicas.

Un constructo antisentido puede ser suministrado, por ejemplo, en forma de un plásmido de expresión que, al ser transcrito en la célula, produzca RNA que sea complementario de al menos una parte singular del RNAm celular objetivo. Como alternativa, el constructo antisentido es una sonda oligonucleotídica que es generada ex vivo y que, al ser introducida en la célula, ocasiona la inhibición de la expresión a base de hibridarse con las secuencias de RNAm y/o genómica de un gen objetivo. Tales sondas oligonucleotídicas son preferiblemente oligonucleótidos modificados que son resistentes a las nucleasas endógenas, como p. ej. exonucleasas y/o endonucleasas, y son por consiguiente estables in vivo. Son ejemplos de moléculas de ácido nucleico que pueden ser usadas como oligonucleótidos antisentido análogos de fosforamidato, fosfotioato y metilfosfonato de DNA (véanse también las Patentes U.S. 5.176.996, 5.264.564 y 5.256.775). Adicionalmente, enfoques generales para la construcción de oligómeros útiles en terapia antisentido han sido estudiados, por ejemplo, por Van der Krol et al. (1988) Biotechniques 6:958-976; y Stein et al. (1988) Cancer Res 48:2659-2668.

Al construir oligonucleótidos antisentido destinados a ser usados en los métodos de la invención deberán hacerse varias consideraciones: (1) Los oligos deberán tener un contenido de GC de un 50% o más; (2) deberán evitarse las secuencias con tramos de 3 o más G's; y (3) los oligonucleótidos no deberán tener una longitud de más de 25-26 mers. Cuando se somete a ensayo a un oligonucleótido antisentido, puede construirse un control discordante. Los controles pueden ser generados a base de invertir el orden de la secuencia del correspondiente oligonucleótido antisentido a fin de conservar la misma proporción de bases.

El agente terapéutico ptc puede ser un constructo antisentido para inhibir la expresión de patched, p. ej. para imitar la inhibición de patched por parte de hedgehog. Los ejemplos de constructos antisentido incluyen los siguientes:

5'-GTCCTGGCGCCGCCGCCGCCGTCGCC

5'-TTCCGATGACCGGCCTTTCGCGGTGA

5'-GTGCACGGAAAGGTGCAGGCCACACT

VI. Ejemplos de preparaciones farmacéuticas de agentes terapéuticos hedgehog

La fuente de los agentes terapéuticos hedgehog a utilizar en la preparación de formulaciones dependerá de la forma específica del agente. Pueden ser sintetizadas químicamente y puestas en una forma pura adecuada para uso farmacéutico/cosmético pequeñas moléculas orgánicas y fragmentos de peptidilo. Los productos de extractos naturales pueden ser purificados según técnicas que son conocidas en el ramo. Por ejemplo, la Patente U.S. 5.286.654 de Cox et al. describe un método para purificar formas naturales de una proteína secretada y puede ser adaptada para la purificación de polipéptidos hedgehog. Están también disponibles fuentes recombinantes de polipéptidos hedgehog. Por ejemplo, los genes que codifican polipéptidos hedgehog son conocidos, inter alia, por las publicaciones al amparo del PCT WO 95/18856 y WO 96/17924.

Los expertos en el tratamiento de tejidos epiteliales pueden determinar la cantidad efectiva de un agente terapéutico hedgehog o ptc que debe ser incorporada en la formulación de una preparación farmacéutica o cosmética.

Las formulaciones con agentes terapéuticos hedgehog que son usadas en el método de la invención son con la máxima preferencia aplicadas en forma de composiciones apropiadas. Pueden citarse como composiciones apropiadas todas las composiciones que son habitualmente empleadas para administrar drogas sistémica o tópicamente. El vehículo farmacéuticamente aceptable deberá ser prácticamente inerte, a fin de que no actúe en el componente activo. Los vehículos inertes adecuados incluyen el agua, el alcohol polietilenglicol, el aceite mineral o la vaselina, el propilenglicol y vehículos similares.

Para preparar las composiciones farmacéuticas de esta invención, una cantidad efectiva del específico agente terapéutico hedgehog en calidad del ingrediente activo es combinada en mezcla íntima con un vehículo farmacéuticamente aceptable, pudiendo dicho vehículo adoptar las de una amplia variedad de formas en dependencia de la forma de preparación deseada para la administración. Estas composiciones farmacéuticas son deseables en formas de dosificación unitaria adecuadas particularmente para administración por vía oral, rectal o percutánea o mediante inyección parenteral. Por ejemplo, al preparar las composiciones en forma de dosificación oral pueden emplearse cualesquiera de los habituales medios farmacéuticos tales como, por ejemplo, agua, glicoles, aceites, alcoholes y medios similares en el caso de las preparaciones orales líquidas tales como suspensiones, jarabes, elixires y soluciones; o bien vehículos sólidos tales como almidones, azúcares, caolín, lubricantes, aglutinantes, agentes desintegradores y vehículos similares en el caso de los polvos, las píldoras, las cápsulas y las tabletas. Debido a su facilidad de administración, las tabletas y las cápsulas representan la forma de unidad de dosificación oral más ventajosa, en cuyo caso se emplean obviamente vehículos farmacéuticos sólidos. Para composiciones parenterales, el vehículo comprenderá habitualmente agua estéril, al menos en gran parte, si bien pueden incluirse otros ingredientes por ejemplo para contribuir a la solubilidad. Pueden prepararse por ejemplo soluciones inyectables en las cuales el vehículo comprende solución salina, solución de glucosa o una mezcla de solución salina y solución de glucosa. Pueden también prepararse suspensiones inyectables, en cuyo caso pueden emplearse apropiados vehículos líquidos, agentes de suspensión e ingredientes similares. Están también incluidas las preparaciones en forma sólida que están destinadas a ser convertidas poco antes del uso en preparaciones en forma líquida. En las composiciones que son adecuadas para administración percutánea, el vehículo comprende opcionalmente un agente mejorador de la penetración y/o un adecuado agente mojante, combinado opcionalmente con adecuados aditivos de cualquier naturaleza en pequeñas proporciones, cuyos aditivos no deberán dar lugar a un importante efecto perjudicial en la piel.

Además de la aplicación tópica directa de las preparaciones, las mismas pueden ser administradas tópicamente por otros métodos, estando por ejemplo encapsuladas en una matriz sensible a la temperatura y/o a la presión o en película o vehículo sólido que sea soluble en los fluidos corporales y similares para una subsiguiente liberación, y preferiblemente para una liberación sostenida, del componente activo.

Como composiciones adecuadas para aplicación tópica pueden citarse todas las composiciones que son habitualmente empleadas para administrar tópicamente agentes terapéuticos, como son p. ej. las cremas, los geles, los apósitos, los champús, las tinturas, las pastas, los ungüentos, las pomadas, los polvos, las formulaciones líquidas o semilíquidas y composiciones similares. La aplicación de dichas composiciones puede hacerse mediante aerosol p. ej. con un propelente tal como nitrógeno, dióxido de carbono o un freón, o sin propelente tal como en el caso de un pulverizador de bomba, o bien en forma de gotas, lociones o un semisólido tal como una composición espesada que pueda ser aplicada con un tampón. En determinadas composiciones, serán convenientemente usadas composiciones semisólidas tales como pomadas, cremas, pastas, geles, ungüentos y composiciones similares.

Es especialmente ventajoso formular las composiciones que son objeto de la presente en forma de unidad de dosificación en aras de la facilidad de administración y de la uniformidad de dosificación. En el sentido en el que se la utiliza en la descripción y en las reivindicaciones en la presente, la expresión "forma de unidad de dosificación" se refiere a unidades físicamente discretas que son adecuadas como dosificaciones unitarias, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de ingrediente activo calculada para producir el deseado efecto terapéutico en asociación con el necesario vehículo farmacéutico. Son ejemplos de tales formas de unidades de dosificación las tabletas (incluyendo las tabletas estriadas o recubiertas), las cápsulas, las píldoras, los paquetes de polvos, las obleas, las soluciones o suspensiones inyectables, las cucharadas de café, las cucharadas soperas y formas similares, y múltiplos segregados de las mismas.

Como se ha indicado anteriormente, las preparaciones farmacéuticas de la presente invención pueden ser usadas para las muchas aplicaciones que pueden ser consideradas usos cosméticos. Son especialmente preferidas las composiciones cosméticas que son conocidas en la técnica, preferiblemente hipoalérgicas y de pH controlado, y las mismas incluyen aguas de colonia, emplastos, lociones, leches cutáneas o lociones lechosas. Además del agente terapéutico hedgehog o ptc, las preparaciones contienen componentes de los que son habitualmente empleados en tales preparaciones. Son ejemplos de tales componentes aceites, grasas, ceras, agentes superficiactivos, humectantes, agentes espesantes, antioxidantes, estabilizadores de la viscosidad, agentes quelantes, tampones, preservativos, perfumes, colorantes, alcanoles inferiores y componentes similares. Si se desea, pueden incorporarse a las composiciones adicionales ingredientes, como p. ej. agentes antiinflamatorios, antibacterianos, antifúngicos, desinfectantes, vitaminas, filtros solares, antibióticos u otros agentes anti-acné.

Los ejemplos de aceites comprenden grasas y aceites tales como aceite de oliva y aceites hidrogenados; ceras tales como cera de abeja y lanolina; hidrocarburos tales como parafina líquida, ceresina y escualeno; ácidos grasos tales como ácido esteárico y ácido oleico; alcoholes tales como alcohol cetílico, alcohol estearílico, alcohol de lanolina y hexadecanol; y ésteres tales como miristato de isopropilo, palmitato de isopropilo y estearato de butilo. Como ejemplos de agentes superficiactivos pueden citarse agentes superficiactivos aniónicos tales como estearato sódico, cetilsulfato sódico, lauriléterfosfato de polioxietileno, N-acil glutamato sódico; agentes superficiactivos catiónicos tales como cloruro estearildimetilbencilamónico y cloruro esteariltrimetilamónico; agentes superficiactivos anfóteros tales como soluciones de hidrocloruro de alquilaminoetilglicina y lecitina; y agentes superficiactivos no iónicos tales como monoestearato de glicerina, monoestearato de sorbitán, ésteres de ácidos grasos de sucrosa, monoestearato de propilenglicol, oleiléter de polioxietileno, monoestearato de polietilenglicol, monopalmitato de sorbitán polioxietilénico, monoetanolamida de ácido graso de coco polioxietilénico, polioxipropilenglicol (como p. ej. los materiales que se venden con la marca de fábrica "Pluronic"), aceite de ricino polioxietilénico y lanolina polioxietilénica. Los ejemplos de humectantes incluyen glicerina, 1,3-butilenglicol y propilenglicol; los ejemplos de alcoholes inferiores incluyen etanol e isopropanol; los ejemplos de agentes espesantes incluyen goma de xantano, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, polietilenglicol y carboximetilcelulosa sódica; los ejemplos de antioxidantes comprenden hidroxitolueno butilado, hidroxianisol butilado, galato de propilo, ácido cítrico y etoxiquina; los ejemplos de agentes quelantes incluyen edetato disódico y etanohidroxidifosfato; los ejemplos de tampones comprenden ácido cítrico, citrato sódico, ácido bórico, bórax y fosfato disódico de hidrógeno; y son ejemplos de preservativos el parahidroxibenzoato de metilo, el parahidroxibenzoato de etilo, el ácido dehidroacético, el ácido salicílico y el ácido benzoico.

Para preparar ungüentos, cremas, aguas de colonia, leches cutáneas y preparaciones similares, se incorporará a las composiciones típicamente de un 0,01 a un 10%, en particular de un 0,1 a un 5%, y más en particular de un 0,2 a un 2,5% del ingrediente activo, o sea p. ej. del agente terapéutico hedgehog o ptc. En ungüentos o cremas, el vehículo consta por ejemplo de un 1 a un 20%, y en particular de un 5 a un 15% de un humectante, y de un 0,1 a un 10%, y en particular de un 0,5 a un 5% de un espesante y agua; o bien dicho vehículo puede constar de un 70 a un 99%, y en particular de un 20 a un 95% de un agente superficiactivo, y de un 0 a un 20%, y en particular de un 2,5 a un 15% de una grasa; o de un 80 a un 99,9%, y en particular de un 90 a un 99% de un espesante; o de un 5 a un 15% de un agente superficiactivo, de un 2-15% de un humectante, de un 0 a un 80% de un aceite, y de cantidades muy pequeñas (< 2%) de preservativo, agente colorante y/o perfume y agua. En un agua de colonia, el vehículo consta por ejemplo de un 2 a un 10% de un alcohol inferior, de un 0,1 a un 10%, o en particular de un 0,5 a un 1% de un agente superficiactivo, de un 1 a un 20%, y en particular de un 3 a un 7% de un humectante, de un 0 a un 5% de un tampón, agua y pequeñas cantidades (< 2%) de preservativo, colorante y/o perfume. En una leche cutánea, el vehículo consta típicamente de un 10-50% de aceite, de un 1 a un 10% de agente superficiactivo, de un 50-80% de agua y de un 0 a un 3% de preservativo y/o perfume. En las preparaciones anteriormente mencionadas, todos los porcentajes son en peso.

Son particulares composiciones según la presente invención aquéllas en las que el agente terapéutico hedgehog es incorporado a las formulaciones en composiciones que contienen liposomas. Los liposomas son vesículas artificiales formadas por moléculas anfifáticas tales como lípidos polares, como por ejemplo fosfatidilcolinas, etanolaminas y serinas, esfingomielinas, cardiolipinas, plasmalógenos, ácidos fosfatídicos y cerebiósidos. Los liposomas se forman cuando se deja que adecuadas moléculas anfifáticas se hinchen en agua o en soluciones acuosas para formar cristales líquidos habitualmente de estructura multicapas que consta de muchas bicapas que están separadas unas de otras por material acuoso (siendo éstos también los llamados liposomas gruesos). Otro tipo de liposoma del que se sabe que consta de una sola bicapa que encapsula material acuoso es el llamado vesícula unilamelar. Si durante el hinchamiento de los lípidos son incluidos en la fase acuosa materiales solubles en agua, los mismos quedan atrapados en la capa acuosa entre las bicapas lipídicas.

Son encapsulados en los espacios acuosos entre las capas moleculares ingredientes activos solubles en agua tales como, por ejemplo, varias formas de sal de un polipéptido hedgehog. El ingrediente activo soluble en lípidos, de agente terapéutico hedgehog o ptc, tal como un mimético orgánico, es predominantemente incorporado en las capas lipídicas, si bien grupos polares de cabeza pueden sobresalir de la capa al interior del espacio acuoso. La encapsulación de estos compuestos puede lograrse mediante los de una serie de métodos. El método que es más comúnmente utilizado supone verter una película delgada de fosfolípido sobre las paredes de un matraz mediante evaporación de un disolvente orgánico. Cuando esta película es dispersada en un adecuado medio acuoso, son formados liposomas multilamelares. Tras una adecuada sonicación, los liposomas gruesos forman menores vesículas que están análogamente cerra-
das.

Los ingredientes activos solubles en agua son habitualmente incorporados a base de dispersar la película vertida con una solución acuosa del compuesto. El compuesto no encapsulado es entonces retirado por centrifugación, cromatografía, diálisis u otros adecuados procedimientos que son conocidos en la técnica. El ingrediente activo soluble en lípidos es habitualmente incorporado a base de disolverlo en el disolvente orgánico con el fosfolípido antes de efectuar el vertido de la película. Si no es sobrepasada la solubilidad del material en la fase lipídica o si la cantidad que está presente no sobrepasa la que puede ser fijada al lípido, los liposomas preparados por el método anteriormente indicado contienen habitualmente la mayor parte del material fijado en las bicapas lipídicas, no siendo necesario separar los liposomas del material no encapsulado.

Un método particularmente conveniente para preparar formas formuladas como liposomas de agentes terapéuticos hedgehog y ptc es el método que está descrito en la EP-A-253.619, que queda incorporada a la presente por referencia. En este método son preparados liposomas bicapa individuales que contienen ingredientes activos encapsulados a base de disolver el componente lipídico en un medio orgánico, inyectar la solución orgánica del componente lipídico bajo presión en un componente acuoso mientras se mezclan simultáneamente los componentes orgánico y acuoso con un homogeneizador o con medios de mezcla a alta velocidad, a continuación de lo cual los liposomas se forman espontáneamente.

Los liposomas bicapa individuales que contienen el agente terapéutico hedgehog o ptc encapsulado pueden ser empleados directamente, o bien pueden ser empleados en un adecuado vehículo farmacéuticamente aceptable para administración tópica. La viscosidad de los liposomas puede ser incrementada mediante la adición de uno o varios adecuados agentes espesantes tales como, por ejemplo, goma de xantano, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa y mezcla de los mismos. El componente acuoso puede constar de agua solamente, o bien puede contener electrólitos, sistemas tamponados y otros ingredientes, tales como preservativos, por ejemplo. Los adecuados electrólitos que pueden ser empleados incluyen sales metálicas tales como sales de metales alcalinos y sales de metales alcalinotérreos. Las sales metálicas preferidas son cloruro cálcico, cloruro sódico y cloruro potásico. La concentración del electrólito puede variar desde la de cero hasta la de 260 mM, y preferiblemente desde la de 5 mM hasta la de 160 mM. El componente acuoso es puesto en un adecuado recipiente que puede ser adaptado para efectuar homogeneización a base de generar gran turbulencia durante la inyección del componente orgánico. La homogeneización de los dos componentes puede ser llevada a cabo dentro del recipiente, o bien y como alternativa los componentes acuoso y orgánico pueden ser inyectados por separado al interior de los medios de mezcla que estén situados fuera del recipiente. En este último caso, los liposomas son formados en los medios de mezcla y son entonces transferidos a otro recipiente para ser recogidos.

El componente orgánico consta de un adecuado disolvente atóxico farmacéuticamente aceptable tal como, por ejemplo, etanol, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol, y de un adecuado fosfolípido que es soluble en el disolvente. Los fosfolípidos adecuados que pueden ser empleados incluyen la lecitina, la fosfatidilcolina, la fosfatidilserina, la fosfatidiletanolamina, el fosfatidilinositol, la lisofosfatidilcolina y el fosfatidilglicerol, por ejemplo. Pueden emplearse otros aditivos lipofílicos a fin de modificar selectivamente las características de los liposomas. Los ejemplos de tales otros aditivos incluyen la estearilamina, el ácido fosfatídico, el tocoferol, el colesterol y extractos de lanolina.

Además pueden ser añadidos al componente orgánico otros ingredientes que puedan impedir la oxidación de los fosfolípidos. Los ejemplos de tales otros ingredientes incluyen el tocoferol, el hidroxianisol butilado, el hidroxitolueno butilado, el palmitato de ascorbilo y el oleato de ascorbilo. Pueden ser también añadidos preservativos tales como ácido benzoico, metilparahidroxibenzoato y propilparahidroxibenzoato.

Aparte de las composiciones anteriormente descritas, puede hacerse uso de cubiertas, como p. ej. emplastos, vendajes, apósitos, almohadillas de gasa y cubiertas similares, que contengan una cantidad adecuada de un agente terapéutico hedgehog o ptc. En algunos casos puede hacerse uso de emplastos, vendajes, apósitos, almohadillas de gasa y cubiertas similares que hayan sido impregnadas con una formulación tópica que contenga la formulación terapéutica.

Ejemplificación

Habiendo sido hasta aquí descrita en general la invención, se comprenderá más fácilmente la misma haciendo referencia a los ejemplos siguientes, que son incluidos meramente a efectos de ilustrar determinados aspectos y realizaciones de la presente invención y no pretenden limitarla en modo alguno.

Purificación de proteína hedgehog (erizo)

Fue expresada en el sistema de baculovirus/células de insecto (Roelink et al. (1995) Cell 81:445-455) proteína sonic hedgehog humana (residuos 24-197). El medio acondicionado fue cargado en agarosa Fast Flo SP equilibrada con fosfato potásico 50 mM, DTT (DTT = ditiotreitol) 0,5 mM, a pH 7,0. La columna fue lavada con este tampón, y fue entonces eluida con un gradiente hasta NaCl 10 M. Las fracciones fueron analizadas para determinar la inducción de actividad de fosfatasa alcalina en células troncales mesenquimáticas (células C3H10T1/2, véase, p. ej., Wang et al. (1993) Growth Factors 9:57-71), y fueron entonces agrupadas sobre la base de esta actividad y también según pureza sobre geles de SDS (SDS = dodecilsulfato sódico). El material reunido fue concentrado en una unidad de ultrafiltración Amicon (membrana PM10), y fue sometido a diafiltración contra Tris 10 mM, pH 7,4, DTT 0,5 mM. La proteína fue estimada por el método Bradford usando globulina gamma como patrón.

Preparación de esponja de colágeno

La esponja de colágeno fue lavada extensivamente en agua MilliQ para retirar todos los agentes superficiactivos y aditivos del fabricante. La esponja fue entonces lavada en etanol al 70%, y fue a continuación secada in vacuo.

Preparación de implantes

La proteína fue añadida a pedazos de esponja de colágeno de 1,0 x 1,5 mm por 8-10 mm (de un peso de 1,5-3,0 mg). En algunos casos fue añadido sulfato de cinc hasta una concentración final de 0,2 mM antes de ser añadida a la esponja de colágeno la proteína hedgehog (erizo). Las esponjas reconstituidas fueron entonces congeladas y liofilizadas.

Implantación

Las esponjas fueron implantadas subcutáneamente en la región torácica de ratas de Sprague Dawley (de 4-8 semanas de edad) o en el músculo del muslo de conejos (de 11-14 semanas de edad). Los animales fueron mantenidos por espacio de 2-5 semanas antes de retirar el implante. El implante fue entonces fijado en formalina al 4% o paraformaldehído al 4%, y fue entonces embebido en resina JB-4. Las secciones fueron coloreadas con azul de toluidina (Wang et al. (1988) PNAS 85:9484-9488).

La inducción de nuevos folículos pilosos, glándulas sebáceas y otras estructuras dérmicas fue identificada por medio de su morfología distintiva. La cuidadosa colocación subcutánea o intramuscular de nuestros implantes y la cuidadosa remoción de estos implantes excluyen la posibilidad de contaminación por las estructuras dérmicas existentes. Se ve asimismo en los implantes de duración más corta (2 semanas) la aparición de folículos pilosos más inmaduros.

Fueron obtenidas secciones de biopsia de un implante intramuscular sacado de un músculo de conejo a las tres semanas, y las mismas fueron coloreadas con hematoxilina y eosina. Fueron examinadas secciones similares de un implante intramuscular en músculo de conejo a las tres semanas, y las mismas fueron coloreadas con azul de toluidina. Las secciones de determinadas muestras revelaban una morfología tisular que indicaba la presencia de estructuras de tipo folicular y de tipo capilar en formación en el tejido intramuscular.

Inducción de pelo por Shh

Como seguimiento de los experimentos anteriormente descritos, fueron implantadas bajo la piel afeitada de ratones esponjas de colágeno cargadas con hedgehog. Como se indica en las Figuras 1A-C, las preparaciones de hedgehog fueron capaces de inducir el crecimiento del pelo en los implantes. Además, la proteína Ihh modificada en el C-terminus con un sitio de fijación de colágeno de factor Von Willebrand estaba activa en el crecimiento del pelo, lo cual indica una actividad inductora localizada de la proteína implantada.

Todas las referencias y publicaciones que han sido citadas anteriormente quedan incorporadas a la presente por referencia.

Equivalentes

Usando no más que experimentación rutinaria, los expertos en la materia reconocerán o serán capaces de descubrir numerosos equivalentes de los específicos polipéptidos, ácidos nucleicos, métodos, análisis y reactivos aquí descritos.

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 1:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1277 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

ORIENTACIÓN: ambas

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 1..1275

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 1:

9

10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 2:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1190 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

ORIENTACIÓN: ambas

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 1..1191

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 2:

\vskip1.000000\baselineskip

11

12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 3:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1281 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

ORIENTACIÓN: ambas

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 1..1233

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 3:

\vskip1.000000\baselineskip

13

14

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 4:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1313 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

ORIENTACIÓN: ambas

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 1..1314

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

15

16

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 5:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1256 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

ORIENTACIÓN: ambas

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 1..1257

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

17

18

19

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 6:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1425 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

ORIENTACIÓN: única

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 1..1425

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

20

21

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 7:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1622 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

ORIENTACIÓN: única

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 51..1283

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 7:

\vskip1.000000\baselineskip

23

24

25

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 8:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1191 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

ORIENTACIÓN: única

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 1..1191

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 8

\vskip1.000000\baselineskip

26

27

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 9

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1251 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

ORIENTACIÓN: única

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 1..1248

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 9:

\vskip1.000000\baselineskip

29

30

31

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 10:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 425 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 10:

\vskip1.000000\baselineskip

32

33

\newpage

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 11:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 396 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 11:

\vskip1.000000\baselineskip

34

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 12:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 411 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 12:

\vskip1.000000\baselineskip

36

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 13:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 437 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\newpage

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 13:

\vskip1.000000\baselineskip

38

39

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 14:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 418 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 14:

40

41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 15:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 475 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 15:

\vskip1.000000\baselineskip

42

43

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 16:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 411 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 16:

\vskip1.000000\baselineskip

44

45

\newpage

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 17:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 396 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 17:

\vskip1.000000\baselineskip

47

48

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 18:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 416 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 18:

\vskip1.000000\baselineskip

49

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 19:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1416 es de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

ORIENTACIÓN: única

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 1..1413

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 19:

\vskip1.000000\baselineskip

51

52

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 20:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 471 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 20:

\vskip1.000000\baselineskip

53

54

\vskip1.000000\baselineskip

2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 21:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 471 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(v)

TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 21:

55

\vskip1.000000\baselineskip

2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 22:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 167 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(v)

TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 22:

\vskip1.000000\baselineskip

56

57

Claims (55)

1. Método in vitro que es para modular el estado de crecimiento de una célula epitelial y comprende el paso de poner la célula epitelial ectópicamente en contacto con una cantidad de un polipéptido que comprende una parte extracelular bioactiva de una proteína hedgehog (erizo) que es efectiva para alterar la velocidad de proliferación de la célula epitelial.

2. Uso de un polipéptido que comprende una parte extracelular bioactiva de una proteína hedgehog (erizo) en la fabricación de un medicamento para inducir la formación de piel.

3. Uso de un polipéptido que comprende una parte extracelular bioactiva de una proteína hedgehog (erizo) en la fabricación de un medicamento para inducir el crecimiento del pelo en un animal.

4. El método de la reivindicación 1 o el uso de la reivindicación 2 ó 3, en el que el agente incrementa la velocidad de proliferación de células epiteliales.

5. El método de la reivindicación 1, en el que la célula epitelial es una célula epitelial cutánea.

6. El método o uso de la reivindicación 5, en el que la célula epitelial es un queratinocito dérmico.

7. El método o uso de la reivindicación 5, en el que la célula epitelial es una célula epitelial mucosa.

8. El método o uso de la reivindicación 5, en el que la célula epitelial es una célula troncal epitelial.

9. El método o uso de la reivindicación 5, en el que la célula epitelial es una célula troncal de folículo piloso.

10. El método de la reivindicación 1, en el que la célula está en cultivo, y el agente es aportado como aditivo de cultivo celular.

11. El método de la reivindicación 1, en el que el tejido epitelial está en cultivo tisular, y el agente es aportado como aditivo de cultivo tisular.

12. El uso de la reivindicación 2 ó 3, en el que el medicamento está destinado a aplicación tópica.

13. El método de la reivindicación 1 o el uso de las reivindicaciones 2 ó 3, en los que el polipéptido incluye al menos 50 residuos de aminoácidos de una mitad N-terminal de la proteína hedgehog (erizo).

14. El método o uso de la reivindicación 13, en el que el polipéptido incluye al menos 100 aminoácidos de un dominio extracelular de la proteína hedgehog (erizo).

15. El método o uso de la reivindicación 13, en el que el polipéptido incluye al menos una parte de la proteína hedgehog (erizo) que corresponde a un fragmento de 19 kd de un dominio extracelular de la proteína hedgehog (erizo).

16. El método o uso de la reivindicación 13, en el que la proteína hedgehog (erizo) es codificada por un gen de un organismo vertebrado.

17. El método o uso de la reivindicación 13, en el que el polipéptido incluye una secuencia de polipéptido hedgehog (erizo) representada en la fórmula general de la ID SEC Nº 21.

18. El método o uso de la reivindicación 13, en el que el polipéptido incluye una secuencia de polipéptido hedgehog (erizo) representada en la fórmula general de la ID SEC Nº 22.

19. El método o uso de la reivindicación 13, en el que la proteína hedgehog (erizo) es codificada por un gen hedgehog (erizo) humano.

20. El método o uso de la reivindicación 13, en el que la secuencia de polipéptido hedgehog (erizo) es idéntica en al menos un 60 por ciento a una secuencia de aminoácidos de una proteína hedgehog (erizo) seleccionada de entre los miembros del grupo que consta de las siguientes secuencias identificadas con sus correspondientes números de identificación: ID SEC Nº: 9, ID SEC Nº: 10, ID SEC Nº: 11, ID SEC Nº: 12, ID SEC Nº: 13, ID SEC Nº: 14, ID SEC Nº: 15 e ID SEC Nº: 16.

21. El método o uso de la reivindicación 20, en el que la secuencia de polipéptido hedgehog (erizo) es idéntica en al menos un 75 por ciento a una secuencia de aminoácidos de una proteína hedgehog (erizo) seleccionada de entre los miembros del grupo que consta de las siguientes secuencias identificadas con sus correspondientes números de identificación: ID SEC Nº: 9, ID SEC Nº: 10, ID SEC Nº: 11, ID SEC Nº: 12, ID SEC Nº: 13, ID SEC Nº: 14, ID SEC Nº: 15 e ID SEC Nº: 16.

22. El método o uso de la reivindicación 20, en el que la secuencia de polipéptido hedgehog (erizo) es idéntica en al menos un 85 por ciento a una secuencia de aminoácidos de una proteína hedgehog (erizo) seleccionada de entre los miembros del grupo que consta de las siguientes secuencias identificadas con sus correspondientes números de identificación: ID SEC Nº: 9, ID SEC Nº: 10, ID SEC Nº: 11, ID SEC Nº: 12, ID SEC Nº: 13, ID SEC Nº: 14, ID SEC Nº: 15 e ID SEC Nº: 16.

23. El método o uso de la reivindicación 20, en el que la secuencia de polipéptido hedgehog (erizo) es susceptible de ser codificada por una secuencia de nucleótidos que se hibrida bajo condiciones rigurosas con una secuencia seleccionada de entre los miembros del grupo que consta de las siguientes secuencias identificadas con sus correspondientes números de identificación: ID SEC Nº: 1, ID SEC Nº: 2, ID SEC Nº: 3, ID SEC Nº: 4, ID SEC Nº: 5, ID SEC Nº: 6, ID SEC Nº: 7 e ID SEC Nº: 8.

24. El método o uso de la reivindicación 13, en el que la secuencia de polipéptido hedgehog (erizo) es una secuencia de aminoácidos de una proteína hedgehog (erizo) seleccionada de entre los miembros del grupo que consta de las siguientes secuencias identificadas con sus correspondientes números de identificación: ID SEC Nº: 9, ID SEC Nº: 10, ID SEC Nº: 11, ID SEC Nº: 12, ID SEC Nº: 13, ID SEC Nº: 14, ID SEC Nº: 15 e ID SEC Nº: 16.

25. El método o uso de la reivindicación 13, en el que la secuencia de polipéptido hedgehog (erizo) es una secuencia de aminoácidos de una proteína Sonic hedgehog.

26. El método o uso de la reivindicación 13, en el que la secuencia de polipéptido hedgehog (erizo) es una secuencia de aminoácidos de una proteína Indian hedgehog.

27. El método o uso de la reivindicación 13, en el que la secuencia de polipéptido hedgehog es una secuencia de aminoácidos de una proteína Desert hedgehog.

28. El método o uso de la reivindicación 13, en el que la secuencia de polipéptido hedgehog (erizo) incluye una secuencia de aminoácidos que corresponde aproximadamente a los residuos 24-193 de la ID SEC Nº: 15.

29. El método o uso de la reivindicación 13, en el que el polipéptido es purificado hasta al menos un 80% en peso en seco.

30. El método de la reivindicación 13, en el que el polipéptido es un polipéptido producido por vía recombinante.

31. El método o uso de la reivindicación 13, en el que el polipéptido es un polipéptido sintetizado químicamente.

32. El método o uso de la reivindicación 13, en el que el agente terapéutico hedgehog es un peptidomimético de una secuencia de polipéptido hedgehog.

33. Uso de un constructo antisentido que inhibe la expresión de una proteína patched en la fabricación de un medicamento para inducir la formación de piel o inducir el crecimiento de pelo en un animal.

34. El uso de la reivindicación 33, en el que el constructo antisentido es un oligonucleótido que tiene una longitud de aproximadamente 20-30 nucleótidos y un contenido de GC de al menos un 50 por ciento.

35. El uso de la reivindicación 34, en el que el oligonucleótido antisentido es seleccionado de entre los miembros del grupo que consta de:

5'-GTCCTGGCGCCGCCGCCGCCGTCGCC;

5'-TTCCGATGACCGGCCTTTCGCGGTGA; y

5'-GTGCACGGAAAGGTGCAGGCCACACT

36. Uso de un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que incluye al menos una parte bioactiva de la mitad N-terminal de una proteína hedgehog (erizo) en la fabricación de un medicamento para promover la proliferación de células epiteliales de piel.

37. El uso de la reivindicación 36, en el que dicho medicamento está destinado a ser usado como parte de un tratamiento para regular un proceso de curación de heridas.

38. El uso de la reivindicación 36, en el que el tratamiento es seleccionado de entre los miembros de un grupo que consta de tratamiento de quemaduras, regeneración de piel, injertos de piel, tratamiento de llagas por decúbito, tratamiento de úlceras dérmicas, reducción de cicatrices post-cirugía y tratamiento de colitis ulcerosa.

39. El uso de la reivindicación 36, en el que dicho medicamento está destinado a ser usado como parte de un tratamiento de la alopecia.

40. Preparación de un polipéptido que comprende una secuencia de polipéptido hedgehog (erizo) que incluye un fragmento bioactivo de una proteína hedgehog (erizo), siendo dicho polipéptido incorporado a una formulación para aplicación tópica a tejido epitelial.

41. La preparación de la reivindicación 40, en la que el polipéptido es incorporado a una formulación para aplicación tópica a la piel.

42. La preparación de la reivindicación 40, en la que el polipéptido incluye al menos 50 residuos de aminoácidos de una mitad N-terminal de la proteína hedgehog (erizo).

43. La preparación de la reivindicación 40, en la que el polipéptido incluye al menos 100 aminoácidos de un dominio extracelular de la proteína hedgehog (erizo).

44. La preparación de la reivindicación 40, en la que el polipéptido incluye al menos una parte de la proteína hedgehog (erizo) que corresponde a un fragmento de 19 kd de un dominio extracelular de la proteína hedgehog (erizo).

45. La preparación de la reivindicación 40, en la que la proteína hedgehog (erizo) es codificada por un gen de un organismo vertebrado.

46. Uso de un antagonista para hedgehog en la fabricación de un medicamento para inhibir la proliferación de una célula epitelial, para la inhibición de la formación de tejido epitelial, o para inhibir el crecimiento de pelo en un animal.

47. El uso de la reivindicación 46, en el que el antagonista para hedgehog es un ácido nucleico antisentido que inhibe la expresión de una proteína hedgehog (erizo).

48. El uso de la reivindicación 46, en el que el agente reduce la velocidad de proliferación de células epiteliales.

49. El uso de la reivindicación 46, en el que la célula epitelial es una célula epitelial cutánea.

50. El uso de la reivindicación 46, en el que la célula epitelial es un queratinocito dérmico.

51. El uso de la reivindicación 46, en el que la célula epitelial es una célula epitelial mucosa.

52. El uso de la reivindicación 46, en el que la célula epitelial es una célula troncal epitelial.

53. El uso de la reivindicación 46, en el que la célula epitelial es una célula troncal de folículo piloso.

54. El uso de la reivindicación 46, en el que el medicamento es para aplicación tópica.

55. El uso de la reivindicación 46, en el que el medicamento es para el tratamiento del carcinoma de células basales.