ES2229251T3 - A3c6e2, un anticuerpo monoclonal especifico para el receptor humano del factor de celulas madres (scf). - Google Patents
A3c6e2, un anticuerpo monoclonal especifico para el receptor humano del factor de celulas madres (scf).Info
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Abstract
LA INVENCION TRATA DE UN ANTICUERPO MONOCLONAL, QUE SE UNE ESPECIFICAMENTE A UN RECEPTOR DEL FACTOR HUMANO DE CELULAS GERMINALES (SCF). LA INVENCION TRATA ADEMAS DE HIBRIDOMAS, QUE FABRICAN ESTE ANTICUERPO, ASI COMO UN PROCEDIMIENTO PARA LA PRODUCCION DE TALES HIBRIDOMAS.
Description
A3C6E2, un anticuerpo monoclonal específico para
el receptor humano del factor de células madre(SCF).
La invención hace referencia a un anticuerpo
monoclonal, que se enlaza específicamente a un receptor humano del
factor de células madre o progenitoras(SCF).
El factor de células madre(SCF) es un
factor de crecimiento, que estimula las células madre sanguíneas
hematopoyéticas pluripotentes. Interacciona con un receptor, la
proteína CD117 (Sinónimo: SCF-Receptor o bien
c-kit-receptor (Bühring y cols., en
Schlossman y cols., (eds), Leucocyte Typing V, Oxford University
Press, Oxford 1995, páginas 1882-1888), que está
localizado en la membrana plasmática de las células madre y está
codificado como protoncogén c-kit (Zsebo y cols.,
Cell 63: 213-224, 1990).
El SCF propiamente es fabricado por diferentes
células naturales y se puede obtener además en el comercio como un
producto de recombinación de por ejemplo la E. Coli.
Las células madre de la sangre son las células de
partida, capaces de escindirse de forma ilimitada y no
diferenciada, a partir de las cuales se desarrollan los diferentes
tipos de células sanguíneas altamente especializados. Son
responsables de la formación nueva constante, natural de estos tipos
diferentes de células sanguíneas y juegan un importante papel en la
formación y el desarrollo de las enfermedades de las células
sanguíneas, en particular de anemias, leucemias y linfomas. Son,
por tanto, el objetivo preferido en el diagnóstico y el tratamiento
terapéutico de dichas enfermedades.
La identificación, el aislamiento y la influencia
de las células madre tiene pues un significado elemental para un
diagnóstico a ser posible rápido y seguro, y una terapia eficaz, y
precisa de las enfermedades de las células sanguíneas.
Como mediador de dicho tratamiento celular se
considera a un anticuerpo que sobre todo se una específicamente a
las células madre. Por ejemplo, es especialmente apropiado un
anticuerpo que reconozca como antígeno al
SCF-proteína receptora CD117, ya que la CD117
procede de las células madre.
Dicho anticuerpo puede acoplarse tanto con
reactivos de detección simples como los colorantes de fluorescencia
o los materiales radiactivos, como también con reactivos especiales
activos desde el punto de vista terapéutico.
Puesto que los anticuerpos policlonales se
encuentran disponibles de forma limitada y no son reproducibles de
forma idéntica, el anticuerpo debería ser monoclonal.
En la WO 92/17505 se ha descrito por el momento
un único anticuerpo monoclonal bloqueante, que se enlaza al
receptor del factor de la célula madre (SCF-R).
Este anticuerpo con el nombre SR-1 se une
específicamente a la proteína CD117 y bloquea de este modo el enlace
del SCF a este receptor. El anticuerpo SR-1
pertenece al isotipo IgG 2A.
Con este anticuerpo SR-1 se
preparaba por un lado un medio auxiliar muy eficaz para identificar
e influir en las células madre y por tanto para el diagnóstico y la
terapia de las enfermedades de las células sanguíneas. Por otro
lado, la actual unicidad de este medio auxiliar significaba que no
era posible un verdadero control de los resultados obtenidos
mediante ensayos paralelos con un anticuerpo monoclonal bloqueante
comparable de la misma o de una especificidad muy similar.
La presente invención tiene pues el cometido de
preparar al menos otro anticuerpo monoclonal bloqueante, que se una
específicamente al SCF-proteína receptor CD117
humano.
Este cometido se resuelve mediante la preparación
de un anticuerpo monoclonal, que es producido y liberado por
células del hibridoma, y que se ha registrado en la Deutschen
Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GMBH, DSM bajo el
número DSM ACC 2247, conforme a las disposiciones del Contrato de
Budapest del 19.12.1995. El anticuerpo se conoce por la
denominación A3C6E2. Presenta el isótopo IgG 1 y posee la capacidad
de bloquear el enlace de las moléculas del SCF con el receptor del
SCF.
Con el anticuerpo conforme a la invención se
preparaba un segundo anticuerpo monoclonal, que es reproducible de
forma estandarizada y por tanto puede fabricarse potencialmente de
forma ilimitada, y que se enlaza específicamente al epítopo
SR-1 de la proteína CD117 del receptor SCF de las
células madre humanas.
El anticuerpo conforme a la invención permite un
conocimiento y una influencia de las células, que poseen un dominio
extracelular de la proteína CD117 del receptor SCF. Equivale por
tanto a un medio alternativo al conocido anticuerpo
SR-1 para el médico y el investigador, para detectar
por un lado dichas células y ciertamente tanto en el cultivo
celular como en el organismo del paciente, y para por otro lado
manipular estas células, a través del anticuerpo propiamente o de
reactivos específicos acoplados.
Con la preparación de este anticuerpo conforme a
la invención contra el SCF-proteína receptor CD117
es posible, en primer lugar, controlar de forma eficaz los
resultados del ensayo obtenidos con el anticuerpo conocido, e
incrementar moderadamente la seguridad de su afirmación. Lo mismo
sirve en un caso inverso con el anticuerpo conforme a la invención
como anticuerpo de prueba primario y el anticuerpo
SR-1 como anticuerpo de control.
La invención se refiere además a las células del
hibridoma, que se han registrado bajo el número DSM ACC 2247 en la
Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GMBH, DSM,
según el contrato de Budapest y producen anticuerpos con la
denominación A3C6E2.
Un procedimiento para la fabricación de células
de hibridoma, que sintetizan y liberan un anticuerpo contra el
SCF-proteína receptor CD117 humano incluye las
etapas o pasos siguientes, tal como los ha descrito Bühring y cols.,
en Hybridoma 1991, tomo 10, nº 1, páginas 77-78.
- 1.
- Inmunización o sensibilización de un animal, preferiblemente de un ratón de la raza Balb/c, con el antígeno o inmunógeno;
- 2.
- Obtención de células que producen anticuerpos, preferiblemente de linfocitos del bazo de este animal;
- 3.
- Fusión de estas células que producen anticuerpos con una línea celular estable, inmortalizada, preferiblemente una línea celular de mieloma, con las células del hibridoma; y
- 4.
- Aislamiento y multiplicación (clonación) de dichas células de hibridoma, que trituran un anticuerpo que se une al antígeno.
El procedimiento desarrollado por los autores se
caracteriza porque el animal es inmunizado con células de una línea
celular no diferenciada MOLM-1 megacarioblasto.
Eso tiene como ventaja que esta línea celular
presenta una fuerte expresión del SCF-proteína
receptor CD117, como la desarrollada durante los ensayos que dan
lugar al anticuerpo A3C6E2.
Cuando se investigan las células del hibridoma
que producen anticuerpos específicos de la célula madre, resulta
oportuno en el aislamiento de las células de hibridoma, elegir
aquellas células de hibridoma que produzcan anticuerpos con una
especificidad por las células de la médula ósea, donde además será
oportuno que únicamente sean analizadas aquellas células de
hibridoma en cuando a la especificidad de los anticuerpos producidos
por ellas con las células de médula ósea, en las cuales previamente
se haya verificado que estos anticuerpos presentan una débil o
preferiblemente negativa reacción con las células sanguíneas
periféricas.
Con este método de detección sistemática se
aprovecha el hecho de que en la médula ósea aparecen células muy
poco diferenciadas incluyendo células madre hematopoyéticas, que
presentan el antígeno que va a ser reconocido por el anticuerpo.
Mediante el ensayo previo de la reacción negativa con células
sanguíneas periféricas se obtendrán de una forma rápida y sencilla,
sin que tengan que analizarse inútilmente muchas células, aquellos
anticuerpos, que de un modo selectivo se enlacen a aquellos
antígenos, que sean característicos para las células de la médula
ósea. En otras palabras, la especificidad en la elección de los
anticuerpos específicos de las células madre aumenta claramente de
forma simple con este procedimiento de detección sistemática.
En otro proceso de detección sistemática se
elegirán del modo oportuno aquellas células de hibridoma, que
produzcan un anticuerpo, que se enlace específicamente a los
fibroblastos, que son transferidos con el gen c-kit
humano.
Un proceso de detección sistemática alternativo o
complementario consiste en elegir aquellas células de hibridoma,
que produzcan un anticuerpo, que impida el enlace de las moléculas
DCF a las células madre de la sangre, es decir al
SCF-proteína receptor CD117.
Otro método de detección sistemática como la
inmunoprecipitación del SCF-proteína receptor
purificado marcado radiactivamente o bien el
enzyme-linked immunosorbent assay, brevemente
ELISA, es también posible.
El SCF empleado en este ensayo puede provenir de
distintos tipos de mamíferos, pero en general se prefiere un SCF
humano, en particular un SCF recombinante, por ejemplo de E.
coli.
La invención hace referencia también a la
utilización in vitro del anticuerpo monoclonal con la
denominación A3C6E2, como es producido y liberado por las células
del hibridoma registradas con el número DSM ACC 2247 en el
Deutschen Sammlung von Mikroorganismen y Zellkulturen GMBH, DSM,
según el contrato de Budapest, en un procedimiento para el
diagnóstico de tumores, en particular de leucemias y linfomas.
Aquí se aprovecha el que las células tumorales se
distinguen de las células de la sangre sanas por el número de
moléculas de SCF-receptor en la membrana celular.
Un anticuerpo conforme a la invención, que se acopla a un medio de
detección, por ejemplo a un marcador radioactivo, enlaza de forma
indirecta este medio de detección a estas células y facilita por
tanto la identificación directa de estas células, por ejemplo, con
métodos de diagnóstico de rayos X/ escintigráfía. Por lo tanto es
posible un diagnóstico del tumor prematuro en unas circunstancias
in vivo.
Puesto que el anticuerpo conforme a la invención
se une al receptor para el SCF y por tanto a una proteína, que
tiene un papel central en la regulación de la proliferación
celular, equivale a un punto de ataque directo para una
manipulación, en particular, una inhibición de la multiplicación
celular.
El anticuerpo monoclonal conforme a la invención
A3C6E2, como se ha producido y liberado por las células de
hibridoma registradas bajo el número DSM ACC 2247 en el Deutschen
Sammlung von Mikroorganismen y Zellkulturen GMBH, DSM, puede pues
emplearse también para el tratamiento terapéutico de células
malignas de la sangre. Con esta finalidad el anticuerpo puede
acoplarse a un medio eficaz desde el punto de vista terapéutico y
con ello facilitar una influencia directa o bien una eliminación
total de las células tumorales.
Para facilitar la aplicación terapéutica o
diagnóstica del anticuerpo conforme a la invención, debería
mezclarse el anticuerpo con las sustancias auxiliares adecuadas en
un preparado farmacéutico. La invención se refiere por tanto también
a un medio farmacéutico para el tratamiento diagnóstico así como a
un medio farmacéutico para el tratamiento terapéutico de células
malignas, que contienen el anticuerpo A3C6E2, tal como es producido
y liberado por las células de hibridoma registradas bajo el número
DSM ACC 2247 en la Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und
Zellkulturen GMBH, DSM.
En el medio farmacéutico el anticuerpo A3C6E2
puede acoplarse a un terapéutico especial dirigido contra las
células de leucemia y /o las células de linfoma.
La invención hace referencia también a la
utilización in vitro de un anticuerpo conforme a la
invención para la detección y /o el aislamiento de células
hematopoyéticas y a un procedimiento correspondiente. Este
procedimiento para la detección y /o el aislamiento de células
hematopoyéticas incluye los pasos:
- 1)
- Incubación de una suspensión celular, que contiene las células hematopoyéticas, con un anticuerpo que se une a las células hematopoyéticas, y
- 2)
- Separación de las células enlazadas al anticuerpo de las restantes células,
Y se caracteriza porque el anticuerpo es el
anticuerpo A3C6E2 monoclonal conforme a la invención.
La separación se realiza preferiblemente por
medio de una clasificación celular activada por la fluorescencia
(FACS), por medio de la cromatografía en columna o bien por una
inmunoadherencia directa.
En la clasificación celular (FACS) activada por
la fluorescencia, se mezclan células que llevan el
SCF-receptor, con el anticuerpo monoclonal conforme
a la invención A3C6E2, que previamente se había acoplado directa o
indirectamente con un colorante de fluorescencia como por ejemplo el
isotiocianato de fluoresceína (FITC) o la ficoeritrina (PE). Las
células marcadas con fluorescencia de esta forma pueden ser
clasificadas mediante las técnicas de clasificación conocidas según
el grado de irradiación de la fluorescencia.
El procedimiento de aislamiento conforme a la
invención puede emplearse especialmente en transplantes de médula
ósea, para separar células madre hematopoyéticas sanas de las
células tumorales existentes y de esta forma limpiar la médula ósea
que va a ser transplantada. Sobre todo en los auto transplantes
(transplantes autólogos) en conexión con una quimio- ó
radioterapia, disminuye por tanto claramente el peligro de una
reinfección del paciente.
Para poder llevar a cabo el método de detección o
de aislamiento de una forma rápida y sin preparativos engorrosos,
la invención ha previsto un equipo, que contiene el anticuerpo
A3C6E2 conforme a la invención.
Las células que se obtienen con el método de
aislamiento conforme a la invención y que al mismo tiempo se
purifican podrán ser fraccionadas de nuevo, para conseguir una
población celular todavía más homogénea. Este fraccionamiento puede
realizarse con ayuda de los anticuerpos monoclonales, que se dirigen
contra un antígeno, que únicamente aparece en una subpoblación de
células que llevan el SCF-receptor. Dicho antígeno
es, por ejemplo, la proteína CD34 de la superficie celular.
Las células hematopoyéticas purificadas, aisladas
conforme a la invención, son especialmente apropiadas para un
tratamiento genético, que engloba una transferencia de genes
retrovírica en las células hematopoyéticas.
La invención se refiere también a la utilización
in vitro de un anticuerpo monoclonal, que se une
específicamente a un factor de la célula madre, para la inhibición
de la hematopoyesis, de manera que el anticuerpo es producido y
liberado por las células del hibridoma, que se registran bajo el
número DSM ACC 2247 en la Deutschen Sammlung von Mikroorganismen
und Zellkulturen GMBH, DSM, según el contrato de Budapest, y llevan
la denominación A3C6E2. Esto puede realizarse tanto en el
laboratorio de ensayos con cultivos celulares como en la práctica
médica. En caso de aplicarse a un paciente, el anticuerpo, conforme
a la invención, se debería mezclar con sustancias auxiliares, que
facilitaran su aplicación. La invención hace referencia a un medio
farmacéutico para inhibir la hematopoyesis, que contiene el
anticuerpo en una cantidad que inhibe el SCF.
Se sabe que muchas células neoplásicas se
diferencian de las células normales, es decir, sanas, entre otras
cosas por que no presentan ninguna molécula de
SCF-receptor en la superficie celular.
La invención hace referencia pues a un
procedimiento para la separación de las células normales de las
células de leucemia neoplásicas, con las etapas fundamentales
siguientes:
- 1)
- Incubación de una mezcla de células normales y de células de leucemia neoplásicas con un anticuerpo, y
- 2)
- Separación de las células hematopoyéticas de las células de leucemia neoplásicas con ayuda de un número diferente de SCF-receptores en la membrana plasmática de las células hematopoyéticas por un lado, y de las células de leucemia neoplásicas por otro lado.
El procedimiento conforme a la invención se
caracteriza porque el anticuerpo es el anticuerpo monoclonal
A3C6E2.
La separación puede realizarse, por ejemplo, de
manera que las células inicialmente en la mezcla se marquen con el
anticuerpo conforme a la invención, luego se acoplen a un
anticuerpo biotinilizado, dirigido contra el organismo donante del
anticuerpo A3C6E2, y finalmente se hagan circular a través de una
columna de avidina. Las células con un número elevado de moléculas
de SCF-receptor se mantendrán en la columna
mientras que las células sin SCF-receptores
circularán a través de la columna. Los métodos de separación
alternativos son la inmunoadherencia directa, la clasificación
celular activada por la fluorescencia (FACS) y la clasificación
celular activada de forma magnética (MACS).
La presente invención se refiere también a un
procedimiento para la detección de SCF-receptores
en una muestra celular. Este procedimiento engloba los pasos
siguientes:
- 1)
- Incubación de una muestra celular con un anticuerpo, y
- 2)
- Registro del anticuerpo enlazado al SCF-receptor
y se caracteriza porque el anticuerpo es el
anticuerpo A3C6E2 monoclonal conforme a la invención.
La muestra celular puede estar formada de células
normales y /o de células de leucemia y /o de células de linfomas.
El registro del anticuerpo se realiza preferiblemente por medio de
un marcador acoplado al anticuerpo A3C6E2.
Con ayuda de este procedimiento conforme a la
invención es posible, por ejemplo, comprobar la existencia de
células neoplásicas o de linfoma en una muestra de sangre o de
tejido de un paciente en el que se sospecha la existencia de una
enfermedad tumoral.
El anticuerpo conforme a la invención A3C6E2,
como el producido y liberado por las células de hibridoma
registradas bajo el número DSM ACC 247 en el Deutschen Sammlung von
Mikroorganismen und Zellkulturen GMBH, DSM, puede ser empleado
asimismo para la modificación de la sensibilidad de los pacientes
por el fármaco quimioterapéutico específico del ciclo celular.
Mediante la administración del anticuerpo
conforme a la invención en una cantidad que impida totalmente o
bien limite el enlace del SCF a su receptor, se inhibe el
crecimiento y el desarrollo de las células que llevan el
SCF-receptor.
Para facilitar la administración del anticuerpo
conforme a la invención, éste debería mezclarse con las sustancias
auxiliares adecuadas correspondientes en un preparado farmacéutico.
La invención se refiere, por tanto, también a un medio farmacéutico
para la modificación de la sensibilidad del paciente para los
tratamientos quimioterapéuticos específicos del ciclo celular, que
contiene el anticuerpo A3C6E2, tal como es producido y liberado por
las células de hibridoma registradas bajo el número DSM ACC 2247 en
el Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GMBH,
DSM.
El medio farmacéutico correspondiente debería
contener el anticuerpo en una cantidad, que inhibiera el enlace y
/o la producción de SCF.
De la siguiente descripción se deducen otras
ventajas.
Se entiende que las propiedades mencionadas y las
que se aclararán a continuación no son solamente aplicables a la
combinación indicadas, sino que a otras combinaciones sin exceder
los límites de la presente invención.
La invención se explica con detalle a
continuación con ayuda de los ejemplos de ejecución y de aplicación
representados en las figuras siguientes.
Figura 1 engloba tres histogramas de las
mediciones del citómetro del fluido circulante (control del bloqueo
de los ligandos biotinilizados) en las células M07e, que a 1A
únicamente son incubadas con el ligando (SCF+SA-PE
biotinilizado), a 1B son preincubadas con el anticuerpo A3C6E2 y
luego con el ligando y a 1C han sido preincubadas con el anticuerpo
comparable SR-1 y luego con el ligando;
Figura 2 engloba dos histogramas de las
mediciones del citómetro del fluido circulante (control de la
regulación del receptor) en las células M07e, que a 2A son
preincubadas con un anticuerpo de control IgG1 y luego son incubadas
con el anticuerpo A3C6E2 y un
anti-IgG1-PE-antisuero,
y a 2 B son preincubadas con el anticuerpo A3C6E2 y a continuación
son incubadas con el mismo anticuerpo y un
anti-IgG1-PE-antisuero;
Figura 3 engloba tres histogramas de las
mediciones del citómetro de fluido circulante (análisis del
epítopo) en las células M07e, que a 3A son incubadas con el
anticuerpo A3C6E2 y han sido marcadas con un
anti-IgG1-PE-antisuero,
a 3B se han incubado previamente con el anticuerpo de comparación
SR-1 y luego como en 3A se han incubado de nuevo y
marcado, y a 3C se han incubado inicialmente con el anticuerpo
A3C6E2 y luego con el anticuerpo de comparación
SR-1 y se han marcado con un
anti-IgG2A-Pe-antisuero.
Como antígeno se emplean las células de la línea
celular no diferenciada, megacarioblasto MOLM-1
(Matsuo Y, Adachi T, Tsubota T, Imanishi J, Minowada J.
Establishment and characterization of a novel megakaryoblastoid cell
line, MOLM-1, de un paciente con leucemia
mielogenosa crónica. Human Cell 1991;
4:261-264).
Ratones Balb/c de ocho semanas se inmunizaban dos
veces en intervalos de 10 días por vía intraperitoneal con 10^{7}
células de la línea celular MOLM-1. Ocho días antes
de la fusión se aplicaban directamente en el bazo 5x10^{5}
células, para reforzar la respuesta inmunitaria.
La formación de anticuerpos en el organismo del
ratón se comprueba de manera que se examinan las propiedades de
enlace con el antígeno en el suero sanguíneo del animal
correspondiente en el ensayo ELISA realizado por el experto.
Al cabo de aproximadamente 3 semanas, se obtienen
los linfocitos del animal inmunizado satisfactoriamente, en el que
se ha extraído el bazo y se ha triturado en una suspensión
celular.
Las células del bazo en suspensión se fusionarán
en presencia de polietilenglicol con las células de mieloma de
origen conocido SP2/0. El cultivo de la fusión se incuba en un
medio que contiene hipoxantina, aminopterina y timidina, aquí en
HAT-RPMI-1640, en el cual pueden
multiplicarse únicamente las células de mieloma, ya que éstas
tienen la propiedad de las células de mieloma respecto a una
capacidad de división ilimitada, así como la característica de los
linfocitos productores de anticuerpos para su crecimiento en un
medio que contiene HAT.
Tras la fusión, las células se colocarán en
placas por copitas y se incubarán a 37ºC y un 5% de CO_{2}.
Los residuos del cultivo se detectarán de forma
específica al cabo de 10-14 días en la línea
celular MOLM-1 en un citómetro de fluido circulante.
En una segunda etapa, se comprobará la reactividad de los residuos
con las células sanguíneas periféricas, ya que éstas no presentan
ningún antígeno selectivo de célula madre. Seguidamente se
analizará la reactividad de los residuos, que presenten una
reacción negativa o débil con las células sanguíneas periféricas,
con las células de la médula ósea. Los hibridomas, que produzcan
anticuerpos con una especificidad por las células de la médula
ósea, serán seleccionados y aislados y cultivados, es decir,
clonados, según el método de dilución límite conocido.
En esta estrategia de detección se sacará
provecho del hecho de que aparezcan células no muy diferenciadas en
la médula ósea, incluyendo células madre hematopoyéticas.
Los cultivos de células de hibridoma que
reaccionan positivamente se cultivarán de nuevo, purificarán y
caracterizarán.
Conforme a la estrategia de detección mencionada
se obtendrá el anticuerpo monoclonal A3C6E2. El isotipo se ha
determinado en antisueros conjugados PE específicos del
anti-isotipo mediante una inmunofluorescencia
directa respecto al IgG1.
La producción, purificación y caracterización del
anticuerpo se realizaba con los métodos conocidos en general en el
ámbito más especializado.
El anticuerpo A3C6E2, que es producido por las
células de hibridoma registradas bajo el número DSM ACC 2247 en el
Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GMBH, DSM,
presenta las propiedades características siguientes:
| Clase de inmunoglobulina: | IgG1 |
| Afinidad de enlace específica al: | CD117 |
La identificación del antígeno se realizaba
mediante los ensayos de enlace en células de ratón con y sin
SCF-receptores humanos (transfectantes).
Una muestra(A) con fibroblastos de ratón
de la línea celular NIH-3T3/hc-kit,
que es transfeccionada con el gen c-kit humano
(Yarden y cols., EMBO J.A:3341, 1987), se incubaba con el
anticuerpo A3C6E2 conforme a la invención.
Para el control, se incubaba una muestra (B) con
fibroblastos de ratón de la línea celular NIH-3T3
no transfeccionada con el anticuerpo A3C6E2 en la misma
concentración que la muestra (A).
Ambas muestras se marcaban con un
anti-IgG1-Pe-antisuero
y a continuación se analizaban en un citómetro de fluido
circulante.
Podía detectarse exclusivamente un enlace del
anticuerpo A3C6E2 en la muestra (A). Es decir, que el anticuerpo
A3C6E2 conforme a la invención se ha enlazado específicamente a
aquellas células, que presentan el gen c-kit y
consecuentemente el SCF-receptor.
Para el bloqueo del enlace de ligandos se
incubaba una muestra (1A) de células M07e con el ligando
biotinilizado MGF-biotina (MGF-b =
equipo de ligandos) a la concentración de 200 ng/ml y luego se
marcaba con SA-PE (control positivo).
Una segunda muestra (1B) de células M07e se
incubaba previamente durante 30 minutos con el anticuerpo A3C6E2 a
la concentración de 7 \mug/ ml y a continuación se trataba como
la muestra (1A).
Ambas muestras se analizaban en un citómetro de
fluido circulante. Los resultados se representan en las figuras 1ª
y 1B.
Como ensayo de comparación se trataba una tercera
muestra (1C) de células M07e como la muestra (A), con la diferencia
de que en lugar del anticuerpo conforme a la invención A3C6E2, se
empleaba el conocido anticuerpo SR-1 en una
concentración de 10 \mug/ml.
Como se deduce de los histogramas de la figura 1,
el anticuerpo A3C6E2 conforme a la invención bloquea el enlace del
ligando hasta un 99,99% y el anticuerpo de comparación
SR-1 bloquea hasta el 98,7%.
La activación del receptor iniciada a través del
enlace del ligando conduce en el caso de receptores de
tirosina-quinasa, como el
SCF-receptor, a la formación complejos dímeros del
receptor y a su internalización en la célula. La mayoría de
anticuerpos pueden estimular los ligandos, es decir actuar de forma
agonista, y conducen por ello a una formación de un dímero del
receptor y a una internalización (Bühring y cols., Cancer Res. 53:
4424, 1993).
Una muestra (2A) de células de
MOLM-1 se incubaba previamente durante 2 horas a
37ºC con un anticuerpo de control IgG1. Luego se incubaba con el
anticuerpo A3C6E2 conforme a la invención y finalmente con el
anti-IgG1-Pe-antisuero.
Una segunda muestra (2B) se incubaba inicialmente
con el anticuerpo A3C6E2 y a continuación se trataba como la
muestra (2A).
Ambas muestras se analizaban en un citómetro de
fluido circulante. Los histogramas así obtenidos se representan en
la figura 2. Ambos histogramas presentan señales de igual
intensidad. Esto significa que no se ha producido una
internalización del receptor, y que el anticuerpo conforme a la
invención A3C6E2 no actúa de forma agonista, es decir, los ligandos
no son estimulados, pero si actúa de forma fuertemente antagonista
(bloqueante).
Una muestra (3A) de células M07e se incubaba
inicialmente con el anticuerpo A3C6E2 y el anticuerpo enlazado se
marcaba luego con un
anti-IgG1-Pe-antisuero.
Una segunda muestra(3B) de células de M07e
se incubaba previamente con el conocido anticuerpo
SR-1 durante 30 minutos en una concentración de 10
\mug/ ml, y a continuación, se trataba como la muestra (3A) con el
anticuerpo A3C6E2 y el
anti-IgG1-PE-antisuero.
Una tercera muestra (3C) se incubaba previamente
durante 30 minutos con el anticuerpo conforme a la invención
A3C6E2, luego se incubaba posteriormente con el anticuerpo
SR-1 conocido y el anticuerpo SR-1
enlazado finalmente se marcaba con un
anti-IgG2A-PE-antisuero.
Las tres muestras celulares se analizaban en un
citómetro de fluido circulante. Los histogramas así obtenidos se
representan en las figuras 3A, 3B y 3C.
Como se deduce de estos histogramas, en la
muestra (3B) el enlace del anticuerpo A3C6E2 era inhibido hasta un
94% por el anticuerpo SR-1 y en la muestra (3C) el
enlace del SR-1 era inhibido por el A3C6E2 hasta un
98,7%.
Estos resultados indican que ambos anticuerpos
reconocen el mismo o al menos un epítopo muy similar en el
SCF-proteína receptor CD117.
Claims (22)
1. Anticuerpo monoclonal, que se enlaza
específicamente a un factor de célula madre humano
(SCF)-receptor, que se caracteriza porque es
producido y liberado por las células del hibridoma que se registran
bajo el número DSM ACC 2247 en el Deutschen Sammlung von
Mikroorganismen und Zellkulturen GMBH, DSM, conforme al contrato de
Budapest, y llevan la denominación A3C6E2.
2. Células de hibridoma, que se
caracterizan porque registran bajo el número DSM ACC 2247 en
el Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und
Zellkulturen GMBH, DSM, conforme al contrato de Budapest, y llevan la denominación A3C6E2.
Zellkulturen GMBH, DSM, conforme al contrato de Budapest, y llevan la denominación A3C6E2.
3. Utilización in vitro del anticuerpo
conforme a la reivindicación 1 en un método para el diagnóstico de
tumores, en particular de leucemia y de linfomas.
4. Medio farmacéutico para el tratamiento
diagnóstico de tumores, en particular de leucemia y de linfomas,
que se caracteriza porque contiene el anticuerpo conforme a
la reivindicación 1.
5. Medio farmacéutico conforme a la
reivindicación 4, que se caracteriza porque el anticuerpo se
acopla a un diagnóstico.
6. Medio farmacéutico para el tratamiento
terapéutico de tumores, en particular de leucemia y linfomas, que
se caracteriza porque contiene el anticuerpo conforme a la
reivindicación 1.
7. Medio farmacéutico conforme a la
reivindicación 6, que se caracteriza porque el anticuerpo se
ha acoplado a una cantidad eficaz de un terapéutico, que se dirige
contra las células de leucemia y/o las células de linfoma.
8. Utilización in vitro del anticuerpo
conforme a la reivindicación 1 para la detección y /o el
aislamiento de células hematopoyéticas.
9. Método para la detección y/o el aislamiento de
células hematopoyéticas con los pasos:
- (a)
- Incubación de una suspensión celular, que contiene células hematopoyéticas, con un anticuerpo que se une a células hematopoyéticas, y
- (b)
- Separación de las células unidas al anticuerpo de las células restantes
que se caracteriza porque el
anticuerpo es un anticuerpo monoclonal conforme a la reivindicación
1.
10. Método para la detección y /o el aislamiento
de células hematopoyéticas conforme a la reivindicación 9, que se
caracteriza porque la separación se realiza por medio de una
cromatografía en columna.
11. Método para la detección y /o el aislamiento
de células hematopoyéticas conforme a la reivindicación 9, que se
caracteriza porque la separación se realiza por medio de una
clasificación celular (FACS) activada por la fluorescencia.
12. Método para la detección y/o el aislamiento
de células hematopoyéticas conforme a la reivindicación 9, que se
caracteriza porque la separación se realiza por medio de una
inmunoadherencia directa.
13. Estuche para la detección de células
hematopoyéticas, que se caracteriza porque contiene el
anticuerpo conforme a la reivindicación 1.
14. Utilización in vitro del anticuerpo
conforme a la reivindicación 1 para el aislamiento y la
purificación de células hematopoyéticas para un tratamiento
genético, que engloba una transferencia genética retrovírica en las
células hematopoyéticas.
15. Utilización in vitro de un anticuerpo
monoclonal, que se enlaza específicamente a un factor de célula
madre humano SCF-receptor, para la inhibición de
la hematopoyesis, que se caracteriza porque el anticuerpo es
producido y liberado por células de hibridoma, que se registran bajo
el número DSM ACC 2247 en el Deutschen Sammlung von Mikroorganismen
und Zellkulturen GMBH, DSM, conforme al contrato de Budapest, y
llevan la denominación A3C6E2.
16. Medio farmacéutico para la inhibición de la
hematopoyesis, que se caracteriza porque el medio contiene
el anticuerpo monoclonal, que es producido y liberado por las
células de hibridoma que se registran bajo el número DSM ACC 2247
en el Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GMBH,
DSM, conforme al contrato de Budapest, y llevan la denominación
A3C6E2, en una cantidad que inhibe el enlace del factor de la
célula madre (SCF).
17. Método para la separación de células normales
de las células de leucemia neoplásicas con los pasos
siguientes:
- a)
- Incubación de una mezcla de células normales y células de leucemia neoplásicas con un anticuerpo y
- b)
- Separación de células hematopoyéticas de las células de leucemia neoplásicas con ayuda de un número distinto de receptores del factor de célula madre (SCF) en la membrana plasmática de células hematopoyéticas por un lado y de células de leucemia neoplásicas por otro lado,
que se caracteriza porque el
anticuerpo es el anticuerpo monoclonal conforme a la
reivindicación
1.
1.
18. Método para la detección de receptores de SCF
factor de célula madre en una muestra celular con las etapas
siguientes:
- a)
- Incubación de una muestra celular con un anticuerpo, y
- b)
- Registro del anticuerpo enlazado al (SCF)-receptor del factor de la célula madre,
que se caracteriza porque el
anticuerpo es el anticuerpo monoclonal conforme a la reivindicación
1.
19. Método conforme a la reivindicación 18, que
se caracteriza porque el registro del anticuerpo enlazado se
lleva a cabo por medio de un marcador acoplado al anticuerpo.
20. Método conforme a una de las reivindicaciones
18 ó 19, que se caracteriza porque la muestra celular consta
de células normales y/o de células de leucemia y/o de células de
linfomas.
21. Medio farmacéutico para la modificación de la
sensibilidad del paciente por los tratamientos quimioterapéuticos
específicos del ciclo celular, que se caracteriza porque
contiene el anticuerpo conforme a la reivindicación 1.
22. Medio farmacéutico conforme a la
reivindicación 21, que se caracteriza porque el medio
contiene en anticuerpo en una cantidad que inhibe el enlace del
factor de la célula madre (SCF).
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