BRPI0708672A2

BRPI0708672A2 - métodos para a regulagem de mediadores inflamatórios e peptìdeos úteis nos mesmos.

Info

Publication number: BRPI0708672A2
Application number: BRPI0708672-5A
Authority: BR
Inventors: Shuji Takashi; Indu Parikh; Kenneth B Adler; Linda D Martin; Yuehua Li
Original assignee: Biomarck Pharmaceuticals Ltd; Univ North Carolina State
Priority date: 2006-03-06
Filing date: 2007-03-06
Publication date: 2012-05-29
Also published as: SG10201405436WA; ZA200807626B; CN101500593A; IL193846A0; EP1991250A4; WO2007103368A2; US8563689B1; KR20090069255A; MX2008011375A; AU2007223983A1; RU2008139414A; CN101500593B; EP1991250A2; WO2007103368A3; IL193846A; US20060217307A1; CA2645019A1; JP2009531307A; US7544772B2; SG170082A1

Abstract

MéTODOS PARA A REGULAGEM DE MEDIADORES INFLAMATóRIOS E PEPTìDEOS úTEIS NOS MESMOS A invenção atual inclui métodos para a modulação de processos de secreção celular. Mais especificamente, a invenção atual refere-se à modulação ou redução da liberação de mediadores inflamatórios a partir da células inflamatórias, através, da inibição do mecanismo associado com a liberação de mediadores inflamatórios das veslculas ou grânulos das células inflamatórias. A este respeito, a invenção atual apresenta um mecanismo de sinalização intracelular que ilustra vários objetivos intracelulares novos para a intervenção farmacológica em distúrbios envolvendo a secreção de mediadores inflamatórios das vesículas em células inflamatórias. O peptídeo MANS e os fragmentos ativos do mesmo são úteis em tais métodos.

Description

"MÉTODOS PARA A REGULAGEM DE MEDIADORES INFLAMATÓRIOS E PEPTÍDEOS ÚTEIS NOS MESMOS"

Referência cruzada a solicitações relacionadas

Esta solicitação reivindica prioridade para a solicitação de patente americana núme- ro 11/367.449, depositada em 6 de março de 2006, que é uma solicitação da continuação- em-parte da solicitação de patente americana número 10/802.644, depositada em 17 de março de 2004, que é uma solicitação da continuação da solicitação de patente americana número 10/180.753, depositada em 26 de junho de 2002, agora abandonada, que reivindica prioridade para a solicitação provisória americana número 60/300.933, depositada em 26 de junho de 2001, as apresentações das quais são incorporadas aqui como referência na sua integridade.

Declaração do Apoio Federal

Esta invenção foi feita com o apoio do Governo Federal dos EUA sobre o número de concessão R01 HL36982 do "National Institute of Health". O Governo dos EUA poderá ter certo direitos nesta invenção.

Campo da invenção

A invenção atual refere-se a métodos de modelagem de processos de secreção ce- lular. Mais especificamente, a invenção atual refere-se à modelagem da liberação de media- dores inflamatórios. A invenção atual também se refere à regulagem do mecanismo de sina- lização intracelular da secreção de mediadores inflamatórios de vesículas ou grânulos liga- dos à membrana em células inflamatórias.

Antecedentes da invenção

A hipersecreção de muco contribui para a patogênese de um grande número de doenças inflamatórias das vias respiratórias, tanto em seres humanos como em animais não humanos. Uma secreção aumentada de muco é vista em estados de doenças crônicas, tais como asma, COPD e bronquite crônica; em doenças genéticas, como fibrose cística; em condições alérgicas (atopia, inflamação alérgica); em bronquiectasia; e em uma quantidade de doenças respiratórias agudas infecciosas, tais como pneumonia, rinite, influenza ou o resfriado comum.

Acompanhando a hipersecreção de muco com em muitas destas doenças respirató- rias está a presença constante de células inflamatórias nas vias respiratórias. Estas células contribuem grandemente para a patologia destas doenças, através de danos no tecido feitos pelos mediadores inflamatórios liberados destas células. Um exemplo de tal destruição atra- vés desta inflamação crônica ocorre em pacientes de fibrose cística, onde os mediadores liberados de neutrófilos (por exemplo, mieloperoxidase) induzem à descamação do tecido epitelial das vias respiratórias.

A falta de secreção de muco também tem efeitos prejudiciais. O muco das vias res- piratórias atua como uma barreira física contra as partículas inaladas biologicamente ativas, e poderá auxiliar a evitar a colonização bacteriana das vias respiratórias e inativar os produ- tos citotóxicos liberados dos leucócitos. King et al., Respir. Physiol. 62: 47 - 59 (1985); Vish- wanath and Ramphal1 Infect. Immun. 45: 197 ( 1984); Cross et al., Lancet 1: 1328 (1984). No olho, o muco mantém o filme de lágrima, e é importante para a saúde e o conforto do olho. A secreção de muco do trato gastrintestinal também tem uma função citoprotetora. A função do muco como uma barreira química, biológica e mecânica significa que a secreção de mu- co normalmente baixa das membranas mucosas é indesejável.

As vias respiratórias dos mamíferos são cobertas por uma camada fina de muco produzida e secretada pela células epiteliais das vias respiratórias (goblet) e pelas glândulas submucosais. Em doenças das vias respiratórias, tais como asma, bronquite crônica, e fi- brose cística, a hipersecreção de muco é um sintoma comum. O excesso de muco pode contribuir para a obstrução e a suscetibilidade à infecção. Os componentes principais do muco são glícoproteínas de mucina sintetizadas pelas células secretoras e estocadas dentro dos grânulos citoplásmicos. As mucinas são uma família de glícoproteínas secretadas pelas células epiteliais, incluindo aquelas nos tratos respiratório, gastrintestinal e reprodutivo das mulheres. As mucinas são responsáveis pelas propriedades visco-elásticas do muco e são conhecidos pelo menos oito genes de mucina. Thornton, et al., J. Biol. Chem. 272, 9561- 9566 (1997). O enfraquecimento mucociliar provocado pela hipersecreção de mucina e/ou hiperplasia das células do muco leva ao entupimento de muco nas vias respiratórias que promove a infecção crônica, a obstrução do fluxo de ar e algumas vezes, a morte. Várias doenças das vias respiratórias, como bronquite crônica, doença pulmonar obstrutivas crôni- ca, bronquiectasia, asma, fibrose cística e infecções bacterianas são CARACTERIZADAS pela superprodução de mucina. E. Prescott, et al., Eur. Respir. J., 8: 1333 - 1338 (1995); K. C. Kim, et al., Eur. Respir. J., 10: 1438 (1997); D. Steiger, et al. Am. J. Respir. Cell Mol, Biol., 12: 307 - 314 (1995). Com a estimulação apropriada, os grânulos de mucina são liberados através de um processo exocitótico no qual os grânulos se transferem para a periferia da célula onde as membranas do granulo são fundidas com a membrana do plasma, permitindo a secreção Iuminal do conteúdo.

Apezar da importância patofisiológica óbvia deste processo, os mecanismos de si- nalização intracelular ligando a estimulação na superfície da célula à liberação do granulo de mucina só recentemente foram elucidados. Ver, Li et al., Journal of Biological Chemistry, 276: 40.982 - 40.990 (2001). Sabe-se que uma larga variedade de agentes mediadores in- flamatórios/humorais provocam a secreção de mucina. Estes incluem os agonistas colinérgi- cos, mediadores de lipídios, oxidantes, citoquinas, neuropeptídeos, ATP e UTP, produtos bacterianos, elastase de neutrófilo, e poluentes inalados. Ver, Adler et al., Res. Immunol. 149, 245 - 248 (1998). Interessantemente, vários destes secretagogos de mucina são tam- bém conhecidos como ativando várias proteína quinases, e estudos examinando a regula- ção do excesso de secreção de mucina pelas células epiteliais das vias respiratórias de vá- rias espécies consistentemente implicaram o envolvimento da proteína quinase C (PKC) ou da proteína quinase dependente cGMP (PKG) no processo de secreção. Ver, por exemplo, Ko et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 16, 194 - 198 (1997); Abdullah et al, Am. J. Physiol. 273, L201 -L210 (1997); Abdullah et al., Biochem. J. 316, 943 - 954 (1996); Larivee et al. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 11, 199 - 205 (1994); e Fischer et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 20, 413 - 422 ( 1999). As interações coordenadas ou "cruzadas" entre estas duas pro- teína quinases na regulagem da secreção de mucina só recentemente foram demonstradas, envolvendo a proteínas MARCKS. Ver, Li et al., Journal of Biological Chemistry, 276: 40.982 - 40.990 (2001). No entanto, a sinalização dos eventos a jusante da ação coordenada des- tas proteína quinases que finalmente leva à liberação exocitótica de grânulos de mucina, não foi totalmente elucidada.

MARCKS, uma proteína com aproximadamente 82 kD, tem três regiões conserva- das evolucionalmente (Aderem et al., Nature 1988; 332:362 - 364; Thelen et al., Nature 1991; 351: 320 - 322; Hartwig et al., Nature 1992; 356: 618 - 622; Seykora et al., J Biol Chem 1996; 271: 18.797 - 18.802): um términus N, um domínio de sítio de fosforilação (PSD), e um domínio múltiplo de homologia 2 (MH2). O términus N, uma seqüência de 24 aminoácidos com um radical de ácido mirístico ligado a um resíduo terminal de glicina é en- volvido na ligação de MARCKS a membranas (Seykora et al., J Biol Chem 1996; 271: 18.797 - 18.802) e possivelmente à calmodulina (Matsubara et al., J Biol Chem 2003; 278: 48.898- 48.902). Esta seqüência de 24 aminoácidos é conhecida como o peptídeo MANS. O peptídeo MANS e os fragmentos ativos do mesmo, podem competir com o MARCKS nativo em células para a ligação com a membrana. O envolvimento da proteína MARCKS da Iibe- ração de mediadores inflamatórios dos grânulos dos leucócitos de infiltração é relevante para a inflamação em doenças em todos os tecidos e órgãos, incluindo doenças do pulmão caracterizadas pela inflamação das vias respiratórias, como asma, COPD e fibrose cística. No entanto, a inflamação e a secreção do muco das vias respiratórias são dois processos separados e independentes (Li et al., J Biol Chem 2001; 276: 40.982 - 40.990; Singer et al., Nat Med 2004; 10: 193 - 196). Embora a produção e secreção de muco possa ser provoca- da por vários fatores, incluindo os mediadores liberados pelas células inflamatórias, não e- xiste nenhuma ligação direta conhecida entre o excesso de muco e a inflamação.

Sumário da invenção

A invenção se refere a um novo uso para o polipeptídeo miristoilado de 24 aminoá- cidos, também conhecido como o peptídeo MANS. A invenção também se refere a um mé- todo novo para bloquear qualquer processo de secreção celular, especialmente aqueles que envolvem a liberação de mediadores inflamatórios de células inflamatórias, cujas rotas esti- muladoras envolvem a proteína quinase C (PKC) o substrato da proteína MARCKS e a libe- ração do conteúdo das vesículas ou grânulos intracelulares.

A invenção atual é direcionada para um método de inibição da liberação exocitótica de pelo menos um mediador inflamatório de pelo menos uma célula inflamatória composta do contato pelo menos de uma célula inflamatória, cuja célula é composta pelo menos de um mediador inflamatório contido dentro de uma vesícula dentro da célula, com pelo menos um peptídeo escolhido do grupo consistindo de um peptídeo MANS e um fragmento ativo do mesmo, em uma quantidade efetiva para reduzir a liberação do mediador inflamatório da célula inflamatória quando comparado com a liberação do mediador inflamatório do mesmo tipo de célula inflamatória que ocorreria na ausência pelo menos de um peptídeo.

A invenção atual é adicionalmente direcionada para um método de inibição da libe- ração pelo menos de um mediador inflamatório de pelo menos uma célula inflamatória em um tecido ou fluido de um indivíduo, composto da administração ao tecido e/ou fluido do indivíduo, que é composto pelo menos de uma célula inflamatória composta pelo menos de um mediador inflamatório contido dentro de uma vesícula dentro da célula, de uma quanti- dade terapeuticamente efetiva de uma composição farmacêutica composta pelo menos de um peptídeo escolhido do grupo consistindo de um peptídeo MANS e um fragmento ativo do mesmo em uma quantidade terapeuticamente efetiva para reduzir a liberação do mediador inflamatório de pelo menos uma célula inflamatória quando comparado com a liberação do mediador inflamatório de pelo menos um do mesmo tipo de célula inflamatória que ocorreria na ausência de pelo menos um peptídeo. Mais especificamente, a inibição da liberação de um mediador inflamatório é composta do bloqueio ou redução da liberação de um mediador inflamatório da célula inflamatória.

Mais especialmente, a invenção atual inclui um método de redução da inflamação em um indivíduo, composto da administração de uma quantidade terapeuticamente efetiva de uma composição farmacêutica composta de um peptídeo MANS [i.e., N-miristoil- GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAV (SEQ ID N0:20)] ou de um fragmento ativo do mesmo. O fragmento ativo tem um comprimento de pelo menos seis aminoácidos. Conforme utiliza- do aqui, um "fragmento ativo" de uma proteína MARKS é um que afeta (inibe ou aumenta) a liberação mediada pela proteína MARCKS. Um fragmento ativo pode ser escolhido do grupo consistindo de N-miristoil- GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAA (SEQ ID NO:3); N-miristoil- GAQFSKTAAKGEAAAERPGEA (SEQ ID NO:4); N-miristoil-GAQFSKTAAKGEAAAERPGE (SEQ ID NO:5); N-miristoil-GAQFSKTAAKGEAAAERPG (SEQ ID NO:6) ; N-miristoil- GAQFSKTAAKGEAAAERP (SEQ ID NO:7); N-mirístoil-GAQFSKTAAKGEAAAER (SEQ ID NO:8); N-miristoil-GAQFSKTAAKGEAAAE (SEQ ID NO:9); N-miristoil- GAQFSKTAAKGEAAA (SEQ ID NO: 10); N-miristoil-GAQFSKTAAKGEAA (SEQ ID NO:11); N-miristoil-GAQFSKTAAKGEA (SEQ ID NO: 12); N-miristoil-GAQFSKTAAKGE (SEQ ID NO: 13); N-miristoil-GAQFSKTAAKG (SEQ ID NO: 14); N-miristoil-GAQFSKTAAK (SEQ ID NO: 15); N-miristoil-GAQFSKTAA (SEQ ID NO:16); N-miristoil-GAQFSKTA (SEQ ID NO:17); N-miristoil-GAQFSK (SEQ ID NO: 18); e N-miristoil-GAQFSK (SEQ ID NO: 19); A presença do radical hidrófobo de miristato terminal N nestes peptídeos pode aumentar a sua compati- bilidade com e presumivelmente a sua permeabilidade a membranas de plasma, e potenci- almente viabilizar os peptídeos a serem tomados pelas células. A inserção hidrófoba de mi- ristato em uma camada dupla pode produzir um coeficiente de partição ou uma constante de associação aparente com lipídios de até 104 M"1 ou uma energia de aglutinação livre Gibbs em torno de 8 kcal/mol (ver, por exemplo, Peitzsch, R.M., e McLaughIin1 S. 1993, Aglutina- ção de peptídeos acilados e de ácidos graxos com vesículas de fosfolipídios: pertinência com as proteínas miristoiladas. Biochemistry 32: 10.436 - 10.443) que é suficiente, pelo me- nos em parte, para permitir uma partição do peptídeo MANS e dos fragmentos de peptídeo MANS miristoilados conforme descrito aqui na membrana do plasma de uma célula enquan- to os grupos funcionais adicionais e as suas interações dentro do peptídeo MANS (que é miristoilado) e dentro dos fragmentos de peptídeo MANS miristoilado podem potencializar as suas permeabilidades relativas de membrana. Os fragmentos, cada um deles pode exibir coeficientes de partição e afinidades de membrana que são representativos da sua estrutura respectiva. Os fragmentos podem ser preparados por métodos de síntese de peptídeos co- nhecidos na arte, tais como pela síntese de peptídeos em fase sólida (ver, por exemplo, os métodos descritos em Chan, Weng C. and White1 Peter D.Eds., Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, Oxford University Press1 New York1 New York ( 2000); e Lloyd-Williams, P. et al. Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins (1997) ) e purificado por métodos conhecidos na arte, como por cromatografia líquida em alta pressão. O peso molecular de cada peptídeo pode ser confirmado por espectroscopia de massa com cada um deles mostrando um pico com um a massa molecular apropriada. A eficácia dois peptídeos individuais e de combinações de peptídeos individuais (por exemplo, combinações de dois dos peptídeos, combinações de três dos peptídeos, combinações de quatro dos peptídeos) nos métodos desta apresentação podem ser rapidamente determina- dos sem uma experiência indevida, utilizando os procedimentos descritos nos exemplos apresentados aqui. Uma combinação preferida será composta de dois dos peptídeos; uma relação molar preferida dos peptídeos pode ser de 50:50 a 99,99 a 0,01, cuja relação pode ser imediatamente determinada utilizando-se os procedimentos descritos nos exemplos a- presentados aqui.

De preferência, o peptídeo MANS ou um fragmento ativo do mesmo é contido em uma composição farmacêutica que é útil para bloquear a inflamação. A invenção atual tam- bém inclui métodos para a regulagem de um processo de secreção celular em um indivíduo, que são compostos da administração de uma quantidade terapeuticamente efetiva de um composto constituído de um peptídeo MANS ou de um fragmento ativo do mesmo, que re- gula um mediador inflamatório em um indivíduo. A administração geralmente é escolhida do grupo consistindo de administração tópica, administração parenteral, administração retal, administração pulmonar, inalação e administração nasal ou oral, onde a administração pul- monar geralmente inclui um aerossol, um inalador de pó seco, um inalador de dose medida, ou um nebulizador.

A administração de uma composição composta de uma quantidade de inibição- desgranulação do peptídeo MANS ou uma quantidade de inibição-desgranulação de um fragmento ativo do mesmo, como uma composição farmacêutica do peptídeo MANS ou de um fragmento ativo do mesmo, para o uso humano ou animal, produz o peptídeo MANS ou o fragmento ativo do mesmo pelo menos para o sítio dentro ou sobre um tecido ou para uma camada contendo fluido ou contendo muco em contato com a superfície de um tecido onde reside uma célula granulocítica inflamatória ou para dentro do qual invadirá uma célula gra- nulocítica inflamatória, dessa forma permitindo que o peptídeo MANS ou um fragmento ativo do mesmo contate a célula granulocítica inflamatória. Em um aspecto, a administração de tal composição pode ser feita no primeiro início ou na primeira detecção da inflamação ou na primeira percepção de inflamação pelo ser humano ou pelo animal ou na primeira alteração perceptível no nível de inflamação em um ser humano ou em um animal para reduzir a quantidade de inflamação que de outra forma iria ocorrer na ausência do peptídeo MANS ou do fragmento ativo do mesmo. Em outro aspecto, a administração pode ser feita durante o início de uma inflamação de um tecido no ser humano ou em um animal para reduzir a quantidade de inflamação adicional que de outra forma ocorreria na ausência do peptídeo MANS ou do fragmento ativo do mesmo. Embora a quantidade e a freqüência da dose pos- sa ser determinada pela avaliação clínica e ser uma função da doença ou da fonte de infla- mação e da extensão do tecido envolvido e da idade e do tamanho do paciente, prevê-se que a dosagem de uma composição farmacêutica pode ser repetida depois de 3 a 8h, de preferência, depois de 6 a 8h, após a primeira administração da composição farmacêutica.

A invenção atual também inclui métodos para a redução da inflamação em um indi- víduo, compostos da administração de uma quantidade terapeuticamente efetiva de um composto que inibe a liberação relacionada com MARCKS de mediadores inflamatórios, através do que é reduzida a liberação de pelo menos um mediador inflamatório no indivíduo em comparação com aquela que ocorreria na ausência do referido tratamento. Conforme utilizado aqui "redução" significa geralmente uma diminuição dos efeitos da inflamação. De preferência, os mediadores inflamatórios são inibidos ou bloqueados pelos métodos apre- sentados.

Outra realização da invenção atual inclui métodos de redução da inflamação em um indivíduo, compostos da administração de uma quantidade terapeuticamente efetiva de um composto que inibe a liberação relacionada com MARCKS de mediadores inflamatórios, através do que a inflamação do indivíduo é reduzida, em comparação com aquela que ocor- reria na ausência do referido tratamento. A invenção atual também apresenta métodos de redução ou inibição da inflamação em um indivíduo, que são compostos da administração de uma quantidade terapeuticamente efetiva de um peptídeo MANS ou de um fragmento ativo do mesmo que é efetivo para modular um mediador inflamatório no sítio de inflamação. O termo "inibição" significa uma redução na quantidade de secreção do mediador inflamató- rio. O termo "inibição completa" significa uma redução para zero na quantidade de secreção do mediador inflamatório. Outra vez, conforme mencionado acima, o fragmento ativo tem pelo menos um comprimento de 6 aminoácidos. O termo "processo exocitótico" significa exocitose, i.e., um processo de secreção ou excreção celular no qual as substâncias conti- das em uma vesícula, cuja vesícula reside dentro de uma célula, são descarregados da cé- lula através de fusão da membrana vesicular da vesícula com a membrana celular externa. "Desgranulação" significa a liberação do conteúdo celular do grânulo. O termo "desgranula- ção-inibição" significa uma redução na liberação de mediadores inflamatórios contidos den- tro dos grânulos da célula inflamatória. Assim sendo, uma quantidade de desgranulação- inibição do peptídeo MANS e/ou de um fragmento ativo do mesmo é a quantidade destes peptídeos que é suficiente para reduzir a liberação dos mediadores inflamatórios contidos nos grânulos, quando comparado com a liberação na ausência do mesmo peptídeo.

O peptídeo MANS e os fragmentos ativos do mesmo podem ser úteis na prevenção ou redução de uma quantidade de inflamação em um tecido em um animal causado pelos mediadores inflamatórios. O peptídeo MANS e os fragmentos ativos do mesmo podem ser úteis na prevenção ou redução na quantidade de danos do tecido em um animal produzidos ou provocados por mediadores inflamatórios.

Breve descrição dos desenhos

As figuras 1A-1D são gráficos de barra ilustrando como a hipersecreção de mucina pelas células NHBE é maximizada pela ativação de ambos o PKC e o PKG.

As figuras 2A- 2B demonstram que a proteína MARCKS é um componente chave do caminho de secreção de mucina.

As figuras 3A- 3C detalham um gel ilustrando que um oligonucleotide antisenso di- recionado contra o MARCKS reduz a regulagem da expressão do MARCKS e atenua a hi- persecreção de mucina.

As figuras 4A- 4B ilustram que a fosforilação dependente de PKC libera o MARCKS da membrana de plasma para o citoplasma.

As figuras 5A- 5C mostram que o PKG induz a desfosforilação do MARCKS através da ativação de PP2A.

A figura 6 detalha gráficos de barra que demonstram que o PP2A é um componente essencial do caminho de secreção de mucina.

A figura 7 é um gel que ilustra que o MARCKS é associado com actina e miosina no citoplasma.

A figura 8 detalha um mecanismo de sinalização controlando a secreção de mucina pela células epiteliais das vias respiratórias humanas.

A figura 9 é um gráfico de barras detalhando a habilidade do peptídeo MANS para bloquear a secreção de miloperoxidase dos neutrófilos caninos isolados.

A figura 10 é um gráfico de barras detalhando a habilidade do peptídeo MANS de bloquear a secreção de miloperoxidase de neutrófilos humanos isolados.

A figura 11 é um gráfico de barras mostrando que o PMA estimula um pequeno aumento na secreção de MPO dos neutrófilos humanos estimulados por LPS que é aumen- tado de uma forma dependente da concentração através das estimulação conjunta com 8- Br-cGMP.

A figura 12 é um gráfico de barras mostrando que a estimulação por 8-Br-cGMP tem pouco efeito na secreção MPO dos neutrófilos humanos estimulados por LPS até que ocorra uma estimulação conjunta com PMA em uma forma dependente da concentração.

A figura 13 é um gráfico de barras mostrando que o PMA estimula um pequeno aumento na secreção de MPO dos neutrófilos caninos estimulados por LPS que é aumenta- do de uma forma dependente da concentração através da estimulação conjunta com 8-Br- cGMP.

A figura 14 é um gráfico de barras mostrando que a estimulação de 8-Br-cGMP tem pouco efeito na secreção de MPO dos neutrófilos caninos estimulados por LPS até que o- corra uma estimulação conjunta com PMA em uma forma dependente da concentração.

A figura 15 é um gráfico de barras mostrando que a estimulação conjunta com PMA+8-Br-cGMP é requerida para a secreção MPO maximal a partir dos neutrófilos caninos estimulados por LPS.

Descrição detalhada da invenção

A invenção atual será agora descrita de forma mais completa, daqui por diante, com referência aos desenhos anexos, nos quais as realizações preferidas da invenção são ilus- tradas. A invenção poderá, no entanto, ser incorporada de formas diferentes e não deve ser considerada como limitada às realizações apresentadas aqui. Ao contrário, estas realiza- ções são apresentadas de forma que esta apresentação seja extensa e completa, e apre- sentará de forma completa o escopo da invenção para aqueles adestrados na arte.

A não ser que seja definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos utilizados aqui têm o mesmo significado comumente entendido por uma pessoa adestrada na arte a qual pertence esta invenção. Todas as publicações, solicitações de patente, paten- tes, e outras referências mencionadas aqui são incorporadas como referência na sua inte- gridade. O uso das palavras "um" ou "uma" aqui para descrever qualquer aspecto da inven- ção atual deve ser interpretado como indicando um ou mais.

A invenção atual é direcionada para um método de inibição da liberação exocitótica de pelo menos um mediador inflamatório de pelo menos uma célula inflamatória, que é composto do contato de pelo menos uma célula inflamatória, cuja célula é composta pelo menos de um mediador inflamatório contido dentro de uma vesícula dentro da célula, com pelo menos um peptídeo escolhido do grupo consistindo de um peptídeo MANS e um frag- mento ativo do mesmo, em uma quantidade efetiva para reduzir a liberação do mediador inflamatórios da célula inflamatória quando comparado com a liberação do mediador infla- matório do mesmo tipo de célula inflamatória que ocorreria na ausência pelo menos de um peptídeo.

A invenção atual é adicionalmente direcionada para um método de inibição da libe- ração pelo menos de um mediador inflamatório, de pelo menos uma célula inflamatória em um tecido ou fluido de um indivíduo, compreendendo a administração ao tecido e/ou fluido do indivíduo, que constitui pelo menos uma célula inflamatória composta pelo menos de um mediador inflamatório contido dentro de uma vesícula dentro da célula, de uma quantidade terapeuticamente efetiva de uma composição farmacêutica composta pelo menos de um peptídeo escolhido do grupo consistindo de um peptídeo MANS e um fragmento ativo do mesmo em uma quantidade terapeuticamente efetiva para reduzir a liberação do mediador inflamatório de pelo menos uma célula inflamatória, quando comparado com a liberação do mediador inflamatório de pelo menos uma do mesmo tipo de célula inflamatória que ocorre- ria na ausência de pelo menos um peptídeo. Mais especificamente, a redução da liberação de um mediador inflamatório é composta do bloqueio ou inibição do mecanismo que libera um mediador inflamatório da célula inflamatória.

O peptídeo MANS usado no método atual descrito acima é composto do SEQ ID NO:1. O fragmento ativo útil na invenção atual é composto pelo menos de um fragmento de terminal N miristoilado de SEQ ID NO:1 que é composto pelo menos de seis aminoácidos, onde o primeiro aminoácido do referido fragmento começa na glicina do terminal N de SEQ ID NO:1. Mais especificamente, o fragmento ativo pode ser escolhido do grupo consistindo de N-miristoil-GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAA (SEQ ID NO:3); N-miristoil- GAQFSKTAAKGEAAAERPGEA (SEQ ID NO:4); N-miristoil-GAQFSKTAAKGEAAAERPGE (SEQ ID NO:5); N-miristoil-GAQFSKTAAKGEAAAERPG (SEQ ID NO:6) ; N-miristoil- GAQFSKTAAKGEAAAERP (SEQ ID NO:7); N-miristoil-GAQFSKTAAKGEAAAER (SEQ ID NO:8); N-miristoil-GAQFSKTAAKGEAAAE (SEQ ID NO:9); N-miristoil- GAQFSKTAAKGEAAA (SEQ ID N0:10); N-miristoil-GAQFSKTAAKGEAA (SEQ ID NO:11); N-miristoil-GAQFSKTAAKGEA (SEQ ID NO: 12); N-miristoil-GAQFSKTAAKGE (SEQ ID NO: 13); N-miristoil-GAQFSKTAAKG (SEQ ID NO: 14); N-miristoil-GAQFSKTAAK (SEQ ID NO: 15); N-miristoil-GAQFSKTAA (SEQ ID NO:16); N-miristoil-GAQFSKTA (SEQ ID NO:17); N-miristoil-GAQFSK (SEQ ID NO: 18); e N-miristoil-GAQFSK (SEQ ID NO: 19);

A invenção atual é direcionada para o contato e/ou a administração do peptídeo descrito acima em toda a especificação com qualquer célula inflamatória conhecida que possa ser contida no tecido ou fluido de um indivíduo, que contém pelo menos um mediador inflamatório contido dentro de uma vesícula dentro da célula. A célula inflamatória, de prefe- rência, é um leucócito, mais de preferência, um granulócito, que pode ser ainda é classifica- do como um neutrófilo, um basófilo, um eosinófilo ou uma combinação dos mesmos. As cé- lulas inflamatórias contatadas no método atual poderão também ser um monóci- to/macrófago.

A invenção atual é direcionada para a redução da liberação de mediadores inflama- tórios contidos dentro das vesículas das células inflamatórias e estes mediadores inflamató- rios são escolhidos do grupo consistindo de mieloperoxidase (MPO), eosinofil peroxidase (EPO), proteína básica maior (MBP), lisozima, granzima, histamina, proteoglicano, protease, um fator quimiotático, citoquina, um metabolito de ácido araquidônico, defensina, proteína bactericida e de aumento de permeabilidade (BPI), elastase, catepsina G, catepsina B, ca- tepsina D, beta-D-glucuronidade, alfa- manosidase, fosfolipase A2, condroitina-4-sulfato, proteinase 3, lactoferrina, colagenase, ativador complementar, receptor complementar, re- ceptor N-formilmetionil-leucil-fenilalanina (FMLP), receptor laminina, citocromo b558, fator monocito-quimiotático, histaminase, proteína de aglutinação de vitamina B12, gelatinase, ativador plasminogeno, beta-D-glucuronidase e uma combinação dos mesmos. De preferên- cia, estes mediadores inflamatórios são escolhidos do grupo consistindo de mieloperoxidase (MPO), eosinofil peroxidase (EPO), proteína básica maior (MBP), lisozima, granzima e uma combinação dos mesmos.

A invenção atual contata uma quantidade efetiva do peptídeo com uma célula in- flamatória, onde a quantidade efetiva é definida como uma quantidade de desgranulação- inibição do peptídeo MANS ou de um fragmento ativo do mesmo que reduz a quantidade de um mediador inflamatórios liberado pelo menos de uma célula inflamatória de cerca de 1% a cerca de 99% quando comparado com a quantidade liberada pelo menos de uma célula in- flamatória na ausência do peptídeo MANS ou de um fragmento ativo do mesmo. Mais de preferência, esta quantidade efetiva do peptídeo contatado é composta de uma quantidade de desgranulação-inibição do peptídeo MANS ou de um fragmento ativo do mesmo que re- duz a quantidade de um mediador inflamatório liberado de pelo menos uma célula inflamató- ria de cerca de 5 - 50% a cerca de 99% quando comparado com a quantidade liberada de pelo menos uma célula inflamatória na ausência do peptídeo MANS ou de um fragmento ativo do mesmo.

A invenção atual, em uma realização, é direcionada para a administração pelo me- nos de um peptídeo composto de um peptídeo MANS e um fragmento ativo do mesmo em uma quantidade terapeuticamente efetiva, para dentro do tecido ou fluido de um indivíduo, onde o indivíduo é afetado por uma doença respiratória, que de preferência é asma, bron- quite crônica ou COPD. Em uma outra realização, o indivíduo poderá ser afetado por uma doença do intestino grosso, uma doença de pele, uma doença auto imune, uma síndrome de dor, e combinações das mesmas. A doença do intestino grosso poderá ser colite ulcerativa, doença de Crohn ou síndrome do intestino grosso irritável. O indivíduo poderá ser afetado por uma doença de pele, como rosácea, eczema, psoríase ou acne severa. O indivíduo poderá também ser afetado por artrite, como artrite reumatóide, artrite psoriática, Iupus sis- têmico eritematoso. Os indivíduos afetados por fibrose cística poderão também ser tratados pelo método atual e peptídeos. O método atual, de preferência, é útil para o tratamento de indivíduos, como mamíferos, e de preferência, seres humanos, caninos, eqüinos e felinos.

O método atual de tratamento de indivíduos é pela a administração de um ou mais peptídeos, incluindo o peptídeo MANS ou um fragmento ativo descrito aqui para incluir a administração tópica, administração parenteral, administração retal, administração pulmo- nar, administração nasal, ou a administração oral. Mais especificamente, é escolhida a ad- ministração pulmonar do grupo de aerossol, inalador de pó seco, inalador de dose medida, e nebulizador. Adicionalmente, o método apresentado poderá ainda ser composto da adminis- tração ao indivíduo de uma segunda molécula escolhida do grupo consistindo de um antibió- tico, um composto anti-viral, um composto antiparasítico, um composto anti-inflamatório, e um imuno supressor.

Em um aspecto, a invenção se refere a um método de administração de uma com- posição farmacêutica. A composição farmacêutica é composta de uma quantidade terapeu- ticamente efetiva de um composto conhecido e um veículo farmaceuticamente aceitável.

Uma quantidade "terapeuticamente efetiva", conforme utilizado aqui, é uma quantidade de um composto que é suficiente para melhorar os sintomas apresentados por um indivíduo. A quantidade terapeuticamente efetiva variará com a idade, a condição física do paciente, a severidade da condição do paciente que está sendo tratado, a duração do tratamento, a natureza de qualquer tratamento simultâneo, o veículo farmaceuticamente aceitável usado e fatores semelhantes, dentro do conhecimento e especialidade daqueles adestrados na arte. Os veículos farmaceuticamente aceitáveis, de preferência, são formas de dosagens sólidas, tais como tabletes ou cápsulas. As preparações líquidas para a administração oral também poderiam ser utilizadas e poderão ser preparadas na forma de xaropes ou suspen- sões, por exemplo, soluções contendo um ingrediente ativo, açúcar, e uma mistura de eta- nol, água, glicerol, e propileno glicol. Se desejado, tais preparações líquidas poderão incluir um ou mais dos seguintes: agentes corantes, agentes de sabor, e sacarina. Adicionalmente, agentes de espessamento, tais como carboximetilcelulose poderão também ser utilizados, assim como outros veículos aceitáveis, a escolha dos quais é conhecida na arte.

Conforme mencionado acima, a invenção atual refere-se a métodos para a regula- gem de processos de secreção celular, especialmente aqueles que liberam mediadores in- flamatórios de células inflamatórias. Conforme utilizados aqui, o termo "regulagem" significa bloqueio, inibição, redução, aumento, melhora ou estimulo. Uma quantidade de processos de secreção celular envolvem a liberação de conteúdos de vesículas ou grânulos ligados à membrana dentro das células. Uma vesícula ou grânulo ligado à membrana é definido como uma partícula intracelular, que é principalmente uma vesícula (ou uma vesícula dentro de uma célula) e que contém material guardado que pode ser secretado. Parte do conteúdo destas vesículas, como aquelas contidas em células inflamatórias, descobriu-se que são responsáveis por uma variedade de patologias em numerosos tecidos de mamíferos. Alguns dos efeitos destas secreções parecem incluir danos durante a inflamação em tecidos anteri- ormente saudáveis. Esta invenção apresenta um meio de bloqueio da secreção de qualquer vesícula ligada à membrana, incluindo aquelas encontradas nas células inflamatórias, atra- vés do direcionamento de uma molécula especifica importante no caminho de secreção in- tracelular com um peptídeo sintético. Esta estratégia poderá ser de importância terapêutica para o tratamento de uma grande variedade de condições de hipersecreção inflamatória em seres humanos e animais.

Mais especificamente, a invenção atual direciona as células inflamatórias que con- têm os mediadores inflamatórios em um ou mais grânulos ou vesículas dentro do citoplasma das células. As células são contatadas com um ou mais peptídeos que são escolhidos do peptídeo MANS ou de um fragmento ativo do mesmo, todos os quais são descritos em deta- lhes aqui. De preferência, o contato do peptídeo com a célula inflamatória é feito através de administração a um indivíduo afetado por, ou sofrendo de uma doença na qual estas células inflamatórias estão presentes em um tecido ou fluido específico dentro do tecido. Após a administração ou contato do peptídeo com a célula, o peptídeo compete competitivamente e inibe competitivamente a ligação da proteína nativa MARCKS na membrana dos grânulos ou vesículas intercelulares que contêm os mediadores inflamatórios. Como resultado do blo- queio da aglutinação da proteína MARCKS nas vesículas dentro das células inflamatórias, estas vesículas nestas células não se deslocam para a membrana do plasma das células, como elas normalmente o fariam quando estimuladas para liberarem exocitoticamente o seu conteúdo de mediadores inflamatórios para fora das células. Assim sendo, o método da in- venção atual inibe o movimento das vesículas para a membrana do plasma das células, as quais por seu lado, reduzem a liberação dos mediadores inflamatórios das células inflamató- rias. A quantidade de mediadores inflamatórios liberados das células ao longo do tempo é reduzida, porque tanto a velocidade de liberação como a quantidade de liberação dos medi- adores das células inflamatórias é dependente da concentração do peptídeo administrado e contatado com as células inflamatórias.

Um benefício da invenção atual é que ela poderá combinar uma terapia que inclui o bloqueio direto da secreção de muco com uma terapia anti-inflamatória única. Um benefício da invenção atual superior às terapias atuais anti-inflamatórias que afetam uma supressão geral do sistema imune é que o peptídeo é considerado como bloqueando somente a secre- ção dos componentes intercelulares secretados das células inflamatórias. Assim sendo, vá- rios aspectos do sistema imune devem ainda funcionar, mesmo com a inibição dos media- dores inflamatórios.

Os compostos da invenção poderão regular, i.e. bloquear, a liberação do mediador inflamatório das células. Esta inibição da liberação de mediadores inflamatórios é um meio atraente para se evitar e tratar uma variedade de distúrbios, por exemplo, doenças de con- dições patológica envolvendo a inflamação. Assim sendo, os compostos da invenção pode- rão ser úteis para o tratamento de tais condições. Isto inclui doenças das vias respiratórias e doenças inflamatórias crônicas incluindo, mas não limitado a, osteoartrite, esclerose múlti- pia, síndrome de Guillain-Barre, doença de Crohn, colite ulcerativa, psoríase, enxerto verso doença hospedeira, Iupus sistêmico eritematoso e diabetes melitus dependente de insulina.

Os compostos da invenção também podem ser usados para tratar outros distúrbios associa- dos com a atividade de níveis elevados de mediadores e enzimas pró-inflamatórios, como respostas a vários agentes infecciosos e uma quantidade de doenças autoimunes, tais como artrite reumatóide, síndrome do choque tóxico, diabete e doenças inflamatórias do intestino grosso.

Usos do peptídeo e dos métodos da invenção incluem terapias para o combate da inflamação juntamente com terapias que combinam a atividade anti-inflamatória do peptídeo com a sua habilidade para bloquear a secreção de muco. As doenças que poderão ser tra- tadas pela habilidade do peptídeo de bloquear, tanto a inflamação como a secreção de mu- co incluem, mas não são limitadas a, doenças inflamatórias do intestino grosso, distúrbios digestivos (i.e., bexiga inflamada, doença de Menetier) e doenças inflamatórias das vias respiratórias. O peptídeo poderá também ser utilizado para bloquear a liberação do excesso de insulina das células "islet" pancreáticas.

Outros mediadores pró-inflamatórios foram correlacionados com uma variedade de estados de doença que são correlacionados com o influxo de neutrófílos para dentro dos sítios da inflamação ou do ferimento. Os anticorpos de bloqueio demonstraram ser terapias úteis contra ferimentos em tecidos associados com neutrófilos em inflamação aguda (Hara- da et al., 1996, Molecular Medicine Today 2, 482). Células diferentes de neutrófilos que po- derão liberar mediadores inflamatórios incluem outros leucócitos, tais como basófilos, eosi- nófilos, monócitos e linfócitos, e terapias que poderão ser direcionadas contra a secreção destas células. Os neutrófilos, eosinófilos, e basófilos são cada um deles um tipo de granu- lócito, i.e., um leucócito que tem grânulos no seu citoplasma. Os leucócitos sintetizam uma quantidade de mediadores inflamatórios que são armazenados nos grânulos citoplásmicos. Entre estes mediadores estão, por exemplo, mieloperoxidase[MPO] em neutrófilos (Borre- gaard N, Cowland JB. Grânulos do leucócito polimorfonuclear neutrofílico. Blood 1997; 89: 3503 - 3521), eosinofil peroxidase [EPO] e proteína básica maior [MBP] em eosinófilos (Gle- ich G J. Mechanics of eosinophil-associated inflammation. J Allergy Clin immunol 2000; 105: 651 - 663), Iisozima em monocitos/macrófagos (Hoff T, Spencker T, Emmendoerffer A., Goppelt-Struebe M. Efeitos dos glucocorticoides sobre a diferenciação monocítica induzida por TPA. J Leukoc Biol 1992; 52: 173 - 182; Balboa M A, Saez Y, Balsinde J. A fosfolipase A2 independente de cálcio é requerida para a secreção de Iisozima em promonocitos U937. J Immunol 2003; 170: 5276 - 5280), e granzima em células matadoras naturais (NK) e linfó- citos citotóxicos (Bochan MR, Goebel WS, Brahmi Ζ. A granzima B antisenso transfectada estavelmente e constructs de perforina inibem a habilidade humana lítica mediada por grâ- nulos. Cell Immunol 1995; 164: 234 - 239; Gong J H., Maki G, Klingemann HG. A caracteri- zação de uma linha de células humanas (NK-92) com características fenotípicas e funcio- nais de células matadoras naturais ativadas. Leukemia 1994; 8: 652 - 658; Maki G, Klinge- mann HG, Martinson JA, Tam YK. Fatores de regulagem da atividade citotóxica da linha de células matadoras naturais humanas, NK- 92. J Hematother Stem Cell Res 2001; 10: 369 - 383; e Takayama H, Trenn G, Sitkosky MV. Um ensaio novo de ativação citotóxica do linfóci- to T. J Immunol Methods 1987; 104: 183 - 1970 - 10). Estes mediadores podem ser libera- dos nos sítios de ferimentos e podem contribuir para a inflamação e reparos, tais como no pulmão e em qualquer outro local, como resultado da infiltração destas células no sítio do tecido do ferimento ou doença. Os leucócitos liberam estes grânulos através de um meca- nismo exocitótico (Burgoyne RD, Morgan A. Secretory granule exocytosis. Physiol Rev 2003; 83: 581 - 632; Logan MR, Odemuyiwa SO1 Moqbel R. O entendimento da exocitose em célu- las imunes inflamatórias: a base molecular da secreção do mediador. J Allergy Clin Immunol 2003; 111: 923-932),

As células masto que usualmente não circulam na corrente sangüínea, e os basófi- los contêm grânulos citoplásmicos de secreção que armazenam e podem liberar, após a ativação da célula, mediadores inflamatórios pré-formados (anafiláticos), como histamina; proteoglicanos, tais como heparina e sulfato de condroitina; proteases, tais como triptase, quimase, carboxi-peptidase, e protease semelhante à catepsina G; fatores quimiotáticos, citoquinas e metabolitos de um ácido araquidônico que atuam na vasculatura, músculos ma- cios, tecido conectivo, glândulas mucosas e células inflamatórias.

Neutrófilos, também conhecidos como leucócitos polimorfonucleares (PMN), consti- tuem 50 a 60% dos leucócitos de circulação total. Os neutrófilos atuam contra agentes in- fecciosos, tais como bactérias, fungos, protozoários, vírus, células infectadas por vírus, as- sim como células de tumores, que penetram nas barreiras físicas do corpo nos sítios de in- fecção ou ferimento. Os neutrófilos amadurecem através de seis estágios morfológicos: mie- loblasto, promieloblasto, mielocito, metamielocito, neutrófilo não fragmentado (banda), e neutrófilo segmentado (funcionalmente ativo).

Em neutrófilos, os mediadores inflamatórios são estocados em grânulos primários (azurofilos), secundários (especifico), e terciários (gelatinase), assim como em vesículas de secreção. Entre os numerosos mediadores de inflamação, os grânulos primários (azurofilo) contêm mieloperoxidase (MPO), lisozima, defensimas, proteína bactericida de aumento de permeabilidade (BPI), elastase, catepsina G, catepsina B, catepsina D, beta-D- glucuronidase, alfa-manosidase, fosfolipase A2, condroitina-4-sulfato, e proteinase 3 (ver, por exemplo, Hartwig JH, Thelen M, Rosen A, Jammey PA, Naim AC, Aderem A. MARCKS é uma proteína de reticulação de filamento de actina regulada pela proteína quinase C e cálcio-calmodulin. Nature 1992; 356: 618 - 622); grânulos secundários (específico) contêm lisozima, lactoferrina, colagenase, ativador complementar, fosfolipase A2, receptores com- plementares, por exemplo, receptores CR3, CR4, N-formilmetionil-leucil-fenilalanina (FMLP), receptores de laminina, citocromo b558, fator monocito-quimiotático, histaminase, e proteína de aglutinação de vitamina B12; e grânulos de estocagem pequenos que contêm gelatinase, ativador de plasminogeno, catepsina B, catepsina D, beta-D-glucuronidase, alfa- manosidase, e citocromo b558.

Os grânulos de neutrófilos contêm substâncias antimicrobianas ou citotóxicas, pro- teinases neutras, hidrolases ácidas e um conjunto de receptores de membrana citoplásmica. Entre os constituintes de grânulos azurofilos a mieloperoxidase (MPO) é uma enzima crítica na conversão de peróxido de hidrogênio no ácido hipocloroso. Juntamente com o peróxido de hidrogênio e um co-fator de halogeneto ele forma um mecanismo efetivo microbicida e citotóxico de leucócitos - o sistema mieloperoxidase.

Defensinas, que constituem 30 a 50% da proteína de grânulos azurofílicos, são peptídeos anti-microbianos potentes pequenos (peso molecular < 4000) que são citotóxicos para uma larga faixa de bactérias, fungos e alguns vírus. A sua toxidez poderá ser devida à impermeabilização da membrana da célula alvo que é semelhante a outras proteínas de formação de canal (perforinas).

A proteína de aumento de permeabilidade bacteriana (BPI) é um membro das per- forinas. Ela é altamente tóxica para as bactérias gram negativas mas não para as bactérias ou fungos gram positivos e também pode neutralizar a endotoxina, o componente tóxico do lipopolissacarídeo do envelope de células bacterianas gram negativas.

A lactoferrina seqüestra ferro livre, dessa forma evitando o crescimento de microor- ganismos ingeridos que sobrevivem ao processo de matança e aumenta a permeabilidade bacteriana à lisozima. Proteases serina, tais como elastase e catepsina G hidrolizam proteínas em enve- lopes de células bacterianas. Os substratos do granulócito elastase incluem reticulações de colágeno e proteoglicanos, assim como componentes de elastina dos vasos do sangue, Ii- gamentos e cartilagens. A catepsina D cliva os proteoglicanos de cartilagens, enquanto que as colagenases de granulócitos são ativas na clivagem do tipo I e, em menor grau, do tipo Ill de colágeno do osso, cartilagens, e tendões. Os produtos da decomposição do colágeno têm atividade quimiotática para neutrófilos, monócitos, e fibroblastos.

A regulagem do potencial destrutivo de tecidos de proteases Iisosomais é mediada por inibidores de proteases, tais como alfa2-macroglobulina e alfal-antiprotease. Estas anti- proteases estão presentes no soro e nos fluidos sinoviais. Elas poderão funcionar ligando e cobrindo os sítios ativos de proteases. O desbalanceamento protease-antiprotease pode ser importante na patogênese de enfisema.

Os grânulos de azurofilos funcionam predominantemente no meio intracelular (no vacuolo fagolisosomal), onde eles são envolvidos na matança e degradação de microorga- nismos. Grânulos específicos de neutrófilos são suscetíveis à liberação dos seus conteúdos extracelularmente e têm uma importante função no início da inflamação. Os grânulos espe- cíficos representam um reservatório intracelular de vários componentes de membrana de plasma, incluindo o citocromo b (componente de oxidase NADPH, uma enzima responsável pela produção de superoxido), receptores para os fragmentos complementares de iC3b (CR3, CR4), para laminina, e quimio-atraentes de peptídeo-formilmetionila. Além de outras, existe a histaminase que é relevante para a degradação de histamina, proteína de aglutina- ção de vitamina, e ativador de plasminogeno, que é responsável pela formação de plasmina e a clivagem de C5a do C5.

A importância dos grânulos de neutrófilos em inflamação fica aparente de estudos de vários pacientes com anormalidades congênitas dos grânulos. Os pacientes com síndro- me Chédiak-Higashi têm uma anormalidade profunda na velocidade do estabelecimento de uma resposta anti- inflamatória e têm grânulos Iisosomais anormalmente grandes. A sín- drome congênita de deficiência específica de grânulos é um distúrbio excessivamente raro, caracterizada por respostas inflamatórias diminuídas e várias infecções bacterianas da pele e de tecidos profundos.

Apesar dos mecanismos que regulam a secreção exocitótica destes grânulos serem entendidos somente em parte, foram identificadas várias moléculas chave no processo, in- cluindo os transientes Ca2+ (Richter et al. Proc Natl Acad Sci USA 1990; 87: 9472 - 9476; Blackwood et al., Biochem J 1990; 266: 195 - 200), proteínas G ,tirozina e proteínas quina- ses (PK, especialmente PKC) (Smolen et al., Biochim Biophys Acta 1990; 1052: 133 - 142; Niessen et al., Biochim. Biophys. Acta 1994; 1223: 267 - 273; Naucler et al, Pettersen et al., Chest 2002; 121; 142 - 150), Rac2 (Abdel-Latif et al., Blood 2004; 64: 832 - 839; Lacy et al., J Immunol 2003; 170: 2670-2679) e vários SNAREs, SNAPs e VAMPs (Sollner et al., Nature 1993; 362: 318 - 324; Lacy, Pharmacol Ther 2005; 67: 358 - 376).

As proteínas SNARE (receptor solúvel de proteína de ligação a N-etilmaleimida) são uma família de proteínas associadas com membrana, caracterizadas por um domínio de alça em espiral alfa-helical chamada de motivo SNARE (Li et al., Cell Life Sci 60: 942 - 960 (2003 )). Estas proteínas são classificadas como v-SNAREs e t-SNARES com base na sua localização no veículo ou membrana alvo; outro esquema de classificação define R-SNAREs e Q-SNAREs, como baseados sobre o resíduo de arginina ou glutamina conservado no cen- tro do motivo SNARE. As SNAREs são localizadas em compartimentos distintos de mem- brana dos caminhos de secreção e de trafico endocítico, e contribuem para a especificidade dos processos de fusão da membrana intracelular. O domínio t-SNARE consiste de um feixe de 4 espirais com uma alça torcida. O motivo SNARE contribui para a fusão de duas mem- branas. Os motivos SNARE se enquadram dentro de quatro classes: homólogos de sintaxi- na 1a (t-SNARE), VAMP-2 (v-SNARE), e os motivos SNARE com terminal C de SNAP-25.

Um membro de cada classe poderá interagir para formar um complexo SNARE. O motivo SNARE é encontrado nos domínios do terminal N de certos membros da família sintaxina, tais como sintaxina 1a, que é requerida para a liberação do neurotransmissor (Lerman et al., Biochemistry 39: 8470 - 8479 (2000 )), e sintaxina 6, que é encontrada em vesículas de transporte endosomal (Misura et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 99: 9184 - 9189 (2002 )). 20 As proteínas SNAP-25 (proteína 25 kDA associada com sinaptosoma) são compo-

nentes de complexos SNARE, e poderão ser responsáveis pela especificidade da fusão da membrana e pela execução direta da fusão através da formação de um complexo rígido (o complexo SNARE ou do núcleo) que coloca um vesícula sinática e as membranas de plas- ma juntas. Os SNARES constituem uma grande família de proteínas que são 25 CARACTERIZADAS por 60 seqüências de resíduos conhecidas como motivos SNARE, e têm uma grande propensão para a formação de alças espiraladas e com freqüência prece- dem as regiões de transmembrana carboxi-terminal. O complexo do núcleo sinaptico é for- mado por quatro motivos SNARE (2 de SNAP-25 e um de cada sinaptobrevina e sintaxina) que não são estruturados no isolamento mas formam um feixe ou conjunto paralelo com quatro hélices. A estrutura de cristal do complexo do núcleo revelou que o feixe de hélices é muito torcido e contém várias pontes de sal sobre a superfície, assim como camadas de resíduos hidrófobos interiores. Uma camada polar no centro do complexo é formada por três glutaminas (2 de SNAP-25 e uma de sintaxina 1) e uma arginina (de sinaptobrevina) (Rizo et al., Nat Rev Neurosci 3: 641 - 653 (2002 )). Os membros da família SNAP-25 contêm um grupo de resíduos de cisteína que podem ser 'palmitoilados para a ligação da membrana (Risinger et al., J. Biol. Chem. 268: 24.408 - 24.414)).

A função mais importante dos neutrófilos é a fagocitose e a destruição de agentes infecciosos. Eles também limitam o crescimento de alguns micróbios, antes do início das respostas imunológicas adaptivas (especificas). Apesar dos neutrófilos serem essenciais para a defesa do hospedeiro, eles foram envolvidos na patologia de várias condições infla- matórias crônicas e em ferimentos de reperfusão- isquemia. As enzimas hidrolíticas de ori- gem de neutrófilos e de inibidores de proteases inativados oxidativamente podem ser detec- tados em fluido isolado de sítios inflamatórios. Sob condições normais, os neutrófilos podem migrar para sítios de infecção sem danos nos tecidos hospedeiros. No entanto, algumas vezes podem ocorrer danos indesejáveis em um tecido hospedeiro. Estes danos podem ocorrer através de vários mecanismos independentes. Estes incluem a ativação prematura durante a migração, a liberação extracelular de produtos tóxicos durante a matança de al- guns micróbios, a remoção de células e resíduos de células hospedeiras infectadas ou dani- ficadas como uma primeira etapa na remodelagem do tecido, ou falha do término das res- postas inflamatórias agudas. O ferimento de reperfusão-isquemia é associado com um influ- xo de neutrófilos no tecido afetado e a ativação subseqüente. Isto poderá ser provocado por substâncias liberadas de células hospedeiras danificadas ou como uma conseqüência da geração de um superóxido através de oxidase xantina.

Em condições normais, o sangue poderá conter uma mistura de neutrófilos nor- mais, preparados, ativados e gastos. Em um sítio inflamatório, estão presentes principal- mente neutrófilos ativados e gastos. Os neutrófilos ativados têm uma produção aumentada de intermediários reativos de oxigênio (ROÍ). Uma sub-população de neutrófilos como a e. respiratória aumentada foi detectada no sangue de pessoas com uma infecção bacteriana aguda e pacientes com a síndrome de angústia respiratória adulta (ARDS). Isto é um exem- plo de um paradoxo de neutrófilos. Os neutrófilos foram envolvidos na patologia desta con- dição por causa do grande influxo destas células nos pulmões e os danos associados nos tecidos causados pelos oxidantes e enzimas hidrolíticas liberados dos neutrófilos ativados. O enfraquecimento da atividade microbicida dos neutrófilos que ocorre quando os ARS pio- ram, poderá ser uma resposta protetora sobre a parte do hospedeiro, que é induzida local- mente pelos produtos inflamatórios.

A fase aguda do ferimento térmico é também associada com a ativação dos neutró- filos, e isto é seguido por um enfraquecimento geral de várias funções dos neutrófilos. A ativação de neutrófilos por intermédio de complexos imune no fluido sinovial contribui para a patologia da artrite reumatóide. A ativação crônica de neutrófilos poderá também iniciar o desenvolvimento de tumor, porque alguns ROI gerados por DNA danificado por neutrófilos e proteases promovem a migração da célula do tumor. Em pacientes sofrendo de várias queimaduras, foi estabelecida uma correlação entre o início da infecção bacteriana e a re- dução na proporção e nos números absolutos de neutrófilos positiva para anticorpo e recep- tores complementares. Os oxidantes de provenientes de neutrófilos também mostraram oxi- dar as lipoproteínas de baixa densidade (LDL), que são então ligadas mais efetivamente à membrana do plasma de macrófagos através de receptores varredores específicos. A ab- sorção destes LDL oxidados pelos macrófagos poderá iniciar a aterosclerose. Além disso, os neutrófilos preparados foram encontrados em pessoas com hipertensão essencial, doen- ça de Hodgkin, doença do intestino grosso inflamatório, psoríase, sarcoidose e septicemia, onde a preparação corresponde a concentrações elevadas de circulação de TNF-alfa (ca- chectina).

Danos hidrolíticos em um tecido hospedeiro e portanto condições inflamatórias po- derão ocorrer quando telas antioxidantes e anti-proteases são dominadas. A deficiência de antiprotease é considerada como responsável pela patologia do enfisema. Várias anti- proteases são membros da família do inibidor protease serina (SERPIN). Apesar da circula- ção ser rica em anti-proteases, estas grandes proteínas poderão ser excluídas seletivamen- te em sítios de inflamação porque os neutrófilos se aderem nos seus objetivos. O estresse da oxidação poderá iniciar os danos no tecido através da redução da concentração de anti- proteases extracelulares até abaixo do nível requerido para inibir a liberação de proteases.

Os oxidantes clorados e peróxido de hidrogênio podem inativar as anti-proteases, tais como o inibidor de aIfa 1-protease e alfa2-macroglobulina, que são inibidores endógenos de elas- tase, mas simultaneamente ativam as metalo-proteases latentes, tais como colagenases e gelatinase, que contribuem para a inativação adicional de anti-proteases.

Os constituintes citoplásmicos de neutrófilos poderão também ser uma causa da formação de anticorpos citoplásmicos anti-neutrofílicos específicos (ANCA), que são estrei- tamente relacionados com o desenvolvimento da vasculite sistêmica e da glomerulonefrite. ANCA são anticorpos direcionados contra enzimas que são encontrados principalmente dentro dos grânulos azurofil ou primários dos neutrófilos. Existem três tipos de ANCA que podem ser distinguidos pelos padrões que produzem através de imuno- fluorescência indire- ta sobre neutrófilos normais fixados com etanol. A fluorescência citoplásmica granular fina difusa (cANCA) tipicamente é encontrada na granulomatose de Wegener, em alguns casos de poliartrite microscópica e na síndrome de Churg Strauss, e em alguns casos de glomeru- lonefrite necrotizante crescentic e segmentai. O antígeno visado usualmente é a proteinase 3. A fluorescência perinuclear (pANCA) é encontrada em vários casos de poli- artrite micros- cópica e glomerulonefrite. Estes anticorpos, com freqüência, são direcionados contra a mie- loperoxidase mas outros alvos incluem a elastase, catepsina G, lactoferrina, lisozima e beta- D-glucuronidase. O terceiro grupo designado como ANCA "atípico" inclui fluorescência nu- clear de neutrófilos e alguns padrões citoplásmicos não usuais e enquanto alguns dos antí- genos visados são compartilhados com pANCA, os outros ainda não foram identificados. pANCA são também encontrados em um terço dos pacientes com a doença de Crohn. A incidência relatada de ANCA em artrite reumatóide e SLE varia consideravelmente, mas os padrões são predominantemente de pANCA e ANCA atípico.

O eosinófilo é um leucócito do estágio final, diferenciado terminalmente, que reside predominantemente no tecido submucosal e é recrutado para sítios de reações imune espe- cíficas, incluindo doenças alérgicas. O citoplasma do eosinófilo contém grandes grânulos elipsoidais com um núcleo cristalino denso de elétrons e matriz parcialmente permeável.

Além destes grandes grânulos cristalóides primários, existe um outro tipo de grânulo que é menor (grânulos pequenos) e não tem o núcleo cristalino. Os grânulos específicos grandes de eosinófilos contêm pelo menos quatro proteínas catiônicas distintas, que exercem uma faixa de efeitos biológicos nas células hospedeiras e nos alvos microbianos: proteína básica maior (MBP), proteína catiônica do eosinófilo (ECP), neurotoxina derivada de eosinófilo (EDN), e peroxidase de eosinófilo (EPO). Os basofilos contêm um quarto no máximo da pro- teína básica maior como eosinófilos, juntamente com quantidades detectáveis de EDN, ECP e EPO. São também encontradas quantidades pequenas de EDN e ECP nos neutrófilos (Gleich G J. Mechanisms of eosinophil-associated inflammation. J. Allergy Clin Immunol 2000; 105: 651 - 653). MPB parece não ter atividade enzimática mas é um polipeptídeo al- tamente catiônico que poderá exercer as suas atividades tóxicas através de interações com membranas de lipídios levando ao seu desarranjo. Ambos o MBP e o EPO podem agir como inibidores alostéricos seletivos de agonista de ligação com receptores muscarínicos M2.

Estas proteínas poderão contribuir para a disfunção do receptor M2 e aumentam a bronco- constrição mediada vagamente na asma. EDN pode danificar especificamente o revestimen- to de mielina dos neurônios. A histaminase e uma variedade de enzimas lísosomais hidroliti- cas estão também presentes nos grânulos específicos grandes de eosinófilos. Entre as en- zimas em grânulos pequenos de eosinófilos estão a aril sulfatase, fosfatase ácida, e uma metaloproteinase 92 kDa, uma gelatinase. Os eosinófilos podem elaborar citoquinas que incluem aquelas com atividade em potencial do fator de crescimento autocrine para eosinófi- los e aqueles com funções potenciais em respostas inflamatórias agudas e crônicas. Três citoquinas têm atividades de fator de crescimento para eosinófilos: fator de estimulação de colônia de granulócito-macrófago (GM-CSF), IL-3 e IL-5. Outras citoquinas produzidas pelos eosinófilos humanos que poderiam ter atividades em respostas inflamatórias agudas e crô- nicas incluem IL-1-alfa, IL-6, IL-8, TNF-alfa e ambos os fatores de crescimento de transfor- mação, TGF-alfa e TGF-beta.

Os eosinófilos contêm grânulos cristalóides que contêm MBP, proteína catiônica de eosinófilo, EPO, e neurotoxina derivada de eosinófilo (Gleich, J Allergy Clin Immunol 2000; 105: 651 - 663). A linha de células promielocíticas humanas HL-60 clone 15 pode ser usada para o exame da secreção de EPO. Esta linha de células foi estabelecida a partir de um clone de HL-60 que foi crescido em um pH elevado durante dois meses (Fischkoff, Leuk Res 1988; 12: 679 - 686) e então tratado com ácido butírico para permitir que as células se diferenciem para apresentar várias das características dos eosinófilos periféricos do sangue, incluindo a expressão das proteínas de grânulos específicos de eosinófilos (Rosenberg et ai., J Exp Med 1989; 170:163 - 176; Tiffany et al., J Leukoc Biol 1995; 58: 49 - 54; Badewa et al., Exp Biol Med 2002; 227: 645 - 651).

Os eosinófilos podem participar das reações de hipersensibilidade, especialmente através de dois mediadores inflamatórios de lipídios, leucotrieno C4 (LTC4) e fator de ativa- ção de plaqueta (PAF). Ambos os mediadores contraiem os músculos macios das vias respi- ratórias, promovem a secreção de muco, alteram a permeabilidade vascular e elicitam a infiltração de eosinófilos e neutrófilos. Alem das atividades diretas destes mediadores deri- vados de eosinófilos, MBP pode estimular a liberação de histamina dos basofilos e das cé- lulas masto, e o MBP pode estimular a liberação de EPO das células masto. Os eosinófilos podem servir como uma fonte local de mediadores específicos de lipídios, assim como indu- zir a liberação de mediadores das células masto e dos basofilos. O teor de grânulos de eo- sinófilos é liberado após o estímulo semelhante aos grânulos de neutrófilos, como por e- xemplo, durante a fagocitose de partículas opsonizadas e por fatores quimiotáticos. As en- zimas Iisizomais de neutrófilos atuam principalmente sobre o material envolvido em fagoliso- somas, enquanto que os teores de grânulos de eosinófilos atuam principalmente na estrutu- ra extracelular visada, como parasitas e mediadores inflamatórios.

O desenvolvimento de monócitos e macrófagos acontece na medula do osso e passa através das seguintes etapas: célula básica; comprometimento da célula básica; mo- noblasto; promonocito; monócito da medula do osso; monócito do sangue periférico; e ma- crófago nos tecidos. A diferenciação do monócito na medula do osso prossegue rapidamen- te (em 1,5 a 3 dias). Durante a diferenciação, são formados grânulos no citoplasma do mo- nócito e estes podem ser divididos como nos neutrófilos em pelo menos dois tipos. No en- tanto, eles são em menor quantidade e menores do que as suas contrapartes de neutrófilos (azurofilos e grânulos específicos). O seu teor de enzima é semelhante.

As enzimas ligadas a grânulos de monócitos/macrófagos incluem lisozima, fosfata- se ácida, e beta glucuronidase. Como um modelo para estudos in vivo, foi utilizada a secre- ção de lisozima das células U937. Esta linha de células é derivada de um linfoma histiocitico humano e tem sido usada como uma linha de células monociticas que pode ser ativada por uma variedade de agonistas, tais como PMA (Hoff et al., J Leukoc Biol 1992; 52: 173 - 182; Balboa et al., J Immunol 2003; 170: 5276 - 5280; Sundstrom et al., Int J Câncer 1976; 17: 565 - 577).

As células matadoras naturais (NK) e os linfócitos citotóxicos contêm grânulos cito- tóxicos potentes, incluindo perforina, uma proteína de formação de poros, e granzimas, pro- teases serina específicas de linfócitos. Por exemplo, a linha de células NK-92 é uma linha humana dependente de IL2 estabelecida a partir de um paciente com linfoma não de Hodg- kin rapidamente progressivo (Gong JH., Maki G, Klingemann HG. Caracterização de linha de células humanas (NK-92) com características fenotípicas e funcionais de células matadoras naturais ativadas. Leukemia 1994; 8: 652 - 658). As células NK-92 expressam níveis eleva- dos de moléculas envolvidas na rota citolitica de granzima-perforina que visam uma larga faixa de células malignas (Gong et al, vide infra, e Maki G1 Klingemann HG1 Martinson JA1 Tam YK. Fatores que regulam a atividade citotóxica da linha de células matadoras naturais e humanas, NK-92. J Hematother Stem Cell Res 2001; 10: 369 - 383).

As granzimas são proteases serina exógenas que são liberadas pelos grânulos cí- toplásmicos dentro das células T citotóxicas das células matadoras naturais. Tais granzimas podem induzir a apoptose dentro das células infectadas com o vírus, dessa forma destruindo as mesmas.

A liberação extracelular de um mediador de inflamação (mediador inflamatório de um granulócito (ou leucócito), e a liberação extracelular de mais de um mediador de infla- mação (mediador inflamatório) de um granulócito (ou leucócito) algumas vezes é referida aqui como desgranulação. Em uma realização preferida, a liberação de um mediador de inflamação é composta da liberação do referido mediador de um granulo localizado no inte- rior de um granulócito ou leucócito. A liberação do mediador inflamatório, de preferência, é a liberação de um mediador inflamatório destes grânulos.

Os neutrófilos e os macrófagos, após a preparação através de agentes pro- inflamatórios (estimulantes inflamatórios) tais como TNFa, aumentam dramaticamente a sua síntese de proteína MARCKS: tanto quanto 90% da proteína nova formada pelos neutrófilos em resposta à TNFa ou lipopolisacarídeos (LPS) é MARCKS (Thelen M, Rosen A, Nairn AC, Aderem A. O fator alfa de necrose de tumor modifica as respostas dependentes do agonista nos neutrófilos humanos através da indução da síntese e da miristoilação do substrato es- pecífico da proteína quinase C. Proc Natl Acad Sci USA 1990; 87: 5603 - 5607). MARCKS pode portanto ter uma função importante na interação subseqüente de mediadores inflama- tórios quando as células contendo grânulos, tais como os neutrófilos e os macrófagos, são estimulados por agonistas, especialmente aqueles que trabalham ativando PKC (Bugoyne et al., Physiol Rev 2003; 83: 581 - 632; Logan et al. J Allergy Clin Immunol 2003; 11: 923 - 932; Smolen et al., Biochim Biophys Acta 1990; 1052: 133 - 142; Niessen et al., Biochim. Biophys. Acta 1994; 1223: 267 - 273; Naucler et al., J Leukoc Biol 2002; 71:701-710).

Em um aspecto desta invenção, a administração de uma quantidade de desgranulação- inibição do peptídeo MANS ou de um fragmento ativo do mesmo conforme descrito aqui para um sítio de inflamação em um indivíduo, cujos sítio de inflamação resultou do início da entrada de uma doença, uma condição, um trauma, um corpo estranho, ou uma combinação dos mesmos no sítio de inflamação no indivíduo, pode reduzir a quantidade de um mediador da inflamação liberada dos leucócitos de infiltração no sítio de inflamação, onde os leucóci- tos, de preferência, são granulócitos. A administração do peptídeo MANS e/ou pelo menos um fragmento ativo do mesmo pode reduzir a quantidade de um mediador de inflamação liberada de leucócitos como os granulócitos infiltrados no sítio de inflamação. A quantidade de desgranulação-inibição do peptídeo MANS, ou a quantidade de desgranulação-inibição de um fragmento ativo do mesmo, é suficiente para reduzir ou inibir a liberação exocitotica dos mediadores inflamatórios dos grânulos contidos dentro das células inflamatórias infiltra- das dentro do sítio. A eficácia da desgranulação-inibição é medida em um momento após a administração do peptídeo MANS ou do fragmento do mesmo, por comparação da percen- tagem de inibição (i.e., percentagem de redução) da liberação de mediadores de inflamação das referidas células (leucócitos ou granulócitos ou outras células inflamatórias) em relação ao nível ou quantidade ou concentração dos referidos mediadores de inflamação liberados ou produzidos aproximadamente ao mesmo tempo, na ausência do peptídeo MANS e/ou na ausência do fragmento ativo do mesmo. Adicionalmente, um clínico adestrado pode deter- minar se a inflamação no sítio do tecido foi reduzida através da medição dos sintomas e parâmetros da inflamação conhecidos como indicadores da doença para determinar se foi administrada uma quantidade suficiente ou terapeuticamente efetiva do peptídeo MANS e/ou de um fragmento ativo do mesmo. Uma quantidade suficiente de desgranulação- inibição é a percentagem de redução de um mediador de inflamação liberado de um granu- lócito, no sítio de inflamação, que é de cerca de 1% a cerca de 99%, de preferência, de 5% a cerca de 99%, mais de preferência, de cerca de 10% a cerca de 99%, ainda mais de pre- ferência, de 25% a 99%, e ainda mais de preferência, de cerca de 50% a cerca de 99% da quantidade do referido mediador de inflamação liberado do referido granulócito na ausência do peptídeo MANS ou de um fragmento ativo do mesmo testado nas mesmas condições.

Em um aspecto desta invenção, a administração de uma quantidade de desgranulação- inibição do peptídeo MANS para um sítio de estimulação inflamatória em um animal, cujo sítio de estimulação inflamatória foi criado por administração de uma quantidade de inflama- ção. estimulação de um estimulante inflamatório para o referido sítio, pode reduzir a quanti- dade de um mediador de inflamação liberado de um granulócito, cujo granulócito é estimu- lado pelo referido estimulante inflamatório no referido sítio de estimulação inflamatória, de cerca de 1% a cerca de 99%, de preferência, de 5% a cerca de 99%, mais de preferência, de cerca de 10% a cerca de 99%, ainda mais de preferência, de cerca de 25% a 99%, e ainda mais de preferência, de cerca de 50% a cerca de 99% da quantidade do referido me- diador de inflamação liberado do referido granulócito na ausência do peptídeo MANS na presença da quantidade idêntica de inflamação-estímulo do referido estimulante inflamatório.

Em outro aspecto desta invenção, a administração de uma quantidade de desgra- nulação-inibição do peptídeo MANS para um sítio de estimulação inflamatória em um ani- mal, cujo sítio de estimulação inflamatória foi criado pela administração de uma quantidade de inflamação-estímulo de um estimulante inflamatório para o referido sítio, pode reduzir a quantidade de um mediador de inflamação liberado de um granulócito, cujo granulócito é estimulado pelo referido estimulante inflamatório no referido sítio de estimulação inflamató- ria, em 100% da quantidade do referido mediador de inflamação liberado do referido granu- lócito na ausência do peptídeo MANS na presença de quantidade idêntica de inflamação- estímulo do referido estimulante inflamatório.

Um exemplo de estimulante inflamatório usado nos exemplos in vitro aqui é o forbol 12-miristato 13-acetato (PMA). A proteína quimio-atraente de monócitos (MCP-1) é quase tão efetiva quanto o C5a, e muito mais potente do que o IL-8, na desgranulação de basofi- los, resultando na liberação de histamina. A liberação de histamina pode ocorrer depois da estimulação com quimioquinas (i.e., citoquinas quimioatraentes), RANTES e MIP-1.

Em uma realização preferida, relativa à concentração basal do peptídeo MARCKS presente no sítio de estimulação inflamatória, a quantidade de desgranulação-inibição do peptídeo MANS administrado para um sítio de estimulação inflamatória em um animal é composto de cerca de uma vez a cerca de um milhão de vezes a concentração do peptídeo MARCKS no referido sítio de estimulação inflamatória, de preferência, de cerca de uma vez a cerca de 100.000 vezes a concentração do peptídeo MARCKS no referido sítio de estimu- lação inflamatória, mais de preferência, cerca de uma vez a cerca de 10.000 vezes a con- centração do peptídeo MARCKS no referido sítio de estimulação inflamatória, ainda mais de preferência, cerca de uma vez a cerca de 1000 vezes a concentração do peptídeo MARCKS no referido sítio de estimulação inflamatória, ainda mais de preferência, cerca de uma vez a cerca de 100 vezes a concentração do peptídeo MARCKS no referido sítio de estimulação inflamatória, e ainda mais de preferência, cerca de uma vez a cerca de 10 vezes a concen- tração do peptídeo MARCKS no referido sítio de estimulação inflamatória.

Em uma realização preferida, o granulócito reside sobre a, ou na via respiratória de um animal, de preferência, um ser humano, e o peptídeo MANS é administrado por inalação, como por inalação de uma composição farmacêutica composta do peptídeo MANS, por e- xemplo, uma composição farmacêutica composta do peptídeo MANS e uma solução aquo- sa, cuja composição é administrada na forma de um aerossol, ou uma composição farma- cêutica composta do peptídeo MANS na forma de um pó seco, cuja composição é adminis- trada utilizando-se um inalador de pó seco. Outros métodos e dispositivos conhecidos na arte para a administração de uma solução ou pó por inalação, como por exemplo, gotas, aspersões e nebulizadores, podem ser úteis.

Em algumas realizações, é possível que o peptídeo da invenção atual possa blo- quear processos de secreção que são fisiologicamente importantes, incluindo funções de secreção basal. Apesar dos inventores não desejarem ser limitados por qualquer teoria es- pecífica da invenção, acredita-se que os mecanismos que regulam tal secreção basal são diferentes daqueles que regulam a secreção estimulada. Alternativamente, os mecanismos de secreção basal poderão requerer menos proteína MARCKS do que a secreção estimula- da. A secreção basal poderá ser conservada porque todas as terapias para o bloqueio da secreção mediada por MARCKS poderão não eliminar toda a função MARCKS.

Conforme utilizado aqui, o termo "seqüência de nucleotídeos MARCKS" refere-se a qualquer seqüência de nucleotídeos derivado de um gene que codifica a proteína MARCKS, incluindo, por exemplo, a seqüência de DNA ou RNA, a seqüência de DNA do gene, qual- quer seqüência RNA transcrita, a seqüência de RNA do transcrito pre-mRNA ou mRNA, e o DNA ou RNA ligado na proteína. A administração precisa do peptídeo de bloqueio MARCKS poderá também superar quaisquer limitações em potencial de bloqueio de processos impor- tantes de secreção. A administração de tais agentes para o trato respiratório deve ser feita rapidamente com formulações inaladas. Como estes agentes poderão ser úteis no tratamen- to de doenças inflamatórias do intestino grosso, pode-se prever a administração de agentes de bloqueio no reto/cólon/trato intestinal através de enema ou supositórios. Injeções ou ad- ministração transdérmica nas juntas inflamadas poderão gerar um alívio para os pacientes com artrite ou doenças autoimunes, através da limitação da secreção das células inflamató- rias localizadas. A injeção nas áreas ao redor dos terminais dos nervos poderá inibir a se- creção de alguns tipos de neurotransmissores, bloqueando a transmissão de dor severa ou de espasmos descontrolados dos músculos. A administração do peptídeo para o tratamento de doenças inflamatórias da pele deve ser feita rapidamente, utilizando-se várias formula- ções tópicas conhecidas na arte.

Foi demonstrado que o substrato de quinase C rica em alanina miristoilada (MARCKS), um substrato de PKC largamente distribuído, poderá ser uma molécula regula- tória da chave de mediação da liberação do grânulo de mucina por células epíteliais normais humanas dos brônquios (NHBE). A secreção de mucina destas células poderá ser maximi- zada pela ativação de ambos o PKC e o PKG. Acredita-se que o MARKS serve como ponto de convergência para a coordenação das ações destas duas quinases de proteína para con- trolar a liberação do grânulo de mucina. O mecanismo parece envolver a fosforilação de- pendente de PKC do MARCKS, a qual libera o MARCKS da membrana do plasma para den- tro do citoplasma, onde ela por seu lado é desfosforilada por uma proteína fosfatase 2A (PP2A) que é ativada por PKG. Esta desfosforilação poderá permitir que o MARCKS rega- nhe a sua capacidade de ligação com a membrana, permitindo a sua adesão a membranas dos grânulos de mucina citoplásmicos. Além disso, o MARCKS interage com a actina e mio- sina no citoplasma e portanto poderá ser capaz de reter os grânulos no aparelho contrátil celular, dessa forma mediando o movimento subseqüente do grânulo e a exocitose. A se- creção do MPO mediador inflamatório dos neutrófilos poderá também ser maximizada pela ativação de ambos o PKC e o PKG (conforme ilustrado nas figuras 11- 15). É possível que o MARCKS sirva como ponto de convergência para ações de coordenação destas duas prote- ínas quinazes que controlam a secreção dos compartimentos ligados na membrana em cé- lulas inflamatórias (i.e. secreção de MPO dos neutrófilos).

A invenção atual demonstra que a secreção do mediador inflamatório MPO de neu- trófilos caninos ou humanos foi aumentada pela ativação simultânea de ambos o PKC e o PKG1 enquanto que a ativação da quinase sozinha foi o suficiente para induzir uma resposta de secreção máxima. Uma resposta de secreção aumentada para o PMA sozinho foi docu- mentada nas células NHBE (figura 1, coluna 4) e nos neutrófilos (figura 11), apesar da mag- nitude da resposta ser muito menor do que aquela observada por outros em uma linha de células semelhantes a "goblet" de ratos. Ver, Abdullah et al, supra. Além disso, apesar de ter sido relatado anteriormente que um análogo de cGMP poderia induzir uma secreção de mu- cina significativa de células epiteliais da traquéia de uma criação de porcos da Guiné (Fis- cher et al., supra), deve-se notar que esta resposta não alcançou níveis significativos até 8h da exposição. Uma resposta de secreção com um período de tempo tão grande é pouco provável que tenha um efeito direto e provavelmente envolve a síntese de proteína de novo, ao contrário da liberação dos grânulos citoplásmicos formados previamente e estocados. No entanto, o efeito aparente sinergístico envolvendo a ativação cooperativa de ambos o PKC e o PKG poderá sugerir um complexo e rígido mecanismo de sinalização mediando a secre- ção de mucina e/ou os mediadores inflamatórios. Os solicitantes notam que a rota apresen- tada abaixo que foi utilizada para estudar a liberação do mediador inflamatório dos neutrófi- los possivelmente é a mesma rota que aquela usada para estudar as secreções das células "goblet".

Conforme mencionado acima, a invenção atual poderá ser utilizada em uma formu- lação farmacêutica. Em certas realizações, o produto de fármaco está presente em uma composição farmacêutica sólida que poderá ser adequada para administração oral. Poderá ser formada e poderá ser misturada uma composição sólida de material de acordo com a invenção atual com e/ou diluída por um excipiente. A composição sólida de material também poderá estar envolvida dentro de um veículo, o qual poderá estar, por exemplo, na forma de uma cápsula, sachê, tablete, papel, ou outro recipiente. Quando o excipiente serve como diluente, ele poderá ser um material sólido, semi-sólido, ou líquido, que atua como um veícu- lo, transporte, ou meio para a composição de material.

Vários excipientes adequados serão entendidos por aqueles adestrados na arte e poderão ser encontrados na National Formulary, 19: 2404 - 2406 (2000), a apresentação das páginas 2404 a 2406 sendo incorporadas aqui na sua integridade. Exemplos de excipi- entes adequados incluem, mas não são limitados a, amidos, goma arábica, silicato de cál- cio, celulose microcristalina, metacrilatos, shelac, polivinilpirrolidona, celulose, água, xarope, e metilcelulose. As formulações do produto de fármaco adicionalmente podem incluir agen- tes lubrificantes, tais como, por exemplo, talco, estearato de magnésio e óleo mineral; agen- tes umidificantes; agentes emulsificantes e de colocação em suspensão; agentes conser- vantes, tais como metil- e propil hidroxibenzoatos; agentes adoçantes; ou agentes de sabor.

Polióis, soluções tampão, e cargas inertes também poderão ser utilizados. Exemplos de po- lióis incluem, mas não são limitados a, manitol, sorbitol, xilitol, sacarose, maltose, glicose, lactose, dextrose, e semelhantes. Soluções tampão adequadas incluem, mas não são limi- tadas a, fosfato, citrato, tartarato, succinato, e semelhantes. Outras cargas inertes que pode- rão ser utilizadas, incluem aquelas que são conhecidas na arte e são úteis na fabricação de várias formas de dosagem. Se desejado, as formulações sólidas poderão incluir outros componentes, tais como agentes de produção a granel e/ou agentes de granulação, e se- melhantes. Os produtos de fármaco da invenção poderão ser formulados para produzirem uma liberação rápida, prolongada, ou retardada do ingrediente ativo após a administração ao paciente, utilizando-se procedimentos bem conhecidos na arte.

Para formar tabletes para a administração oral, a composição de material da inven- ção atual poderá ser feita por um processo direto de compressão. Neste processo, os ingre- dientes ativos do fármaco poderão ser misturados com um veículo sólido, pulverulento, co- mo por exemplo, lactose, sacarose, sorbitol, manitol, amido, amilopectina, e derivados de celulose ou gelatina, e misturas dos mesmos, assim como com um agente anti-atrito como por exemplo, estearato de magnésio, estearato de cálcio, e ceras de polietileno glicol. A mis- tura poderá então ser prensada em tabletes utilizando-se uma máquina com as punções e matrizes apropriadas para a obtenção do tamanho de tablete desejado. Os parâmetros de operação da máquina poderão ser escolhidos pelo artesão qualificado. Alternativamente, os tabletes para administração oral poderão ser formados através de um processo de granula- ção úmida. Os ingredientes ativos do fármaco poderão ser misturados com excipientes e/ou diluentes. As substâncias sólidas poderão ser moídas ou peneiradas até um tamanho dese- jado de partícula. Poderá ser adicionado no fármaco um agente aglutinante. O agente aglu- tinante poderá ser colocado em suspensão e homogeneizado em um solvente adequado. O ingrediente ativo e os agentes auxiliares também poderão ser misturados com a solução de agente aglutinante. A mistura seca resultante é umidificada uniformemente com a solução. A umidificação tipicamente faz com que as partículas se agreguem ligeiramente, e a massa resultante é prensada através de uma peneira de aço inoxidável tendo um tamanho deseja- do. A mistura é então seca em unidades de secagem controlada para o período de tempo determinado que é necessário para se atingir um tamanho de partícula e consistência dese- jados. Os grânulos da mistura seca são peneirados para a remoção de qualquer pó. Pode- rão ser adicionados nesta mistura agentes desintegrantes, anti-atrito e/ou anti-adesão. Fi- nalmente, a mistura é prensada em tabletes utilizando-se uma máquina com as punções e matrizes apropriadas para a obtenção do tamanho de tablete desejado. Os parâmetros de operação da máquina poderão ser escolhidos pelo artesão qualificado.

Se são desejados tabletes revestidos, o núcleo preparado acima poderá ser reves- tido com uma solução concentrada de açúcar ou polímeros celulósicos, os quais poderão conter goma arábica, gelatina, talco, dióxido de titânio, ou uma Iaca dissolvida em um sol- vente orgânico volátil ou em uma mistura de solvente. Poderão ser adicionados vários co- rantes a este revestimento para se distinguir entre tabletes com compostos ativos diferentes ou com quantidades diferentes do composto ativo presente. Em uma realização especifica, o ingrediente ativo poderá estar presente em um núcleo cercado por uma ou mais camadas, incluindo camadas de revestimento entérico.

Poderão ser preparadas cápsulas de gelatina macias, nas quais é contida uma mis- tura do ingrediente ativo e óleos vegetais. As cápsulas de gelatina dura poderão conter grâ- nulos do ingrediente ativo em combinação com um veículo sólido, pulverulento, como por exemplo, lactose, sacarose, sorbitol, manitol, amido de batata, amido de milho, amilopectina, derivados de celulose e/ou gelatina.

As preparações líquidas para administração oral poderão ser preparadas na forma de xaropes ou suspensões, por exemplo, soluções contendo um ingrediente ativo, açúcar, e uma mistura de etanol, água, glicerol, e propileno glicol. Se desejado, tais preparações líqui- das poderão ser compostas de um ou mais dos seguintes: agentes corantes, agentes de sabor, e sacarina. Os agentes de espessamento, tais como carboximetilcelulose, também poderão ser utilizados.

No caso dos produtos farmacêuticos acima serem utilizados para administração pa- renteral, tal formulação poderá ser composta de soluções de injeção aquosa estéreis, solu- ções de injeção não aquosa, ou ambas, compostas da composição de material da invenção atual. Quando são preparadas as soluções de injeção aquosa, a composição de material poderá estar presente como um sal farmaceuticamente aceitável solúvel em água. As prepa- rações parenterais poderão conter antioxidantes, soluções tampão, bacteriostáticos, e solu- tos que fazem com que a formulação se torne isotônica com o sangue do recipiente a que se destina. As suspensões estéreis aquosas e não aquosas poderão ser compostas de a- gentes de colocação em suspensão e agentes de espessamento. As formulações poderão estar presentes em recipientes de dose unitária ou de doses múltiplas, por exemplo, ampo- las e frascos selados. As soluções e suspensões de injeção extemporâneas poderão ser preparadas a partir de pós estéreis, grânulos e tabletes do tipo descrito anteriormente.

A composição de material poderá também ser formulada de tal forma que possa ser adequada para a administração tópica (por exemplo, creme para a pele). Estas formulações poderão conter vários excipientes conhecidos por aqueles adestrados na arte. Excipientes adequados poderão incluir, mas não são limitados a, cera de cetil ésteres, cetil álcool, cera branca, monoestearato de glicerila, propileno glicol, monoestearato, estearato de metila, álcool benzílico, Iauril sulfato de sódio, glicerina, óleo mineral, água, carbômero, álcool etíli- co, adesivos de acrilato, adesivos de poliisobutileno, e adesivos de silicone.

Tendo agora sido descrita a invenção, a mesma será ilustrada com referência a cer- tos exemplos, que são incluídos aqui somente para fins de ilustração, e que não se desti- nam a ser limitantes da invenção.

Exemplos

A hipersecreção proveniente de mucina de células NHBE envolve a ativação de ambos o PKC e o PKG.

Para determinar a função em potencial do PKC e/ou do PKG no processo de secre- ção de mucina, células NHBE foram expostas aos seguintes dois ativadores de proteína quinase específicos: o ésterforbol, forbol 12-miristato 13- acetato (PMA), para a ativação do PKC, e o análogo de cGMP não hidrolizável, 8-Br-cGMP, para a ativação do PKG. Estudo preliminares de exame da secreção de mucina em resposta à estimulação por PMA em vá- rias concentrações para tempos diferentes (até 1 μΜ durante 2h) indicou que a ativação do PKC sozinho não induz secreção de mucina significante de células NHBE, apesar de ter sido observada repetitivamente uma resposta de secreção moderada em concentrações de PMA maiores do que 100 nM (0,05<p<0,1). As células também não responderam aos aná- logos de cGMP em concentrações tão elevadas quanto 500 μΜ durante até 2h de exposi- ção. No entanto, uma combinação de PMA+8-Br-cGMP, afetando as duas ativações PKC e PKG, provocou um aumento rápido na secreção, dobrando a mesma em aproximadamente quinze minutos de exposição (figura 1A). Esta resposta de secreção induzida por ΡΜΑ+8-Br- cGMP foi dependente da concentração, com uma estimulação máxima a 100 nM PMA+1 μΜ 8-Br-cGMP (figuras 1B e 1C). Nas figuras 1A, 1B é 1C, as células NHBE foram expostas ao reagente ou meio indicado sozinho (CTL) durante quinze minutos. Na figura 1D, as células NHBE foram incubadas previamente com o inibidor indicado durante quinze minutos e então estimuladas com 100 .mu.M UTP durante 2h. A mucina secretada em resposta ao tratamen- to foi recolhida e ensaiada por ELISA. Os dados são apresentados como média ± S.E. (n=6 em cada ponto). O quer dizer significativamente diferente do controle do meio (p<0,05); quer dizer diferente do meio de controle (0,05<p<0,1); e t significa muito diferente da esti- mulação UTP CD<0,05).

UTP é um secretagogo de mucina patofisiologicamente relevante bem definido. Lethem et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 9, 315 - 322 (1993). A invenção atual demonstra ainda que UTP, em várias concentrações, de preferência, 40 a 140 μΜ, poderá induzir a um aumento significativo na secreção de mucina a partir de células NHBE depois de uma expo- sição de 2h. Para se determinar se PKC e PKG foram envolvidos na regulação da secreção de mucina em resposta a um estímulo patofisiológico, foram investigados os efeitos dos ini- bidores de PKC/PKG sobre a secreção de mucina induzida por UTP. As células NHBE fo- ram pré-incubadas com vários inibidores durante quinze minutos e então foram expostas ao UTP (100 μΜ) + o inibidor durante 2h. A mucina secretada foi medida por ELISA. Os resul- tados indicaram que a secreção de mucina provocada pelo UTP poderá requerer ambas as atividades de PKC e PKG1 porque a resposta de secreção foi atenuada independentemente pelo inibidor de PKC calfostina C (500 nM), o inibidor de PKG Rp-8-Br-PET-cGMP (10 μΜ), o inibidor de ciclase guanilil solúvel (GC-S) LY 83583 (50 μΜ) mas possivelmente não pelo inibidor de proteína quinase A (PKA) KT 5720 (500 nM) (figura 1D). Aparentemente, a se- creção de mucina nas células NHBE poderá ser regulada através de um mecanismo de si- nalização envolvendo ambos o PKC e o PKG.

Para avaliar o envolvimento do PKG no processo de secreção, foi utilizado nestes estudos o 8-Br-cGMP. Apesar do efeito fisiológico principal do 8-Br-cGMP ser a ativação de PKG1 também foi relatado que ele atua como um agonista para os canais de íons engatados em cGMP em algumas células e em concentrações elevadas, a ativação cruzada de PKA.

Para impedir a possibilidade dos canais de íons engatados em cGMP e/ou PKA poderem ter uma participação na secreção de mucina pelas células NHBE, Rp-8-Br-cGMP, um análogo de cGMP único que pode ativar os canais de íons engatados a cGMP semelhantes a 8-Br- cGMP mas inibir a atividade de PKG, foi usado um agonista para distinguir os efeitos de PKG e dos canais de ions engatados em cGMP na liberação de mucina. Conforme ilustrado nas figuras, especialmente, na figura 1A (coluna 11), Rp-8-Br-cGMP não aumentou a secre- ção de mucina quando adicionado nas células com PMA. Da mesma forma, o inibidor espe- cífico de PKA, o KT5720 (500 nM), não afetou a secreção de mucina induzida por PMA+8- Br-cGMP ou UTP (figura 1D, coluna 4). Estes estudos poderão negar a possibilidade dos canais de íons engatados em cGMP ou de PKA serem associados com a secreção de muci- na, indicando que a ativação do PKG nas células NHBE é o mecanismo através do qual o 8- Br-cGMP contribui para a secreção aumentada. Além disso, como a hipersecreção de muci- na induzida por UTP pode ser atenuada pelo inibidor ciclase guanilil solúvel (GC-S) LY83583, é possível que a ativação de PKG ocorra através da rota de sinalização de oxido nítrico (NO) —» GC-S —> cGMP —> PKG, conforme ilustrado anteriormente nas células epite- liais diferenciadas das traquéias dos porcos da Guiné in vitro.

Dada a participação de ambos o PKC e o PKG no processo de secreção de muci- na, a invenção atual examina os substratos intracelulares potenciais destas enzimas que poderiam ter um papel nos eventos de sinalização a jusante da ativação quinase. Numero- sos substratos intracelulares podem ser fosforilados pelo PKC ou PKG, e a fosforilação pelo PKC de tal substrato, a proteína MARCKS, parece ser de interesse especial. A fosforilação de MARCKS foi observada como correlacionada com uma quantidade de processos celula- res envolvendo a sinalização e a contração cito-esqueletal de PKC, como o movimento de célula, metagênese, e liberação de transmissor neural. Como o processo dinâmico de se- creção requer tanto a ativação como a translocação quinase de grânulos intracelulares para a periferia da célula, MARCKS parece ser um candidato para a uma molécula mediadora ligando a ativação PKC/PKG e a exocitose do grânulo de mucina.

MARCKS é uma molécula chave de ligação da ativação PKC/PKG com a secreção de mucina nas células NHBE.

Para avaliar o mecanismo de sinalização a jusante da ativação da proteína quinase, a proteína MARCKS, foi estudado um substrato celular específico de PKC que pode ter um papel na ligação da ativação quinase com a liberação do grânulo. Primeiramente, a presen- ça de MARCKS nas células NHBE foi confirmada através do ensaio de imuno- precipitação marcado por ácido mirístico [3H]. Conforme ilustrado na figura 2A, MARCKS foi expresso nas células NHBE, e a maior parte desta proteína foi associada com a membrana nas con- dições não estimuladas. Na figura 2A, as células foram marcadas com ácido mirístico[3H] durante a noite e as frações de membrana (alameda 1) e de citosol (alameda 2) foram então isoladas por centrifugação diferencial. Uma função do MARCKS como um componente regu- latório chave da rota de secreção de mucina poderá ser demonstrado de três formas diferen- tes.

Conforme mencionado acima, o envolvimento direto de MARCKS na secreção de mucina pelas células NHBE poderá ser demonstrado através de três linhas separadas de evidência. Primeiramente, a secreção de mucina em resposta à estimulação por ΡΜΑ+8-Br- cGMP ou UTP foi inibida de uma forma dependente da concentração pelo peptídeo MANS, que tinha a seqüência de aminoácido identifica a região do terminal N do MARCKS, enquan- to que o peptídeo de controle correspondente (RNS), que continha a mesma composição de aminoácido, mas que foi arrumado em uma ordem aleatória, não afetou a secreção. O do- mínio miristoilado do terminal N do MARCKS é conhecido como mediando a associação membrana-MARCKS. Conforme indicado na figura 8, MARCKS poderá funcionar como uma ligação molecular através da interação com membranas do grânulo no seu domínio do ter- minal N e sendo ligado a filamentos de actina no seu sítio PSD, dessa forma retendo os grânulos para o citoesqueleto contrátil para a movimentação e a exocitose. A figura 8 mostra um mecanismo possível mostrando que o secretagogo de mucina interage com as células epiteliais das vias respiratórias (goblet) e ativa duas proteínas quinases separadas, PKC e PKG. O PKC ativado fosforila o MARCKS, provocando a translocação do MARCKS da membrana do plasma para o citoplasma, enquanto que o PKG ativado através da rota do óxido nítrico (NO)—>GC-S->cGMP—>PKG, por seu lado ativa um PP2A citoplásmico o qual desfosforila o MARCKS. Esta desfosforilação estabiliza a ligação de MARCKS com as membranas do grânulo. Além disso, o MARCKS também interage com actina e miosina, dessa forma ligando os grânulos na maquinaria contrátil celular para a movimentação sub- seqüente e a liberação exocitótica. A ligação de MARCKS com os grânulos depois que ele é liberado para dentro do citoplasma poderá também ser orientada através de proteínas com o objetivo específico ou alguma outra forma de interação proteína-proteína nas quais o domí- nio do terminal N de MARCKS é envolvido. Em qualquer caso, o peptídeo MANS1 ou um fragmento ativo do mesmo, composto pelo menos de 6 aminoácidos, agiria para inibir com- petitivamente o direcionamento do MARCKS para as membranas dos grânulos de mucina, dessa forma bloqueando a secreção.

Um segundo teste demonstrou o efeito inibidor de um oligo- nucleotídeo anti-senso específico do MARCKS sobre a secreção de mucina. Conforme mostrado nas figuras 3A-3C o olígonucleotídeo regula para baixo o MARCKS mRNA e os níveis de proteína das células NHBE e atenua substancialmente a secreção de mucina induzida pela ativação PKC/PKG. A inibição não era tão dramática quanto aquela vista com o peptídeo MANS1 o que poderá ser devido aos níveis elevados de proteína MARCKS endógena nas células NHBE e a meia vida relativamente longa de MARCKS mRNA (t1/2 = 4 - 6 h). Nas figuras 3A- 3C, as células NHBE foram tratadas com o anti-senso ou o olígonucleotídeo de controle durante três dias e então estimuladas com PMA (100 nM)+8-Br-cGMP (1 μΜ) durante quinze minutos. A secreção de mucina foi analisada por ELISA. O total de RNA total e proteína foi isolado das células trata- das. MARCKS mRNA foi avaliada pela hibridização Northern, e a proteína foi avaliada pelo "Western blot". No PMA (100 nM)+8-Br-cGMP (1 μΜ) a figura 3A é um "Northern blot" que mostrou uma redução em torno de 15% no MARCKS mRNA comparado com o controle do tráfico anexo; a figura 3B é um "Western blot" que mostrou uma redução de cerca de 30% na proteína MARCKS no gráfico anexo; e a figura 3C mostra uma hipersecreção de mucina atenuada significativamente pelo oligonucleotide anti-senso, enquanto que o olígonucleotí- deo de controle não tinha nenhum efeito. Os dados são apresentados como média ± S.E. (n=6 em cada ponto) enquanto que o * é significativamente diferente do meio de controle (p<0,05); e o ΐ é significativamente diferente da estimulação PMA+8=Br=cGMP (p<0,05). Adicionalmente, é notado que o termo CTO é o olígonucleotídeo de controle, enquanto o termo ASO é um olígonucleotídeo anti-senso.

Foi demonstrado que os oligonucleotídeos anti-senso que são complementares aos RNAs específicos podem inibir a expressão dos genes celulares como proteínas. Ver Erick- son e Izant, Gene Regulation: Biology of Antisense RNA And DNA, Vol 1, Raven Press, N.Y., 1992. Por exemplo, foi relatada a inibição seletiva de um gene p21 que é diferente de um gene normal em um só nucleotídeo. Chang et al., Biochemistry (1991), 30: 8283 - 8286. Foram propostas várias hipóteses para explicar os mecanismos pelos quais os oligonucleo- tídeos anti-senso inibem a expressão do gene, no entanto, o mecanismo específico envolvi- do poderá depender do tipo de célula estudada, do RNA visado, do sítio específico no RNA visado, e da natureza química do olígonucleotídeo. Chiang et al., J. Biol. Chem. 1991, 266: 18162- 18171; Stein and Cohen1 Câncer Res. 1988, 48: 2659 - 2668.

Uma terceira experiência indicou que a transfecção de células BHEI com um MARCKS mutante com PSD deletado resultou em uma repressão significativa da secreção de mucina induzida pela ativação PKC/PKG. A eliminação do PSD aboliria a habilidade do MARCKS para se ligar à actina. Conforme indicado na figura 8, através da competição com o MARCKS nativo para a ligação com a membrana do grânulo, o MARCKS truncado de PSD poderia através do mesmo inibir a liberação do grânulo porque ele é incapaz de intera- gir com os filamentos de actina. A transfecção destas células com o MARCKS cDNA do tipo selvagem não aumentou ainda mais a secreção de mucina. O ensaio de "Western blot" mos- trou que o nível de expressão do MARCKS endógeno nas células HBEI era bastante eleva- do, comparável com aquele nas células NHBE, e a transfecção do MARCKS cDNA do tipo selvagem não levou a aumentos notáveis no nível total de proteína MARCKS nestas células. Isto poderá explicar porque a transfecção com o MARCKS do tipo selvagem não aumentou ainda mais a secreção e também porque a transfecção com o MARCKS com o PSD deleta- do obstruiu somente parcialmente a secreção de mucina.

Estudos de bloqueio de peptídeo - As células NHBE foram pré-incubadas com o peptídeo MANS ou o RNS (1-100 mu.M) durante quinze minutos, e então foi adicionado PMA (100nM)+8-Br-cGMP (1 μΜ) ou UTP (100 μΜ), e as células foram incubadas durante quinze minutos adicionais ou 2h, respectivamente. A secreção de mucina foi medida por ELISA. Conforme mostrado na figura 2B, a incubação das células NHBE com o peptídeo MANS resultou em uma supressão dependente da concentração de secreção de mucina em resposta à ativação PKC/PKG ou à estimulação UTP1 enquanto que o peptídeo de controle (RNS) pode não ter afetado a secreção nestas mesmas concentrações. Na figura 2B, o pep- tídeo MANS bloqueia a hipersecreção de mucina induzida por PMA+8-Br-cGMP ou UTP de uma forma dependente da concentração. As células NHBE foram pré-incubadas com o pep- tídeo indicado durante quinze minutos e então expostas ao PMA (100nM)+8-Br-cGMP (l.mu.M) durante quinze minutos ou UTP (100 μΜ) durante 2h. A secreção de mucina foi medida por ELISA. Os dados são apresentados como média ± .S.E.(n=6 em cada ponto), enquanto que * é significativamente diferente do meio de controle p<0,05); t é significativa- mente diferente da estimulação PMA+8-Br-cGMP (p<0,05); e í é significativamente diferente da estimulação UTP (<0,05). Os efeitos do peptídeo MANS provavelmente não eram rela- cionados com a citotoxidez ou repressão geral da atividade alcoólica celular, porque nem o peptídeo MANS nem o RNS afetaram a liberação de desidrogenase de Iactato ou da absor- ção de deoxiglicose [3H] pelas células.

Estudos de oligonucleotídeo anti-senso - Para demonstrar ainda mais que o MARCKS é um componente de sinalização chave da rota de secreção de mucina, foi exa- minado o efeito do oligonucleotídeo anti-senso direcionado contra o MARCKS na secreção de mucina. Conforme ilustrado na figura 3, este oligonucleotídeo anti-senso reduziu ambos os níveis de mRNA e de proteína do MARCKS nas células NHBE e atenuou significativa- mente a secreção de mucina induzida pelo PMA+8-Br-cGMP, enquanto que o oligonucleotí- deo de controle não tinha nenhum efeito.

MARCKS serve como uma molécula de sinalização convergente mediando a comunicação cruzada das rotas de PKC e PKG

Coletivamente, os resultados acima demonstraram que o MARCKS foi envolvido to- talmente no processo de secreção de mucina. A seguir, os inventores atuais mostram como o MARCKS atua como uma molécula reguladora chave sobre a qual convergem PKC e PKG para regular a secreção de mucina. Conforme ilustrado na figura 5, MARCKS foi fosforilado pelo PKC e em conseqüência, foi translocado da membrana para o citoplasma. Aqui, o PKG parece induzir a desfosforilação do MARCKS (figura 5A, alameda 4, e figura 5B). Esta des- fosforilação foi revertida pelo inibidor de PKG Rp-8-Br-PET-cGMP ( figura 5A, alameda 5), indicando que a desfosforilação era especificamente dependente de PKG. Na figura 5, as células NHBE foram marcadas com ortofosfato [32P] e então foram expostas aos reagentes indicados. A fosforilação de MARCKS em resposta aos tratamentos foi avaliada pelo ensaio de imuno-precipitação. na figura 5A , 8-Br-cGMP reverteu a fosforilação de MARCKS indu- zida por PMA, e este efeito do 8-Br-cGMP podia ser bloqueado pelo Rp-8-Br-PET-cGMP (inibidor de PKG) ou pelo ácido ocadaico (inibidor PP1/2A). Para a figura 5B, a fosforilação do MARCKS induzida pelo PMA foi revertida pela exposição subseqüente das células ao 8- Br-cGMP. Alameda 1, somente o meio durante 8 minutos; alameda 2, 100 nM PMA durante 3 minutos; alameda 3, 100 nM PMA durante 3 minutos e então com 1 μΜ de 8-Br-cGMP durante 5 minutos; alameda 4, 100 nM PMA durante 8 minutos; o alameda 5, somente o meio durante três minutos e então 100 nM PMA+1 μΜ 8-Br-cGMP durante 5 minutos. Na figura 5C, a desfosforilação MARCKS induzida por 8-Br-cGMP foi atenuada pela fostriecina de uma forma dependente da concentração.

Acredita-se que o PKG atue para desfosforilar o MARCKS através da ativação de uma proteína fosfatase. Conforme ilustrado na figura 5A (alameda 6, ácido ocadaico a 500 nM, uma concentração que poderia inibir ambos o PP1 e PP2A, bloqueou a desfosforilação de MARCKS induzida por PKG, sugerindo que o PKG provocou a desfosforilação através da ativação do PP1 e/ou do PP2A. Outros estudos com fostriecina e ensaio direto das ativida- des da fosfatase indicou que somente o PP2A foi ativado pela PKG e foi responsável pela remoção dos grupos fosfato do MARCKS (figura 5C). É provável que o ácido ocadaico ou a fostriecina, em concentrações que inibiram a desfosforilação do MARCKS induzida pelo PKG, atenuaram a secreção de mucina induzida pelo PMA+8-Br-cGMP ou UTP conforme mostrado na figura 6. A figura 6 ajuda a demonstrar que o PP2A é um componente essenci- al da rota de secreção de mucina. As células NHBE foram pré-incubadas com a concentra- ção indicada de fostriecina, ácido ocadaico (500 nM), ou somente o meio durante 15 minu- tos e então foram estimuladas com PMA (100 nM)+8-Br-cGMP (1 μΜ) durante 15 minutos ou com UTP (100 μΜ) durante 2h. A mucina secretada foi medida por ELISA. Os dados são apresentados como média ± S.E (n+6 em cada ponto) onde * significa que é significativa- mente diferente do meio de controle (p<0,05);t significa significativamente diferente da esti- mulação PMA+8-Br-cGMP (p<0,05); e í significa significativamente diferente da estimulação UTP p<0,05). Assim sendo, a desfosforilação de MARCKS por meio de PP2A ativado por PKG parece ser um componente essencial da rota de sinalização que leva à exocitose do grânulo de mucina.

Para revelar os eventos moleculares pelos quais MARCKS liga a ativação quinase à secreção de mucina, foi investigada em profundidade a fosforilação de MARCKS em res- posta à ativação PKC/PKG. Conforme ilustrado na figura 4A , PMA (100 nM) possivelmente induziu um aumento significativo (3-4 vezes) na fosforilação do MARCKS nas células NHBE, e esta fosforilação foi atenuada pelo inibidor de PKC calfostina C (500 nM). Tão logo foi fosforilado, o MARCKS foi translocado da membrana do plasma para o citoplasma (figu- ra 4B). Mais especificamente, a figura 4A mostrou que a ativação do PKC resulta na desfos- forilação do MARCKS nas células NHBE. As células foram marcadas com ortofosfato [32P] durante 2h e então foram expostas aos reagentes de estimulação e/ou inibição. A fosforila- ção do MARCKS em resposta aos tratamentos foi avaliada através de imuno-precipitação, conforme descrito. Alameda 1, meio de controle; alameda 2, veículo, 0,1% Me.sub.2SO; alameda 3, 100 nM 4a-PMA; alameda 4, 100 nM PMA; alameda 5, 100 nM PMA+500 nM calfostina C; alameda 6, 500 nM calfostina C. A figura 4B demonstra que o MARCKS fosfori- lado é translocado da membrana do plasma para o citoplasma. As células marcadas com 32P foram expostas ao PMA (100 nM) sou ao meio sozinho durante 5 minutos, e então a membrana e as frações de citosol foram isoladas. A ativação do PKG por 8-Br-cGMP (1 μΜ, outro evento necessário de ativação de quinase para provocar a secreção de mucina, não levou à fosforilação do MARCKS, mas de fato, foi observado um efeito oposto: a fosforilação do MARCKS induzida pelo PMA foi revertida pelo 8-Br-cGMP (figura 5A). Este efeito do 8- Br-cGMP não era devido à supressão da atividade do PKC, porque a fosforilação induzida pelo PMA podia ser revertida pela adição subseqüente de 8-Br-cGMP para as células (figura 5B). Assim sendo, a ativação de PKG provavelmente resulta na desfosforilação do MARCKS.

Investigação adicional demonstrou que a desfosforilação de MARCKS induzida pelo PKG foi bloqueada pelo ácido ocadaico 500 nM, um inibidor de proteína fosfatase (tipo 1 e/ou 2A (PP1/2A)) ( figura 5A, alameda 6). Assim sendo, parece que a desfosforilação foi mediada pelo PP1 e/ou PP2A. Para definir o sub-tipo de proteína fosfatase envolvida, foi utilizado um inibidor novo mais específico de PP2A, fostriecina (IC50=3,2 nM), nos estudos adicionais de fosforilação. Conforme ilustrado na figura 5C, a fostriecina inibiu a desfosfori- lação do MARCKS induzida por PKG de uma forma dependente da concentração (1- 500 nM), sugerindo que o PKG induziu a desfosforilação através da ativação do PP2A. Para con- firmar ainda mais a ativação do PP2A pelo PKG nas células NHBE, as atividades citosolicas de PP1 e PP2A foram determinadas depois da exposição das células ao 8-Br-cGMP. A ati- vidade do PP2A foi aumentada aproximadamente 3 vezes (de 0,1 a 0,3 nmol/min/mg de proteínas, p<0,01) em concentrações de 8-Br-cGMP tão baixas quanto 0,1. um.M, enquanto que a atividade do PP1 permaneceu inalterada. Estes dados indicam que o PP2A poderá ser ativado pelo PKG e é responsável pela desfosforilação do MARCKS. Assim sendo, esta atividade do PP2A parece crítica para que ocorra a secreção de mucina; quando a desfosfo- rilação do MARCKS induzida pelo PKG foi bloqueada pelo ácido ocadaico ou pela fostrieci- na, a resposta de secreção e ativação pelo PKC/PKG ou estimulação pelo UTP foi melhora- da (figura 6).

MARCKS é associado com actina e miosina no citoplasma

A figura 7 detalha um ensaio de imuno-precipitação rádio- marcado que revela que o MARCKS poderá ser associado com duas outras proteínas (em torno de 200 e em torno de 40 kDa) no citoplasma. Na figura 7 as células NHBE foram marcadas com Ieucina [3H] e prolina[3H] durante a noite e a membrana e as frações de citosol foram preparadas conforme descrito em "Experimental Procedures". As frações isoladas foram pré-clareadas previamen- te com o anticorpo de controle não imune (6F6). O citosol foi então dividido igualmente em duas frações e foi usado para a execução da imuno-precipitação na presença de 10 μΜ de citocalasina D (Biomol, Plymouth Meeting, Pa.) com o anticorpo anti-MARCKS 2F12 (alame- da 2) e o anticorpo de controle não imune 6F6 (alameda 3), respectivamente. A proteína MARCKS na fração de membrana foi também avaliada através de imuno-precipitação utili- zando-se o anticorpo 2F12 (alameda 1). O complexo de proteína precipitado foi recolocado em solução por intermédio de eletroforese de gel de poliacrilamida-SDS a 8% e visualizado através de auto- radiografia aumentada. O MARCKS parece ser associado com duas proteí- nas citoplásmicas com massas moleculares em torno de 200 e cerca de 40 kDa, respecti- vamente. Estas duas proteínas associadas a MARCKS foram retiradas do gel e analisadas através de ionização de desorção a leiser auxiliado pela matriz/espectrometria de massa tempo de vôo/seqüência interna (the Protein/DNA Technology Center of Rockfeller Univer- sity, N.Y.). A massa de peptídeo obtida e os dados de seqüência foram usados para procu- rar um banco de dados de proteínas através dos programas da Internet ProFound e MS-Fit. Os resultados indicam que eles são miosina (cadeia pesada, tipo A, diferente de músculo) e actina, respectivamente. A análise de ionização de desorção a Ieiser auxiliada por ma- triz/espectrometria de massa tempo de vôo/seqüência interna, indica que estas duas proteí- nas associadas com MARCKS eram miosina (cadeia pesada, tipo A, diferente de músculo) e actina, respectivamente.

Estes estudos sugerem um novo paradigma para o mecanismo de sinalização con- trolando a secreção exocitótica dos grânulos de mucina das vias respiratórias assim como fornecendo o que se acredita ser a primeira evidência direta que demonstra uma função biológica especifica do MARCKS em um processo fisiológico. O MARCKS serve como uma molécula mediadora chave regulando a liberação do grânulo de mucina nas células epiteliais humanas das vias respiratórias. Acredita-se que a elicitação da secreção de mucina das vias respiratórias requer as duas ações de ativação e de sinérgica de PKC e PKG . O PKC ativado fosforila o MARCKS, resultando na translocação do MARCKS da face interna da membrana do plasma para dentro do citoplasma. A ativação do PKG1 por seu lado, ativa o PP2A, o qual desfosforila o MARCKS no citoplasma. Como a habilidade de associação com a membrana do MARCKS é dependente do seu estado de fosforilação, esta desfosforilação poderá permitir que o MARCKS reganhe a sua capacidade de ligação com a membrana e poderá permitir que o MARCKS ataque as membranas dos grânulos de mucina citoplásmi- cos. Como também interage com a actina e a miosina no citoplasma (figura 7), o MARCKS poderá então ser capaz de reter os grânulos no aparelho contrátil celular, mediando o mo- vimento dos grânulos para a periferia da célula e a liberação exocitótica subseqüente. A lar- ga distribuição dos MARCKS sugere a possibilidade deste ou de um mecanismo semelhante poder regular a secreção de grânulos ligados com membrana em vários tipos de célula sob condições normais ou patológicas.

A invenção também se refere a um método novo para o bloqueio de qualquer pro- cesso de secreção celular, especialmente àquele de liberação de mediadores inflamatórios de grânulos contidos dentro de células inflamatórias, cujas rotas de estimulação envolvem o substrato de proteína MARCKS da proteína quinase C (PKC) e libera os conteúdos das vesículas ligadas na membrana. Especificamente, os inventores mostraram que a liberação estimulada do mediador inflamatório peroxidase de neutrofilos humanos (figura 9) ou cani- nos (figura 10) pode ser bloqueada pelo peptídeo de uma forma dependente da concentra- ção. Especificamente, a figura 9 mostra neutrofilos isolados que foram estimulados para a secreção de peroxidase (MPO) com 100 nM PMA e 10 mu.M 8-Br-cGMP. 100 μΜ de peptí- deo MANS reduziu a secreção de MPO para níveis de controle (*=p<0,05). 10 μΜ de MANS provoca uma ligeira redução na secreção de MPO. 10 a 100 μΜ de um peptídeo de controle (RNS) não tem nenhum efeito na secreção de MPO. Na figura 10, os neutrofilos isolados foram estimulados para a secreção de mielo- peroxidase (MPO) com 100 nM de PMA e 10 μΜ de 8-Br-cGMP. 100 μΜ do peptídeo MANS reduziram a secreção de MPO para níveis de controle (*=p<0,05). 10 μΜ de MANS provoca uma ligeira redução na secreção de MPO. 10 ou 100 μΜ de um peptídeo de controle (RN) não tem nenhum efeito na secreção de MPO. Assim sendo, o peptídeo poderá ser utilizado terapeuticamente para bloquear a Iibe- ração de mediadores de inflamação secretados de células inflamatórias de infiltração em quaisquer tecidos. Vários destes mediadores liberados são responsáveis pelos danos ex- tensos nos tecidos observados em uma variedade de doenças inflamatórias crônicas (i.e., doenças respiratórias tais como asma, bronquite crônica e COPD, doenças inflamatórias do intestino grosso, incluindo colite ulcerativa e doença de Crohn1 doenças autoimunes, doen- ças da pele, tais como rosácea, eczema; e acne severa, artrite e síndrome de dor, tais como artrite reumatóide). Esta invenção poderá ser útil para o tratamento de doenças, tais como artrite, bronquite crônica, COPD e fibrose cística.

Esta invenção, assim sendo, é útil para o tratamento de doenças, tanto em seres humanos como em animais, especialmente aquelas afetando eqüinos, caninos, felinos, e outros animais domésticos.

As figuras 11-15 mostram a secreção de MPO, tanto para seres humanos como para caninos. Em todas estas experiências, os neutrófilos isolados foram estimulados com PLS em uma concentração de 1 χ 10~6 M durante 10 minutos a 37 ° C antes da adição do estímulo, conforme indicado nas figuras. O LPS prepara as células de forma que possam responder ao secretagogo.

Em uma realização, esta invenção apresenta um método de regulagem de uma in- flamação em um indivíduo, que é composto da administração de uma quantidade terapeuti- camente efetiva de uma composição farmacêutica composta de um peptídeo MANS ou um fragmento ativo do mesmo. Em um aspecto desta realização, o referido fragmento ativo da proteína MANS é composto pelo menos de 6 aminoácidos. Em outro aspecto, a referida in- flamação é provocada por doenças respiratórias, doenças do intestino grosso, doenças da pele, doenças autoimunes e síndromes da dor. Em outro aspecto, as referidas doenças res- piratórias são escolhidas do grupo consistindo de asma, bronquite crônica, e COPD. Em outro aspecto, as referidas doenças do intestino grosso são escolhidas do grupo consistindo de colite ulcerativa, doença de Crohn e síndrome do intestino grosso irritável. Em outro as- pecto, as referidas doenças da pele são escolhidas do grupo consistindo de rosácea, ecze- ma, psoríase e acne severa. Em outro aspecto, a referida inflamação é provocada por artrite ou fibrose cística. Em outro aspecto, o referido indivíduo é um mamífero. Adicionalmente, em outro aspecto, o referido mamífero é escolhido do grupo consistindo de seres humanos, caninos, eqüinos e felinos. Em outro aspecto, a referida etapa de administração é escolhida do grupo consistindo de administração tópica, administração parenteral, administração retal, administração pulmonar, administração nasal, inalação e administração oral. Em outro as- pecto, a referida administração pulmonar é escolhida do grupo de aerossol, inalador de pó seco, inalador de dose medida, e nebulizador.

Em outra realização, esta invenção apresenta um método para a regulagem de um processo de secreção celular em um indivíduo, que é composto da administração de uma quantidade terapeuticamente efetiva de uma composição farmacêutica compreendendo pelo menos de um composto constituído de um peptídeo MANS ou um fragmento ativo do mes- mo, que regula um mediador inflamatório em um indivíduo. Em um aspecto desta realização, o referido fragmento ativo da proteína MANS é composto pelo menos de 6 aminoácidos. Em outro aspecto, a referida regulagem de um processo de secreção celular é o bloqueio ou a redução de um processo de secreção celular. Em outro aspecto, o referido mediador infla- matório é provocado por doenças respiratórias, doenças do intestino grosso, doenças da pele, doenças autoimunes e síndrome da dor. Em outro aspecto, as referidas doenças respi- ratórias são escolhidas do grupo consistindo de asma, bronquite crônica, e COPD. Em outro aspecto, as referidas doenças do intestino grosso são escolhidas do grupo consistindo de colite ulcerativa, doença de Crohn e síndrome do intestino grosso irritável. Em outro aspec- to, as referidas doenças da pele são escolhidas do grupo consistindo de rosácea, eczema, psoríase e acne severa. Em outro aspecto, o referido mediador inflamatório é provocado por artrite ou fibrose cística. Em outro aspecto, o referido indivíduo é um mamífero. Em outro aspecto, o referido mamífero é escolhido do grupo consistindo de seres humanos, caninos, eqüinos e felinos. Em outro aspecto, a referida etapa de administração é escolhida do grupo consistindo de administração tópica, administração parenteral, administração retal, adminis- tração pulmonar, administração nasal, inalação e administração oral. Em outro aspecto, a referida administração pulmonar é escolhida do grupo de aerossol, inalador de pó seco, ina- lador de dose medida, e nebulizador.

Em outra realização, esta invenção apresenta um método para a redução da infla- mação em um indivíduo, que é composto da administração de uma quantidade terapeutica- mente efetiva de um composto que inibe a liberação de mediadores inflamatórios relaciona- da com MARCKS, onde a liberação dos mediadores inflamatórios no indivíduo é reduzida, em comparação com aquela que ocorreria na ausência do referido tratamento. Em um as- pecto desta invenção, o referido composto é pelo menos um fragmento ativo de uma proteí- na MARCKS. Em outro aspecto, o referido fragmento ativo tem um comprimento pelo menos de 6 aminoácidos. Em outro aspecto, o referido composto é um peptídeo MANS ou um fragmento ativo do mesmo. Em outro aspecto, o referido composto é um oligonucleotídeo anti-senso direcionado contra a seqüência de codificação de uma proteína MARCKS ou de um fragmento ativo da mesma. Em outro aspecto, o referido fragmento ativo tem um com- primento pelo menos de 6 aminoácidos.

Em outra realização, esta invenção apresenta um método de redução da inflama- ção em um indivíduo, que é composto da administração de uma quantidade terapeuticamen- te efetiva de uma composição farmaceuticamente ativa constituída de um composto que inibe a liberação de mediadores inflamatórios relacionada com MARCKS, onde a inflamação no indivíduo é reduzida em comparação com aquela que ocorreria na ausência do referido tratamento. Em um aspecto desta invenção, o referido composto é um fragmento ativo de uma proteína MARCKS. Em outro aspecto, o referido fragmento ativo tem um comprimento pelo menos de 6 aminoácidos. Em outro aspecto, o referido composto é um peptídeo MANS ou um fragmento ativo do mesmo. Em outro aspecto, o referido composto é um oligonucleo- tídeo anti-senso direcionado contra a seqüência de codificação de uma proteína MARCKS ou de um fragmento ativo da mesma. Em outro aspecto, o referido fragmento ativo tem um comprimento pelo menos de 6 aminoácidos. A invenção atual se destina a incluir uma com- posição que contém um ou mais dos peptídeos MANS ou dos seus fragmentos ativos e o uso dos mesmos no tratamento de inibição da liberação de mediadores inflamatórios em grânulos ou vesículas de células inflamatórias.

Em outra realização, esta invenção apresenta um método de regulagem da libera- ção do grânulo de mucina em um indivíduo, que é composto da administração de um com- posto que regula a liberação do grânulo de mucina, onde os grânulos de mucina são reduzi- dos, quando comparado com aquilo que ocorreria na ausência dos referidos grânulos de mucina. Em um aspecto desta invenção, o referido composto é um fragmento ativo de uma proteína MARCKS. Em outro aspecto, o referido composto é um peptídeo MANS.

Em outra realização, esta invenção apresenta um método para a regulagem da se- creção exocitótica de grânulos de mucina das vias respiratórias em um indivíduo, que é composto de: administração de um composto que regula a liberação do grânulo de mucina, onde os grânulos de mucina são reduzidos, quando comparados com aqueles que ocorreria um na ausência dos referidos grânulos de mucina. Em um aspecto desta realização, o refe- rido composto é um fragmento ativo de uma proteína MARCKS. Em outro aspecto, o referi- do composto é um peptídeo MANS.

Em outra realização, esta invenção apresenta um método para a modulação da se- creção de muco em um indivíduo que é composto de: administração de uma quantidade terapêutica de uma seqüência anti-senso que é complementar à codificação de seqüências de uma proteína MARCKS ou de um fragmento ativo da mesma, onde a secreção de muco pela referida celular é inibida, em comparação com aquela que ocorreria na ausência de tal administração. Em um aspecto desta realização, a referida seqüência tem pelo menos 18 ácidos nucleicos de comprimento. Em outro aspecto, o referido composto é complementar à codificação de seqüências do peptídeo MANS ou de um fragmento ativo do mesmo. Em outro aspecto, a referida modulação da secreção de muco está bloqueando ou reduzindo a secreção de muco.

Em outra realização, esta invenção apresenta um método para a redução ou inibi- ção da inflamação em um indivíduo, que é composto da administração de uma quantidade terapeuticamente efetiva, pelo menos de um peptídeo composto do peptídeo MANS ou de um fragmento ativo do mesmo, que é efetiva para modular um mediador inflamatório no sítio de inflamação. Em um aspecto desta realização, o referido fragmento ativo tem pelo menos um comprimento de 6 aminoácidos. Em outro aspecto, os referidos mediadores inflamatórios são produzidos por células que são escolhidas do grupo consistindo de neutrófilos, basófi- los, eosinófilos, monócitos e leucócitos. De preferência, as células são leucócitos, mais de preferência, granulócitos, e ainda mais de preferência, neutrófilos, basófilos, eosinófilos ou uma combinação dos mesmos. Em outro aspecto, o agente é administrado oralmente, pa- renteralmente, cavitariamente, retamente, ou através de passagem de ar. Em outro aspecto, a referida composição é ainda constituída de uma segunda molécula, escolhida do grupo consistindo de um antibiótico, um composto anti-viral, um composto anti-parasítico, um composto anti-inflamatório e um imunosupressor.

Um fragmento ativo de um peptídeo MANS pode ser escolhido do grupo consistindo dos peptídeos miristoílados de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, e SEQ ID NO:19.

Em outro aspecto desta invenção, os métodos apresentados nesta invenção podem ser executados utilizando-se ou administrando-se as combinações dos peptídeos apresen- tados na invenção, i.e., através do uso ou da administração de um peptídeo escolhido do grupo consistindo de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID N0:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO: 19 e combinações dos mesmos. De preferência, é utilizado ou administrado um só peptídeo nos métodos apresentados aqui.

Em resposta à ativação da proteína quinase C (PKC) por um estimulante inflamató- rio, a desgranulação em uma célula escolhida do grupo consistindo de neutrófilos, eosinófi- los, monócitos/macrófagos e linfócitos pode ser atenuada pela pré-incubação e pela co- incubação com um peptídeo idêntico à região terminal N da proteína MARCKS, onde o pep- tídeo é escolhido do grupo consistindo do peptídeo MANS (SEQ ID NO: 1) e fragmentos N- terminais miristoílados do mesmo (SEQ ID NO: 3 a 19). Apesar da duração dos tempos e concentrações poderem variar entre os tipos de células, em todos os casos o peptídeo MANS atenua a desgranulação induzida pelo PKC.

Métodos e materiais

Cultura de células NHBE - A expansão, crio-conservação, e cultura de células NHBE na interface ar/liquido foram executadas conforme descrito anteriormente. Ver, Krun- kosky et al. Resumidamente, as células NHBE (Clonetics, San Diego, Calif.) foram semea- das em frascos de cultura de tecido T75 ventados (500 células/cm2) e cultivados até que as células alcançaram uma confluência de 75 - 80%. As células foram então dissociadas por tripsina/EDTA e congeladas como passage-2. A cultura da interface ar/líquido foi iniciada semeando-se as células passage-2 (2 χ 10^4 células/cm2) em inserções de cultura clara TRANSWELL® (Costar, Cambridge, Mass.) que foram finamente revestidas com colágeno de calda de rato, tipo I (Collaborative Biomedical, Bedford, Mass.). As células foram cultiva- das submersas em meio em um ambiente com ar umidificado a 95%, 5% de CO2 durante 5 - 7 dias até próximo da confluência. Naquele momento, foi criada a interface ar/líquido re- movendo-se o meio apical e alimentando-se as células basalateralmente. Daí por diante, o meio foi renovado diariamente. As células foram cultivadas durante 14 dias adicionais para permitir a diferenciação completa.

Medição da secreção de mucina por ELISA - Antes do recolhimento de amostras de mucina de "uma linha de referencia" e de "teste", o muco acumulado na superfície apical das células foi removido por lavagem com solução salina tamponada por fosfato, pH 7,2. Para recolher a secreção da linha de referencia, as células foram incubadas somente com o meio, e a mucina secretada no meio apical foi recolhida e guardada. As células foram colocadas em descanso durante 24h e então foram expostas ao meio contendo os reagentes estimula- dores e/ou inibidores escolhidos (ou controles apropriados) após o que a mucina secretada foi recolhida é guardada como a amostra de teste. Os tempos de incubação para a linha de referencia e de teste eram os mesmos, mas variaram, dependendo do reagente de teste utilizado. Ambas as secreções da linha de referencia e de teste foram analisadas por ELISA utilizando-se um método de captura de anticorpo conforme é conhecido na arte. Ver, por exemplo, Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, pp. 570 - 573, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1988). O anticorpo principal para este ensaio foi o 17Q2 (Babco, Richmond, Calif.), um anticorpo monoclonal que reage especificamente com um epitopo de carboidrato na mucina das vias respiratórias humanas. A relação entre a mu- cina de teste e a da linha de referencia, é semelhante a um "índice de secreção", e foi usada para quantificar a secreção de mucina, permitindo que cada prato de cultura servisse como o seu próprio controle e portanto, minimizando o desvio causado pela variabilidade entre os poços de cultura. Wright et al., Am. J. Physiol. 271, L854-L861 (1996). Os níveis de secre- ção de mucina foram relatados como percentagem do meio de controle.

Ensaio de imunoprecipitação rádio-marcada - Quando foi feita a marcação com fos- fato [-32P] as células foram pré- incubadas durante 2h em um meio Eagle modificado por Dulbecco isento de fosfato contendo 0,2% de albumina de soro bovino e então marcadas com 0,1 mCi/ ml [32P] ortofosfato (9000 Ci/mmol, PerkinElmer Life Sciences) durante 2h.

Para a marcação com ácido mirístico [3H] ou aminoácidos 3H, as células foram incubadas durante a noite em meio contendo 50 μCi/ml de ácido mirístico [3H] (49 Ci/mmol, PerkinEI- mer Life Sciences) ou 0,2 mCi/ml de leucina [2H] (159 Ci/mmol, PerkinElmer Life Sciences) mais 0,4 mCi/ml de prolina [3H] (100 Ci/mmol, PerkinEImer Life Sciences). Após a marcação, as células foram expostas a reagentes estimulantes durante 5 minutos. Quando foi utilizado um inibidor, as células foram pré-incubadas com o inibidor durante 15 minutos antes da es- timulação. No final dos tratamentos, as células foram Iisadas em uma solução tampão con- tendo 50 mM de Tris-HCI (pH 7,5), 150 mM de NaCl, 1 mM de EDTA, 10% de glicerol, 1% de Nonidet P-40, 1 mM de fluoreto de fenilmetilsulfonila, 1 mM de benzamidina,10 pg/ml de pepstatina A, e 10 pg/ml de leupeptina. A contagem da precipitação e cintilação de ácido tricloroacético poderá determinar a eficiência da radio- marcação em cada cultura. A imuno- precipitação da proteína MARCKS foi executada de acordo com o método de Spizz and Blackshear utilizando lisatos de célula contendo contagens iguais/min. Spizz et ai., J. Biol. Chem 271, 553 - 562 (1996). As proteínas precipitadas foram recolocadas em solução por eletroforese de gel de poliacrilamida-SDS a 8% e visualizadas através de auto-radiografia. Foram utilizados neste ensaio o anticorpo MARCKS anti-humano (2F12) e o anticorpo de controle não imune (6F6).

Para avaliar o MARCKS ou os complexos de proteína associados com MARCKS em frações sub-celulares diferentes, as células rádio-marcadas e tratadas foram colocadas em uma solução tampão de homogeneização (50 mm Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM de fluoreto de fenilmetilsulfonila, 1 mM de benzamidina,10 pg/ml de pepstatina A, 10 pg/ml de leupeptina) e então desintegradas por cavitação com nitrogênio (800 li- bras/polegada quadrada durante 20 minutos a 4°C). Os Iisatos de célula foram centrifuga- dos a 600 χ g durante 10 minutos a 4 ° C para a remoção do núcleo das células não fratura- das. Os sobrenadantes pós-nucleares foram separados em frações de membrana e de cito- sol através de ultra-centrífugação a 400.000 χ g durante 30 minutos a 4°C. O grânulo de membrana foi solubilizado na solução tampão de Iise através de sonicação. A imuno- precipitação foi então executada conforme descrito acima.

Peptídeos relacionados com MARCKS - Ambos os peptídeos da seqüência N- terminal miristoílada (MANS) e da seqüência N-terminal aleatória foram sintetizados na Ge- nemed Synthesis, Inc. (San Francisco, Calif.), e então foram purificados por cromatografia líquida de alta pressão (> 95% puro) e confirmada por espectroscopia de massa com cada um mostrando um só pico com uma massa molecular apropriada. O peptídeo MANS consis- tiu de uma seqüência idêntica aos primeiros 24 aminoácidos do MARCKS, i.e., a região N- terminal miristoílada que media a inserção de MARCKS em membranas, MA- GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA, (SEQ ID NO: 1 (onde MA= cadeia de miristato N- terminal). O peptídeo de controle correspondente (RNS) continha a mesma composição de aminoácido que o MANS, mas colocado em uma ordem aleatória, MA- GTAPAAEGAGAEVKRASAEAKQAF (SEQ ID NO: 2). A presença do radical miristato hidró- fobo nestes peptídeos sintéticos aumenta a sua permeabilidade para as membranas de plasma, permitindo que os peptídeos sejam absorvidos rapidamente pelas células. Para se determinar os efeitos destes peptídeos na secreção de mucina, as células foram pré- incubadas com os peptídeos durante 15 minutos antes da adição de secretagogos, e a se- creção de mucina foi então medida por ELISA.

Oligonucleotídeos anti-senso - O oligonucleotídeo anti-senso MARCKS e seu oligo- nucleotídeo de controle correspondente foram sintetizados na Biognostik GmbH (Gottingen, Alemanha). As células NHBE foram tratadas com 5 μΜ de anti-senso ou oligonucleotídeo de controle apicalmente durante 3 dias (na presença de 2 μ/ml de lipofectina para as primeiras 24h). As células foram então incubadas com secretagogos, e a secreção de mucina foi me- dida por ELISA. O total de RNA e de proteínas foi isolado das células tratadas. MARCKS mRNA foi avaliada pela hibridização Northern, de acordo com procedimentos convencionais, utilizando-se o MARCKS cDNA como uma sonda. O nível de proteína MARCKS foi determi- nado por "Western blot" utilizando-se anti-MARCKS IgGI (clone 2F12) como o anticorpo de detecção principal.

Transfecção transitória - O domínio do sítio de fosforilação (PSD) do MARCKS contém os sítios de fosforilação dependentes de PKC e o sítio de ligação a filamentos de actina. Para construir um MARCKS cDNA com PSD deletado, foram gerados pela reação da cadeia de polimerase dois fragmentos flanqueando a seqüência PSD (codificação para 25 aminoácidos) e então foram ligados através do sítio Xhol que foi ligado nos terminais 5' dos iniciadores de oligonucleotídeos destinados para a reação da cadeia de polimerase. O mu- tante resultante cDNA e o MARCKS cDNA do tipo selvagem foram cada um deles inseridos em um vetor de expressão de mamíferos pcDNA4/TO (Invitrogen, Carlsbad, Calif.). Os cons- tructos recombinantes isolados foram confirmados por digestos de restrição e seqüência de DNA.

HBEI é uma linha de células epiteliais bronquiais humanas transformadas em vírus papiloma da secreção de mucina quando cultivadas na interface ar/líquido. A transfecção das células HBEI foi feita utilizando-se o reagente de transfecção Effectene (Quiagen, Va- lentia, Calif.) de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, as células HBEI diferenciadas cultivadas na interface ar/ líquido foram dissociadas por tripsina/EDTA e se- meadas novamente em placas de cultura com 12 poços com 1 χ 10^5 células/cm2. Depois de incubação durante a noite, as células foram transfectadas com o MARCKS cDNA do tipo selvagem, o MARCKS cDNA truncado com PSD, ou o vetor de DNA. As células foram culti- vadas durante 48h para permitir a expressão dos genes e então foram expostas aos secre- tagogos e a secreção de mucina foi medida por ELISA. Todas as transfecções foram execu- tadas na presença de pcDNA4/TO/lacZ plasmid (lnvitrogen)(relação do DNA 6:1, total 1pg de DNA, relação entre o DNA e o reagente de Effectene -1:25) para monitorar as variações na eficiência de transfecção. Os resultados não mostraram nenhuma diferença significativa nas atividades na beta-galactosidase nos Iisatos da célula isolados das células transfecta- das, indicando uma eficiência de transfecção semelhante entre os constructos diferentes de DNA (dados não mostrados).

Ensaio da atividade da proteína fosfatase - As atividades PP1 e PP2A foram medi- das utilizando-se um sistema de ensaio de proteína fosfatase (Life Technologies, Inc.) con- forme conhecido na arte, com ligeiras modificações. Huang et al., Adv. Exp. Biol. 396, 209 - 215 (1996). Resumidamente, as células NHBE foram tratadas com 8-Br-cGMP ou somente o meio durante 5 minutos. As células foram então desagregadas em uma solução tampão de Iise (50 mM Tris-HCI (pH 7,4), 0,1% de beta-mecaptoetanol, 0,1 mM de EDTA, 1 mM de benaamidina, 10 μg/ml de pepsatina A, 10 Mg/ml de leupeptina) e dissolvidas por sonicação durante 20 segundos a 4 ° C. Os Iisatos de célula foram centrifugados e os sobrenadantes foram guardados para teste de atividade da fosfatase. O teste foi executado utilizando-se fosforilase A marcada com 32P como um substrato. O 32Pi foi contado por cintilação. A con- centração de proteína de cada amostra foi determinada pelo teste Bradford. A atividade PP2A foi expressa como a atividade total da amostra de fosfatase menos a atividade rema- nescente na presença de ácido ocadaico 1 nM. A atividade do PP1 foi expressa como a dife- rença entre as atividades restantes na presença de 1 μΜ de ácido ocadaico 1 nM, respecti- vamente. As atividades da proteína fosfatase foram relatadas como mois de Pi liberados por minuto/mg de proteína total.

Ensaio de citotoxidez - Todos os reagentes utilizados no tratamento das células NHBE foram examinados em relação à citotoxidez medindo-se a liberação total da desidro- genase Iactato das células. O ensaio foi executado utilizando-se o kit Cytotox Promega de acordo com as instruções do fabricante. Todas as experiências foram executadas com rea- gentes em concentrações não citotóxicas.

Análise estatística - Foram analisados os dados em relação à significância utilizan- do-se uma análise de uma só passagem da variância com correções pós-teste Bonferroni. As diferenças entre os tratamentos foram consideradas significantes em um ρ < 0,05.

Isolamento de PMNs do sangue canino - As etapas envolvidas no isolamento de PMN incluem a coleta de 10 ml de sangue anti- coagulado ACD. Então adicionando-se 5 ml sobre 3,5 ml do meio de isolamento PMN enquanto se assegurava que o meio de isolamen- to PMN (IM) estava na temperatura ambiente (RI). A seguir, o sangue foi centrifugado na temperatura ambiente durante 30 minutos, 550 χ g a 1700 RPM. A pequena banda branca inferior foi transferida para um tubo centrífugo cônico de 15 ml (CCFT). A seguir, foi adicio- nado 2V HESS com 10% de soro bovino fetal (PBS) e foi centrifugado na temperatura ambi- ente durante 10 minutos, 400 χ g a 1400 RPM. O grânulo foi então colocado em suspensão em 5 ml de 1-1ESS com PBS. A suspensão da célula foi adicionada a 50 ml de CCFT con- tendo 20 ml de NH4CI a 0,88% resfriado por gelo e invertido duas a três vezes. O produto resultante foi centrifugado durante 10 minutos, 800 χ g a 2000 RPM, e então aspirado e re- colocado em suspensão em 5 ml de HBSS com FBS. A preparação foi examinada através da contagem da citospina, e de preferência, para o sangue integral, o número de células devendo ser entre 109 -1011 células e para os PMNs1 o número de células deveria ser entre 2 - 4 χ 10^7 células. Ver, genericamente, Wang et al., J. Immunol., " Neutrophil-induced changes in the biomechanical properties of endothelial cells: roles of ICAM-1 and reactive oxygen species," 6487- 94 (2000).

Ensaio colorimétrico de enzima - As amostras foram ensaiadas em relação à ativi- dade MPO em placas de microtitulação de fundo redondo com 96 poços utilizando um kit sanduíche ELISA (R & D Systems, Minneapolis, Minn.). Resumidamente, 20 μΙ de amostra 10 são misturados com 180 μΙ da mistura de substrato contendo fosfato de potássio 33 mM, pH 6,0, 0,56% de Triton X-100, 0,11 mM de peróxido de hidrogênio, e 0,36 mM de diidrocloreto de O-dianisidina em um poço de microtitulação individual. As concentrações finais na mistu- ra do ensaio são: fosfato de potássio 30 mM, pH 6,0, 0,05% de Trityon X-100, 0,1 mM de peróxido de hidrogênio, e 0,32 mM de diidrocloreto de O-dianisidina. Depois da mistura, a 15 mistura do ensaio foi incubada na temperatura ambiente durante 5 minutos, e foi determina- da espectro-fotometricamente a atividade da enzima a 550 nanômetros. As amostras foram ensaiadas em duplicata.

Estudos de secreção do mediador inflamatório

Foram utilizados quatro tipos diferentes de leucócitos ou modelos que secretam conteúdos específicos de grânulos em resposta à ativação induzida por éster forbol de PKC. Os neutrófilos foram isolados do sangue humano e foi avaliada a liberação in vítro de MPO por estas células. Também foi avaliada a liberação dos mediadores inflamatórios ligados à membrana a partir de linhas de células humanas de leucócitos disponíveis comercialmente.

O clone 15 da linha de células promielocíticas humanas HL-60 foi utilizado para avaliar a secreção de EPO (Fischkoff SA. Aumento gradual na probabilidade da diferenciação de eo- sinófilos das células de leucemia promielocíticas HL-60 induzidas por cultura em condições alcalinas. Leuk Res 1988; 12: 679 - 686; Rosenberg HF, Ackerman S J, Tenen DG. proteína catiônica de eosinófilos humanos: clonagem molecular de uma citotoxina e helmintototoxina com a atividade da ribonuclease. J Exp Med 1989; 170: 163 - 176; Tiffany HL, Li F, Rosenberg HF. Hyperglycosylation of eosinophil ribonucleases in a promyelocytic Ieukemia cell Iine and in differentiated peripheral blood progenitor cells. J Leukoc Biol 1995; 58: 49 - 54; Badewa AP, Hudson CE, Heiman AS. Os efeitos regulatórios da eotaxina, eotaxina-2 e eotaxina-3 na desgranulação dos eosinófilos e na geração de anions de superóxido. Exp Biol Med 2002; 227: 645 - 651). A linha de células de leucemia monocíticas U937 foi utili- zada para a avaliação da secreção de lisozima (Hoff T, Spencker T, Emmendoerffer A., Goppelt-Struebe M. Effects of glucocorticoids on the TPA-induced monocytic differentiation. J Leukoc Biol 1992; 52: 173 - 182; Balboa M A, Saez Y, Balsinde J. Calcium-independent phospholipase Α2 is required for Iysozyme secretion in U937 promonocytes. J Immunol 2003; 170: 5276 - 5280; Sundstrom C1 Nilsson K. Establishment and characterization of a human histiocytic Iymphoma cell Iine (U-937). Int J Câncer 1976; 17: 565 - 577). A linha de células matadoras naturais de linfócitos NK- 92 usada para avaliar a liberação de granzima (Gong JH, Maki G, Klingemann HG. Caracterização da linha de células humanas (NK- 92) com características fenotípicas e funcionais das células matadoras naturais ativadas. Leu- kemia 1994; 8: 652 - 658; Maki G, Klingemann HG1 Martinson JA1 Tam YK. Fatores de regu- lagem da atividade citotóxica da linha de células matadoras naturais e humanas, NK- 92. J Hematother Stem Cell Res 2001; 10: 369 - 383; Takayama H, Trenn G, Sitkovsky MV. Um ensaio novo de ativação do linfócito citotóxico T. J Immunol Methods 1987; 104: 183 - 190). Em todos os casos, as células foram pré-incubadas com uma faixa de concentrações de um peptídeo sintético idêntico ao terminal N do MARCKS com 24 aminoácidos [peptídeo de se- qüência de terminal N miristoílado - MANS; MA-GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA (SEQ IN NO: 1)] onde MA é miristoíla ligada na amina de terminal N do peptídeo através de uma ligação amida), ou um peptídeo de controle mis-senso [RNSA: Peptídeo de seqüência de terminal N aleatória; MAGTAPAAEGAGAEVKRASAEAKQAF (SEQ ID NO: 2)], que consiste dos mesmos 24 aminoácidos, mas colocados em uma seqüência de ordem aleatória que possui menos de 13% de identidade de seqüência com a seqüência do peptídeo MANS.

Em cada um dos tipos de célula, MANS, mas não RNS, atenua a liberação dos me- diadores inflamatórios de uma forma dependente da concentração. Um curso de tempo útil de observação é de 0,5 - 3,0 horas. Os resultados são consistentes com a região do termi- nal N da proteína MARCKS sendo envolvida em rotas intercelulares levando à desgranula- ção de leucócitos.

Isolamento de neutrófilos humanos - Estes estudos foram aprovados pelo "NCSU Human Studies Institutional Review Board (IRB)". Os neutrófilos humanos foram isolados conforme descrito anteriormente (ver Takabhi S, Okubo Y, Horie S. A contribuição do CD54 para eosinófílos humanos e produção do superóxido de neutrófilos. J Appl Physiol 2001; 91: 613 - 622) com ligeiras modificações. Resumidamente, o sangue venenoso heparinizado foi obtido de voluntários saudáveis normais, foi diluído com RPMI- 1640 (Cellgro: Mediatech, Inc., Herndon, VA) em uma relação de 1:1, depositado sobre um Histopaco (densidade, 1,077 g/ml; Sigma-Aldrich1 Co., St. Louis, MO) e centrifugado a 400 g durante 20 minutos a 4°C. As células sobrenadantes e mononucleares na interface foram cuidadosamente remo- vidas, e os eritrócitos no segmento foram lisados em água destilada resfriada. Os granulóci- tos isolados foram lavados duas vezes com solução de sais balanceados de Hanks (HBSS) e recolocados em suspensão em HBSS sobre gelo. Os neutrófilos usados para as experiên- cias tinham uma pureza > 98% com contaminação < 2% por eosinófílos, e a viabilidade era > 99% conforme determinado pela exclusão de corante azul Trypan. Medição da atividade MPO de neutrófilos liberados - Para a medição da liberação de MPO, neutrófilos humanos purificados em suspensão em HBSS foram separados em cotas de 4 χ 10^6 células/ml em tubos de 15 ml e foram pré- incubados com 50 ou 100 μΜ do peptídeo MANS ou RNS durante 10 minutos a 37°C. As células foram então estimuladas com 100 nM de forbol 12-miristato 13-acetato, (PMA) durante até 3h. Foi estabelecida uma referência de controle (referência de controle PMA) utilizando-se neutrófilos humanos purifi- cados em suspensão em HBSS em cotas de 4 χ 10^6 células/ml em tubos de 15 ml estimula- dos com 100 nM de forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) na ausência de MANS ou RNS pelos mesmos períodos de tempo. A reação foi finalizada colocando-se os tubos sobre gelo e centrifugando-se a 400 durante 5 minutos a 4°C.

A atividade MPO no sobrenadante de célula foi ensaiada utilizando tetrametilbenzi- dina (TMB) com base em uma técnica estabelecida anteriormente (Abdel-Latif D, Steward M, Macdonald DL, Francis GA., Dinauer MC, Lacy P. Rac2 é crítico para a exocitose dos grânulos primários de neutrófilos. Blood 2004; 104: 832 - 839). Resumidamente, 100 μΙ de solução de substrato TMB foram adicionados a 50 μl de sobrenadante de células ou MPO humano standard (EMD Biosciences, Inc., San Diego, CA) em um micro-prato de 96 poços seguido por incubação na temperatura ambiente durante 15 minutos. A reação foi terminada pela adição de 50 μl de H2SO4 1M e foi lida a absorbância a 450 nm em um leitor de micro- prato de espectrofotômetro (VERSA max, Molecular Devices, Sunnyvale, CA).

Estudos de cultura de leucócito

Três tipos de linhas de células de leucócitos humanos, especificamente, a linha de células promielicíticas HL-60 clone 15, a linha de células monocíticas U 937, e a linha de células matadoras naturais de linfócitos NK- 92, foram compradas da American Type Culture Collection (ATCC; Rockville, MD). As células HL-60 clone 15 (ATCC CRL-1964) foram man- tidas em meio consistindo de RPMI 1640 com L-glutamina suplementada com 10% de soro bovino fetal inativado por calor (FBS; Gibco; Invitrogen Co., Carlsbad, CA), 50 lU/ml de pe- nicilina, 50 pg/ml de streptomicina, e 25 mM de solução tampão HEPES, pH 7,8, a 37°C em uma atmosfera contendo 5% de CO2. A diferenciação final para um fenótipo semelhante a eosinófilo foi iniciada através do cultivo de células a 5 χ 10^5 células/ml no meio acima con- tendo 0,5 mM de ácido butírico (Sigma-Aldrich Co.) durante 5 dias conforme descrito anteri- ormente (Tiffany HL, Li F, Rosenberg HF. Hiperglicosilação de ribonucleases de eosinófilos em uma linha de células de leucemia promielocíticas em células progenitoras de sangue periférico diferenciado. J Leukoc Biol 1995; 58: 49 - 54; Tiffany HL, Alkhatib G, Combadiere C, Berger EA, Murphy PM. Receptores 1e 3 de quimioquina CC são regulados diferencial- mente por IL-5 durante a maturação das células HL-60 eosinofílicas. J Immunol 1998; 160: 1385 - 1392). As células U937 (ATCC CRL- 1593.2) foram cultivadas a 37°C em uma at- mosfera de 5% de CO2 em um meio completo consistindo de RPMI 1640 com L-glutamina suplementada com 10% de FBS1 50 IU/ml de penicilina, e 50 pg/ml de streptomicina. As cé- lulas NK- 92 (ATCC CRL- 2407) foram mantidas em meio de alfa-MEM (Sigma-AIdrich Co.) suplementado com 20% de FBS , 100 U/ml de interleukin-2 (IL-2) (Chemicon International, Inc., Temecula, CA), 5 χ 10-5 M de 2-mercaptoetanol, 50 lU/ml de penicilina, e 50 μο/ιτιΙ de streptomicina a 37 0 C em uma atmosfera contendo 5% de CO2. A morfologia da célula foi avaliada através da variação de células manchadas com Wright-Giemsa. A viabilidade das células coletadas para as experiências foi avaliada através da exclusão de azul trypan e foram usadas em populações de células com viabilidade de > 95%.

Incubação de células para os ensaios de desgranulação

As células HL-60 clone 15, U 937, e NK- 92 foram lavadas e recolocadas em sus- pensão a 2,5 χ 106 células/ml em RPMI- 1640 isento de fenol vermelho (Cellgro; Mediatech, Inc.) para todos os ensaios de desgranulação. Amostras de células em tubos de 15 ml foram pré-incubadas com as concentrações indicadas do peptídeo MANS ou RNS durante 10 mi- nutos a 37 ° C. As células foram então estimuladas com PMA durante até 2h. Foi estabele- cido uma referência de controle (referência de controle de PMA) para cada tipo de célula utilizando-se HL-60 clone 15, U937, e NK-92, respectivamente, que foram lavadas e recolo- cadas em suspensão a 2,5 χ 10^6 células/ml em RPMI- 1640 isento de vermelho fenol e esti- muladas com PMA, mas na ausência do peptídeo MANS ou RNS, pelos mesmos períodos de tempo. A reação foi finalizada colocando-se os tubos sobre gelo e centrifugando-se as células a 400 g durante 5 minutos a 4 ° C.

Para as medições de MPO liberado dos neutrófilos e da lisozima liberada das célu- las U 937, nós fomos capazes de quantificar a secreção utilizando como padrões MPO hu- mano e ovalbumina branca de ovo, respectivamente. Para a liberação de EPO das células HL-60 clone 15 e para a granzima liberada das células NK- 92, não havia nenhum standard disponível para uso para quantificação. Assim sendo, foram medidos ambos os níveis libe- rados e intracelulares (das células lisadas de EPO e granzima, e o EPO e a granzima libe- rados foram expressos como percentagem do total (intracelular e liberado) para cada um deles. Para medir a EPO intracelular nas células HL-60 clone 15 e a granzima intracelular nas células NK-92, foram utilizadas amostras apropriadas de células Iisadas com triton X- 100 a 0,1% para a quantificação das proteínas de grânulos intracelulares conforme descrito abaixo. Todos os tratamentos foram expressos como percentagens do controle para minimi- zar a variabilidade entre as culturas.

Medição da liberação de HL-60 EPO.

A atividade EPO liberada pelas células HL-60 clone 15 foi testada utilizando-se TMB de acordo com uma técnica estabelecida previamente (Lacy P, Mahmudi-Azer S, Ba- blitz B, Hagen SC, Velazquez JR, Man SF1 Moqbel R. Mobilização rápida das RANTES es- tocadas intracelular- mente em resposta às interferon-gama em eosinófilos humanos. Blood 1999; 94: 23 - 32). Assim sendo, 100 μΙ de solução de substrato TMB foram adicionados a 50 microlitros (μΙ = microlitro) de amostras em um micro-prato com 96 poços e incubados na temperatura ambiente durante 15 minutos (min = minutos). A reação foi finalizada pela adi- ção de 50 μΙ de H2SO4 1,0 M e foi lida a absorbância a 450 nm (nm = nanômetros) em um leitor de micro-prato espectrofotometricamente. A quantidade de EPO secretada foi expres- sa como percentagem do conteúdo total, utilizando-se a quantidade obtida no mesmo núme- ro de células Iisadas por triton X-100.

Medição da secreção de monócito de Iisozima

A Iisozima secretada pelas células U 937 foi medida utilizando-se um ensaio espec- trofotométrico conforme descrito anteriormente (Balboa M A, Saez Y, Balsinde J. É requeri- da a fosfolipase A2 independente de cálcio para a secreção de lisozima em promonocitos de U 937. J. Immunol 2003; 170: 5276-5280) com uma ligeira modificação. Assim sendo, 100 μl de amostras foram misturados com 100 μl de suspensão de Micrococcus lysodeikticus (Sigma-Aldrich Co.) (0,3 mg/ml em 0,1 mM de solução tampão de fosfato de sódio, pH 7,0) em um micro-prato com 96 poços. A redução na absorbância a 450 nm foi medida na tem- peratura ambiente. Foi construída uma curva de calibração utilizando-se Iisozima branca de ovo de galinha (EMD Biosciences, Inc.) como standard.

Medição de secreção de granzima de células NK

A granzima secretada das células NK- 92 foi ensaiada através da medição da hidró- lise de Να-benziloxicarbonil-L-lisina tiobenzil éster (BLT) essencialmente conforme descrito anteriormente (Takayama H, Trenn G, Sitkovsky MV. Um ensaio novo de ativação de linfóci- to T citotóxico. J Immunol Methods 1987; 104: 183 - 190). 50 μΙ do sobrenadante foram transferidos para um prato com 96 poços, e 150 μl da solução BLT (0,2 mM BLT; EMD Bios- ciences, Inc., e 0,22 mM de DTNB; Sigma-Aldrich Co.) (mM = milimolar) em solução salina tamponada por fosfato (PBS, pH 7,2) foi adicionada ao sobrenadante. Foi lida a absorbância a 410 nm depois da incubação durante 30 minutos na temperatura ambiente. Os resultados foram expressos como percentagem do teor total de enzima celular, utilizando a quantidade obtida no mesmo número de células Iisadas por triton X-100.

Análise estatística

A significância estatística das diferenças entre os vários grupos de tratamento foi avaliada com ANOVA de uma só passagem. Valores de P < 0,05 foram considerados como significativos.

Liberação de MPO de neutrófilos

Descobriu-se que 100 nM PMA (como estimulador da liberação do mediador infla- matório) aumentou a liberação de MPO de neutrófilos humanos em aproximadamente três vezes contra o nível de controle a 30 minutos na referência de controle PMA, a liberação de MPO aumentando até aproximadamente 5-6 vezes depois de 3h. Após 30 minutos, em relação à atividade do MPO de controle com 100% de PMA ausente e PMA ausente mais MAN ou RNS, a atividade de MPO da referência de controle de PMA era em torno de 275%, PMA mais 50 μΜ de MANS era em torno de 275%, e 100 μΜ de MANS era em torno de 305%. Assim sendo, o peptídeo MANS não tinha nenhum efeito detectado em 30 minutos.

No entanto, após 1 hora, a concentração maior de MANS (100 μΜ tinha um efeito inibidor significativo (medido em torno de 260% do controle ou cerca de 25% de redução na libera- ção de MPO contra o nível de referência de controle de PMA (o qual foi medido em torno de 340% do controle). A amostra de 50 μΜ de MANS foi medida em torno de 290% do controle ou cerca de 15% de redução em relação a referência de controle de PMA. Após 2h e persis- tindo até 3h, o peptídeo MANS atenuou significativamente a atividade de MPO em uma for- ma dependente da concentração. No final de 2h, a atividade do MPO de referência do con- trole de PMA era em torno de 540% do controle, os 50 μΜ de MANS (medido em torno de 375% do controle) provocaram uma redução de aproximadamente 30% da liberação de MPO contra a referência de controle de PMA; e 100 μΜ de MANS (medido em torno de 295% do controle) provocaram uma redução de aproximadamente 45% da liberação de MPO contra a referência de controle de PMA. Depois de 3h, a atividade de MPO da referên- cia de controle era em torno de 560% do controle, os 50 μΜ de MANS (medido em torno de 375% do controle) provocaram uma redução de aproximadamente 33% de liberação de MPO em relação à referência de controle de PMA ; 100 μΜ de MANS (medido em torno de 320% de controle) provocaram uma redução de aproximadamente 40% de liberação de MPO contra a referência de controle de PMA. O peptídeo RNS não afetou a liberação de MPO induzida por PMA em nenhum dos pontos de tempo ou das concentrações testados.

Liberação de HL-60 EPO

A atividade EPO no sobrenadante das células HL-60 clone 15 foi significativamente aumentada depois de 1 e 2h após a estimulação de PMA. Depois de 1 hora, em relação à atividade EPO do controle como sendo 100%, a referência de controle PMA foi medida em torno de 110%. A amostra continha 10 μΜ de MANS medida em torno de 95% para produzir cerca de 15% de redução na atividade EPO em relação à referência de controle de PMA; a amostra contendo 50 μΜ de MANS medida em torno de 78% para produzir cerca de 30% de redução na atividade de EPO em relação a referência de controle de PMA; e a amostra con- tendo 100 μΜ de MANS, medida em torno de 65% para produzir cerca de 40% de redução na atividade de EPO em relação a referência de controle de PMA. Depois de 2h, em relação à atividade de EPO do controle como sendo 100%, a referência de controle de PMA foi me- dida em torno de 145%; a amostra contendo 10 μΜ de MANS foi medida em torno de 130% para produzir cerca de 10% de redução na atividade de EPO em relação a referência de controle de PMA; a amostra contendo 50 μΜ de MANS foi medida em torno de 70% para produzir cerca de 50% de redução na atividade de EPO em relação a referência de controle de PMA; e a amostra contendo 100 μΜ de MANS foi medida em torno de 72% para produzir cerca de 50% de redução na atividade de EPO em relação a referência de controle PMA. Assim sendo, tanto em 1 como 2h, MANS a 50 ou 100 μΜ atenuou significativamente a libe- ração de EPO. O peptídeo RNS não afetou a liberação de EPO aumentada por PMA em nenhum momento ou concentrações testadas.

Liberação de lisozima de U937

A secreção de lisozima pelas células U937 foi aumentada através da estimulação do PMA 1h após a incubação, e aumentou ainda mais depois de 2h. Em 1h, em relação à secreção de lisozima pelas células U937 do controle como sendo 100%, a referência de controle de PMA foi medida em torno de 210%; a amostra contendo 10 μΜ de MANS foi medida em torno de 170% para produzir cerca de 20% de redução na secreção de lisozima pelas células U937 em relação a referência de controle PMA; a amostra contendo 50 μΜ de MANS foi medida em torno de 170% para produzir cerca de 20% de redução da secreção de lisozima pelas células U937 em relação a referência de controle de PMA; e a amostra con- tendo 100 μΜ de MANS foi medida em torno de 115% para produzir cerca de 45% de redu- ção na secreção de Iisozima pelas células U937 em relação a referência de controle de PMA. Depois de 2h, em relação à secreção de lisozima das células U937 do controle como sendo 100%, a referência de controle de PMA foi medida em torno de 240%; a amostra con- tendo 10 μΜ de MANS foi medida em torno de 195% para produzir cerca de 20% de redu- ção na secreção de lisozima pelas células U937 em relação a referência de controle de PMA; a amostra contendo 50 μΜ de MANS foi medida em torno de 185% para produzir cer- ca de 25% de redução na secreção de células U937 em relação a referência de controle de PMA; e a amostra contendo 100 μΜ de MANS foi medida em torno de 140% para produzir cerca de 40% de redução na secreção de lisozima pelas células U937 em relação a referên- cia de controle PMA. Assim sendo, a secreção de lisozima foi significativamente atenuada 1 e 2h após a estimulação por 100 μΜ de MANS mas nem tanto por 50 ou 10 μΜ de MANS. O peptídeo RNS não afetou a secreção de Iisozima aumentada por PMA em nenhum momento ou concentração testada.

Liberação de granzina de células NK

Depois de 1 hora, em relação à secreção de granzina pelas células NK- 92 do con- trole como sendo 100%, a referência de controle de PMA foi medida em torno de 125%. A amostra contendo 10 μΜ de MANS foi medida em torno de 115% para produzir cerca de 10% de redução na secreção de granzina pelas células NK- 92 em relação a referência de controle de PMA; e a amostra contendo 100 μΜ de MANS foi medida em torno de 85% em relação a referência de controle de PMA para produzir cerca de 30% de redução na secre- ção de granzima pelas células NK- 92 em relação a referência de controle de PMA. Após 2h, em relação a secreção de granzina pelas células NK- 92 do controle como sendo 100%, a referência de controle de PMA mediu cerca de 220%. A amostra contendo 10 μΜ de MANS foi medida em torno de 200% para produzir cerca de 10% de redução na secreção de gran- zima pelas células NK-92 em relação a referência de controle de PMA; e a amostra conten- do 100 μΜ de MANS mediu cerca de 80% para produzir cerca de 60% de redução da secre- ção de granzima pelas células NK- 92 em relação a referência de controle de PMA. Assim sendo, a secreção de granzima das células NK- 92 não foi significativamente aumentada pelo PMA após 1h, mas foi aumentada duas vezes após 2h. 100 μΜ de MANS, mas não 10 micro M de MANS, atenuaram a secreção de granzima 1 e 2h após a incubação. O peptídeo RNS não afetou a secreção de granzima aumentada pelo PMA em nenhum momento ou concentração testados.

Citotoxidez

Nenhum dos tratamentos gerou uma resposta tóxica nas células, conforme avaliado pela retenção/liberação de LDH (dados não mostrados) (ver também Park J-A, He F, Martin LD, Li Y, Adler KB. A elastase de neutrófilos humanos induz a hipersecreção de mucina das células epiteliais bronquiais humanas in vitro através de um mecanismo mediado por PKCõ. Am J Pathol 2005; 167: 651 - 661).

Os exemplos mencionados são ilustrativos da invenção atual e não devem ser con- siderados como Iimitantes da mesma. A invenção é definida pelas reivindicações anexas, com os equivalentes das reivindicações sendo incluídos na mesma. LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> BioMarck Pharmaceuticals, Ltd. North Carolina State University

<120> nMETODOS PARA A REGDLAGEM DE MEDIADORES

INFLAMATÓRIOS E PEPTÍDEOS ÚTEIS NOS MESMOS"

<130> BMRK-003/03WO

<150> US 11/367.499 <151> 2006-03-06

<160> 20

<170> Patentln Ver. 3.3

<210> 1 <211> 24 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial: peptideo sintético

<220>

<223> Peptideo poderá ter um radical miristato de terminal N

<400> 1

Gly Ala Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu 1 5 10 15

Arg Pro Gly Glu Ala Ala Val Ala 20

<210> 2 <211> 24 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial: peptideo sintético

<220>

<223> Peptideo poderá ter um radical miristato de terminal N

<400> 2

Gly Thr Ala Pro Ala Ala Glu Gly Ala Gly Ala Glu Val Lys Arg Ala 1 5 10 15

Ser Ala Glu Ala Lys Gln Ala Phe 20

<210> 3 <211> 22 <212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Descrição da seqüência artificial: peptideo sintético

<220>

<223> Peptideo poderá ter um radical miristato de terminal N <400> 3

Gly Ala Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu 1 5 10 15

Arg Pro Gly Glu Ala Ala 20

<210> 4 <211> 21 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial: peptideo sintético

<220>

<223> peptideo poderá ter um radical miristato de terminal N

<400> 4

Gly Ala Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu 1 5 10 15

Arg Pro Gly Glu Ala 20

<210> 5 <211> 20 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial: peptideo sintético

<220>

<223> Peptideo poderá ter um radical miristato de terminal N <400> 5

Gly Ala Gln Phe ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu 1 5 10 15

Arg Pro Gly Glu 20

<210> 6 <211> 19 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial: peptideo sintético

<220>

<223> Peptideo poderá ter iam radical miristato de terminal N

Gly0Ala Gln Phe ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu 1 5 10 15

Arg Pro Gly <210> 7 <211> 18 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial: peptideo sintético

<220>

<223> Peptideo poderá ter um radical miristato de terminal N <400> 7

Gly Ala Gln Phe ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu 1 5 10 15

Arg Pro

<210> 8 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial: peptideo sintético

<220>

<223> Peptideo poderá ter um radical miristato de terminal N <400> 8

Gly Ala Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu 1 5 10 15

Arg

<210> 9 <211> 16 <212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Descrição da seqüência artificial: peptideo sintético

<220>

<223> Peptideo poderá ter um radical miristato de terminal H

<400> 9

Gly Ala Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu 1 5 10 15

<210> 10 <211> 15 <212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Descrição da seqüência artificial: peptideo sintético

<220> <223> Peptideo poderá ter um radical miristato de terminal N

<400> 10

Glv Ala Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala 1 5 10 15

<210> 11 <211> 14 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial: peptideo sintético

<220>

<223> Peptideo poderá ter um radical miristato de terminal N <400> 11

Gly Ala Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala 1 5 10

<210> 12 <211> 13 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial: peptideo sintético

<220>

<223> Peptideo poderá ter um radical miristato de terminal N <400> 12

Gly Ala Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala 1 5 10

<210> 13 <211> 12 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial: peptideo sintético

<220>

<223> Peptideo poderá ter um radical miristato de terminal N

<400> 13

Gly Ala Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu 1 5 10

<210> 14 <211> 11 <212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Descrição da seqüência artificial: peptideo sintético

<220> <223> Peptideo poderá ter um radical miristato de terminal N <400> 14

Gly Ala Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly 1 5 10

<210> 15 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial: peptídeo sintético

<220>

<223> Peptideo poderá ter um radical miristato de terminal N <400> 15

Gly Ala Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys 1 5 10

<210> 16 <211> 9 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial: peptideo sintético

<220>

<223> Peptideo poderá ter um radical miristato de terminal N <400> 16

Gly Ala Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala 1 5

<210> 17 <211> 8 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial: peptideo sintético

<220>

<223> Peptideo poderá ter um radical miristato de terminal N

<400> 17

Gly Ala Gln Phe Ser Lys Thr Ala 1 5

<210> 18 <211> 7 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial: peptideo sintético

<220> <223> Peptideo poderá ter um radical miristato de terminal N <400> 18

Gly Ala Gln Phe Ser Lys Thr 1 5

<210> 19 <211> 6 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial: peptideo sintético

<220>

<223> Peptideo poderá ter vim radical miristato de terminal N <400> 19

Gly Ala Gln Phe Ser Lys 1 5

<210> 20 <211> 23 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial: peptideo sintético

<220>

<223> Peptideo poderá ter um radical miristato de terminal N <400> 20

Gly Ala Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu 1 5 10 15

Arg Pro Gly Glu Ala Ala vai 20

Claims

1. Método para a inibição da liberação exocitótica de pelo menos um mediador in- flamatório de pelo menos uma célula inflamatória, CARACTERIZADO pelo fato que com- preende o contato de pelo menos uma célula inflamatória, cuja célula é composta pelo me- nos que um mediador inflamatório contido dentro de uma vesícula dentro da célula, com pelo menos um peptídeo escolhido do grupo consistindo de um peptídeo MANS e um frag- mento ativo do mesmo em uma quantidade efetiva para a redução da liberação do referido mediador inflamatório da referida célula inflamatória quando comparado com a liberação do referido mediador inflamatório do mesmo tipo de célula inflamatória que ocorreria na ausên- cia do referido pelo menos um peptídeo.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato do referi- do peptídeo ser um peptídeo MANS composto de SEQ ID NO:1.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato do referi- do fragmento ativo ser composto pelo menos de um fragmento N-terminal miristoílado com- posto pelo menos de 6 aminoácidos, onde o primeiro aminoácido do referido fragmento co- meça na glicina N-terminal do SEQ ID NO:1.

4. Método, de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADO pelo fato do referi- do fragmento ativo poder ser escolhido do grupo consistindo de N-miristoil- GAQ FS KTAAG EAAE RPG EAAV(SEQ ID N0:20);N-miristoil- GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAA (SEQ ID NO: 3); N-miristoil- GAQFSKTAAKGEAAAERPGEA (SEQ ID NO: 4); N-miristoil-GAQFSKTAAKGEAAAERPGE (SEQ ID NO: 5); N-miristoil-GAQFSKTAAKGEAAAERPG (SEQ ID NO: 6); N-miristoil- GAQFSKTAAKGEAAAERP (SEQ ID NO: 7); N-miristoíI-GAQFSKTAAKGEAAAER (SEQ ID NO: 8); N-miristoil-GAQFSKTAAKGEAAAE (SEQ ID NO: 9); N-miristoil- GAQFSKTAAKGEAAA (SEQ ID NO: 10); N-miristoil-GAQFSKTAAKGEAA (SEQ ID NO: 11); N-miristoil-GAQFSKTAAKGEA (SEQ ID NO: 12); N-miristoil-GAQFSKTAAKGE (SEQ ID NO: 13); N-miristoil-GAQFSKTAAKG (SEQ ID NO: 14); N-miristoil-GAQFSKTAAK (SEQ ID NO: 15); N-miristoil-GAQFSKTAA (SEQ ID NO: 16); N-miristoil-GAQFSKTA (SEQ ID NO: 17); N- miristoil-GAQFSKT (SEQ ID NO: 18); e N-miristoil-GAQFSK (SEQ ID NO: 19).

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato da referi- da célula inflamatória ser um leucócito.

6. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato da referi- da célula inflamatória ser um granulócito.

7. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato da referi- da célula inflamatória ser escolhida do grupo consistindo de um neutrófilo, um basófilo, um eosinófilo e uma combinação dos mesmos.

8. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato da referi- da célula inflamatória ser um monócito ou um macrofágio.

9. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato do referi- do mediador inflamatório ser escolhido do grupo consistindo de mieloperoxidase (MPO), eosinofil peroxidase (EPO)1 proteína básica maior [MBP], Iisozima1 granzima, histamina, pro- teoglicano, protease, um fator quimiotático, citoquina, um metabolito de ácido araquinódico, defensina, proteína bactericida de aumento da permeabilidade (BPI), elastase, catepsina G1 catepsina B, catepsina D, beta-D-glucuronidase, alfa-manosidase, fosfolipase A2, condroitin- -4-sulfato, proteinase 3, lactoferrina, colagenase, ativador complementar, receptor comple- mentar, receptor N-formilmetionil-leucil-fenilalanina (FMLP), receptor laminina, citocromo b558, fator monocitoquimiotático, histaminase, proteína de aglutinação de vitamina B12, gela- tinase, ativador plasminogeno, beta-D-glucuronidase, e uma combinação dos mesmos.

10. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato do refe- rido mediador inflamatório ser escolhido do grupo consistindo de mieloperoxidase (MPO), eosinofil peroxidase (EPO), proteína básica maior (MBP), lisozima, granzima e uma combi- nação dos mesmos.

11. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato da refe- rida quantidade efetiva do referido peptídeo ser composta de uma quantidade de inibição- desagrunalização do peptídeo MANS ou de um fragmento ativo do mesmo que reduz a quantidade de um mediador inflamatório liberado pelo menos de uma célula inflamatória de cerca de 1% a cerca de 99%, quando comparado com a quantidade liberada pelo menos de uma célula inflamatória na ausência do peptídeo MANS ou de um fragmento ativo do mes- mo.

12. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato da refe- rida quantidade efetiva do referido peptídeo ser composta de uma quantidade de inibição- desagrunalização do peptídeo MANS ou de um fragmento ativo do mesmo, que reduz a quantidade de um mediador inflamatório liberado pelo menos de uma célula inflamatória de cerca de 5-50% a cerca de 99% quando comparado com a quantidade liberada de pelo me- nos uma célula inflamatória na ausência do peptídeo MANS ou de um fragmento ativo do mesmo.

13. Método de inibição da liberação, pelo menos de um mediador inflamatório de pelo menos uma célula inflamatória em um tecido e/ou fluido de um indivíduo, CARACTERIZADO pelo fato de ser composto de: administração ao tecido e/ou ao fluido do referido indivíduo, onde o referido tecido e/ou o referido fluido são compostos pelo menos de uma célula inflamatória constituída pelo menos de um mediador inflamatório contido dentro de uma vesícula dentro da célula, uma quantidade terapeuticamente efetiva de uma composição farmacêutica composta pelo me- nos de um peptídeo escolhido do grupo consistindo de um peptídeo MANS e um fragmento ativo do mesmo em uma quantidade terapeuticamente efetiva para reduzir a liberação do referido mediador inflamatório de pelo menos uma célula inflamatória, quando comparado com a liberação do referido mediador inflamatório de pelo menos uma célula do mesmo tipo de célula inflamatória que ocorreria na ausência do referido pelo menos um peptídeo.

14. Método, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADO pelo fato da re- ferida redução da liberação de um mediador inflamatório ser composto do bloqueamento ou inibição do mecanismo que libera um mediador inflamatório da referida célula inflamatória.

15. Método, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADO pelo fato do re- ferido peptídeo ser um peptídeo MANS que é composto de SEQ ID NO:1.

16. Método, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADO pelo fato do re- ferido fragmento ativo ser composto pelo menos de um fragmento N-terminal miristoílado de SEQ ID NO:1 constituído pelo menos de 6 aminoácidos, onde o primeiro aminoácido do referido fragmento começa na glicina N-terminal do SEQ ID NO:1.

17. Método, de acordo com a reivindicação 16, CARACTERIZADO pelo fato do re- ferido fragmento ativo poder ser escolhido do grupo consistindo de N-miristoil- GAQ FS KTAAG E AAE RPG EAAV (SEQ ID N0:20); N-miristoil- GAQFSKT AAKGEAAAERPGEAA (SEQ ID NO: 3); N-miristoil- GAQFSKTAAKGEAAAERPGEA (SEQ ID NO: 4); N-miristoil-GAQFSKTAAKGEAAAERPGE (SEQ ID NO: 5); N-miristoil-GAQFSKTAAKGEAAAERPG (SEQ ID NO: 6); N-miristoil- GAQFSKTAAKGEAAAERP (SEQ ID NO: 7); N-miristoil-GAQFSKTAAKGEAAAER (SEQ ID NO: 8); N-miristoil-GAQFSKTAAKGEAAAE (SEQ ID NO: 9); N-miristoil- GAQFSKTAAKGEAAA (SEQ ID NO: 10); N-miristoil-GAQFSKTAAKGEAA (SEQ ID NO: 11); N-miristoil-GAQFSKTAAKGEA (SEQ ID NO: 12); N-miristoil-GAQFSKTAAKGE (SEQ ID NO: - 13); N-miristoil-GAQFSKTAAKG (SEQ ID NO: 14); N-miristoil-GAQFSKTAAK (SEQ ID NO: - 15); N-miristoil-GAQFSKTAA (SEQ ID NO: 16); N-miristoil-GAQFSKTA (SEQ ID NO: 17); N- miristoil-GAQFSKT (SEQ ID NO: 18); e N-miristoil-GAQFSK (SEQ ID NO: 19).

18. Método, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADO pelo fato da re- ferida célula inflamatória ser um leucócito.

19. Método, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADO pelo fato da re- ferida célula inflamatória ser um granulócito.

20. Método, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADO pelo fato da re- ferida célula inflamatória ser escolhida do grupo consistindo de um neutrófilo, um basófilo, um eosinófilo e uma combinação dos mesmos.

21. Método, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADO pelo fato da re- ferida célula inflamatória ser um monócito ou um macrofágio.

22. Método, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADO pelo fato do re- ferido mediador inflamatório ser escolhido do grupo consistindo de mieloperoxidase (MPO), eosinofil peroxidase (EPO)1 proteína básica maior [MBP], lisozima, granzima, histamina, proteoglicano, protease, um fator quimiotático, citoquina, um metabolito de ácido araquinódico, defensina, proteína bactericida de aumento da permeabi- lidade (BPI)1 elastase, catepsina G1 catepsina B1 catepsina D, beta-D-glucuronidase, alfa- manosidase, fosfolipase A2l condroitin-4-sulfato, proteinase 3, lactoferrina1 colagenase, ati- vador complementar, receptor complementar, receptor N-formilmetionil-leucil-fenilalanina (FMLP)1 receptor laminina, citocromo b558, fator monocitoquimiotático, histaminase, proteína de aglutinação de vitamina B12, gelatinase, ativador plasminogeno, beta-D-glucuronidade, e uma combinação dos mesmos.

23. Método, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADO pelo fato do re- ferido mediador inflamatório ser escolhido do grupo consistindo de mieloperoxidase (MPO), eosinofil peroxidase (EPO), proteína básica maior (MBP)1 lisozima, granzima e uma combi- nação dos mesmos.

24. Método, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADO pelo fato da re- ferida quantidade efetiva do referido peptídeo ser composta de uma quantidade de inibição- desagrunalização do peptídeo MANS ou de um fragmento ativo do mesmo que reduz a quantidade de um mediador inflamatório liberado pelo menos de uma célula inflamatória, de cerca de 1% a cerca de 99%, quando comparado com a quantidade liberada pelo menos de uma célula inflamatória na ausência do peptídeo MANS ou de um fragmento ativo do mes- mo.

25. Método, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADO pelo fato da re- ferida quantidade efetiva do referido peptídeo ser composta de uma quantidade de inibição- desagrunalização do peptídeo MANS ou de um fragmento ativo do mesmo que reduz a quantidade do mediador inflamatório liberado pelo menos de uma célula inflamatória, entre cerca de 5- 50% a cerca de 99%, quando comparado com a quantidade liberada pelo menos de uma célula inflamatória na ausência do peptídeo MANS ou de um fragmento ativo do mesmo.

26. Método, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADO pelo fato do re- ferido indivíduo ser afetado por uma doença respiratória.

27. Método, de acordo com a reivindicação 26, CARACTERIZADO pelo fato da re- ferida doença respiratória ser escolhida do grupo consistindo de asma, bronquite crônica, e COPD.

28. Método, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADO pelo fato do re- ferido indivíduo ser um mamífero.

29. Método, de acordo com a reivindicação 28, CARACTERIZADO pelo fato do re- ferido mamífero ser escolhido do grupo consistindo de seres humanos, caninos, suínos e felinos.

30. Método, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADO pelo fato da re- ferida administração ser escolhida do grupo consistindo de administração tópica, administra- ção parenteral, administração retal, administração pulmonar, administração nasal, e admi- nistração oral.

31. Método, de acordo com a reivindicação 30, CARACTERIZADO pelo fato da re- ferida administração pulmonar ser escolhida do grupo de aerossol, inalador de pó seco, ina- lador de dose medida, e nebulizador.

32. Método, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADO pelo fato de ser ainda composto da administração ao referido indivíduo de uma segunda molécula, escolhida do grupo consistindo de um antibiótico, um composto anti-viral, um composto anti-parasítico, um composto anti-inflamatório, e um imunossupressor.

33. Método, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADO pelo fato do re- ferido indivíduo ser afetado por uma doença escolhida do grupo consistindo de doença do intestino grosso, doença de pele, doença autoimune, síndrome da dor, e combinações das mesmas.

34. Método, de acordo com a reivindicação 33, CARACTERIZADO pelo fato da re- ferida doença do intestino grosso ser escolhida do grupo consistindo de colite ulcerativa, doença de Crohn e síndrome do intestino grosso irritável.

35. Método, de acordo com a reivindicação 33, CARACTERIZADO pelo fato da re- ferida doença de pele ser escolhida do grupo consistindo de rosácea, eczema, psoríase e acne severa.

36. Método, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADO pelo fato do re- ferido indivíduo ser afetado por artrite ou fibrose cística.