JPH01172344A - エンケファリナーゼ含有医薬製剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野コ 本発明は、様々な内因性ペプチドに関連した病理学的状
況の治療に関するものである。さらに詳しくは、本発明
は、そのような治療に用いられる、エンケファリナーゼ
（Ｅ、　Ｃ，３，４，２４，１１）および新規な形状の
該物質を含有する医薬組成物に関するものである。

種々の生理学的な系において活性と思われる様々な内因
性ペプチドが発見された。例えば、エンケファリン類と
称される２つのペンタペプチドが脳から抽出された。エ
ンケファリンの作用には、鎮痛、熱調節、精神安定、胃
腸機能、および食欲増進が含まれる。本発明がなされる
までは、中枢神経系でのエンケファリンの開裂かエンケ
ファリナーゼの唯一の生理活性であると考えられており
（シュワルツ、Ｊ、Ｃ，ら、トウレンズ・ファーマコロ
ンカル・サイエンス、６：４７２−４７６［１９８５］
）、今日まで、エンケファリナーゼがなんらかの病理学
的な異常に関連していることは知られていなかった。そ
の活性の結果として痛みが増加されるので、科学的な研
究はエンケファリナーゼ活性を阻害することに向けられ
ていた。本発明は、明めてエンケファリナーゼを治療に
用いることを達成したちのである。

他の内因性ペプチドであるアンキオテンシン■は、腎性
高血圧の病理学的状況における病因性物質であると考え
られている。ブラジキニンおよびノノリ／ンは、火傷、
リウマチ様関節炎、ｔ７腫、カルン／イド症（侯Ｒ１膵
炎、偏頭痛、血漿製剤にょる輸注後の反応、アレルギー
性疾患、内毒素ショノり、およびアナフィラキシ−ショ
ック等に関連する急性炎症の如き他の病理学的症状に関
連していた。

その池の内因性ペプチドとしては、幾つかの同じ生理活
性を共有するタキキニン類がある。タキキニン類には、
サブスタンスＰ１エレドイシン、ノイロキニンＡおよび
Ｂ１フイサレミンおよびカシニンが含まれる。サブスタ
ンスＰは、平滑筋の収縮、神経伝達、傷み、咳、外分泌
、血管拡張、血管の透過性増加、細動脈へのリンパ球の
付着の増加、多形核白血球、マクロファージおよびＴＩ
Ｊンバ球刺激作用、およびマスト細胞の脱顆粒に関連し
ていることが分かっている。ボンベシン等の内因性ペプ
チドは、正常な肺の内分泌細胞に存在していることが見
出され（クララら、エクスプリエンノア、３７：７６５
−７６７［１９８１］）、カルシノイド腫瘍から放出さ
れ、皮膚潮紅、下痢、および気管支収縮と関連している
ことが示唆された。

ボンベシンは気道の上皮細胞（ウィリーら、Ｅｘｐ、Ｃ
ｅ１ｌ　　Ｒｅｓ、　、１５３：２４５−２４８［１９
８４］、およびヒト小細胞肺癌（クチツタ　Ｉ”、ら、
ネイチュアー、３１６：８２３−８２６［１９８５］）
の成長因子として機能する。サブスタンスＰとボンベシ
ンは、それらの腫瘍に関連した作用とは別に、肺動脈お
よび気道を収縮させることが分かった。本発明の観察に
よると、これらの内因性ペプチドは気管支喘息および低
酸素性肺血管収縮症等の様々な病理学的な状態を媒介す
ると思われる。

幾つかのペプチドは、好酸球走化性因子、Ｃ’ａおよび
サブスタンスＰの如く化学走性である。それらは炎症部
位で生成され、好中球等の様々な免疫細胞を該部位に誘
引する。最後に、コレシストキニン、ソマトスフチン、
オキシドノン、およびカエルリン等の他のペプチドは、
他の病理学的疾患を発現し得る様々な組織に強い影響力
を有することが分かった。

エンケファリナーゼは、これまでに、腎臓（ケール、Ｍ
、　　Ａ、およびケニー、Ａ、　　Ｊ、　、バイオケミ
カル・ジャーナル、１３７：４７７−４８８［１９７４
］、ガラフォード、Ｊ、ら、バイオケミストリー、２２
：３２６５−３２７１［１９８，３］およびメルフロイ
、Ｂ、およびシュワルツ、Ｊ、Ｃ，、ライフ・サイエン
ス３１：１７４５−’１７４８［１９８２］、腸（ダニ
ールセン、Ｅ、Ｍ、　　ら、バイオケミカル・ジャーナ
ル、１９１：５４５−５４８［１９８０１）、脳下垂体
（オーロウスキー、Ｍ、およびウイルク、Ｓ３、バイオ
ケミストリー、２０：４９４２−４９４５［１９８１］
）、脳（ジルトン、Ｊ、Ｍ、ら、バイオケミカル・ジャ
ーナル、２１５ニア５５−７６２［１９８３］およびリ
ンパ節（ボウズ、Ｍ、　　Ａ、およびケニー、Ａ、　　
Ｊ、バイオケミカル・ジャーナル、２３６：８０１−８
１０［１９８６］から精製された。エンケファリナーゼ
は、多くの末梢器官（ロレンス、Ｃ３およびシュバルズ
。

Ｊ、Ｃ，、ヨーロピアン・ジャーナル・オフ・ファーマ
コロジー、６９：１１３−１１６［１９８１］）および
ヒト好中球（コネリー、Ｊ、Ｃ，ら、プロシーデインゲ
ス・オフ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オフ・サイエ
ンス［ＵＳＡ］８２：８７３７−８７４１［１９８５］
）に検出されている。脳におけるエンケファリナーゼの
分布は、エンケファリンの脳における分布と密接な並行
関係にある（ロレンス、Ｃ１ら、ジャーナル・オフ・二
ニーロケミスドリー、３９：１０８１−＋０８９［１９
８２］）。本発明の観察によって、エンケファリナーゼ
が、内因性ペプチド類に関連している末梢組織および細
胞にも存在していることが確立された。エンケファリナ
ーゼは、サブユニット分子ｆｆｉ（Ｍｒ）が８７０００
−９４０００の膜結合性糖タグバク質である。Ｍｒ値の
変化はグリコジル化の程度およびパターンに帰される。

エンケファリナーゼの基質特異性はラット腎臓およびヒ
ト腎臓由来の酵素を用いて研究された［ワルツロイ、Ｂ
、およびンユワルツ、Ｊ、Ｃ，、ジャーナル・オフ゛・
ザ・ハイオロシオカル・ケミストリー、２５９：１４３
６５−１４３７０（１９８４）、カッフォードら、バイ
オケミストリー、２２：３２６５−３２７１（１９８３
）；およびポズガイ１Ｍ。

ら、バイオケミストリー、２２：Ｉ２９２−１２９９（
１９８６）］。これらの研究は、エンケファリナーゼが
疎水性残基のアミノ基からなるペプチド結合を優先的に
加水分解し、かつ短いペプチドに顕著な優先性を示すこ
と、特に、ジペプチジルカルボキシペプチダーゼとして
作用してカルボキシ末端のジペプチドを放出する場合に
最も有効であることを示唆している。脳シナプス膜に見
出されたエンケファリナーゼは、エンケファリンのＧＩ
ｙ３−Ｐｈｅ’アミドを効率的に開裂する（ワルツロイ
。

Ｂ、ら、ネイチャー（ロンドン）、２７６：５２３−５
２６［１９７８］）。エンケファリナーゼはへブタペプ
チド（Ｍｅｔ５）エンケファリン−Ａｒｇ”ＰｂＯ２（
シュワルズ、Ｊ、Ｃ，ら、プロシーデインゲス・インタ
ーナショナル・ユニオン・サブ・ファーマコロジー、第
９回コンブレス・オフ慟ファーマコロジー、３：ミッチ
ェルら編、２７７−２８３、マツラミラン・プレスＬＴ
Ｄ、　、ロンドン［１９８４］、並びにコレシストキニ
ン（ズッツェル、Ｋ。

Ａ、ら、ニューロサイエンス、１５：１４９−１５８［
１９８５］）、サブスタンスＰ（ホーセムケ。

Ｂ、ら、バイオケミカル・バイオフィジカル・リサーチ
・コミュニケーション、１２５＋７２８−７３３［１９
８４］）、二二一口テンシン（チエクラ−ら、１９８３
）、アンギオテンシン■およびＩｌ（マドサスら、バイ
オケミカル・ジャーナル、２２３：４３３［１９８４］
およびガラフォードら、バイオケミストリー、２２：３
２６５［１９８３］）、キニン類、例えばブラジキニン
（ガラフォード、Ｊ。

Ｔ、ら、バイオケミストリー、２２：３２６５−３２７
　］［］　９８３］）、オキントシン（ジョンシンら、
１９８４）、およびソマトスタチン（マムフォード、Ｒ
，Ａ、　　ら、プロシーデインゲス・サブ・ザ・す／：
ｌＩナル・アカデミ−・サブ・サイエンス［ＵＳＡ］７
８：６６２３−６６２７［１９８１１）等の様々な神経
ペプチドをも開裂することが見出されている。エンケフ
ァリナーゼはインビトロで様々な生物学的ペプチドを加
水分解することができル（ケニー、Ａ、　　Ｊｌ、トレ
ンズ・イン・バイオケミカル・サイエンス、Ｉ　１：４
０−４２［１９８６］）が、インビボでは今日まで、エ
ンケファリナーゼは、脳内で放出された場合に内因性の
エンケファリンを加水分解することが示唆されていたに
すぎない（シュワルツ、Ｊ、Ｃ，ら、ライフ・サイエン
ス、２９：ｌ７１５−１７４０［１９８１］およびレコ
ムテ、Ｊ、Ｍ、　　ら、Ｊ　、　　Ｐ　ｈａｒｍａｃｏ
ｌ、　　Ｅ　Ｘｐ。

Ｔｈｅｒ、　　、　２３７：９３７−９４４［１９８６
コ）。

通常、エンケファリナーゼの血中濃度は極めて低いが（
コネリーら、前掲）、成人性呼吸困難症候群の患者の血
清中には高レベルで存在していることが見出された（コ
ネリーら、前掲）。エンケファリナーゼは、走化性トリ
ペプチドｆＭｅｔ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｐ　ｈｅを開裂する
（同様）。また、喫煙供給者の好中球は、非喫煙供給者
のそれの約２倍のエンケファリナーゼ活性を有すること
が認められた（同様）。エンケファリナーゼは、ヒト胎
盤の微絨毛にも高レベルで見出されている（ジョンソン
、Ａ、　　Ｒ，ら、ペプチド、５ニア８９−７９６［１
９８４コ）。

本発明は、エンケファリナーゼの特異的な阻害物質であ
るチオルファン、ロイシンチオルファンおよびホスホラ
ミトンが、サブスタンスＰ等のタキキニン類、およびブ
ラジキニン等のキニン類によって誘発される気道粘液の
分泌および平滑筋収縮を強化するという新規な知見に基
づくものである。また本発明は、インビボにおいてエン
ケファリナーゼがサブスタンスＰで誘発される面前透過
性の増加を阻害するという新規な知見にも基づくもので
ある。エンケファリナーゼはサブスタンスＰを、粘液分
泌および／または平滑筋収縮の刺激作用において無効で
あると認められた２つのフラグメントに開裂することが
知られている。また、本発明は、エンケファリナーゼが
走化性分子を消化することにより、損傷部への様々な炎
症性細胞（好中球を含む）の誘引を阻止し得るという知
見によるものである。

本発明は、内因性ペプチドか関連していると思われる種
々の病理学的症状の治療のための医薬組成物を提供する
ことを目的とするものである。特ニ本発明は、サブスタ
ンスＰまたは池の神経系ペプチドの逆効果を克服するた
めにエンケファリナーゼを治療剤として用いることに関
する。さらに詳しくは、本発明は、例えば喘息、慢性気
管支炎、嚢胞性繊維症、およびウィルス感染症等の様々
な疾患の結果としての、気道でのペプチド媒介性粘液分
泌および気管支収縮を軽減するためにエンケファリナー
ゼを用いることに関するものである。

また、エンケファリナーゼは、カルシノイド腫や肺の小
細胞癌の如き種々の腫瘍の治療にも治療剤として、さら
にまた、ある種の内因性ペプチドによって媒介される様
々な病理学的疾患の治療剤としてエンケファリナーゼ誘
導体を用いることを目的とするものである。その他のペ
プチド誘発性疾患は胃腸、視覚系、尿路系、循環系、生
殖系、および結合系に起こり得る。ある種の内因性ペプ
チドによる様々な病理学的疾患の治療に、細胞質および
／またはトランスメンブランが欠失または置換されてい
るエンケファリナーゼを用いることができる。

［発明の要約］ 本発明は、サブスタンスＰおよび池のタキキニン類、お
よび／またはブラジキニン等の内因性ペプチドの、気道
内での粘液骨ｌ必や平滑筋収縮における作用がエンケフ
ァリナーゼに特異的な阻害物質によって強化されるとい
う新規な知見に基づくものである。本発明は、様々な内
因性ペプチドによって媒介されるある種の病理学的疾患
、例えば気管支収縮、気道の分泌過剰、急性炎症または
高度免疫反応、咳、不妊または癌の治療のために投与さ
れる、エンケファリナーゼまたはその誘導体を含有する
治療用組成物に関するものである。

［図面の簡単な記述］ 第１図：３５Ｓｏ、で標識した高分子（硫酸塩フラック
ス）の放出によって測定した、サブスタンスＰ（ＳＰ）
誘導性分泌の濃度依存性（平均値±ＳＥ）を示すグラフ
。６頭のフエレット獣から得た組織を指示濃度のＳＰと
一緒にインキュベートシ、各組織について硫酸塩フラッ
クス（流速）の変化を、ＳＰを加える直前に採取した標
本についての結合ＳＯ４のフラックスをＳＰ不添加１５
分後または３０分後に採取した標本の結６ｓｏ４のフラ
ックスから差し引いてくいずれが大きくとも）算出した
。ＳＰ添加１５分間の基準（ベースライン）分泌（Ｂ）
の平均の変化を比較のために示した（Ｂ）。ＳＰは３５
３０標識高分子の放出を用量依存性に刺激した。

第２図：１頭のフエレット獣由来の２セグメントからの
硫酸塩フラックスに対するサブスタンスＰのフラグメン
トの影響を示すグラフ。チャンバー内で組織と３５ｓｏ
、を発光面側でインキュベートし、３時間後、ＳＰフラ
グメントをチャンバーの粘膜上組織側に添加した。左：
Ｃ末端フラグメント、５Ｐ６−１１（１０−５Ｍ）刺激
下の分泌。右・Ｎ末端フラグメント、Ｓ　Ｐ　ｌ−９（
ｌ　Ｏ−５Ｍ）は分泌に有意な影響を及ぼさなかった。

第３図−１頭のフエレット獣由来の１組織からの硫酸塩
フラックスにおけるサブスタンスＰ（ＳＰ）誘導性変化
に対するプロテイナーゼ阻害物質の影響を示すグラフ。

左；対照組織、３５ｓｏ、と−緒にインキュベートされ
、５Ｐ（１０−’Ｍ）に暴露されたもの。右：テキスト
に記載の９種類のプロテイナーゼ阻害物質からなる混合
物（９１ＮＨＩＢ）が、５Ｐ（１０−りに対する分泌応
答を増強した。

第４図：フエレット獣気管由来の組織からの硫酸塩フラ
ックス（平均値±ＳＥ）におけるサブスタンスＰ誘導変
化に対するブロテイナーセ阻害物質の影響を示すグラフ
である。空白の棒：各１ＦＴからの対照組織における５
Ｐ（Ｉ　Ｏ−８Ｍ）に対する応答。

斜線を引いた棒：９プロテイナーゼ阻害物質（９１ＮＩ
ｒｒＢ、１０μｇ／ｘの、ホスホラミトン（１０−’Ｍ
、Ｐ［（Ｏ３Ｐ）、チオルア　７７（ｌ　Ｏ−’ＭＡＴ
Ｈ［ＯＲ）、カプトプリル（ＩＯ−４Ｍ；ＣΔＰ１ゞＯ
）、テブロチド（１０−’Ｍ；ＴＥＰＲＯ）、またはロ
イペプチン、アブロトニン、バシトラシン、ウシ血清ア
ルブミン（各阻害物質について、ＩＯμｇ／ｍの、ある
いはベスタチン（１０−５Ｍ）等の他の阻害物質（ＯＴ
ｌｌＥＲＳ）で予備処理された組織中での５ｐｔｏ−６
にχ・ｌする応答を示す。＊：ｐ＜Ｑ、０５゜ホスホラ
ミトンおよびチオルファン（エンケファリナーセ阻害物
質）のみがＳ　＋）の分泌促進剤効果を増強した。

第５図：６頭のフエレット獣由来の気管セグメントから
のサブスタンスＰ誘導硫酸塩フラックス（平均値±ＳＥ
）に対するエンケファリナーゼ阻害物質チオルファンの
濃度増加の影響を示すグラフである。塗り潰された棒：
薬物添加前１５分間の硫酸塩フラックスの増加。点描を
付した棒：指示した濃度のチオルファンの添加後におけ
る硫酸塩フラックスの増加。斜線を付した棒：５Ｐ（１
０−’Ｍ誘誘導硫酸塩フラックス増加。＊：ｐ＜０．　
０５；硫酸塩フラツクスの突発性の増加との比較；ｎ＝
６゜＊＊：ｐ＜０．０５；対照組織でのＳＰに対する応
答の比較；ｎ−６゜チオルファンは用量依存的に、分泌
におけるＳＰ誘導作用を増強した。

第６図：フエレット獣気管からの”ｓｏ、標識高分子の
放出におけるタキキニンおよびエンケファリナーゼ阻害
物質、ホスホラミトンの影響を示すグラフである。塗り
潰した棒：薬物非存在下、１５分間のベースライン期間
（ＢＬ）中の硫酸塩フラックスの変化を示すグラフであ
る。空白の捧；タキキニン、サブスタンスｐ（ｓｐ）、
ノイロキニンＡ（ＮＫ−Ａ）、ノイロキニンＢ（ＮＫ−
Ｂ）、フィサレミン（ＰＨＹＳ）、エレドイシン（ＥＬ
ＥＤ）、およびカッシニン（ＫΔ５Ｓ）（各薬物、Ｉ　
Ｏ−５Ｍ）に対する応答。斜線を付した棒；ホスホラミ
トン（１０−５Ｍ）によって組織を予備処理した後のタ
キキニンに対する応答。＊ｐ＜０．０５；ベースライン
との比較。＊＊；ｐ（Ｑ。

０５；ホスホラミトン非存在下における同じタキキニン
に対する応答。ホスホラミトンは、各タキキニンの分泌
促進剤作用を増強した。

第７図ニトリプシンの、３頭のフエレソト獣におけるエ
ンケファリナーゼ活性およびサブスタ゛ンスＰ誘導粘液
分泌に対する影響を示すグラフである。左：（３Ｈ−Ｔ
ｙｒ’、Ｄ　Ａ　Ｉａ’、　Ｌｅｕ５）エンケファリン
の分解として表した、肺ホモジネートにおけるエンケフ
ァリナーゼ活性。右：塗り潰した棒：薬物非存在下、１
５分間のベースライン期間における粘液分〜・の変化。

空白の棒：サブスタンスＰに対する応答。点描を付した
俸ニトリプシン添加後の粘液分泌の変化。斜線を付した
棒ニトリプシンで予備処理された組織でのＳＰ誘導粘液
分泌の変化。データーは平均値±ＳＥＭで表されている
。トリプシンはエンケファリナーゼ活性を減少させ、サ
ブスタンスＰ誘導分泌を増強した。

第８図：フエレット獣気管の平滑筋から単離されたセグ
メントにおける活性張力に対するサブスタンスｐ（ｓｐ
）およびエンケファリナーゼ阻害物質、ロイーチオルフ
ァンの影響を示すグラフである。結果は、１２頭のフエ
レット獣（ＳＰ≦１０−６Ｍ）または６頭のフエレフト
獣（ＳＰ≧５　Ｘ　１０−’Ｍ）の平均値±ＳＥＸで表
されている。対応する対照値との有意差異は、＊−ｐ＜
０．０５、＊＊−ｐ＜Ｑ、０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００
１で示されている。サブスタンスＰｌｉ独（空白の四角
）では張力が増大されたが、それはただ、５Ｘ１０−’
Ｍおよびそれ以上の場合のみである。ロイーチオルファ
ン（塗り潰した菱形）は用量依存曲線を描いてＳＰａ度
を減少させた。

第９図、フェレット獣の気管平滑筋から単離したセグメ
ントにおいて、エンケファリナーゼ阻害物質ロイーチオ
ルファン（１０−５Ｍ）の存在下、サブスタンスＰ（１
０−’Ｍ）によって産生される活性な張力に対する、レ
セプターアンタゴニストの影響を示すグラフである。各
ポイントは、対応するＳＰ十ロイーチオルファンに対す
るコントロール応答と、各アンタゴニストによって産生
された張力減少とを比較し、平均値±ＳＥで表されてい
る。対照値との有意差は、＊−ｐ＜０．０５、＊＊＊＝
ｐ＜０．０１で示される。

ムスカリンアンタゴニストであるアトロピン（Ｉ　Ｏ−
５Ｍ）、ＳＰアンタゴニストである（Ｄ　Ｐ　ｒｏ！、
　Ｄ　Ｔ　ｒｐ７”）、　Ｓ　Ｐ（１０−５Ｍ）および
両薬物の混合物はｓｐ＋ロイーチオルファン誘導収縮を
有意に減少させた。

ＳＰアンタゴニストはアトロビンよりも大きイ効果を示
した。

第１０図；フエレット獣の気管平滑筋から単離したセグ
メントにおいて、電場刺ｆｆ１（５Ｈ２）によって産生
される活性な張力に対するサブスタンスＰ十エンケファ
リナーゼ阻害物質ロイーチオルファンの影響を示すグラ
フである。データーは、薬物添加のない場合における電
場刺激への対照応答に対する割合パーセントで表されて
おり、平均値±ＳＥ（１０−５Ｍにおいてｎ−１Ｏｌｌ
　０−’Ｍにおいてｎ−４）として示されている。ＳＰ
単独またはｓ　ｐ＋ｏイーチオルファンとの有意差は、
＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＊＝ｐ＜０．００１で示されて
いる。サブスタンスＰ単独の場合は電場刺激に対して収
縮応答を起こすと主張されていたが、この主張はロイー
チオルファンによって増強された。

第１１図：フェレット獣の気管平滑筋から単離したセグ
メントにおいて、電場刺激（５Ｈ２）によって産生され
る活性な張力に対するエンケファリナーゼ阻害物質ロイ
ーチオルファン及びサブスタンスＰアンタゴニスト、（
Ｄ　Ｐ　ｒｏ”、　Ｄ　Ｔ　ｒｐ”　″）　Ｓ　Ｐの影
響を示すグラフである。データーは、薬物添加のない場
合における電場刺激への対照応答に対する割合パーセン
トで表されており、平均値上５Ｅ（ｎ＝５）として示さ
れている。対照値との有意差は、＊　＊　＊　−ｐ＜０
．０１で示されている。ロイーチオルファンは電場刺激
に対して収縮応答を起こすと主張されていたが、この主
張はＳＰアンタゴニスト（１０−’Ｍ）によって阻害さ
れた。

第１２図：フェレット獣気管平滑筋から単離したセグメ
ントにおける活性な張力に対するサブスタンスｐ（ｓｐ
）（三角）、ノイロキニンＡ（ＮＫ〜Δ）（円）、ノイ
ロキニンＢ（ＮＫ−ＢＸ四角）、およびエンケファリナ
ーゼ阻害物質、ロイーチオルファンの影響を示すグラフ
である。データーは、アセチルコリン（１０−’Ｍ）へ
の応答に対する割合パーセントで示されている。結果は
、１０頭のフェレット獣（１０−＠Ｍ）および５頭のフ
ェレット獣（１０−５Ｍ）の平均値±ＳＥで表されてい
る。各タキキニンについて、ロイーチオルファン（１０
−５Ｍ）の存在および非存在下における収縮の相違は有
意であった。ロイーチオルファン（塗り潰された印）は
濃度減少に向けて、用量依存性曲線へのシフトをもたら
した。ロイーチオルファンの非存在下においては、ＮＫ
−Ａの方がＮＫ−Ｂよりも強力であるが、ロイーチオル
ファン（１０−５Ｍ）のび右下においてはＮＫ−ＡとＮ
Ｋ−Ｂとの間に収縮の有意差を認めない。

第１３図：フエレット獣の気管平滑筋から単離したセグ
メントにおける、サブスタンスｐ（ｓｐ）、ノイロキニ
ンＡ（ＮＫ−Ａ）、ノイロキニンＢ　（Ｎ　Ｋ　−Ｂ）
誘導活性張力に対するエンケファリナーゼ阻害物質、ロ
イーチオルファンの収縮増加作用を示すグラフである。

データーはアセチルコリン（１０〜３　Ｍ　）への応答
に対する割合パーセントとして表されており、平均値上
ＳＥ（ｔｏ−５Ｍにおいてｎ＝５．３Ｘ１０−’Ｍにお
いてｎ＝３）で示されている。ロイーチオルファンは、
用量依存的に、各タキキニンによって誘導される収縮を
増強した。

第１４図：フェレット獣の気管平滑筋から単離したセグ
メントにおいて電場刺激下（５Ｈ２）に産生される活性
な張力に対するサブスタンスｐ（ｓｐ）、ノイロキニン
Ａ（ＮＫ−Ａ）およびノイロキニンＢ（ＮＫ−Ｂ）、並
びにタキキニンレセブターのアンタゴニストである（Ｄ
　Ｐｒｏ”、　ＤＴｒｐ”’）Ｓ　Ｐの影響を示すグラ
フである。データーは薬物添加なしに電場刺激への応答
に対する割合パーセントとして表されている。各タキキ
ニンは電場誘導収縮を増強した。ＳＰは最も強力な効果
を有していた。タキキニンレセブターアンタゴニストに
よってこの強化作用は阻害された。

第１５図：フェレット獣の気管平滑筋から単離したセグ
メントの活性な張ノ１に対するブラジキニン（Δ）また
はりスープラジキニン（Ｂ）およびエンケファリナーゼ
阻害物質ロイーチオルファン（ＩＣ）”Ｍ）の収縮増加
作用を示すグラフである。データーはアセチルコリン（
ｌ　Ｏ−３Ｍ）への応答に対スル割合パーセントとして
表されている。結果は平均値±ＳＥで示されている。ロ
イーチオルファンの存在下および非存在下での収縮にお
ける有意差は、＊−ｐ＜Ｑ、０５で示される。ブラジキ
ニンおよびリス−ブラジキニンは用−ｍ　（１＜存的に
活性張力を増強した。ロイーチオルファンは両用量依ａ
曲線を濃度減少に向けてシフトさせた。

第１６図：フエレフト獣の回腸平滑筋から単離した縦方
向セグメントにおける活性張力に対するサブスタンスＩ
〕およびエンケファリナーゼ阻害物質ロイーチオルファ
ン（１０−５Ｍ）の収縮増強作用を示すグラフである。

サブスタンスＰ単独（空白の円）では用量依存的に収縮
が増加された。エンケファリナーゼ阻害物質ロイーチオ
ルファン（塗り漬した円）はサブスタンスＰ誘導収縮を
増強した。

第１７ａ図および１’　７　ｂ図：第１７ａおよび１７
ｂ図は、以後、第１７図として表す。これらは、ラフト
エンケファリナーゼのアミノ酸の配列式を示ス模式図で
ある。

第１８ａ図および１８ｂ図：第１８ａおよび１８ｂ図は
、以後、第１８図として表す。これらは、ヒトエンケフ
ァリナーゼのアミノ酸の配列式を示す模式図である。

［詳しい記述］ エンケファリナーゼは疎水性残基からなるアミノ基を優
先的に切断し、特に、短いペプチドに著しい優先作用を
示す。エンケファリナーゼを病理学的疾患の治療剤とし
ての用途は、サブスタンスＰやブラジキニンの如き内因
性ペプチドの遊離に対する気道の応答、およびその毛細
管透過性への影響を例として行った本発明の観察によっ
て確立された。エンケファリナーゼは中性のエンドペプ
チダーゼ、または腎臓刷子縁中性ブロテイナーゼ（酵素
委員会提唱の命名法によるＥ、　Ｃ，３，４，２４，１
１）としても知られており、その誘導体は様々な病理学
的症状の治療における治療剤として用いられる。

実験の詳細を以下に記載する。

エンケファリン、アンギオテンシンＩおよび■、コレシ
ストキニン、タキキニン類、例えばサブスタンスＰ１ノ
イロキニンＡおよびＢ１フィサレミン、エレドイシン、
カシニン、キニンＬ　例、ｔばブラジキニン、リス−ブ
ラジキニン（カリジン）、他のペプチド、例えばノイロ
テンシン、オキシトシン、ソマトスタチン、ボンベシン
および走化性因子、例えば好酸球走化性因子等の内因性
ペプチドが様々な生理学的および病理学的症状に関連し
ていると示唆されている。作用は、例えば、カルシノイ
ド腫からのサブスタンスＰ１ブラジキニンおよびボンベ
シン遊離に起因する皮膚潮紅、毛細血管拡張、下痢およ
び気管支収縮等である。

循環性アンギオテンシンＩはアンギオテンシン転換酵素
（ＡＣＥ）によって強力な血管収縮物質であるアンギオ
テンシンＨに転換される。現行の全身性高血圧の治療法
には、ＡＣＥの阻害によるアンギオテンシンＩのアンギ
オテンシン■への転換阻止が含まれる。ＡＣＥ阻害物質
による副作用である咳は、咳誘発性ペプチド（例、ブラ
ジキニン）の分解が阻止されることによるとされている
。エンケファリナーゼはアンギオテンシンＩおよびアン
ギオテンシン■を分解するので、抗高血圧治療剤として
役立ち得る。エンケファリナーゼはブラジキニンのよう
な咳発現性ペプチドを開裂することにより、高血圧治療
における副作用を解消し得る。他の病理学的症状は、例
えばアレルゲンによる気道上皮の刺激に伴う、タキキニ
ン媒介性の気管の粘膜下分泌腺からの粘液分泌の過剰で
ある。

粘液分泌に加えて、炎症、毛細血管の透過性増加、好中
球の走化性、浮腫、および気管平滑筋の収縮（気管支収
縮）等が起き易い。皮膚においては、高レベルのタキキ
ニン類またはキニン類が痛み、刺激、発赤および熱、並
びにはう疹を含む、皮膚炎と称される広範な症状を余病
としてもたらす。胃腸系および尿路系で放出されるタキ
キニンは、遊離に際し、例えば耳下腺からの唾液の如く
、回腸および食道の平滑筋の収縮、排尿回数への影響、
空腸からの水および電解質の分泌刺激、および膵臓外分
泌刺激をもたらす。タキキニンはまた、胚子の着床を促
進する。

本明細書に記載の」二記のデーターから、気道内のエン
ケファリナーゼがサブスタンスＰおよび他の内因性ペプ
チドを分解して不活性な代謝産物にすることが確立され
た。この不活化により、内因性ペプチドの粘液分泌およ
び気管支収縮作用か緩和される。このことは、エンケフ
ァリナーゼ′の特異的な阻害物質であるチオルファンお
よびホスホラドミンが濃度依存的にサブスタンスＰその
他のペプチドに対する分泌および収縮応答を増強すると
いう観察結果に基づくものである。エンケファリナーゼ
阻害物質は、粘液分泌および筋肉収縮にはなんら直接的
な作用を有さない。粘液分泌におけるエンケファリナー
ゼ阻害物質および外因性タキキニンの作用は、気管組織
の粘膜下表面への投与の際に認められた。他の酵素系の
阻害物質は内因性ペプチド誘導分泌を変化させなかった
。例えば、アンギオテンシン転換酵素（ＡＣＥ）は、肺
に存在し、サブスタンスＰを分解することが分かってい
る。しかしながら、ＡＣＥの特異的阻害物質はサブスタ
ンスＰ誘導性の分泌および気管支収縮を増強しなかった
。同様に、様々な細胞（好中球および肥満細胞ヰ含む）
から分泌されるプロテアーゼであるセリンプロテアーゼ
の阻害物質もサブスタンスＰ媒介性の気管組織からの粘
液分泌を促進しなかった。ロイーチオルファンは、サブ
スタンスＰ誘導性回腸組織の平滑筋収縮を増強すること
が認められ、胃腸（回腸）組織に存在するエンケファリ
ナーゼがサブスタンスＰ誘導性の効果を阻止することが
示唆された。エンケファリナーゼ阻害物質、ロイーチオ
ルファンはまた、ブラジキニンおよびカリジン（リス−
ブラジキニン）で誘導される呼吸器組織の平滑筋収縮を
阻害することが認められた。このことは、内因性エンケ
ファリナーゼがタキキニンと同様、キニンをも不活化す
ることを示すものである。このように、エンケファリナ
ーゼは内因性ペプチドを介する粘液分泌および／または
気道の平滑筋収縮に調節作用を有するように思われる。

エンケファリナーゼの静注により、ラットでのサブスタ
ンスＰ誘導−染料溢出が阻止されることが認められた。

このことは、身体に投与されたエンケファリナーゼがペ
プチド誘導性の作用を阻止し得ることの直接的な証拠を
与えるものである。エンケファリナーゼまたはその誘導
体のエアゾル投与は、気管への局所治療剤として利用し
得る。

本明細書においては、エンケファリナーゼまたはエンケ
ファリナーゼ誘導体とは、酵素的に活性であるか、また
は酵素的に活性なエンケファリナーゼと免疫学的に交差
反応し得るタンパク質を指すものとする。酵素的に機能
性を有するエンケファリナーゼは、ロレンスら（１９８
２）記載のアッセイにおいて、’Ｈ−（Ｄ　Ａ　ｌａ”
、　ＬｅｕリエンケファリンのＧｌｙ３−Ｐｈｅ’アミ
ド結合を開裂し得る。

エンケファリナーゼまたはエンケファリナーゼ誘導体は
、例えばワルツロイおよびシュワルツ、ジャーナル・サ
ブ・バイオロジカル・ケミストリー、２５９：１４３６
５−１４３７０［１９８４］等に既に記載されている精
製法、あるいは本出願人の出願に係る米国特許出願０６
／９４６５６６（１９８６年１２月２４日）に基づいて
優先権を主張し、同時に出願された欧州特許出願に記載
の如く、組換え法によって製造することができる。

本明細書において用いられるエンケファリナーゼという
語句の範囲には、第１７図および第１８図に示すラット
およびヒトエンケファリナーゼの固をのグリコジル化お
よびアミノ酸配列を有するエンケファリナーゼ、ウシ、
ブタ等の他の種由来のエンケファリナーゼ同族体、その
ようなエンケファリナーゼの脱グリフシル化または非グ
リコジル化誘導体、エンケファリナーゼのアミノ酸配列
変異体、およびインビトロで産生されたエンケファリナ
ーゼの共有結合誘導体が含まれるものとする。

これらの形状の全エンケファリナーゼは酵素的に活性で
ある。

エンケファリナーゼのアミノ酸配列の変異体は、置換、
挿入または欠失の３種類の変異の１またはそれ以上に帰
される。アミノ酸配列の変異体は、予め定められた変異
の性質、天然に存在するエンケファリナーゼのアミノ酸
配列におけるアジル変異または柱間変異からそれらを区
別している変異の特性によって特徴付けられる。通常、
変異体は、天然に存在する類似体と同質の生物学的活性
を示すが、以下に詳細に述べるように、エンケファリナ
ーゼの特性を改良するように変異を選択することもでき
る。

アミノ酸の置換は通常、１個の残基の置換であり、アミ
ノ酸の挿入は約１−１０個のアミノ酸残基の挿入であり
、アミノ酸の欠失は約１−３０個のアミノ酸残基の欠失
である。欠失または挿入は隣接する１対について行うの
が好ましく、即ち、２残基の欠失または２残基の挿入が
好ましい。最終的な組み立てに至るのに、置換、欠失、
挿入またはそれらの任意の混合を組み合わせて良い。

置換変異体は、第１７または第１８図に記載の配列の、
少なくとも１残基か除去され、その位置に別の残基が挿
入されたものである。そのような置換は一般にそれがエ
ンケファリナーゼの特性を細かく変化させることを目的
とする場合には下記の表１に従って行なわれる。

表−」。

元の残基　　　代表的な置換基 Ａｌａ　　　　　　５ｅｒ Ａ　ｒｇ　　　　　　Ｌ　ｙｓ ＡＳＩＩ　　　　　　ＧＩｎ、　ＨｙｓＡ　ｓｐ　　　
　　　Ｇ　ｌｕ Ｃｙｓ　　　　　　　　　Ｓ　ｅｒ Ｇｌｎ　　Ａｓｎ Ｇｌｕ　　Ａｓｐ Ｇｌｙ　　Ｐｒ。

Ｈｉｓ　　Ａｓｎ；Ｇｌｎ １１ｅ　　Ｌｅｕ；Ｖａｌ Ｌｅｕ　　ｒ　ｌｅ：Ｖａｌ Ｌ　ｙｓ　　Ａ　ｒｇ；Ｇ　Ｉｎ；Ｇ　ＩｕＭｅｔ　　
Ｌｅｕ；　Ｉ　Ｉｅ Ｐｂｅ　　Ｍｅｔ；Ｌｅｕ；Ｔｙｒ Ｓｅｒ　　Ｔｈｒ Ｔｈｒ　　５ｅｒ Ｔｒｐ　　Ｔｙｒ Ｔｙｒ　　　　　　　　　　　Ｔｒｐ；ＰｈｅＶａｌ　
　　Ｉ　ｌｅ；Ｌｅｕ 機能または免疫学的な同一性における実質的な変化は、
表１の置換より、非構成的な置換を選択すること即ち、
ａ）置換領域のポリペプチドバックボーンの構造、例え
ばシート構造またはへソックス構造、ｂ）標的部位にお
ける分子の電荷または疎水性、あるいはＣ）側鎖の大き
さ、の維持に及ぼす影響をより顕著に変えるような残基
を選択することによって得られる。一般に、エンケファ
リナーゼの性質に最も大きい変化を生じさせると思われ
る置換には、ａ）親水性残基、例えばセリルまたはスレ
オニルで（を）疎水性残基、例えばロイシル、インロイ
シル、フェニルアラニル、バリルまたはアラニルを（で
）置換する、ｂ）システィンまたはプロリンで（を）他
の残基を（で）置換する、Ｃ）電気的に陽性の側鎖を有
する残基、例えばリシル、アルギニルまたはヒスチジル
で（を）電気的に陰性の残基、例えばグルタミルまたは
アスパルチルを（で）置換する、あるいはｄ）大きい側
鎖を有する残基、例えばフェニルアラニンで（を）側鎖
を有しない残基、例えばグリシンを（で）置換すること
による置換がある。

重要な種類の置換変異または欠失変異には、エンケファ
リナーゼのトランスメンブランおよび／または細胞質領
域が関連している。エンケファリナーゼの細胞質領域は
、第１７図（Ｍｅｔ−’またはＭｅじつに示されている
ように２つのメチオニン残基のいずれかから始まり、お
よそ２１−２４個の付加的な残基が続いている。ラット
およびヒトの配列において、Ｐ　ｒｏ　−Ｌ　ｙｓ　−
Ｐ　ｒｏ　−Ｌ　ｙｓ　−Ｌ　ｙｓ−Ｌｙｓ領域（およ
そ８から１３までの残基）はトランスファー終止配列と
して作用すると考えられており、プロリル残基によって
導入される屈折した立体配座とリシル残基によって与え
られる電気陽性的な性質は、下記のトランスメンブラン
領域と一緒になって、エンケファリナーゼの細胞膜を妨
害すると考えられている。

エンケファリナーゼのトランスメンブラン領域はラット
の配列ではほぼ２１−４４残基（第１７図かられかるよ
うに、この配列では、Ａｓｐは＋１である）に位置して
おり、ヒトの配列では類似の領域に位置している。この
領域は、細胞膜の脂質２重層を横切るのに適当な大きさ
の極めて疎水性に富む領域である。これは、細胞質領域
と一緒になって細胞膜へのアンカー（いかり）として機
能すると考えられている。

細胞質領域およびトランスメンブラン領域のいずれかま
たは両方を欠失または置換させると、組換えエンケファ
リナーゼの細胞性脂質または膜脂質への親和性が減少さ
れ、その水への溶解性が向上するので、エンケファリナ
ーゼ水溶液を維持するために界面活性剤を添加する必要
がなく、組換えエンケファリナーゼの回収が容易になる
。細胞質領域のみを欠失すると、トランスメンブラン領
域が残存し、界面活性剤によって可溶化されるが、治療
上Ｙ＝７’益なエンケファリナーゼが得られるであろう
。細胞質領域を欠失したエンケファリナーセを治療のた
めに投与すると、膜に対して一層挿入し易くなっている
ので、普通、それが活性を有するエンベロープの直ぐ細
胞外の領域に活性が向けられることとなるので、軟膏ま
たは疎水性ミセルを含有する脂質性組成物での溶解性が
向上する。

潜在的な免疫源エピトープの導入を避けるために、置換
よりも、細胞質領域およびトランスメンブラン領域を欠
失させることが好ましい。

本発明に用いるために、エンケファリナーゼおよびその
誘導体を注射または局所投与に適した剤形に製剤化する
ことができる。非経口製剤については既知であり、本発
明に好適であって、筋注または静注投与が好ましい。筋
注または静注用の治療用製剤は、エンケファリナーゼの
トランスメンブランおよび細胞質を欠失した誘導体を含
有することか好ましい。治療有効■のエンケファリナー
ゼまたはその誘導体を含有する製剤は滅菌した溶液、懸
濁液または凍結乾燥品の形状のいずれかであり、所望に
より安定化剤または賦形剤を含有している。凍結乾燥組
成物は、適当な希釈剤、例えば、２５°Ｃにおいて、Ｏ
，１％Ｔｗｅｅｎ２０を含んだ５０　ｍＭ　　Ｉ−Ｉ　
Ｅ　Ｐ　Ｅ　Ｓバッフｙ　　（ｐＨ７，４）中、（３Ｈ
−ＤＡＩａ″、Ｌｃｕ５）エンケファリナンを基質とし
て用いて測定した場合、その生物活性が約１０ｎｍｏ　
ｌｅ／　ｍｇ／　Ｋ　ｇとなるように、注射用の水また
は食塩水に約０．Ｏ０１ｍｇ／Ｋｇ−２５ｍｇ／Ｋｇの
濃度で再溶解することによって再構成される。一般に、
エンケファリナーゼを含有する凍結乾燥組成物は、約０
．　０１ｍｇ／Ｋｇ−約２０ｍｇ／Ｋｇの投与範囲で肢
治療動物に投与される。

エンケファリナーゼは、治療有効濃度のエンケファリナ
ーゼを皮膚科用担体中に含有せしめて局部治療用の局所
用製剤に製剤化される。そのような局所用製剤は、細胞
質領域を欠失したエンケファリナーゼ誘導体を含有して
いることが好ましい。

投与すべきエンケファリナーゼの■、および局所製剤中
のエンケファリナーゼ濃度は選択された担体（ビヒクル
）、患者の臨床上の状態、用いられるエンケファリナー
ゼ、および製剤中のエンケファリナーゼの安定性に依存
するであろう。従って、医師は、問題の患者または同様
の患者における臨床上の経験に基づいて、製剤の投与量
を適切にすると共に、エンケファリナーゼ含有濃度が適
切な製剤を用いる必要がある。局所製剤中のエンケファ
リナーゼ濃度は、約０１１ｍｇ／ｍ１以上約２５ｍｇ／
ｍｌまでの範囲である。通常、局所製剤におけるエンケ
ファリナーゼ濃度は、約１ｍｇ／ｍ１以上約２０ｍｇ／
ｍｌまでの範囲である。エンケファリナーゼは、溶液製
剤と同様、固形の分散剤とそて用いることができる。従
って、ビヒクル中に用いられる正確な濃度は治療応答を
最適にするために適当な実験操作に委ねられることにな
るであろう。皮膚炎症の治療には、１％Ｗ／Ｗハイドロ
ゲルビヒクルを用い、ビヒクルｌｏｏｇあたり、エンケ
ファリナーゼが約１０ｘｇ以上であることが好ましい。

ゲル以外の適当なビヒクルとして、鉱物油および石油等
を用いた、水中油エマルジョンまたは油中水エマルジョ
ンがある。

所望により、エンケファリナーゼは経皮治療系（バリー
、１９８３、皮膚科学製剤、ｐ１８１および該引用例に
記載されている文献）を用いて投与してもよい。好まし
い局所製剤は、細胞質−トランスメンブラン領域を含有
するエンケファリナーゼを含んでいる。最も好ましい局
所製剤は、細胞質領域を欠くエンケファリナーゼを含有
している。

そのような局所投与システムは、たいてい、それらが経
皮的に送達し得ることが明らかであることにから、低分
子量の薬物の経皮投与のために計画されている。速度を
コントロールし得るミクロポーラス（微孔性）メンプラ
ンを選択することにより、それらを、エンケファリナー
ゼまたはその誘導体、および関連する治療用タンパク質
の投与に容易に適用することができる。

全身または局所のいずれかに適用されるエンケファリナ
ーゼの局所用製剤には、非経口投与のための上記の賦形
剤およびコソルベント、表面活性剤、オイル、湿潤剤、
皮膚軟化剤、保存剤、安定化剤、および抗酸化剤等の局
所製剤に用いられる他の賦形剤をも含有していよい。薬
学的に許容し得ルハノファー（例、トリスまたはホスフ
エートバッファー）を用いることができる。また、局所
製剤は、所望により、いわゆる促進剤、吸収促進剤また
はエンケファリナーゼまたは他の物質の透過性を促進す
るような透過性増加剤等、様々な物質の１またはそれ以
上を含有していてよい。そのような物質は、当業者には
知られている以下の性質の全てまたは１部を有すること
が望ましい。薬学的に不活性であり、体液または電解質
の損失を促進せず、エンケファリナーゼに適合性であり
（不活化しない）、さらにクリーム、ゲルおよび他の局
所適用系に製剤化し得る。

エンケファリナーゼはまた、肺への局所適用を達成する
ためにエアゾルによって投与することができる。このこ
とは、エンケファリナーゼまたはその誘導体を含有する
水性エアゾル、リポソーム製剤、または固形顆粒剤を調
製することによって達成される。一般に、水性エアゾル
は、エンケファリナーゼの水溶液または水性懸濁液を通
常の薬学的に許容し得る担体および安定化剤と一緒に製
剤化することにより調製される。担体および安定化剤は
、特定のエンケファリナーゼについての必要性に応じて
変化し得る。−船釣に、非イオン界面活性剤（′ｒｗｅ
ａｎｓ、　Ｐ　１ｕｒｏｎｉｃｓ、またはポリエチレン
グリコール）、血清アルブミンのような無害なタンパク
質、ソルビタンエステル、オレイン酸、レシチン、グリ
シンのようなアミノ酸、バッファー、塩類、糖類または
糖アルコールを含有している。製剤は、気管支拡張剤並
びに粘液溶解剤をも含有していてよい。製剤は滅菌製剤
であろう。エアゾルは、通常、等偏成から調製される。

粒剤には適宜、正常な肺界面活性剤を含有させる。

エアゾルは、水性または非水性（例、フルオロカーボン
プロペラント）懸濁液中粒子から製剤化される。そのよ
うな粒子には、例えば、エンケファリナーゼまたはその
誘導体の分子内会合体、またはリポソームまたはマイク
ロカプセルに包み込まれたエンケファリナーゼまたはそ
の誘導体が含まれる。エアゾルは肺に対して刺激性のも
の、即ち、急性の気管支収縮、咳、肺肝、または組織の
損傷をもたらす物質を含有していてはならない。しかし
ながら、本発明においては、非刺激性の吸収促進剤を用
いることが適当である。エアゾルの調製には、ソニック
ネブライザー（音波噴霧器）を用いることが好ましい。

ソニックネブライザーは、エンケファリナーゼまたはそ
の誘導体が、それを分解に至らしめ得る剪断力にさらさ
れることを最小限に止める。

エンケファリナーゼは、例えば、筋注、皮下注射、また
は血管内空間（スペース）への注射、特に結合部への注
入、例えば約１μｇ／結合液ｃｃ／日以上の用量での関
節内注射の如く、注射によって、局所（局部）投与より
むしろ全身投与するとよい。

用量は用いられるエンケファリナーゼの性質、例えばそ
の活性および生物学的半減期、製剤中のエンケファリナ
ーゼの濃度、投与部位および投与速度、関連の患者の臨
床上の耐容性、患者の病理学的状態等、医師にとってよ
く知られているような事柄に左右される。

本発明のエンケファリナーゼは溶液として投与してもよ
い。溶液として投与するには、エンケファリナーゼは、
トランスメンブラン領域を欠失しているか、細胞質とト
ランスメンブラン領域とを欠失していることが好ましい
。溶液のｐＨは５−９゜５の範囲であることが必要であ
り、ｐＨ６，５−７，５の範囲であることが好ましい。

エンケファリナーゼまたはその誘導体は、ホスフェート
、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−１−Ｉ　
Ｃ＋またはチトレートのような適当な薬学的に許容し得
るバッファーを含有する溶液中に含まれていなければな
らない。バッファーのンｇ娶度は１１−１Ｏ０ｎの範囲
である必要がある。エンケファリナーゼ溶液は、塩化ナ
トリウムや塩化カリウムのような塩類を、ａ度５０−１
５０ｍＭで含有していてもよい。有効量のアルブミン、
グロブミン、ゼラチン、プロタミンまたはプロタミンの
塩等の安定化剤をも含有していてよく、エンケファリナ
ーゼを含有する溶液に加えるか、溶液が調製される組成
物に加えてもよい。

エンケファリナーゼの全身投与は、毎日、一般に筋注に
よって行なわれるが、静脈内注入も許容し得る。投与は
、鼻腔的投与または他の非経口経路からの投与であって
よい。また、エンケファリナーゼは、血液をも含むある
種の組織に適用されるミクロスフェア−（中心体）、リ
ポソームその他の微粒子適用系を介して投与され得る。

局所製剤は、毎日、皮膚または粘膜に適用した後、閉塞
する、即ち、バンデージ、ポリオレフィンンフィルム、
またはその他の局所製剤が透過し得ない遮蔽物を重ねて
置き、防御することが好ましい。

以下に実施例を挙げ、本発明の方法を詳しく説明するが
、これらの実施例は本発明を制限するものではない。

実施例１　サブスタンスＰのｆｆ１１１定１０倍定職０
ｆｔｆｆｉの２Ｎ酢酸中で白イタチ（フエレノト獣）の
気管を細かく刻み、−晩抽出し、組織フラグメントを遠
心し、上清をＣ−１８カラム［セプーバック（Ｓｅｐ−
Ｐａｋ）　；ウォーターズ・アンド・アソシエーツ（Ｗ
ａｔｅｒｓ　ａｎｄ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｅｓ）　：　０
．　］％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含有する水で平
衡化し、０．１％ＴＦＡ中の０．５μｇ／酎ポリーＬ−
リジン［シグマ（Ｓｉｇｎ＋ａ）］　０　、２１１２で
あらかじめ循環させておいた］にかけることによって、
白イタチ°気管のサブスタンスＰ様の免疫反応性の程度
を測定した。次いでこのセブーバックを、０，１％ＴＦ
Ａ水溶液中にメタノールを０５２０．４０および６０％
含む溶液それぞれ４．０ｆｆｆ２からなる段階勾配で連
続して洗浄し、６０％メタノールでサブスタンスＰを溶
離した。Ｎ、下でメタノールを蒸発させ、次いで試料を
凍結乾燥し、検定前に検定緩衝液でｉｕ元した。この検
定緩衝液は、０．０５ＭＮａＰＯ４緩衝液中に０．０３
％ＮａＮ３．０．２５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）
、０．５％　２−メルカプトエタノールを含んでいる（
ｐＨ７，４）。

組織抽出物およびユシングチャンバー（Ｕｓｓｉｎｇ　
ｃｈａｎ＋ｂｅｒｓ）から直接得られた試料液につき、
前−平衡放射線免疫検定で検定した。遊離の放射線ラベ
ルしたサブスタンスＰの、抗体と結合した放射線ラベル
したサブスタンスＰからの分離は、デキストラン（Ｄｅ
ｘｔｒａｎ）Ｔ−７０被覆炭［ファーマシア（Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａ）］を用いて行った。

放射線ラベルしたサブスタンスＰは、サブスタンスＰを
ポルトン−ハンター試薬［Ｂｏｌｔｏｎ、　Ａ、　Ｅ、
　ａｎｄ　ｔｌｕｎｔｅｒ、　Ｗ、　Ｍ、　、　Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ、　Ｊ、　、　１３３．５２９−５３９（１９
７３）］にカップリングさせ、次いで、ＨＰＬＣ［ヒユ
ーレット・パソカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ　Ｐａｃｋａｒ
ｄ）モデルｌ０９０］を用いてカップリングした生成物
を精製することによって調製した。この反応混合物を、
１０μ肩Ｃ−１８逆相ＨＰ　Ｌ　Ｃカラム（ウォーター
ズ・アンド・アソシエーツ）にかけ、５５％メタノール
および０．０４５％ＴＦＡの水溶液を用い、１　ｒｌＱ
／分の流速でカラムからインクラティックに溶離した。

クロラミン−Ｔ　［ｃｈｌｏｒａＩ！１ｉｎｅ−Ｔ　；
　ｖ　ッコナエイおよびデイクソン（ＭｃＣｏｎａｈｅ
ｙ、Ｐ、　ａｎｄ　Ｄｉｘｏｎ、　Ｒ，、Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　７０．２１０−２
１３（＋９８０））］を用いて、モノ−誘導体化された
サブスタンスＰを放射線ヨウ素化した。この反応混合物
を、セダーパックＣ−１８カラムにかけ、ヨウ素化した
サブスタンスＰのポルトン−ハンター誘導体を６０％メ
タノールで溶離した。

グルタルアルデヒドを用いて精製ＢＳＡにカップリング
させたサブスタンスＰ、緩衝食塩水、およびフロイント
の完全アジュバントの混合物でウサギを免疫化した。モ
ノマーＢＳΔ　２５ｉ９およびサブスタンスＰ　５所を
ｐＨ６，８の０．ＩＭＮａ　ＰＯ，緩衝液１．０ｉ（！
中に溶解することによってサブスタンスＰをコンジュゲ
ート化し、次いて撹拌しながら、０．５％グルタルアル
デヒドのＮａＰＯ，緩衝液０．１＋１２を徐々に加えた
。この混合物を少なくとも２時間インキュベートし、そ
の後、０．１Ｍ　（Ｎ）［、）、ＣＯ，、を１．Ｏｘ（
加えることによって反応を止めた。さらに３０分間撹拌
した後、この混合物を蒸留水に対して徹底的に透析し、
凍結乾燥し、秤量した。

血清を集め、凍結乾燥し、凍結した。放射線免疫検定用
に血清を蒸留水で復元した。ブラジキニン、リンルブラ
ジキニン、血管活性な腸ペプチド、ソマトスタチン、コ
レシストキニン−８、ガストリン、ボンベシンおよびメ
イロテンシン［ペニンスラ・ラブダ（Ｐｅｎｉｎｓｕｌ
ａ　Ｌａｂｓ＋　Ｂｅｌｍｏｎｔ、　ＣＡ）］を含む他
のペプチドに対する交差反応性について、サブスタンス
Ｐ抗血清を試験した。さらに、数種のブロテイナーゼ阻
害剤（後記参照）、サブスタンスＰのＮ−末端フラグメ
ント、サブスタンスＰＩ−１１、およびＣ−末端フラグ
メント、サブスタンスＰ、−１、（ペニンスラ・ラブダ
）を試験した。

白イタチ気管セグメントは、生重量１９あたり平均０．
５８±０．２３０ｐモルのサブスタンスＰ様免疫反応性
（ｎ＝３）を有しており、サブスタンスＰが白イタチの
気道に存在していることを示唆した。

実施例２肺組織からの粘液分泌 前に記載されている方法［ボーマン等（Ｂｏｒｓｏｎ　
ｅｔ　ａｌ、　、　Ｊ、　Ａｐｐｌ、　Ｐｈｙｓ　ｉｏ
ｌ、　、　５７．４５７−４６６（１９８４））］を用
いて、白イタチ３６匹の気管セグメントからの粘液分泌
を測定した。簡単に説明すると、体重１〜２ｋｇの雄成
体の白イタチをベントパルビタールナトリウム（４５〜
６０ｏ／ｋｇ、腹腔内）で麻酔した後、気管を取り出し
、３８℃、９５％０７−５％ＣＯ，でバブルした培地１
９９／イールス（Ｅａｌｅｓ）ＨＣＯ，中で洗浄した。

気管セグメントを、シリコンガラス製の濯流チャンバー
［ＭＲＡ＞ｆ（ＭＲＡ　Ｉｎｃ、　、　ＣＩｃａｒｗａ
ｔｅｒ＋　Ｆｌｏｒｉｄａ）コと接続したプラスチ′、
。

り製のユシング型のチャンバーに入れた。両側を培地１
９９にさらした後、粘膜上組織側に０．１６７　ｍｃｉ
のＮａ、３５Ｓｏ、を加えた。１５分間隔で、管腔側か
ら培地を排出し、新鮮なラベルされていない培地と交換
した。それぞれの試料を透析管［スペクトロボアー（Ｓ
ｐｅｃｔｒｏｐｏｒｅ）　ｎｏ、　Ｄ１６１５−１　；
　ＭＷカットオフ：１２〜１４．００（ｌ］に入れ、過
剰のラベルされていないＳ０４およびアジ化ナトリウム
（１ｏｎ／Ｑ＞を含有する蒸留水（少な（とも６回交換
する：各４Ｑ）に対し、該実験からの試料の残りととも
に徹底的に透析して巨大分子の細菌分解を防止した。透
析の後、ベックマン・インスツルメンツ（Ｂｅｃｋｍａ
ｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）のベータ拳カウンター（
モデルＬＳ　　７５００）を用いて、各試料の結合放射
線活性を測定した。始めにセファデックス（Ｓｅｐｈａ
ｄｅｗ）Ｇ　−５０カラムを用いて試料を脱塩化し、次
いでＤＥＡＥセファセル（Ｓｅｐｈａｃｅｌ）で炭水化
物を含有する分子を濃縮し、セファロース（Ｓｅｐｈａ
ｒｏｓｅ）ＣＬ　−６Ｂカラムを用いて変性条件下［４
Ｍグアニジン、ｌ０ｍＭ２−メルカプトエタノール、０
．１％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ　−１００］で見か
けの分子量を測定することによって、分泌された物質の
分子量プロファイルを得た。以前の研究から、透析およ
びカラムクロマトグラフィーを用いる試料分析により定
量的に同様の結果が得られることがわかっていた［ボー
マン等（Ｂｏｒｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｊ、　Ａｐ
吐Ｐｈｙｓｉｏ１．、５７．４５７−４６６（１９８４
））］。

経時変化、濃度依存性および再現性を含むサブスタンス
Ｐに対する応答の特徴を調べた。白イタチ８匹からの気
管セグメントを放射線ラベルの存在下で３時間インキュ
ベートし、これに別々の濃度のサブスタンスＰ　（１０
−９Ｍ−１０−’Ｍ　；ペニンスラ・ラブダ）を加えた
。１０−’ＭのサブスタンスＰを２回、最初はインキュ
ベートの３時間後、そして４時間後にもう一度加えるこ
とによって、サブスタンスＰに対する応答の再現性を確
かめた。

系の偏りを排除するため、気管のサンプリング部位に関
する限り、すべての処置をランダムに行った。

組織をチャンバーに入れ、放射線ラベルを加えた後、組
織の管腔側への３５ＳＱ４−巨大分子の分泌速度は増加
し、分泌は２〜３時間までほぼ直線状に増加した。ラベ
ルして３時間後には、組織は１１１．８±１５．６ｐモ
ル結合Ｓ○ｔ／ｃｍ’／時間の平均速度で分泌した。こ
のとき、試料間隔あたりの結合Ｓ○４流量の平均増加は
１１．７±２．５ｐモル結合Ｓ　Ｏ、／ｃｔｔｔ”７時
間（ベースライン　１０゜５％）であった。組織の粘膜
下側に加えたときには、サブスタンスＰは１５分以内に
分泌を増加させ、その後、ベースラインに向かって復帰
し、最終的には刺激する前のベースラインを引き伸ばす
ことによって得られる値まで達した。ゲル透過クロマト
グラフィーにより、サブスタンスＰに応答して分泌され
る放射線ラベルされた物質の８５％が１０６以上の分子
量を有することがわかり、このことはおそらく大部分が
ムチン類またはプロテオグリカン類であることを示唆し
た。サブスタンスＰは、濃度に依存して結６ｓｏ、の流
量を増加させた（　１０−９ＭのサブスタンスＰから始
まり、１０−’Ｍに応答して１５６．４±２６．１ｐモ
ル結合ＳＯ４／ｃｘｆｆ／時間、または刺激前のベース
ライ／（７）　ｌ　５５±４２％；第１図）。サブスタ
ンスＰが誘導する分泌は、１０−”Ｍ以上のすべてのサ
ブスタンスＰ濃度について、時間単独による増加より有
意に多かった（ｐ＜０．０５；それぞれｎ＝６）。さら
に、刺激を繰り返すと応答も繰り返した。２回目の応答
は１回目の応答の平均７１．４±２４．２％であった（
ｐ＞０．１　；　ｎ＝４）。最初の刺激の後、培地から
サブスタンスＰを除くと、２回目の応答の強さは１回目
の応答の９１１±４８．３％までわずかに増加したが、
これは、サブスタンスＰに連続的にさらした組織の２回
目の応答と有意に異なってはいなかった（ｐ＞０．２；
それぞれｎ−４）。

Ｃ−末端フラグメント、サブスタンスＰ、−、、（１０
−５Ｍ）は、結合Ｓ０４の強い放出を引き起こしたが、
Ｎ−末端フラグメント、サブスタンスＰｉ９は引き起こ
さなかった（３６９．４±１８．３対３３．７±２４．
７ｐモル結合Ｓ０４／ｃＩ＊／時間；ｐ＜０．０５；そ
れぞれｎ＝４０たとえば、ポ２図）。

サブスタンスＰａ−１１に対する応答は、同一濃度でサ
ブスタンスＰ　１−１１に対する応答より有意に大きか
った（１５６．４±２６．１ｐモル結合ＳＯ，／ｃｙｒ
２／時間；　ｐ＜０．００１　；　ｎ＝４）。サブスタ
ンスＰｌ−８が誘導する分泌は、時間だけによるこれら
組織におけるベースライン流量の自然の変化と異なって
いなかった（−１８，４±１６．８ｐモル結合ＳＯａ／
ｃｍ”７時間；　ｐ＞Ｏ，Ｉ　；　ｎ＝４）。

実施例３サブスタンスＰ！Ｊ＜誘導する粘液分泌に及ぼ
すブロティナーゼ阻害剤の作用 法の一連の実験では、サブスタンスＰに対する分泌応答
に及ぼすサブスタンスＰ代謝の作用を調べた。種々の酵
素が種々の部位でサブスタンスＰを切断する。ペプチド
の活性部分、Ｃ−末端フラグメントが分泌活性のもとで
ある。エンケファリナーゼがサブスタンスＰを不活性な
フラグメントであるサブスタンスＰ１−８に切断するこ
とがわかった。

４匹の白イタチそれぞれからの少なくとも２つの組織を
３０分間培地中で２．５時間インキュベートし、各組織
の粘膜下側に９種類のブロティナーゼ阻害剤の組合せ物
を加えることによって（それぞれ、１０μｙ／ｚ（り、
内生のブロティナーセ類の作用を調べた。用いた阻害剤
には、ロイペプチン、アンチパイン、ペプスタチンΔ、
チオルファン、サブスタンスＰＩ−９［グロウコノトお
よびターペイ（Ｇｒｏｗｃｏｔｔ、　Ｊ、　Ｗ、　　ａ
ｎｄ　Ｔａｒｐｅｙ、　Ａ、　Ｖ、　、　Ｅｕｒ、　Ｊ
、　Ｐｈａｒｔ　、　８４．１０７−１０７−１０９（
１９コおよびアンギオテンシン変換酵素阻害剤、テブロ
チド（ベニンスラ・ラプス）、アブロトニン、ＢｓΔ、
およびバシトラシン（シグマ）が含まれる。阻害剤を加
えて３０分後に、サブスタンスＰ（ｔｏ−”Ｍ）を粘膜
上組織側に加えた。プロテイナーゼ阻害剤の存在しない
ところでは、このサブスタンスＰ濃度は妥当かつほぼ最
大の作用を引き起こした。ある組織では、阻害剤の組合
せが分泌を刺激し、これが存在すると、阻害剤を加えて
３０分以内にその作用は最大に達した。阻害剤の存在下
でのサブスタンスＰに対スる応答の平均を、同じ動物の
それぞれからの２つの対照セグメントの応答の平均と比
較した。次の実験で、個々のブロテイナーゼ阻害剤、チ
オルファン、テプロチド、ホスホルアミトン（シグマ）
、カプトプリル［スクイブ・ファーマシューティカルズ
社（Ｓｑｕｉｂｂ　Ｉ’ｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ
、　Ｉｎｃ、　）］、テプロチド、ウシ１ｍ　ｉ＋￥　
Ｎアルブミン、バシトラシン、ロイペプチン、アブロト
ニン、およびベスタチン（シグマ）、エンケファリン類
を分解する脳中のアミノペプチダーゼの阻害剤［チャイ
レット等（Ｃｈａｉｌｌｅｔ、　Ｐ、　ｃＬ　ａｌ、　
、　Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、　、　８６
．３２９−３３６（１９８３））］の作用を試験した。

異なる濃度のチオルファンを別々の組織に加えることに
よって、濃度依存性のエンケファリナーゼ阻害を調べた
。サブスタンスＰの分泌作用が、内生エンケファリン類
の放出によって間接的に介されているかどうかを測定す
るため、分泌応答に及ぼすｍｅｔ−エンケファリン（ペ
ニンスラ・ラブダ）の作用を試験した。

以下に示すコラレス等［Ｃｏｒｒａｌｅｓ、　Ｒ，Ｊ、
　ｅＬ　ａｔ、　、　Ｊ。

＾ｐｐ１．　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　、　５６．１０７６−
１０８２（１９８５）］の式の修正式により、透析試料
中のｅｐｌＲから結合ｓｏ４の流量［Ｊ（Ｓｏ、）］を
計算した： Ｊ（ＳＯ４）（２モル　５ＯＪｃｚ’７０４間）薬物投
与の１５または３０分後の組織で観察される流量（これ
は常に高い）から、薬物投与前の１５分間の流量を差し
引くことによって、薬物による流量の変化を計算した。

各条件での平均流量または流量変化を、変動の一方向分
析によって互いに比較した。多重比較用のニューマンー
カールス（Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ）試験により、ｌ
Ｘ１間の差異を測定した［ザー（Ｚａｒ、　Ｊ、　Ｉｔ
、　、”Ｍｕｌｔｉｐｌｅ　Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ”
　ｉｎ　ＢｉｏｇｔａＬｉｓｔｉｃａｌ　Ａｎａｌｙｓ
ｉｓ、　Ｐｒｅｎｔｉｃｅ　ｌ１ａｌｌ、　Ｅｎｇｌｅ
ｗ。

ｏｄ　Ｃ１１ｆｆｓ、　Ｎ、　Ｊ、　（１９７４））］
。

組織の粘膜下側に加えると、９種類のプロティナーゼ阻
害剤の組合せは、結合ＳＯ４の腔への流量をわずかに増
加させたが、時間だけによる増加（１２，３±６．２ｐ
モル結合ＳＱ、／ｃｍ’／時間）と比較すると有意なも
のではなかった（４５．８±２８．２ｐモル結合ＳＯ，
／ｃｍ”７時間）。コレラｌｆｌ　織の粘膜下側にサブ
スタンスＰを加えた後には、結合ＳＯ，の流■は、平均
３８３．５±１４８１）モル結合Ｓ　Ｏ４／　ｃｘ　’
　７時間、または同じ動物由来の対照組織のサブスタン
スＰに対する応答（８３，７±２１．４ｐモル結合ＳＯ
４／ｃｆｆ２／時間；ｐ＜０．０５　；　ｎ＝４）の４
３８．６±１０５．２％で増加した（第３図および第４
図）。それぞれの作用の合計、すなわち８３．７ｐモル
結合Ｓｏ、／Ｃ１″／時間（サブスタンスＰ）＋４５．
８ｐモル結合ＳＱ、／ｃｆｆ”７時間（阻害剤）は１２
９．５ｐモル結合ｓＯ４／ｃＩＩ２／時間であり、阻害
剤の存在下でのサブスタンスＰに対する応答（３８３，
５ｐモル結合Ｓｏ、／ｃｍ”７時間）の３４％にすぎな
いので、サブスタンスＰへの応答の増加は、阻害剤とサ
ブスタンスＰの加酸的な効果によるものではなかった。

研究に供したそれぞれの阻害剤のなかで、チオルファン
およびホスホルアミトン、エンケファリナーゼの阻害剤
だけが、サブスタンスＰ誘導の分泌を増強した（第４図
および第５図）。ｌ　Ｏ−’Ｍで組織の粘膜下側の加え
たときには、チオルファンは単独で、結合Ｓ０４の腔へ
の流量を増加させたく平均５７±１７．８ｐモル結合Ｓ
　Ｏ４／　ｃｍ”／　時間）。

これは、チオルファンを加える前の同一組織での自然の
流量増加（２０，５±６，３ｐモル結合ＳＯ４／ａｘ’
／時間；　ｐ＜０．０５　；　ｎ＝６）より有意に大き
かった。比較的低い濃度では、チオルファンは分泌を有
意に刺激しなかった。しかし、チオルファンは、約１０
−＠Ｍから始まり、濃度に依存してサブスタンスＰに対
する分泌応答を増強した（第５図）。チオルファン（１
０−’Ｍ）であらかじめ処置した組織では、サブスタン
スＰは、平均２６８゜０±５８．０ｐモル／ｃｙ’／時
間（対照の５０２±１４７％；　ｐ＜０．０５　；　ｎ
＝６）で結合ＳＯ４の流量を増加させた。この平均応答
は、同一の動物由来の対照組織のもの（７９，２±１３
．０ｐモル結合ＳＱ、／ｃｍ”７時間；　ｐ＜０．０５
　；　ｎ＝６）より有意に大きかった。サブスタンスＰ
誘導の分泌の増加は、チオルファンとサブスタンスＰの
加酸的な作用ではなかった。すなわち、それぞれの作用
の合計は７９．２ｐモル結合Ｓ　Ｏａ／　ａｍ’７１１
４間（サブスタンスＩ’）＋５７．０ｐモル結合ＳＱ、
／ｃｆｆ’／時間（チオルファン）＝　１３６．２　ｐ
モル結合５０４７ｃｍ”７時間であり、チオルファンの
存在下でのサブスタンスＰに対する応答（２６８，０ｐ
モル結合Ｓ　Ｏ、／　ｃ１／時間）の５１％にすぎなか
った。

ホスホルアミトン（１（Ｉ５Ｍ）で処置した組織におい
ては、サブスタンスＰ（１０−’Ｍ）は、平均３５７±
９１．９ｐモル結合Ｓ○Ｊｃｘ”７時間で流量を増加さ
せ、これは、同一の動物由来の対照組織の応答（６２，
３±２４．８ｐモル結Ｂ５０４／ＣＮ７時間；　ｐ＜０
．０５　：それぞれｎ＝４）より有意に大きかった。

エンケファリナーゼの阻害剤とは対照的に、他のブロテ
イナーゼ類の阻害剤は、サブスタンスＰ誘導の分泌を増
強しなかった（第４図）。すなわち、カプトプリルおよ
びテブロチド、キニナーゼ■（アンギオテンシン変換酵
素）の阻害剤は、サブスタンスＰ誘導の分泌をわずかに
増強したが（それぞれ４４±２７％および４９±３９％
）、その増加は、同一の動物由来の対照組織の応答と有
意に異なっていなかった（ｐ〉０．２；それぞれｎ＝４
）。

同様に、ロイペプチン、アブロトニン、バシトラシン、
ＢＳＡ、およびベスタチンはサブスタンスＰ誘導の分泌
を増強しなかった。

内生的に放出されるエンケファリン類によってサブスタ
ンスＰに対する分泌応答が影響を受けるかどうかを調べ
るために、実験を行った。ｍｅｔ−エンケファリンは分
泌を有意に刺激することはなかった。ｍｅｔ−エンケフ
ァリン（１０−’Ｍ）を加えた後の、結合ＳＯ４の流■
の変化は６．７±４．２ｐモル／ＣＪＩ！／時間であっ
たが、これは、笠時間での対照組織の流量変化（７，０
±１５ｐモル結合ＳＱ、／ｃＲ１／時間；　ｐ＞０．５
　；　ｎ＝４）と異なってはいなかった。これらの研究
は、気道組織に存在するエンケファリナーゼがサブスタ
ンスＰ誘導の分泌を阻害することを示している。

実施例４　タキキニン類に対する分泌応答に及ぼすエン
ケファリナーゼ阻害剤の作用 次の一連の実験で、別のタキキニン類とエンケファリナ
ーゼ阻害剤、ホスホルアミトンの作ｍを比較した。白イ
タチ気管からの組織をチャンバーに入れ、前述（実施例
２）の方法を用いてラベルした。次いで組織を、タキキ
ニン類、サブスタンスｐ（ｓｐ）、ノイロキニンΔ（Ｎ
Ｋ−Ａ）、ノイロキニンＢ（ＮＫ−Ｂ）、エレドイシン
（Ｅ　Ｌ　Ｅ　Ｄ）、フィサレミ７（ＰＨＹＳ）、また
はカシニン（ＫＡｓｓ）のいずれかにさらした。ホスポ
ルアミトン（１０−５Ｍ、３０分；シグマ）の存在下、
または非存在下、タキキニンそれぞれを１０−’Ｍで投
与した。上記実施例２に記載のようにして、高分子ｆｆ
１３５Ｓｏ４の放出を測定した。この結果を第６図に示
す。ホスホルアミトンの存在しないところでは、はとん
どのタキキニン類は次の強さ順序で分泌を刺激した： サブスタンスＰ〉フィサレミン＝エレドイシン＝カシニ
ン〉ノイロキニンＡ　（ｐ＜０．０５　；それぞれｎ＝
５）。

ノイロキニンＢは、ホスホルアミトンの存在しないとこ
ろでは不活性であった。しかし、ホスホルアミトンで前
処理した組織では、それぞれのタキキニンに対する分泌
応答は有意に増加した（ｐ＜０．０５；それぞれｎ−５
）。さらに、ホスホルアミトンの存在下では、強さの順
序は次のように変わった： サブスタンスＰ＝ノイロ牛ニンＡ−フィサレミン＝エレ
ドイシン＝カシニン〉ノイロキニンＢエンケファリナー
ゼ阻害剤の存在しないところでは、サブスタンスＰの作
用はノイロキニンＡのものより大きかった。エンケファ
リナーゼ阻害を行うと、サブスタンスＰおよびノイロキ
ニンへの作用は同じであった。これらの結果は、エンケ
ファリナーゼか、サブスタンスＰを切断するよりも高い
効率でノイロキニンＡを切断することを示唆する。また
これらは、気道組織に存在するエンケファリナーゼが種
々のタキキニン類によって誘導される分泌を阻害するこ
とを示している。

実施例５気道エンケフアリナーセの局在性および機能性 本一連の実験で、エンケファリナーゼの組織局在性を調
べた。公知の方法［ワルフロイおよｄシュワルツ（Ｍａ
ｌ「ｒｏｙ　ａｎｄ　Ｓｃｈｗａｒｔｚ、上記）］を用
いて、白イタチ腎臓からほぼ均質になるまでエンケファ
リナーゼを精製した。白イタチの迷走神経、気管上皮、
粘膜上組織、筋肉、肺および腎臓由来の膜フラクション
中のエンケファリナーゼ活性を調べた。白イタチを麻酔
し、迷走神経、気管、肺および腎臓を取り出した。Ｃａ
”不含の培地で１５分間気管をインキュベートすること
によって、気管上皮、粘膜下組織および筋肉を互いに分
離させた後、容易に上皮を取り出した。次いで、腺を含
む粘膜上組織から筋肉を分離した。それぞれの組織を細
かくつぶし、ポリトン（Ｐｏｌｙｔｏｎ）ホモジナイザ
ーを用い、５０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７゜４）中
でホモジナイズした。

膜フラクションまたは精製エンケファリナーゼ１こよる
（３）（−Ｔｙｒ電、ＤＡ　ｌ　ａ”、Ｌｅ　ｕ５）：
ｃンケファリン［リサーチ・プロダクツ・インターナシ
ョナル（Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　Ｉｎｔ
ｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）］の切断速度を測定することに
よってエンケファリナーゼ活性を測定した。膜フラクシ
ョン（５０μのを、（３Ｈ−Ｔｙ　ｒ’ＳＤＡ　Ｉ　ａ
”、Ｌｅｕ’）ｚンケファリン（２０ｎＭ）を含有する
緩衝液（５０μＣ）とともに室温で４０分間インキュベ
ートし、次いで２ＮＨＣｆ２（５０μｉ２）を加えるこ
とによって反応を停止させた。

この溶液７５μσをポリスチレン・ビーズ［ボロバック
−Ｑ　（Ｐｏｒｏｐａｋ）］のカラムにかけ、特徴的な
代謝物、３Ｈ−Ｔｙｒ−ＤＡｌａ−Ｇｌｙを水で溶離し
、放射線活性を測定した。タンパク質濃度はブラッドフ
ォード法［Ｂｒａｄｆｏｒｄ、　Ｍ、　Ｍ、　、　Ａｎ
ａｌｙｔｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍ、　、　７２．２４８
−２５４（＋９７６）］で測定し、エンケファリナーゼ
活性の結果を、タンパク質１ｘｙあたり、１分間あたり
の切断された基質の１モルで表した。

この結果を第２表に示す。

梃ス人気道エンケファリナーゼの局在性およびＬｅｕ−
チオルファンおよび基質との相互作用組　　織 ｌｅｕ−ｆオル７ｙン（ｎＭ）　　　２．１　　　　ｇ
、７　　　２．８　　　２．１　　２．８　　３．３（
ＤＡＩａ”、Ｌｅｕ’）− １７ケ７ｙりン（μＭ）　　　　５３．２　　２０．０
　　３０．６　　３２．４　２４．１　５２．０サブス
タンスＰ（μＭ）　　　　　　５．４　　　５．３　　
　３．２　　　３．６　　２．７　　４．１＊１つの実
験での３回の測定の平均 ＊＊結果をｒモル／分／ＪＩｇタンパク質で表す各組織
は基質を切断したが、気道の粘膜上組織において最も活
性が高かった。ロイシンーチオルファン（Ｉｅｕ−チオ
ルファン、エンケファリナーゼ阻害剤）は、各組織に対
してナノモル範囲の親和定数（Ｋｌ）で基質の切断を阻
害した。１ｅｕ−チオルファンとは対照的に、他のブロ
テイナーゼまたはペプチダーゼ阻害剤（１０−’Ｍ）は
、どの組織についても基質の切断を阻害しなかった。こ
れらの阻害剤には次のものが含まれる：カプトグリル、
アンギオテンシン変換酵素の阻害剤；ベスタチン、アミ
ノペプチダーゼ類の阻害剤；アブロトニン、セリンブロ
テイナーゼ類の阻害剤；または、ロイペプチン、セリン
あるいはチオールブロテイナーゼ類の阻害剤。従って、
基質の切断はもっばらエンケファリナーゼの作用によっ
ている。また、ペプチド類、（ＤＡｌａ”、Ｌｅｕ５）
＋−ンケ７７リン、サブスタンスＰおよびノイロキニン
Ａは、それぞれの基質につき、すべての組織に対して同
じである親和定数（Ｋ１）で基質の切断を阻害した（第
２表参照）。サブスタンスＰおよびノイロキニンＡに対
するエンケファリナーゼの親和性は、（ＤＡＩａ’、Ｌ
ｅｕ’）エンケファリンに対するエンケファリナーゼの
親和性の約１０倍である。サブスタンスＰおよびメイロ
キニンへに対する親和定数は同じであるので、粘液分泌
（実施例４）および筋肉収縮（実施例８）に及ぼすこれ
らペプチド類の活性の差異は、おそらく転換数（Ｋ　ｃ
ａｔ）の差によるものであって、基質に対するエンケフ
ァリナーゼの親和力の差によるものではないであろう。

実施例６サブスタンスＰ誘導の粘液分泌およびエンケフ
ァリナーゼ活性に及ぼすトリプシンの作用 この一連の実験では、エンケファリナーゼおよびサブス
タンスＰが介する粘液分泌に及ぼす、原型の細胞外プロ
テイナーゼの作用を調べた。これらの研究を行った理由
は、多種類のブロティナーゼ類が異なる細胞および組織
から放出され（たとえば、好中球エラスターゼ、アルカ
リブロティナーゼ、マスト細胞トリブターゼおよびチマ
ーセ）、これらのブロテイナーゼ類がエンケファリナー
ゼを破壊するときには、ペプチド誘導の分泌の変化が観
察されるはずであるからである。トリプシン（１０−ロ
〜１０−５Ｍ；１５分）、原型のセリンブロテイナーゼ
を用いてこの仮説を試験した。白イタチ３匹の気管から
の粘液分泌および（３Ｈ−’ｒｙｒ−ＤＡ　Ｉ　ａ’−
Ｌｅ　ｕ）：ｃンケ７７リンノ分解で計測した肺ホモジ
ネートのエンケファリナーゼ活性に及ぼすトリプシンの
作用を測定した。

トリプシンインキュベート（１５分）すると、濃度に依
存して（１０−”Ｍ以上で始まり、１０−５Ｍで最大作
用となる）肺ホモジネートのエンケファリナーゼ活性が
減少した（第７図）。さらに、トリプシン（ＩＦ’Ｍ、
３０分）自体は、時間単独による増加を越えては粘液分
泌を増加させなかった。

しかし、トリプシンはサブスタンスＰに対する分泌応答
を増加させた。すなわち、エンケファリナーゼ阻害剤（
たとえば、チオルファン）の場合のように、トリプシン
によって引き起こされるエンケファリナーゼ活性の減少
は、サブスタンスＰに対する分泌応答の増加と関連して
いる。従って、他のプロテイナーゼ類（たとえば、炎症
細胞、マスト細胞、好中球などからのもの）もまた、組
織中のエンケファリナーゼの量または活性を調節するこ
とによって間接的にペプチド誘導の応答を変えることも
あるようである。

実施例７サブスタンスＰ誘導の気道平滑筋収縮に及ぼす
プロテイナーゼ阻害剤の作用２７匹の白イタチをベント
パルビタールナトリウム（４５〜６０１９／に９、腹腔
内）で麻酔し、気管を取り出した。気管から横方向のリ
ング（長さ　８Ｘ、Ｗ）を切り出し、次の組成（ｍモル
／ののクレブスーヘンセレイト（Ｋｒｅｂｓ−１１ｅｎ
ｓｅｌｅｉｔ）溶液１４ｍＮ！を満たしたガラス製チャ
ンバーに入れた・ＮａＣＱ　］１８、ＫＣＱ　５．９、
ＣａＣＱｖ　２．５、ＭｇＳｃ４１．２、ＮａＨｔＰｏ
、１，２、Ｎａ［−＋ＣＯ３２５，５、グルコース　５
．６．０．１％ウシ血清アルブミン、およびペニシリン
−ストレプトマイノン（１００単位／村）。この溶液を
３７°Ｃに保ち、常時９５％０、−５％ＣＯ，の混合物
（ｐＨ７，４となる）を通した。６個の気管リングを同
時に試験した。

イソメトリックな張力を連続的に記録するために、気管
リングを引っ張りゲージ［グラス（Ｇｒａｓｓ）ＦＴＯ
３］に接続し、リングを、電場刺激用の２つの直交プラ
チナ電極（６Ｘ　４０ｘｍ＞の間に置いた。

始めに、このリングを２０ｇの張力で３０秒間引き伸ば
し、次いで、静止張力を４ｇに調節しながら１時間平衡
化した［スコー等（Ｓｋｏｏｇｈ、Ｂ−Ｅ、　ｅｔ　ａ
ｌ、　、　Ｊ、　Ａｐｐｌ、　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　、靜
、　２５３−２５７（１９８２））コ。平衡中は、１５
分毎に培地を交換した。電場刺激（２相、パルス期間０
．５ｍｓ：２０ｓに対して２０Ｖ、周波数２０Ｈ２）に
対する最大の応答が４ｇの静止張力のときに得られるこ
とが予備試験かられかっていた（同上）。

サブスタンスＰ（１０−’〜１０−’Ｍの濃度を用いた
）および１ｅｕ−チオルファンに対する応答性、および
サブスタンスＰ（ペニンスラ・ラブダ）に対する漸増の
用量一応答曲線を得た。収縮がプラトーに達した後に、
次の濃度のサブスタンスＰを加えた。サブスタンスＰに
対する最初の用量一応答曲線が終了した後に、１ｅｕ−
チオルファン（ｔｏ−’Ｍ、スクイブ・ファーマシュー
ティカル）を器官の浴に加えた。１５分のインキュベー
トの後、サブスタンス１〕に対する第２の用量一応答曲
線を得た。

エンケファリナーゼはサブスタンスＰを９位と１０位の
間で切断してＮ−末端フラグメントを生成するので［マ
ドサス等（Ｍａｔｓａｓ、Ｒ，ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ
。

Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、（ＵＳＡ）、８０，３
…−３１１５（１９８３））コ、　該フラグメント（１
０−５Ｍ、ペニンスラ・ラブダ）、サブスタンスＰ１〜
９を試験した。また、（Ｄ　Ｐ　ｒ　。

２、ＤＴｒｐ７．９）−サブスタンスＰ（１０−５Ｍ、
ベニンスラ・ラブダ）、サブスタンスＰアフタコニスト
［ハカンソン等（Ｉｌａｋａｎｓｏｎ、Ｒ，ｅｔ　ａｌ
、、Ｂｒ、Ｊ、Ｐｈａｒｍａｃ、　、　７７、６９７−
Ｔｏｏ（１９８２））コを用いても実験を行った「サブ
スタンスＰ（１０−’Ｍ）と１ｃｕ−チオルフ１ン（１
０−５Ｍ）への応答がプラト−に到達した後にこのアン
タゴニストを加えることによって］。

サブスタンスＰを０．１Ｍ酢酸に溶解し、１ｅｕ−チオ
ルファンを［％エタノールに溶解して約１０−３Ｍのシ
ヨ、り溶液を得た。これらの薬物を−２５°Ｃで保存し
、各実験用にその一部を解凍し、クレブスーヘンセレイ
ト溶液で希釈した。

結果を平均上標準誤差で表す。サブスタンスＰに対する
用量一応答曲線用に、それぞれの濃度の２つの群間の平
均を対のｔ検定で比較した。電場刺激の研究用に、応答
を、変動の一方向分析およびニューマンーカールスの多
重範囲検定で比較した。Ｐ＜０．０５であるときに有意
であるとみなした。

サブスタンスＰは単独で筋肉張力の増加を引き起こした
が、５ＸｌＯ−’Ｍ以上の濃度のときだけであった（第
８図）。１ｅｕ−チオルファン（１０−’Ｍ）を単独で
加えても静止張力に有意の作用は及ぼさなかったが、サ
ブスタンスＰに対する用量一応答の関係を、対数でほぼ
１単位数、低濃度側へ移動させた（第８図）。サブスタ
ンスＰとは対照的に、Ｎ−末端フラグメントサブスタン
スｐ＋−ｓ（ｔｏ−５Ｍ）は静止張力に有意の作用は有
してしなかった（ｎ＝３）。

Ｉｅｕ−チオルファンの存在下、サブスタンスＰ（１０
−”Ｍ）が引き起こす収縮は、サブスタンスＰアンタゴ
ニスト（ＤＰｒｏ２、ＤＴｒｐ’、’）サブスタンスＰ
（ｔｏ−５Ｍ）によって減少した（対照の３６゜０±１
０．０％）。サブスタンスＰアンタゴニストはサブスタ
ンスＰ誘導の収縮を、アトロピン単独のときより有意に
減少させた（Ｐ＜０．０１．第９図）。

カプトグリル（１０−５Ｍ、スクイブ・ファーマシュー
ティカル）、ベスタチン（１０−５Ｍ、シグマ）または
ロイペプチン（ｌ　Ｏ−’Ｍ、ペニンスラ・°ラブダ）
のいずれか、およびサブスタンスＰ（５ＸｌＯ−”Ｍ）
の存在下、電場刺激誘導の収縮を測定して、アンギオテ
ンシン変換酵素（ＡＣＥ）、アミノペプチダーゼ類、お
よびセリンあるいはチオールブロテイナーゼ類の阻害が
、電場刺激に対する増強応答に応答性であるかどうかを
調べた。Ｉｅｕ−チオルファンの濃度を増加させながら
加え（１０”〜１０−’Ｍ）、刺激を繰り返して、Ｉｅ
ｕ−チオルファンが電場刺激誘導の収縮を変化させるか
どうかを測定した。別の５匹の白イタチを用いて、電気
的に誘導した収縮に及ぼす１ｅｕ−チオルファンの作用
を調べた。電場刺激（５Ｈｚ）に対する対照応答を測定
した後、１ｅｕ−チオルファン（ｔｏ−’Ｍ；１５分）
を加え、刺激を繰り返し、（ＤＰｒｏ”、ＤＴｒｐ７．
１１）サブスタンスＰ１サブスタンスＰアンタゴニスト
（１０−５Ｍ；　１５分；ペニンスラ・ラブダ）を加え
、刺激を繰り返した。

極めて低濃度（５Ｘ　１０−ＩＩＭ）であっても、サブ
スタンスＰは単独で電場刺激に対する応答を増加させた
（第１０図）。サブスタンスＰ（１０−”または１０”
Ｍ）は、５回の応答後であっても、作用の有意のタキフ
ィラキンーを伴わずに、電場刺激が誘導する収縮を再現
性よく増加させた（ｎ＝３）。１０−’Ｍまでの濃度の
Ｉｅｕ−チオルファンは、すべての実験において静止張
力を変えなかった。

しかし、１ｅｕ−チオルファンの濃度を増加させながら
加えると、電場刺激に対する応答に、約１０−９Ｍから
始まり、ｌ　Ｏ−’Ｍで最大となる、用量相関性を有す
る増加が生じた（第１Ｏ図）。

Ｉｅｕ−チオルファンは、濃度に依存して、電場刺激に
対する応答を増強した（第１１図）。（ＤＰｒｏ２、Ｄ
Ｔｒｐ’、’）サブスタンスＰ（１０−５Ｍ）は、１ｅ
ｕ−チオルファンが誘導する、電場刺激に対する応答の
増加を有意に阻害した（ｌｅｕ−チオルファンの存在下
の１１８±１．７％に対して１０１．６±１．７％；　
ｐ＞０．０１　；　ｎ＝５）。

１ｅａ−チオルファンの作用とは対照的に、用いたその
池のペプチダーゼ阻害剤類はいずれも、サブスタンスＰ
（５Ｘ　Ｉ　Ｏ−”Ｍ）の存在下の電場刺激に対する応
答を増強しなかった（ｐ＞０．５：ｎ−３）。

これらの研究により、エンケファリナーゼが気道筋肉お
よび神経に存在し、これが、サブスタンスＰ誘導の作用
（気道平滑筋への神経伝達の増強および気管支収縮を含
む）を減少させることが確かめられた。

１ｅｕ−チオルファンはサブスタンスＰ誘導の作用を増
強し、一方、その他のプロテイナーゼおよびペプチダー
ゼ阻害剤類、たとえばカプトプリル、アンギオテンシン
変換酵素の阻害剤［ターナ−等（Ｔｕｒｎｅｒ＋　Ａ、
　Ｊ、　ｅｔ　ａｌ　＋　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｐｈａｒ
ｍａｃｏｌ、　、　３４＋　１３４７−１３５６（１９
８５））］、ベスタチン、アミノペプチダーゼ類の阻害
剤、またはロイペプチン、セリンあるいはチオールプロ
テイナーゼ類の阻害剤は作用を有してしないので、エン
ケファリナーゼはサブスタンスＰ誘導の作用を減少させ
るのに関与している。

実施例８気道平滑筋のタキキニン誘導収縮に及ぼすブロ
テイナーゼ阻害剤の作用 気管組織を切り出し、処置し、この組織を電気的に刺激
するのに用いた方法は、上述のものと同じである。タキ
キニン類および１ｅｕ−チオルファンに対する応答、サ
ブスタンスＰ（ペニンスラ・ラブダ）、ノイロキニンＡ
（ペニンスラ・ラブダ）およびノイロキニンＢ（ペニン
スラ・ラブダ）に対する漸増用量一応答曲線を、１ｅｕ
−チオルファン（１０−５Ｍ；１５分；スクイブ・ファ
ーマシューティカル）の存在下または非存在下、１０−
目〜１０−５Ｍの濃度範囲で得た。その前の収縮がプラ
トーに達した後に、次の濃度のタキキニンを加えた。

カプトプリル（１０−５Ｍ；１５分；スクイブ・ファー
マシューティカル）、ベスタチン（１０”Ｍ；１５分；
シグマ）またはロイペプチン（１０−’Ｍ；１５分；ペ
ニンスラ・ラブダ）のいずれかと混合した、サブスタン
スＰ（１０−”Ｍ）、ノイロキニンΔ（１０−”Ｍ）お
よびノイロキニンＢ（１０−’’Ｍ）の存在下で、電場
刺激誘導の収縮を測定し、アンギオテンシン変換酵素（
ＡＣＥ）、アミノペプチダーゼ類、またはセリンあるい
はチオールブロテイナーゼ類が電場刺激に対する応答の
増強に応答性であるかどうかを調べた。

データを平均上標準誤差で表した。タキキニン類に対す
る用量一応答曲線用には、それぞれの濃度の２つの群間
の平均を非対のｔ検定で分析した。

電場刺激の研究用には、変動の一方向分析および二二一
マンーカールスの多重範囲検定によって応答を比較した
。ｐ＜０．０５のときに有意であるとみなした。

サブスタンスＰ１ノイロキニンＡおよびノイロキニンＢ
は単独で平滑筋収縮を引き起こすが、ノイロキニンＡに
ついては１０−”Ｍまたはそれ以上の濃度のとき、およ
びサブスタンスＰおよびノイロキニンＢについては１０
−５Ｍの濃度のときだけである（第１２図）。タキキニ
ン類が誘導する収縮を１０−”Ｍおよび１０−５Ｍで比
較すると、強さの順序は次のようであった［統計学的に
有意な差異は、１０−’ＭのノイロキニンＡとノイロキ
ニンＢ（ｐ＜０．０１）またはノイロキニンＡとサブス
タンスＰ（ｐ＜０．０５）の間、ならびに１０−５Ｍの
ノイロキニンＡとノイロキニンＢ（ｐ＜０．０１）の間
でだけ得られたコ　： ＩイαにンＡ＞９ブスタンスＰ〉ノイ０キニンＢ０１ｅ
ｕ−チオルファン（１０−５Ｍ）だけを加えても静止張
力に有意の作用は示さなかったが、サブスタンスＰ１ノ
イロキニンＡおよびノイロキニンＢに対する用量一応答
曲線を、サブスタンスＰでは対数で約１単位数、ノイロ
キニンＡでは対数で約２単位数、そしてノイロキニンＢ
では対数で約３単位数、低濃度側に移動させた（第１２
図）。１ｅｕ−チオルファンの存在下でのタキキニン類
の強さの順序は以下のようであった： ノイ■二ン＾＝ノイ０キニンＢ＞ｆブスタンスＰ０Ｉｅ
ｕ−チオルファンは、濃度に依存してタキキニン類に対
する応答を増強した（約１０−’Ｍから始まり、１０−
’Ｍで最大作用となる：第１３図）。１ｅｕ−チオルフ
ァンとは対照的に、使用したその他のペプチダーゼ阻害
剤はいずれも、サブスタンスＰ１ノイロキニンＡまたは
ノイロキニンＢ（ｉｏ”Ｍ）の存在下での電場刺激に対
する応答を増強しなかった。

サブスタンスＰ１ノイロキニンＡおよびノイロキニンＢ
のそれぞれは、濃度に依存して電場刺激に対する応答を
増強した。サブスタンスＰは、電場刺激に対する応答を
ノイロキニンＡおよびノイロキニンＢより有意に高く増
強した。（ＤＰｒｏ”。

ＤＴｒｐ’、’）サブスタンスＰ（特異的なタキキニン
アンタゴニスト：ｌ（Ｉ’Ｍ）は、サブスタンスＰ、ノ
イロキニンＡおよびノイロキニンＢが誘導する電場刺激
にχ・すする応答の増強を阻害したく第１４図）。

これらの研究により、サブスタンスＰ１ノイロキニンＡ
およびノイロキニンＢが平滑筋収縮を引き起こし、異な
る強さで気道平滑筋への神経伝達を増強することが確か
められた。気道に存在するエンケファリナーゼはタキキ
ニンが誘導する作用の重要な阻害剤である。１ｅｕ−チ
オルファンがタキキニン誘導の作用を増強する機序は、
エンケファリナーゼがペプチド類の分解を防止すること
によるものと考えるのが最も有力である。エンケファリ
ナーゼによる別種タキキニン類の加水分解の受は易さに
より、タキキニン誘導の作用における強さの順序の変化
か説明されるのかもしれない。

サブスタンスＰアンタゴニスト、（ＤＰｒｏ！、ＤＴｒ
ｐ’、’）サブスタンスＰは電場刺激が誘導する収縮を
阻害したが、このことは、このアンタゴニストがタキキ
ニン類に対して選択的であるので［リーンダー等（Ｌｅ
ａｎｄｅｒ、Ｓ、Ｒ，ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ、２
９４゜４６７−４６９（１９８１））］、タキキニン受
容体がタキキニン類の作用に関与していることを示唆す
るものである。

上述のように、１ｅｕ−チオルファンはタキキニン誘導
の作用を増強したが、その他のブロテイナーセ類および
ペプチダーゼ類の阻害剤は増強しなかったので、白イタ
チ気管におけるタキキニン誘導の作用にエンケファリナ
ーゼが関与しているのかもしれない。上記の阻害剤類に
は次のものが含まれる：カプトプリル、アンギオテンシ
ン変換酵素の阻害剤；ベスタチン、アミノペプチダーゼ
類の阻害剤；および、ロイペプチン、セリンあるいはチ
オールプロテイナーゼ類の阻害剤。さらに、タキキニン
誘導の収縮に及ぼす１ｅｕ−チオルファンの作用は濃度
依存性であり（第１３図）、これは、内生エンケファリ
ナーゼの活性がタキキニン誘導の作用と密接に関係して
いることを示唆するものである。

実施例９　ブラジキニン誘導の気道平滑筋収縮に及ぼす
エンケファリナーゼ阻害剤類の作用用いた方法は実施例
７に記載したものと同じである。ブラジキニン（シグマ
）および１ｙｓ−ブラジキニン（カリジン；シグマ）は
用量（１０−”〜１０−５Ｍ）に依存して収縮を引き起
こした（第１５図）。

エンケファリナーゼ阻害剤類の存在しないところでは、
ブラジキニンの方が１ｙｓ−ブラジキニンより強か−っ
た。１ｅｕ−チオルファン（ｌ　Ｏ−”Ｍ）は用ｆｉ−
応答曲線を対数で１〜１，５単位数低濃度側に移動させ
た。１ｅｕ−チオルファンの存在下では、ブランキニン
およびＩｙｓ−ブラジキニンの収縮作用の強さは同等で
あった。この研究は、気道組織に存在するエンケファリ
ナーゼがキニン誘導の平滑筋収縮の作用を減少させるこ
とを示している。

実施例１０サブスタンスＰが誘導する回腸平滑筋収縮に
及ぼすエンケファリナーゼ阻害剤類の作用 実施例７に記載した白イタチ気道平滑筋での方法に類似
する方法を用い、縦方向の回腸平滑筋を試験した。コン
トロール状態では、エンケファリナーゼ阻害剤類の非存
在下、サブスタンスＰは用量に依存して緊張性の収縮を
引き起こした（第１６図）。Ｉｅｕ−チオルファン（１
０−５Ｍ）は用量応答曲線を対数で１単位数低濃度側に
移動させた。この研究により、胃腸（回腸）組織に存在
するエンケファリナーゼかサブスタンスＰ誘導の平滑筋
収縮の作用を減少させることがわかる。

実施例１１　走化性の検定 完熟好中球の正常な機能は、走化性、食作用、殺微生物
作用、および外来物質の消化である。走化性因子は炎症
部位に生成し、この部位は好中球を含む種々の免疫学的
な細胞を該部位に引き寄せる。好中球の炎症部位への走
化的な引き寄せの機序は完全にはわかっていない。エン
ケファリナーゼがこの機序に関与している［コ不す−等
（Ｃｏｎｎｅｌｌｙ、　Ｊ、　Ｃ，ｅｔ　ａｌ、　、　
Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　（Ｕ
ＳＡ）、　８２．８７３７−８７４１（１９８５））］
。過免疫応答のある場合には、好中球およびその他の免
疫細胞の異常な流入がさらに別の組織損傷を引き起こす
こともある。

エンケファリナーゼかヒト好中球の細胞膜に結合するこ
とがわかった［コ不り一等、上記］。好中球由来の膜結
合したエンケファリナーゼは走化性ペプチドｒＭｅｔ−
Ｌｅｕ−Ｐｈｅを切断する（同上）。好中球の脱顆粒お
よび走化は走化性ペプチド類の切断を必要とする［スミ
ス等（Ｓｍｉｔｈ、Ｒ，ａｔ　ａｌ、、Ｆｅｄ、Ｐｒｏ
ｃ。

Ｆｅｄ、　＋Ｌｍ、　Ｓｏｃ、　Ｅｘｐ、　Ｂｉｏｌ、
　、　４４．５７６（１９８５））およびアスワニクマ
ー等（Ａｓｗａｎｉｋｕｍａｒ、Ｓ、　ｅｔ　ａｌ、、
Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　（ＵＳＡ）、　７３．２４３９
−２４４２（１９７６））］。従って、好中球膜結合エ
ンケファリナーゼが、好中球受容体のすぐ近くのｆＭｅ
ｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅを切断することによって走化性シグ
ナルと結合していることもあることが示唆されていた。

この分解は走化性ペプチドの局所濃度をコントロールす
るであろう。

好中球の走化性に及ぼすエンケファリナーゼの作用を試
験するため検定を行った。市販の走化性検定キット［ノ
イロプローブ（Ｎｅｕｒｏｐｒｏｂｅ、　Ｃａｂｉｎ　
Ｊｏｈｎ、　Ｍｄ）］を用い、下記のように変えた。ヒ
ト供与者の周辺血液からデキストラン沈降によって好中
球を単離した。５μｌフイルターを通して、試験物質の
一部を含む走化チャンバーに好中球試料を入れた。３〜
６の複製を３７℃で１時間、それぞれの試験にかけた。

次いで、それぞれのチャンバー中の移動好中球の数を数
えた。５つの選択した単位領域中の細胞数によって走化
性の強さを評価した。市販の走化性キット［ノイロブロ
ーブ（Ｎｅｕｒｏｐｒｏｂｅ、　Ｃａｂｉｎ　Ｊｏｈｎ
、　Ｍｄ）］を用いた。エンケファリナーゼの種々の特
異的な阻害剤を用いて好中球の走化におけるエンケファ
リナーゼの役割を調へた。

ｔｏｏｘの倍率下、キット膜の５つの領域で観察される
好中球の合計数で走化活性を表す。すなわち、数が大き
いほど特定の試験組成物の走化性が大きかった。

蝮旦人走化活性 好中球の移動 ネルミルＭｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ＋ｆオル７７ン　１０
μＭ　　　　　　　２９±１９（ｎ＝５）このように、
好中球エンケファリナーゼは走化活性を調節する。

Ｘ廊例１１　　ボンベシンのエンケファリナーゼ切断 ボンベシンおよびボンベシン様ペプチド類は、気道］二
皮細胞用の成長因子［ウィリー等、上記］、およびヒト
小細胞肺ガン（ＳＣＬＣ）における成長因子［カチック
等（Ｃｕｔｔｉｔｔａ　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｎａｔｕｒ
ｅ、　３１６．８２３−８２６（１９８５））］として
機能することが知られている。ボンベシンに対するモノ
クローナル抗体がインビボでマウスの５ＣＬＣ細胞の成
長を阻害することがわかっていた（同上）。

ボンベシン（１０−’Ｍ）および（Ｌｅｕ５）エンヶフ
ァ’Ｊ　７　（１０−’Ｍ）ヲ精製したラットの腎エン
ケファリナーゼ（０，０２％トリトンＸ−１００を含有
する５　０ｍＭ、　ｐ　１１７．４のＨＥｒ’ＥＳ緩衝
液■５０ｕ（ｌ中に５０　ｎｇ）に加えた。３７°Ｃで
３０分間放置した後、２ＮＨＣｆｆを５０μＱ加え、イ
ンキュベート培地をｔｔｐｔ−ｃ［ｃ１８　μボンダバ
ック０カラム；０．１％トリフルオロ酢酸中、０〜７５
％アセトニトリルの３０分の直線勾配］で分析した。（
Ｌｅｕ’）エンケファリンの１５％が分解することがわ
かる一方、ボンベシンの８０％が加水分解された。ボン
ベシンはエンケファリナーゼの良好な基質となるようで
ある。治療学的有効量のエンケファリナーゼを投与する
と、細胞増殖にボンベシンを必要としている腫瘍の成長
を遅らせるのかもしれない。

実施例１３サブスタンスＰが誘導する管外遊出に及ぼす
エンケファリナーゼの作用のインビボ試験 サブスタンスＰを注入するとエバンス・ブルー（Ｅｖａ
ｎｓ　Ｂｌｕｅ）染料の管外遊出が増加することがこの
試験によってわかった。動物をエンケファリナ−ゼで前
処理するとこの作用は減少した。・雄のロング・エバン
ス（Ｌｏｎｇ　Ｅｖａｎｓ）ラットをこの研究に用いた
。ナトリウムメチルへキサバルビクール（７５ｍ９／に
９、腹腔内）を注射することによってそれぞれのラット
（２５０ｇ）を麻酔し、あおむけにした。血管的注射用
に頚静脈または大腿静脈を切開した。

エバンス・ブルー染料の管外遊出を測定して血管透過率
の変化を調べた。血管的注射すると、この染料は血管系
中に急速に混ざり、そこで血清アルブミンと結合し、高
分子量の染料−タンパク質複合体が生成する。血管透過
率が増加しなければ、この染料−タンパク質複合体は血
管系中に残存する。静脈循環中にエバンス・ブルー染料
溶液（３０ｒｎ／　ｘ（ｌの食塩水溶液を０．２５０ｚ
Ｃ）を注射することによって透過率の変化をモニターし
た。１分後に食塩水中のサブスタンスＰ（１μｙ／　ｋ
ｇ）を注射した。その５分後に、１％バラホルムアルデ
ヒドを含有する０、０５Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ３，５
）からなる定着溶液を動物に２分間潅流した。この酸性
の定着液はエバンス・ブルーが組織外に拡散するのを防
止する。この定着の後、足および体の皮膚をその下の結
合組織から切り取り、秤量し、ホルムアミド２．ＯｘＣ
中に入れ（５０°Ｃ１２４時間）、染料を抽出した。６
２０　ｒ＋＋ｎでの吸収をｆｌｌｌ＋定し、その結果を
既知濃度の染料の標準曲線と比較することによって、そ
れぞれの組織から抽出した染料のｎｌを１ｌｌｌｌ　定
した。エバンス・ブルーの量を、染料（ｎ９）／組織生
重量（９）で表す。

再現性ある、さほど大きくない応答を引き起こすサブス
タンスＰの用量を決定するため予備試験を設計した。こ
の試験から、上記を満足させる量か１μｇ／ｋｇである
ことがわかった。エンケファリナーゼがサブスタンスＰ
に対する応答を阻害するかどうかを調べるために別の試
験を設計した。

公知の方法［ワルツロイおよびシュワルツ（Ｍａｌｆｒ
ｏｙ　ａｎｄ　Ｓｃｈｗａｒｔｚ、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、
　Ｃｈｅｍ、　（１９８４））］を用いてラットの腎臓
からエンケファリナーゼを精製し、用いる際にｌ　Ｆｉ
／　ｚ（ｌ緩衝液に濃縮した。この緩衝液は、５００ｍ
Ｍ　メチル−α−Ｄ−グルコピラノシドおよび０．１％
トリトンｘ−ｔｏｏを含有する５ｎ＋Ｍ　ＨＥＰＥＳ（
ｐｌ（７，４）からなっていた。

サブスタンスＰを注射する１５分前に動物にこの酵素（
１００μ９、静脈内）を注射することによって、サブス
タンスＰに対する応答に及ぼすエンケファリナーゼの作
用を調べた。

これら試験の結果を第４表に示す。これらの試験は、サ
ブスタンスＰが鼻および足の皮膚の血管透過性を増加さ
せることを示している。また、サブスタンスＰ（１，０
μｇ／ｋｇ、静脈内）カエハンス・ブルー染料の透過性
を増加させ、エンケファリナーゼ（１００μｇ）が、サ
ブスタンスＰに対する４試験のうち３つにおいて皮膚の
血管の応答を阻害することもわかった。

第４表血管透過性に及ぼすエンケファリナーゼの作用 鼻　＃Ｒ−４１８Ｊ±１．１２＊　　　１２．１　　　
６６．２＃Ｒ−６５８，４３０，０５１，３ 足＃Ｒ−４９，４±２，７　　１１．１　１１８＃Ｒ−
６１１，９３，６２９，９ ＊エバンス・ブルーｆｆｌ：ｎ９／９生重ｆｆｉ実施例
１４　インビボでの気流抵抗に及ぼすエンケファリナー
ゼの作用 公知の方法［ホルツマン等（Ｉｌｏｌｔｚｍａｎ　ｅｔ
　ａｌ、、Ａｍ。

Ｒｅｖ、　Ｒｅ５ｐｉｒａｔ、　Ｄｉｓｅａｓｅ、　１
２７．６８６（１９８３））］を用いて、インビボでの
気道平滑筋に及ぼすエンケファリナー−ｄの作用を調べ
た。麻酔した動物［ベントパルビタールナトリウム３０
　ｔｔｒ９／　ｋｇ（腹腔内）またはフロラロース４０
〜６０Ｒ９／ｋｇ（静脈内）］で気流抵抗を測定した。

気管上部に気管内チューブを挿入し、一定容量の換気装
置を用い、動物の大きさに応じて換気した。イヌのよう
な大きな動物は、１分間に３０呼吸の頻度で１０１σ／
ｋｇ容量を必要とする。食道の中程に挿入したバルーン
カテーテルを用いて食道圧を測定した。肺を横切る圧力
は気管内チューブと食道カテーテルの間の圧力の差であ
る。感度の高い呼吸タコメータで気流速度を測定し、電
気的な引き算法によって気流抵抗を計算した。

エーロゾル、気管内滴下、または静脈内投与により、サ
ブスタンスＰ等のタキキニン類を投与する。気流抵抗を
約２倍増加させる量の媒介ペプチドを、気道応答の次の
研究に用いる。異なる量のエンケファリナーゼの存在下
、または非存在下でペプチドアゴニストに対する応答を
比較する。

実施例１５　インビボでの炎症細胞応答の測定好中球の
走化性、好酸球およびその他の炎症細胞の存在、ならび
にマスト細胞の脱顆粒（インビボ）を、気道およびその
他の組織からの生検試料で測定する。対照動物、サブス
タンスＰまたはその他の内生ペプチド媒介物で処理した
動物、ならびに動物を内生ペプチド類にさらす前または
後にエンケファリナーゼで前処理した動物から組織を採
取した。試料を１０％緩衝ホルマリンで固定し、パラフ
ィン中に埋め込み、各組織から厚さ４ＲＩＩの断片３つ
を得る。この断片を、ヘマトキシリン−エオシンで、次
いでナフトールΔＳ−Ｄ　クロロアセテートエステラー
ゼで染色する。それぞれの生検試料由来の各断片につい
て好中球またはその他の細胞の数を測定し、気道の炎症
を評価する。

細胞の計数は６３０×で行う。デジタイザー［クロス社
（Ｔａｌｏｓ　Ｉｎｃ、　）　；モデル６１４Ｂ］を用
いて断片（４ｘ、ｗ）の厚みおよび面積を測定し、上皮
またはその他の組織の体積を得、組織体積あたりの細胞
数で結果を表す。

実施例１６　インビボでの食道平滑筋収縮に及ぼすエン
ケファリナーゼの作用 公知の方法［レイノルズ等（Ｒｅｙｎｏｌｄｓ　ｅｔ　
ａｌ、、Ａｍ。

Ｊ、　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　（Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ
ｉｎａｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ）、　２４６゜３４６
（１９８４））］を修飾して麻酔動物の低部食道括約筋
の収縮を測定する。２つのチューブからなるカテーテル
システム（一方は流体または薬物の注入および圧力を記
録するためのものであり、他方は食道中の流体を回収す
るためのものである）を食道中に挿入し、カテーテルか
らポンプで水を入れる（流速：約０．７５ｘＱ／分）。

食道中の流体量を一定に保ち、食道を通れるように保つ
ため、食道から流体を常時抜き取る。縦方向の筋肉短縮
を防止するために食道の低部末端を固定して環状筋肉収
縮だけを記録する。圧力記録カテーテルを変換器［たと
えば、スタタム（Ｓｔａｔｈａｍ）モデルＰ２３］に接
続し、圧力をチャート式レコーダーに記録する。

実施例１７　ラットの腎性高血圧に及ぼすエンケファリ
ナーゼの作用 腎臓疾患によって動脈圧の上昇すなわち高血圧が引き起
こされることもある。ある型の腎性高血圧はレニンーア
ンギオテンシン系の活性化によるものである。レニン、
すなわち腎臓で産生されるタンパク質加水分解酵素はア
ンギオテンシノーゲンをデカペプチド、アンギオテンシ
ン■に変換し、次いでこれがアンギオテンシンＨに変換
される。

アンギオテンシン■は強力な昇圧化合物であり、この昇
圧作用を直接小動脈平滑筋に及ぼす。エンケファリナー
ゼはアンギオテンシンＩを切断し、こうしてそのアンギ
オテンシン■への変換を妨げる。従って、腎性高血圧治
療の有効な治療薬となりそうである。

以下の方法を用いて腎性高血圧に及ぼすエンケファリナ
ーゼの作用を調べる：ある腎臓動脈を狭搾して高濃度の
レニンを産生させると、次いで高レベルのアンギオテン
シンが全身高面圧中に現れる。

外科手術により大腿動脈中にカテーテルを入れ、このカ
テーテルを背中から取り出して全身の血圧をモニターす
る。これにより、麻酔されておらず、かつ拘束されてい
ない動物の血圧の正確なモニターが可能になる。動脈面
圧、レニン、アンギオテンシンｌおよびアンギオテンン
ンｎの血液レベルに及ぼすエンケファリナーゼおよびエ
ンケファリナーゼ阻害剤類の作用をモニターする。

実施例１８目におけるサブスタンスＰに及ぼすエンケフ
ァリナーゼの作用 サブスタンスＰ様の生物学的活性または免疫反応性が、
角膜および角膜縁、虹彩、毛様体、および脈絡膜を含む
目のさまざまな部分で見い出された［ストーンおよびク
ワヤマ（Ｓｔｏｎｅ、Ｒ，Ａ、　ａｎｄ　Ｋｕｗａｙａ
ｍａ、　Ｙ、　、　Ａｒｃｈ、　Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ
、　、　１０３．１２０７（１９８５））］。

サブスタンスＰ様の活性が、ニワトリ、ハト、ラット、
テンジク不ズミ、ウサギ、イヌ、ウシおよびサルを含む
種々の動物の網膜で観察された［たとえば、スジャーン
シャンッ等（Ｓｔｊｅｒｎｓｃｈａｎｔｚ、　Ｊ。

ｅｔ　ａｌ、　、　Ｊ、　Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ、　３８．１３２３−１３２８（１９８２））および
ウンガー等（υｎｇｅｒ、Ｗ、Ｇ、　ｅｔ　ａｌ、＋Ｅ
ｘｐ、Ｅｙｅ　Ｒｅｓ、、１９．３６７４７７（１９８
１））コ。

目でのサブスタンスＰの機能はわかっていない。

目の損傷に対する炎症性応答の一部として、サブスタン
スＰが逆行性の血管拡張および神経性の血漿の管外遊出
を媒介することもあることが示唆されていたしホルムダ
ール等（ｔ（ｏｌｍｄａｈｌ、Ｇ、　ｅｔ　ａｌ、＋５
ｃｉｅｎｃｅ、　２１４．１０２９（１９８１））］。

網膜、虹彩平滑筋、目の血行および血液−水性バリアー
、眼内圧力、水性体液の生成および流出におけるサブス
タンスＰの役割が再検討された［スジャーンシャンツ（
ＳＬｊｅｒｎｓｃｈａｎｔｚ、　Ｊ、　）、Ｐｈａｒｍ
ａｃ。

１ｏｇｙ　ｏ「ｔｈｅ　Ｅｙｅ、　シアーズ（Ｓｃａｒ
ｓ、　Ｍ、　Ｌ、　）編（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌ
ａｇ＋　１９７９）］。サブスタンスＰが虹彩の括約筋
に顕著な作用を有していることがわかったしマンダール
およびビル（Ｍａｎｄａｈｌ、　Ａ　ａｎｄ　Ｂｉ　Ｉ
　Ｉ、　Ａ、　、　Ａｃｔａ、　Ｔ’ｈｙｓ　ｉｏｌ、
　５ｃａｎｄ、　、　１０９．２６（１９８０））］。

また、ウサギ虹彩括約筋の神経刺激に対する収縮応答が
サブスタンスＰ類似体によって拮抗されることもあるこ
ともわかった。これらの結果は、サブスタンスＰまたは
密接に関連したペプチドがこの応答に特異的に関与して
いることを示唆する「リーンター（Ｌｃａｎｄｅｒ、　
Ｊ、　、　Ａｃｔａ、　Ｐｈｙｓ　ｉｏｌ、　５ｃａｎ
ｄ、　、　１１２．１８５−１９３（１９８ｔ））］。

重篤な損傷の後に、インビボで強い持続した縮瞳を伴う
瞳孔のブロックおよび眼内圧力の増加が観察された［ア
ル−チャシャン等（ＡＩ−Ｃｈａｄｙａｎ、　Ａ、　ｅ
ｔ　ａｌ、　、　Ｉｎｖｅｓｔ、　Ｏｐｈｔｈａｌｍｏ
ｌ、　Ｖｉｓ、　Ｓｃｉ、　、　１８．３６１−３６５
（１９７９））　；スジャーンシャンッ等（Ｓｔｊｅｒ
ｎｓｃｈａｎｔｚ、　Ｊ、　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｉｎｖ
ｅｓｔ、　Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ、　Ｖｉｓ、　Ｓｃｉ
、　、　２０、５３−６０（１９８１））］。このよう
に、目の重篤な損傷への応答に、または白内障の外科手
術中に観察される持続した強い縮瞳にサブスタンスＰが
関与していることもある。

目の前室に高用量（≧ｌ　ａｇ）のサブスタンスＰを注
射すると眼内圧力の増加を誘導した［マンダールおよび
ビル（Ｍａｎｄａｈｌ、Ａ　ａｎｄ　Ｂ１１１．＾、　
、　Ａｃｔａ、　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　５ｃａｎｄ、　、
月２．３３１−３３８（１９８１））　；スジャーンシ
ャンツ等（Ｓｔｊｅｒｎｓｃｈａｎｔｚ、Ｊ、　ｅｔ　
ａｌ、、　Ｉｎｖｅｓｔ、Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ、　Ｖ
ｉｓ、　Ｓｃｉ、　、　２０．５３−６０（１９８１）
）］。低用量（≦ｌＯｎｇ）のときは、縮瞳は誘導する
が、検出しうる眼内圧力の増加は誘導しなかった［ニシ
ャナ等（Ｎｉｓｈｉｙａｎａ、　Ａ、　ｅｔ　ａｌ、　
、　Ｊｐｎ、　Ｊ、　０ｐｈｔｈａ１．　、２５．３６
２−３６９（１９８１））］。

エンケファリナーゼはサブスタンスＰを切断するので、
白内障手術の前、間または直後にエンケファリナーゼを
投与すると、強い縮瞳および眼圧力の増加を妨げそうで
ある。局所的に適用した薬物の作用を調べるために種々
のウサギ眼モデル、たとえば無水晶体ウサギモデルを用
いて、強い縮瞳および眼圧力の増加に及ぼすエンケファ
リナーゼの作用を調べることができる［ミレート等（Ｍ
ｉｒａｔｅ、　Ｄ、　Ｊ、　ｅＬ　ａｌ、　、　Ｃｕｒ
ｒ、　Ｅｙｅ　Ｒｅｓ、　、　１（８）、　４９１−４
９３（１９８１））およびアンダーソン等（＾ｎｄｅｒ
ｓｏｎ、Ｊ、Ａ、　ｅｔ　ａｌ。

、　Ａｒｃｈ、　ＯｐＬｈａｌｍｏｌ、　、　＋００（
４）、　６４２−６４５（１９ｇ２））］。エンケファ
リナーゼを投与するか、または投与しない手術の間の、
瞳孔および虹彩括約筋の収縮、ならびに眼内圧力および
目の領域への薬物吸収をモニターする。

【図面の簡単な説明】

第１図は３Ｓ３Ｑ４で標識した高分子（硫酸塩フラック
ス）の放出によって測定した、サブスタンスＰ（ＳＰ）
Ｘ導性分泌の濃度依存性（平均値上ＳＥ）を示すグラフ
、第２図は１頭のフェレット獣由来の２セグメントから
の硫酸塩フラックスに対するサブスタンスＰのフラグメ
ントの影響を示すグラフ、第３図は１頭のフエレノト獣
由来の１組織からの硫酸塩フラックスにおけるサブスタ
ンスＰ（ＳＰ）誘導性変化に対するブロテイナーゼ阻害
物質の影響を示すグラフ、第４図は１頭のフエレソト獣
気管ＦＩＪ来の組織からの硫酸塩フラックス（平均値士
ＳＥ）におけるサブスタンスＰ誘導変化に対するプロテ
イナーゼ阻害物質の影響を示すグラフ、第５図は６頭の
フェレット獣由来の気管セグメントからのサブスタンス
Ｐ誘導硫酸塩フラックス（平均値±ＳＥ）に対するエン
ケファリナーゼ阻害物質チオルファンの濃度増加の影響
を示すグラフ、第６図はフエレノト獣気管からの”ｓｏ
、標識高分子の放出におけるタキキニンおよびエンケフ
ァリナーゼ阻害物質、ホスホラミトンの影響を示すグラ
フ、第７図はトリプシンの、３頭のフエレット獣におけ
るエンケファリナーゼ活性およびサブスタンスＰ誘導粘
液分泌に対する影響を示すグラフ、第８図はフェレット
獣気管の平滑筋から単離されたセグメントにおける活性
張力に対するサブスタンスＰ（ＳＰ）およびエンケファ
リナーゼ阻害物質、ロイーチオルファンの影響を示すグ
ラフ、第９図はフエレット獣の気管平滑筋から単離した
セグメントにおいて、エンケファリナーゼ阻害物質ロイ
ーチオルファン（１０−５Ｍ）の存在下、サブスタンス
Ｐ（１０−’Ｍ）によって産生される活性な張力に対す
る、レセプターアンｉゴニストの影響を示すグラフ、第
１０図はフエレノト獣の気管平滑筋から単離したセグメ
ントにおいて、電場刺激（５Ｈ２）によって産生される
活性な張力に対するサブスタンスＰ十エンケファリナー
ゼ阻害物質ロイーチオルファンの影響を示すグラフ、第
１１図はフェレノト獣の気管平滑筋から単離したセグメ
ントにおいて、電場刺激（５Ｈ２）によって産生される
活性な張力に対するエンケファリナーゼ阻害物質ロイー
チオルファン及びサブスタンスＰアンタゴニスト、（Ｄ
　Ｐｒｏ”、　ＤＴｒｐ”’）Ｓ　Ｐの影響を示すグラ
フ、第１２図はフエレソト獣気管平滑筋から単離したセ
グメントにおける活性な張力に対するサブスタンスｐ（
ｓｐ）（△）、ノイロキニンΔ（ＮＫ−Ａ）（○）、ノ
イロキニンＢ（ＮＫ−Ｂ）（ロ）、およびエンケファリ
ナーゼ阻害物質、ロイーチオルファン（塗り潰した印）
の影響を示すグラフ、第１３図はフェレット獣の気管平
滑筋から単離したセグメントにおける、サブスタンスＰ
（ＳＰ）、ノイロキニンＡ（ＮＫ−Ａ）、ノイロキニン
Ｂ（ＮＫ−Ｂ）誘導活性張力に対するエンケファリナー
ゼ阻害物質、ロイーチオルファンの収縮増加作用を示す
グラフ、第１４図はフエレット獣の気管平滑筋から単離
したセグメントにおいて電場刺激下（５Ｈ２）に産生さ
れる活性な張力に対するサブスタンスＰ（ＳＰ）、ノイ
ロキニンＡ（ＮＫ−Ａ）およびノイロキニンＢ（ＮＫ−
Ｂ）、並びにタキキニンレセプターアンタゴニストであ
る（Ｄ　Ｐ　ｒｏ”、　Ｄ　Ｔ　ｒｐ’”）ｓｐの影響
を示すグラフ、第１５図はフェレット獣の気管平滑筋か
ら単離したセグメントの活性な張力に対するブラジキニ
ン（Ａ）またはりスープラジキニン（Ｂ）およびエンケ
ファリナーゼ阻害物質ロイーチオルファン（１０−５Ｍ
）の収縮増加作用を示すグラフである。第１６図はフェ
レット獣の回腸平滑筋から単離した縦方向セグメントに
おける活性張力に対するサブスタンスＰおよびエンケフ
ァリナーゼ阻害物質ロイーチオルファン（１０−５Ｍ　
）の収縮増強作用を示すグラフ、第１７図はラットエン
ケファリナーゼのアミノ酸配列の模式図、第１８図はヒ
トエンケファリナーゼのアミノ酸配列の模式図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、エンケファリナーゼまたはその機能的な誘導体と薬
   学的に許容し得る担体とを含有する医薬製剤。 ２、エンケファリナーゼ誘導体が細胞質領域を欠失して
   いるものである第１項記載の製剤。 ３、担体が表皮適用のための軟膏である第１項記載の製
   剤。 ４、エンケファリナーゼがトランスメンブラン領域を欠
   失しているものである第１項記載の製剤。 ５、薬学的に用いるためのエンケファリナーゼおよびそ
   の機能的な誘導体。 ６、エンケファリナーゼによって開裂され易い内因性ペ
   プチドが関与している病理学的疾患の治療のための医薬
   製剤であってエンケファリナーゼまたはその機能的な誘
   導体を含有する製剤。 ７、内因性ペプチドがタキキニン類である第６項記載の
   製剤。 ８、内因性ペプチドがサブスタンスＰである第７項記載
   の製剤。 ９、内因性ペプチドがノイロキニンＡである第７項記載
   の製剤。 １０、内因性ペプチドがノイロキニンＢである第７項記
   載の製剤。 １１、内因性ペプチドがフィサレミンである第７項記載
   の製剤。 １２、内因性ペプチドがカシニンである第７項記載の製
   剤。 １３、内因性ペプチドがエレドイシンである第７項記載
   の製剤。 １４、内因性ペプチドが走化性ペプチドである第６項記
   載の製剤。 １５、内因性ペプチドがアンギオテンシン I である第
   ６項記載の製剤。 １６、内因性ペプチドがボンベシンである第６項記載の
   製剤。 １７、内因性ペプチドがキニン類である第６項記載の製
   剤。 １８、内因性ペプチドがブラジキニンである第１７項記
   載の製剤。 １９、内因性ペプチドがカリジンである第１７項記載の
   製剤。 ２０、病理学的疾患が炎症である第６項記載の製剤。 ２１、病理学的疾患がアレルギー性皮膚炎である第６−
   １０項のいずれかに記載の製剤。２２、病理学的疾患が
   気道の疾患である第６項記載の製剤。 ２３、気道疾患が喘息である第２２項記載の製剤。 ２４、病理学的疾患がタキキニン類および／またはキニ
   ン類に関連した咳である第１項記載の製剤。 ２５、病理学的疾患が腫瘍である第６項記載の製剤。 ２６、病理学的疾患がカルシノイド腫瘍に関連した疾患
   である第２５項記載の製剤。 ２７、腫瘍が肺小細胞癌である第２５項記載の製剤。 ２８、病理学的疾患が腎性高血圧である第６項記載の製
   剤。 ２９、エンケファリナーゼが細胞質領域およびトランス
   メンブラン領域を欠くものである第６−２８項のいずれ
   かに記載の製剤。 ３０、エンケファリナーゼが細胞質領域を欠くものであ
   る第６−２８項のいずれかに記載の製剤。 ３１、エンケファリナーゼがトランスメンブラン領域を
   欠くものである第６−２８項のいずれかに記載の製剤。 ３２、エンケファリナーゼが随伴する固有のグリコシル
   化を伴っていないものである第６−３１項のいずれかに
   記載の製剤。 ３３、筋肉内投与するための第６−３２項のいずれかに
   記載の製剤。 ３４、静脈内投与するための第６−３２項のいずれかに
   記載の製剤。 ３５、肺内吸入によって投与するための第６−３２項の
   いずれかに記載の製剤。 ３６、局所投与するための第６−３２項のいずれかに記
   載の製剤。 ３７、エンケファリナーゼを約０．００１ｍｇ／Ｋｇ−
   約２５ｍｇ／Ｋｇの治療有効量で投与するための第６−
   ３２項のいずれかに記載の製剤。 ３８、エンケファリナーゼを約０．０１ｍｇ／Ｋｇ−約
   ２０ｍｇ／Ｋｇの治療有効量で投与するための第３６項
   記載の製剤。