CN107206046A - 改良的钠通道的肽抑制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及特化的非天然存在的肽与钠通道结合并抑制钠通道活化的能力。本发明还涉及用于通过调节特化的非天然存在的肽与钠通道的结合来调节钠吸收和流体体积的方法以及用于通过调节特化的非天然存在的肽与钠通道的结合来治疗响应于调节钠吸收的病症的方法。

Description

改良的钠通道的肽抑制剂
优先权声明
本申请要求于2014年10月8日提交的美国临时申请序列号62/061,461的权益，其全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本发明涉及经优化的肽，其是具有提高的与钠通道结合并抑制钠通道活化的能力的特化的非天然存在的肽。本发明还涉及用于通过钠通道的活性调节钠吸收和流体体积的方法以及用于通过钠通道的活性治疗响应于调节钠吸收的病症的方法。
背景技术
上皮黏膜表面内衬有体积和组成受到精确控制的流体。在气道中，气道表面液体的薄膜通过用作润滑剂高效地清除黏液来帮助保护哺乳动物气道免受感染(Hobbs等,J.Physiol.591:4377(2013)；Knowles等,J.Clin.Invest.109:571(2002))。该层在清除黏液期间向头部移动，并且在两个气道聚合时累积的过量液体通过以Na+通过上皮Na+通道(ENaC)的Na+调节的气道表面液体吸收来消除(Hobbs等,J.Physiol.591:4377(2013)；Knowles等,J.Clin.Invest.109:571(2002))。关键的是，在气道中调节ENaC活性的机制了解甚少。最近，已累积的证据表明，气道表面液体中的分子调节剂可以用作体积敏感信号，其稀释或浓缩可以改变控制离子转运速率的特定细胞表面受体以根据需要吸收或分泌气道表面液体(Chambers等,Respir.Physiol.Neurobiol.159:256(2007))。作为调节靶标之一，ENaC必须被细胞内弗林蛋白酶类型蛋白酶和/或细胞外通道激活蛋白酶(channelactivating protease，CAP)(例如前列腺蛋白酶(prostasin))切割以具有活性并传导Na+(Planes等,Curr.Top.Dev.Biol.78:23(2007)；Rossier,Proc.Am.Thorac.Soc.1:4(2004)；Vallet等,Nature 389:607(1997)；Chraibi等,J.Gen.Physiol.111:127(1998))。ENaC还可被外源性丝氨酸蛋白酶(例如胰蛋白酶)切割和活化，这是被蛋白酶抑制剂抑肽酶减弱的作用(Vallet等,Nature 389:607(1997))。当将人支气管上皮培养物封固在洗掉天然气道表面液体的尤斯灌流室中时，ENaC显著地具有活性，这表明细胞附着的蛋白酶占优势(Myerburg等,J.Biol.Chem.281:27942(2006)；Tarran等,J.Gen.Physiol.127:591(2006)；Gaillard等,2010Pfleugers Arch,460:1-17)。相比之下，在存在天然气道表面液体的薄膜条件下，ENaC活性降低，表明气道表面液体包含可溶性蛋白酶抑制剂(Myerburg等,J.Biol.Chem.281:27942(2006)；Tarran等,J.Gen.Physiol.127:591(2006)；Gaillard等,2010Pfleugers Arch,460:1-17)。
最近，已表明，短腭、肺和鼻上皮克隆(SPLUNC1)蛋白占气道表面液体中的总蛋白质的多至10％，并且可容易地在鼻腔灌洗液和气管分泌物二者中检测到(Bingle,C.D.,和Craven,C.J.(2002)PLUNC:a novel family of candidate host defense proteinsexpressed in the upper airways and nasopharynx Hum Mol Genet 11,937；Campos,M.A.,等(2004)Purification and characterization of PLUNC from humantracheobronchial secretions Am J Respir Cell Mol Biol 30,184；Lindahl,M.,Stahlbom,B.,和Tagesson,C.(2001)；Identification of a new potential airwayirritation marker,palate lung nasal epithelial clone protein,in human nasallavage fluid with two-dimensional electrophoresis and matrix-assisted laserdesorption/ionization-time of flight Electrophoresis 22,1795)。SPLUNC1显示是一种体积敏感分子，因为其可以分泌到表达ENaC的表面上皮的黏膜表面中(Bartlett等,J.Leukoc.Biol.83:1201(2008)；Bingle等,J.Pathol.205:491(2005))。此外，已证明，SPLUNC1包含通过其N端结构域发挥作为ENaC的抑制剂的功能的亚结构域。
本发明公开了新的特化的非天然存在的肽，其通过结合并抑制离子转运以调节钠吸收和流体体积来模拟SPLUNC1在调节钠通道中的特性，并且治疗响应于调节钠吸收的病症。
发明内容
本发明部分地基于设计调节钠通道活性的特化的非天然存在的肽。因此，在一个方面，本发明涉及抑制钠通道活化的方法，其包括使钠通道与特化的非天然存在的肽或其功能性片段接触。在一个实施方案中，钠通道是上皮钠通道(ENaC)。在一个实施方案中，特化的非天然存在的肽或其功能性片段与钠通道结合。
本发明的另一方面涉及通过钠通道抑制钠吸收的方法，其包括使钠通道与特化的非天然存在的肽或其功能性片段接触。在一个实施方案中，特化的非天然存在的肽或其功能性片段与钠通道结合。
本发明的另一方面涉及增加内衬于上皮黏膜表面的流体的体积的方法，其包括使上皮黏膜表面上存在的钠通道与特化的非天然存在的肽或其功能性片段接触。在一个实施方案中，特化的非天然存在的肽或其功能性片段与钠通道结合。
本发明的另一方面涉及降低细胞表面上存在的钠通道的水平的方法，其包括使钠通道与特化的非天然存在的肽或其功能性片段接触。在一个实施方案中，特化的非天然存在的肽或其功能性片段与钠通道结合。
本发明的另一方面涉及在有需要的对象中治疗响应于抑制跨上皮黏膜表面的钠吸收的病症的方法，其包括向该对象递送治疗有效量的特化的非天然存在的肽或其功能性片段。在一个实施方案中，特化的非天然存在的肽或其功能性片段与钠通道结合。
本发明的另一方面涉及在有需要的对象中调节盐平衡、血量和/或血压的方法，其包括向该对象递送治疗有效量的特化的非天然存在的肽或功能性片段。在一个实施方案中，特化的非天然存在的肽或其功能性片段与钠通道结合。
本发明的另一方面涉及模拟PLUNC蛋白的钠通道结合结构域并与钠通道结合的特化的非天然存在的肽或其功能性片段，其中当与该肽结合时蛋白酶对钠通道的切割受到抑制。
本发明的另一方面涉及包含本发明的肽的试剂盒。
本发明的另一方面涉及特化的非天然存在的肽或其功能性片段用于制备在有需要的对象中治疗响应于抑制钠吸收的病症的药物的用途。
本发明的这些及其他方面在下文对本发明的描述中更详细地阐述。
附图简述
图1示出了S18(SEQ ID NO:1)的序列。红色突出显示的是ENaC相互作用所必需的残基，而蓝色突出显示的是发现不起作用的残基。
图2A至2B显示，抑制ENaC和保持ASL高度需要S18的第一半(LPVPLDQT(SEQ ID NO:113)而不是剩余部分DQTLPLNVNP(SEQ ID NO:114)。
图3A显示，尽管SEQ ID NO:2以D-丙氨酸为侧翼，S18(SEQ ID NO:1)和aaLPVPLDQTLPLNVNPaa(SEQ ID NO:2)具有相同的功效和效力。图3B显示，尽管(SEQ ID NO:3)以D-丙氨酸为侧翼，S18和aaLPVPLDQTaa(SEQ ID NO:3)具有相等的功效和效力。图3A还示出了肽样品的相对功效，所述肽样品包括aaLPNlePLDQTaa(SEQ ID NO:5)，其相对于S18或SEQ ID NO:4显示出增加的功效。
图4示出了S18和SEQ ID NO:5的另外的比较，以及SEQ ID NO：5的增加的功效。
图5A至5U示出了分析当GFP标记的α-ENaC与β和γENaC共表达时不同肽对HEK293T细胞中α-ENaC内化的作用和对细胞生存力的作用的实验结果。在几幅图的底部示出了EC50值。在这些图中，ADG是具有以下序列的阴性对照肽：NH3-ADGGLLLLNNPPPPQTVV-NH2(SEQ IDNO:143)。这些实验中使用的肽是S18(SEQ ID NO:1)、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:141、SEQ IDNO:129、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:138、SEQ IDNO:131、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:144和SEQ ID NO:127。这些实验中还使用了SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18和SEQID NO:136的肽，其各自在N和C两端具有aa帽。还示出了阿米洛利，其通过另一种机制抑制ENaC，并且不降低细胞表面上功能性受体的量。
图6示出了分析当GFP标记的α-ENaC仅与γENaC而不与β-ENaC共表达时不同肽对HEK293T细胞中α-ENaC内化的作用的实验结果。在该图中，与S18(SEQ ID NO:1)和SEQ IDNO:128一起使用了SEQ ID NO:143(阴性对照肽)和水(载体)对照。尽管当共表达β-ENaC时SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:128有效地降低α-ENaC，但是当不存在β-ENaC时，在该实验中没有观察到影响。
图7A示出了分析在用S18肽(SEQ ID NO:1)处理之后对ENaC-Tg C57BL:FVB小鼠的百分比存活的作用的实验结果。S18(100mM溶液)以1μL/g体重每天施用3次。
图7B示出了分析在用吸入的SEQ ID NO:142或SEQ ID NO:128处理之后对ENaC-TgC57BL:FVB小鼠的百分比存活的作用的实验结果。
图7C和7D示出了分析在用SEQ ID NO：129或SEQ ID NO：128处理之后对ENaC-TgC57BL:C3H小鼠的百分比存活的作用的实验结果。
图7E示出了分析在用每天一次剂量的SEQ ID NO：128处理之后对ENaC-Tg C57BL:C3H小鼠的百分比存活(左图)和体重增加(右图)的作用的实验结果。
图7F示出分析在用SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:134或SEQ ID NO:136处理之后对ENaC-Tg C57BL:C3H小鼠的百分比存活的作用的实验结果。
发明详述
现在将参照附图更详细地描述本发明，在附图中示出了本发明的一些优选实施方案。然而，本发明可以以不同的形式体现，并且不应被解释为限于本文所述的实施方案。当然，提供这些实施方案，使得本公开内容是彻底且完整的，并且将向本领域技术人员充分地传达本发明的范围。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员通常理解的相同的含义。本文用于描述本发明的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并且不旨在限制本发明。本文引用的所有出版物、专利申请、专利、专利公开及其他参考文献针对与引用文献所在句子和/或短语相关的教导而通过引用并入整体本文。
氨基酸以由IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的方式，或者(对于氨基酸)通过单字母代码或三字母代码表示，二者均根据37C.F.R.§1.822和已建立的使用方法。
除非上下文另外明确指出，在本发明说明书和所附权利要求书的中使用的没有数量词修饰的名词还旨在包括复数形式。
此外，本文使用的“和/或”是指且涵盖相关所列举项目中一个或更多个的任何和所有可能组合，以及在替代方案(“或”)中解释时缺少的组合。
术语“基本上由...组成”(及其语法变化形式)当应用于本发明的肽序列时意指由以下两者组成肽：所记载的序列(例如，SEQ ID NO)和在所记载的序列的N-端和/或C-端的总共10个或更少(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)的附加氨基酸，以致所述肽的功能未被实质改变。总共10个或更少的附加氨基酸残基包括两端的附加氨基酸残基加在一起的总量。术语“实质地改变”当应用于本发明的肽时是指与由所记载的序列组成的肽的活性相比，结合活性(例如，与钠通道或特化的非天然存在的肽)增加或降低至少约50％或更多。
术语“调节”指特定活性水平的增强(例如增加)或抑制(例如降低)。
术语“增强”或“增加”指特定参数增加至少约1.25倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、8倍、10倍、12倍或者甚至15倍。
本文使用的术语“抑制”或“降低”或者其语法变化形式指特定水平或活性降低或减小至少约15％、25％、35％、40％、50％、60％、75％、80％、90％、95％或更多。在一些具体实施方案中，抑制或降低导致很少或基本上没有可检测的活性(至多，不显著量，例如小于约10％或甚至5％)。
关于特化的非天然存在的肽和钠通道，所使用的术语“接触”或其语法变化形式指使特化的非天然存在的肽和钠通道彼此充分接近以使一者对另一者施加生物效应。在一些实施方案中，术语接触意指特化的非天然存在的肽与钠通道结合。
本文使用的“治疗有效”量是为对象提供一些改善或益处的量。换句话说，“治疗有效”量是在对象中一定程度地缓解、缓和或减轻至少一种临床症状的量。本领域技术人员将理解，治疗效果无需是完全或可治愈的，只要向对象提供一些益处即可。
术语“治疗”旨在降低或者至少部分地改善或改变对象的病症的严重程度，并且旨在实现至少一种临床症状的一定程度的缓解、缓和或减轻。
术语“片段”当应用于肽时将被理解为意指相对于参照肽或氨基酸序列而言长度缩短的氨基酸序列，并且包含与参照肽或氨基酸序列相同的连续氨基酸的氨基酸序列、基本上由其组成和/或由其组成。在适当时，根据本发明的这样的肽片段可包含较大多肽中，所述肽片段为较大多肽的组成部分。在一些实施方案中，这样的片段可以包含长度为根据本发明的肽或氨基酸序列的至少约4、5、6、7、8、9、10或更多个连续氨基酸的肽、基本上由其组成和/或由其组成。在另一些实施方案中，这样的片段可以包含长度小于根据本发明的肽或氨基酸序列的约10、9、8、7、6、5、4或更少个连续氨基酸的肽，基本上由其组成和/或由其组成。
除非另外说明，否则本文使用的术语“蛋白质”和“多肽”可互换使用并且涵盖肽和蛋白质二者。
“融合蛋白”是当将天然发现未融合在一起的编码两种(或更多种)不同多肽的两个异源核苷酸序列或其片段一起融合在正确的翻译阅读框时产生的多肽。举例说明性的融合多肽包括本发明的肽(或其片段)与谷胱甘肽-S-转移酶、麦芽糖结合蛋白或报道蛋白(例如，绿色荧光蛋白、β-葡糖醛酸糖苷酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶等)、血凝素、c-myc、FLAG表位等的全部或一部分的融合体。
本文使用的“功能性”肽或“功能性片段”是基本上保留与该肽通常相关的至少一种生物活性(例如，结合或抑制钠通道)的功能性片段。在一些具体实施方案中，“功能性”肽或“功能性片段”基本上保留未经修饰的肽所具有的所有活性。“基本上保留”生物活性意指该肽保留天然多肽的生物活性的至少约20％、30％、40％、50％、60％、75％、85％、90％、95％、97％、99％或更多(并且甚至可以具有比天然肽更高的活性水平)。“非功能性”肽是显示出很少或基本上没有与所述肽相关的可检测生物活性(例如，至多，仅不显著量，例如例如小于约10％或甚至5％)的肽。生物活性(例如蛋白质结合和钠通道抑制活性)可以使用本领域公知的和如本文所述的测定来测量。
当涉及例如多肽量、剂量、时间、温度、酶活性或其他生物活性等的可测量值时，本文使用的术语“约/大约”意指涵盖特定量的±20％、±10％、±5％、±1％、±0.5％或±甚至0.1％的变化。
本发明的第一方面涉及特化的非天然存在的肽与钠通道结合并阻止钠通道活化从而抑制钠离子流动的能力。因此，本发明的一个方面涉及抑制钠通道活化的方法，其包括使钠通道与特化的非天然存在的肽或其功能性片段接触(例如，结合)。在一个实施方案中，钠通道是上皮钠通道(ENaC)，例如人ENaC或非人哺乳动物ENaC。在另一个实施方案中，钠通道是在序列和/或结构上与ENaC类似的通道，例如酸敏感离子通道(ASIC)。钠通道活性的抑制可通过本领域已知或本文公开的任何方法来测量，包括但不限于钠流量或者跨膜、跨细胞或跨天然或人工内衬的电位变化。抑制可为至少约20％，例如至少约30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。
抑制钠通道活化的方法可在例如分离的钠通道、人工膜中的钠通道或细胞中的钠通道上进行。在一个实施方案中，钠通道存在于分离的细胞，例如培养的原代细胞或细胞系中。在另一个实施方案中，分离的细胞是上皮细胞培养物的一部分，例如天然或人工上皮内衬，例如其中可跨内衬测量例如离子流量和/或电位的特征的装置(例如尤斯灌流室)中的细胞培养物。在另一个实施方案中，细胞是分离的组织或组织培养物的一部分。在另一个实施方案中，细胞可以存在于动物，例如作为疾病模型或需要治疗的对象的动物中。
在一个实施方案中，使钠通道与特化的非天然存在的肽接触(例如，结合)的步骤包括将特化的非天然存在的肽或者其功能性片段或同系物递送至包含钠通道的细胞。
本文使用的术语“同系物”用于指这样的多肽，其与公开的特化非天然存在的肽的区别之处在于对特化的天然存在的多肽进行了修饰但显著保留所公开的非天然存在的肽的生物活性。次要修饰包括但不限于一个或几个氨基酸侧链的改变、一个或几个氨基酸的变化(包括缺失、插入和替换)、一个或几个原子的立体化学变化以及少量衍生化，包括但不限于甲基化、糖基化、磷酸化、乙酰化、肉豆蔻酰化、异戊烯化、棕榈酰化、酰胺化和糖基磷脂酰肌醇的添加。本文使用的术语“基本上保留”指保留天然存在的肽的活性(例如，结合钠通道)的至少约20％，例如约30％、40％、50％或更多的肽片段、同系物或其他变体。取决于肽的其他生物活性可包括酶活性、受体结合、配体结合、生长因子的诱导、细胞信号转导事件等。
在一个实施方案中，所述方法包括向包含钠通道的细胞递送分离的特化的非天然存在的肽。在一些示例性实施方案中，特化的非天然存在的肽包含公开的特化的非天然存在的肽或其功能性片段、基本上由其组成或由其组成。在另一个实施方案中，分离的特化的非天然存在的肽包含与公知的氨基酸序列或其功能性片段具有至少70％同一性，例如至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成。在一些实施方案中，所述肽包含PLUNC蛋白的天然氨基酸序列的一部分，其具有一个或更多个保守的天然或非天然氨基酸替换和/或一个或更多个非天然氨基酸添加。保守替换物如下所述。在一些实施方案中，如下所述，所述肽包含如下一个或更多个末端修饰。
本发明肽的非限制性实例在下表1中公开。在一些实施方案中，本发明的肽可以在氨基和/或羧基末端包含一个或更多个附加残基。在一些实施方案中，一个或更多个附加残基是D-丙氨酸。例如，肽可以在氨基和/或羧基末端包含一个或两个D-丙氨酸。
本发明的特化的非天然存在的肽还包括功能性部分或片段。片段的长度不关键，只要其基本上保留肽的生物活性(例如，钠通道结合活性)即可。举例说明性的片段包含特化的天然存在的肽的至少约4、5、6、7、8、9、10或更多连续氨基酸。在另一些实施方案中，所述片段包含特化的非天然存在的肽的不超过约10、9、8、7、6、5或4个连续氨基酸。
同样，本领域技术人员将认识到，本发明还涵盖包含特化的非天然存在的肽或其功能性片段的融合多肽。作为另一个替代方案，融合蛋白可包含报道分子。在另一些实施方案中，融合蛋白可包含提供与所述肽的活性相同或不同的功能或活性的多肽，例如靶向、结合、或者酶活性或功能。
同样，应理解，本文具体公开的肽通常容许氨基酸序列中的替换并且基本上保留生物活性。为了鉴定本发明除本文具体公开的那些之外的肽，氨基酸替换可基于本领域已知的任何特征，包括氨基酸侧链取代基的相对类似性或差异，例如其疏水性、亲水性、电荷、大小等。
在鉴定编码除本文具体公开的那些肽之外的肽的氨基酸序列中，可考虑氨基酸的亲水指数。亲水性氨基酸指数在赋予蛋白质相互作用的生物功能中的重要性在本领域中是普遍理解的(参见，Kyte和Doolittle,J.Mol.Biol.157:105(1982)；其通过引用整体并入本文)。公认的是，氨基酸的相对亲水特征有助于所得蛋白质的二级结构，其进而限定蛋白质与其他分子例如酶、底物、受体、DNA、抗体、抗原等的相互作用。
每个氨基酸已基于其疏水性和电荷特征分配亲水指数(Kyte和Doolittle,同上)，这些是：异亮氨酸(+4.5)、缬氨酸(+4.2)、亮氨酸(+3.8)、苯丙氨酸(+2.8)、半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)、甲硫氨酸(+1.9)、丙氨酸(+1.8)、甘氨酸(-0.4)、苏氨酸(-0.7)、丝氨酸(-0.8)、色氨酸(-0.9)、酪氨酸(-1.3)、脯氨酸(-1.6)、组氨酸(-3.2)、谷氨酸(-3.5)、谷氨酰胺(-3.5)、天冬氨酸(-3.5)、天冬酰胺(-3.5)、赖氨酸(-3.9)和精氨酸(-4.5)。
因此，当修饰本文具体公开的肽时，可考虑氨基酸(或氨基酸序列)的亲水指数。
在本领域中还应理解，氨基酸的替换可基于亲水性进行。美国专利No.4,554,101(通过引用整体并入本文)指出，蛋白质的最大局部亲水性(如由其相邻氨基酸的亲水性控制的)与蛋白质的生物特性相关。
如美国专利No.4,554,101中详述的，已向氨基酸残基分配以下亲水性值：精氨酸(+3.0)、赖氨酸(±3.0)、天冬氨酸(+3.0±1)、谷氨酸(+3.0±1)、丝氨酸(+0.3)、天冬酰胺(+0.2)、谷氨酰胺(+0.2)、甘氨酸(0)、苏氨酸(-0.4)、脯氨酸(-0.5±I)、丙氨酸(-0.5)、组氨酸(-0.5)、半胱氨酸(-1.0)、甲硫氨酸(-1.3)、缬氨酸(-1.5)、亮氨酸(-1.8)、异亮氨酸(-1.8)、酪氨酸(-2.3)、苯丙氨酸(-2.5)、色氨酸(-3.4)。
因此，当鉴定除本文具体公开的那些肽之外的另外的肽时，可考虑氨基酸(或氨基酸序列)的亲水性。
本发明的肽(及其片段)包括与本文公开的肽序列具有至少约70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高氨基酸序列同一性的肽。
如本领域已知的，可使用很多不同的程序来鉴定多肽是否与已知序列具有序列同一性或相似性。序列同一性或相似性可使用本领域已知的标准技术来确定，包括但不限于Smith&Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981)的局部序列同一性算法；通过Needleman&Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)的序列同一性比对算法；通过Pearson&Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444(1988)的相似性检索方法；通过这些算法(WisconsinGenetics Software Package,Genetics Computer Group,575Science Drive,Madison,WI中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)的计算机化实施；Devereux等,Nucl.Acid Res.12:387(1984)描述的最佳拟合序列程序，优选地使用默认设置，或者通过检验。
可用算法的一个实例是PILEUP。PILEUP使用渐进式的成对比对由一组相关序列生成多重序列比对。其还可绘制显示用于生成比对结果的聚类关系的树。PILEUP使用Feng和Doolittle,J.Mol.Evol.35:351(1987)的渐进式比对方法的简化；该方法与Higgins和Sharp,CABIOS 5:151(1989)所述的方法类似。
可用算法的另一个实例是在Altschul等,J.Mol.Biol.215:403(1990)和Karlin等.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873(1993)中所述的BLAST算法。特别有用的BLAST程序是从Altschul等,Meth.Enzymol.,266:460(1996)；blast.wustl/edu/blast/README.html.获得的WU-BLAST-2程序。WU-BLAST-2使用数个优选设置为默认值的检索参数。这些参数是动态值，并且由程序本身根据具体序列的组成和检索目的序列所针对的具体数据库的组成确定；然而，可调整这些值以增加灵敏度。
另一种可用的算法是由Altschul等,Nucleic Acids Res.25:3389(1997)报道的有空位的BLAST。
百分比氨基酸序列同一性值由匹配相同残基的数目除以比对区中“较长”序列的残基总数来确定。“较长”序列是在比对区中具有最多实际残基的序列(忽略WU-Blast-2为最大化比对评分而引入的空位)。
比对可包括在待比对的序列中引入空位。此外，对于与本文具体公开的肽相比包含更多或更少氨基酸的序列，应理解，在一个实施方案中，序列同一性的百分比将基于相对于总氨基酸数的相同氨基酸的数目来确定。因此，例如，在一个实施方案中，使用较短序列中氨基酸的数目来确定比本文具体公开的序列短的序列的序列同一性。在百分比同一性计算中，序列变化的不同显示(例如插入、缺失、替换等)不分配相对权重。
在一个实施方案中，仅将同一性评正分(+1)并且向包括空位的所有序列变化形式评分为“0”，其避免用于序列相似性计算的下述加权标度或参数的需要。百分比序列同一性，可例如通过将匹配相同残基的数目除以比对区中“较短”序列的总残基数并乘以100来确定。“较长”序列是在比对区中具有最多实际残基的序列。
可通过在氨基和/或羧基末端添加封端剂促进相关肽的体内存活来修饰本发明的肽和片段以用于体内使用。这可用于其中肽末端在被细胞摄取之前易于被蛋白酶降解的情况。这样的封端剂可包括但不限于可与待施用肽的氨基和/或羧基末端残基连接的另外的相关或不相关的肽序列。这可在肽合成期间化学进行或者通过任何合适方法通过重组DNA技术进行。例如，可向末端添加一个或更多个非天然存在的氨基酸，例如D-丙氨酸。或者，可使封端剂诸如焦谷氨酸或本领域已知的其他分子连接至氨基和/或羧基末端残基，或者可用不同部分替换氨基末端的氨基或羧基末端的羧基。另外，可对肽末端进行修饰，例如通过N端的乙酰化和/或C端的酰胺化进行修饰。同样地，可在施用之前使肽与可药用的“载体”蛋白共价或非共价偶联。
在一个实施方案中，本发明的肽或其片段直接施用于对象。一般来说，使本发明的化合物混悬在可药用载体(例如。生理盐水)中并经口或通过静脉内输注施用，或者如下施用：皮下、肌内、鞘内、腹膜内、直肠内、阴道内、鼻内、胃内、气管内或肺内。在另一个实施方案中，气管内或肺内递送可使用标准的喷雾器、喷射喷雾器、丝网喷雾器、干粉吸入器或定量雾化吸入器来完成。其可直接递送至疾病或病症的部位，例如肺、肾或肠。所需剂量取决于施用途径的选择、制剂的性质、患者疾病的性质、对象的大小、体重、表面积、年龄和性别，正施用的其他药物，以及主治医师的判断。合适的剂量为0.01μg/kg至100.0μg/kg。考虑到可利用的肽、片段和同系物的多样性以及不同施用途径的不同效率，预期所需剂量广泛变化。例如，预期与通过静脉内注射来施用相比，经口施用需要更高的剂量。如本领域中公知的，这些剂量水平的变化可使用用于优化的标准经验途径进行调整。施用可以是单次或多次的(例如2、3、4、6、8、10、20、50、100、150或更多次)。肽、片段和同系物在合适递送载体(例如聚合物微粒或可植入装置)中的包封可提高递送的效率，特别是对于经口递送。
根据某些实施方案，肽或其片段可在体内靶向特定细胞或组织。靶向递送载体(包括脂质体)和所靶向的系统是本领域已知的。例如，脂质体可通过使用与脂质体一起并入以靶向可结合靶向分子的特定细胞或组织的靶向剂(例如抗体、可溶性受体或配体)来针对特定的靶细胞或组织。靶向脂质体在例如Ho等.,Biochemistry 25:5500(1986)；Ho等,J.Biol.Chem.262:13979(1987)；Ho等,J.Biol.Chem.262:13973(1987)；Huang等的美国专利No.4,957,735中进行了描述，其全部内容通过引用并入本文。
本发明的另一方面涉及通过钠通道抑制钠吸收的方法，其包括使钠通道与特化的非天然存在的肽或其片段接触(例如，结合)。钠吸收的抑制可通过本领域已知的或本文公开的任何技术来测量。
本发明的另一方面涉及一种增加内衬于上皮黏膜表面的流体的体积的方法，其包括使上皮黏膜表面上存在的钠通道与特化的非天然存在的肽或者其功能性片段或同系物接触(例如，结合)。内衬于上皮黏膜表面的流体的体积可通过本领域已知的或本文公开的任何技术来测量。
本发明的另一方面涉及降低细胞表面上存在的钠通道的水平的方法，其包括使钠通道与特化的非天然存在的肽或者其功能性片段或同源物接触(例如，结合)。
本发明的另一方面涉及在有需要的对象中治疗响应于抑制跨上皮黏膜表面的钠吸收的病症的方法，其包括向该对象递送治疗有效量的特化的非天然存在的肽或者其功能性片段或同系物。在一个实施方案中，本发明涵盖在有需要的对象中治疗响应于抑制跨上皮黏膜表面的钠吸收的病症的方法，其包括向该对象施用包含选自SEQ ID NO:2至128的序列的肽。在一些非限制性实例中，本发明方法中的病症可以是肺病(例如，囊性纤维化、非囊性纤维化、支气管扩张、慢性阻塞性肺病、急性或慢性支气管炎、或哮喘)、胃肠病(例如、炎性肠病)、肾病或心血管病。
本发明的另一方面涉及在有需要的对象中调节盐平衡、血量和/或血压的方法，其包括向该对象递送治疗有效量的特化的非天然存在的肽或者其功能性片段或其同系物。
本发明的第三方面涉及可用于实施本文公开的方法的产品。因此，本发明的一个方面涉及包含以下序列的肽或其功能性片段：
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(SEQ ID NO:116)
其中：
X1为亮氨酸或者以天然或非天然氨基酸的保守替换物；
X2为脯氨酸或者以天然或非天然氨基酸的保守替换物；
X3为缬氨酸或者以天然或非天然氨基酸的保守替换物；
X4为脯氨酸或者以天然或非天然氨基酸的保守替换物；
X5为亮氨酸或者以天然或非天然氨基酸的保守替换物；
X6为天冬氨酸或者以天然或非天然氨基酸的保守替换物；
X7为谷氨酰胺或者以天然或非天然氨基酸的保守替换物；并且
X8为苏氨酸或者以天然或非天然氨基酸的保守替换物。
本发明的另一方面涉及包含以下序列的肽或其功能性片段：
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(SEQ ID NO:117)
其中：
X1为亮氨酸、正亮氨酸或缬氨酸；
X2为脯氨酸、4-羟脯氨酸、(2R,5S)-5-苯基-吡咯烷-2-羧酸或3,4-脱氢-L-脯氨酸；
X3为缬氨酸、亮氨酸、正亮氨酸或N-甲基缬氨酸；
X4为脯氨酸、4-羟脯氨酸、(2R,5S)-5-苯基-吡咯烷-2-羧酸或3,4-脱氢-L-脯氨酸；
X5为亮氨酸、正亮氨酸或缬氨酸；
X6为天冬氨酸或谷氨酸；
X7为谷氨酰胺或天冬酰胺；并且
X8为苏氨酸，丝氨酸或L-α-甲基丝氨酸。
本发明的另一方面涉及包含以下序列的肽或其功能性片段：
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15(SEQ ID NO:118)
其中：
X1为亮氨酸或者以天然或非天然氨基酸的保守替换物；
X2为脯氨酸或者以天然或非天然氨基酸的保守替换物；
X3为缬氨酸或者以天然或非天然氨基酸的保守替换物；
X4为脯氨酸或者以天然或非天然氨基酸的保守替换物；
X5为亮氨酸或者以天然或非天然氨基酸的保守替换物；
X6为天冬氨酸或者以天然或非天然氨基酸的保守替换物；
X7为谷氨酰胺或者以天然或非天然氨基酸的保守替换物；
X8为苏氨酸或者以天然或非天然氨基酸的保守替换物；
X9为苏氨酸或者以天然或非天然氨基酸的保守替换物；
X10为亮氨酸或者以天然或非天然氨基酸的保守替换物；
X11为脯氨酸或者以天然或非天然氨基酸的保守替换物；
X12为天冬酰胺或者以天然或非天然氨基酸的保守替换物；
X13为缬氨酸或者以天然或非天然氨基酸的保守替换物；
X14为天冬酰胺或者以天然或非天然氨基酸的保守替换物；并且
X15为脯氨酸或者以天然或非天然氨基酸的保守替换物。
在一些实施方案中，所述肽包含选自SEQ ID NO:4-142和SEQ ID NO:144的序列。在一个实施方案中，所述肽包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:122的序列。在一个实施方案中，所述肽包含SEQ ID NO:2(aaLPVPLDQTLPLNVNPaa)或SEQ ID NO:119的序列。在一个实施方案中，所述肽包含SEQ ID NO：127或SEQ ID NO:128(aaLPIPLDQTaa)的序列。
在某些实施方案中，本发明的肽包含至少一个经修饰的末端，例如以保护肽免于降解。在一些实施方案中，N端是乙酰化的和/或C端是酰胺化的。在一些实施方案中，所述肽包含SEQ ID NO:10-127、129、130、133、134或136-140中任一个的序列，所述肽还包含在氨基和/或羧基末端的一个或两个D-丙氨酸。
在某些实施方案中，本发明的肽包含至少一个非天然氨基酸(例如，1、2、3个或更多)或至少一个末端修饰(例如1或2个)。在一些实施方案中，所述肽包含至少一个非天然氨基酸和至少一个末端修饰。
在某些实施方案中，所述肽模拟PLUNC蛋白的钠通道结合结构域。钠通道结合结构域是具有与全长PLUNC蛋白基本相同的钠通道结合活性所需的PLUNC蛋白的最小片段。术语“基本相同的结合活性”指为全长蛋白质的结合活性的至少约50％，例如结合活性的的至少约60％、70％、80％或90％的活性。在一些实施方案中，所述肽至少与全长PLUNC蛋白具有相同的结合活性。在一个实施方案中，钠通道是ENaC，例如人ENaC。在另一个实施方案中，钠通道是在序列和/或结构上与ENaC类似的通道，例如酸敏感离子通道(ASIC)。
本发明的肽可任选地与其他治疗剂联合递送。另外的治疗剂可与本发明的肽并行递送。本文使用的词语“并行”意指在时间上足够接近以产生组合效果(即，并行可以是同时，或者其可以是在彼此之前或之后的短时间内发生的两个或更多个事件)。在本发明的一个实施方案中，将特化的非天然存在的肽与调节囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)的功能的化合物并行递送于患者，在此特化的非天然存在的肽和CFTR靶向剂的组合活性具有优于单独CFTR靶向剂的活性。在本发明的另一个实施方案中，将特化的非天然存在的肽与黏液溶解化合物并行递送于患者，在此特化的非天然存在的肽和黏液溶解剂的组合活性具有优于单独黏液溶解剂的活性。在本发明的又一个实施方案中，将特化的非天然存在的肽与长效B激动剂化合物(LABA)并行递送于患者，在此特化的非天然存在的肽和LABA剂的组合活性具有优于单独LABA的活性。在本发明的又一个实施方案中，将特化的非天然存在的肽与糖皮质激素激动剂并行递送于患者，在此特化的非天然存在的肽和糖皮质激素剂的组合活性具有优于单独糖皮质激素的活性。
本发明的另一方面涉及包含本发明的肽并且可用于实施本发明方法的试剂盒。所述试剂盒还可包含用于进行方法的另外试剂(例如，缓冲剂、容器、另外的治疗剂)以及说明书。
作为另一方面，本发明提供了实现本文所讨论的任何治疗效果(例如，钠吸收的调节)的药物制剂及其施用方法。所述药物制剂可以包含在可药用载体中的上文所讨论的任何试剂，例如特化的非天然存在的肽或其功能性片段。
“可药用”意指不是生物学或其他方面不期望的材料，即所述材料可施用于对象而不引起任何不期望的生物效应，例如毒性。
本发明的制剂可以任选地包括药用试剂、药剂、载体、佐剂、分散剂、稀释剂等。
本发明的肽可以根据已知技术配制成用于在药用载体中施用。参见，例如，Remington,The Science And Practice of Pharmacy(第9版1995)。在制备根据本发明的药物制剂中，通常将肽(包括其生理上可接受的盐)与尤其可接受的载体混合。所述载体可以是固体或液体，或者二者，并且优选地与肽配制成单位剂量制剂，例如片剂，其可包含按重量计0.01％或0.5％至95％或99％的肽。本发明的制剂中可包含一种或更多种肽，其可通过药学的任何公知技术来制备。
本发明的另一方面是在体内治疗对象的方法，其包括向对象施用包含在可药用载体中的本发明肽的药物组合物，其中所述药物组合物以治疗有效量施用。向有此需要的人对象或动物施用本发明的肽可通过本领域已知的用于施用化合物的任何方式来进行。
本发明的制剂包括适于以下的那些：经口、直肠、局部、经颊(例如，舌下)、经阴道、肠胃外(例如皮下，肌内包括骨骼肌、心肌、隔膜肌和平滑肌，皮内，静脉内，腹膜内)、表面(即，皮肤和黏膜表面二者，包括气道表面)、鼻内、经皮、关节内、鞘内和吸入施用；通过门静脉内递送来适用于肝；以及直接器官注射(例如，注入肝中、注入脑中以递送到中枢神经系统、注入胰腺中、或者注入肿瘤或肿瘤周围的组织中)。任何给定情况下的最合适途径将取决于所治疗病症的性质和严重程度以及正在使用的具体肽的性质。
对于注射，载体通常是液体，例如无菌无热原水、无菌生理盐水、高张盐水、无热原磷酸缓冲盐水溶液、抑菌水或Cremophor EL[R](BASF,Parsippany,N.J.)。对于其他施用方法，载体可以是固体或液体。
对于经口施用，肽可以以固体剂型(例如胶囊剂、片剂和散剂)或液体剂型(例如酏剂、糖浆剂和混悬剂)施用。肽可以与无活性成分和粉状载体一起包封在明胶胶囊中，所述载体例如葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、淀粉、纤维素或纤维素衍生物、硬脂酸镁、硬脂酸、糖精钠、滑石、碳酸镁等。可以添加以提供期望颜色、味道、稳定性、缓冲能力、分散或其他已知的所期望特征的另外的无活性成分的实例为氧化铁红、硅胶、月桂基硫酸钠、二氧化钛、食用白色墨等。可使用类似的稀释剂来制备压制片剂。片剂和胶囊剂二者均可制成持续释放产品以提供药物在数小时时间内的持续释放。压制片剂可以是糖包衣或膜包衣的以掩盖任何令人不愉快的味道并且保护片剂免受大气破坏，或者是肠溶包衣的以在胃肠道中选择性崩解。用于经口施用的液体剂型可包含着色剂和调味剂以提高患者的接受度。
适于经颊(舌下)施用的制剂包括包含在矫味基质(通常为蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶)中的化合物的锭剂和包含在惰性基质(例如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶)中的化合物的锭剂。
适于肠胃外施用的本发明制剂包含肽的无菌水性和非水性注射液剂，该制剂优选地与预期接受者的血液等张。这些制剂可包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂以及使制剂与预期接受者的血液等渗的溶质。水性和非水性无菌混悬液剂可包含悬浮剂和增稠剂。制剂可存在于单位/剂量或多剂量容器(例如密封的安瓿和小瓶)中，并且可储存在冷冻干燥(冻干)条件下，仅需在使用之前即刻添加无菌液体载体(例如盐或注射用水)。
即时注射溶液剂和混悬剂可由前述种类的无菌散剂、颗粒剂和片剂制备。例如，在本发明的一个方面，提供了在密封容器中的单位剂型的包含本发明肽的可注射的稳定无菌组合物。肽或盐以冻干物的形式提供，其能够用合适的可药用载体重构以形成适于将其注入对象中的液体组合物。单位剂型通常包含约1mg至约10g的肽或盐。当肽或盐基本上不溶于水时，可使用足够量的可药用的乳化剂以在水性载体中乳化肽或盐。一种这样的可用乳化剂是磷脂酰胆碱。
适于直肠施用的制剂优选作为单位剂量栓剂存在。这些可通过将肽与一种或更多种常规的固体载体(例如可可脂)混合并随后使所得混合物成形来制备。
适于表面施用于皮肤的制剂优选采用软膏剂、乳膏剂、洗剂，糊剂、凝胶剂、喷雾剂、气雾剂或油剂的形式。可使用的载体包括凡士林、羊毛脂、聚乙二醇、醇、经皮增强剂，及其两种或更多种的组合。
适于经皮施用的制剂可作为适于与接受者的表皮长时间紧密接触的离散贴剂存在。适于经皮施用的制剂还可通过离子电渗法递送(参见，例如，Tyle,Pharm.Res.3:318(1986))，并且通常采用肽的任选缓冲水溶液剂的形式。合适的制剂包含柠檬酸盐或Bis/Tris缓冲液(pH6)或乙醇/水，并且包含0.1M至0.2M的化合物。
或者，可将肽配制成用于经鼻施用或另外地通过任何合适的方式施用于对象的肺，所述方式例如通过对象吸入的包含肽的可呼吸颗粒的气雾剂混悬剂来施用。可呼吸颗粒可以是液体或固体。术语“气雾剂”包括任何气载混悬相，其能够被吸入细支气管或鼻通道。特别地，气雾剂包括液滴的气载混悬剂，如可在定量雾化吸入器或喷雾器中或者在雾状喷雾器中产生。气雾剂还包括混悬在空气或其他载体气体中的干粉组合物，其可以通过从例如吸入器装置吹入而被递送。参见Ganderton和Jones,Drug Delivery to theRespiratory Tract,Ellis Horwood(1987)；Gonda(1990)Critical Reviews inTherapeutic Drug Carrier Systems 6:273-313；以及Raeburn等,J.Pharmacol.Toxicol.Meth.27:143(1992)。如本领域技术人员已知的，包含肽的液体颗粒的气雾剂可通过任何合适的方式产生，例如用压力驱动的气雾剂喷雾器或超声喷雾器。参见，例如，美国专利No.4,501,729。包含肽的固体颗粒的气雾剂同样地可通过药学领域已知的技术用任何固体的颗粒药物气雾剂发生器产生。
或者，可以以局部而非全身的方式，例如在药性持久或持续释放制剂中施用肽。
此外，本发明提供了本文公开的肽及其盐的脂质体制剂。用于形成脂质体混悬剂的技术是本领域公知的。当肽或其盐是水溶性盐时，使用常规的脂质体技术，可将其并入脂质囊泡中。在这样的情况下，由于肽或盐的水溶性，肽或盐将基本上夹带在脂质体的亲水性中心或核心内。所使用的脂质层可具有任何常规的组成，并且可包含胆固醇或可不含胆固醇。当目的肽或盐不溶于水时，仍使用常规的脂质体形成技术时，盐可基本上夹带在形成脂质体结构的疏水性脂质双层内。在任一情况下，所产生的脂质体的尺寸可减小，如通过使用标准的超声处理和匀浆技术来减小。
可将包含本文公开的肽或其盐的脂质体制剂冻干以产生冻干物，所述冻干物可用可药用载体(例如水)重构以再生脂质体混悬剂。
在水不溶性肽的情况下，可以制备包含水不溶性肽，例如在水性基质乳剂中的水不溶性肽的药物组合物。在这样的情况下，组合物将包含足够量的可药用乳化剂以乳化期望量的肽。特别可用的乳化剂包括磷脂酰胆碱和卵磷脂。
在一些具体实施方案中，将治疗有效量(如该术语在上文定义的)的肽施用于对象。药学活性肽的剂量可通过本领域已知的方法来确定，参见例如Remington'sPharmaceutical Sciences(Mack Publishing Co.,Easton,Pa)。任何特定肽的治疗有效剂量将根据肽或患者而所有变化，并且将取决于患者的状况和递送途径。作为一般命题，约0.1mg/kg至约50mg/kg的剂量将具有治疗效力，其中所有重量均基于肽的重量来计算，包括使用盐的情况。较高级别的毒性问题可将静脉内剂量限制在较低水平，例如至多约10mg/kg，其中所有的重量均基于肽的重量来计算，包括使用盐的情况。约10mg/kg至约50mg/kg的剂量可用于经口施用。通常来说，约0.5mg/kg至5mg/kg的剂量可用于肌内注射。对于静脉内或经口施用，具体剂量分别为约1微摩尔/kg至50微摩尔/kg、更具体地约22微摩尔/kg至33微摩尔/kg的肽。
在本发明的一些具体实施方案中，可在不同时间间隔(例如，每小时、每天、每周、每月等)内使用一次以上施用(例如，两次、三次、四次或更多次施用)以实现治疗效果。
本发明用于兽医和医疗应用。合适的对象包括禽类和哺乳动物，其中优选哺乳动物。本文使用的术语“禽类”包括但不限于鸡、鸭、鹅、鹌鹑、火鸡和野鸡。本文使用的术语“哺乳动物”包括但不限于人、牛、绵羊、山羊、马、猫、犬、兔形动物等。人对象包括新生儿、婴幼儿、青少年和成人。
在以下实施例中更具体地描述本发明，这些实施例旨在仅是举例说明性的，因为本文的众多修改方案和变化方案对本领域技术人员都将是显而易见的。
实施例1
实验部分
组织获取和细胞培养：如由UNC医学院IRB批准的方案先前所述的，从人支气管组织通过酶促消化来收获细胞(Tarran等,J.Gen.Physiol.127:591(2006))。在肺移植时从主干或肺叶(lumbar)支气管的一部分获得人过量的供体肺和切除的接受者肺，并通过酶促消化来收获细胞。使所有制备物维持在改良的支气管上皮培养基中的空气-液体界面处，并接种在用人胎盘VI型胶原(Sigma)包被的12mm T-Clear插入物(Corning Costar)上后2至5周使用。使用磷酸缓冲盐水(PBS)来洗涤人支气管上皮培养物黏膜表面。
共聚焦显微镜：为标记气道表面液体，向人支气管上皮培养物黏膜表面添加包含德克萨斯红-右旋糖酐(2mg/ml；Invitrogen)的林格液。经黏膜添加全氟化碳以防止气道表面液体蒸发，并将培养物放置在具有63×甘油浸渍物镜的Leica SP8共聚焦显微镜的台上包含100μl林格液的室中。每个培养物扫描10个点，并确定平均气道表面液体高度。对于共聚焦显微镜，将人支气管上皮培养物在包含以下(mM)的改良林格溶液中浆膜浸浴：116NaCl、10NaHCO3、5.1KCl、1.2CaCl2、1.2MgCl2、20TES、10葡萄糖,pH 7.4)。在所有其他时间，将人支气管上皮培养物维持在充入5％CO2的包含24mM NaHCO3的改良BEGM生长培养基中。全氟化碳(FC-77)从3M获得，并且如先前报道的，其对ASL的高度没有作用。
α-ENaC的内化：根据生产商的说明并如先前所公开的，在384孔板中使用lipofectamine用在ENaC的N端融合gfp的gfp-αENaC以及未经标记的βENaC和γENaC转染HEK293T细胞(参见，例如，Hobbs等Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol.2013年12月；305(12):L990-L1001.doi:10.1152/ajplung.00103.2013.电子出版于2013年10月；Garland等Proc Natl Acad Sci U S A.2013年10月1日；110(40):15973-8.doi:10.1073/pnas.1311999110.电子出版于2013年9月16日；Tan等J Physiol.2014年12月1日；592(Pt23):5251-68)。24小时之后，在t＝0时添加肽或载体对照，3小时后使用Tecan M1000读板器读取荧光。在488nm和510nm下读取荧光。
图6示出了分析在GFP标记的α-ENaC仅与γENaC而不与β-ENaC共表达时不同肽对HEK293T细胞中α-ENaC内化的作用的实验结果。在该图中，与S18(SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:128)一起使用了SEQ ID NO:143(阴性对照肽)和水(载体)对照。尽管在共表达β-ENaC时SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:128有效地降低α-ENaC，但是当不存在β-ENaC时，在该实验中没有观察到影响。
βENaC小鼠中的效力测试：与CF患者一样，ENaC-Tg小鼠在出生时未患疾病，但很快发生阻塞性肺病(Zhou,Z.,等Am J Respir Crit Care Med 178,1245-1256(2008))。C57BL:FVB和C57BL:C3H混合菌株的死亡率分别为90％和50％，并且在这些背景下疾病的再现率足够高：用n为约8至10只动物/组产生可靠的数据。此外，βENaC-Tg小鼠以与人中CF/COPD类似的方式对治疗干预作出反应，并且在出生时抑制肺病后可预防肺病的发展(Livraghi,A.,等J Immunol 182,4357-4367(2009))。在平行的小鼠组群中，通过鼻内滴注(1μl/g体重)每天1至3次地给药S18衍生肽或载体，持续14天。每天称重小鼠，并且如果发现利尿效应，则通过皮下注射无菌盐水来替代分泌的体积。在处理结束时，处死小鼠用于表型分析。
统计学分析：所有数据均表示为n个实验的平均值±SE。每个研究使用来自三个或更多个单独供体的气道培养物，并且在三个独立的场合重复每个卵母细胞研究。视实验情况而定，使用配对或非配对t检验或其非等效参数测试平均值之间的差异的统计学显著性。从这样的比较，判断产生P≤0.05的差异是显著的。将所有的结合测定拟合成Hill方程。
实施例2
特化的非天然存在的肽的鉴定
基于正常人支气管上皮培养物将气道表面液体高度调节至7μm的能力(其与胰蛋白酶敏感性ENaC活性的降低相并联)，我们之前表明SPLUNC1衍生肽(即S18；图1)在单次剂量之后可以以亚微摩尔范围内的EC50抑制ENaC多达24小时(Hobbs等,2013)。尽管S18对蛋白水解具有抗性且热稳定，我们仍测试了我们是否可减小S18的大小、增加其稳定性和/或提高其功效。任何这些作用都会增加其作为药物的效用。
为了确定我们的丙氨酸扫描数据，我们制备了子序列A(LPVPLDQT(SEQ ID NO:113))；图1)的肽。作为对照，我们制备了含有带电荷的中间区(DQT)的重叠第二肽，以及子序列B(DQTLPLNVNP(SEQ ID NO:114))。如图2中所示，LPVPLDQT(SEQ ID NO：113)保留与S18类似的活性，而DQTLPLNVNP(SEQ ID NO:114)无活性。然而，我们检测对蛋白酶的易感性的另外实验证明，尽管LPVPLDQT(SEQ ID NO:113)可抑制ENaC引导的流体吸收，但该肽更易遭受蛋白水解降解。因此，我们产生了新的肽，其中我们使C端和N端的侧翼具有一对D-丙氨酸(示为小写‘a’)。将30μM肽经黏膜添加至HBEC并在3小时后通过XZ-共聚焦显微镜测量ASL高度。图2A示出了S18的N端区域(LPVPLDQT)(SEQ ID NO:113)相对于重叠的，但是为C端的区段(DQTLPLNVNP)(SEQ ID NO:114)的比较。在图2B中，向子-S18肽LPVPLDQT(SEQ ID NO:113)和LPVPLDQTLPL(SEQ ID NO:115)中添加D-丙氨酸以增加LPVPLDQT(SEQ ID NO：113)的稳定性。D-丙氨酸以小写a表示。所有n＝6至9。数据示为平均值±SEM。
当与S18相比时，15-聚体和8-聚体显示出相同的活性(图2A至2B)。然后，我们产生针对S18对比肽aaLPVPLDQTaa(SEQ ID NO:3)的全剂量应答。S18和aaLPVPLDQTaa(SEQ IDNO:3)产生相同的剂量应答(图3A)，表明缩短肽并使其侧翼具有非天然氨基酸不影响其功效或效力。接着，我们基于SEQ ID NO:2的序列制备了几种新的肽。在此，由于脯氨酸通常在肽中提供扭结，因此不对其进行改变和替换，我们系统地对其他氨基酸进行保守替换物。剂量应答示于图3B中。注意，由于该图上有几条线，因此省略了误差棒和数据符号。然而，这些数据是使用配对气道培养物同时获得的，因此其比较是有效的。显然，与S18相比，SEQ IDNO:5(aaLPNlePLDQTaa)显示出效力呈对数倍增加，而SEQ ID NO:9(aaLPVPLDQSaa)和SEQID NO:6(aaLPVPNleDQTaa)分别显示出降低的功效和效力(图3B)。图3B中包括的其他序列是SEQ ID NO：4(aaNlePVPLDQTaa)、SEQ ID NO:7(aaLPVPLDNTaa)和SEQ ID NO:8(aaLPVPLEQTaa)。
使用新鲜批次的气道细胞，我们进行了针对SEQ ID NO：5的另外的剂量应答(图4)。可以看出，与S18相比，该肽产生功效的显著增加，并且IC50为30nM。
测试了肽调节αENaC的内化的能力。来自这些实验的结果示于图5A至5U中。ADG是具有以下序列的阴性对照肽：NH3-ADGGLLLLNNPPPPQTVV-NH2(SEQ ID NO:143)。这些实验中使用的肽是S18(SEQ ID NO:1)、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:134、SEQID NO:135、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:144和SEQ ID NO:127。在这些实验中还使用了SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:136的肽，其各自在N和C两端具有aa帽。还示出了阿米洛利，其通过另一种机制抑制ENaC，并且不降低细胞表面上功能性受体的量。这些结果表明SPLUNC肽触发ENaC功能的破坏以抑制其活性。
在βENaC小鼠中测试肽的效力。来自这些实验的结果示于图7A至7F中。与吸入的SEQ ID NO:142相比，用吸入的SEQ ID NO:128进行14天处理在增加βENaC-Tg C57BL:FVB小鼠的百分比存活方面更有效(图7B)。SEQ ID NO:128的14天处理还增加βENaC-Tg C57BL:C3H小鼠的百分比存活(图7C和7D)。每日一次给药SEQ ID NO:128增加βENaC-Tg C57BL:C3H小鼠的存活百分比(图7E，左图)。图7E的右图显示，SEQ ID NO:128不具有利尿作用。图7F显示，用SEQ ID NO:127进行处理增加ENaC-Tg C57BL:C3H小鼠的百分比存活。实验中使用的其他肽的序列是SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:134和SEQ ID NO:136。
前述内容是对本发明的举例说明，并且不应解释为对本发明进行限制。本发明由所附权利要求书限定，其中本文中包括权利要求书的等同方案。
序列表
<110> 北卡罗米纳大学查佩尔希尔分校
斯拜丽丝生物科学公司
R·塔兰
D·J·克里斯滕森
<120> 改良的钠通道的肽抑制剂
<130> 5470-721WO
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<151> 2014-10-08
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<170> PatentIn version 3.5
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<223> 抑制钠通道活性的肽序列
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<223> 酰胺化
<400> 28
Val Xaa Leu Xaa Val Glu Gln Ser
1 5
<210> 29
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 酰胺化
<400> 29
Val Pro Leu Pro Val Glu Gln Ser
1 5
<210> 30
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 酰胺化
<400> 30
Leu Pro Leu Pro Leu Glu Gln Ser
1 5
<210> 31
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa是mV
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 酰胺化
<400> 31
Leu Pro Xaa Pro Leu Asp Gln Ser
1 5
<210> 32
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa是Nle
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 酰胺化
<400> 32
Leu Pro Xaa Pro Leu Asp Gln Thr
1 5
<210> 33
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa是Nle
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 酰胺化
<400> 33
Leu Pro Xaa Pro Val Glu Gln Ser
1 5
<210> 34
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MOD_RES
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> Xaa是HYP
<220>
<221> MOD_RES
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa是HYP
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa是Nle
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa是NYP
<220>
<221> MOD_RES
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MOD_RES
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MOD_RES
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MOD_RES
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<223> 乙酰化
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> Xaa是DHP
<220>
<221> MOD_RES
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<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MOD_RES
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MOD_RES
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MOD_RES
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> Xaa是2PP
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 酰胺化
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Leu Pro Val Xaa Leu Asp Gln Thr
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MOD_RES
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<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MOD_RES
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<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
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<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 酰胺化
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<213> 人工序列
<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa是HYP
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa是HYP
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 酰胺化
<400> 43
Leu Xaa Val Xaa Leu Asp Gln Thr
1 5
<210> 44
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 酰胺化
<400> 44
Leu Pro Val Pro Leu Glu Gln Ser
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MOD_RES
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MOD_RES
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<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
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<400> 46
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MOD_RES
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<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 酰胺化
<400> 47
Leu Pro Val Pro Val Glu Gln Ser
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 酰胺化
<400> 48
Leu Pro Val Pro Val Asp Gln Ser
1 5
<210> 49
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 酰胺化
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MOD_RES
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<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 酰胺化
<400> 50
Leu Pro Leu Pro Leu Asp Gln Ser
1 5
<210> 51
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
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<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 酰胺化
<400> 51
Val Pro Leu Pro Leu Asp Gln Ser
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 酰胺化
<400> 52
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1 5
<210> 53
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MOD_RES
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<223> 乙酰化
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> Xaa是HYP
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
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<211> 8
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<213> 人工序列
<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 酰胺化
<400> 54
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1 5
<210> 55
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 酰胺化
<400> 55
Leu Pro Leu Pro Leu Glu Gln Ser
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MOD_RES
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<223> 乙酰化
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 酰胺化
<400> 56
Leu Pro Xaa Pro Leu Asp Gln Ser
1 5
<210> 57
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa是Nle
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 酰胺化
<400> 57
Leu Pro Xaa Pro Leu Asp Gln Thr
1 5
<210> 58
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa是Nle
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 酰胺化
<400> 58
Leu Pro Xaa Pro Val Glu Gln Ser
1 5
<210> 59
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MOD_RES
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa是HYP
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa是Nle
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa是HYP
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 酰胺化
<400> 60
Leu Xaa Xaa Xaa Leu Glu Gln Ser
1 5
<210> 61
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa是HYP
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa是Nle
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa是HYP
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 酰胺化
<400> 61
Leu Xaa Xaa Xaa Val Glu Gln Ser
1 5
<210> 62
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa是DHP
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 酰胺化
<400> 62
Leu Xaa Val Pro Leu Asp Gln Thr
1 5
<210> 63
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa是DHP
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 酰胺化
<400> 63
Leu Pro Val Xaa Leu Asp Gln Thr
1 5
<210> 64
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa是DHP
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa是DHP
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 酰胺化
<400> 64
Leu Xaa Val Xaa Leu Asp Gln Thr
1 5
<210> 65
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa是2PP
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 酰胺化
<400> 65
Leu Xaa Val Pro Leu Asp Gln Thr
1 5
<210> 66
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa是2PP
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 酰胺化
<400> 66
Leu Pro Val Xaa Leu Asp Gln Thr
1 5
<210> 67
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa是HYP
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 酰胺化
<400> 67
Leu Xaa Val Pro Leu Asp Gln Thr
1 5
<210> 68
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa是HYP
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 酰胺化
<400> 68
Leu Pro Val Xaa Leu Asp Gln Thr
1 5
<210> 69
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa是HYP
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa是HYP
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 酰胺化
<400> 69
Leu Xaa Val Xaa Leu Asp Gln Thr
1 5
<210> 70
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 酰胺化
<400> 70
Leu Pro Val Pro Leu Glu Gln Ser
1 5
<210> 71
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> Xaa是MS
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 酰胺化
<400> 71
Leu Pro Val Pro Leu Glu Gln Xaa
1 5
<210> 72
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 酰胺化
<400> 72
Leu Pro Val Pro Val Asp Gln Thr
1 5
<210> 73
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 酰胺化
<400> 73
Leu Pro Val Pro Val Glu Gln Ser
1 5
<210> 74
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 酰胺化
<400> 74
Leu Pro Val Pro Val Asp Gln Ser
1 5
<210> 75
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 酰胺化
<400> 75
Val Pro Val Pro Leu Asp Gln Thr
1 5
<210> 76
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 酰胺化
<400> 76
Leu Pro Leu Pro Leu Asp Gln Ser
1 5
<210> 77
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 酰胺化
<400> 77
Val Pro Leu Pro Leu Asp Gln Ser
1 5
<210> 78
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 酰胺化
<400> 78
Leu Pro Leu Pro Leu Asp Gln Thr
1 5
<210> 79
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa是HYP
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa是HYP
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 酰胺化
<400> 79
Val Xaa Leu Xaa Val Glu Gln Ser
1 5
<210> 80
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 酰胺化
<400> 80
Val Pro Leu Pro Val Glu Gln Ser
1 5
<210> 81
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 酰胺化
<400> 81
Leu Pro Leu Pro Leu Glu Gln Ser
1 5
<210> 82
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa是mV
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 酰胺化
<400> 82
Leu Pro Xaa Pro Leu Asp Gln Ser
1 5
<210> 83
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa是Nle
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 酰胺化
<400> 83
Leu Pro Xaa Pro Leu Asp Gln Thr
1 5
<210> 84
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa是Nle
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 酰胺化
<400> 84
Leu Pro Xaa Pro Val Glu Gln Ser
1 5
<210> 85
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa是Nle
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 酰胺化
<400> 85
Leu Pro Xaa Pro Val Glu Gln Ser
1 5
<210> 86
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa是HYP
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa是Nle
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa是HYP
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 酰胺化
<400> 86
Leu Xaa Xaa Xaa Leu Glu Gln Ser
1 5
<210> 87
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa是HYP
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa是Nle
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa是HYP
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 酰胺化
<400> 87
Leu Xaa Xaa Xaa Val Glu Gln Ser
1 5
<210> 88
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa是DHP
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 酰胺化
<400> 88
Leu Pro Val Xaa Leu Asp Gln Thr
1 5
<210> 89
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa是DHP
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa是DHP
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 酰胺化
<400> 89
Leu Xaa Val Xaa Leu Asp Gln Thr
1 5
<210> 90
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa是2PP
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 酰胺化
<400> 90
Leu Xaa Val Pro Leu Asp Gln Thr
1 5
<210> 91
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa是2PP
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 酰胺化
<400> 91
Leu Pro Val Xaa Leu Asp Gln Thr
1 5
<210> 92
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa是HYP
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 酰胺化
<400> 92
Leu Xaa Val Pro Leu Asp Gln Thr
1 5
<210> 93
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa是HYP
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 酰胺化
<400> 93
Leu Pro Val Xaa Leu Asp Gln Thr
1 5
<210> 94
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa是HYP
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa是HYP
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 酰胺化
<400> 94
Leu Xaa Val Xaa Leu Asp Gln Thr
1 5
<210> 95
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 酰胺化
<400> 95
Leu Pro Val Pro Leu Glu Gln Ser
1 5
<210> 96
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> Xaa是MS
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 酰胺化
<400> 96
Leu Pro Val Pro Leu Glu Gln Xaa
1 5
<210> 97
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 酰胺化
<400> 97
Leu Pro Val Pro Val Asp Gln Thr
1 5
<210> 98
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 酰胺化
<400> 98
Leu Pro Val Pro Val Glu Gln Ser
1 5
<210> 99
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 酰胺化
<400> 99
Leu Pro Val Pro Val Asp Gln Ser
1 5
<210> 100
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 酰胺化
<400> 100
Val Pro Val Pro Leu Asp Gln Thr
1 5
<210> 101
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 酰胺化
<400> 101
Leu Pro Leu Pro Leu Asp Gln Ser
1 5
<210> 102
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 酰胺化
<400> 102
Val Pro Leu Pro Leu Asp Gln Ser
1 5
<210> 103
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 酰胺化
<400> 103
Leu Pro Leu Pro Leu Asp Gln Thr
1 5
<210> 104
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa是NYP
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa是NYP
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 酰胺化
<400> 104
Val Xaa Leu Xaa Val Glu Gln Ser
1 5
<210> 105
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 酰胺化
<400> 105
Val Pro Leu Pro Val Glu Gln Ser
1 5
<210> 106
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 酰胺化
<400> 106
Leu Pro Leu Pro Leu Glu Gln Ser
1 5
<210> 107
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa是mV
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 酰胺化
<400> 107
Leu Pro Xaa Pro Leu Asp Gln Ser
1 5
<210> 108
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa是Nle
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 酰胺化
<400> 108
Leu Pro Xaa Pro Leu Asp Gln Thr
1 5
<210> 109
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa是Nle
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 酰胺化
<400> 109
Leu Pro Xaa Pro Val Glu Gln Ser
1 5
<210> 110
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa是Nle
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 酰胺化
<400> 110
Leu Pro Xaa Pro Val Glu Gln Ser
1 5
<210> 111
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa是HYP
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa是Nle
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa是HYP
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 酰胺化
<400> 111
Leu Xaa Xaa Xaa Leu Glu Gln Ser
1 5
<210> 112
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa是HYP
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa是Nle
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa是HYP
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 酰胺化
<400> 112
Leu Xaa Xaa Xaa Val Glu Gln Ser
1 5
<210> 113
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 酰胺化
<400> 113
Leu Pro Val Pro Leu Asp Gln Thr
1 5
<210> 114
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 酰胺化
<400> 114
Asp Gln Thr Leu Pro Leu Asn Val Asn Pro
1 5 10
<210> 115
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> 酰胺化
<400> 115
Leu Pro Val Pro Leu Asp Gln Thr Leu Pro Leu
1 5 10
<210> 116
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa是L或者具有天然或非天然氨基酸的保守替换物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa 是 P或者具有天然或非天然氨基酸的保守替换物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa是V或者具有天然或非天然氨基酸的保守替换物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa是P或者具有天然或非天然氨基酸的保守替换物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Xaa是L或者具有天然或非天然氨基酸的保守替换物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> Xaa是D或者具有天然或非天然氨基酸的保守替换物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> Xaa是Q或者具有天然或非天然氨基酸的保守替换物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> Xaa是T或者具有天然或非天然氨基酸的保守替换物
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 酰胺化
<400> 116
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5
<210> 117
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa是L、Nle或者V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa是Pro、HYP、2PP或者DHP
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa是V、L、Nle或者mV
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa是Pro、HYP、2PP或者DHP
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Xaa是L、Nle或者V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> Xaa是D或者E
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> Xaa是Q or N
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> Xaa是T、S或者MS
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 酰胺化
<400> 117
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5
<210> 118
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa是L或者具有天然或非天然氨基酸的保守替换物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa是P或者具有天然或非天然氨基酸的保守替换物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa是V或者具有天然或非天然氨基酸的保守替换物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa 是 P或者具有天然或非天然氨基酸的保守替换物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Xaa是L或者具有天然或非天然氨基酸的保守替换物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> Xaa是D或者具有天然或非天然氨基酸的保守替换物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> Xaa是Q或者具有天然或非天然氨基酸的保守替换物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> Xaa是T或者具有天然或非天然氨基酸的保守替换物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> Xaa是T或者具有天然或非天然氨基酸的保守替换物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> Xaa是L或者具有天然或非天然氨基酸的保守替换物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(11)
<223> Xaa是P或者具有天然或非天然氨基酸的保守替换物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)..(12)
<223> Xaa是N或者具有天然或非天然氨基酸的保守替换物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> Xaa是V或者具有天然或非天然氨基酸的保守替换物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (14)..(14)
<223> Xaa是N或者具有天然或非天然氨基酸的保守替换物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (15)..(15)
<223> Xaa是P或者具有天然或非天然氨基酸的保守替换物
<220>
<221> MOD_RES
<222> (15)..(15)
<223> 酰胺化
<400> 118
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10 15
<210> 119
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> (15)..(15)
<223> 酰胺化
<400> 119
Leu Pro Val Pro Leu Asp Gln Thr Leu Pro Leu Asn Val Asn Pro
1 5 10 15
<210> 120
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 酰胺化
<400> 120
Leu Pro Val Pro Leu Asp Gln Thr
1 5
<210> 121
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa是Nle
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 酰胺化
<400> 121
Xaa Pro Val Pro Leu Asp Gln Thr
1 5
<210> 122
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa是Nle
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 酰胺化
<400> 122
Leu Pro Xaa Pro Leu Asp Gln Thr
1 5
<210> 123
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Xaa是Nle
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 酰胺化
<400> 123
Leu Pro Val Pro Xaa Asp Gln Thr
1 5
<210> 124
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 酰胺化
<400> 124
Leu Pro Val Pro Leu Asp Asn Thr
1 5
<210> 125
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 酰胺化
<400> 125
Leu Pro Val Pro Leu Glu Gln Thr
1 5
<210> 126
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 酰胺化
<400> 126
Leu Pro Val Pro Leu Asp Gln Ser
1 5
<210> 127
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 酰胺化
<400> 127
Leu Pro Ile Pro Leu Asp Gln Thr
1 5
<210> 128
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(2)
<223> Xaa是d-Ala
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(12)
<223> Xaa是d-Ala
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> 酰胺化
<400> 128
Xaa Xaa Leu Pro Ile Pro Leu Asp Gln Thr Xaa Xaa
1 5 10
<210> 129
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa是Ahp
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 酰胺化
<400> 129
Leu Pro Xaa Pro Leu Asp Gln Thr
1 5
<210> 130
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 酰胺化
<400> 130
Leu Pro Phe Pro Leu Asp Gln Thr
1 5
<210> 131
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(2)
<223> Xaa是d-Ala
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa是HYP
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Xaa是Nle
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(12)
<223> Xaa是d-Ala
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> 酰胺化
<400> 131
Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Pro Leu Asp Gln Thr Xaa Xaa
1 5 10
<210> 132
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(2)
<223> Xaa是d-Ala
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Xaa是Nle
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> Xaa是HYP
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(12)
<223> Xaa是d-Ala
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> 酰胺化
<400> 132
Xaa Xaa Leu Pro Xaa Xaa Leu Asp Gln Thr Xaa Xaa
1 5 10
<210> 133
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Xaa是Nle
<220>
<221> MOD_RES
<222> (18)..(18)
<223> 酰胺化
<400> 133
Gly Gly Leu Pro Xaa Pro Leu Asp Gln Thr Leu Pro Leu Asn Val Asn
1 5 10 15
Pro Ala
<210> 134
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 酰胺化
<400> 134
Leu Pro Ile Pro Leu Asp Gln Thr
1 5
<210> 135
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa是d-Ala
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa是Nle
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> Xaa是d-Ala
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> 酰胺化
<400> 135
Xaa Leu Pro Xaa Pro Leu Asp Gln Thr Xaa
1 5 10
<210> 136
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa是DHP
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 酰胺化
<400> 136
Leu Xaa Val Pro Leu Asp Gln Thr
1 5
<210> 137
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 酰胺化
<400> 137
Val Pro Val Pro Leu Asp Gln Ser
1 5
<210> 138
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 酰胺化
<400> 138
Gly Gly Leu Pro Ile Pro Leu Asp Gln Thr Leu Pro Leu Asn Val Asn
1 5 10 15
Pro Ala
<210> 139
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa是HYP
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 酰胺化
<400> 139
Leu Xaa Ile Pro Leu Asp Gln Thr
1 5
<210> 140
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> (18)..(18)
<223> 酰胺化
<400> 140
Gly Gly Leu Pro Ile Pro Leu Asp Gln Thr Leu Pro Leu Asn Val Asn
1 5 10 15
Pro Ala
<210> 141
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(2)
<223> Xaa是d-Ala
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(12)
<223> Xaa是d-Ala
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> 酰胺化
<400> 141
Xaa Xaa Leu Pro Leu Pro Leu Asp Gln Thr Xaa Xaa
1 5 10
<210> 142
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(2)
<223> Xaa是d-Ala
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Xaa是Nle
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(12)
<223> Xaa是d-Ala
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> 酰胺化
<400> 142
Xaa Xaa Leu Pro Xaa Pro Leu Asp Gln Thr Xaa Xaa
1 5 10
<210> 143
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ADG 阴性对照肽序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> (18)..(18)
<223> 酰胺化
<400> 143
Ala Asp Gly Gly Leu Leu Leu Leu Asn Asn Pro Pro Pro Pro Gln Thr
1 5 10 15
Val Val
<210> 144
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抑制钠通道活性的肽序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa是d-Ala
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> Xaa是d-Ala
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> 酰胺化
<400> 144
Xaa Leu Pro Ile Pro Leu Glu Gln Ser Xaa
1 5 10

Claims (42)

1.一种包含以下序列的肽或其功能性片段：
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(SEQ ID NO:116)
其中：
X1为亮氨酸或者以天然或非天然氨基酸的保守替换物；
X2为脯氨酸或者以天然或非天然氨基酸的保守替换物；
X3为缬氨酸或者以天然或非天然氨基酸的保守替换物；
X4为脯氨酸或者以天然或非天然氨基酸的保守替换物；
X5为亮氨酸或者以天然或非天然氨基酸的保守替换物；
X6为天冬氨酸或者以天然或非天然氨基酸的保守替换物；
X7为谷氨酰胺或者以天然或非天然氨基酸的保守替换物；并且
X8为苏氨酸或者以天然或非天然氨基酸的保守替换物。
2.一种包含以下序列的肽或其功能性片段：
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12(SEQ ID NO:117)
其中：
X1为亮氨酸、正亮氨酸或缬氨酸；
X2为脯氨酸、4-羟脯氨酸、(2R,5S)-5-苯基-吡咯烷-2-羧酸或3,4-脱氢-L-脯氨酸；
X3为缬氨酸、亮氨酸、正亮氨酸或N-甲基缬氨酸；
X4为脯氨酸、4-羟脯氨酸、(2R,5S)-5-苯基-吡咯烷-2-羧酸或3,4-脱氢-L-脯氨酸；
X5为亮氨酸、正亮氨酸或缬氨酸；
X6为天冬氨酸或谷氨酸；
X7为谷氨酰胺或天冬酰胺；并且
X8为苏氨酸，丝氨酸或L-α-甲基丝氨酸。
3.根据权利要求1或2所述的肽，其包含SEQ ID NO:4至115中任一个序列。
4.一种包含以下序列的肽或其功能性片段：
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15(SEQ ID NO:118)
其中：
X1为亮氨酸或者以天然或非天然氨基酸的保守替换物；
X2为脯氨酸或者以天然或非天然氨基酸的保守替换物；
X3为缬氨酸或者以天然或非天然氨基酸的保守替换物；
X4为脯氨酸或者以天然或非天然氨基酸的保守替换物；
X5为亮氨酸或者以天然或非天然氨基酸的保守替换物；
X6为天冬氨酸或者以天然或非天然氨基酸的保守替换物；
X7为谷氨酰胺或者以天然或非天然氨基酸的保守替换物；
X8为苏氨酸或者以天然或非天然氨基酸的保守替换物；
X9为苏氨酸或者以天然或非天然氨基酸的保守替换物；
X10为亮氨酸或者以天然或非天然氨基酸的保守替换物；
X11为脯氨酸或者以天然或非天然氨基酸的保守替换物；
X12为天冬酰胺或者以天然或非天然氨基酸的保守替换物；
X13为缬氨酸或者以天然或非天然氨基酸的保守替换物；
X14为天冬酰胺或者以天然或非天然氨基酸的保守替换物；并且
X15为脯氨酸或者以天然或非天然氨基酸的保守替换物。
5.根据权利要求4所述的肽，其包含SEQ ID NO:120的序列。
6.一种肽，其包含SEQ ID NO:127或SEQ ID NO:128的序列。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的肽，其中N端是乙酰化的和/或C端是酰胺化的。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的肽，其中所述肽包含至少一个非天然氨基酸或至少一个末端修饰。
9.根据权利要求1至7中任一项所述的肽，其在N端和/或C端还包含至少一个D-丙氨酸。
10.一种试剂盒，其包含权利要求1至9中任一项所述的肽。
11.一种抑制钠通道活化的方法，其包括使钠通道与权利要求1至9中任一项所述的肽接触。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述钠通道是上皮钠通道(ENaC)。
13.根据权利要求11所述的方法，其中所述钠通道存在于分离的细胞中。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述分离的细胞是上皮细胞培养物的一部分。
15.根据权利要求11所述的方法，其中所述钠通道存在于动物的细胞中。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述动物是疾病模型。
17.根据权利要求11所述的方法，其中使所述钠通道与所述肽接触包括将所述肽递送至包含所述钠通道的细胞。
18.根据权利要求11所述的方法，其中所述钠通道的活化被抑制至少20％。
19.根据权利要求11所述的方法，其中所述钠通道的活化被抑制至少50％。
20.根据权利要求11所述的方法，其中所述钠通道的活化被抑制至少90％。
21.一种通过钠通道抑制钠吸收的方法，其包括使所述钠通道与权利要求1至9中任一项所述的肽接触。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述钠通道为ENaC。
23.一种增加内衬于上皮黏膜表面的流体的体积的方法，其包括使所述上皮黏膜表面上存在的钠通道与权利要求1至9中任一项所述的肽接触。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述钠通道为ENaC。
25.一种降低细胞表面上存在的钠通道的水平的方法，其包括使所述钠通道与权利要求1至9中任一项所述的肽接触。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述钠通道为ENaC。
27.一种在有需要的对象中治疗响应于抑制跨上皮黏膜表面的钠吸收的病症的方法，其包括向所述对象递送治疗有效量的权利要求1至9中任一项所述的肽。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述钠通道为ENaC。
29.根据权利要求27所述的方法，其中所述病症为肺病。
30.根据权利要求27所述的方法，其中所述肺病为囊性纤维化。
31.根据权利要求27所述的方法，其中所述肺病是非囊性纤维化性支气管扩张。
32.根据权利要求27所述的方法，其中所述肺病为慢性阻塞性肺病。
33.根据权利要求27所述的方法，其中所述肺病为急性或慢性支气管炎。
34.根据权利要求27所述的方法，其中所述肺病为哮喘。
35.根据权利要求27所述的方法，其中所述病症为胃肠病。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述胃肠病为炎性肠病。
37.根据权利要求27所述的方法，其中所述病症为肾病。
38.一种在有需要的对象中调节盐平衡、血量和/或血压的方法，其包括向所述对象递送治疗有效量的权利要求1至9中任一项所述的肽。
39.根据权利要求27所述的方法，其中递送所述肽降低所述对象中的细胞的表面上存在的钠通道的水平。
40.一种用于在有需要的对象中治疗肺病、胃肠病、肾病或心血管病的症状的方法，其包括向所述对象施用治疗有效量的权利要求1至9中任一项所述的肽。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述肺病为囊性纤维化、非囊性纤维化性支气管扩张、慢性阻塞性肺病、急性或慢性支气管炎、或哮喘。
42.根据权利要求40所述的方法，其中所述胃肠病为炎性肠病。
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