JP2002529423A - 末梢神経障害を治療し又は予防するための方法及び組成物 - Google Patents

末梢神経障害を治療し又は予防するための方法及び組成物

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、ヘッジホッグ遺伝子産物が末梢神経細胞を保護しなければ末梢神経障害を生じる条件下で保護することができるという発見に向けられている。この発明のある面は、パッチト又はスムースンドシグナリングを調節するヘッジホッグポリペプチド又は他の分子の調製物、及びそれらの後天性及び遺伝性の神経障害に対する保護剤としての利用に向けられている。ここで用いる場合、「末梢神経障害」は、末梢神経系のセグメントを冒す疾患をいう。例えば、本発明の方法は、全身性疾患例えばウイルス感染症、糖尿病、炎症と関係する神経障害並びに；遺伝的に獲得した(遺伝性の)神経障害例えばシャルコー・マリー・ツース病；及び毒性薬剤例えばビンクリスチン等の化学療法剤により引き起こされる神経障害の取り扱いにおける治療プログラムの一部として利用することができる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 発明の背景 運動単位（脊髄の運動ニューロン細胞、神経、神経筋接合部、および筋繊維）
、感覚神経および自律神経、またはこれらの支持構造の構成成分に影響を与える
状態は、広い範疇での「神経筋障害」に包含され、末梢神経障害を含む。
【０００２】 運動神経は、随意運動を担う。これらの細胞体は脊髄内に存在し、これらのプ
ロセスは、シグナルを骨格筋上の特定の運動受容体に伝達する。感覚神経は、痛
み、振動、接触を知覚し、手足が空間の中でどこに位置しているかを感じ取る。
それらの細胞体は、脊髄に隣接する感覚「神経節」と呼ばれる特定の構造にグル
ープ化される。そして、それらは皮膚や他の器官にある感覚受容体からのシグナ
ルを中枢神経系（ＣＮＳ）に伝達する。自律神経は、呼吸、心臓の鼓動、血圧、
消化、性機能のような不随意機能をコントロールする。それらの細胞体は、自律
神経節に集約されており、体全体に広がっている。
【０００３】 神経障害（神経障害）は、末梢神経系の疾患を表すために用いられる総称語で
ある。末梢神経障害には約２００の異なる原因が存在する。大部分の神経障害は
３種類の神経のすべてに程度の差こそあれ影響を与えるが、幾つかの疾患は一つ
か二つだけに影響し、そこで、純粋な、あるいは優先的な、運動神経障害、感覚
神経障害、または自律神経障害と呼ばれる。
【０００４】 例えば、ギラン・バレー症候群は、流感様の疾患や他の感染症ののち通常、二
、三週間で発症する末梢神経系が関与する急性疾患である。それはほとんどが運
動神経障害であり、その症状は主に運動神経が関与するものであることを意味す
る。この疾患は主として運動に関するものであるが、ごく初期の症状は下肢に感
じる痺れおよび疼きであり、しばらくして、下肢の遠位筋における脱力が生じる
。患者が訴える共通の初期の症状は、つま先でつまずくことであり、のちに下垂
足（尖足）をもたらす。脱力は通常下肢全体に広がり、その後、上肢に進む。脱
力が呼吸筋に進むと危険が生じる。
【０００５】 ギラン・バレー症候群の診断は、患者が、脱力が上向していく経過および初期
の運動神経障害と一致する身体的検査を示したときに、示唆される。診断は、通
常、白血球数の増加なしに髄液中の蛋白質レベルの上昇を示す、脊椎穿刺を行う
こと、および筋電図で確定する。ギラン・バレー症候群に類似の他のすべての状
態は、また排除されなくてはならない。
【０００６】 ギラン・バレー症候群は通常、自己限定的疾患であるが、しばしば集中的な治
療的介入が必要になる。
【０００７】 ＣＩＤＰあるいは慢性炎症性脱髄性多発神経障害は、末梢の運動および感覚神
経に影響を及ぼす免疫が関与する神経障害である。症状は、ゆっくりと進行する
痺れおよび疼きであり、通常足先から始まり、その後、脚および手に広がる。患
者はまた、同じく通常下肢に始まり、すぐに上肢に至るある脱力を訴える。さら
に感覚系に広がるにつれて、平衡感覚のような他の感覚体系が影響を受けて、患
者は歩行できないことや暗所でバランスを保てないことを訴える。
【０００８】 ＣＩＤＰの診断では、知覚運動性神経障害の経過で疑いが生じる。遠位よりも
近位に多い運動の脱力と共に、上下肢における遠位感覚欠損を伴う身体的検査が
臨床的診断をサポートする。脊椎穿刺においては、通常、髄液の蛋白質レベルの
上昇がみられる。神経の状態検査を伴う筋電図の測定も、診断をサポートする。
通常、主徴は末梢神経の伝達速度の低下である。最終的な診断ステップは、神経
の生検を行うことである。あまりないことではあるが、神経生検において炎症が
認められると、はっきりと診断が確定する。しかしながら、炎症がないからとい
って、全くは除外できない。神経生検において顕著な脱髄が認められると、他の
検査や臨床的な徴候と共に、ＣＩＤＰの診断を支持するのに用いることができる
。一旦診断が確定すれば、免疫抑制剤での治療が開始される。治療の第一は、依
然として経口的に毎日から始めるステロイド剤の大量投与であり、患者の症状が
改善されると共に経時的に徐々に減らしていく。ステロイド剤障害やステロイド
剤に対する不寛容には、他の免疫抑制剤の使用が必要となる。しかしながら、Ｃ
ＩＤＰに対するより良い治療的介入は、また本発明の所望の目的である。
【０００９】 末梢神経障害は、長年にわたる糖尿病の多くの合併症の一つである。通常、神
経障害は糖尿病が始まってから約８〜１０年で発症する。しかしながら、そのと
き糖尿病であると診断されて神経障害の症状を示している患者や２０年以上も糖
尿病で神経障害の徴候をほとんどあるいは全く示さない患者を見ることは珍しい
ことではない。糖尿病性神経障害の症状は、痛みを伴う神経障害に進行しうる、
下肢の緩慢で油断できない痺れおよび疼きから成る。この痛みは通常、足が焼け
る感じというように表現される。時折、この痛みは、下肢を巡り下る鋭い電気シ
ョックと表現される。悪化すると、痛みは深部の骨からのもののようになる。そ
れは夜間に悪化し、普通、患者の睡眠を妨げたり、目を覚まさせたりする。神経
障害が悪化すると、上肢に影響を与え、脚や腕の遠位筋の脱力を訴えて、運動神
経に広がりうる。糖尿病の神経障害は、発汗、血圧、および性機能における不具
合を引き起こす自律神経系にも広がりうる。
【００１０】 糖尿病性神経障害は、患者の病歴および身体的検査が糖尿病の定められた条件
での臨床像と合致したときに疑われる。糖尿病の病歴がない場合には、糖尿病を
除外するための診断的な試験が必要である。末梢神経系での広がりの程度を定量
するための神経伝達検査を伴う筋電図の測定により、精密検査は完了する。
【００１１】 糖尿病性神経障害については、残念ながら、現在のところ有効な治療法は存在
しない。ただ、患者の血糖値を適切にコントロールすることで、症状の進行を遅
らせることがわかっている。Ｅｌａｖｉｌ、Ｔｅｇｒｅｔｏｌ、およびより最近
のＵｌｔｒａｍを包含する、神経障害の痛みを抑える種々の医薬での対症療法は
、有効である。そこで、糖尿病性神経障害のより有効な治療法は、本発明の目的
の一つである。
【００１２】 他の良く見られる神経障害の原因として、アルコール性、あるいは薬物誘起神
経障害が、そのような障害の遺伝的な型のものと共に挙げられる。
【００１３】 発明の概要 本出願の一態様は、とくに末梢神経障害の治療において、神経筋障害に伴う症
状の全部または一部を治療しあるいは緩和する方法に関する。概括すれば、対象
の方法は、冒された組織にヘッジホッグ治療剤またはｐｔｃ治療剤（定義は下記
する）を、例えばヘッジホッグ治療剤またはｐｔｃ治療剤を投与しなかった場合
に比べて、処理した細胞の成長状態を変えるのに有効な量で、接触させることを
含んで成る。
【００１４】 本方法はヘッジホッグ治療剤を用いて行われるが、ヘッジホッグ治療剤は、好
ましくはヘッジホッグタンパク質の少なくとも生物活性な細胞外部分を含んで成
るヘッジホッグ部分を含むポリペプチドであり、例えばこのヘッジホッグ部分は
ヘッジホッグタンパク質のＮ−末端半部分の少なくとも５０、１００、または１
５０個の（連続した）アミノ酸残基を含む。好ましい実施例では、ヘッジホッグ
タンパク質は、ヘッジホッグタンパク質の細胞外ドメインの１９ｋｄフラグメン
トに対応するヘッジホッグタンパク質の少なくとも一部を含む。
【００１５】 好ましい実施例においては、ヘッジホッグタンパク質は、配列番号１０〜１８
、または２０のいずれかのヘッジホッグタンパク質と少なくとも６０、７５、８
５、または９５％が同一であるアミノ酸配列を有する。ただし、リストしたそれ
らの配列と同一な配列は同様に本方法において有用と考えられる。ヘッジホッグ
タンパク質は、ストリンジェントな条件で配列番号１〜９または１９のいずれか
の核酸配列とハイブリダイズする核酸でコードすることができる。例えば、ヘッ
ジホッグタンパク質は、脊椎動物のヘッジホッグ遺伝子、とくにヒトヘッジホッ
グ遺伝子によりコードされうる。
【００１６】 他の実施例においては、本方法は、遺伝子活性化構築物を投与することにより
行われうる。この遺伝子活性化構築物は患者のゲノムヘッジホッグ遺伝子で組換
えるようにデザインされて、ヘッジホッグ遺伝子をコードする配列に作動するよ
うにリンクされた異種転写調節配列を与える。
【００１７】 さらに他の実施例では、本方法は、ヘッジホッグポリペプチドをコードする遺
伝子治療構築物を投与して実施することができる。例えば、遺伝子治療構築物は
組換えウイルス粒子、リポソーム、およびポリカチオン性核酸結合剤からなる群
から選択される組成物中で提供されうる。
【００１８】 またその他の実施例においては、本方法はｐｔｃ治療剤を用いて行われる。ｐ
ｔｃ治療剤の例は、パッチトタンパク質に結合し、パッチトが介在する有糸分裂
の阻害を抑制解除する小さい有機分子であり、例えば、パッチトに結合し、パッ
チト依存性の遺伝子発現を調節する、パッチトに結合し、ヘッジホッグ介在パッ
チトシグナル伝達を模倣する分子である。例えば、パッチトにｐｔｃ治療剤が結
合すると、パッチトおよび／またはｇｌｉ発現のアップレギュレーションが生じ
うる。
【００１９】 より一般的な意味において、ｐｔｃ治療剤は、パッチトシグナル経路に含まれ
る局在性、タンパク質−タンパク質結合、および／または細胞内タンパク質の酵
素活性を変えることによるような、ＭＫ細胞と相互作用してヘッジホッグ介在パ
ッチトシグナル伝達を誘起する小さな有機分子でありうる。例えば、ｐｔｃ治療
剤はヘッジホッグタンパク質、パッチトタンパク質、またはパッチトの細胞内シ
グナル伝達に関与するタンパク質の発現レベルを変化させる。
【００２０】 ある実施例において、ｐｔｃ治療剤は、パッチトのシグナル伝達経路に関与し
、その発現がヘッジホッグ介在シグナルに拮抗するタンパク質の発現を阻害する
アンチセンス構築物である。このアンチセンス構築物は、好ましくは長さが約２
０〜３０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドであり、少なくとも５０％のＧＣ含
量を有するものである。
【００２１】 他の実施例においては、ｐｔｃ治療剤は、５−イソキノリンスルホンアミドの
ようなプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）の阻害剤である。このＰＫＡ阻害剤は、
サイクリックＡＭＰ類縁体でありうる。ＰＫＡ阻害剤の例として、Ｎ−〔２−（
（ｐ−ブロモシンナミル）アミノ）エチル〕−５−イソキノリンスルホンアミド
、１−（５−イソキノリンスルホニル）−２−メチルピペラジン、ＫＴ５７２０
、８−ブロモ−ｃＡＭＰ、ジブチリル−ｃＡＭＰ、およびＰＫＡ熱安定阻害剤イ
ソ型タンパク質αが挙げられる。他のＰＫＡ阻害剤の例は、下記一般式で表され
る：
【００２２】
【化３】 （式中、 Ｒ１およびＲ２は各々独立に、水素、および、価数と安定性が許すような、低
級アルキル、低級アルケニル、低級アルキニル、（カルボキシ、エステル、ホル
メート、またはケトンのような）カルボニル、（チオエステル、チオアセテート
、またはチオホルメートのような）チオカルボニル、アミノ、アシルアミノ、ア
ミド、シアノ、ニトロ、アジド、スルフェート、スルホネート、スルホンアミド
、−（ＣＨ２）ｍ−Ｒ８、−（ＣＨ２）ｍ−ＯＨ、−（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−低級ア
ルキル、−（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−低級アルケニル、−（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２
）ｍ−Ｒ８、−（ＣＨ２）ｍ−ＳＨ、−（ＣＨ２）ｍ−Ｓ−低級アルキル、−（
ＣＨ２）ｍ−Ｓ−低級アルケニル、−（ＣＨ２）ｎ−Ｓ−（ＣＨ２）ｍ−Ｒ８を
表すか、または Ｒ１およびＲ２はＮと共に（置換または無置換の）ヘテロ環を形成する； Ｒ３は存在しないかあるいは、低級アルキル、低級アルケニル、低級アルキニ
ル、（カルボキシ、エステル、ホルメート、またはケトンのような）カルボニル
、（チオエステル、チオアセテート、またはチオホルメートのような）チオカル
ボニル、アミノ、アシルアミノ、アミド、シアノ、ニトロ、アジド、スルフェー
ト、スルホネート、スルホンアミド、−（ＣＨ２）ｍ−Ｒ８、−（ＣＨ２）ｍ−
ＯＨ、−（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−低級アルキル、−（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−低級アルケニ
ル、−（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｒ８、−（ＣＨ２）ｍ−ＳＨ、−（Ｃ
Ｈ２）ｍ−Ｓ−低級アルキル、−（ＣＨ２）ｍ−Ｓ−低級アルケニル、−（ＣＨ
２）ｎ−Ｓ−（ＣＨ２）ｍ−Ｒ８のようなイソキノリン環への１以上の置換基を
表し； Ｒ８は置換もしくは無置換のアリール、アラルキル、シクロアルキル、シクロ
アルケニル、またはヘテロ環を表し、 ｎおよびｍは各出現ごとに独立に、０または１〜６の範囲の整数である。
【００２３】 発明の詳細な説明 末梢神経系は、身体の神経系の二つの主要な部分のうちの一つである。他のも
のは、中枢神経系であり、脳と脊髄が挙げられる。「末梢」とは中心から離れる
ことを意味し、この系は中枢神経系を筋肉、皮膚、および内部器官とをつなぐ神
経を含んでいる。
【００２４】 末梢神経障害は、末梢神経の損傷（例えば、機械的、化学的、ウイルス性、細
菌性、または遺伝的）による障害を表すために用いられる用語である。それは、
末梢神経のみに影響を与える疾患により、あるいは身体の他の部分にも影響を与
える状態によって、引き起こされる。症状としては、ほぼ常に、通常は腕と脚に
おける脱力、痺れ、および痛みが挙げられる。神経生物学のいくつかの基礎を知
ることは、神経障害がどのようにして始まるかを理解する上で有用であろう。
【００２５】 Ｉ．概観 本出願は、ヘッジホッグ遺伝子の産生物が、それがなければ末梢神経障害をも
たらす条件下で末梢神経細胞を保護することができるという発見に係るものであ
る。本発明のある態様は、ヘッジホッグポリペプチド、またはパッチトもしくは
スムースにされたシグナル送信を調節する他の分子の調製、並びに後天的および
遺伝的神経障害の双方に対する保護剤としてのそれらの使用に関する。本明細書
中で使用される「末梢神経障害」は、末梢神経系のセグメントに影響を与える障
害を意味する。例えば、本発明の方法は、全身性疾患、例えばウイルス感染症、
糖尿病、炎症に伴う神経障害；並びに遺伝的に獲得した（遺伝的）神経障害、例
えばシャルコー・マリー・ツース病、および毒性薬剤、例えばビンクリスチンの
ような化学療法剤により引き起こされた神経障害の管理における治療プログラム
の一部として用いることができる。
【００２６】 さらに例示すれば、本方法は、糖尿病性神経障害のような後天的神経障害；ギ
ラン・バレー症候群（ＧＢＳ）やその変形、慢性炎症性脱髄性多発神経障害（Ｃ
ＩＤＰ）、末梢神経に対する抗体での慢性多発神経障害、末梢神経における血管
炎または血管の炎症、上腕もしくは腰仙神経叢炎に伴う神経障害、および単クロ
ーン性免疫グロブリン異常症に伴う神経障害；肺癌に伴う感覚神経障害、多発性
骨髄腫に伴う神経障害、ワルデンストロームマクログロブリン血症、慢性リンパ
性白血病、またはＢ細胞リンパ腫に伴う神経障害のような腫瘍または新生物に伴
う神経障害；アミロイドーシスに伴う神経障害；感染症により引き起こされた神
経障害；栄養不均衡により引き起こされた神経障害；腎疾患における神経障害；
甲状腺機能低下性神経障害；アルコールおよび毒物により引き起こされた神経障
害；薬物により引き起こされた神経障害；局所的照射によりもたらされた神経障
害；外傷または圧迫により引き起こされた神経障害；突発性神経障害の治療にお
いて使用することができる。
【００２７】 同様に、本方法は、シャルコー・マリー・ツース病（ＣＭＴ）；家族性アミロ
イド神経障害および他の遺伝性神経障害；並びに遺伝性ポルフィリン症のような
遺伝性神経障害の治療において使用することができる。
【００２８】 もう一つの実施例において、本方法は、老化関連神経障害に伴う神経変性イベ
ントを防止あるいはそうでなければ進行を遅らせるために使用することができる
。 添付の実施例で述べるように、ヘッジホッグタンパク質は、末梢神経の化学的
損傷を促進する条件下で神経を保護する。確かに、ヘッジホッグタンパク質は、
ＮＧＦの報告された効果と同様の有意な保護効果を示した。その神経向性および
神経保護作用に基づいて、ヘッジホッグまたはｐｔｃ治療剤の投与は、神経障害
を含む神経変性疾患のいくつかのタイプの治療法として本明細書中で示唆される
。一般に、本発明の方法は、例えば、分化、アポトーシスおよび／またはネクロ
ーシスがなくなるということで特徴付けられる、変性に抵抗性を示す細胞による
非毒性応答を生じる量のヘッジホッグまたはｐｔｃ治療剤（定義は下記する）を
動物に、あるいは生体外で培養した末梢神経に投与することを含んで成る。本方
法は、培養物中に分散しているか、あるいは無傷の組織または器官の一部である
細胞上で行われる。また、この方法は、培養物中（生体外）で提供される細胞、
または動物全体の中（生体内）の細胞について行われる。
【００２９】 一つの態様において、本発明は、活性成分としてヘッジホッグポリペプチドま
たはその模倣物を用いる神経障害の治療および予防のための医薬製剤および方法
を提供する。本発明はまた、本発明の医薬製剤を使用することによる末梢神経細
胞の機能的性能をコントロールする方法に関する。
【００３０】 本ヘッジホッグ治療法は、これらの状態に罹患したヒトおよび動物の対象物の
双方に有効である。本発明を適用する動物の対象物は、ペットとしてあるいは販
売目的で飼育された、家庭内動物および家畜の双方に及ぶ。例として、犬、猫、
牛、馬、羊、豚、および山羊が挙げられる。
【００３１】 いかなる特定の理論にも縛られることを望むものではないが、ヘッジホッグ治
療法の神経保護効果は、少なくとも部分的にであれ、パッチトが介在する遺伝子
発現の調節およびそのタンパク質が介在する他の生理学的効果に（直接的にまた
は間接的に）拮抗するこれらのタンパク質の能力によるものであろう。パッチト
遺伝子の産生物、細胞表面タンパク質は、位置情報を与えるタンパク質であるモ
ルフォルゲンのＷｎｔおよびＤｐｐ／ＢＭＰファミリーのメンバーの転写抑制を
引き起こす経路を通じてシグナルを出すと考えられている。脊椎動物におけるＣ
ＮＳおよび手足のパターン化の発達において、ヘッジホッグの導入は、パッチト
により与えられたこの阻害を取り除き、特定の遺伝子プログラムの発現が行われ
るようにする。
【００３２】 近年、ショウジョウバエの発生経路で最初に同定された遺伝子である、パッチ
トのヒトバージョンにおける変異は、遺伝的な皮膚癌を引き起こし、また散発性
の皮膚癌の原因となりうる。例えば、Ｈａｈｎら、（１９９６） Ｃｅｌｌ ８
６：８４１−８５１；およびＪｏｈｎｓｏｎら、（１９９６） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２：１６６８−１６７１参照。母斑性基底細胞癌（ＮＢＣＣ）はヒトパッ
チト遺伝子における変異から生じることの証明は、パッチトは胚発生後に働くと
いう役割の一例を提供した。これらの知見は、パッチトの一つの活性が、ヘッジ
ホッグからの増殖シグナルを阻害することにより作用する、腫瘍抑制遺伝子であ
ると当分野で理解されるように導いた。下記の本発明者らの知見は、末梢神経細
胞の維持において、ヘッジホッグ／パッチト経路に対する潜在的な新しい役割を
示している。したがって、本発明は、パッチトシグナリングについてのヘッジホ
ッグタンパク質の効果を模倣することができる他の薬剤、例えば下記の薬物スク
リーニングアッセイから同定されうる薬剤の使用を意図している。
【００３３】 さらに他の実施例において、ヘッジホッグシグナリングの拮抗剤が、例えば慢
性痛み症候群の治療におけるような、感覚ニューロンの選択的除去に使用するこ
とができる。
【００３４】 ＩＩ．定義 簡便のため、明細書、実施例、および添付の請求の範囲中で使用される幾つか
の用語をここに集める。
【００３５】 「ヘッジホッグ治療剤」なる用語は、ヘッジホッグポリペプチドの種々の形態
、および、個々の例から明らかになるように、天然由来のヘッジホッグタンパク
質の効果を模倣し、あるいは増強（作動）し、あるいは阻害（拮抗）することに
より、末梢神経細胞の増殖／分化状態を調節することができる、ペプチドミミッ
ク（ペプチド模倣物）を意味する。野生型ヘッジホッグタンパク質の活性を模倣
しあるいは増強するヘッジホッグ治療剤は、「ヘッジホッグ作動薬（アゴニスト
）」である。反対に、野生型ヘッジホッグタンパク質の活性を阻害するヘッジホ
ッグ治療剤は、「ヘッジホッグ拮抗薬（アンタゴニスト）」である。
【００３６】 とくに、「ヘッジホッグポリペプチド」なる用語は、特定の文脈から明らかに
なるように、作動薬あるいは拮抗薬の両方の形態で、ヘッジホッグタンパク質お
よびそのペプチドフラグメントの製剤を包含する。
【００３７】 本明細書中で使用されるように、「ヘッジホッグタンパク質の生物活性フラグ
メント」なる用語は、完全長のヘッジホッグポリペプチドのフラグメントであっ
て、フラグメントが、野生型ヘッジホッグタンパク質に介在されて誘起するイベ
ントを具体的に作動させ、あるいはそれに拮抗するものである。ヘッジホッグ生
物活性フラグメントは、好ましくはヘッジホッグタンパク質の可溶性の細胞外部
分であって、ここで溶解性は生理学的に適合性の溶液に関してのものである。生
物活性フラグメントの例は、ＰＣＴのＷＯ９５／１８８５６号明細書およびＷＯ
９６／１７９２４号明細書に記載されている。
【００３８】 「ｐｔｃ治療剤」なる用語は、（ｉ）例えばパッチトの細胞サイクル阻害活性
に拮抗する、パッチトシグナリングにおけるヘッジホッグタンパク質の効果を模
倣するか、あるいは（ｉｉ）パッチトシグナリングを活性化または増強するかの
いずれかの薬剤を意味する。他の実施例において、ｐｔｃ治療剤はヘッジホッグ
拮抗剤でありうる。ｐｔｃ治療剤は、例えば、ペプチド、核酸、炭水化物、小さ
な有機分子、または天然物の抽出物（もしくはその画分）でありうる。
【００３９】 本治療方法に関して、例えばヘッジホッグ治療剤の、「有効量」は、治療され
る障害についての臨床的に許容しうる基準に従って、望ましい投薬計画の一部と
して投与した場合、ヘッジホッグ治療剤なしのときに比べて末梢神経の生存率を
向上させる、製剤中でのヘッジホッグポリペプチドの量を意味する。
【００４０】 本方法で治療される「患者」および「対象物」は、ヒトまたは非ヒト動物のい
ずれかを意味する。
【００４１】 細胞の「成長状態」は、細胞の増殖速度および細胞の分化状態を意味する。 「相同性（ホモロジー）」および「同一性」は、各々、二つのポリペプチド配
列間の配列類似性を意味し、同一性はより厳密な比較である。相同性および同一
性は、それぞれ、比較の目的で並べられた各々の配列における位置を比較するこ
とによって決定される。比較する配列中の位置が同じアミノ酸残基で占められて
いるとき、ポリペプチドはその位置で同一であると称する。対応する位置が同じ
アミノ酸（例えば、同一）または類似のアミノ酸（例えば、立体的なおよび／ま
たは電子的な性質において類似）で占められているときには、それらの分子はそ
の位置で相同であると称する。配列間での相同性あるいは同一性のパーセントが
、配列が共に有している合致したあるいは相同な位置の数の関数である。「関連
性がない」あるいは「非相同」配列は、４０％未満の同一性（好ましくは２５％
未満の同一性であるが）を、本発明のヘッジホッグ配列と分かち合うものである
。 特定のポリペプチドまたは核酸配列についていわれる場合の、「対応する」な
る用語は、当該配列が対応するとされる参照配列と同一または相同であることを
示すことを意味する。
【００４２】 「組換えタンパク質」、「異種タンパク質」および「体外性タンパク質」は、
相互に交換可能な語として明細書全体で使用され、組換えＤＮＡ法により製造さ
れるポリペプチドを意味する。その方法では、そのポリペプチドをコードするＤ
ＮＡが適当な発現構築物に挿入され、それは次いでホスト細胞にトランスフォー
ムされて異種タンパク質が産生される。つまり、そのポリペプチドは、異種核酸
から発現される。
【００４３】 「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」は、ヘッジホッグポリペプチ
ドをコードする第一のアミノ酸配列の、ｈｈタンパク質のどのドメインとも無関
係で実質的に相同ではないドメインを規定する第二のアミノ酸配列との融合体で
ある。キメラタンパク質は、第一のタンパク質を発現する有機体中に（異なるタ
ンパク質中であっても）見出される外来ドメインを示すか、あるいは「種間の」
、「遺伝子間の」等の、異種の有機体により発現されたタンパク質構造の融合体
でありうる。一般に、融合タンパク質は一般式（Ｘ）ｎ−（ｈｈ）ｍ−（Ｙ）ｎ
で表され、ここでｈｈはヘッジホッグタンパク質の全体のあるいは一部を表し、
ＸおよびＹは各々独立に、ヘッジホッグ配列に隣接するポリペプチド鎖としては
天然には見出されないアミノ酸配列を表し、ｍは１以上の整数であり、各々のｎ
は独立に、０または１以上の整数である（ｎおよびｍは好ましくは５または１０
未満である）。
【００４４】 ＩＩＩ．方法および組成物の用途の例 本方法は、神経節ニューロン、交感ニューロン、感覚ニューロン、および運動
ニューロンを含む、末梢神経の制御に影響を与える障害の治療または予防に、広
汎な用途を有している。一般に、この方法は、処置される末梢神経細胞の増殖お
よび／または分化状態を変化させるのに治療上有効な量のｐｔｃあるいはヘッジ
ホッグ治療剤を、動物に投与するステップを含むことを特徴とする。そのような
治療的組成物は、例えば網膜神経節、内耳および聴覚神経、および運動ニューロ
ンを、損傷に誘起された死から救うためにデザインされた、並びにそのようなダ
メージののちこれらのニューロンをレプロジェクションに導く治療において有用
でありうる。そのような疾患および状態として、これらに限定されるものではな
いが、化学的あるいは機械的外傷、（水痘・帯状ヘルペス・ウイルスでのウイル
ス感染症のような）感染症、糖尿病のような代謝性疾患、栄養不足、（シスプラ
チン処置のような）毒性薬剤が挙げられる。各々のケースにおける治療のゴール
は、（１）疾患の原因を取り除くこと、（２）症状を緩和、除去することの二つ
でありうる。
【００４５】 末梢神経障害は、手および足における神経末端損傷を含む状態である。末梢神
経障害は一般に、最も多くは運動、感覚、感覚運動、または自律神経の機能障害
のひとつまたは組み合わせとして現れる、末梢神経における障害をいう。末梢神
経障害により現される広範な種類の形態は、それぞれ、比類のないほど同じく広
汎な種類の原因によるものといえる。例えば、末梢神経障害は、遺伝的にもたら
されうるし、全身性の疾患から生じることもあり、あるいは毒性薬剤により誘起
されうる。神経毒性を引き起こすいくつかの毒性薬剤は、治療薬、抗新生物剤、
食品または医薬の不純物、並びに環境および産業汚染物質である。
【００４６】 とくに、感覚および／または運動神経障害を引き起こすことが知られている化
学療法剤として、血液性悪性腫瘍および肉腫を治療するために使用される抗新生
物薬である、ビンクリスチンが、シスプラチン、タキソール、およびその他のも
のと共に挙げられる。この神経毒性は投与量に相関するものであり、腸運動の減
少および、とくに手足の遠位筋における末梢神経障害、体位性低血圧、および膀
胱無緊張症として現れる。同様の問題は、タキソールおよびシスプラチンでも報
告されている（Ｍｏｌｌｍａｎ，Ｊ．Ｅ．，１９９０、Ｎｅｗ Ｅｎｇ Ｊｏｕ
ｒ Ｍｅｄ．３２２：１２６−１２７）が、シスプラチン関連神経障害は、神経
成長因子（ＮＧＦ）で軽減される（Ａｐｆｅｌ，Ｓ．Ｃ．ら、１９９２、Ａｎｎ
ａｌｓ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ３１：７６−８０）。神経毒性は神経毒性
薬剤を取り除いたのちに修復可能な場合もあるが、回復は非常にゆっくりしたプ
ロセスでありうる（Ｌｅｇｈａ，Ｓ．，１９８６、Ｍｅｄｉｃａｌ Ｔｏｘｉｃ
ｏｌｏｇｙ １：４２１−４２７；Ｏｌｅｓｅｎら、１９９１、Ｄｒｕｇ Ｓａ
ｆｅｔｙ ６：３０２−３１４）。
【００４７】 レフサム病、無β・リポ蛋白血症、タンジール病、クラッベ病、異染性白質萎
縮症、ファブリー病、デジェリン−ソッタス症候群等を含む、多くの遺伝性末梢
神経障害が存在する。すべての遺伝性神経障害のうち、群を抜いて最も多いもの
は、シャルコー・マリー・ツース病である。
【００４８】 シャルコー・マリー・ツース（ＣＭＴ）病（腓骨筋萎縮、あるいは遺伝性運動
感覚神経障害（ＨＭＳＮ）としても知られている）は、最も多い遺伝性神経障害
である。末梢神経の節性脱髄および軸索と前角細胞の付随的変性による、主とし
て腓骨筋の、脱力および萎縮が特徴である。常染色体優性遺伝が通常であり、フ
リードライヒ失調症のような、随伴性変性性ＣＮＳ障害が多く見られる。
【００４９】 一つの態様において、本発明の方法は、遺伝性神経障害の治療および維持に使
用することができる。この群の神経障害は、分子遺伝学の飛躍的な進歩により、
現在多く認められるようになっている。種々の遺伝性神経障害の症状は、広範囲
なものである。広く共通する特徴は、通常、足における温和な痺れと疼きが初期
に始まり、徐々に脚や手、そしてその後上肢の残りの部分に広がることである。
大部分の遺伝性神経障害は、下肢および上肢における遠位での脱力からなる運動
要素を有している。遺伝性神経障害の患者の大部分は、高い土踏まずまたは他の
骨変形を有している。症状は極めてゆっくり進行するものであり、患者の大部分
はその症状が始まったのち、２０年を経ても歩行している。
【００５０】 遺伝性神経障害の診断は、通常、とくに陽性の家族病歴が同じく存在するとき
に、初期の神経障害症状の始まりで示唆される。最近の遺伝学上の進歩があった
以前には、診断は筋電図検査での神経伝達の顕著な低下および神経生検の典型的
な知見により支持された。神経生検での典型的な知見として、神経線維の再発性
脱髄および髄再生を示す、いわゆるたまねぎ球の存在が挙げられる。ごく最近の
遺伝学の進歩につれて、「シャルコー・マリー・ツース病」および「圧迫性麻痺
になりやすい遺伝性神経障害」として知られている二つの主要な遺伝性神経障害
は、これら二つの病気の原因となる種々の変異を同定する簡単な血液検査で診断
することができる。
【００５１】 遺伝性神経障害は、世代から世代へと伝えられる遺伝子異常により引き起こさ
れる。これらのいくつかについては、遺伝子欠損が知られており、診断と出生前
のカウンセリングのために検査することが可能である。
【００５２】 上述したように、本方法は、シャルコー・マリー・ツース病（ＣＭＴ）の治療
における治療計画の一部として使用することができる。これは、遺伝性感覚運動
神経障害に与えられた一般用語である。ＣＭＴタイプ１（ＣＭＴ１）は、脱髄ま
たはミエリン鞘の破壊を伴う。いくつかの異なる異常が同定されている。ＣＭＴ
タイプ１Ａは最も一般的には、ＰＭＰ−２２と呼ばれているミエリンタンパク質
をコードする遺伝子の重複により生じ、ＣＭＴタイプ１Ｂは、Ｐｏ糖タンパク質
と呼ばれているミエリンタンパク質における変異により生じる。ＣＭＴＸは、男
性のみに影響を与える遺伝性感覚運動神経障害である。Ｘ染色体上のコネキン（
Ｃｏｎｎｅｘｉｎ）３２と呼ばれているタンパク質をコードする遺伝子における
変異によって引き起こされる。
【００５３】 ある実施例において、本方法は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の重症度を治
療または少なくとも軽減するために使用することができる。本発明によれば、栄
養量のヘッジホッグまたはｐｔｃ治療剤をＡＬＳに冒されたあるいはＡＬＳに冒
される危険性のある動物に投与することができる。
【００５４】 他の実施例において、本方法は、家族性アミロイド神経障害や他の関連する遺
伝性神経障害の治療に用いることができる。アミロイド神経障害は通常、痛み、
感覚欠損、および自律神経機能障害を伴う。トランスサイレチンと呼ばれている
タンパク質における変異により引き起こされ、末梢神経中にアミロイドとしてタ
ンパク質が沈着することが生じる。
【００５５】 本方法は、末梢神経障害の構成要素を有しうる、遺伝性ポルフィリン症の治療
に使用することができる。
【００５６】 本方法を治療のために使用しうるその他の遺伝性神経障害は、遺伝性感覚神経
障害タイプＩＩ（ＨＳＮ ＩＩ）である。
【００５７】 本発明の方法および組成物は、後天性神経障害の治療および維持にも使用する
ことができる。
【００５８】 例えば、ヘッジホッグおよびｐｔｃ治療剤は、糖尿病性神経障害の予防に使用
することができる。糖尿病は神経障害の最も広く知られている原因である。糖尿
病の人々のおよそ１０％に症状が出る。多くの場合、神経障害は主として感覚に
生じ、手と足において痛みと感覚欠損を伴う。しかし、ある種の糖尿病では、一
つもしくはそれ以上の神経に脱力をもたらす、あるいは脚の脱力を起こす腰仙部
の神経叢障害もしくは筋萎縮をもたらす、単発神経炎または多発単神経炎を起こ
す。
【００５９】 本方法はまた、免疫が関与する神経障害の治療において使用することができる
。免疫系の主な機能は、外部から侵入した感染性有機体に対抗して体を守ること
である。しかしながら、ある場合には、免疫系が体に対して作動して、自己免疫
疾患を引き起こす。免疫系は、同様に免疫応答を調節するＴリンパ球および「抗
体」と呼ばれる特殊なタンパク質を分泌するＢリンパ球またはプラズマ細胞を含
む、数種の白血球から成る。時折、知られていない理由で、免疫系は誤って、末
梢神経のような体の一部を攻撃する。これが、「自己免疫」末梢神経障害である
。攻撃される末梢神経の場所と、免疫反応のタイプによって、いくつかの異なっ
たタイプが存在する。以下に、免疫系が関与する神経障害を簡単に説明する。
【００６０】 例えば、ヘッジホッグまたはｐｔｃ治療剤は、ギラン・バレー症候群（ＧＢＳ
）の治療に用いることができる。突然あるいは急激に起こる急性神経障害である
、ギラン・バレー症候群は、発症後数日から数週間以内に、麻痺と呼吸不全に進
行しうる。この神経障害は、免疫系が運動神経と感覚神経のミエリン鞘を破壊す
るときに引き起こされる。この前には、しばしば感染、ワクチン投与、外傷があ
り、それが自己免疫反応の引き金となったものと考えられている。この疾患は、
自己限定的なものであり、６〜８週間以内に自然に回復する。しかし、回復は不
完全なことが多い。
【００６１】 急性的に始まり、また本発明の方法で治療できる他の神経障害として、急性運
動神経障害、急性感覚神経障害、および急性自律性神経障害が挙げられ、そこで
は、それぞれ、運動神経、感覚神経、自律神経に対する免疫攻撃が起こっている
。ミラー・フィッシャー症候群は、眼の凝視麻痺、協調運動障害、および歩行不
安定が生じる、他の異型である。
【００６２】 本方法で治療しうるさらに他の後天性神経障害は、慢性炎症性脱髄性多発神経
障害（ＣＩＤＰ）である。ＣＩＤＰは、ギラン・バレー症候群の慢性型でより無
痛型のものと考えられる。この病気は、ぶり返しと呼ばれる反復攻撃で、あるい
は段階的にもしくは確実に進む形のいずれかで進行する。ＧＢＳの場合と同様に
、抗体およびＴリンパ球によるミエリン鞘の破壊が認められる。しかし、ＣＩＤ
Ｐについての特定の検査はないので、診断は臨床的および実験室的な特徴に基づ
く。
【００６３】 末梢神経に対する抗体での慢性多発性神経障害は、本方法がその治療または予
防に使用されうるさらに他の末梢神経障害である。あるタイプの慢性神経障害に
おいて、神経の特定の構成成分に対する抗体が同定されている。これらには、ミ
エリン随伴糖タンパク質（ＭＡＧ）に対する抗体に伴う脱髄神経障害、ガングリ
オシドＧＭ１またはＧＤ１ａに対する抗体に伴う運動神経障害、および抗スルフ
ァチドまたはＧＤ１ｂガングリオシド抗体に伴う感覚神経障害が含まれる。これ
らの場合の抗体は、神経のタンパク質（糖タンパク質）または脂質（糖脂質もし
くはガングリオシド）に結合しているオリゴ糖または糖様分子に結合する。これ
らの抗体が神経障害の原因であろうと推察される。
【００６４】 本方法は、同様に、末梢神経における血管炎または血管の炎症に伴う神経障害
の治療についての治療計画の一部として使用することができる。神経障害は、血
管炎、つまり末梢神経における血管の炎症によっても引き起こされうる。それは
、末梢神経の経路に沿って小さな「ストローク」を生じ、神経に限定されるか、
あるいはそれは広汎化して、皮膚発疹を含み、あるいは他の器官に広がりうる。
リウマチ様関節炎、狼瘡、結節性動脈周囲炎、またはシェーグレン症候群のよう
ないくつかのリウマチ性疾患は、広汎化した血管炎に伴うものであり、末梢神経
にも広がりうる。血管炎は、損傷の広がりおよび重症度によっては、多発性神経
炎、単発神経炎、または多発単神経炎を引き起こす。
【００６５】 さらに他の実施例において、本発明の方法は、上腕神経叢炎および腰仙神経叢
炎の治療に使用することができる。腋窩の下にある腕神経叢は、腕と手への神経
を含んでいる。上腕神経叢炎は、その神経束の炎症の結果であり、一方または両
方の腕に脱力と痛みをもたらす。骨盤で起こる腰仙神経叢炎は、脚に脱力と痛み
を引き起こす。
【００６６】 ヘッジホッグおよびｐｔｃ治療剤は、単クローン性免疫グロブリン血症に伴う
神経障害の治療に使用するのにも好適でありうる。単クローン性免疫グロブリン
血症においては、骨髄またはリンパ器官中のＢ細胞またはプラズマ細胞の単一の
クローンが増殖して良性のあるいは悪性の腫瘍を形成し、抗体を分泌する。「単
クローン性」とは、抗体の単一クローンが存在するからである。そして、「免疫
グロブリン血症」は、抗体のもう一つの名前であるガンマグロブリンを表す。あ
る場合において、抗体は神経構成成分と反応し、他の場合には、アミロイド沈着
からの抗体のフラグメントである。
【００６７】 本発明のさらに他の態様は、本方法を、腫瘍または新生物に伴う神経障害の治
療に使用することに関する。神経障害は、腫瘍細胞による神経の直接的侵襲ある
いは腫瘍の間接的効果によると考えられる。後者は腫瘍随伴性神経障害と呼ばれ
る。いくつかのタイプが記述されている。例えば、本方法は、肺癌に伴う感覚神
経障害を管理するために使用することができる。この神経障害は、末梢神経の感
覚ニューロンに存在する、Ｈｏと呼ばれるタンパク質に対する抗体に随伴する。
同様に、本方法は、多発性骨髄腫に伴う神経障害を治療するために使用すること
ができる。多発性骨髄腫は、骨髄中の抗体を分泌するプラズマ細胞により引き起
こされる骨の腫瘍である。この腫瘍はプラズマ細胞の単一クローンから成ってお
り、産生する抗体は同一であり、単クローン性である。多発性骨髄腫のある人々
は、末梢神経中の軸索の変性を伴う感覚運動多発性神経障害を患っている。他の
実施例において、本方法は、ワルデンストロームマクログロブリン血症、慢性リ
ンパ性白血病、またはＢ細胞リンパ腫に伴う神経障害を治療するために使用する
ことができる。これらは、脾臓、骨髄、またはリンパ節中の抗体を分泌するＢリ
ンパ球により引き起こされる腫瘍である。これらの抗体は、単クローン性であり
、しばしばＭＡＧ，ＧＭ１、またはスルファチドのような末梢神経構成成分と反
応する。さらに他の実施例では、本発明のヘッジホッグおよびｐｔｃ治療剤は、
神経障害が局所照射の結果であるか、あるいはビンクリスチンおよびシスプラチ
ンのような医薬により引き起こされたものである癌患者の治療のための治療プロ
トコルの一部として用いることができる。
【００６８】 本発明はまた、アミロイドーシスに伴う神経障害治療のための、ヘッジホッグ
およびｐｔｃ治療剤の使用を意図している。アミロイドは、末梢神経に沈着し、
その作動を妨げる物質であり、その障害がアミロイドーシスである。二つの主な
タイプ、すなわち、沈着が単クローン性抗体（上記の単クローン性免疫グロブリ
ン血症の項参照）のフラグメントを有する、原発性アミロイドーシスおよび、沈
着がトランスサイレチンと呼ばれる変異タンパク質を含む遺伝性アミロイドーシ
スが存在する。原発性アミロイドーシスは、通常、単クローン性免疫グロブリン
血症または骨髄腫に随伴する（上記参照）。
【００６９】 本発明のさらに他の態様は、感染症により引き起こされた神経障害を治療する
ための手段としての本方法を提供する。末梢神経障害は、末梢神経の感染症によ
り引き起こされうる。末梢神経障害を引き起こすウイルスとして、徐々に進行す
る感覚神経障害を引き起こすエイズウイルスであるＨＩＶ−Ｉ、急激に進行する
麻痺性神経障害を引き起こすサイトメガロウイルス、帯状疱疹を引き起こす帯状
ヘルペスウイルス、および運動神経障害を引き起こすポリオウイルスが挙げられ
る。Ｂ型およびＣ型肝炎感染は時として、血管炎性の神経障害に随伴する。
【００７０】 神経障害を引き起こす細菌感染症として、斑点状感覚神経障害を引き起こすハ
ンセン氏病および急激に進行する麻痺性神経障害を引き起こすジフテリアが挙げ
られる。神経障害を引き起こす他の感染性疾患として、スピロヘータにより引き
起こされるライム病、および寄生虫により引き起こされるトリパノソーマ症があ
る。両者は、通例、多病巣性神経障害と共に存在する。
【００７１】 栄養不均衡により引き起こされる神経障害も、本方法により治療される障害の
候補である。例えば、ビタミンＢ１２、Ｂ１（チアミン）、Ｂ６（ピリドキシン
）、またはＥの欠乏は、末梢神経の軸索の変性を伴う多発性神経障害をもたらし
うる。これは、貧しい食事、あるいは胃または腸から栄養を吸収することができ
ないことにより生じうる。
【００７２】 さらにビタミンＢ６の大量投与もまた、末梢神経障害を引き起こすことがあり
、本方法は、そのような場合に、解毒プログラムの一部として使用することがで
きる。
【００７３】 本方法のさらに別の使用は、腎疾患において発生する神経障害の治療において
である。慢性腎不全は、末梢神経軸索の変性を伴う主として感覚神経障害を引き
起こしうる。
【００７４】 本発明の他の態様は、甲状腺機能低下神経障害の治療方法を提供する。甲状腺
機能低下症は、ときどき、軸索変性を伴う、痛みのある感覚多発性神経障害を随
伴する。単発神経障害または多発性単神経障害も、膨張した組織により末梢神経
が圧迫されることにより生じうる。
【００７５】 本方法はまた、アルコールおよび毒物により引き起こされる神経障害の治療に
用いることができる。ある種の毒物は末梢神経障害を引き起こしうる。鉛毒は運
動神経障害を伴い、砒素または水銀は感覚神経障害を引き起こす。タリウムは感
覚および自律性神経障害を引き起こしうる。いくつかの有機溶媒および殺虫剤は
また、多発性神経障害を引き起こしうる。アルコールは神経に直接的に毒であり
、アルコールの乱用は神経障害の主たる原因である。本方法は、ある実施例にお
いて、広汎な解毒プログラムの一部として使用することができる。
【００７６】 さらに他の実施例として、本発明の方法および組成物は、薬物により引き起こ
される神経障害も治療に用いることができる。いくつかの薬物が神経障害を引き
起こすことが知られている。それらの薬物として、癌におけるビンクリスチンお
よびシスプラチン、腎盂腎炎に使用されるニトロフルラントイン、心不整脈にお
けるアミオダロン、アルコール症におけるジスルフィラム、エイズにおけるｄｄ
ＣおよびｄｄＩ、並びにハンセン氏病治療に用いられるダプソーンが挙げられる
。上記のように、本方法は、ある実施例において、広汎な解毒プログラムの一部
として使用することができる。
【００７７】 本発明の方法は、また、外傷および圧迫により引き起こされる神経障害の治療
に用いることができる。局所的神経障害が、外的圧力あるいは上にかぶさってい
る腱や他の組織により神経が圧迫されることから生じうる。これらのうちで最も
よく知られたものは、手首の圧迫から生じる手根管症候群、および脊椎からはみ
出したような神経根の圧迫から生じる頚部または腰部神経根障害（坐骨神経痛）
である。神経圧迫がよく起こる他の領域として、ひじ、脇の下、およびひざの後
ろがある。
【００７８】 本方法はまた、種々の突発性神経障害に有用である。「突発性」なる用語は、
神経障害の原因が見出されない場合に使用される。これらの場合、神経障害はそ
の発現にしたがって、すなわち、感覚、運動、または感覚運動突発性多発性神経
障害と、分類される。
【００７９】 本発明の他の態様は、１以上の他の治療剤がヘッジホッグまたはｐｔｃ治療剤
と共に投与される、同席療法を提供する。そのような同席療法は、個々の治療成
分を、同時に、順番に、あるいは別々に投与することにより達成される。本明細
書中に記載した投与量は、治療用組成物中のそのような追加の成分ついて補正す
るように調整される。処置された患者の経過は、慣用の方法でモニターすること
ができる。
【００８０】 ＩＶ．ヘッジホッグ治療化合物の例 本方法のヘッジホッグ治療化合物は、天然由来のタンパク質の精製、遺伝子操
作で製造されたタンパク質および合成化学等の、種々の技術のいずれかにより得
ることができる。ヘッジホッグ治療剤のポリペプチド形態は、好ましくは脊椎動
物ヘッジホッグタンパク質由来のもの、例えば、脊椎動物有機体からの、天然由
来のヘッジホッグタンパク質に対応する配列を有するものあるいはそのフラグメ
ントである。しかしながら、ヘッジホッグポリペプチドは、いかなる後生動物有
機体において生じたヘッジホッグタンパク質（またはそのフラグメント）にも対
応しうるということが認められる。
【００８１】 本治療剤がもたらされる種々の天然由来のヘッジホッグタンパク質は、シグナ
ルペプチド、よく保存されたＮ−末端領域、およびより相違点の多いＣ−末端領
域により特徴付けられる。分泌経路におけるシグナル配列の開裂に加えて（Ｌｅ
ｅ，Ｊ．Ｊ．ら、（１９９２） Ｃｅｌｌ ７１：３３−５０； Ｔａｂａｔａ
，Ｔ，ら、（１９９２） Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． ２６３５−２６４５； Ｃｈ
ａｎｇ， Ｄ．Ｅ．ら，（１９９４） Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２０：３３
３９−３３５３）、ヘッジホッグ前駆体タンパク質は自然に、Ｃ−末端部分にお
ける保存された配列に依存する、内部自己タンパク質分解開裂を起こす（Ｌｅｅ
ら、（１９９４） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６：１５２８−１５３７；Ｐｏｒｔｅ
ｒら、（１９９５） Ｎａｔｕｒｅ ３７４：３６３−３６６）。この自己開裂
は、１９ｋＤのＮ−末端ペプチドおよび２６〜２８ｋＤのＣ−末端ペプチドを与
える（Ｌｅｅら、（１９９２）同上；Ｔａｂａｔａら、（１９９２）同上；Ｃｈ
ａｎｇら、（１９９４）同上；Ｌｅｅら、（１９９４）同上；Ｂｕｍｃｒｏｔ，
Ｄ．Ａ．ら、（１９９５） Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ． １５：２２９４−
２３０３；Ｐｏｒｔｅｒら、（１９９５）同上；Ｅｋｋｅｒ，Ｓ．Ｃ．ら、（１
９９５） Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ． ５：９４４−９５５；Ｌａｉ，Ｃ．Ｊ．ら、
（１９９５） Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２１：２３４９−２３６０）。Ｎ−
末端ペプチドはそれが合成された細胞の表面に強く結合してとどまるが、Ｃ−末
端ペプチドは生体内および生体外の両方に自由に拡散する（Ｌｅｅら、（１９９
４）同上；Ｂｕｍｃｒｏｔら、（１９９５）同上；Ｍａｒｔ’，Ｅ．ら、（１９
９５） Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２１：２５３７−２５４７；Ｒｏｅｌｉｎ
ｋ，Ｈ．ら、（１９９５） Ｃｅｌｌ ８１：４４５−４５５）。内部開裂の正
常な位置で正確にターミネートするＲＮＡでコード化されたヘッジホッグの端を
切り取った形態では生体内（Ｐｏｒｔｅｒら、（１９９５）同上）および生体外
（Ｐｏｒｔｅｒ，Ｊ．Ａ．ら、（１９９６） Ｃｅｌｌ ８６：２１−３４）に
拡散しうることから、Ｎ−末端ペプチドが細胞表面にとどまることは、自己開裂
に依存的である。生化学的な研究から、ヘッジホッグ前駆体タンパク質の自己タ
ンパク質分解開裂は、引き続き求核置換反応において開裂される、内部チオエス
テル中間体を経由して進行することが示されている。求核剤は、小さな親油性分
子、より具体的にはコレステロールであり、これはＮ−ペプチドのＣ−末端部に
共有結合して（Ｐｏｒｔｅｒら、（１９９６）同上）、それを細胞表面につなぎ
とめることが示唆されている。
【００８２】 ヘッジホッグ遺伝子の脊椎動物ファミリーは、少なくとも４つのメンバー、例
えば単一ショウジョウバエヘッジホッグ遺伝子（配列番号１９）のパラローグを
含む。本明細書中でデザート（砂漠）ヘッジホッグ（Ｄｈｈ）、ソニックヘッジ
ホッグ（Ｓｈｈ）およびインディアンヘッジホッグ（Ｉｈｈ）と称するこれらの
メンバーのうちの３つは、明らかに、魚、鳥類、および哺乳類等のすべての脊椎
動物中に存在する。
【００８３】 本明細書中でティギーウインクルヘッジホッグ（Ｔｈｈ）と称する第４のメン
バーは、魚に特異的であると思われる。添付の配列表によれば（同じく表１参照
）、ニワトリＳｈｈポリペプチドは配列番号１によりコードされ、マウスＤｈｈ
ポリペプチドは配列番号２によりコードされ、マウスＩｈｈポリペプチドは配列
番号３によりコードされ、マウスＳｈｈポリペプチドは配列番号４によりコード
され、ゼブラフィッシュＳｈｈポリペプチドは配列番号５によりコードされ、ヒ
トＳｈｈポリペプチドは配列番号６によりコードされ、ヒトＩｈｈポリペプチド
は配列番号７によりコードされ、ヒトＤｈｈポリペプチドは配列番号８によりコ
ードされ、そしてゼブラフィッシュＴｈｈポリペプチドは配列番号９によりコー
ドされている。
【００８４】
【表１】 表１ 配列表中のヘッジホッグ配列の手引き 核酸 アミノ酸 ニワトリＳｈｈ 配列番号１ 配列番号１０ マウスＤｈｈ 配列番号２ 配列番号１１ マウスＩｈｈ 配列番号３ 配列番号１２ マウスＳｈｈ 配列番号４ 配列番号１３ ゼブラフィッシュＳｈｈ 配列番号５ 配列番号１４ ヒトＳｈｈ 配列番号６ 配列番号１５ ヒトＩｈｈ 配列番号７ 配列番号１６ ヒトＤｈｈ 配列番号８ 配列番号１７ ゼブラフィッシュＴｈｈ 配列番号９ 配列番号１８ ショウジョウバエＨＨ 配列番号１９ 配列番号２０
【００８５】 種々のヘッジホッグ同族体間の配列変動に加えて、ヘッジホッグタンパク質は
、プロ型、完全長成熟型、およびそれらのプロセッシングされたフラグメント等
の、明らかに自然界で多くの異なる形態で存在している。プロ型は細胞外ドメイ
ンの直接的分泌のためのＮ−末端シグナルペプチドを含み、一方完全長成熟型は
このシグナル配列を持たない。
【００８６】 上記のように、成熟型のさらなるプロセッシングは、ある例では、生理学的に
活性なタンパク質のフラグメントを産生する。例えば、ソニックヘッジホッグは
、さらなるタンパク質分解プロセッシングを経て、約１９ｋＤａと２７ｋＤａの
二つのペプチドを産生し、１９ｋＤａのフラグメントは、タンパク質分解された
、成熟タンパク質のＮ−末端部分に相当する。
【００８７】 タンパク質分解フラグメントに加えて、タンパク質の細菌産生型（例えば、非
変性型）のものは、生来のタンパク質の生物活性のいくらかを依然として維持し
ているが、脊椎動物ヘッジホッグタンパク質は、また、ステント、脂肪酸等のよ
うな親油性部分のグリコシル化および／または付加等により翻訳後に、修飾する
ことができる。本発明のヘッジホッグポリペプチドの生物活性フラグメントが生
成し、その詳細は、例えばＰＣＴのＷＯ９５/１８８５６号およびＷＯ９６／１
７９２４号明細書に記載されている。
【００８８】 ヘッジホッグポリペプチドがそれによって誘導体化されうる広汎な親油性基が
存在する。ヘッジホッグペプチドに付随する文脈中での「親油性基」なる用語は
、それによって脂質相に高い親和性を付与しうる高い炭化水素含量を有する基を
意味する。親油性基は、例えば、およそ７〜３０の炭素数を有する比較的長鎖の
アルキル基またはシクロアルキル基（好ましくはｎ−アルキル基）である。アル
キル基は、ヒドロキシルまたは一級アミン「末尾」を末端基として有しうる。さ
らに例示すれば、親油性分子として、脂肪酸、ステロール、エステルおよびアル
コールのような天然由来のおよび合成の芳香族または非芳香族部分、他の脂質分
子、アダマンタンやフラーレンのようなかご型構造体、並びにベンゼン、ペリレ
ン、フェナントレン、アントラセン、ナフタレン、ピレン、クリセン、およびナ
フタセンのような芳香族炭化水素が挙げられる。
【００８９】 一つの実施例において、ヘッジホッグポリペプチドは、コレステロールのよう
な１以上のステロールで修飾される。例えば、ＰＣＴのＷＯ９６/１７９２４号
明細書を参照のこと。ある実施例において、コレステロールは、天然由来のＮ−
末端タンパク質分解フラグメントに対応するヘッジホッグポリペプチドであるＣ
−末端グリシンに付加することが好ましい。
【００９０】 他の実施例において、ヘッジホッグポリペプチドは、ミリストイル、パルミト
イル、ステアロイル、またはアラキドニル基のような脂肪酸部分で修飾すること
ができる。例えば、Ｐｅｐｉｎｓｋｙら、（１９９８） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ ２７３：１４０３７参照。
【００９１】 タンパク質の細胞外フラグメントのＣ−末端へのコレステロールの付加あるい
はＮ−末端への脂肪酸の付加により認められるこれらの効果に加えて、ヘッジホ
ッグ遺伝子産物の生理学的活性の少なくともいくらかは、タンパク質の他の部位
を脂溶性部分でタンパク質の誘導体化を行うか、あるいはコレステロールまたは
脂肪酸以外の部分によって、予期しないほどに増強される。本発明のある態様は
、タンパク質の自然にプロセッシングされた形態のＮ−末端もしくはＣ−末端残
基以外の部位で修飾された、および／またはＣ−末端でのステロールもしくはＮ
−末端での脂肪酸以外の脂溶性部分でそのような末端残基を修飾された、ヘッジ
ホッグポリペプチドの製剤の使用に関する。
【００９２】 脂溶性分子としてとくに有用なものは、脂環式炭化水素、飽和および不飽和脂
肪酸並びに他の脂質およびリン脂質部分、ワックス、コレステロール、イソプレ
ノイド、テルペン、並びにアダマンタンやフラーレン等の多環式炭化水素、ビタ
ミン、ポリエチレングリコールまたはオリゴエチレングリコール、（Ｃ１−Ｃ１
８）−アルキルホスフェートジエステル、−ＯＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）−Ｏ−（Ｃ
１２−Ｃ１８）−アルキル、そして、とくにピレン誘導体の結合体である。脂溶
性部分は脂溶性染料であってもよく、本発明で好適に使用されるものとして、こ
れらに限定されるものではないが、ジフェニルヘキサトリエン、ナイルレッド、
Ｎ−フェニル−１−ナフチルアミン、プロダン、ラウロダン、ピレン、ペリレン
、ローダミン、ローダミンＢ、テトラメチルローダミン、テキサスレッド、スル
ホローダミン、１，１’−ジドデシル−３，３，３’、３’−テトラメチルイン
ドカルボシアニン、パークロレート、オクタデシルローダミンＢ、およびＭｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｉｎｃ．から入手できるＢＯＤＩＰＹ染料が挙げ
られる。
【００９３】 他の脂溶性部分の例は脂肪族カルボニル基であり、１−もしくは２−アダマン
チルアセチル、３−メチルアダマント−１−イルアセチル、３−メチル−３−ブ
ロモ−１−アダマンチルアセチル、１−デカリンアセチル、カンファーアセチル
、カンファンアセチル、ノルアダマンチルアセチル、ノルボルナンアセチル、ビ
シクロ〔２．２．２〕−オクト−５−エンアセチル、１−メトキシビシクロ〔２
．２．２〕−オクト−５−エン−２−カルボニル、シスー５−ノルボルネン−エ
ンド−２，３−ジカルボニル、５−ノルボルネン−２−イルアセチル、（１Ｒ）
−（−）−ミルテンタンアセチル、２−ノルボルナンアセチル、アンチ−３−オ
キソ−トリシクロ〔２．２．１．０＜２，６＞〕ヘプタン−７−カルボニル、デ
カノイル、ドデカノイル、ドデセノイル、テトラデカジエノイル、デシノイル、
またはドデシノイルが挙げられる。
【００９４】 ヘッジホッグポリペプチドは、化学的結合手段または遺伝子工学による等の、
多くの方法により脂溶性部分に結合することができる。
【００９５】 当業者に公知の多くの化学的架橋剤が存在する。本発明に対して、好ましい架
橋剤は、ヘテロ二官能性架橋剤であり、これはヘッジホッグポリペプチドと疎水
性部分を段階的に結合させるのに使用することができる。ヘテロ二官能性架橋剤
は、タンパク質への接合のより特異的な結合方法をデザインする可能性を提供し
、これにより単独タンパク質ポリマーのような望まない副反応が生じるのを減少
させる。広汎なヘテロ二官能性架橋剤がこの分野で公知である。これらには、ス
クシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシ
レート（ＳＭＣＣ），ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ
ドエステル（ＭＢＳ）、Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベ
ンゾエート（ＳＩＡＢ）、スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブ
チレート（ＳＭＰＢ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カル
ボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）；４−スクシンイミジルオキシカルボニル−ａ−メ
チル−ａ−（２−ピリジルチオ）−トルエン（ＳＭＰＴ）、Ｎ−スクシンイミジ
ル（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル６−
〔３−（２−ピリジルチオ）プロピオネート〕ヘキサノエート（ＬＣ−ＳＰＤＰ
）が含まれる。Ｎ−ヒドロスクシンイミド部分を有するそれらの架橋剤は、一般
により高い水溶性を有するＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド類縁体として得
ることができる。さらに、結合鎖中にジスルフィドブリッジを有するそれらの架
橋剤は、生体内でのリンカーの開裂量を減らすように、アルキル誘導体として代
わりに合成することができる。
【００９６】 ヘテロ二官能性架橋剤以外に、ホモ二官能性架橋剤や光反応性架橋剤等の多く
の他の架橋剤が存在する。ジスクシンイミジルスベレート（ＤＳＳ）、ビスマレ
イミドヘキサン（ＢＭＨ）およびジメチルピメルイミデート−２ＨＣｌ（ＤＭＰ
）は有用なホモ二官能性架橋剤の例である。また、ビス−〔β−（４−アジドサ
リシルアミド）エチル〕ジスルフィド（ＢＡＳＥＤ）およびＮ−スクシンイミジ
ル−６−（４’−アジド−２’−ニトロフェニルアミノ）ヘキサノエート（ＳＡ
ＮＰＡＨ）は、本発明で用いられる、有用な光反応性架橋剤である。タンパク質
結合技術の最近の総説として、本明細書に参照で組み入れられる、Ｍｅａｎｓら
、（１９９０） Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １：２−１
２を参照されたい。
【００９７】 一つのとくに有用な種類のヘテロ二官能性架橋剤は、上記に含まれる、一級ア
ミン反応性基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）またはその水溶性類縁
体、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ−ＮＨＳ）を含有する。アル
カリ性のｐＨで一級アミン（リジンイプシロン基）はプロトン化されておらず、
ＮＨＳまたはスルホ−ＮＨＳ上で求核攻撃により反応する。この反応は、アミド
結合の生成と、副生成物としてのＮＨＳまたはスルホ−ＮＨＳの遊離をもたらす
。
【００９８】 ヘテロ二官能性架橋剤の一部として有用な他の基は、チオール反応性基である
。通常のチオール反応性基としてはマレイミド、ハロゲン、およびピリジルジス
ルフィドが挙げられる。マレイミドは遊離のスルフヒドリル（システイン残基）
と、少し酸性から中性（ｐＨ６．５〜７．５）の条件下、数分で特異的に反応す
る。ハロゲン（ヨードアセチル官能基）は生理的なｐＨで−ＳＨ基と反応する。
これらの反応性基の両方が安定なチオエーテル結合の生成をもたらす。
【００９９】 ヘテロ二官能性架橋剤の第三の成分は、スペーサー鎖またはブリッジ（橋かけ
）である。ブリッジは二つの反応性末端を結ぶ構造である。ブリッジの最も明確
な属性は、立体障害に対するその効果である。いくつかの例では、より長いブリ
ッジは、二つの複雑なバイオ分子をリンクするのに必要な距離を容易に補うこと
ができる。例えば、ＳＭＰＢは１４．５オングストロームの長さ（スパン）を有
している。
【０１００】 ヘテロ二官能性架橋剤を用いるタンパク質−タンパク質結合体の調製は、アミ
ン反応とスルフヒドリル反応を含む二段階プロセスである。第一段階、アミン反
応では、選択されるタンパク質は一級アミンを含んでいなければならない。これ
は、リジンイプシロンアミンまたは大部分のタンパク質のＮ−末端に見出される
一級アルファアミンでありうる。このタンパク質は遊離のスルフヒドリル基を有
していてはならない。結合される両方のタンパク質が遊離のスルフヒドリル基を
含んでいる場合は、一方のタンパク質を、例えばＮ−エチルマレイミドを用いて
すべてのスルフヒドリルがブロックされるように修飾することができる（Ｐａｒ
ｔｉｓら、（１９８３）Ｊ．Ｐｒｏ．Ｃｈｅｍ． ２：２６３参照、本明細書に
参照で組み入れられる）。エルマン試薬をある特定のタンパク質中のスルフヒド
リルの量を算出するために用いることができる（例えば、Ｅｌｌｍａｎら、（１
９５８） Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ． ７４：４４３および
Ｒｉｄｄｌｅｓら、（１９７９） Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． ９４：７５参
照、本明細書に参照で組み入れられる）。
【０１０１】 反応用緩衝液は外来のアミンやスルフヒドリルを含まないものである必要があ
る。反応用緩衝液のｐＨは７．０〜７．５である必要がある。このｐＨ範囲は、
マレイミド基がアミンと反応することを防ぎ、マレイミド基をスルフヒドリルと
の第二の反応のために保存する。
【０１０２】 架橋剤を含有するＮＨＳ−エステルは不十分な水溶性を有する。それらは、架
橋剤を反応混合物に加える前に、最少量の有機溶媒（ＤＭＦまたはＤＭＳＯ）に
溶解しなければならない。架橋剤／溶媒は、反応を生起させうるエマルジョンを
形成する。
【０１０３】 スルホ−ＮＨＳ−エステルは、より水溶性であり、反応用緩衝液に直接加える
ことができる。高イオン強度の緩衝液は、スルホ−ＮＨＳ−エステルを「塩析」
する傾向があるので、避けるべきである。加水分解による反応性の損失を避ける
ために、架橋剤はタンパク質溶液を溶解した直後に反応混合物に加える。
【０１０４】 反応は、濃縮タンパク質溶液中でより効率的である。反応混合物のｐＨがより
アルカリ性であればあるほど、反応の速度はより速い。ＮＨＳおよびスルホ−Ｎ
ＨＳエステルの加水分解速度もまた、ｐＨが高くなるにつれて増大する。より高
い温度は、加水分解とアシル化の両方の反応速度を増大させる。
【０１０５】 反応が完結すると、第一のタンパク質がスルフヒドリル反応性部分で活性化さ
れる。活性化されたタンパク質は、簡単なゲルろ過あるいは透析により反応混合
物から単離しうる。第二段階の架橋、スルフヒドリル反応を行うために、マレイ
ミド、活性化ハロゲン、またはピリジルジスルフィドとの反応のために選ばれた
脂溶性基は、遊離のスルフヒドリルを有していなければならない。あるいは、一
級アミンをスルフヒドリルを付加するために修飾しうる。
【０１０６】 すべてのケースで、緩衝液はスルフヒドリル基の酸化を防ぐために、脱気する
必要がある。ＥＤＴＡを、緩衝液中に存在しうるすべての酸化性金属をキレート
化するために加えてもよい。緩衝液は、スルフヒドリルを含有する化合物を一切
含んでいてはならない。
【０１０７】 マレイミドは、やや酸性から中性のｐＨ範囲（６．５〜７．５）で−ＳＨ基と
特異的に反応する。ハロゲンおよびピリジルジスルフィドを含む反応については
、中性のｐＨで充分である。これらの条件下で、マレイミドは一般に−ＳＨ基と
おおむね数分以内に反応する。ハロゲンおよびピリジルジスルフィドについては
、より長い反応時間が必要である。
【０１０８】 アミン反応ステップで調製された第１のスルフヒドリル反応性タンパク質を、
スルフヒドリル含有親油性基と適当な緩衝条件下で混合する。これらの結合体を
反応混合物から、ゲル濾過等の方法により又は透析により単離することができる
。
【０１０９】 典型的な結合のために活性化された親油性部分には、Ｎ−(１−ピレン)マレイ
ミド；２，５−ジメトキシスチルベン−４’−マレイミド，エオシン−５−マレ
イミド；フルオレセイン−５−マレイミド；Ｎ−(４−(６−ジメチルアミノ−２
−ベンゾフラニル)フェニル)マレイミド；ベンゾフェノン−４−マレイミド；４
−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−マレイミド(ＤＡＢＭＩ)、テト
ラメチルローダミン−５−マレイミド、テトラメチルローダミン−６−マレイミ
ド、ローダミンレッドＴＭ Ｃ２マレイミド、Ｎ−(５−アミノペンチル)マレイ
ミド、トリフルオロ酢酸塩、Ｎ−(２−アミノエチル)マレイミド、トリフルオロ
酢酸塩、オレゴングリーンＴＭ４８８マレイミド、Ｎ−(２−((２−(((４−アジ
ド−２，３，５，６−テトラフルオロ)ベンゾイル)アミノ)エチル)ジチオ)エチ
ル)マレイミド(ＴＦＰＡＭ−ＳＳ１)、２−(１−(３−ジメチルアミノプロピル)
インドール−３−イル)−３−(インドール−３−イル)マレイミド(ビシンドリル
マレイミド；ＧＦ１０９２０３Ｘ)、ＢＯＤＩＰＹ(登録商標)ＦＬ Ｎ−(２−ア
ミノエチル)マレイミド、Ｎ−(７−ジメチルアミノ−４−メチルクマリン−３−
イル)マレイミド(ＤＡＣＭ)、ＡｌｅｘａＴＭ４８８Ｃ５マレイミド、Ａｌｅｘ
ａＴＭ５９４Ｃ５マレイミド、Ｎ−(１−ピレン)マレイミドナトリウム塩、２，
５−ジメトキシスチルベン−４’−マレイミド、エオシン−５−マレイミド、フ
ルオレセイン−５−マレイミド、Ｎ−(４−(６−ジメチルアミノ−２−ベンゾフ
ラニル)フェニル)マレイミド、ベンゾフェノン−４−マレイミド、４−ジメチル
アミノフェニルアゾフェニル−４’−マレイミド、１−(２−マレイミジルエチ
ル)−４−(５−(４−メトキシフェニル)オキサゾール−２−イル)ピリジニウム
メタンスルホネート、テトラメチルローダミン−５−マレイミド、テトラメチル
ローダミン−６−マレイミド、ローダミンレッドＴＭ Ｃ２マレイミド、Ｎ−(
５−アミノペンチル)マレイミド、Ｎ−(２−アミノエチル)マレイミド、Ｎ−(２
−((２−(((４−アジド−２，３，５，６−テトラフルオロ)ベンゾイル)アミノ)
エチル)ジチオ)エチル)マレイミド、２−(１−(３−ジメチルアミノプロピル)イ
ンドール−３−イル)−３−(インドール−３−イル)マレイミド、Ｎ−(７−ジメ
チルアミノ−４−メチルクマリン−３−イル)マレイミド(ＤＡＣＭ)、１１Ｈ−
ベンゾ[ａ]フルオレン、ベンゾ[ａ]ピレンが含まれる。
【０１１０】 一具体例において、このヘッジホッグポリペプチドは、ピレンマレイミドを用
いて誘導することができ、これは、Molecular Probes (オレゴン、Eugene)から
購入できる(例えば、Ｎ−(１−ピレン)マレイミド又は１−ピレンメチルヨード
アセテート(ＰＭＩＡエステル))。
【０１１１】 疎水性部分がポリペプチドである具体例について、この発明の改変したヘッジ
ホッグポリペプチドは、ヘッジホッグポリペプチド及び疎水性部分を含む一本の
連続したポリペプチド鎖としての融合タンパク質として構築することができる。
【０１１２】 ある具体例において、親油性部分は、両親媒性ポリペプチド例えばマゲイニン
、セクロピン、アタシン、メチリン、グラミシジンＳ、黄色ブドウ球菌のアルフ
ァ−トキシン、アラメチシン又は合成の両親媒性ポリペプチドである。ウイルス
粒子からのフソゲニックコートタンパク質も又、主題のヘッジホッグタンパク質
のための便利な両親媒性配列の起源である。
【０１１３】 その上、突然変異誘発も又、例えば、治療効果若しくは予防効果又は安定性(
例えば、生体外での貯蔵安定性及びイン・ビボでのタンパク質分解に対する耐性
)を増大させる等の目的のために、改変ｈｈポリペプチドを造るのに利用するこ
とができる。かかる改変されたペプチドは、例えば、アミノ酸置換、欠失又は付
加により生成することができる。改変ヘッジホッグポリペプチドは又、天然のヘ
ッジホッグタンパク質と比べて変化された翻訳後プロセッシング(例えば、変化
したグリコシル化、コレステロール化、プレニル化等)を受けたものをも包含す
ることができる。
【０１１４】 一具体例において、このヘッジホッグ治療剤は、緊縮条件下でSEQ ID NO:１〜
７の少なくとも１つに表されたヘッジホッグコード配列にハイブリダイズするヌ
クレオチド配列によりコードされ得るポリペプチドである。ＤＮＡハイブリダイ
ゼーションを促進する適当な緊縮条件例えば６．０×塩化ナトリウム／クエン酸
ナトリウム(ＳＳＣ)(４５℃)とその後の２．０×ＳＳＣ(５０℃)は、当業者に公
知であり、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y
.(1989), 6.3.1-6.3.6中に見出すことができる。例えば、洗浄ステップでの塩濃
度は、約２．０×ＳＳＣ(５０℃)の低緊縮から約０．２×ＳＳＣ(５０℃)の高緊
縮から選択することができる。加えて、洗浄ステップでの温度は、室温約２２℃
の低緊縮条件から約６５℃の高緊縮条件まで増すことができる。
【０１１５】 文献中に記載されているように、他のヘッジホッグタンパク質(例えば、他の
動物からのもの)の遺伝子は、ｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡ試料から当分野で周知
の技術を用いて得ることができる。例えば、ヘッジホッグタンパク質をコードす
るｃＤＮＡは、全ｍＲＮＡを細胞例えば哺乳動物細胞例えばヒト細胞(胎児細胞
を含む)から単離することにより得ることができる。この全ｍＲＮＡから、次い
で、二本鎖ｃＤＮＡを調製し、その後、適当なプラスミド又はバクテリオファー
ジベクターに多くの公知の技術の何れか１つを用いて挿入する。ヘッジホッグタ
ンパク質をコードする遺伝子は又、確立されたポリメラーゼ連鎖反応技術を用い
てクローン化することもできる。
【０１１６】 好適な核酸は、SEQ ID NO:８〜１４よりなる群から選択するアミノ酸配列と少
なくとも６０％相同又は同一の、一層好ましくは７０％相同又は同一の、最も好
ましくは８０％相同又は同一のアミノ酸配列を含むヘッジホッグポリペプチドを
コードする。SEQ ID NO:８〜１４の１つに表されているアミノ酸配列と少なくと
も約９０％の、一層好ましくは少なくとも約９５％の、最も好ましくは少なくと
も約９８〜９９％の相同性又は同一性を有するポリペプチドをコードする核酸も
又、この発明の範囲内にある。
【０１１７】 天然のヘッジホッグタンパク質に加えて、本発明により好適とされるヘッジホ
ッグポリペプチドは、SEQ ID NO:８〜１４の何れかにより表されるアミノ酸配列
と少なくとも６０％相同又は同一、一層好ましくは７０％相同又は同一、最も好
ましくは８０％相同又は同一である。SEQ ID NO:８〜１４よりなる群から選択す
る配列と少なくとも９０％、一層好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは
少なくとも約９８〜９９％相同又は同一であるポリペプチドも又、この発明の範
囲内にある。唯一の必要条件は、ヘッジホッグポリペプチドが抹消神経細胞の生
育状態を調節することができることである。
【０１１８】 用語「組換えタンパク質」は、組換えＤＮＡ技術により生成される本発明のポ
リペプチドをいい、該技術では、一般に、ヘッジホッグポリペプチドをコードす
るＤＮＡを、適当な発現ベクターに挿入し、更に、それを用いて、宿主細胞をト
ランスフォームして異種性タンパク質を生成する。その上、組換えヘッジホッグ
遺伝子に関して、句「由来の」は、「組換えタンパク質」の意味に、天然のヘッ
ジホッグタンパク質のアミノ酸配列を有するか又はそれに類似のアミノ酸配列を
有するものを含めることを意味しており、後者は、このタンパク質の天然型の置
換及び欠失(切り詰めを含む)を含む突然変異により生成される。
【０１１９】 本発明の方法は又、天然のヘッジホッグポリペプチドの変異型(例えば、突然
変異体)を用いて実施することもできる。
【０１２０】 当分野で公知のように、ヘッジホッグポリペプチドは、標準的な生物学的技術
又は化学合成により生成することができる。例えば、主題のポリペプチドをコー
ドするヌクレオチド配列の発現を指示する核酸ベクターを用いてトランスフェク
トした宿主細胞を、適当な条件下で培養して、そのペプチドを発現させることが
できる。このポリペプチドヘッジホッグは、分泌され得て、その組換えヘッジホ
ッグポリペプチドを含む細胞と培地の混合物から単離することができる。或は、
このペプチドを、そのシグナルペプチド配列を組換えヘッジホッグ遺伝子から除
去することにより、細胞質に保持させることができ、それらの細胞を集めて溶解
させてこのタンパク質を単離することができる。細胞培養物は、宿主細胞、培地
及び他の副生物を含んでいる。細胞培養のための適当な培地は、当分野で周知で
ある。組換えヘッジホッグポリペプチドは、細胞培養培地、宿主細胞又はこれら
の両方から、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、限
外濾過、電気泳動及びかかるペプチドに特異的な抗体を用いるイムノアフィニテ
ィー精製を含むタンパク質の精製のための当分野で公知の技術を用いて単離する
ことができる。好適具体例において、この組換えヘッジホッグポリペプチドは、
ヘッジホッグ／ＧＳＴ融合蛋白質等の精製を容易にするドメインを含む融合蛋白
質である。宿主細胞は、任意の原核又は真核細胞であってよい。
【０１２１】 組換えヘッジホッグ遺伝子は、ヘッジホッグタンパク質又はその部分をコード
する核酸を、原核細胞、真核細胞又はその両方での発現のための適当なベクター
に連結することにより生成することができる。主題のヘッジホッグポリペプチド
の組換え型の生成のための発現ベクターは、プラスミド及びその他のベクターを
包含する。例えば、ヘッジホッグポリペプチドの発現に適したベクターには、次
の型のプラスミドが含まれる：ｐＢＲ３２２由来のプラスミド、ｐＥＭＢＬ由来
のプラスミド、ｐＥＸ由来のプラスミド、ｐＢＴａｃ由来のプラスミド及びｐＵ
Ｃ由来のプラスミド(原核細胞例えば大腸菌における発現用)。
【０１２２】 酵母における組換えタンパク質の発現のための多くのベクターがある。例えば
、ＹＥＰ２４、ＹＩＰ５、ＹＥＰ５１、ＹＥＰ５２、ｐＹＥＳ２及びＹＲＰ１７
は、Ｓ．セレビシエへの遺伝子構築物の導入に有用なクローニング用及び発現用
のビヒクルである(例えば、Broach等(1983)Experimental Manipulation of Gene
Expression, M. Inouye編, Academic Press, p83(参考として本明細書中に援用
する)を参照されたい)。これらのベクターは、ｐＢＲ３２２ｏｒｉの存在のため
に大腸菌中で複製することができ、酵母２ミクロンプラスミドの複製デターミナ
ントのためにＳ．セレビシエ中で複製することができる。加えて、薬物(例えば
、アンピシリン)に対する耐性マーカーを利用することができる。説明のための
具体例において、ヘッジホッグポリペプチドを、SEQ ID NO:１〜７に表されたヘ
ッジホッグ遺伝子の１つのコード配列のサブクローニングにより生成した発現ベ
クターを用いて、組換えにより生成することができる。
【０１２３】 好適な哺乳動物の発現ベクターは、細菌中でのそのベクターの増殖を促進する
ための原核生物の配列と、真核細胞で発現させる少なくとも１つの真核生物の転
写ユニットの両方を含む。ｐｃＤＮＡＩ／ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ／ｎｅo、ｐＲ
ｃ／ＣＭＶ、ｐＳＶ２ｇｐｔ、ｐＳＶ２ｎｅo、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ、ｐＴｋ２
、ｐＲＳＶｎｅo、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＴ７、ｐｋｏ−ｎｅo及びｐＨｙｇ由来のベ
クターは、真核細胞のトランスフェクションに適した哺乳動物用発現ベクターの
例である。これらのベクターの幾つかは、原核細胞及び真核細胞の両方での複製
及び薬物耐性選択を促進するように細菌プラスミド例えばｐＢＲ３２２からの配
列により改変されている。或いは、ウイルス例えばウシパピローマウイルス(Ｂ
ＰＶ−１)又はエプスタイン−バールウイルス(ｐＨＥＢｏ、ｐＲＥＰ由来の及び
ｐ２０５)の誘導体を、真核細胞におけるタンパク質の一過性の発現に利用する
ことができる。プラスミドの調製及び宿主生物のトランスフォーメーションにお
いて用いられる様々な方法は、当分野で公知である。原核及び真核細胞の両方の
ための他の適当な発現系並びに一般的組換え手順については、Molecular Clonin
g A Laboratory Manual, 第二版、Sambrook, Fritsch及びManiatis編, (Cold Sp
ring Harbor Laboratory Press: 1989)第１６及び１７章を参照されたい。
【０１２４】 幾つかの例においては、組換えヘッジホッグポリペプチドを、バキュウロウイ
ルス発現系を用いて発現させるのが望ましいであろう。かかるバキュウロウイル
ス発現系の例には、ｐＶＬ由来のベクター(例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１
３９３及びｐＶＬ９４１)、ｐＡｃＵＷ由来のベクター(例えば、ｐＡｃＵＷ１)
及びｐＢｌｕｅＢａｃ由来のベクター(例えば、β−ｇａｌ含有ｐＢｌｕｅＢａ
ｃＩＩＩ)が含まれる。
【０１２５】 Ｎ末端部分を欠いた形態(即ち、シグナルペプチドを欠く、切り詰めた変異体)
等のように、ヘッジホッグタンパク質の一部分のみを発現させるのが望ましい場
合には、開始コドン(ＡＴＧ)を発現させるべき所望の配列を含むオリゴヌクレオ
チド断片に加えることが必要であり得る。Ｎ末端位置のメチオニンを酵素メチオ
ニンアミノペプチダーゼ(ＭＡＰ)の利用により酵素的に開裂させることができる
ことは、当分野では周知である。ＭＡＰは、大腸菌(Ben-Bassat等(1987)J.Bacte
riol.169:751-757)及びネズミチフス菌においてクローン化されており、そのイ
ン・ビトロ活性が、組換えタンパク質について示されている(Miller等(1987)PNA
S 84:2718-1722)。それ故、Ｎ末端メチオニンの除去は(所望であれば)、ヘッジ
ホッグ由来のポリペプチドを、ＭＡＰを生成する宿主(例えば、大腸菌又はＣＭ
８９又はＳ．セレビシエ)中で発現させることによりイン・ビボで、又は、精製
ＭＡＰの利用によりイン・ビトロで達成することができる(例えば、Miller等の
手順、前書)。
【０１２６】 或は、ポリペプチドのコード配列は、異なるポリペプチドをコードするヌクレ
オチド配列を含む融合遺伝子の部分として取り込まれ得る。融合蛋白質も又タン
パク質の発現を容易にするということは広く認められており、従って、本発明の
ヘッジホッグポリペプチドの発現で用いることができる。例えば、ヘッジホッグ
ポリペプチドは、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ(ＧＳＴ融合)タンパク
質として生成することができる。かかるＧＳＴ融合タンパク質は、例えば、グル
タチオン由来のマトリクスを利用することにより、ヘッジホッグポリペプチドの
容易な精製を可能にすることができる(例えば、Current Protocols in Molecula
r Biology, Ausubel等編(N.Y.: John Wiley & Sons, 1991)を参照されたい)。他
の具体例において、精製用リーダー配列例えばポリ−(Ｈｉｓ)／エンテロキナー
ゼ開裂部位配列をコードする融合遺伝子を用いて、ヘッジホッグタンパク質のＮ
末端に自然に存在するシグナル配列を置き換えることができる(例えば、プロ型
、Ｎｉ２＋金属樹脂を用いて、アフィニティークロマトグラフィーによるポリ(
Ｈｉｓ)−ヘッジホッグタンパク質の精製を可能にするため。その後、この精製
用リーダー配列は、エンテロキナーゼ処理により除去することができる(例えば
、Hochuli等(1987)J.Chromatography 411:177；及びJanknecht等 PNAS 88:8972
を参照されたい)。
【０１２７】 融合遺伝子を製造する技術は、当業者に公知である。本質的に、異なるポリペ
プチド配列をコードする様々なＤＮＡ断片の結合は、慣用の技術に従って行われ
るが、該技術では、連結のための鈍端化又は食違い末端化、適当な末端を与える
ための制限酵素消化、粘着性末端の充填(適宜)、望ましくない結合を避けるため
のアルカリホスファターゼ処理、及び酵素的連結を用いる。他の具体例において
は、融合遺伝子を、自動化ＤＮＡシンセサイザーを含む慣用の技術により合成す
ることができる。或は、遺伝子断片のＰＣＲ増幅を、２つの連続する遺伝子断片
間の相補的オーバーハングを生じさせるアンカープライマーを用いて行うことが
でき、これはその後アニールさせてキメラ遺伝子配列を生成することができる(
例えば、Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel等編、John Wiley
& Sons: 1992参照)。
【０１２８】 ヘッジホッグポリペプチドは又、他の化学的部分例えばグリコシル基、コレス
テロール、イソプレノイド、脂質、ホスフェート、アセチル基等との共有結合又
は凝集結合の形成により、化学的に改変してヘッジホッグ誘導体を造ることがで
きる。ヘッジホッグタンパク質の共有結合による誘導体は、化学的部分を、この
タンパク質のアミノ酸側鎖上の官能基に又はこのポリペプチドのＮ末端若しくは
Ｃ末端の官能基に結合することにより製造することができる。
【０１２９】 例えば、ヘッジホッグタンパク質は、細胞外マトリクスの成分に結合して類似
体の細胞表面への局在化を促進する、そのタンパク質に自然に結合している配列
以外の部分を含むように生成することができる。例えば、フィブロネクチン「Ｉ
ＩＩ型リピート」に由来する配列例えばテトラペプチド配列Ｒ−Ｇ−Ｄ−Ｓ(Pie
rschbacher等(1984)Nature 309:30-3；及びKornblihtt等(1985)EMBO 4:1755-9)
をヘッジホッグポリペプチドに加えて、キメラ分子の結合性ＥＣＭ成分による細
胞への付着を支持することができる(Ruoslahti等(1987)Science 238:491-497；P
ierschbacheret等(1987)J.Biol.Chem.262:17294-8；Hynes(1987)Cell 48:549-54
；及びHynes(1992)Cell 69:11-25)。
【０１３０】 好適具体例において、このヘッジホッグポリペプチドを、通常ヘッジホッグポ
リペプチドと結合し得る他の細胞性タンパク質特に他の細胞外又は細胞表面結合
性タンパク質から単離し、或は、実質的に他の細胞性タンパク質を含まない(ヘ
ッジホッグポリペプチドとの融合タンパク質の型を除く)。用語「実質的に他の
細胞性又は細胞外タンパク質を含まない」(ここでは、夾雑タンパク質とも呼ぶ)
又は「実質的に純粋な調製物」又は「精製調製物」は、２０％(乾燥重量)未満の
好ましくは５％未満の夾雑タンパク質を有するヘッジホッグポリペプチドの調製
物を包含すると定義する。「精製された」は、示された分子が、他の生物学的巨
大分子例えば他のタンパク質の実質的な非存在下で存在することを意味する。用
語「精製された」は、ここで用いる場合、好ましくは、少なくとも８０乾燥重量
％、一層好ましくは９５〜９９重量％の範囲、最も好ましくは少なくとも９９．
８重量％の存在する同じ型の生物学的巨大分子を意味する(但し、水、緩衝剤、
その他の低分子特に分子量５０００未満を有する分子は、存在してよい)。用語
「純粋な」は、ここで用いる場合、好ましくは、直前の「精製された」と同じ数
値限定を有する。
【０１３１】 組換えポリペプチドについて上記したように、単離されたヘッジホッグポリペ
プチドは、SEQ ID NO:１０〜１８又は２０の何れかで表されたアミノ酸配列又は
それらに相同な配列の全部又は一部分を含むことができる。主題のヘッジホッグ
タンパク質の好適な断片は、成熟タンパク質のＮ末端及びＣ末端タンパク質分解
断片に対応する。ヘッジホッグポリペプチドの生物学的に活性な断片は、ＰＣＴ
公開ＷＯ９５／１８８５６及びＷＯ９６／１７９２４に非常に詳しく記載されて
いる。
【０１３２】 ヘッジホッグポリペプチドの生物学的に活性な断片に関して、好適なヘッジホ
ッグ治療剤は、ヘッジホッグポリペプチドの少なくとも５０(隣接)アミノ酸残基
を、一層好ましくは少なくとも１００(隣接)、尚一層好ましくは少なくとも１５
０(隣接)残基を含む。
【０１３３】 ヘッジホッグ治療剤に含まれ得る他の好適なヘッジホッグポリペプチドは、分
子量約１９ｋＤａを有する成熟タンパク質のＮ末端断片である。
【０１３４】 好適なヒトのヘッジホッグタンパク質は、SEQ ID NO:１５の残基２４〜１９７
、SEQ ID NO:１６の残基２８〜２０２及びSEQ ID NO:１７の残基２３〜１９８に
ほぼ対応するＮ末端断片を含む。「ほぼ対応する」は、関心ある配列が、長さに
おいて、参照配列と最大で２０アミノ酸残基異なることを意味する(もっとも、
一層好ましくは、最大で５、１０又は１５アミノ酸長だけ異なる)。
【０１３５】 組換えポリペプチドについて上記したように、単離されたヘッジホッグポリペ
プチドは、SEQ ID NO:８、SEQ ID NO:９、SEQ ID NO:１０、SEQ ID NO:１１、SE
Q ID NO:１２、SEQ ID NO:１３及びSEQ ID NO:１４で表されるアミノ酸配列又は
それらと相同な配列の全部又は一部分を含むことができる。主題のヘッジホッグ
タンパク質の好適な断片は、成熟タンパク質のＮ末端及びＣ末端タンパク質分解
断片に対応する。ヘッジホッグポリペプチドの生物学的に活性な断片は、ＰＣＴ
公開ＷＯ９５／１８８５６及びＷＯ９６／１７９２４に非常に詳しく記載されて
いる。
【０１３６】 更に別の好適なヘッジホッグポリペプチドは、式Ａ−Ｂにより表されるアミノ
酸配列を含み、ここに：(ｉ)Ａは、SEQ ID NO:２１の残基１〜１６８により示さ
れるアミノ酸配列の全部又は一部分を表し；Ｂは、SEQ ID NO:２１の残基１６９
〜２２１により示されるアミノ酸配列の少なくとも１つのアミノ酸残基を表し；
(ｉｉ)Ａは、SEQ ID NO:１５の残基２４〜１９３により示されるアミノ酸配列の
全部又は一部分を表し；Ｂは、SEQ ID NO:１５の残基１９４〜２５０により示さ
れるアミノ酸配列の少なくとも１つのアミノ酸残基を表し；(ｉｉｉ)Ａは、SEQ
ID NO:１３の残基２５〜１９３により示されるアミノ酸配列の全部又は一部分を
表し；Ｂは、SEQ ID NO:１３の残基１９４〜２５０により示されるアミノ酸配列
の少なくとも１つのアミノ酸残基を表し；(ｉｖ)Ａは、SEQ ID NO:１１の残基２
３〜１９３により示されるアミノ酸配列の全部又は一部分を表し；Ｂは、SEQ ID
NO:１１の残基１９４〜２５０により示されるアミノ酸配列の少なくとも１つの
アミノ酸残基を表し；(ｖ)Ａは、SEQ ID NO:１２の残基２８〜１９７により示さ
れるアミノ酸配列の全部又は一部分をあらわし；Ｂは、SEQ ID NO:１２の残基１
９８〜２５０により示されるアミノ酸配列の少なくとも１つのアミノ酸残基を表
し；(ｖｉ)Ａは、SEQ ID NO:１６の残基２９〜１９７により示されるアミノ酸配
列の全部又は一部分を表し；Ｂは、SEQ ID NO:１６の残基１９８〜２５０により
示されるアミノ酸配列の少なくとも１つのアミノ酸残基を表し；(ｖｉｉ)Ａは、
SEQ ID NO:１７の残基２３〜１９３により示されるアミノ酸配列の全部又は一部
分を表し；Ｂは、SEQ ID NO:１７の残基１９４〜２５０により示されるアミノ酸
配列の少なくとも１つのアミノ酸残基を表す。ある好適具体例においては、Ａ及
びＢは、一緒に、隣接するポリペプチド配列(指定配列)を表し、Ａは、指定配列
の少なくとも２５、５０、７５、１００、１２５又は１５０(隣接)アミノ酸を表
し、Ｂは、配列表中の対応する項目により示されるアミノ酸配列の少なくとも５
、１０又は２０(隣接)アミノ酸残基を表し、Ａ及びＢは、一緒に、好ましくは、
配列表項目に対応する隣接配列を表す。他のヘッジホッグからの類似の断片、例
えば上記の配列表項目に由来する好適な断片に対応する断片も又、企図される。
好適具体例において、ヘッジホッグポリペプチドは、コレステロールと誘導体化
されるＣ末端グリシン(又は他の適当な残基)を含む。
【０１３７】 ヘッジホッグタンパク質の単離されたペプチジル部分を、組換えにより生成し
たペプチドを、かかるペプチドをコードする核酸の対応する断片からスクリーニ
ングすることにより得ることができる。加えて、断片を、メリーフィールド固相
ｆ−Ｍｏｃ又はｔ−Ｂｏｃ化学等の当分野で公知の技術を用いて化学合成するこ
とができる。例えば、本発明のヘッジホッグポリペプチドを、所望の長さの重複
を有しない断片に、又は好ましくは所望の長さの重複する断片に自由に分割する
ことができる。これらの断片を生成し(組換えにより又は化学合成により)、試験
をして、野生型(例えば、「真正」)ヘッジホッグタンパク質のアゴニスト又はア
ンタゴニストとして機能することのできるペプチジル断片を同定することができ
る。例えば、Roman等(1994)Eur J Biochem 222:65-73は、一層大きいタンパク質
由来の短い重複合成ペプチドを用いて結合ドメインを同定する競争的結合アッセ
イの利用を記載している。
【０１３８】 本発明の組換えヘッジホッグポリペプチドは、真正ヘッジホッグタンパク質の
同族体例えば潜在的開裂配列を変化させる突然変異又はそのタンパク質と関連す
る酵素活性を不活性化する突然変異によるタンパク質分解性開裂に耐性のタンパ
ク質のバージョンをも含む。本発明のヘッジホッグ同族体は又、真正タンパク質
と異なる仕方で翻訳後修飾を受けたタンパク質をも包含する。ヘッジホッグタン
パク質の典型的な誘導体には、Ｎ−グリコシル化部位を欠いた(例えば、グリコ
シル化されないタンパク質を生じる)、コレステロール化部位を欠いた及び／又
はＮ末端及び／若しくはＣ末端配列を欠いたポリペプチドが含まれる。
【０１３９】 主題のヘッジホッグポリペプチドの構造の改変は、治療効果若しくは予防効果
又は安定性(例えば、生体外貯蔵安定性及びイン・ビボでのタンパク質分解に対
する耐性)を増す等の目的のためでもあり得る。かかる改変ペプチドは、このタ
ンパク質の天然型の少なくとも１つの活性を保持するようにデザインした場合に
は、ここに一層詳細に記載されているヘッジホッグポリペプチドの機能的同等物
と考えられる。かかる改変ペプチドは、例えば、アミノ酸の置換、欠失又は付加
により生成することができる。
【０１４０】 ある独立したアミノ酸置換、例えばアミノ酸残基の他の関連アミノ酸での置換
(即ち、等配電子及び／又は等電の突然変異)を、その結果生じる分子の生物学的
活性に主たる影響を与えずに行うことができるということが合理的に期待できる
ということは、当分野では周知である。保存的置換は、側鎖において関連してい
るアミノ酸のファミリー内で起きるものである。一般に、コードされるアミノ酸
は、次の４つのファミリーに分けることができる：(１)酸性＝アスパルテート、
グルタメート；(２)塩基性＝リジン、アルギニン、ヒスチジン；(３)非極性＝ア
ラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチ
オニン、トリプトファン；及び(４)非帯電極性＝グリシン、アスパラギン、グル
タミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン。フェニルアラニン、トリ
プトファン及びチロシンは、ときとして、一緒に、芳香族アミノ酸として分類さ
れる。類似の様式で、アミノ酸レパートリーは、次のようにグループ分けするこ
とができる：(１)酸性＝アスパルテート、グルタメート；(２)塩基性＝リジン、
アルギニン、ヒスチジン、(３)脂肪族＝グリシン、アラニン、バリン、ロイシン
、イソロイシン、セリン、スレオニン(セリン及びスレオニンは、適宜、別に、 脂肪族ヒドロキシルとしてグループ分けされる)；(４)芳香族＝フェニルアラニ
ン、チロシン、トリプトファン；(５)アミド＝アスパラギン、グルタミン；及び
(６)硫黄含有＝システイン及びメチオニン(例えば、Biochemistry, 第二版、L.
Stryer編, WH Freeman and Co.: 1981を参照されたい)。ペプチドのアミノ酸配
列の変化が機能的ヘッジホッグ同族体を生じるかどうかは、変異体ペプチドの細
胞中で野生型タンパク質と類似の様式で応答するか又はかかる応答を競争的に阻
害する能力を評価することにより容易に測定することができる。１つより多くの
置換が起きたポリペプチドは、同様にして、容易に試験することができる。
【０１４１】 本発明の方法が、天然のヘッジホッグタンパク質の同族体を用いて実施できる
ことは特に企図される。一具体例において、この発明は、組合せ突然変異誘発に
より生成したヘッジホッグポリペプチドを用いることを企図している。かかる方
法は、当分野で公知であるが、点突然変異及び切り詰めた変異の両方を生成する
のに便利であり、ヘッジホッグタンパク質のレセプターへの結合において機能的
である潜在的変異配列(例えば、同族体)を同定するために特に有用であり得る。
かかる組合せライブラリーのスクリーニングの目的は、例えば、アゴニスト又は
アンタゴニストとして作用し得る新規なヘッジホッグ同族体を生成することであ
る。説明のために、ヘッジホッグ同族体を、本発明の方法により処理して、同源
のレセプター(例えば、パッチト)に対する一層効率的な結合を与え、しかも依然
としてヘッジホッグに関連する活性の少なくとも一部分を保持することができる
。従って、組合せに由来する同族体は、天然型のタンパク質と比較して増大され
た能力を有するように生成することができる。同様に、ヘッジホッグ同族体を、
本発明の組合せによるアプローチによって、それらが、例えば他の細胞外マトリ
クス成分との結合を真似ることができ(レセプター等)しかも如何なる生物学的応
答も誘導せず、それにより真正ヘッジホッグ又はヘッジホッグアゴニストの作用
を阻止する点において、アンタゴニストとして作用するように生成することがで
きる。その上、ヘッジホッグのあるドメインの本発明の方法による操作は、細胞
外マトリクスに由来し及び／又は細胞外マトリクス成分と結合する他のタンパク
質の部分を取り込んだもの等の融合タンパク質における利用に一層適したドメイ
ンを与えることができる。
【０１４２】 組合せ突然変異誘発の技術の状況を更に説明するために、Gallop等 (1994) J
Med Chem 37:1233の総説論文が、１９９０年代初期の組合せライブラリーの技術
の一般的状況を記載しているということが注意される。特に、Gallop等は、１２
３９頁で「類似体ライブラリーのスクリーニングは、活性配列の最小の大きさの
決定並びに結合及び置換の不寛容に臨界的な残基の同定を助成する」と述べてい
る。加えて、Ladner等、ＰＣＴ公開ＷＯ９０／０２８０９、Goeddel等、米国特
許第５，２２３，４０８号及びMarkland等、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／１５６７９号
は、当業者が、ヘッジホッグポリペプチドの特定の活性を保持した変異体／断片
を同定するために迅速にスクリーニングすることのできるヘッジホッグ変異体の
ライブラリーを生成するのに利用できるであろう特別の技術を示している。これ
らの技術は、この分野の典型であり、関連変異体／切り詰め変異体の大きいライ
ブラリーを生成して特定の変異体を過度の実験をしないでアッセイして単離する
ことができることを示している。Gustin等(1993)Virology 193:653及びBass等(1
990)Proteins:Structure, Function and Genetics 8:309-314も又、ヘッジホッ
グポリペプチドの変異体を生成する手段として適合させ得る他の典型的技術を記
載している。
【０１４３】 実際、ヘッジホッグタンパク質の大規模な突然変異誘発が、どの残基が生物学
的機能に臨界的であるかの如何なる予想をも必要とせずに、同等の生物学的活性
を有する変異体の広範なアレイを生成することは、組合せ突然変異誘発技術から
明らかである。実際、１０億の異なる変異体を、臨界的残基のアプリオリな理解
又は知識の如何なる必要をも排除するハイスルーアウト分析によりスクリーニン
グすることが組合せ技術の能力である。
【０１４４】 説明のために、ヘッジホッグ同族体又は他の関連タンパク質の集団のアミノ酸
配列を整列させ、好ましくは、可能な最高の相同性を促進する。かかる変異体の
集団は、例えば、一以上の種に由来するヘッジホッグ同族体を含むことができる
。整列させた配列の各位置に現れるアミノ酸を、組合せ配列の縮重セットを生成
するように選択する。好適具体例において、ヘッジホッグ変異体の多彩なライブ
ラリーを、組合せ突然変異誘発により核酸レベルで生成し、該変異体は、多彩な
遺伝子ライブラリーによりコードされる。例えば、合成のオリゴヌクレオチドの
混合物は、遺伝子配列中に、潜在的ヘッジホッグ配列の縮重セットが個々のポリ
ペプチドとして又はヘッジホッグ配列のセットを含んだ一層大きい融合タンパク
質のセット(例えば、ファージディスプレー)として発現され得るように酵素的に
連結することができる。
【０１４５】 ＰＣＴ公開ＷＯ９５／１８８５６に示されたように、変異体の集団の配列を分
析するために、関心あるアミノ酸配列を、配列相同性に関して整列させることが
できる。特定の変異体の整列させた配列からのアミノ酸の存否は、基準配列の選
択した共通の長さに比例し、これは、真正でも人工のものであってもよい。
【０１４６】 説明のための具体例において、Ｓｈｈクローンの各々のエキソン１、２及びエ
キソン３の一部分にコードされる配列(例えば、成熟タンパク質のＮ末端の約２
２１残基)のアラインメントは、下記の一般式により表されるＳｈｈポリペプチ
ドの縮重セットを生成する：
【化４】 (式中、縮重位置「Ｘ」の各々は、ヒト、マウス、ニワトリ又はゼブラフィッシ
ュのＳｈｈクローンの一つにおけるその位置に存在するアミノ酸であってよく、
又は、ライブラリーを広げるために、各Ｘは、天然においてそれらの位置に現れ
るアミノ酸の保存的置換物であろうアミノ酸残基から選択することもできる)。
例えば、Ｘａａ(１)は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔ
ｙｒ又はＴｒｐを表し；Ｘａａ(２)は、Ａｒｇ、Ｈｉｓ又はＬｙｓを表し；Ｘａ
ａ(３)は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ又はＴｈｒを表し
；Ｘａａ(４)は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ又はＴｈｒ
を表し；Ｘａａ(５)は、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｎ又はＧｌｎを表し；Ｘ
ａａ(６)は、Ｌｙｓ、Ａｒｇ又はＨｉｓを表し；Ｘａａ(７)は、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ
、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ又はＰｈｅを表し；Ｘａａ(８)は、Ｌｙｓ、Ａｒｇ又はＨｉｓ
を表し；Ｘａａ(９)は、Ｍｅｔ、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ又はＴｈｒを表し；Ｘａａ(１
０)は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ又はＴｈｒを表し；
Ｘａａ(１１)は、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ｔｈｒ又はＳｅｒを表し；Ｘａａ(
１２)は、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ又はＣｙｓを表し
；Ｘａａ(１３)は、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ又はＡｓｐを表し；Ｘａａ(１４)は
、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ又はＡｓｐを表し
；Ｘａａ(１５)は、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｍｅｔ
又はＣｙｓを表し；Ｘａａ(１６)は、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｃｙｓ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ
又はＭｅｔを表し；Ｘａａ(１７)は、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ａｓｎ
、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ又はＣｙｓを表し；Ｘａａ(１８)は
、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ又はＩｌｅを表し；Ｘａａ(１９)は、Ａｌａ、Ｇｌｙ
、Ｃｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ又はＭｅｔを表し
；Ｘａａ(２０)は、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｃｙｓ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ又はＧｌ
ｎを表し；Ｘａａ(２１)は、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ａｓｎ、Ａｓｐ
、Ｇｌｕ又はＧｌｎを表し；Ｘａａ(２２)は、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ又はＩｌ
ｅを表し；Ｘａａ(２３)は、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ、Ｈｉｓ又はＴｒｐを表し
；Ｘａａ(２４)は、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ又はＭｅｔを表し；Ｘａａ(２５)は
、Ｍｅｔ、Ｃｙｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ又はＳｅｒを表し；Ｘａａ
(２６)は、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ｔｈｒ又はＳｅｒを表す。尚一層拡張した
ライブラリーにおいては、各Ｘは、任意のアミノ酸から選択してよい。
【０１４７】 類似の様式で、ヒト、マウス、ニワトリ及びゼブラフィッシュのヘッジホッグ
クローンの各々のアラインメントは、下記式により表される縮重ポリペプチド配
列を与えることができる：
【化５】 (式中、前記の通り、縮重位置「Ｘ」の各々は、野生型クローンの１つにおける
対応する位置に存在するアミノ酸であってよく、保存的置換物であるアミノ酸残
基を含むこともでき、又は各Ｘは、任意のアミノ酸残基であってよい)。典型的
具体例において、Ｘａａ(１)は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ又はＩｌｅ、
Ｐｒｏ、Ｐｈｅ又はＴｙｒを表し；Ｘａａ(２)は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌ
ｅｕ又はＩｌｅを表し；Ｘａａ(３)は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌ
ｅ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ又はＡｒｇを表し；Ｘａａ(４)は、Ｌｙｓ、Ａｒｇ又はＨｉ
ｓを表し；Ｘａａ(５)は、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はアミノ酸ギャップを表し
；Ｘａａ(６)は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ又はアミノ酸ギャッ
プを表し；Ｘａａ(７)は、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ又はＬｙｓを表し；
Ｘａａ(８)は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ又はＴｈｒを
表し；Ｘａａ(９)は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ又はＴ
ｈｒを表し；Ｘａａ(１０)は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｓｅ
ｒ又はＴｈｒを表し；Ｘａａ(１１)は、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎ又はＡｓｎを表
し；Ｘａａ(１２)は、Ｍｅｔ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌ
ｅ、Ｓｅｒ又はＴｈｒを表し；Ｘａａ(１３)は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅ
ｕ、Ｉｌｅ又はＰｒｏを表し；Ｘａａ(１４)は、Ａｒｇ、Ｈｉｓ又はＬｙｓを表
し；Ｘａａ(１５)は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ａｒ
ｇ、Ｈｉｓ又はＬｙｓを表し；Ｘａａ(１６)は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅ
ｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ又はＴｙｒを表し；Ｘａａ(１７)は、Ａｒｇ、Ｈｉｓ又はＬ
ｙｓを表し；Ｘａａ(１８)は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｓｅ
ｒ又はＴｈｒを表し；Ｘａａ(１９)は、Ｔｈｒ又はＳｅｒを表し；Ｘａａ(２０)
は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ａｓｎ又はＧｌｎを表し；Ｘａ
ａ(２１)は、Ａｒｇ、Ｈｉｓ又はＬｙｓを表し；Ｘａａ(２２)は、Ａｓｐ又はＧ
ｌｕを表し；Ｘａａ(２３)は、Ｓｅｒ又はＴｈｒを表し；Ｘａａ(２４)は、Ｇｌ
ｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ又はＡｓｎを表し；Ｘａａ(２５)は、Ｇｌｕ又はＡｓｐを表
し；Ｘａａ(２６)は、Ａｒｇ、Ｈｉｓ又はＬｙｓを表し；Ｘａａ(２７)は、Ｇｌ
ｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ又はＩｌｅを表し；Ｘａａ(２８)は、Ｇｌｙ、Ａｌ
ａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ又はＳｅｒを表し；Ｘａａ(２９)は、Ｍｅ
ｔ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ又はＨｉｓを表し；Ｘａａ(３０)は、Ａｒ
ｇ、Ｈｉｓ又はＬｙｓを表し；Ｘａａ(３１)は、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ａｒ
ｇ、Ｈｉｓ又はＬｙｓを表し；Ｘａａ(３２)は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅ
ｕ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ又はＰｈｅを表し；Ｘａａ(３３)は、Ｇｌ
ｎ、Ａｓｎ、Ａｓｐ又はＧｌｕを表し；Ｘａａ(３４)は、Ａｓｐ又はＧｌｕを表
し；Ｘａａ(３５)は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ又はＩｌｅを表し；Ｘａ
ａ(３６)は、Ａｒｇ、Ｈｉｓ又はＬｙｓを表し；Ｘａａ(３７)は、Ａｓｎ、Ｇｌ
ｎ、Ｔｈｒ又はＳｅｒを表し；Ｘａａ(３８)は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅ
ｕ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ又はＣｙｓを表し；Ｘａａ(３９)は、Ｇｌ
ｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ又はＳｅｒを表し；Ｘａａ(４０)
は、Ａｒｇ、Ｈｉｓ又はＬｙｓを表し；Ｘａａ(４１)は、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｇｌ
ｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ又はＩｌｅを表し；Ｘａａ(４２)は、Ｇｌｙ、Ａｌ
ａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ又はＩｌｅを表し；Ｘａａ(４３)は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａ
ｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ又はＣｙｓを表し；Ｘａａ(４４)は、Ｇｌ
ｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ又はＳｅｒを表し；Ｘａａ(４５)
は、Ａｓｐ又はＧｌｕを表す。
【０１４８】 潜在的ヘッジホッグのライブラリーを縮重オリゴヌクレオチド配列から生成す
ることのできる多くの方法がある。縮重遺伝子配列の化学合成を、自動化ＤＮＡ
シンセサイザーで行うことができ、次いで、その合成遺伝子を適当な発現ベクタ
ーに連結することができる。遺伝子の縮重セットの目的は、一の混合物中に、潜
在的ヘッジホッグ配列の所望のセットをコードするすべての配列を与えることで
ある。縮重オリゴヌクレオチドの合成は、当分野で周知である(例えば、Narang,
SA(1983)Tetrahedron 39:3；Itakura等(1981) Recombinant DNA, Proc 3rd Clev
eland Sympos. Macromolecules, AG Walton編、Amsterdam: Elsevier p273-289
；Itakura等(1984) Annu.Rev.Biochem. 53:323；Itakura等(1984) Science 198:
1056；Ike等(1983) Nucleic Acid Res. 11:477を参照されたい)。かかる技術は
、他のタンパク質の方向付けられた進化において用いられてきた(例えば、Scott
等(1990)Science 249:386-390；Roberts等(1992) PNAS 89:2429-2433；Devlin等
(1990)Science 249:404-406；Cwirla等(1990) PNAS 87:6378-6382；並びに米国
特許第５，２２３，４０９号、５，１９８，３４６号及び５，０９６，８１５号
を参照されたい)。
【０１４９】 点突然変異により作られた組合せライブラリーの遺伝子産物をスクリーニング
するための、及びある特性を有する遺伝子産物についてｃＤＮＡライブラリーを
スクリーニングするための広範囲の技術が、当分野で知られている。かかる技術
は、一般に、ヘッジホッグ同族体の組合せ突然変異誘発により生成された遺伝子
ライブラリーの迅速なスクリーニングに適合させることができる。大きい遺伝子
ライブラリーのスクリーニングのための最も広く用いられている技術は、典型的
には、遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベクター中にクローン化し、その結
果生成したベクターライブラリーで適当な細胞をトランスフォームして、組合せ
遺伝子を、所望の活性の検出が、産物が検出される遺伝子をコードするベクター
の比較的容易な単離を促進する条件下で発現させることを含む。下記の説明用の
アッセイの各々は、組合せ突然変異誘発技術により造られた多数の縮重ヘッジホ
ッグ配列のスクリーニングに必要な高スループット分析に従順である。
【０１５０】 一具体例において、組合せライブラリーは、分泌されるようにデザインし(例
えば、このライブラリーのポリペプチドは、すべて、シグナル配列を含むが、膜
貫通ドメイン又は細胞質ドメインは含まない)、末梢神経細胞と共存培養するこ
とのできる真核細胞のトランスフェクトに利用する。組合せライブラリーを発現
する細胞により分泌された機能的ヘッジホッグタンパク質は、近隣の末梢神経細
胞に拡散して、特定の生物学的応答例えば増殖又は分化を誘導する。かかる表現
型の変化の検出パターンは、勾配関数を真似し、神経栄養因子として活性なヘッ
ジホッグ同族体を生成する細胞の単離を可能にする(一般に、数回の選択ラウン
ドの反復の後に)。同様に、ヘッジホッグアンタゴニストは、近隣の細胞を培地
に加えた野生型ヘッジホッグの効果から保護する(例えば、増殖を阻止する)機能
的アンタゴニストを生成する細胞の能力により、類似の様式で選択することがで
きる。
【０１５１】 説明のために、標的の末梢神経細胞を、２４ウェルミクロ滴定プレートで培養
する。他の真核細胞を、組合せヘッジホッグ遺伝子ライブラリーでトランスフェ
クトし、ミクロ滴定プレートのウェルに適合する細胞培養インサート(例えば、C
ollaborative Biomedical Products, カタログ番号４０４４６)中で培養する。
これらの細胞培養インサートをこれらのウェル中に、インサート中の細胞により
分泌された組換えヘッジホッグ同族体がインサートの多孔性の底から拡散してミ
クロ滴定プレートのウェル中の標的細胞と接触するように置く。機能的形態のヘ
ッジホッグタンパク質が標的細胞において測定できる応答を生じさせるのに十分
な時間の後に(生育状態等)、これらのインサートを取り出して変異型ヘッジホッ
グタンパク質の標的細胞に対する効果を測定する。活性について陽性の評価のウ
ェルに対応するインサートの細胞を分けて、幾つかのインサートで再培養し、こ
の処理を活性クローンが同定されるまで繰り返す。
【０１５２】 更に別のスクリーニングアッセイにおいては、候補のヘッジホッグ遺伝子産物
を、細胞又はウイルス粒子の表面上にディスプレーし、特定の細胞又はウイルス
粒子のヘッジホッグ結合部分(例えば、パッチトタンパク質又は他のヘッジホッ
グレセプター)とこの遺伝子産物を介して結合する能力を「パニング」アッセイ
で検出する。かかるパニングステップは、胚由来の培養細胞で行うことができる
。例えば、この遺伝子ライブラリーを、細菌細胞の表面膜タンパク質の遺伝子中
にクローン化することができ、その結果生成した融合タンパク質をパニングによ
り検出することができる(Ladner等、ＷＯ８８／０６６３０；Fuchs等(1991)Bio/
Technology 9:1370-1371；及びGoward等(1992)TIBS 18:136-140)。類似の様式で
、ヘッジホッグに結合する蛍光標識した分子を用いて、潜在的に機能的なヘッジ
ホッグ同族体を評価することができる。細胞は、蛍光顕微鏡下で視覚的に調べて
分離することができ、細胞の形態が許せば、蛍光活性化セルソーターにより分離
することができる。
【０１５３】 別の具体例においては、遺伝子ライブラリーをウイルス粒子の表面上の融合タ
ンパク質として発現させる。例えば、繊維状ファージの系において、外来ペプチ
ド配列を、感染性ファージの表面で発現させ、それにより、２つの有意の利益を
与えることができる。第１に、これらのファージは、アフィニティーマトリクス
に非常に高濃度で加えることができるので、多数のファージを一度にスクリーニ
ングする事ができる。第２に、各感染性ファージは、組合せ遺伝子産物をその表
面上にディスプレーするので、もし特定のファージがアフィニティーマトリクス
から低収率で回収されたならば、そのファージを他の感染ラウンドにより増幅す
ることができる。殆ど同じ大腸菌繊維状ファージのＭ１３、ｆｄ及びｆｌのグル
ープは、ファージｇＩＩＩ又はｇＶＩＩＩコートタンパク質の何れかを用いて、
ウイルス粒子の最終的パッケージングを破壊せずに融合タンパク質を生成するこ
とができるので、ファージディスプレーライブラリーにおいて最もしばしば用い
られる(Ladner等、ＰＣＴ公開ＷＯ９０／０２９０９；Garrard等、ＰＣＴ公開Ｗ
Ｏ９２／０９６９０；Marks等(1992)J.Biol.Chem.267:16007-16010；Griffiths
等(1993)EMBO J 12:725-734；Clackson等(1991)Nature 352:624-628；及びBarba
s等(1992)PNAS 89:4457-4461)。
【０１５４】 説明のための具体例において、組換えファージ抗体システム(ＲＰＡＳ、Pharm
aciaカタログ番号２７−９４００−０１)は、ヘッジホッグ組合せライブラリー
の発現及びスクリーニングにおける利用のために容易に改変することができる。
例えば、ＲＰＡＳキットのｐＣＡＮＴＡＢ５ファージミドは、ファージｇＩＩＩ
コートタンパク質をコードする遺伝子を含む。ヘッジホッグ組合せ遺伝子ライブ
ラリーは、このファージミド中に、ｇＩＩＩ融合タンパク質として発現されるよ
うに、ｇＩＩＩシグナル配列と隣接させてクローン化することができる。連結後
に、このファージミドを用いてコンピテント大腸菌ＴＧ１細胞をトランスフォー
ムする。トランスフォームされた細胞に、続いて、Ｍ１３ＫＯ７ヘルパーファー
ジを感染させてそのファージミド及びその候補のヘッジホッグ遺伝子インサート
をレスキューする。その結果生成した組換えファージは、特定の候補のヘッジホ
ッグをコードするファージミドＤＮＡを含み、少なくとも１コピーの対応する融
合コートタンパク質をディスプレーする。ヘッジホッグレセプターに結合するこ
とのできるこれらのファージディスプレーされた候補のヘッジホッグタンパク質
を、パニングにより選択して富化させる。例えば、このファージライブラリーを
、パッチトタンパク質を発現する細胞に適用して未結合ファージをこれらの細胞
から洗い去ることができる。次いで、結合したファージを単離し、もし組換えフ
ァージが少なくとも１コピーの野生型ｇＩＩＩコートタンパク質を発現するなら
ば、それらは、大腸菌に感染する能力を保持する。こうして、大腸菌の再感染及
びパニングの連続的ラウンドは、ヘッジホッグ同族体を大いに富化させ、次いで
、それらをアゴニスト及びアンタゴニストを識別するために、更なる生物学的活
性についてスクリーニングすることができる。
【０１５５】 組合せ突然変異誘発は、変異体タンパク質の非常に大きいライブラリー(例え
ば、１０２６分子のオーダー)を生成する潜在力を有する。この大きさの組合せ
ライブラリーは、ファージディスプレー等の高スループットスクリーニングアッ
セイを用いても、スクリーニングするのが技術的に挑戦的なものである。この問
題を克服するために、リカーシブアンサンブル突然変異誘発(ＲＥＭ)という新た
な技術が最近開発されたが、これは、ランダムライブラリー中の非常に高い割合
の非機能的タンパク質を回避することを可能にし、容易に機能的タンパク質の頻
度を増大させ、そうして、配列空間の有用なサンプリングを達成するのに必要と
される複雑さを減少させる。ＲＥＭは、適当な選択又はスクリーニング方法を用
いた場合にライブラリー中の機能的変異体の頻度を増大させるアルゴリズムであ
る(Arkin及びYourvan, 1992, PNAS USA 89:7811-7815；Yourvan等 1992, Parall
el Problem Solving from Nature, 2., In Maenner及びManderick編、Elsevir P
ublishing Co., Amsterdam, p.401-410；Delagrave等, 1993, Protein Engineer
ing 6(3):327-331)。
【０１５６】 この発明は又、本発明のヘッジホッグポリペプチドのヘッジホッグレセプター
との結合を破壊することのできる模倣物(例えば、ペプチド又は非ペプチド因子)
の生成のためのヘッジホッグタンパク質の還元をも提供する。従って、上記のよ
うな突然変異誘発技術は又、例えば、主題のヘッジホッグポリペプチドの他の細
胞外マトリクス成分への結合に関係するタンパク質−タンパク質相互作用に参加
するヘッジホッグタンパク質のデターミナントをマップするのにも有用である。
説明のために、ヘッジホッグレセプター例えばパッチトの分子的認識に関与する
主題のヘッジホッグポリペプチドの臨界的残基を決定して、真正ヘッジホッグタ
ンパク質のその部分での結合を競争的に阻害するヘッジホッグ由来ペプチド模倣
物を生成するために利用することができる。例えば、他の細胞外タンパク質との
結合に関係している主題のヘッジホッグタンパク質の各々のアミノ酸残基をマッ
プするためにスキャニング突然変異誘発を用いることにより、相互作用を促進す
るヘッジホッグタンパク質の残基を真似るペプチド模倣化合物を生成することが
できる。次いで、かかる模倣物を用いて、ヘッジホッグタンパク質の正常の機能
を邪魔することができる。例えば、かかる残基の加水分解可能でないペプチド類
似体を、ベンゾジアゼピン(例えば、Freidinger等、Peptides: Chemistry and B
iology, G.R. Marshall編, ESCOM Publisher: Leiden, オランダ、1988参照)、
アゼピン(例えば、Huffman等、Peptides: Chemistry and Biology, G.R. Marsha
ll編, ESCOM Publisher: Leiden, オランダ、1988参照)、置換されたガンマラク
タム環(Garvey等、Peptides: Chemistry and Biology, G.R. Marshall編, ESCOM
Publisher: Leiden, オランダ、1988参照)、ケト−メチレンシュードペプチド(
Ewenson等、(1986)J Med Chem 29:295；及びEwenson等、Peptides: Structure a
nd Function (Proceedings of the 9th American Peptide Symposium)Pierce Ch
emical Co. Rockland, IL, 1985)、β−ターンジペプチドコア(Nagai等(1985)Te
trahedron Lett 26:647；Sato等(1986)J Chem Soc Perkin Trans 1:1231)及びβ
−アミノアルコール(Gordon等(1985)Biochem Biophys Res Commun 126:419;；及
びDann等(1986)Biochem Biophys Res Commun 134:71)を用いて生成することがで
きる。
【０１５７】 組換え生成型のヘッジホッグタンパク質を、例えば、ヘッジホッグポリペプチ
ドをコードする核酸を少なくとも１つの転写調節配列に操作可能に結合して含む
発現ベクターを用いて生成することができる。操作可能に結合するは、ヌクレオ
チド配列を調節配列にそのヌクレオチド配列の発現を可能にする仕方で結合する
ことを意味することを意図している。調節配列は、当分野で認められており、ヘ
ッジホッグポリペプチドの発現を指示するために選択される。従って、この用語
転写調節配列は、プロモーター、エンハンサー及び他の発現制御用エレメントを
包含する。かかる調節配列は、Goeddel; Gene Expression Technology; Methods
in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA(1990)に記載されている
。例えば、広範囲の発現制御配列(機能的に結合されたＤＮＡ配列の発現を制御
する配列)の何れかを、これらのベクター中で用いて、ヘッジホッグポリペプチ
ドをコードするＤＮＡ配列を発現させることができる。かかる有用な発現制御配
列には、例えば、ウイルス性ＬＴＲ(例えば、モロニーマウス白血病ウイルスの
ＬＴＲ)、ＳＶ４０の初期及び後期プロモーター、アデノウイルス又はサイトメ
ガロウイルスの最初期プロモーター、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣ又はＴＲＣ系
、ＴＲＲＮＡポリメラーゼにより指令されるＴ７プロモーター、λファージの主
要オペレーター及びプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の制御領域、３−
ホスホグリセレートキナーゼ又は他の解糖系酵素のプロモーター、酸性ホスファ
ターゼ例えばＰｈｏ５のプロモーター、酵母α交配因子のプロモーター、バキュ
ロウイルス系のポリヘドロンプロモーター及び原核又は真核細胞の遺伝子の発現
を制御することが知られている他の配列並びにこれらの様々な組合せが含まれる
。発現ベクターのデザインは、トランスフォームすべき宿主細胞の選択及び／又
は発現させるべき所望のタンパク質の種類等の因子に依存し得るということは理
解されるべきである。その上、このベクターのコピー数、コピー数を制御する能
力及びこのベクターによりコードされる任意の他のタンパク質(例えば、抗生物
質マーカー)の発現も又、考慮されるべきである。
【０１５８】 精製のためにヘッジホッグポリペプチドの既成の源を提供することに加えて、
本発明の遺伝子構築物は又、ヘッジホッグポリペプチドのアゴニスト形態又はア
ンタゴニスト形態をコードする核酸を送達する遺伝子治療のプロトコールの一部
として利用することもできる。従って、この発明の他の面は、末梢ニューロン又
はその関連細胞におけるヘッジホッグポリペプチドの異所的発現を引き起こす、
ヘッジホッグポリペプチドの特定の細胞型におけるイン・ビボトランスフェクシ
ョンのための発現ベクターを特徴とする。
【０１５９】 かかる発現用構築物の配合物を、任意の生物学的に有効なキャリアーで例えば
組換え遺伝子をイン・ビボで細胞に効果的に送達することのできる任意の配合物
又は組成物で投与することができる。アプローチは、ヘッジホッグコード配列の
、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、及び１型単純ヘルペ
スウイルスを含むウイルスベクターへの挿入又は組換え細菌用若しくは真核生物
用プラスミドへの挿入を含む。ウイルスベクターは、細胞を直接トランスフェク
トし；プラスミドＤＮＡは、例えばカチオン性リポソーム(リポフェクチン)の助
成により又は誘導体化(例えば、抗体結合体化)ポリリジン結合体、グラミシジン
Ｓ、人工ウイルスエンベロープ又は他のかかる細胞内キャリアーの助成により送
達され得、並びに、遺伝子構築物を直接注射することもでき又はＣａＰＯ４沈殿
法をイン・ビボで行うこともできる。適当な標的細胞の形質導入が遺伝子治療の
臨床的な第１ステップの典型であるので、特定の遺伝子送達システムの選択は、
意図する標的の表現型及び投与経路(例えば、局所投与又は全身投与)等の因子に
依存するということは認められよう。その上、ヘッジホッグ発現のイン・ビボ形
質導入用の特定の遺伝子構築物が、下記の生体外組織培養系での使用のためのイ
ン・ビトロ形質導入にも有用であるということは認められよう。
【０１６０】 核酸の細胞へのイン・ビボでの導入の好適アプローチは、特定形態の所望のヘ
ッジホッグポリペプチドをコードする核酸例えばｃＤＮＡを含むウイルスベクタ
ーの利用によるものである。ウイルスベクターの細胞への感染は、標的細胞の大
きい集団が核酸を受けることができるという利点を有する。更に、ウイルスベク
ター内にコードされる分子(例えば、ウイルスベクターに含まれるｃＤＮＡによ
り)を、ウイルスベクター核酸を取り込んだ細胞内で効率的に発現させる。
【０１６１】 レトロウイルスベクター及びアデノ随伴ウイルスベクターは、一般に、外因性
遺伝子のイン・ビボでの特にヒトへのトランスファーのためのえり抜きの組換え
遺伝子ライブラリーシステムであると理解されている。これらのベクターは、遺
伝子の細胞への効率的な送達を与え且つトランスファーされた核酸は、宿主の染
色体ＤＮＡ中に安定に組み込まれる。レトロウイルスの利用の主な必要条件は、
それらの利用の安全性を(特に、細胞集団における野生型ウイルスの拡大の可能
性に関して)確実にすることである。複製欠損レトロウイルスのみを生成する特
別の細胞株(「パッケージング細胞」と呼ばれる)の開発は、遺伝子治療のための
レトロウイルスの有用性を増大させ、欠損レトロウイルスは、遺伝子治療目的で
の遺伝子トランスファーにおける利用のためによく特性決定されている(総説と
しては、Miller, A.D.(1990) Blood 76:271を参照されたい)。従って、レトロウ
イルスコード配列(ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ)の部分が、ヘッジホッグポリペプチ
ドをコードする核酸により置換されており、そのレトロウイルスを複製欠損にす
る、組換えレトロウイルスを構築することができる。この複製欠損レトロウイル
スを、次いで、ウイルスにパッケージし、これは、標準的技術により、ヘルパー
ウイルスを利用して標的細胞に感染させるのに用いることができる。組換えレト
ロウイルスの製造のための及びかかるウイルスをイン・ビトロ又はイン・ビボで
細胞に感染させるためのプロトコールは、Current Protocols in Molecular Bio logy , Ausubel, F.M.等(編) Greene Publishing Associates, (1989), 第9.10-9
.14節中及び他の標準的ラボラトリーマニュアル中に見出すことができる。適当
なレトロウイルスの例には、ｐＬＪ、ｐＺＩＰ、ｐＷＥ及びｐＥＭが含まれ、こ
れらは、当業者に周知である。環境栄養性及び両栄養性レトロウイルスシステム
の両方を調製するための適当なパッケージングウイルス株の例には、Ｃｒｉｐ、
Ｃｒｅ、２及びＡｍが含まれる。レトロウイルスは、様々な遺伝子を、ニューロ
ン細胞を含む多くの異なる細胞型にイン・ビトロ及び／又はイン・ビボで導入す
るために用いられてきた(例えば、Eglitis等(1985)Science 230:1395-1398；Dan
os及びMulligan(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:6460-6464；Wilson等(1988)P
roc.Natl.Acad.Sci.USA 85:3014-3018；Armentano等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.
USA 87:6141-6145；Huber等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:8039-8043；Ferr
y等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:8377-8381；Chowdhury等(1991)Science 2
54:1802-1805；van Beusechem等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:7640-7644；
Kay等(1992)Human Gene Therapy 3:641-647；Dai等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA 89:10892-10895；Hwu等(1993)J.Immunol.150:4104-4115；米国特許第４，８
６８，１１６号；米国特許第４，９８０，２８６号；ＰＣＴ出願ＷＯ８９／０７
１３６；ＰＣＴ出願ＷＯ８９／０２４６８；ＰＣＴ出願ＷＯ８９／０５３４５；
及びＰＣＴ出願ＷＯ９２／０７５７３を参照されたい)。
【０１６２】 その上、ウイルス粒子の表面のウイルスパッケージングタンパク質を改変する
ことにより、レトロウイルスの(従って、レトロウイルスベースのベクターの)感
染スペクトルを限定することが可能であるということが示されている(例えば、
ＰＣＴ公開ＷＯ９３／２５２３４及びＷＯ９４／０６９２０参照)。例えば、レ
トロウイルスベクターの感染スペクトルの改変のためのストラテジーは：細胞表
面抗原に特異的な抗体をウイルスのｅｎｖタンパク質に結合させること(Roux等(
1989)PNAS 86:9079-9083；Julan等(1992)J.Gen Virol 73:3251-3255；及びGoud
等(1983)Virology 163:251-254)；又は細胞表面レセプターリガンドをウイルス
ｅｎｖタンパク質に結合することを含む(Neda等(1991)J Biol Chem 266:14143-1
4146)。結合は、タンパク質又は他の変種との化学的架橋の形態であってよく(例
えば、ｅｎｖタンパク質をアシアロ糖タンパク質に変換するラクトース)並びに
融合タンパク質を生成することによる(例えば、一本鎖抗体／ｅｎｖ融合タンパ
ク質)。この技術は、ある組織型に対する感染を制限し又は指示するのに有用で
あるが、環境栄養性ベクターを両栄養性ベクターに変換するためにも利用するこ
とができる。
【０１６３】 その上、レトロウイルス遺伝子送達の利用は、レトロウイルスベクターのヘッ
ジホッグ遺伝子の発現を制御する組織又は細胞特異的転写調節配列の利用により
更に増大され得る。
【０１６４】 本発明の方法において有用な他のウイルス遺伝子送達システムは、アデノウイ
ルス由来のベクターを利用する。アデノウイルスのゲノムは、関心ある遺伝子産
物をコードして発現するが正常の溶菌性ウイルス生活環において複製する能力に
関しては不活性化されるように操作することができる。例えば、Berkner等(1988
)BioTechniques 6:616；Rosenfeld等(1991)Science 252:431-434；及びRosenfel
d等(1992)Cell 68:143-155を参照されたい。アデノウイルス株Ａｄ５型ｄ１３２
４又は他のアデノウイルス株(例えば、Ａｄ２、Ａｄ３、Ａｄ７等)に由来する適
当なアデノウイルスベクターは、当業者に周知である。組換えアデノウイルスは
、それらを末梢神経細胞を含む広範囲の細胞型に感染させるのに用いることので
きるある状況において有利であり得る。その上、このウイルス粒子は、比較的安
定であり、生成及び濃縮に従順であり、上記の通り、感染スペクトルに影響する
ように改変することができる。加えて、導入されたアデノウイルスＤＮＡ(及び
それに含まれる外来のＤＮＡ)は、宿主細胞のゲノム中に組み込まれず、エピゾ
ームのままであり、それにより、導入されたＤＮＡが宿主のゲノムに組み込まれ
る状況(例えば、レトロウイルスＤＮＡ)において挿入変異の結果として生じ得る
潜在的問題が回避される。その上、アデノウイルスゲノムの外来ＤＮＡに対する
運搬容量(最大で８キロベース)は、他の遺伝子送達ベクターと比較して大きい(B
erkner等、前書；Haj-Ahmand及びGraham(1986)J.Virol.57:267)。現在使用され
ており、それ故、本発明に好適な殆どの複製欠損アデノウイルスベクターは、ウ
イルスのＥ１及びＥ３遺伝子の全部又は部分を欠失しているが、アデノウイルス
の遺伝物質の８０％程も保持している(例えば、Jones等(1979)Cell 16:683；Ber
kner等、前書；及びGraham等、Methods in Molecular Biology, E.J.Murray編(H
umana, Clifton, NJ, 1991)第７巻、109-127頁参照)。挿入されたヘッジホッグ
遺伝子の発現は、例えば、Ｅ１Ａプロモーター、主要後期プロモーター(ＭＬＰ)
及び関連リーダー配列、Ｅ３プロモーター又は外因的に加えられたプロモーター
配列の制御下にあってよい。
【０１６５】 上記したようなウイルストランスファー方法に加えて、非ウイルス的方法も、
ヘッジホッグポリペプチドの動物組織内での発現を引き起こすために用いること
ができる。殆どの非ウイルス的遺伝子トランスファー方法は、哺乳動物細胞が巨
大分子の取り込み及び細胞内輸送に利用する正常の機構に依存している。好適具
体例において、本発明の非ウイルス性遺伝子送達システムは、標的細胞によるヘ
ッジホッグポリペプチド遺伝子の取り込みのためにエンドサイトーシス経路に依
存している。この型の典型的遺伝子送達システムは、リポソーム由来のシステム
、ポリリジン結合体及び人工的ウイルスエンベロープを包含する。
【０１６６】 臨床環境において、治療用ヘッジホッグ遺伝子のための遺伝子送達システムを
患者に、当分野で周知の多くの方法の何れかによって導入することができる。例
えば、遺伝子送達システムの医薬製剤を、例えば静脈注射により全身に導入する
ことができ、標的細胞におけるタンパク質の特異的形質導入が、主として、遺伝
子送達ビヒクル、レセプター遺伝子の発現を制御する転写調節配列による細胞型
又は組織型発現により又はこれらの組合せにより与えられる形質導入の特異性に
より起きる。他の具体例において、組換え遺伝子の初期の送達は、一層限られて
おり、動物への導入は、極めて局所的である。例えば、遺伝子送達ビヒクルは、
カテーテルにより(米国特許第５，３２８，４７０号参照)又は定位注射(例えば
、Chen等(1994)PNAS 91:3054-3057)により導入することができる。ヘッジホッグ
発現用構築物は、遺伝子治療用構築物にて、例えば、Dev等((1994)Cancer Treat
Rev 20:105-115)に記載された技術を用いるエレクトロポレーションによって真
皮細胞に送達することができる。
【０１６７】 遺伝子治療用構築物の医薬製剤は、本質的に、許容し得る希釈剤中の遺伝子送
達システムからなっていてよく、又は遺伝子送達ビヒクルを埋めたゆっくり放出
させるマトリクスを含むことができる。或は、完全な遺伝子送達システムを組換
え細胞例えばレトロウイルスから作ることができ、医薬製剤は、遺伝子送達シス
テムを生成する少なくとも一の細胞を含むことができる。
【０１６８】 更に別の具体例において、ヘッジホッグ又はｐｔｃ治療剤は、ゲノムＤＮＡと
の相同組換えにより内因性遺伝子の転写調節配列を変える「遺伝子活性化」構築
物であってよい。例えば、この遺伝子構築物は、ヘッジホッグ遺伝子の内因性プ
ロモーターを、例えばヘッジホッグ遺伝子の構成的発現を引き起こすか又は遺伝
子の誘導的発現をその遺伝子の正常の発現パターンと異なる条件下で引き起こす
異質プロモーターで置換することができる。パッチトシグナリング経路における
他の遺伝子を同様にして標的とすることができる。遺伝子活性化構築物のための
様々な異なる形式を利用することができる。例えば、Transkaryotic Therapies,
Inc ＰＣＴ公開ＷＯ９３／０９２２２、ＷＯ９５／３１５６０、ＷＯ９６／２
９４１１、ＷＯ９５／３１５６０及びＷＯ９４／１２６５０を参照されたい。
【０１６９】 好適具体例において、遺伝子活性化構築物として用いるヌクレオチド配列は、
(１)組換えを指示する内因性ヘッジホッグ遺伝子のある部分に由来するＤＮＡ(
エキソン配列、イントロン配列、プロモーター配列等)及び(２)遺伝子活性化構
築物の組換えに際してゲノムのヘッジホッグ遺伝子のコード配列に操作可能に結
合されるべき異質転写調節配列よりなってよい。ヘッジホッグ産生細胞の培養の
生成において用いるために、この構築物は、更に、細胞中のノックアウト構築物
の存在を検出するレポーター遺伝子を含むことができる。
【０１７０】 この遺伝子活性化構築物を、細胞に挿入して、細胞のゲノムＤＮＡに、ネイテ
ィブなヘッジホッグ遺伝子と機能的に結合した異質調節配列を与えるような位置
に組み込む。かかる挿入は、相同組換えにより起き、即ち、内因性ヘッジホッグ
遺伝子配列と相同な活性化構築物の組換え領域がゲノムＤＮＡとハイブリダイズ
し、この構築物がゲノムＤＮＡの対応する位置に組み込まれるようにゲノム配列
と組換えを起こす。
【０１７１】 用語「組換え領域」又は「標的配列」は、ゲノム遺伝子配列(例えば、ゲノム
遺伝子の５’隣接配列を含む)と実質的に同じであるか又は実質的に相補的であ
って、ゲノム配列と標的トランスジーン構築物との間の相同組換えを促進するこ
とのできる配列を有する遺伝子活性化構築物のセグメント(即ち、一部分)をいう
。
【０１７２】 ここで用いる場合、用語「置換領域」は、組換え領域とゲノム配列の間の相同
組換えの後に、内因性染色体位置に組み込まれる活性化構築物の一部分をいう。
【０１７３】 例えば置換領域内に与えられた異質調節配列は、プロモーター(構成的又は誘
導可能プロモーター)、エンハンサー、負の調節エレメント、遺伝子座制御領域
、転写因子結合部位又はこれらの組合せを包含する様々なエレメントの少なくと
も１つを含むことができる。
【０１７４】 標的遺伝子の発現のイン・ビボでの制御に用いることのできるプロモーター／
エンハンサーには、次のものが含まれるが、これらに限らない：サイトメガロウ
イルス(ＣＭＶ)プロモーター／エンハンサー(Karasuyama等、1989, J.Exp.Med.,
169:13)、ヒト−β−アクチンプロモーター(Gunning等(1987)PNAS)84:4831-4835
、マウス乳癌ウイルスのロングターミナルリピート(ＭＭＴＶＬＴＲ)中に存在す
るグルココルチコイド誘導性プロモーター(Klessig等(1984)Mol.Cell Biol.4:13
54-1362)、モロニーマウス白血病ウイルスのロングターミナルリピート(ＭｕＬ
ＶＬＴＲ)(Weiss等(1985)RNA Tumor Viruses, Cold Spring Harbor Laboratory,
Cold Spring Harbor, New York)、ＳＶ４０初期又は後期領域プロモーター(Ber
noist等(1981)Nature 290:304-310；Templeton等(1984)Mol.Cell Biol.,4:817；
及びSprague等(1983)J.Virol.45:773)、ラウス肉腫ウイルス(ＲＳＶ)の３’ロン
グターミナルリピート中に含まれるプロモーター(Yamamoto等、1980, Cell, 22:
787-797)、単純ヘルペスウイルス(ＨＳＶ)チミジンキナーゼプロモーター／エン
ハンサー(Wagner等(1981)PNAS 82:3567-71)及び単純ヘルペスウイルスＬＡＴプ
ロモーター(Wolfe等(1992)Nature Genetics, 1:379-384)。
【０１７５】 典型的具体例において、ヒトＳｈｈ遺伝子の５’隣接領域の部分を、下記の断
片を生成する制限部位を加えるプライマーを用いて増幅する
【化６】 示したように、プライマー１は、ヒトＳｈｈ遺伝子の５’非コード領域を含み、
ＡｓｕＩＩ制限部位及びＣｌａ制限部位と隣接している。プライマー２は、プラ
イマー１中に存在する領域の直ぐ３’側の５’非コード領域を含む。このヘッジ
ホッグ遺伝子配列は、ＸｈｏＩＩ及びＢａｍＨＩ制限部位と隣接している。精製
したアンプリマーを適当な酵素で切断する。
【０１７６】 ベクターｐＣＤＮＡ１．１(Invitrogen)は、ＣＭＶプロモーターを含む。この
プラスミドを、ＣＭＶプロモーター配列の丁度３’側で開裂させるＡｓｕＩＩで
切断する。プライマー１のＡｓｕＩＩ／ＣｌａＩ断片を、ｐｃＤＮＡベクターの
ＡｓｕＩＩ開裂部位に連結する。ＣｌａＩ／ＡｓｕＩＩ連結は、適当に挿入され
たプライマー１の３’末端のＡｓｕＩＩ部位を破壊する。
【０１７７】 このベクターを、次いで、ＢａｍＨＩで切断し、プライマー２のＸｈｏＩＩ／
ＢａｍＨＩ断片をＢａｍＨＩ開裂部位に連結する。上記のように、ＢａｍＨＩ／
ＸｈｏＩＩ連結は、適当に挿入されたプライマー２の５’末端のＢａｍＨＩ部位
を破壊する。
【０１７８】 個々のコロニーを選択して、ＡｓｕＩＩ及びＢａｍＨＩで切断し、ＡｓｕＩＩ
／ＢａｍＨＩ断片の大きさを測定する。プライマー１及びプライマー２の両方の
配列が正しく挿入されたコロニーを更に増幅して、ＡｓｕＩＩ及びＢａｍＨＩで
切って、下記の遺伝子活性化構築物を生成する
【化７】 この構築物において、隣接プライマー１及びプライマー２配列は、ＣＭＶプロモ
ーターの、ヒトＳｈｈ遺伝子のコード配列の前への挿入を可能にする組換え領域
を与える。他の異質プロモーター(又は他の転写調節配列)をゲノムヘッジホッグ
遺伝子に、同様の方法により、挿入することができる。
【０１７９】 更に別の具体例において、この置換領域は、例えば発現を活性化するために、
ネイティブな遺伝子の負の転写制御エレメントを単に欠失させ、又は例えば標的
遺伝子の発現を阻止するために、正の制御エレメントを除去する。
【０１８０】 Ｖ．典型的ｐｔｃ治療用組成物 他の具体例において、主題の方法は、ｐｔｃ治療用組成物を用いて実施する。
かかる組成物は、例えば、パッチトに結合してそのシグナル変換活性を変える化
合物、パッチトシグナル経路に関与するタンパク質(例えば、細胞内)の結合及び
／又は酵素活性を変化させる化合物、及びヘッジホッグタンパク質、パッチトタ
ンパク質又はパッチトの細胞内シグナル変換経路に関与するタンパク質の発現レ
ベルを変化させる化合物を用いて生成することができる。
【０１８１】 精製された及び組換えのヘッジホッグポリペプチドの利用可能性は、ヘッジホ
ッグ及び／又はパッチトタンパク質の正常な細胞機能、特に末梢神経の増殖及び
／又は分化におけるそれらの役割のアゴニスト又はアンタゴニストである小さい
有機分子等の薬物のスクリーニングに用いることのできるアッセイ系の生成を容
易にする。一具体例において、このアッセイは、ヘッジホッグポリペプチドとパ
ッチト等のヘッジホッグレセプターとの結合を調節する化合物の能力を評価する
。他の具体例において、このアッセイは、単に、パッチトタンパク質のシグナル
変換活性を変化させる試験化合物の能力を評価する。この方法において、様々な
ヘッジホッグ及び／又はｐｔｃ治療剤(増殖性及び抗増殖性の両方)を同定するこ
とができる。様々なアッセイ形式が十分であり、本願の開示に照らして、当業者
に理解されよう。
【０１８２】 化合物及び天然抽出物のライブラリーを試験する多くの薬物スクリーニングプ
ログラムにおいて、所定時間内に調べられる化合物の数を最大化するためには、
高スループットアッセイが望ましい。無細胞系で実施するアッセイ(精製又は半
精製タンパク質を用いて得られるもの等)は、しばしば、「一次」スクリーニン
グとして好ましく、該スクリーニングにおいて、それらは、迅速な開発及び試験
化合物に媒介される分子標的の変化の比較的容易な検出を可能にするように生成
することができる。その上、試験化合物の細胞毒性及び／又はバイオアベイラビ
リティーの効果は、一般に、イン・ビトロ系では無視され、アッセイは、主とし
て、レセプタータンパク質との結合親和性の変化において明白であり得る分子標
的に対する薬物の効果に集中する
【０１８３】 従って、ｐｔｃ治療剤の典型的スクリーニングアッセイにおいては、関心ある
化合物を、ヘッジホッグレセプタータンパク質(例えば、パッチトレセプターを
発現する細胞)とヘッジホッグタンパク質を含む混合物と、通常それがヘッジホ
ッグタンパク質と結合することのできる条件下で接触させる。次いで、この混合
物に、試験化合物を含む組成物を加える。レセプター／ヘッジホッグ複合体の検
出及び定量は、レセプタータンパク質とヘッジホッグポリペプチドの間の複合体
形成の阻止(又は増強)に対する試験化合物の効力を測定する手段を与える。この
化合物の効力は、様々な濃度の試験化合物を用いて得られたデータから投与量応
答曲線を生成することにより評価することができる。その上、対照用アッセイを
行って、比較のための基線を与えることもできる。対照用アッセイにおいては、
単離された及び精製されたヘッジホッグポリペプチドをレセプタータンパク質に
加えて、レセプター／ヘッジホッグ複合体の形成を、試験化合物の非存在下で定
量する。
【０１８４】 他の具体例において、本発明のｐｔｃ治療剤は、パッチトのスムースンドとの
会合を破壊するものである。
【０１８５】 末梢神経の維持のアゴニストとアンタゴニストは、区別することができ、その
化合物の効力は、その後の末梢神経細胞(例えば、培養細胞)を用いる試験によっ
て評価することができる。
【０１８６】 説明のための具体例において、ヘッジホッグレセプターとして用いるポリペプ
チドは、パッチトタンパク質から生成することができる。従って、典型的スクリ
ーニングアッセイは、例えばヒトパッチト遺伝子(GenBank Ｕ４３１４８)又は
他の脊椎動物起源(ニワトリパッチトについてはGenBank受理番号Ｕ４００７４を
マウスパッチトについてはＵ４６１５５を参照)から並びにキイロショウジョウ
バエ(GenBank受理番号Ｍ２８９９９)その他の無脊椎動物起源から得ることので
きるパッチトタンパク質の全部又は適当な部分を含む。パッチトタンパク質は、
スクリーニングアッセイにおいて、全タンパク質として(好ましくは、細胞表面
で発現されたもの)或はヘッジホッグポリペプチドに結合する完全長タンパク質
の断片例えば主要な細胞外ドメイン(例えば、ヒトパッチトタンパク質の残基Ａ
ｓｎ１２０〜Ｓｅｒ４３８及び／又はＡｒｇ７７０〜Ｔｒｐ１０２７に対応する
ドメイン − これは、ヘッジホッグ依存性シグナル変換の潜在的アンタゴニス
トでもある)の一方又は両方として与えることができる。例えば、パッチトタン
パク質は、例えば細胞外ドメインの一方の調製物として、又は非構造化リンカー
により共有結合で繋がれた細胞外ドメインの両方の調製物として可溶性形態で与
えることができる(例えば、Huston等(1988)PNAS 85:4879；及び米国特許第５，
０９１，５１３号参照)。他の具体例において、このタンパク質は、リポソーム
調製物の部分として与えることができ、又は細胞表面で発現させることができる
。パッチトタンパク質は、組換え遺伝子から誘導することができ、例えば、異所
的に異種細胞で発現される。例えば、このタンパク質は、標準的組換えＤＮＡ技
術により、卵母細胞、哺乳動物細胞(例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、３Ｔ３等)、又は
酵母細胞で発現され得る。これらの組換え細胞は、レセプター結合アッセイ、シ
グナル変換アッセイ又は遺伝子発現アッセイのために利用することができる。Ma
rigo等(1996)Development 122:1225-1233は、ヒトヘッジホッグの、アフリカツ
メガエル卵母細胞で異所的に発現されたヒナパッチトタンパク質に対する結合ア
ッセイを説明している。Marigo等のアッセイ系は、本願の薬物スクリーニングア
ッセイに適合させることができる。この参考文献に説明されているように、Ｓｈ
ｈは、パッチトタンパク質に、選択的な、適当な、投与量依存性の様式で結合し
、従って、パッチトがＳｈｈのレセプターであることを示している。
【０１８７】 ヘッジホッグポリペプチドとヘッジホッグレセプターの間の複合体形成は、様
々な技術により検出することができる。例えば、複合体の形成の調節は、例えば
、検出可能に標識したタンパク質例えば放射性標識、蛍光標識又は酵素標識した
ヘッジホッグポリペプチドを用いて、イムノアッセイにより、又はクロマトグラ
フィー検出により定量することができる。
【０１８８】 典型的には、無細胞アッセイ用に、ヘッジホッグレセプター又はヘッジホッグ
ポリペプチドを固定してレセプター／ヘッジホッグ複合体の、タンパク質の一つ
の未結合形態からの分離を容易にすること並びにアッセイの自動化に適合させる
ことは望ましい。一具体例において、タンパク質をマトリクスに結合させるドメ
インを加える融合タンパク質を与えることができる。例えば、グルタチオン−Ｓ
−トランスフェラーゼ／レセプター(ＧＳＴ／レセプター)融合タンパク質をグル
タチオンセファロースビーズ(Sigma Chmicals, St.Louis, MO)又はグルタチオン
由来ミクロ滴定プレート上に吸着させることができ、それらを、次いで、ヘッジ
ホッグポリペプチド(例えば、３５Ｓ標識ヘッジホッグポリペプチド)及び試験化
合物と合わせて、複合体形成を誘導する条件下で例えば塩及びｐＨに関して生理
的条件下でインキュベートする(もっとも、もう少し高緊縮の条件が望ましいで
あろうが)。インキュベーション後に、これらのビーズを洗って、如何なる未結
合のヘッジホッグポリペプチドをも除去し、マトリクスビーズ結合放射能標識を
直接測定する(例えば、ビーズをシンチラント中に置いて)か、又はレセプター／
ヘッジホッグ複合体を解離させた後に上清中で測定する。或は、これらの複合体
をビーズから解離させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにより分離することができ、ビー
ズ画分に見出されるヘッジホッグポリペプチドのレベルをゲルから、標準的電気
泳動技術を用いて定量することができる。
【０１８９】 タンパク質をマトリクス上に固定する他の技術も又、主題のアッセイでの使用
のために利用可能である。例えば、ヘッジホッグレセプタータンパク質の可溶性
部分を、ビオチンとストレプトアビジンの結合を用いて固定化することができる
。例えば、ビオチン化レセプター分子を、ビオチン−ＮＨＳ(Ｎ−ヒドロキシス
クシンイミド)から当分野で周知の技術(例えば、ビオチン化キット、Pierce Che
micals, Rockford, IL)を用いて調製して、ストレプトアビジンコートした９６
ウェルプレート(Pierce Chemical)のウェル中に固定化することができる。或は
、ヘッジホッグレセプターと反応性であるがヘッジホッグ結合を邪魔しない抗体
をプレートのウェルに誘導体化し、レセプターを抗体結合によりウェル中にトラ
ップすることができる。上記のように、ヘッジホッグポリペプチドと試験化合物
の調製物を、プレートのレセプター提示ウェル中でインキュベートし、ウェル中
にトラップされたレセプター／ヘッジホッグ複合体の量を定量することができる
。かかる複合体を検出するための典型的方法は、上記のＧＳＴ固定化複合体に関
するものに加えて、ヘッジホッグポリペプチドと反応性の抗体を用いる複合体の
免疫的検出(又は、該抗体は、レセプタータンパク質と反応性であって、結合に
ついてヘッジホッグポリペプチドと競争する)；並びにヘッジホッグポリペプチ
ドと関係した酵素活性の検出に依存する酵素結合アッセイを包含する。後者の例
において、酵素は、ヘッジホッグポリペプチドと化学的に結合し、それとの融合
タンパク質として与えることができる。説明のために、このヘッジホッグポリペ
プチドは、アルカリホスファターゼと化学的に架橋し又は一般にそれと融合する
ことができ、複合体中にトラップされたヘッジホッグポリペプチドの量は、酵素
の色原体基質(例えば、パラニトロフェニルホスフェート)を用いて評価すること
ができる。同様に、ヘッジホッグポリペプチドとグルタチオン−Ｓ−トランスフ
ェラーゼを含む融合タンパク質を用意し、１−クロロ−２，４−ジニトロベンゼ
ンを用いてＧＳＴ活性を検出することにより複合体形成を定量することができる
(Habig等(1974)J Biol Chem 249:7130)。
【０１９０】 複合体中にトラップされたタンパク質の一つを定量するための免疫検出に依存
するプロセスのために、そのタンパク質に対する抗体例えばここに記載の抗ヘッ
ジホッグ抗体を用いることができる。或は、複合体中で検出されるべきタンパク
質は、ヘッジホッグポリペプチド又はヘッジホッグレセプター配列に加えて抗体
を容易に利用できる第２のポリペプチド(例えば、市販のもの)を含む融合タンパ
ク質の形態において、「エピトープタグされた」ものであってよい。例えば、上
記のＧＳＴ融合蛋白質も、ＧＳＴ部分に対する抗体を用いて、結合の定量に利用
することができる。他の有用なエピトープタグには、ｃ−ｍｙｃ由来の１０残基
の配列を含むｍｙｃ−エピトープ(例えば、Ellison等(1991)J Biol Chem 266:21
150-21157参照)並びにｐＦＬＡＧシステム(International Biotechnologies, In
c.)又はｐＥＺＺタンパク質Ａシステム(Parmacia, NJ)が含まれる。
【０１９１】 ヘッジホッグレセプター(又は、他のヘッジホッグ結合分子)の所望の部分を可
溶性形態で用意できない場合には、リポソームビヒクルを用いて、操作可能な及
び単離し得るレセプター源を与えることができる。例えば、真正の及び組換え形
態のパッチトタンパク質を人工脂質小胞 (例えば、ホスファチジルコリンリポソ
ーム) 中に及び細胞膜由来の小胞(例えば、Bear等(1992)Cell 68:809-818；Newt
on等(1983)Biochemistry 22:6110-6117；及びReber等(1987)J Biol Chem 262:11
369-11374参照)中に再構成することができる。
【０１９２】 無細胞系(例えば、上記のもの)に加えて、この技術により与えられる容易に利
用できるヘッジホッグタンパク質源は、小分子アゴニスト／アンタゴニスト等を
同定するための細胞ベースのアッセイの生成をも容易にする。上記の組合せライ
ブラリーのスクリーニングのための細胞ベースのアッセイと同様に、ヘッジホッ
グ誘導に感受性の細胞(例えば、パッチト発現細胞)又は他のヘッジホッグ誘導に
感受性の筋芽細胞由来の細胞をヘッジホッグタンパク質及び関心ある試験薬剤と
接触させ、このアッセイは、細胞への単独の結合に由来する如何なるものをも評
価する(試験薬剤の存在下又は非存在下での標的細胞によるヘッジホッグ誘導応
答における調節に対して)。無細胞系と同様に、ヘッジホッグ活性において統計
的に有意の変化(阻害又は増強)を生じる薬剤を同定することができる。
【０１９３】 他の具体例において、細胞ベースのアッセイは、パッチト及びスムースンドタ
ンパク質の会合(例えば、細胞表面膜又はリポソーム調製物)を破壊する薬剤を評
価する。
【０１９４】 パッチトタンパク質を天然において発現している細胞の特性決定に加えて、パ
ッチトを異所的に発現するように遺伝子工学処理した細胞を、薬物スクリーニン
グアッセイに利用することができる。例として、パッチトタンパク質を低レベル
で発現するか該タンパク質の発現を欠く細胞例えばアフリカツメガエル卵母細胞
、ＣＯＳ細胞又は酵母細胞を標準的技術を用いて遺伝子工学的に改変してパッチ
トタンパク質を異所的に発現させることができる(Marigo等、前書参照)。
【０１９５】 その結果生成した細胞(例えば、機能的パッチトレセプターを発現する細胞)を
レセプター結合アッセイで使用して、ヘッジホッグ結合のアゴニスト又はアンタ
ゴニストを同定することができる。結合アッセイは、全細胞を用いて実施するこ
とができる。その上、本発明の組換え細胞を処理して、ヘッジホッグ依存性シグ
ナル経路に関与するタンパク質をコードする他の異質遺伝子を含ませることがで
きる。例えば、スムースンド、コスタル−２及び／又はフューズドの少なくとも
１つの遺伝子産物を、試薬細胞中でパッチトと同時発現させ、アッセイは、ヘッ
ジホッグシグナル変換カスケードの機能的再構成に対する感度を有する。
【０１９６】 或は、再構成したパッチトタンパク質を利用するリポソーム調製物を利用する
ことができる。真正及び組換え起源の両方からのデタージェント抽出物から精製
したパッチトタンパク質を、人工の脂質小胞中(例えば、ホスファチジルコリン
リポソーム)又は細胞膜由来の小胞中で再構成することができる(例えば、Bear等
(1992)Cell 68:809-818；Newton等(1983)Biochemistry 22:6110-6117；及びRebe
r等(1987)J Biol Chem 262:11369-11374参照)。その結果生成したリポソームの
ラメラ構造及び大きさは、電子顕微鏡検査により特性決定することができる。パ
ッチトタンパク質の再構成膜における外向き配向を例えば免疫電子顕微鏡観察に
より示すことができる。パッチトを含むリポソームと含まないリポソームの、候
補の薬剤の存在下でのヘッジホッグタンパク質結合活性を、ヘッジホッグ−パッ
チト相互作用の潜在的モジュレーターを同定するために比較することができる。
【０１９７】 これらの細胞ベースのアッセイにおいて用いるヘッジホッグタンパク質は、精
製起源(天然又は組換え起源)として、又はこのタンパク質を発現する細胞／組織
(標的細胞と共存培養)の形態で与えることができる。無細胞系におけるように、
単純な結合(誘導ではなく)が、アッセイで評価されるヘッジホッグ活性である場
合には、そのタンパク質を、前述の技術の何れかによって標識することができる
(例えば、蛍光、酵素若しくは放射能により、又はイムノアッセイにより検出)。
【０１９８】 結合研究に加えて、機能的アッセイを用いて、ヘッジホッグ又はパッチトの活
性のモジュレーター即ちアゴニスト又はアンタゴニストを同定することができる
。試験薬剤と接触したパッチト発現細胞における細胞内シグナルの変化例えば二
次メッセンジャー及び遺伝子発現の変化を検出することにより、パッチトシグナ
リングに対する候補のアゴニスト及びアンタゴニストを同定することができる。
【０１９９】 多くの遺伝子産物(パッチト、転写因子キュビタスインターラプタス(ｃｉ)、
セリン／スレオニンキナーゼヒューズド(ｆｕ)並びにコスタル−２、スムースン
ド及びサプレッサーオブヒューズドの遺伝子産物を含む)が、パッチト媒介のシ
グナル変換に関係してきた。
【０２００】 ヘッジホッグタンパク質とパッチトとの相互作用は、下流のエフェクターの活
性化及び阻害を含むカスケードを推進し、その最終結果は、幾つかの場合には、
遺伝子の転写又は翻訳における検出可能な変化である。パッチトシグナリングの
潜在的転写標的は、パッチト遺伝子自身であり(Hidalgo及びIngham, 1990 Devel
opment 110, 291-301；Marigo等、1996)、キイロショウジョウバエキュビタスイ
ンターラプタス遺伝子の脊椎動物同族体、ＧＬＩ遺伝子(Hui等(1994)Dev Biol 1
62:402-413)である。パッチト遺伝子発現は、Ｓｈｈに応答性の肢芽及び神経板
の細胞で誘導されることが示されてきた(Marigo等(1996)PNAS, 印刷中；Marigo
等(1996) Development 122:1225-1233)。ＧＬＩ遺伝子は、亜鉛フィンガーＤＮ
Ａ結合ドメインを有する推定の転写因子をコードしている(Orenic等(1990)Genes
& Dev 4:1053-1067；Kinzler等(1990)Mol Cell Biol 10:634-642)。ＧＬＩ遺伝
子の転写は、肢芽においてヘッジホッグに応答してアップレギュレートされると
報告されているが、ＧＬＩ３は、ヘッジホッグ誘導に応答してダウンレギュレー
トされる(Marigo等(1996) Development 122:1225-1233)。かかる標的遺伝子例え
ばパッチト又はＧＬＩ遺伝子(これらは、パッチトシグナリングに応答するこれ
らの遺伝子のアップ又はダウンレギュレーションの原因である)から転写調節配
列を選択すること及びかかるプロモーターをレポーター遺伝子に機能的に結合す
ることにより、特定の試験化合物のパッチトシグナリング経路を調節する能力に
対する感度を有する転写ベースのアッセイを得ることができる。レポーター遺伝
子の発現は、従って、分化／休止のｐｔｃ誘導のアゴニスト又はアンタゴニスト
として作用する化合物の開発のための価値あるスクリーニングツールを与える。
【０２０１】 この発明のレポーター遺伝子ベースのアッセイは、上記の事象(例えば、転写
の調節)のカスケードの最後の段階を測定する。従って、このアッセイの一具体
例の実施では、レポーター遺伝子構築物を、ｐｔｃシグナリングに依存する検出
シグナルを生成するために試薬細胞に挿入する。標的遺伝子の転写調節配列中に
存在するｐｔｃシグナリングに応答する潜在的調節エレメントを同定するために
、標的遺伝子のゲノムクローンのネストした欠失を、標準的技術を用いて構成す
ることができる。例えば、Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel,
F.M.等(編) Greene Publishing Associates,(1989)；米国特許第５，２６６，４
８８号；Sato等(1995)J Biol Chem 270:10314-10322；及びKube等(1995) Cytoki
ne 7:1-7を参照されたい。遺伝子の５’隣接領域からのＤＮＡ断片のネストした
セットを、レポーター遺伝子例えばルシフェラーゼ遺伝子の上流に位置させ、パ
ッチト発現細胞においてレポーター遺伝子の発現を指示するそれらの能力につい
てアッセイする。レポーター遺伝子構築物で一時的にトランスフェクトした宿主
細胞をヘッジホッグの存在下及び非存在下でのレポーター遺伝子の発現の誘導に
ついて評価して、パッチト依存性シグナリングに応答する調節配列を決定する。
【０２０２】 このアッセイの一具体例の実施においては、ヘッジホッグタンパク質による誘
導による二次メッセンジャーに依存する検出シグナルを生成するためにレポータ
ー遺伝子構築物を試薬細胞に挿入する。典型的には、レポーター遺伝子構築物は
、レポーター遺伝子を、ヘッジホッグ活性に応答する少なくとも１つの転写調節
エレメントに機能的に結合して含み、レポーター遺伝子の発現レベルがヘッジホ
ッグ依存性検出シグナルを与える。レポーター遺伝子からの転写量は、当業者に
公知の何れかの適当な方法を用いて測定することができる。例えば、レポーター
遺伝子からのｍＲＮＡの発現は、ＲＮアーゼ保護又はＲＮＡベースのＰＣＲを用
いて検出することができ、レポーター遺伝子のタンパク質産物を特徴的な染色又
は固有の活性により同定することができる。次いで、レポーター遺伝子からの発
現量を、試験化合物(又はヘッジホッグ)の非存在下での同じ細胞における発現量
と比較するか、又は標的レセプタータンパク質を欠く実質的に同じ細胞における
転写量と比較することができる。転写量の如何なる統計的に(又は、統計以外で)
有意の差異も、試験化合物が、幾分か、パッチトタンパク質のシグナル変換を変
化させたこと例えば試験化合物が潜在的なｐｔｃ治療剤であることを示す。
【０２０３】 下記にそれ以上詳細に検討する通りに、好適な実施態様では、リポーターの遺
伝子生成物は、その生成物に付随する内因性活性によって検出される。例えば、
リポーター遺伝子は、酵素活性によって、色、蛍光、又はルミネセンスに基づい
て検出シグナルを生じる遺伝子生成物を検出し得る。その他の好適な実施態様で
は、リポーター又はマーカー遺伝子は、選択的増殖利点を備える、例えば、リポ
ーター遺伝子は、細胞生存度を高め、細胞栄養要求を軽減し、及び／又は耐薬剤
性をもたらし得る。
【０２０４】 好適なリポーター遺伝子は、容易に検出可能なものである。リポーター遺伝子
は、また、構成体中に所望の転写調節配列を含み又はその他の望ましい性質を示
す遺伝子との融合遺伝子の形態で含まれ得る。リポーター遺伝子の例は、下記を
含み、それらに限定しない：ＣＡＴ（クロラムフェニコールアセチルトランスフ
ェラーゼ）（Ａｌｔｏｎ及びＶａｐｎｅｋ（１９７９），Ｎａｔｕｒｅ ２８２
：８６４−８６９）ルシフェラーゼ及びベータ−ガラクトシダーゼのようなその
他の酵素検出系；発光性飛翔昆虫ルシフェラーゼ（ｄｅＷｅｔ等（１９８７），
Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：７２５−７３７）；細菌性ルシフェラーゼ（
Ｅｎｇｅｂｒｅｃｈｔ及びＳｉｌｖｅｒｍａｎ（１９８４），ＰＮＡＳ １：４
１５４−４１５８；Ｂａｌｄｗｉｎ等（１９８４），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
２３：３６６３−３６６７）；アルカリホスファターゼ（Ｔｏｈ等（１９８９
）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８２：２３１−２３８，Ｈａｌｌ等（１９８
３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．２：１０１）、ヒト胎盤分泌されるアルカ
リホスファターゼ（Ｃｕｌｌｅｎ及びＭａｌｉｍ（１９９２）Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１６：３６２−３６８）。
【０２０５】 リポーター遺伝子構成体中に含まれ得る転写制御要素は、プロモーター、エン
ハンサー、及びリプレッサー並びにアクチベーター結合部位を含み、それらに限
定しない。適した転写調節要素は、遺伝子であって、それらの発現がパッチトシ
グナル形質導入経路を変調した後に誘発されるものの転写調節領域に由来され得
る。転写制御要素が由来する好適な遺伝子の特徴は、静止細胞における低い又は
検出し得ない発現、数分内の細胞外刺激の転写レベルでの急速な誘発、一過性で
ありかつ新規なタンパク質合成に無関係な誘発を含み、それらに限定せず、続い
ての転写の遮断は、新規なタンパク質合成を要し、これらの遺伝子から転写され
るｍＲＮＡは、短い半減期を有する。これらの性質のすべてが存在することは必
要でない。
【０２０６】 なおその他の実施態様では、第二メッセンジャー生成は、細胞内カルシウムの
代謝のような検出工程において直接測定することができ、リン脂質代謝又はアデ
ニレートシクラーゼ活性を定量化し、例えば、リン脂質加水分解の生成物ＩＰ３
、ＤＡＧ又はｃＡＭＰを測定することができた。例えば、最近の研究は、関係さ
れるタンパク質キナーゼＡ（ＰＫＡ）をヘッジホッグ／パッチトシグナリングの
可能な成分として有する（Ｈａｍｍｅｒｓｃｈｍｉｄｔ等（１９９６）Ｇｅｎｅ
ｓ ＆ Ｄｅｖ １０：６４７）。高いＰＫＡ活性は、これらの系においてヘッ
ジホッグシグナリングに拮抗するのが示された。ＰＫＡが直接下流に作用するか
又はヘッジホグシグナリングと平行に作用するかどうかは明らかでないが、ヘッ
ジホッグシグナリングがＰＫＡ活性の抑制を経て起きることが可能である。これ
より、ＰＫＡの検出は、本アッセイについての可能な読出しとなる。
【０２０７】 １つの好ましい具体例において、ｐｔｃ治療薬はＰＫＡ阻害剤である。ペプチ
ジル及び有機化合物の両方を含めて様々なＰＫＡ阻害剤が当技術分野において知
られている。例えば、ｐｔｃ治療薬は次の一般式で表わされるような５−イソキ
ノリンスルホンアミドであることができる。
【化８】 （ここで、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立的に水素を表わすことができ、原子価及
び安定性が可能にするときは、低級アルキル、低級アルケニル、低級アルキニル
、カルボニル（例えばカルボキシル、エステル、ホルメート若しくはケトン）、
チオカルボニル（例えばチオエステル、チオアセテート若しくはチオホルメート
）、アミノ、アシルアミノ、アミド、シアノ、ニトロ、アジド、サルフェート、
スルホネート、スルホンアミド、−(ＣＨ２)ｍ−Ｒ８、−(ＣＨ２)ｍ−ＯＨ、−
(ＣＨ２)ｍ−Ｏ−低級アルキル、−(ＣＨ２)ｍ−Ｏ−低級アルケニル、−(ＣＨ
２)ｎ−Ｏ−(ＣＨ２)ｍ−Ｒ８、−(ＣＨ２)ｍ−ＳＨ、−(ＣＨ２)ｍ−Ｓ−低級
アルキル、−(ＣＨ２)ｍ−Ｓ−低級アルケニル、−(ＣＨ２)ｎ−Ｓ−(ＣＨ２)ｍ
−Ｒ８を表わすことができ、 Ｒ１及びＲ２はまた、Ｎと一緒になってヘテロ環（置換されたもの又は置換さ
れていないもの）を形成し、 Ｒ３は存在しないか又はイソキノリン環に対する１種以上の置換基、例えば低
級アルキル、低級アルケニル、低級アルキニル、カルボニル（例えばカルボキシ
ル、エステル、ホルメート若しくはケトン）、チオカルボニル（例えばチオエス
テル、チオアセテート若しくはチオホルメート）、アミノ、アシルアミノ、アミ
ド、シアノ、ニトロ、アジド、サルフェート、スルホネート、スルホンアミド、
−(ＣＨ２)ｍ−Ｒ８、−(ＣＨ２)ｍ−ＯＨ、−(ＣＨ２)ｍ−Ｏ−低級アルキル、
−(ＣＨ２)ｍ−Ｏ−低級アルケニル、−(ＣＨ２)ｎ−Ｏ−(ＣＨ２)ｍ−Ｒ８、−
(ＣＨ２)ｍ−ＳＨ、−(ＣＨ２)ｍ−Ｓ−低級アルキル、−(ＣＨ２)ｍ−Ｓ−低級
アルケニル若しくは−(ＣＨ２)ｎ−Ｓ−(ＣＨ２)ｍ−Ｒ８を表わし、 Ｒ８は置換又は非置換アリール、アルアルキル、シクロアルキル、シクロアル
ケニル又はヘテロ環を表わし、 ｎ及びｍはそれぞれの出現について独立的に０又は１〜６の範囲の整数である
。）
【０２０８】 １つの好ましい具体例において、ＰＫＡ阻害剤はＮ−［２−（（ｐ−ブロモシ
ンナミル）アミノ）エチル］−５−イソキノリンスルホンアミド（Ｈ−８９；Ca
lbiochem Cat. No. 371963）、例えば次式を有するものである。
【化９】
【０２０９】 別の具体例において、ＰＫＡ阻害剤は１−（５−イソキノリンスルホニル）−
２−メチルピペラジン（Ｈ−７；Calbiochem Cat. No. 371955）、例えば次式を
有するものである。
【化１０】
【０２１０】 さらに別の具体例において、ＰＫＡ阻害剤は次の構造を有するＫＴ５７２０（
Calbiochem Cat. No. 420315）である。
【化１１】
【０２１１】 また、様々なヌクレオシド類似体もＰＫＡ阻害剤として有用である。例えば、
ＰＫＡのキナーゼ活性を阻害する環状ＡＭＰ類似体、例えば８−ブロモ−ｃＡＭ
Ｐ又はジブチリル−ｃＡＭＰで主題の方法を実施することができる。
【化１２】
【０２１２】 ＰＫＡ活性の例示的なペプチジル阻害剤には、ＰＫＡ熱安定阻害剤（アイソホ
ームα、例えばCalbiochem Cat. No. 539488及びWenら（１９９５年）J. Biol.
Chem. 270:2041）が包含される。
【０２１３】 ある種のヘッジホッグ（hedgehog）受容体はホスホリパーゼの活性を刺激する
ことができる。イノシトール脂質は、標準的な脂質抽出技術によって抽出して分
析することができる。また、３種のイノシトール脂質（ＩＰ１、ＩＰ２、ＩＰ３
）すべての水溶性誘導体を、放射性同位元素識別技術によって定量化することも
できる。
【０２１４】 細胞内カルシウムの動態化又は細胞の外部からのカルシウムの内向きフラック
スは、ヘッジホッグ刺激又はそれの欠乏への応答になり得る。試薬細胞中のカル
シウムフラックスは、標準技術を使用して測定することができる。適したインデ
ィケーター、蛍光性、生物発光性、メタロクロミック、又はＣａ＋＋−センシチ
ブ微小電球の選定は、細胞タイプ並びに研究中の事象の大きさ及び時定数に依存
する（Ｂｏｒｌｅ（１９９０）Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｈｅａｌｔｈ Ｐｅｒｓｐｅｃ
ｔ ８４：４５−５６）。Ｃａ＋＋検出の典型的な方法として、細胞に標準方法
を使用してＣａ＋＋−センシチブ蛍光染料フラ−２又はインド−１を入れること
ができ、Ｃａ＋＋の変化を蛍光光度計を使用して測定することができた。
【０２１５】 アッセイの所定の実施態様では、細胞ホスホリル化の変化についてスクリーン
するのが望ましいかもしれない。例として、セリン／トレオニンキナーゼをコー
ド化するショウジョウバエ遺伝子フューズド（ｆｕ）が、ヘッジホッグシグナリ
ングにおいて潜在的な下流標的として同定された。（Ｐｒｅａｔ等、１９９０，
Ｎａｔｕｒｅ ３４７，８７−８９；Ｔｈｅｒｏｎ等、Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．４４
．６５−８０）。化合物がセリン／トレオニンキナーゼ活性を変調する能力は、
コロニー免疫ブロット法（Ｌｙｏｎｓ及びＮｅｌｓｏｎ（１９８４）Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：７４２６−７４３０）を使用しホ
スホリル化されたセリン／トレオニン残基に対する抗体を用いてスクリーンする
ことができた。そのようなアッセイをおこなうための試薬は、市販されており、
例えば、それらの残基のホスホリル化の増大を測定するホスホセリン及びホスホ
トレオニン特異性抗体を商業元から購入することができる。
【０２１６】 なお別の実施態様では、ｐｔｃ療薬は、パッチト媒介されるシグナル形質導入
経路に関与されるタンパク質の発現を抑制するアンチセンス分子である。例示す
るために、フューズド、肋骨−２，スムーズンド及び／又はＧｌｉ遺伝子のよう
な、パッチトシグナル経路に関与されるタンパク質の発現を抑制することによっ
て、パッチトシグナル経路が細胞の増殖を抑制する能力を変える、例えば効力を
増す又は抑えることができる。
【０２１７】 本明細書中で用いる通りの「アンチセンス」治療法とは、パッチされたヘッジ
ホッグタンパク質又はパッチト媒介されるシグナル形質導入経路に関与されるタ
ンパク質をコード化する細胞性ｍＲＮＡ及び／又はゲノム性ＤＮＡと細胞条件下
で特異的に雑種形成する（例えば、結合する）オリゴヌクレオチドプローブ又は
それらの誘導体を投与する又は現場発生させることを言う。雑種形成は、そのタ
ンパク質の発現を、例えば転写及び／又はトランスレーションを抑制することに
よって抑制するはずである。結合は、在来の塩基対相補性により、又は例えば、
ＤＮＡ腹式に結合する場合では、二重螺旋の主要な溝における特定的な相互作用
によることができる。「アンチセンス」治療法とは、当分野で一般的に採用され
る技術の範囲を言い、オリゴヌクレオチド配列への特定的な結合に基づく任意の
治療法を含むのが普通である。
【０２１８】 本発明のアンチセンス構成体は、例えば発現プラスミドとして導出することが
でき、これは、細胞中で転写されると、標的細胞性ｍＲＮＡの少なくとも特有の
部分に相補性のＲＮＡを産生する。代わりに、アンチセンス構成体は、オリゴヌ
クレオチドプローブであり、これは、半ビボで生成されかつ細胞中に導入される
と、標的遺伝子のｍＲＮＡ及び／又はゲノム性配列と雑種形成することによって
発現の抑制を引き起こす。そのようなオリゴヌクレオチドプローブは、内因性ヌ
クレアーゼ、例えばエキソヌクレアーゼ及び／又はエンドヌクレアーゼに耐性で
あり、従ってインビボ安定な改質されたオリゴヌクレオチドであるのが好ましい
。アンチセンスオリゴヌクレオチドとして使用するための具体例としての核酸分
子は、ＤＮＡのホスホロアミデート、ホスホチオエート及びメチルホスホネート
類似体である（また、米国特許第５，１７６，９９６号；同第５，２６４，５６
４号；及び同第５，２５６，７７５号も参照）。加えて、アンチセンス治療法に
おいて有用なオリゴマーを構築する一般的なアプローチは、例えばＶａｎ ｄｅ
ｒ Ｋｒｏｌ等（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ８：９５８−９７６
；及びＳｔｅｉｎ等（１９８８）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ４８：２６５９−２６
６８によって検討された。
【０２１９】 発明の方法において用いるためのアンチセンスオリゴヌクレオチドを構築する
際に下記のいくつかを考慮に入れるべきである：（１）オリゴは５０％以上のＧ
Ｃ含量を有すべきであり；（２）Ｇが３以上のストレッチを有する配列を避ける
べきであり；及び（３）オリゴヌクレオチドは、２５〜２６のマーよりも長くす
べきでない。アンチセンスオリゴヌクレオチドをテストする時は、不適当な組み
合わせの対照を構築することができる。対照は、同じ塩基比を保つために対応す
るアンチセンスオリゴヌクレオチドの配列順序を逆にすることによって発生させ
ることができる。
【０２２０】 例示の実施態様では、ｐｔｃ治療薬は、パッチトの発現を抑制して、例えばヘ
ッジホッグによってパッチトの抑制によく似るためのアンチセンス構成体にする
ことができる。具体例としてのアンチセンス構成体は、下記を含む：
【化１３】 5'-GTCCTGGCGCCGCCGCCGCCGTCGCC 5'-TTCCGATGACCGGCCTTTCGCGGTGA 5'-GTGCACGGAAAGGTGCAGGCCACACT
【０２２１】 ＶＩ．ヘッジホッグ及びｐｔｃ治療薬の具体例としての製薬調剤 配合すべきヘッジホッグ及びｐｔｃ治療薬の源は、作用物質の特定の形態に依
存することになる。小さい有機分子及びペプチジル断片を化学的に合成し、製薬
／化粧使用法に適した純形態で提供することができる。天然エキストラクトの生
成物は、当分野で知られた技術に従って精製することができる。例えば、Ｃｏｘ
等の米国特許第５，２８６，６５４号は、分泌されたタンパク質の天然産形態を
精製する方法について記載しており、ヘッジホッグポリペプチドを精製するため
に適応させることができる。ヘッジホッグポリペプチドの組み換え源も利用可能
である。例えば、ヘッジホッグポリペプチドをコード化する遺伝子が、取り分け
ＰＣＴ公表ＷＯ９５／１８８５６及びＷＯ９６／１７９２４から知られている。
【０２２２】 末梢神経障害を治療する当業者ならば、製薬又は化粧調剤において配合すべき
ヘッジホッグ又はｐｔｃ治療薬の有効量を決めることができる。
【０２２３】 発明の方法において用いるヘッジホッグ又はｐｔｃ治療薬配合物は、適した組
成物の形態で適用するのが最も好ましい。適した組成物として、全身系で又は局
部に投与する薬剤用に通常採用されるすべての組成物を挙げることができる。製
薬上許容し得るキャリヤーは、有効成分と作用しないように、実質的に不活性で
あるべきである。適したキャリヤーは、水、アルコール、ポリエチレングリコー
ル、鉱油又はペトロリュームゲル、ポリプロピレングリコール、等を含む。
【０２２４】 本発明の製剤組成物を調製するには、有効成分としての特定のヘッジホッグ又
はｐｔｃ治療薬の有効量を製薬上許容し得るキャリヤーと均質な混合物で組合せ
、該キャリヤーは、投与するために所望される調剤の形態に応じて広範囲の形態
を採ってよい。これらの製剤組成物は、特に、経口で、直腸で、経皮で、又は非
経口注入によって投与するために適した単位投与形態であるのが望ましい。例え
ば、組成物を経口投与形態で調製する際には、懸濁液、シロップ、エリキシル及
び溶液のような経口液体調剤の場合には、例えば水、グリコール、油、アルコー
ル、等のような通常の製薬媒体；又は粉末、ピル、カプセル及び錠剤の場合には
、デンプン、カオリン、潤滑剤、バインダー、粉状化剤、等のような固体キャリ
ヤーの内のいずれかを採用してよい。錠剤及びカプセルが、それらが投与容易で
あるために、最も有利な経口投与ユニット形態を表し、その場合に、固体の調剤
キャリヤーを採用するのは自明である。非経口組成物については、キャリヤーは
、殺菌した水を少なくとも大部分で含むことになるのが普通であるが、その他の
成分、例えば溶解を助成するための成分を入れてもよい。注入可能な溶液を、例
えばキャリヤーが食塩水、グルコース溶液又は食塩水とグルコース溶液との混合
物を含むようにして調製してもよい。また、注入可能な懸濁液を調製してもよく
、この場合に、適当な液体キャリヤー、懸濁剤、等を採用してよい。また、使用
する直ぐ前に液状形態の調剤に転化することを意図する固体形態の調剤も含む。 経皮投与に適した組成物では、キャリヤーは、必要に応じて浸透増進剤及び／
又は適した湿潤剤に、必要に応じて任意の性質の適した添加剤を従たる割合で組
み合わせて含み、該添加剤は、皮膚に有意な有害な作用を導入しないものである
。
【０２２５】 製剤の直接局所適用に加えて、これらは別の方法によって局所投与することが
でき、例えば感熱及び／又は感圧マトリックスや、体液中に可溶のフィルム又は
固体キャリヤー等の、活性物質のその後の放出、好ましくは持続した放出のため
のものの中に封入することができる。
【０２２６】 局所適用のための好適な組成物としては、治療薬を局所投与するために通常用
いされるすべての組成物、例えばクリーム、ゼリー、包帯、シャンプー、チンキ
剤、パスタ（泥膏）、軟膏、膏薬、パウダー、液状又は半液状処方物等を挙げる
ことができる。かかる組成物の適用は、エアゾールによって、例えば窒素、二酸
化炭素、フレオンのような噴射剤を用いて、又はポンプスプレー、ドロップ、ロ
ーションのように噴射剤なしで、又は綿棒によって適用できる増粘組成物のよう
な半固体によって、行うことができる。特定的な組成物においては、膏薬クリー
ム、パスタ、ゼリー、軟膏等のような半固体組成物を用いるのが便利であろう。
【０２２７】 投与の容易さ及び投与量の均一性のために、投与量単位の形態で主題の組成物
を処方するのが特に有利である。本明細書及び請求の範囲において用いられる投
与量単位形態とは、必要な製薬キャリヤーと共同で所望の治療効果をもたらすよ
うに計算された予め定められた量の活性成分を各単位が含有する単位投与量とし
て好適な物理的に消滅する単位を言う。かかる投与量単位形態の例は、錠剤（刻
み目入り又は被覆錠剤）、カプセル、丸薬、パウダー、パケット（包み）、カシ
ェ剤（wafers）、注射用溶液若しくは懸濁液、ティースプーンフル、テーブルス
プーンフル等及びそれらの分離されたマルチプルである。
【０２２８】 本発明の製薬製剤は上述のように多くの用途に用いることができ、化粧品用途
を考えることができる。当技術分野において周知の化粧品用途、好ましくは低ア
レルギー性のもの及びｐＨ調節されたものが特に好ましく、これらには化粧水、
パック剤、ローション、皮膚乳剤又は乳状ローションが包含される。これら製剤
には、ヘッジホッグ又はｐｔｃ治療薬に加えて、かかる製剤に通常用いられる成
分を含有する。かかる成分の例には、油、脂肪、ワックス、界面活性剤、湿潤剤
、増粘剤、抗酸化剤、粘度安定剤、キレート剤、緩衝剤、保存料、香料、染料、
低級アルカノール等がある。所望ならば、さらなる成分、例えば抗炎症剤、抗細
菌剤、抗菌剤、消毒剤、ビタミン類、日焼け止め剤、抗生物質又は他のニキビ止
め剤を組成物に組み込むことができる。
【０２２９】 油の例には、オリーブ油及び硬化油のような脂肪及び油；蜜蝋及びラノリン（
羊毛脂）のようなワックス；流動パラフィン、セレシン、スクアランのような炭
化水素；ステアリン酸及びオレイン酸のような脂肪酸；セチルアルコール、ステ
アリルアルコール、ラノリンアルコール及びヘキサデカノールのようなアルコー
ル；並びにミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル及びステアリ
ン酸ブチルのようなエステルが含まれる。界面活性剤としては、ステアリン酸ナ
トリウム、セチル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレンラウリルエーテルホスフ
ェート、Ｎ−アシルグルタミン酸ナトリウムのようなアニオン性界面活性剤；ス
テアリルジメチルベンジルアンモニウムクロリド及びステアリルトリメチルアン
モニウムクロリドのようなカチオン性界面活性剤；アルキルアミノエチルグリシ
ン塩酸塩溶液及びレシチンのような両性界面活性剤；並びにグリセリンモノステ
アレート、ソルビタンモノステアレート、ショ糖脂肪酸エステル、プロピレング
リコールモノステアレート、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリエチレ
ングリコールモノステアレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテー
ト、ポリオキシエチレンココヤシ脂肪酸モノエタノールアミド、ポリオキシプロ
ピレングリコール（例えば商品名「Pluronic」の下で販売されている物質）、ポ
リオキシエチレンヒマシ油、及びポリオキシエチレンラノリンのようなノニオン
性界面活性剤を挙げることができる。湿潤剤の例にはグリセリン、１，３−ブチ
レングリコール及びプロピレングリコールが包含される；低級アルコールの例に
はエタノール及びイソプロパノールが包含される；増粘剤の例にはキサンタンガ
ム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポ
リエチレングリコール及びナトリウムカルボキシメチルセルロースが包含される
；抗酸化剤の例にはブチル化ヒドロキシトルエン、ブチル化ヒドロキシアニソー
ル、没食子酸プロピル、クエン酸及びエトキシキンが包含される；キレート剤の
例にはエデト酸ナトリウム及びエタンヒドロキシルジホスフェートが包含される
；緩衝剤の例にはクエン酸、クエン酸ナトリウム、ホウ酸、ホウ砂、燐酸水素二
ナトリウムが包含される；保存料の例にはｐ−ヒドロキシ安息香酸メチル、ｐ−
ヒドロキシ安息香酸エチル、ジヒドロ酢酸、サリチル酸及び安息香酸が包含され
る。
【０２３０】 軟膏、クリーム、化粧水、皮膚乳剤等を調製するためには、例えばヘッジホッ
グ又はｐｔｃ治療薬の０．０１〜１０％、特に０．１〜５％、さらに特に０．２
〜２．５％の活性成分が組成物中に組み込まれる。軟膏及びクリームにおいては
、キャリヤーは例えば１〜２０％、特に５〜１５％の湿潤剤、０．１〜１０％、
特に０．５〜５％の増粘剤及び水から成る；又は前記キャリヤーは７０〜９９％
、特に２０〜９５％の界面活性剤及び０．２０％、特に２．５〜１５％の脂肪；
又は８０〜９９．９％、特に９０〜９９％の増粘剤；又は５〜１５％の界面活性
剤、２〜１５％の湿潤剤、０〜８０％の油、非常に少量（２％未満）の保存料、
着色料及び／若しくは香料、並びに水から成ることができる。化粧水においては
、キャリヤーは例えば２〜１０％の低級アルコール、０．１〜１０％、特に０．
５〜１％の界面活性剤、１〜２０％、特に３〜７％の湿潤剤、０〜５％の緩衝剤
、水及び少量（２％未満）の保存料、染料及び／又は香料から成る。皮膚乳剤に
おいては、キャリヤーは典型的には１０〜５０％の油、１〜１０％の界面活性剤
、５０〜８０％の水並びに０〜３％の保存料及び／又は香料から成る。上記の製
剤において、すべての％記号は重量／重量百分率を意味する。
【０２３１】 本発明の方法において用いるための特定の組成物は、ヘッジホッグ又はｐｔｃ
治療薬をリポソーム含有組成物中に配合したものである。リポソームは、極性脂
質、例えばホスファチジルコリン、エタノールアミン及びセリン、スフィンゴミ
エリン、カルジオライピン、プラスマロゲン、ホスファチジン酸及びセレビオサ
イドのような両親媒性分子によって形成される人工のベシクルである。リポソー
ムは、適した両親媒性分子を水又は水溶液中で膨潤させて通常互いに水性物質に
よって分離される多数の二層で構成される多層構造の液状結晶を形成する時に形
成される（また、粗リポソームとも呼ばれる）。水性物質を被包する単一の二層
からなっていることが知られている別のタイプのリポソームは、ユニラメラベシ
クルと呼ばれる。脂質が膨潤する間に水溶性物質を水性相に入れるならば、それ
らは脂質二層の間の水性層中に取り込められることになる。
【０２３２】 水溶性の有効成分、例えばヘッジホッグポリペプチドの種々の塩のようなもの
は、分子層の間の水性空間中に被包される。有機ミメティックのようなヘッジホ
ッグ又はｐｔｃ治療薬の脂質溶性の有効成分が主に脂質層中に組み込められるが
、極性ヘッド基が層から水性空間中に突き出てよい。これらの化合物の被包は、
多数の方法によって達成することができる。最も一般的に用いられている方法は
、リン脂質の薄いフィルムを有機溶媒から蒸発させることによってフラスコの壁
の上にキャストすることを伴う。このフィルムを適した水性媒体中に分散させる
時に、マルチラメラリポソームが形成される。粗リポソームは、適した音波処理
する際に、一層小さい同様に閉止されたベシクルを形成する。
【０２３３】 水溶性の有効成分は、キャストフィルムを化合物の水溶液で分散させることに
よって組み込むのが普通である。次いで、未被包の化合物を、遠心分離、クロマ
トグラフィー、透析又はその他の適した手順によって除く。脂質溶性の有効成分
は、それをリン脂質と共に有機溶媒中に溶解した後にフィルムをキャストするこ
とによって組み込むのが普通である。その物質のリン脂相への溶解度を越えない
又は存在する量が脂質に結合されることができる量を超過しないならば、上記の
方法によって調製されるリポソームは、脂質二層中の結合される物質のほとんど
を含有するのが普通であり；未被包の物質からリポソームを分離することは必要
でない。
【０２３４】 ヘッジホッグ及びｐｔｃ治療薬のリポソーム配合形態を調製するための特に簡
便な方法は、ＥＰ−Ａ−２５３，６１９に記載されている方法であり、ＥＰ−Ａ
−２５３，６１９を本明細書中に援用する。この方法では、脂質成分を有機媒体
中に溶解し、脂質成分の有機溶液を加圧下で水性成分中に注入し、その間同時に
有機成分と水性成分とを高速ホモジナイザー又は混合手段によって混合すること
によって被包された有効成分を含有する単一の二層をなすリポソームを調製する
もので、その際リポソームが自然発生的に形成される。
【０２３５】 被包されたヘッジホッグ又はｐｔｃ治療薬を含有する単一の二層をなすリポソ
ームは、直接採用することができ又はそれらは、局部投与するために適した製薬
上許容し得るキャリヤー中に用いることができる。リポソームの粘度は、適した
増粘剤、例えばキサンタンガム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプ
ロピルメチルセルロース及びこれらの混合物のようなものを一種又はそれ以上加
えることによって増大させることができる。水性成分は、水単独からなってもよ
く又はそれは、電解質、緩衝系及びその他の成分、例えば防腐薬のようなものを
含有してもよい。採用することができる適した電解質は、アルカリ金属塩及びア
ルカリ土類金属塩のような金属塩を含む。好適な金属塩は、塩化カルシウム、塩
化ナトリウム及び塩化カリウムである。電解質の濃度は、ゼロ〜２６０ｍＭ、好
ましくは５〜１６０ｍＭの範囲にすることができる。水性成分を、有機成分を注
入する間大きな乱流をもたらすことによって均質化を達成するのに適応させるこ
とができる適した容器に入れる。２つの成分の均質化は、容器内で達成するする
ことができ、又は代わりに水性成分と有機成分とを別々に容器の外部に配置した
混合手段の中に注入してもよい。後者の場合には、リポソームを混合手段の中で
形成し、次いで収集するために別の容器に移す。
【０２３６】 有機成分は、適した非毒性の製薬上許容し得る溶媒、例えばエタノール、グリ
セロール、プロピレングリコール及びポリエチレングリコールのようなもの、並
びに溶媒に可溶性の適したリン脂質からなる。用いることができるリン脂質は、
例えば、レシチン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチ
ジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、リソホスファチジルコリ
ン及びホスファチジルグリセロールを含む。リポソームの性質を選択的に改質す
るために、その他の親油性添加物を用いてよい。そのようなその他の添加物の例
は、ステアリルアミン、ホスファチジルン酸、トコフェロール、コレステロール
及びラノリンエキストラクトを含む。
【０２３７】 加えて、リン脂質の酸化を防ぐことができるその他の成分を有機成分に加えて
よい。そのようなその他の成分の例は、トコフェロール、ブチル化ヒドロキシア
ニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、アスコルビルパリミテート及びアスコ
ルビルオレエートを含む。安息香酸、メチルパラベン及びプロピルパラベンもま
た加えてよい。
【０２３８】 上記した組成物の他に、適当な量のヘッジホッグ又はｐｔｃ治療薬を含有する
カバー、例えば硬膏剤、帯具、包帯、ガーゼパッド、等を用いてよい。治療配合
物を含有した局部配合物を含浸させた硬膏剤、帯具、包帯、ガーゼパッド、等を
用いてよい場合がいくつかある。
【０２３９】 例証 発明を今一般的に記載し、発明は、下記の例を参照することによって一層容易
に理解されるものと思う。下記の例は、単に本発明の所定の態様及び実施態様を
例示するために載せており、発明を制限することを意図しない。
【０２４０】 例１：シスプラチン誘発される神経疾患における神経保護作用ソニックヘッジホ
ッグの評価 抗ウイルス又は抗癌化学療法の使用は、ひどい神経疾患を誘発し得、これは、
用いる投与量の低減及び治療の不成功の危険を意味する。例えば、シスプラチン
は、主として膀胱、睾丸又は卵巣の腫瘍を治療するために用いられる；しかし、
固有感覚の感度を改質する直径の大きな知覚ファイバーの方を選ぶことにより、
一部回復不能の毒性の神経疾患が出現することから、その投与量が制限される（
Ｍｏｌｌｍａｎ，１９９０）。しかし、現在そのような神経毒性を治癒する又は
予防するための現実の治療は、存在しない。
【０２４１】 ＮＧＦは、そのような化学治療剤によって誘発される神経疾患の重要性を制限
することができることが示されたことに留意すべきである（Ａｐｆｅｌ等、１９
９１，Ａｐｆｅｌ等、１９９２）。その他の２つのペプチド（ＮＴ３及びＡＣＴ
Ｈ類似物）もまた同様のモデルでテストされた（Ｇａｏ等、１９９５；Ｈａｍｅ
ｒｓ等、１９９３）。ソニックヘッジホッグは、発育中のチック（ｃｈｉｋ）肢
の前後パターン付け（Ｒｉｄｄｌｅ等、１９９３）及び運動ニューロン分化（Ｒ
ｏｅｌｉｎｋ等、１９９５）に関係があるとされた。本研究は、Ｓｏｎｉｃ Ｈ
ｅｄｇｅ Ｈｏｇ（ＳＨＨ）の作用をシスプラチン誘発される神経疾患に関して
保護性として測定するために行った。行動測定及びＥＭＧ測定は、ＳＨＨが抹消
ニューロンを神経疾患に対して、特にテストした最も高い濃度（５００μｇ／ｋ
ｇ）で効率的に保護することを示した。
【０２４２】 １）物質及び方法 １．１）動物ハウジング及び処置 ３９匹のマウスを本研究の中に数え、開始時に３８〜４０ｇのマウス９〜１０
匹の４グループに分割した：一つのグループをＳＨＨ（５０μｇ／ｋｇ、皮下）
で週に３回処置し；第二グループは投与量５００μｇ／ｋｇを受け；第三グルー
プはビヒクルグループであった。これらの３つのグループを、またシスプラチン
で処置した（下記に記載する通り）。第四グループは、シスプラチンを投与しな
いが、ＳＨＨ５００μｇ／ｋｇで処置した対照グループであった（対照５００）
。保存溶液ＳＨＨ（２．８ｍｇ／ｍｌ）を−７０℃で貯蔵冷凍し；使用の日に、
バイアルをＰＢＳで希釈して０．２ｍｇ／ｍｌにし、タンパク質をペペット（ｐ
ｅｐｅｔ）することによって静かに混合した。動物を室温のプラスチックケージ
中に１２：１２時間の明−暗サイクルで収容した。マウスは、食事及び水を自由
に手に入れた。
【０２４３】 動物を週に１回目方を計り、それらの全体的な挙動歩行態度及び全体的な外観
について検査した。筋電図検査及び行動テストもまた週に１回行った。
【０２４４】 １．２）シスプラチン投与 シスプラチンを水溶液（１ｍｇ／ｍｌ）として連続１４日間日に１回投与量２
μｇ／ｋｇで腹膜内投与した（累積投与）。動物の体重の重要な減量を避けるた
めに、Ｒｉｎｇｅｒ−ラクテート溶液を毎日投与した（０．４ｍｌ／日腹膜内）
。
【０２４５】 １．３）行動テスチング １．３．１）痛覚閾値測定 １．３．１．１）尾部をさっと動かす（ｆｌｉｃｋ）テスト マウスの尾を加熱源としてのシャッター制御式ランプの下に置いた。マウスが
その尾を熱からさっと動かす前の潜時を記録した。感覚変化は、さっと動かす潜
時を増大させることになろう。
【０２４６】 １．３．１．２）ホットプレートテスト 動物を５２℃のホットプレート上の高さ１７ｃｍ及び直径９ｃｍのガラスシリ
ンダー内部に入れた。動物の挙動、特に足をなめる、シリンダー内でのジャンプ
及び適応した跳躍を観察した。足をなめる前又は熱からのがれるためにジャンプ
する前の潜時を記録した。熱感度を変えるならば、苦痛を感じるのに要する時間
が増大されることになろう。
【０２４７】 １．３．２）運動協調測定 １．３．２．１）ロータロッド（ｒｏｔａｒｏｄ）テスト 動物が回転ドウエル（ロータロッド）上にとどまる能力は、運動協調及び固有
感覚の感度を測定するための良好な手段である。装置は、直径１ｃｍの棒が１２
ｒｐｍで回転するからなるものであった。マウスを、回転する棒上で最大時間１
８０秒の間バランスをとる能力についてテストした（Ｔｉｌｓｏｎ及びＭｉｔｃ
ｈｅｌｌ，１９８４）。
【０２４８】 １．３．２．２）棒上歩行 動物を床の上５０ｃｍに水平に位置させた直径１．５ｃｍ及び長さ４０ｃｍの
棒の上に置き；それらを一端に置き、それらは木製のプラットフォームからなる
他端に到達する傾向にあった。プラットフォームに到達するのに要した時間を運
動協調に相関させた：時間が最も長いと、運動欠損が最も重要であった。
【０２４９】 １．３．３）筋能力協調測定 １．３．３．１）筋持久力 筋強さを、動物を尾で持ち上げている時に動物が体重３２グラムを支える能力
を測定することによって評価した。動物に２本肢か又は４本肢のいずれかを使用
させた。動物が体重を支える間の時間を、最大６０秒で記録し、これは筋持久力
を反映するものであった。
【０２５０】 １．３．３．２）最大強さ 最大筋力を、ワイヤの片に結合した等長性トランスデューサーを用いて測定し
た。動物がワイヤを支える２本脚か又は４本脚のいずれかで支えた時に、それを
ゆっくり後方に、動物がワイヤを離すまで、移動させた。トランスデューサーは
、最大強さを測定し；結果をニュートンで表して挙げる。
【０２５１】 １．４）電気生理学的測定 センシチブ誘発反応：知覚神経伝導速度（ＳＮＣＶ） 動物にケタミンクロルヒドレート（Ｋｅｔａｌａｒ）及びジアゼパム（Ｖａｌ
ｉｕｍ）（１ｍｌ／ｋｅｔａｌａｒ １１．２５ｍｇ及びｖａｌｉｕｍ ０．３
７５ｍｇを含有する溶液１ｋｇ；腹膜内）で麻酔をかけた。電気生理学的記録を
、Ｎｅｕｒｏｍａｔｉｃ筋電図（ＥＭＧ）装置（Ｄａｎｔｅｃ，Ｌｅｓ Ｕｌｉ
ｓ、フランス）を使用して行った。マウスに深く麻酔をかけ、正常の体温を加熱
ランプで保った。
【０２５２】 センシチブ誘発反応を尾部神経において測定した。尾部神経の刺激を、３ｍｍ
離した２つの電極（一つは活性であり、一つは参照）を用いて尾の付け根に行い
；単極記録用針を基部の部位のおよそ４０ｍｍの所に置いた。知覚神経速度を順
方向伝導（尾の先端から付け根に）に従って記録した。研磨された針電極を刺激
用電極針と記録用電極針との間に挿入した。ＳＮＣＶを２つの活性な電極の間の
距離に従って計算した。
【０２５３】 １．５）統計学上の研究 電気生理学的データ及び行動上のデータを反復測定による分散の分析（ＡＮＯ
ＶＡ）によって統計学的に分析した。これらの分析の後に、個々のグループの間
の差異について調べるためにＳｃｈｅｆｆのポストｈｏｃテストを使用した。
【０２５４】 ２）結果 ２．１）全体的な調査 動物の全体的な挙動は、初めの２週の研究の間正常であった；が、神経疾患が
進行している間、歩行活動が低下し、髪の色が変わりかつ最終的に、動物は、ケ
ージ内で静止していた。体重は、２週後に著しく減少し、ビヒクルグループでは
５週まで低いままであった。（図１；処置の間の差異は、ｐ＜０．０００１で有
意であり；処置効果と時間変化との間の相関は、ｐ＜０．０００１で有意である
）。しかし、ＳＨＨで（両方の濃度で）治療した動物の体重は、最後のシスプラ
チン投与の後直ぐに増大し、研究の終わりにはほとんど正常であった。ビヒクル
グループでは、体重は、やっと５週で増大し始め、研究の終わりに正常値よりも
有意に低かった。
【０２５５】 シスプラチン毒性の結果、数匹の動物は、３週で始まって、研究中に死んだ。
しかし、生き残った動物の数は、ＳＨＨ治療したグループでは、ビヒクルに比べ
て多かった（図２）。他方、３匹の対照ＳＨＨ動物は、１及び５週で麻酔中に死
んだ。
【０２５６】 ２．２）ＥＭＧ：知覚神経伝導速度（ＳＮＣＶ） ＥＭＧ測定に従えば、神経疾患は、シスプラチン投与の１週後に現れることが
分かり、３週で最大になり（遅延作用）回復期間は８週に上った。
【０２５７】 標準の状態では、ＳＮＣＶは、８週齢のマウスについて４７〜５１ｍ／ｓの間
で変化した。シスプラチン投与後に、ＳＮＣＶは、ビヒクル及びＳＨＨ５０グル
ープにおいて有意に低下した（図３；処置の間の差異は、ｐ＜０．０００１で有
意であり；処置効果と時間変化との間の相関は、ｐ＜０．０００１で有意である
）；回復は、ＳＨＨ５０グループでは、シスプラチン投与を終えた後直ぐに始ま
ったが、ビヒクルグループでは、１週後に遅れた。正常ＳＮＣＶ値は、８週後に
回復された。しかし、ＳＨＨ５００グループ又は対照ＳＨＨ５０グループでは、
有意の減少が認められなかった。
【０２５８】 ２．３）行動テスチング ２．３．１）痛覚閾値測定 ２．３．１．１）尾部をさっと動かすテスト 尾部をさっと動かす潜時は、ビヒクルグループにおいてシスプラチン投与後に
、最大４週で増大された（図４；処置の間の差異は、ｐ＜０．０００１で有意で
あり；処置効果と時間変化との間の相関は、ｐ＜０．０００２で有意である）。
同様の傾向がＳＨＨ５０グループにおいて認められたが、カーブは常にビヒクル
よりも下であった、すなわち、痛覚閾値欠陥は、それ程重要でなった。ＳＨＨ５
０グループでは、潜時は、３週で一時的に測定しただけであった。
【０２５９】 ２．３．１．２）ホットプレートテストビヒクルグループにおいて６週で一時
的に増大した外は、足をなめる前の潜時は、研究中、大きく変化しなかった（図
４；処置の間の差異は、有意でなく；処置効果と時間変化との間の相関は、有意
でない）。その時に大きな変化が認められ、有意の差異が見られなかったことに
留意すべきである。
【０２６０】 苦痛が一層程重要になった時は、マウスは、ジャンプすることによって逃れる
ことを試み；最初にジャンプする前の潜時を記録した。ビヒクルグループでは、
７週まで増大され、ＳＨＨ５０グループでは、２週まで増大されるが認められ（
図６）；処置の間の差異は、ビヒクルグループにおける大きな変化の故に、６週
で統計学的に有意であっただけであった（時間経過は、ｐ＜０．０００１で有意
であり；処置効果と時間変化との間の相関は、有意でない）。ＳＨＨ５００グル
ープの最小の増大もまた３週まで測定され；その後値は正常に戻り、それらは５
週でビヒクルよりも有意に低かった。
【０２６１】 マウスは、熱に長期に暴露された後に、シリンダーの縁にジャンプすることに
よって逃れた；逃れる潜時のいくらかの増大が、有意に達しないで２週で（特に
ＳＨＨ５０グループにおいて）認められた（図７）。一層大きな増大が、ビヒク
ルグループにおいて５週後に認められ、差異は、ＳＨＨ処置されたグループと比
べた時に、統計学的に有意であった（時間経過は、ｐ＜０．０００１で有意であ
り；処置効果と時間変化との間の相関は、ｐ＜０．０００１で有意である）。
【０２６２】 ２．３．２）運動協調測定 ２．３．２．１）ロータロッドテスト 動物が回転ロッド上にとどまる能力は、ビヒクルグループにおいて、３週で最
小能力で有意に低下されるのが認められた（図８）。対照ＳＨＨ５００グループ
又はＳＨＨ５００グループでは、低下が測定されず、ＳＨＨ５０グループでは、
２週で一時的な低下が測定されただけであった（処置の間の差異は、ｐ＜０．０
００１で有意であり；処置効果と時間変化との間の相関は、ｐ＜０．００７２で
有意である）。
【０２６３】 ２．３．２．２）棒上歩行 プラットフォームに到達するのに要した時間は、ビヒクルグループにおいて２
及び５週で有意に増大したが、ＳＨＨ５０グループでは、２週で有意に増大した
だけであった（図９；処置の間の差異は、ｐ＜０．００１５で有意であり；処置
効果と時間変化との間の相関は、ｐ＜０．０００１で有意である）。ＳＨＨ５０
０グループでは、３週での外は、増大が認められなかった。
【０２６４】 ２．３．３）筋能力協調測定 ２．３．３．１）筋持久力 マウスに４本すべての肢を使用してワイヤを引っ張らせた時に、ビヒクルグル
ープにおいて５週での外は、筋持久力の低下が測定されなかった（図１０ａ；処
置の間の差異は、有意でなく；処置効果と時間変化との間の相関は、有意でない
）。マウスに前肢だけを使用してワイヤを引っ張らせた時に、ビヒクルグループ
において筋持久力のいくらかの低下が測定されたが、ＳＨＨ５０グループ又はＳ
ＨＨ５００グループでは、低下が測定されなかった（図１０ｂ；処置の間の差異
は、有意でなく；処置効果と時間変化との間の相関は、有意でない）。いくらか
の低下は、また、対照５００においても４及び５週で一時的に認められたことに
留意すべきである。
【０２６５】 ２．３．３．２）最大強さ ４本の肢によって発揮される最大筋力は、すべてのシスプラチン処置されたグ
ループにおいて１〜２週後に低下された（図１１ａ；時間経過は、ｐ＜０．０１
９で有意であり；処置効果と時間変化との間の相関は、有意でない）。回復は、
ＳＨＨ５０グループ及びＳＨＨ５００グループでは、５週で行われたが、ビヒク
ルグループでは、７週で行われただけであった。対照では、低下は認められなか
った。
【０２６６】 前肢によって発揮される最大筋力は、ビヒクルグループでは、漸進的に低下し
、最小値は６週で、回復は７週であった（図１１ｂ；処置の間の差異は、ｐ＜０
．０１４で有意であり；処置効果と時間変化との間の相関は、ｐ＜０．００５で
有意である）。ＳＨＨ５０グループでは２週で一時的な（かつ有意でない）低下
が認められ、ＳＨＨ５００グループ又は対照ＳＨＨ５００グループでは、有意の
減少が測定されなかった。
【０２６７】 ３）検討 本研究で得られた結果は、ＳＨＨがシスプラチンによって誘発される神経疾患
に対して、特に、最も高い濃度で保護することができたことを示す。最も顕著な
効果はＳＮＣＶに関して観測され、ＳＨＨ５００グループでは、低下が認められ
なかった。ＳＨＨ５０グループでは、ビヒクルと同様の低下が２週で測定された
；が、回復がすでに３週で始まった、すなわちビヒクルグループに比べて１週早
かった。同様に、感覚欠損がビヒクルグループにおいて尾部をさっと動かすテス
トで示され、これが研究中ずっと続き、他方、それは、ＳＨＨ５００グループで
は一時的にすぎなかった。ホットプレートに関して測定された感覚欠損（最初の
ジャンプ）が、ビヒクルグループでは５週までかつＳＨＨ５０では２週まで認め
られた。固有感覚欠損もまた、ロータロッドにより、ビヒクルグループでは７週
までかつＳＨＨ５０では２週で一時的に示唆された。ＳＨＨ５００グループでは
、欠損が認められなかった。しかし、これらの変化もまた、運動協調の変調に関
係させてよい。
【０２６８】 初期の知覚神経疾患は、シスプラチン処置された患者において運動機能障害の
方向に広がることが知られる。同様に、本研究では、筋能力が、前肢持久力テス
トにおいてビヒクルグループでそこなわれたが、ＳＨＨグループでは、何らそこ
なわれなかった。５本の肢によって発揮される最大筋力は、ビヒクル及び両方の
ＳＨＨグループにおいて低下されたが、機能の回復は、ＳＨＨグループでは、一
層速く行われた。そのような低下は、前肢最大筋力テストにおいてＳＨＨ５００
グループで認められた。
【０２６９】 体重変化は、動物の全体的な代謝の良好な指標である。体重は、シスプラチン
投与後２週で著しく減少し、ビヒクルグループでは５週まで続いた；両方のＳＨ
Ｈグループでは、シスプラチン投与を終えた後直ぐに回復が行われた。同様に、
ＳＨＨ治療によって動物残存が改良された。
【０２７０】 ５００μｇ／ｋｇを用いたＳＨＨ治療は、ほとんどのテストにおいて神経疾患
機能障害を回避する又はいくらかの欠損が測定される時には、回復を促進すると
結論付けられる。５０μｇ／ｋｇを用いたＳＨＨ治療は、同じ程度に保護しない
が、また回復を改良する（ＳＮＣＶ、ジャンプ、ロータロッド、筋力）。回復の
時間経過の差は、ビヒクルグループに比べた時に、２週又はそれ以上である。こ
れらの効果は、同様のパラジウムにおいてＮＧＦ又はＡＣＴＨ類似物治療によっ
て観測される効果と同様である（Ａｐｆｅｌ等、１９９２；Ｈａｍｅｒｓ等、１
９９３）；シスプラチン投与を終えた後に、減量及びＳＮＣＶ低下の回復もまた
観測された。ＡＣＴＨの投与量は、同様であり（４８時間毎に７５μｇ／ｋｇ皮
下に）、他方ＮＧＦの量は、１０倍多く（週毎に５ｍｇ／ｋｇ３回）、１ｍｇ／
ｋｇは、効果がなかった。
【０２７１】 ＳＨＨ５００μｇ／ｋｇを用いて（シスプラチンを用いないで）治療した天然
の動物は、前肢持久力の外は、機能障害を示さなかった。しかし、前述した通り
に、このグループの内の３匹の動物は、１及び５週で麻酔中に死んだ。このグル
ープにおいてその他の機能障害の不存在と一緒にして考えると、この発生が、化
合物を長期に投与することの毒性によることは最もありそうもない。しかし、一
層少ない投与量（ＳＨＨ１００又は２００μｇ／ｋｇ）を用いた同様の研究が、
有用になり得る。
【０２７２】 ５）例１についての参考文献 Ａｐｆｅｌ Ｓ．Ｃ，Ａｒｅｚｚｏ Ｊ．Ｃ，Ｌｉｐｓｏｎ Ｌ．Ａ及びＫｅｓ
ｓｌｅｒ Ｊ．Ａ，ＮＧＦ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｃ
ｉｓｐｌａｔｉｎ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ，Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ （１９９２
）３１，７６−８０ Ａｐｆｅｌ Ｓ．Ｃ，Ｌｉｐｔｏｎ Ｒ．Ｂ，Ａｒｅｚｚｏ Ｊ．Ｃ及びＫｅｓ
ｓｌｅｒ Ｊ．Ａ，ＮＧＦ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ｔｏｘｉｃ ｎｅｕｒｏｐａｔ
ｈｙ ｉｎ ｍｉｃｅ，Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ （１９９１）２９，８７−９０ Ｇａｏ ＷＱ，Ｄｙｂｄａｌ Ｎ，Ｓｈｉｎｓｋｙ Ｎ等、Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏ
ｌ （１９９５）３８，３０−３７ Ｈａｍｅｒｓ ＦＰＴ，Ｐｅｔｔｅ Ｃ，Ｂｒａｖｅｎｓｏｅｒ Ｂ，Ｖｅｃｈ
ｔ ＣＪ，Ｎｅｕｊｔ ＪＯ及びＧｉｓｐｅｎ ＷＨ，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍ
ｏｔｈｅｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ （１９９３）３２，１６２−１６６ Ｌｉｐｔｏｎ Ｒ．Ｂ Ａｐｆｅｌ Ｓ．Ｃ及びＤｕｔｃｈｅｒ Ｊ．Ｐ，Ｎｅ
ｕｒｏｌｏｇｙ （１９８９）３９，３６８−３７３ Ｍｏｌｌｍａｎ Ｊ．Ｅ，Ｎ．Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊ．Ｍｅｄ（１９９０）３２２
，１２６−１２７ Ｒｉｄｄｌｅ ＲＤ，Ｊｏｈｎｓｏｎ ＲＬ，Ｌａｕｆｅｒ Ｅ及びＴａｂｉｎ
Ｃ，Ｓｏｎｉｃ ｈｅｄｇｅｈｏｇ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｔｈｅ ｐｏｌａｒ
ｉｚｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ＺＰＡ，Ｃｅｌｌ ７５（１９
９３）１４０１−１６． Ｒｏｅｌｉｎｋ Ｈ，Ｐｏｒｔｅｒ ＪＡ等、Ｆｌｏｏｒ ｐｌａｔｅ ａｎｄ
ｍｏｔｏｒ ｎｅｕｒｏ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ａｍｉｎｏ−ｔｅｒｍｉｎａｌ
ｃｌｅａｖａｇｅ ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ ｓｏｎｉｃ ｈｅｄｇｅｈｏｇ
ａｕｔｏｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ，Ｃｅｌｌ ８１（１９９５）４４５−５５．
Ｔｉｌｓｏｎ Ｈ．Ａ及びＭｉｔｃｈｅｌｌ Ｃ．Ｌ，Ｎｅｕｒｏｂｅｈａｖｉ
ｏｒａｌ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｏｆ ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ｏｎ ｔｈｅ
ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ，Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｐｈａｒｍ Ｔｏｘｉｃｏｌ
（１９８４）２４，４２５−４５０．
【０２７３】 例２：正常な及びトランスゲニックＤｈｈノックアウトマウスにおける抹消神経
の評価 本発明者等は、また、正常なマウス及びＤｈｈ遺伝子を分断したトランスゲニ
ックマウス（「Ｄｈｈ−／−」表現型）において抹消神経細胞及び束の電気生理
学及び形態学の比較も試みた。
【０２７４】 成マウスを腹膜内注入によって加えるケタミン／キシラジン０．５ｃｃ（無菌
食塩水で１：１０に希釈した）で麻酔をかけた。後肢を覆う毛をそり落とし、足
に広範囲にわたる位置でテープした。それらのコアー温度を赤外ランプで３８℃
に保った。一対の表面記録用電極を各々の足のボトムの上に置いた；一つは内在
性の足底筋の上に、他方は一層末端に置いた。座骨神経をＤａｎｔｅｃ Ｎｅｕ
ｒｏｍａｔｉｃ ２０００を使用した一対の皮下電極によって基部近くで（Ｌ５
脊椎のレベルで）及び末端（頸骨神経を足首で刺激した）の両方で刺激した。刺
激強さを、最大の複合筋作用ポテンシャルが得られるまで、徐々に増大した。基
部近くの位置部位と末端位置部位との距離を測定し、運動神経伝導速度を計算す
るのに使用した。
【０２７５】 図１２は、Ｄｈｈ−／−マウスにおいて、運動神経伝導速度が減少される、例
えばＤｈｈ−／−マウスの抹消神経における機能的障害を示すことを例示する。
【０２７６】 これらのマウスにおける抹消神経細束の形態学もまた観測した（図１３Ａを図
１３Ｂと、及び図１４Ａを図１４Ｂと比較する）。神経上膜鞘と神経周膜鞘との
一体性をＤｈｈ−／−マウスにおいて変えた。別の系統の実験で、本発明者等は
、Ｓｈｈ及びＤｈｈの、神経周膜細胞の増殖を変える能力についてテストした。
ＢｒｄＵの組み込みに基づいて、両方のヘッジホッグタンパク質は抹消細束の増
殖を増大することができたが、Ｄｈｈ顕著に一層有効であった。
【０２７７】 抹消神経障害におけるヘッジホッグ遺伝子生成物についての役割を提案するこ
とに加えて、ヘッジホッグタンパク質が神経周膜細胞の増殖を誘発することがで
きると言う観測は、ヘッジホッグ活性のアンタゴニストが望まれない神経周膜細
胞の増殖によって特徴付けられる疾患において有用になり得ることを示唆する。
例えば、局在肥厚性単神経障害（ＬＨＭ）は、規定されない刺激による神経周膜
細胞増殖に付随するまれな限局性神経障害である。ペリニューリオマス（Ｐｅｒ
ｉｎｅｕｒｉｏｍａｓ）。同様に、らい性神経疾患では、神経周膜細胞の増殖は
、神経周膜の異常な多層をなす外観に関係されることができる。従って、ヘッジ
ホッグシグナリングのアンタゴニストは、そのような疾患を治療する際に神経周
膜細胞の増殖を抑制するのに有用になり得る。
【０２７８】 例３：タキソール誘発される神経疾患における神経保護性作用ソニックヘッジホ
ッグの評価 抗ウイルス又は抗癌化学療法の使用は、ひどい神経疾患を誘発し得、これは、
用いる投与量の低減を意味しかつ治療の不成功の危険を増進する。例えば、タキ
ソールは、卵巣癌又は黒色腫を治療するために用いられる；しかし、知覚毒性の
神経疾患が出現することから、その投与量が制限される（Ｌｉｐｔｏｎ，１９８
９）。ＮＧＦは、そのような化学治療剤によって誘発される神経疾患の重要性を
制限するのが示されたことに留意すべきである。本研究は、タキソール誘発され
る神経疾患に対して保護するＳｈｈの可能性について調べるためにデザインした
。図１６及び１７に示される通りに、Ｓｈｈは、タキソール処置されたマウスに
対して正の効果を有する、例えば長い掛かった棒の長さを歩行し及び回転ドラム
（いわゆるロトロッド）の上に止まるマウスの能力を増進する。両方が運動能力
及び協調の尺度である。
【０２７９】 １）動物 ２２〜２４ｇの雄のスイスマウス（ＩＦＦＡ−ＣＲＥＤＯ，Ｌ’Ａｒｂｒｅｓ
ｌｅ、フランス）６４匹を本研究で使用した。それらを捕集ケージ中に収容し（
ケージ当たり４〜５匹）、調節温度（２１〜２２℃）及び反転式１２：１２明−
暗サイクル下のライトを有する室内に保ち、食事及び水は随意に入手可能にした
。実験は、すべて制度化したガイドラインに従って実施した。
【０２８０】 ２）薬理学的処理 タキソール(Sigma, l'Isle d'Abeau, フランス国)を、クレモフォー１０％Ｖ
／ｖ(Sigma)(２０ｍｇタキソール、１ｍｌクレモフォー、９ｍｌ塩溶液)用いて
塩溶液で希釈して、容積１０ｍｌ／ｋｇ(２０ｍｇ／ｋｇの投与量)で、連続７日
間、一日一回、腹腔内(ＩＰ)投与した。Ｓｈｈは、Biogen(Cambridge, MA, 米国
)から得た。Ｓｈｈのストック溶液(２ｍｇ／ｍｌ及び０．２ｍｇ／ｍｌ)を−７
０℃に保存した。Ｓｈｈ溶液とビヒクル溶液を二重盲検による研究を行うために
Ａ、Ｂ又はＣとラベルした。使用する日に、Ｓｈｈ又はビヒクルを含む瓶(Ａ、
Ｂ又はＱ)を塩溶液(２００μｌの試料＋７．８ｍｌ塩溶液)で１／４０に希釈し
、１０ｍｌ／ｋｇの容積で注射した。Ｓｈｈ(５０又は５００μｇ／ｋｇ)又は塩
溶液を、週３回、皮下(ＳＣ)投与した(ｎ＝１６マウス／グループ)。これらの３
グループをもタキソールで処理した。対照グループよりなる第４グループは、ク
レモフォーＩＰ及び塩溶液ＳＣを受けた(ｎ＝１６)。Ｓｈｈ処理は、タキソール
投与の第一日から開始して、２週間続けた。
【０２８１】 ３）行動試験 知覚運動試験を、週一回で、３週間行った。これらの試験は、常に、電気生理
学的(ＥＰＧ)記録の一日前に行った。各グループを２つのサブグループに分けた
(系列１及び２)。系列１を行動試験について月曜日に、ＥＰＧ試験について火曜
日に試験し、系列２を行動試験について水曜日に、ＥＰＧ分析について木曜日に
試験した。行動試験を、０日目(基線、タキソール中毒前)、７日目(タキソール
注射の６日後)、及び１４日目(タキソール中止の６日後)に行った。ＥＰＧ測定
を、タキソール中毒前(１日目)、８日目(タキソールの最後の注射の一日後)、及
び１５日目(タキソール中止の７日後)に行った。タキソールの最初の注射を、１
日目に、ＥＰＧ記録の直後に行った。
【０２８２】 ３．１）運動調整測定 歩行試験：用いた装置は、テーブルの４０ｃｍ上に水平に維持した直径１．５
ｃｍ、長さ８０ｃｍの棒であった。この棒に中央(０ｃｍ)から両端(４０ｃｍ)ま
で目盛りを付けて、動物が歩いた距離を測れるようにした。
【０２８３】 動物を毎週一回試験した。３回の連続した試験を行った。各試験(最長で６０
秒)について、各マウスを棒の中央に置いて４０ｃｍの距離を歩くのに要した時
間を記録した。動物が落ちるか４０ｃｍを歩くことができない場合は、６０秒と
記録する。各動物について、３回の試験の平均時間を計算した。この時間は、運
動調整能力を反映する。
【０２８４】 ロータロッド試験：回転する棒(ロータロッド)上にとどまる動物の能力は、運
動調整及び固有受容感性を反映する。用いた装置は、毎分１２回回転する直径３
ｃｍの自動化ロッド(Bloseb, Paris, フランス国)であった。
【０２８５】 動物を各週一回試験した。マウスを回転ロッドの上に置き、それがロッド上に
とどまった時間を記録した(最長で３００秒)。もし動物が、３００秒前に落ちた
ならば、更なる試験を行う(最大で３回)。
【０２８６】 ３．２）筋力 最大力：最大筋力を、格子に接続したアイソメトリック筋力計を用いて測定し
た。一度動物が２脚又は４脚で格子を握ったら、それをゆっくり後ろ向きに、そ
れがそれを離すまで動かした。筋力計は、生じた最大力を測定した(結果は、Ｎ
で与えてある)。セッション当たり２回試験を行った。両試験の平均を各動物に
ついて計算した。
【０２８７】 筋持久力：筋持久力を、尾で持ち上げた動物が３８ｇの重りを持っていられる
時間(最長で６０秒)を測定することにより評価した。動物は、２脚でも４脚でも
使うことができた。連続した２試験を行った。両試験の平均を計算した。
【０２８８】 ３．３）感受性試験 尾をさっと動かす試験：装置は、うなり源としてのシャッター制御されたラン
プ(Bioseb)よりなった。各週のセッションは、約１分の間隔で連続する２試験よ
りなり、その平均を計算した。
【０２８９】 実施例４：脊髄運動ニューロンに対するソニックヘッジホッグ神経保護作用の評
価 筋萎縮性側索硬化症(ＡＬＳ)は、主として運動ニューロンを含む進行性の神経
組織変性疾患である(Ripps等、1995)。変異したヒトのスーパーオキシドジスム
ターゼ遺伝子のマウスにおける過剰発現は、腰部脊髄における運動ニューロンの
減損の結果として、進行性の麻痺性疾患を引き起こす(Mohajeri等、1998)。ＡＬ
Ｓ用薬剤の前臨床試験で用いられるＳＯＤＩ−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウ
スモデル(Gurney, 1997；Morrison等、1996)は、病因論的機構を探求し、潜在的
治療剤をスクリーニングするための優れたモデルである。本実験(その結果は、
図１８〜２１に示してある)は、ＳＯＤトランスジェニック(ＡＬＳのマウスモデ
ル)における脊髄運動ニューロンの生存に対するヘッジホッグ処理の正の効果を
示す。
【０２９０】 変異型ヒトスーパーオキシドジスムターゼを過剰発現するトランスジェニック
マウスにおける進行性の運動ニューロンの退行変性に対するＳＨＨの効果を筋電
図検査と知覚運動試験により分析する研究を完了させることを意図して、神経組
織を採取して、腰部脊髄切片について組織学的研究を行った。
【０２９１】 １）動物及び処理 ＳＯＤマウスを、生後３０日目に、尾から抽出したＤＮＡのポリメラーゼ連鎖
反応(ＰＣＲ)増幅により、遺伝子型を調べた。ＤＮＡ(１０ｎｇ)を、ＭｇＣｌ２
とデオキシヌクレオチド三リン酸混合物を含む５０ｍｌの反応混合物に加えた。
反応は、対向鎖とハイブリダイズし且つＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲ２４００サーマル
サイクラー(Perkin-Elmer, 米国)を用いて増幅すべき標的ＤＮＡ配列と隣接する
Rosen等(1993)に記載されたエキソン４用のプライマー配列セットｂを利用する
。これらのプライマーの伸長を、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼのＴａｇＤＮＡポ
リメラーゼ(Appligene, フランス国)により触媒する。テンプレートの変性(９２
℃で２０秒)、プライマーのアニーリング(６０℃で２０秒)及びアニールしたプ
ライマーのＴａｇＤＮＡポリメラーゼによる伸長(７２℃で２０秒)を含む３０サ
イクルの反復シリーズは、特異的ＤＮＡ断片の指数関数的累積を生じる。生じた
ＰＣＲ生成物を２％アガロースゲル上での電気泳動にかけエチジウムブロミド(S
igma, L'Isle d'Abeau, フランス国)で可視化した。
【０２９２】 １２匹のＧ９３Ａヘテロ接合のトランスジェニックマウス(雄６匹と雌６匹)を
研究に使用し、これらを６匹ずつの２つのグループに分けた。一グループをビヒ
クル及び体重１ｋｇ当たり５００μｇのＳＨＨを有するオリエで処理した。それ
らをプラスチックケージに収容し、食餌と水を自由に摂取させた。構内を定常的
に温度２２℃、湿度５５％に維持し(慣用の条件下)、１２時間ずつの明暗サイク
ルとした(午後７時に点灯)。
【０２９３】 ＳＨＨを、週３回皮下(ＳＣ)投与した(６０日齢で開始して１００日間続けた)
。
【０２９４】 ２）組織の採取と染色 １００日齢のマウスを６０ｍｇ／ｋｇのケタミンヒドロクロリド(Ketalar)と
２ｍｇ／ｋｇのジアゼパム(Valium)で麻酔した。それらを、０．１％ヘパリン(S
igma, L'Isle d'Abeau, フランス国)を含むリン酸緩衝塩溶液(ＰＢＳ)で、心臓
から潅流した。次いで、動物を、それらが固くなるまで、４％パラホルムアルデ
ヒド(ＰＢＳ中)で潅流した。脊髄を採取して一晩後固定した。次いで、組織を、
使用するまで、４℃の３０％シュークロース(Sigma, L'Isle d'Abeau, フランス
国)中に置いた。
【０２９５】 脊髄を冷イソペンタン(Prolabo, Fontenay-sous-bois, フランス国)中で凍結
させ、ティシューｔｅｋＯ．Ｃ．Ｔ．コンパウンド(Miles, 米国)に包埋して、
クリオスタット(Leica Jung CM 1800, Rueil-Malmaison, フランス国)を用いて
切片を作成した。これらの切片を、クレシルバイオレット(Sigma, L'Isle d'Abe
au, フランス国)の０．１％水溶液を用いて３０〜４５秒間染色し、次いで、脱
水してＥｕｋｉｉｔ(O.Kindler GmbH and Co., Freiburg)に載せた。腰部セグメ
ントからの切片だけを調べ且つ、隣接する２つの切片中の一つの所定ニューロン
を２回数える可能性を回避するために、２つの内の一方の切片のシリーズのみを
集めた。一の所定腰部セグメントから２７〜３１の切片が得られた。切片を、光
学顕微鏡(Nikon, 日本国)を用いて観察した。結果は、両側の前角中の計数した
動物当たりの細胞の平均数で表してある。
【０２９６】 ３）統計的分析 値は、平均±標準誤差で与えてある。対照グループとＳＨＨ５００グループと
の間の差異を、Ｓｔａｔｖｉｅｗ Ｓｔｕｄｅｎｔ ｖ１．ＯＶＦソフトウェア
を用いる一因子ＡＮＯＶＡ試験により評価した。
【０２９７】 ４）結果 図１８は、体重１ｋｇ当たり５００μｇの投与量のＳＨＨで処理されたグルー
プが対照グループより多数の運動ニューロンを示したことを示すが、差異は有意
ではなかった[Ｆ(１，１０)＝１．３；Ｎ．Ｓ．]。各グループにおいて、一のマ
ウスの脊髄の腰部切片において計数された細胞数が他のものよりずっと少ないこ
と(対照グループについては２Ｙ０、ＳＨＨ５００グループについては１Ｙ０)及
びこれらのマウスが同腹子であったことに注意すべきである。それ故、これらの
マウスを分析から除くことが示唆された。図１９は、Ｙ０同腹子を除くと、計数
された細胞数が、対照グループとＳＨＨ５００グループとの間で有意に異なるこ
と及びｓ．ｅ．ｍ．がずっと小さかったことを示している。ＳＨＨ５００グルー
プ中の細胞数は、対照グループより１５％多かった[Ｆ(１，８)＝１３．７；ｐ
＜０．０１]。
【０２９８】
【表２】 表１：各グループで計数された細胞数(個体ごとの値)
【０２９９】 データを更に分析するために、雄と雌で測定された運動ニューロン数を、別々
に分析した。図２０は、雄では、対照グループとＳＨＨ５００グループの間で統
計的な差異がない[Ｆ(１，４)＝０．００１４；Ｎ．Ｓ．]ことを示している。し
かしながら、雌では、ＳＨＨ５００グループで計数された細胞数は、図２１に示
したように、対照グループより有意に多かった[Ｆ(１，４)＝８．１；ｐ＜０．
０５]。これらのデータは、ＳＨＨ化合物が、特に雌において、運動ニューロン
の生存を有意に改善したことを示唆している。
【０３００】 対照グループにおける個々のデータの観察は、有意ではないが、雌で計数され
た細胞数が雄より少ない(７９５．７±５９．９対９０１．０±２５．２)という
ことを示す。この差異は、病気が雄よりも雌において一層早く始まることにより
説明することができる。一層高齢のものにおける運動ニューロンの生存に対する
ＳＨＨの効果を測定すること及びホルモン処理がＳＨＨ投与と協力し得るかどう
か調べることは興味深いことである。加えて、データが、神経筋障害が６０日目
で既に存在することを示唆しているので、ＳＨＨ処理を一層早く開始することは
重要であろう。
【０３０１】 ５）参考文献 GURNEY M.E.(1997) J Neurol Sci, 152 前書 1, S67-73. MORRISON等(1996) J Comp Neurol, 373:619-631. MOHAJERI等(1998) Exp Neurol, 150:329-336 RIPPS等(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 92:689-693. ROELINK等(1995) Cell 81:445-455. ROSEN等(1993) Nature, 362:59-62. TANABE等(1995) Curr.Biol 5:651-658.
【０３０２】 実施例５：ヘッジホッグタンパク質のガラクトース中毒媒介の神経障害に対する
作用の評価 ガラクトース中毒は、ラットにおいて神経障害を誘導し、末梢神経細胞への神
経栄養支持を破壊する手段である。ラットに高ガラクトースの食餌を与えること
は、例えばシュワン細胞及び筋肉に形態的異常を引き起こし、これは、軸索の萎
縮及び低下する神経伝導速度を特徴とする神経障害を伴う。
【０３０３】 Mizisin等(1997)J. Neuropath Exp Neurol 56:1290-1301に示された方法論を
適合させることにより、ガラクトース血症ラットの神経における機能的及び構造
的障害に対するヘッジホッグ処理の効果を評価することができる。
【０３０４】 図２３に示したように、Ｓｈｈでの処理は、ガラクトース中毒の動物において
神経伝導性を改善することができる。
【０３０５】 実施例６：ヘッジホッグタンパク質処理の糖尿病性神経障害を防ぐ能力の評価 ラットにおいて、ストレプトゾトシン(ＳＴＺ)の腹腔内注射を用いて、糖尿病
性神経障害の動物モデルを生成することができる。Garrett等 (1977) Neurosci. Lett 222:191-194に記載されたような手順を用いて、ヘッジホッグ処理のＳＴＺ
誘導された神経障害を防ぐ能力を評価することができる。
【０３０６】 実施例７：ヘッジホッグ処理の神経圧挫損傷に対する効果の評価 ヘッジホッグタンパク質は、座骨神経圧挫損傷後の機能回復を改善する。雄のＣ
Ｄ−１マウス(２５〜３０ｇ)の両側の座骨神経に圧挫損傷を与え、機能の回復を
各後脚で金網をつかむ能力を評価することにより毎日モニターした。図２２を参
照されたい。このデータは、左右の脚についての１０回の試験におけるつかみ損
ないの平均数で表してある。マウスを一日おきに、ビヒクル(対照用グループ)、
ペギレイテドイソロイシン−イソロイシンソニックヘッジホッグ(Ｓｈｈ−ＰＥ
Ｇ)(投与量１ｍｇ／ｋｇ、皮下投与)又はイソロイシン−イソロイシンソニック
ヘッジホッグマウスＩｇ融合タンパク質(Ｓｈｈ−Ｉｇ)(投与量１又は５ｍｇ／
ｋｇ、皮下投与)で処理した(神経圧挫損傷の日に開始)。これらの値は、グルー
プ当たり１４匹のマウスについての平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表している。すべての
Ｓｈｈグループについてビヒクル処理した対照と比較して＊Ｐ＜０．０５である
(Student-Newman-Keuls試験)。
【０３０７】 上記の引用文献及び刊行物のすべてを参考として本明細書中に援用する。
【０３０８】 同等物 当業者は、ここに記載した特定のポリペプチド、核酸、方法、アッセイ及び試
薬に対する多くの同等物を認識し、日常的実験を用いて確かめることができるで
あろう。かかる同等物は、この発明の範囲内にあると考えられる。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 処理および対照マウスにおける、調査の間での動物の体重の変動： 対照ＳＨ
Ｈ＝シスプラチンなしで、５００μｇ／ｋｇのＳＨＨで処理した動物；ｖｅｈ＝
２ｍｇ／ｋｇ／日のシスプラチンで１４日間処理したビヒクル群；ＳＨＨ５００
＝５００μｇ／ｋｇのＳＨＨとシスプラチンで処理した動物；ＳＨＨ５０＝５０
μｇ／ｋｇのＳＨＨとシスプラチンで処理した動物。化合物は、週に３回、皮下
に投与した。重量は、ｇで、平均値±ＳＥＭとして表す。ｈｏｃ後のビヒクル群
との比較は、フィッシャーテストで行った。＊：ｐ＜０．０５での有意差；＊＊
：ｐ＜０．０１での有意差；＊＊＊ｐ＜０．００１での有意差。
【図２】 処理および対照マウスにおける、調査を通して存在した動物数。各群の動物数
は、繰り返しアノーバテストにより比較し、群の間で有意な差は認められなかっ
た。
【図３】 処理および対照マウスで測定された感覚神経伝達速度（ＳＮＣＶ）の時間経過
である。結果はｍ／ｓｅｃで、平均値±ＳＥＭとして表す。ｈｏｃ後のビヒクル
群との比較は、フィッシャーテストで行った。＊：ｐ＜０．０５での有意差；＊
＊：ｐ＜０．０１での有意差；＊＊＊ｐ＜０．００１での有意差。
【図４】 処理および対照マウスで測定された尾振り潜時。結果はｓｅｃで、平均値±Ｓ
ＥＭとして表す。ｈｏｃ後のビヒクル群との比較は、フィッシャーテストで行っ
た。＊：ｐ＜０．０５での有意差；＊＊：ｐ＜０．０１での有意差；＊＊＊ｐ＜
０．００１での有意差。
【図５】 処理および対照マウスで測定された足なめ潜時。結果はｓｅｃで、平均値±Ｓ
ＥＭとして表す。ｈｏｃ後のビヒクル群との比較は、フィッシャーテストで行っ
た。
【図６】 処理および対照マウスで測定された初回ジャンプまでの潜時。結果はｓｅｃで
、平均値±ＳＥＭとして表す。ｈｏｃ後のビヒクル群との比較は、フィッシャー
テストで行った。＊：ｐ＜０．０５での有意差；＊＊：ｐ＜０．０１での有意差
；＊＊＊ｐ＜０．００１での有意差。
【図７】 処理および対照マウスで測定された調整ジャンプまでの潜時。結果はｓｅｃで
、平均値±ＳＥＭとして表す。ｈｏｃ後のビヒクル群との比較は、フィッシャー
テストで行った。
【図８】 処理および対照マウスで測定された回転ロッド上に滞在する能力。
【図９】 処理および対照マウス測定された、プラットフォームに到達するのに要するロ
ッド上を歩行する時間。結果はｓｅｃで、平均値±ＳＥＭとして表す。ｈｏｃ後
のビヒクル群との比較は、フィッシャーテストで行った。＊：ｐ＜０．０５での
有意差；＊＊：ｐ＜０．０１での有意差；＊＊＊ｐ＜０．００１での有意差。
【図１０Ａ】 処理および対照マウスで測定された、４本足で重量を支える能力。結果はｓｅ
ｃで、平均値±ＳＥＭとして表す。ｈｏｃ後のビヒクル群との比較は、フィッシ
ャーテストで行った。＊：ｐ＜０．０５での有意差；＊＊：ｐ＜０．０１での有
意差；＊＊＊ｐ＜０．００１での有意差。
【図１０Ｂ】 処理および対照マウスで測定された前足のみで重量を支える能力。結果はｓｅ
ｃで、平均値±ＳＥＭとして表す。ｈｏｃ後のビヒクル群との比較は、フィッシ
ャーテストで行った。＊：ｐ＜０．０５での有意差；＊＊：ｐ＜０．０１での有
意差；＊＊＊ｐ＜０．００１での有意差。
【図１１Ａ】 処理および対照マウスで測定された、４本足で行う最大強度。結果はｓｅｃで
、平均値±ＳＥＭとして表す。ｈｏｃ後のビヒクル群との比較は、フィッシャー
テストで行った。＊：ｐ＜０．０５での有意差；＊＊：ｐ＜０．０１での有意差
；＊＊＊ｐ＜０．００１での有意差。
【図１１Ｂ】 処理および対照マウスで測定された、前足のみで行う最大強度。結果はｓｅｃ
で、平均値±ＳＥＭとして表す。ｈｏｃ後のビヒクル群との比較は、フィッシャ
ーテストで行った。＊：ｐ＜０．０５での有意差；＊＊：ｐ＜０．０１での有意
差；＊＊＊ｐ＜０．００１での有意差。
【図１２】 正常およびＤｈｈ−／−マウスにおける運動神経速度のグラフ。
【図１３Ａ】 正常マウスにおける末梢神経細胞のマイクログラフ。
【図１３Ｂ】 Ｄｈｈ−／−マウスにおける末梢神経細胞のマイクログラフ。
【図１４Ａ】 神経フィラメント（軸索マーカー）およびラミニン（およびＥＣＭ／結合組織
マーカー）に対する抗体を用いた、末梢神経の免疫組織化学的染色。
【図１４Ｂ】 神経フィラメント（軸索マーカー）およびラミニン（およびＥＣＭ／結合組織
マーカー）に対する抗体を用いた、末梢神経の免疫組織化学的染色。
【図１５】 末梢細胞の増殖に対するヘッジホッグの効果。
【図１６】 処理および対照マウスにおける走行時間（歩行テスト）。
【図１７】 処理および対照マウスにおける回転ロッドから落下するまでの時間。
【図１８】 ５００μｇ／ｋｇのＳＨＨで処理したＳＯＤマウスでの組織学的検査。運動ニ
ューロンは、クレジルバイオレット染色後の、１００日齢のｈＳＯＤマウス由来
の腰部骨髄断面の腹側角部でカウントした。
【図１９】 ５００μｇ／ｋｇのＳＨＨで処理したＳＯＤマウスでの組織学的調査（Ｙ０同
腹子なし）。
【図２０】 ５００μｇ／ｋｇのＳＨＨで処理した雄ＳＯＤマウスでの組織学的調査。
【図２１】 ５００μｇ／ｋｇのＳＨＨで処理した雌ＳＯＤマウスでの組織学的調査。
【図２２】 坐骨神経圧坐損傷後の、握る能力に対するヘッジホッグタンパク質の効果の評
価。
【図２３】 ガラクトース中毒関与の神経障害における感覚神経伝達速度に対するヘッジホ
ッグタンパク質の効果の評価。ＣＡ＝対照で処理した正常動物；ＣＢ＝Ｓｈｈで
処理した正常動物；ＧＡ＝ビヒクルで処理したガラクトース中毒動物；およびＧ
Ｂ＝Ｓｈｈで処理したガラクトース中毒動物。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 31/711 Ａ６１Ｋ 45/00 45/00 Ａ６１Ｐ 3/10 Ａ６１Ｐ 3/10 5/14 5/14 9/00 9/00 13/12 13/12 19/08 19/08 25/00 25/00 25/02 25/02 １０１ １０１ 25/32 25/32 29/00 29/00 31/00 31/00 31/12 31/12 35/02 35/02 Ｃ０７Ｋ 14/46 Ｃ０７Ｋ 14/46 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｚ Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ， ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，Ｓ Ｌ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ナゲシュ マハンタッパ アメリカ合衆国 02139 マサチューセッ ツ、ケンブリッジ、ノーフォーク ストリ ート 240 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA80 CA01 HA17 4B063 QA20 QQ02 QQ42 QR90 QS34 QX01 4C084 AA02 AA13 AA17 BA19 BA20 BA21 BA22 BA44 CA18 CA59 CA70 NA14 ZA022 ZA202 ZA212 ZA222 ZA362 ZA812 ZA962 ZB112 ZB262 ZB272 ZB322 ZB332 ZC352 4C086 AA01 AA02 BC30 BC50 CB22 EA16 EA18 GA07 GA09 MA01 MA04 NA14 ZA02 ZA20 ZA21 ZA22 ZA36 ZA81 ZA96 ZB11 ZB26 ZB27 ZB32 ZB33 ZC35 4H045 AA30 BA41 BA50 BA55 CA40 EA20

Claims (51)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 動物における運動神経又は知覚神経の機能的能力の低下を阻
    止する方法であって、その動物に治療的量のヘッジホッグ又はｐｔｃ治療剤を投
    与することを含む当該方法。
  2. 【請求項２】 運動神経又は知覚神経細胞の機能不全を阻止する方法であっ
    て、それらの細胞を有効量のヘッジホッグ又はｐｔｃ治療剤と接触させることを
    含む当該方法。
  3. 【請求項３】 末梢神経障害を治療し又は予防する方法であって、動物に予
    防的量のヘッジホッグ又はｐｔｃ治療剤を投与することを含む当該方法。
  4. 【請求項４】 末梢神経細胞を、保護しなければ末梢神経障害を生じる条件
    下で保護する方法であって、それを必要とする患者に、治療上有効な量のヘッジ
    ホッグ又はｐｔｃ治療剤を投与することを含む当該方法。
  5. 【請求項５】 糖尿病性神経障害を治療し又は予防する方法であって、それ
    を必要とする患者に、治療上有効な量のヘッジホッグ又はｐｔｃ治療剤を投与す
    ることを含む当該方法。
  6. 【請求項６】 ウイルスで誘導した末梢神経障害を治療し又は予防する方法
    であって、それを必要とする患者に、治療上有効な量のヘッジホッグ又はｐｔｃ
    治療剤を投与することを含む当該方法。
  7. 【請求項７】 ヘッジホッグ治療剤が、SEQ ID NO:１０〜１８の何れか１つ
    のアミノ酸配列と同一であるか又は相同であるヘッジホッグアミノ酸配列を含む
    ポリペプチドである、請求項１〜６の何れかに記載の方法。
  8. 【請求項８】 ヘッジホッグアミノ酸配列が、ポリペプチドのパッチトタン
    パク質への特異的結合に十分である、請求項７に記載の方法。
  9. 【請求項９】 ヘッジホッグアミノ酸配列が、SEQ ID NO:１０〜１８の何れ
    か１つのアミノ酸配列と少なくとも８０％同一である、請求項７に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 ヘッジホッグアミノ酸配列が、緊縮条件下で、SEQ ID NO:
    １〜９の何れか１つとハイブリダイズする核酸によりコードされ得る、請求項７
    に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 ヘッジホッグアミノ酸配列が、脊椎動物のヘッジホッグタ
    ンパク質である、請求項７に記載の方法。
  12. 【請求項１２】 脊椎動物のヘッジホッグタンパク質が、Ｄｈｈである、請
    求項１１に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 ポリペプチドが、脊椎動物のヘッジホッグタンパク質の少
    なくとも５０アミノ酸の細胞外部分を含む、請求項７に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 ポリペプチドが、脊椎動物のヘッジホッグタンパク質の少
    なくとも１５０アミノ酸の細胞外部分を含む、請求項７に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 ポリペプチドが、SEQ ID NO:１５の残基２４〜１９４に対
    応する脊椎動物のヘッジホッグタンパク質の少なくとも一つの細胞外部分を含む
    、請求項７に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 ヘッジホッグポリペプチドが、少なくとも一つの親油性部
    分で改変されている、請求項７に記載の方法。
  17. 【請求項１７】 ヘッジホッグポリペプチドが、少なくとも一つのステロー
    ル部分で改変されている、請求項１６に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 ステロール部分が、コレステロールである、請求項１７に
    記載の方法。
  19. 【請求項１９】 ヘッジホッグポリペプチドが、少なくとも一つの脂肪酸部
    分で改変されている、請求項１６に記載の方法。
  20. 【請求項２０】 各脂肪酸部分を、独立に、ミリストイル、パルミトイル、
    ステアロイル及びアラキドイルよりなる群から選択する、請求項１９に記載の方
    法。
  21. 【請求項２１】 ヘッジホッグポリペプチドが、少なくとも一つの芳香族炭
    化水素で改変されている、請求項１６に記載の方法。
  22. 【請求項２２】 各芳香族炭化水素を、独立に、ベンゼン、ペリレン、フェ
    ナントレン、アントラセン、ナフタレン、ピレン、クリセン及びナフタセンより
    なる群から選択する、請求項２１に記載の方法。
  23. 【請求項２３】 ヘッジホッグポリペプチドが、少なくとも一回、Ｃ７〜Ｃ
    ３０アルキル又はシクロアルキルで改変されている、請求項１６に記載の方法。
  24. 【請求項２４】 ｐｔｃ治療剤が、小さい有機分子である、請求項１〜６の
    何れかに記載の方法。
  25. 【請求項２５】 ｐｔｃ治療剤のパッチトに対する結合が、パッチト及び／
    又はｇｌｉ発現のアップレギュレーションを生じる、請求項２４に記載の方法。
  26. 【請求項２６】 ｐｔｃ治療剤が、パッチトに結合して、ヘッジホッグ媒介
    のパッチトシグナル変換を真似る、請求項１〜６の何れかに記載の方法。
  27. 【請求項２７】 ｐｔｃ治療剤が、小さい有機分子である、請求項２６に記
    載の方法。
  28. 【請求項２８】 ｐｔｃ治療剤のパッチトへの結合が、パッチト及び／又は
    ｇｌｉ発現のアップレギュレーションを生じる、請求項２６に記載の方法。
  29. 【請求項２９】 ｐｔｃ治療剤が、ニューロン細胞と相互作用してヘッジホ
    ッグ媒介のパッチトシグナル変換を真似る小さい有機分子である、請求項１〜６
    の何れかに記載の方法。
  30. 【請求項３０】 ｐｔｃ治療剤が、パッチトシグナル経路に関与する細胞内
    タンパク質の局在性、タンパク質−タンパク質結合及び／又は酵素活性を変化さ
    せることによりヘッジホッグ媒介のパッチトシグナル変換を真似る、請求項１〜
    ６の何れかに記載の方法。
  31. 【請求項３１】 ｐｔｃ治療剤が、ヘッジホッグタンパク質、パッチトタン
    パク質又はパッチトの細胞内シグナル変換経路に関与するタンパク質の発現レベ
    ルを変化させる、請求項１〜６の何れかに記載の方法。
  32. 【請求項３２】 ｐｔｃ治療剤が、パッチトのシグナル変換経路に関与する
    タンパク質の発現を阻止するアンチセンス構築物であり、その発現がヘッジホッ
    グ媒介のシグナルと拮抗する、請求項３１に記載の方法。
  33. 【請求項３３】 アンチセンス構築物が、約２０〜３０ヌクレオチド長で、
    少なくとも５０パーセントのＧＣ含量を有するオリゴヌクレオチドである、請求
    項３２に記載の方法。
  34. 【請求項３４】 アンチセンスオリゴヌクレオチドを、下記よりなる群から
    選択する、請求項３３に記載の方法： 【化１】
  35. 【請求項３５】 ｐｔｃ治療剤が、パッチトに結合してパッチト依存性の遺
    伝子発現を調節する小さい有機分子である、請求項３１に記載の方法。
  36. 【請求項３６】 ｐｔｃ治療剤が、プロテインキナーゼＡの阻害剤である、
    請求項３５に記載の方法。
  37. 【請求項３７】 ＰＫＡ阻害剤が、５−イソキノリンスルホンアミドである
    、請求項３６に記載の方法。
  38. 【請求項３８】 ＰＫＡ阻害剤が、下記の一般式で表される、請求項３７に
    記載の方法： 【化２】 (式中、Ｒ１及びＲ２は、各々、独立に、水素を表し、原子価及び安定性が許せ
    ば、低級アルキル、低級アルケニル、低級アルキニル、カルボニル(例えば、カ
    ルボキシル、エステル、ホルメート又はケトン)、チオカルボニル(例えば、チオ
    エステル、チオアセテート又はチオホルメート)、アミノ、アシルアミノ、アミ
    ド、シアノ、ニトロ、アジド、サルフェート、スルホネート、スルホンアミド、
    −(ＣＨ２)ｍ−Ｒ８、−(ＣＨ２)ｍ−ＯＨ、−(ＣＨ２)ｍ−Ｏ−低級アルキル、
    −(ＣＨ２)ｍ−Ｏ−低級アルケニル、−(ＣＨ２)ｎ−Ｏ−(ＣＨ２)ｍ−Ｒ８、−
    (ＣＨ２)ｍ−ＳＨ、−(ＣＨ２)ｍ−Ｓ−低級アルキル、−(ＣＨ２)ｍ−Ｓ−低級
    アルケニル、−(ＣＨ２)ｎ−Ｓ−(ＣＨ２)ｍ−Ｒ８を表し、又は Ｒ１及びＲ２は、Ｎと一緒に、ヘテロ環(置換されているか又はされていない)
    を形成し； Ｒ３は、存在しないか又は、イソキノリン環に対する少なくとも１つの置換基
    例えば低級アルキル、低級アルケニル、低級アルキニル、カルボニル(例えば、
    カルボキシル、エステル、ホルメート又はケトン)、チオカルボニル(例えば、チ
    オエステル、チオアセテート又はチオホルメート)、アミノ、アシルアミノ、ア
    ミド、シアノ、ニトロ、アジド、サルフェート、スルホネート、スルホンアミド
    、−(ＣＨ２)ｍ−Ｒ８、−(ＣＨ２)ｍ−ＯＨ、−(ＣＨ２)ｍ−Ｏ−低級アルキル
    、−(ＣＨ２)ｍ−Ｏ−低級アルケニル、−(ＣＨ２)ｎ−Ｏ−(ＣＨ２)ｍ−Ｒ８、
    −(ＣＨ２)ｍ−ＳＨ、−(ＣＨ２)ｍ−Ｓ−低級アルキル、−(ＣＨ２)ｍ−Ｓ−低
    級アルケニル、−(ＣＨ２)ｎ−Ｓ−(ＣＨ２)ｍ−Ｒ８を表し； Ｒ８は、置換された又はされてないアリール、アルアルキル、シクロアルキル
    、シクロアルケニル又はヘテロ環を表し；そして ｎ及びｍは、独立に、ゼロ又は１〜６の範囲の整数である)。
  39. 【請求項３９】 ＰＫＡ阻害剤が、サイクリックＡＭＰ類似体である、請求
    項３６に記載の方法。
  40. 【請求項４０】 ＰＫＡ阻害剤を、Ｎ−[２−((ｐ−ブロモシンナミル)アミ
    ノ)エチル]−５−イソキノリンスルホンアミド、１−(５−イソキノリン−スル
    ホニル)−２−メチルピペラジン、ＫＴ５７２０、８−ブロモ−ｃＡＭＰ、ジブ
    チル−ｃＡＭＰ及びＰＫＡ熱安定性阻害剤イソ型αよりなる群から選択する、請
    求項３６に記載の方法。
  41. 【請求項４１】 患者が、予防的に処置される、請求項４〜６の何れかに記
    載の方法。
  42. 【請求項４２】 パッチトの小さい分子のアンタゴニストの治療用製剤であ
    って、パッチトアンタゴニストを、製薬上許容し得るキャリアー中で、末梢神経
    障害を治療するのに十分な量で供給する当該治療用製剤。
  43. 【請求項４３】 末梢神経細胞を、保護しなければ末梢神経障害を生じる条
    件下で保護する方法であって、患者に、遺伝子活性化構築物を投与することを含
    み、その構築物が患者のゲノムのヘッジホッグ遺伝子と組換えを起こして、その
    ヘッジホッグ遺伝子のコード配列に機能的に結合された異種転写調節配列を与え
    る、上記の方法。
  44. 【請求項４４】 後天性神経障害の治療のためのプロトコールの部分である
    、請求項４、５、６又は４３に記載の方法。
  45. 【請求項４５】 神経障害が、ウイルス感染、糖尿病又は炎症による、請求
    項４４に記載の方法。
  46. 【請求項４６】 神経障害が、毒性因子との接触による、請求項４４に記載
    の方法。
  47. 【請求項４７】 神経障害を、糖尿病性神経障害；免疫媒介の神経障害、慢
    性炎症性脱髄性多発性神経障害(ＣＩＤＰ)、末梢神経に対する抗体による慢性多
    発性神経障害、血管炎又は末梢神経中の血管の炎症と関係する神経障害、腕及び
    腰仙神経叢炎及びモノクローナルガンマグロブリン異常と関係する神経障害；腫
    瘍又は新生物と関係する神経障害例えば肺癌と関係する知覚神経障害、多発性骨
    髄腫と関係する神経障害、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、慢性リ
    ンパ球白血病又はＢ細胞リンパ腫と関係する神経障害；アミロイド症と関係する
    神経障害；感染により引き起こされる神経障害；栄養失調により引き起こされる
    神経障害；腎臓病における神経障害；甲状腺機能低下性神経障害；アルコール及
    び毒素により引き起こされる神経障害；薬物により引き起こされる神経障害；局
    所照射の結果生じる神経障害；トラウマ又は圧迫により引き起こされる神経障害
    ；及び特発性神経障害よりなる群から選択する、請求項４４に記載の方法。
  48. 【請求項４８】 遺伝性の神経障害の治療のためのプロトコールの部分であ
    る、請求項４、５、６又は４３に記載の方法。
  49. 【請求項４９】 神経障害を、シャルコー・マリー・ツース病(ＣＭＴ)、家
    族性アミロイド神経障害及び遺伝性ポルフィリン症よりなる群から選択する、請
    求項４８に記載の方法。
  50. 【請求項５０】 加齢随伴神経病理と関係する神経組織変性事象を遅らせる
    ためのプロトコールの部分である、請求項４、５、６又は４３に記載の方法。
  51. 【請求項５１】 ヘッジホッグポリペプチドが、融合タンパク質である、請
    求項７に記載の方法。
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