ES2226331T3 - Medicamento que contiene oligosacaridos para el tratamiento de disfunciones de apoptosis. - Google Patents
Medicamento que contiene oligosacaridos para el tratamiento de disfunciones de apoptosis.Info
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Abstract
Medicamento, caracterizado por presentar, como principio activo, una cantidad eficaz de como mínimo una sustancia de oligosacárido apropiada para modular las disfunciones de la apoptosis y que comporta eventualmente, por lo menos en ciertos de sus motivos unitarios, como mínimo un sustituyente del grupo que comprende las agrupaciones sulfato, metilo y acetilo, escogiéndose la sustancia en el grupo que comprende - los oligosacáridos derivados por vía enzimática o química de los polímeros del grupo que comprende los beta 1-3 glucanos que comportan eventualmente ramificaciones beta 1-6, y y - los oligosacáridos derivados por vía enzimática o química de los carragenanos, de los agares y de los porfiranos.
Description
Medicamento que contiene oligosacáridos para el
tratamiento de disfunciones de apoptosis.
La presente invención tiene como objetivo un
medicamento para el tratamiento de disfunciones de apoptosis.
Se designa con el término "apoptosis" la
muerte celular programada o suicida celular.
Esta palabra corresponde a una autoeliminación de
las células según un programa definido.
Se traduce inicialmente por hinchamientos a nivel
de la membrana plasmática, hinchamientos acompañados por un cambio
estructural de la membrana, y a continuación por pérdida de volumen
de la célula que parece contraerse y hundirse sobre sí misma.
El núcleo se condensa y el ADN es clivado o
fragmentado en trozos pequeños (Raff, "Nature", 356, 397, 1992;
Bortner y otros, "Trends in Cell. Biol." 5, 21, 1995).
In vivo, la célula en apoptosis es
reconocida por los macrófagos que la fagocitarán y la eliminarán en
ausencia de cualquier proceso inflamatorio.
Siempre in vivo, la apoptosis es utilizada
ampliamente por los organismos vivos para controlar las poblaciones
celulares, en particular los linfocitos después de su
activación.
Por otra parte, la apoptosis juega, en el curso
del desarrollo de los organismos, un papel primordial en la
eliminación de tejidos embrionarios no necesarios (cola de lagarto,
rudimento de órganos genitales de un sexo o del otro), y en la
formación del organismo (eliminación de las membranas interdigitales
entre los futuros dedos y otros).
Ciertos compuestos presentes en los organismos
vivos inducen específicamente un fenómeno apoptótico. Así, por
ejemplo, en los mamíferos, el enlace del ligando Fas a la membrana
receptora Fas, designado igualmente por APO-1 ó
CD95, induce específicamente una apoptosis; esta apoptosis es
utilizada por el organismo vivo para controlar las poblaciones de
linfocitos, en especial linfocitos T.
Dichos receptor y ligando representan un sistema
fisiológico extremadamente interesante que está implicado en la
eliminación específica de células que ya no son deseables en el
organismo.
Se puede citar en particular la eliminación
celular en el curso de la maduración y de la activación de los
linfocitos T. En realidad, el sistema Fas, es decir, ligando
Fas/receptor Fas, desempeña un papel primordial en la homeostasis
del sistema inmunitario.
El receptor Fas es un miembro de una familia de
proteínas que actúan como receptoras en la superficie de células y
que comprenden igualmente los receptores TNF (factor de necrosis
tumoral) y NGF (factor de crecimiento nervioso).
El receptor Fas es expresado en numerosas
células; se acumulará a nivel del aparato de Golgi.
El mecanismo por el que el sistema Fas induce la
muerte celular no es conocido pero requiere la activación de las
proteasas conocidas con la designación "similares a ICE"
("interleukine-1 beta-converting
enzyme") en inglés) o caspasas.
Se puede observar que el ligando Fas puede ser
segregado por las células para inducir su propio suicidio; pero dado
que este ligando se encuentra también en la superficie de las
células activadoras, éstas inducirán por este hecho el suicidio de
células trampa por simple contacto. Una vez activado, el receptor
Fas interacciona con numerosas proteínas intracelulares para
transmitir la señal que inicia la apoptosis.
In vitro, existen otros medios para
inducir apoptosis, por ejemplo, inhibiendo la actividad de ciertas
kinasas, y en particular kinasa C; en este caso, se puede recurrir a
la estaurosporina.
Este producto es muy eficaz para inducir la
muerte de las células por apoptosis.
Por otra parte, la Patente EP 795 560 describe un
sulfato de keratan oligosacárido como agente capaz de inducir
apoptosis.
No obstante, se debe observar que la transducción
de las señales inducidas por la estaurosporina es diferente de la
que hace intervenir el receptor Fas.
No obstante, si bien los medios de activar la
apoptosis son distintos, la ejecución del programa de muerte
inducida por estos dos modos de activación es equivalente y se
caracteriza por una activación de la cascada de las caspasas y una
disfunción del mitocondrio que libera compuestos (por ejemplo,
citocroma C) que promoverán la destrucción programada de la célula.
Este fenómeno tiene dependencia de energía pero no requiere la
síntesis de nuevas proteínas. En realidad, todo se encuentra
dispuesto en una célula para asegurar su propia destrucción.
In vivo, la regulación del fenómeno
apoptótico tiene una considerable importancia.
En efecto, numerosas patologías están asociadas a
su disfunción.
Se puede citar, por ejemplo, dos casos de
disfunción de la apoptosis en los que ésta está modulada por
intermedio del sistema Pas: se trata de enfermedades
autoinmunitarias en las que la apoptosis es deficiente y la
destrucción de los linfocitos T CD4+ infectados por
HIV-1 en los cuales la apoptosis es demasiado
activa.
En otros casos, tales como las degeneraciones
neuronales que se encuentran, por ejemplo, en la esclerosis en
placas, la apoptosis es activada por vías que todavía no son
conocidas.
Existen otras patologías en las que la apoptosis
es difícil; a este respecto, se puede citar la acumulación de
células cancerosas cuya apoptosis parecería depender del sistema FAS
("Green", Science, vol 278, 1246, 1997).
La sociedad solicitante, en vista de las
comprobaciones que se han indicado anteriormente, ha tenido el
mérito de descubrir que, desde el momento en que se dispone de un
medicamento capaz de modular las disfunciones de la apoptosis tanto
desde el punto de vista de activación como en el caso de patologías
del grupo de las que comprenden las enfermedades autoinmunitarias y
las patologías de tipo cáncer y desde el punto de vista de su
inhibición en el caso de las patologías del grupo de las que
comprenden el SIDA, ha resultado posible luchar contra estas
enfermedades.
La propia sociedad ha tenido el mérito no menos
importante de descubrir que ciertas sustancias del tipo de
oligosacáridos y monosacáridos presentan eventualmente, por lo menos
en algunos de sus motivos unitarios, como mínimo un sustituyente del
grupo que comprende los grupos sulfato, metilo y acetilo, que son
propios para modular las disfunciones de la apoptosis.
La invención tiene por lo tanto como objeto un
medicamento que se caracteriza por comportar, a título de principio
activo, una cantidad eficaz como mínimo de una sustancia de
oligosacárido apropiada para modular las disfunciones de la
apoptosis, y que presente eventualmente, por lo menos en algunos de
sus motivos unitarios, como mínimo un sustituyente del grupo que
comprende los grupos sulfato, metilo y acetilo, escogiéndose dicha
sustancia dentro del grupo que comprende
- los oligosacáridos derivados por vía enzimática
o química de los polímeros del grupo que comprende los \beta
1-3 glucanos que presentan eventualmente
ramificaciones \beta 1-6,
- los oligosacáridos derivados por vía enzimática
o química de los carragenanos, agares y porfiranos.
Según una forma de realización ventajosa, el
medicamento según la invención presenta, a título de principio
activo, una cantidad eficaz como mínimo de un oligosacárido
apropiado para modular las disfunciones de la apoptosis y que
responde a la fórmula
en la que n representa un número
entero de 1 a 50, preferentemente de 5 a 10 y en el que el número de
ramificaciones varía de 0 a 3 por unidad de
repetición.
Según otra forma de realización ventajosa, el
medicamento según la invención presenta, a título de principio
activo, una cantidad eficaz como mínimo de un disacárido de
repetición apropiado para modular las disfunciones de la apoptosis y
que corresponde a la fórmula
en la que n representa un número
entero de 1 a 50, preferentemente de 1 a 20, pudiendo presentar como
mínimo alguno de los disacáridos de repetición de fórmula (II) uno o
varios grupos
sulfato.
Según otra forma de realización ventajosa, el
medicamento según la invención presenta, a título de principio
activo, una cantidad eficaz del producto apropiado para inhibir como
mínimo parcialmente la apoptosis y que es obtenido por hidrólisis a
partir de iota-carragenato de sodio, estando
constituido este producto por una mezcla de
oligo-iota-carragenanos designada
por I_{g}, cuyo contenido en osas totales (determinado según
Tillmans y Philippi) es de 62% y cuyo perfil de distribución por
talla, estimado por electroforesis sobre gel de poliacrilamida según
Zablakis y Perez, es:
Dichos métodos se describen, por lo que respecta
a Zablakis E. & Perez J., en "Botanica marina", 33,
273-276 (1990) y, por lo que respecta a Tillmans J.
y Philippi K., en "Biochem. Z", 215, 30-60
(1930).
Para preparar el producto I_{g}, se puede
proceder de la forma siguiente.
Se incuba el iotacarragenano en presencia de la
enzima iotacarragenasa parcialmente purificada a una temperatura de
45 - 50ºC, y después se ultrafiltran los productos de hidrólisis
sobre una membrana de 10.000 Da. Se obtiene de esta manera el
producto I_{g}.
Más particularmente, el polímero de
iotacarragenano es hidrolizado por una iotacarragenasa recombinante
expresada en la cepa Escherichia coli.
La preparación de la enzima se hace por
disolución del residuo bacteriano (correspondiente a un litro de
cultivo) en 50 ml de tampón Tris 10 mM pH 7,5, 100 mM NaCl, 5 mM
CaCl_{2} de manera que se obtenga al final, 500 U/ml.
Desde el punto de vista práctico, se disuelven
100 g de sustrato de iotacarragenano en 20 l de agua destilada en
caliente (80ºC) de manera que se obtenga una concentración de 5 g/l
y a continuación se ajusta el pH a 7,5 con carbonato amónico.
Para efectuar la hidrólisis, la enzima es añadida
a 50 U/g de polímero. La ultrafiltración continua es realizada
después de 30 minutos; tratándose de una ultrafiltración
tangencial.
Para esta utlrafiltración tangencial, se pude
utilizar un aparato de marca Pellicon que presente un casete de
10.000 Da 0,46 m^{2} PTGC de la Sociedad Millipore; este aparato
está ajustado a 2 bar en la entrada y 0,5 bar en la salida.
La salida del filtrado está parcialmente cerrada
para mantener el caudal de filtrado en 1 litro por hora.
Las características de la envolvente reactiva se
escogen de manera que permitan un aprovisionamiento de la enzima en
el substrato hasta agotamiento de los 20 litros de solución y el
mantenimiento de un volumen fijo de 2 litros.
Se obtienen 18 litros de un ultrafiltrado que es
concentrado hasta 1 litro por evaporación rotativa, y después el
concentrado es liofilizado. El liofilizado obtenido de este modo
contiene el producto I_{g}.
Los oligocarragenanos de la fracción I_{g}
obtenidos de este modo han sido sometidos a un fraccionamiento
suplementario por cromatografía de baja presión sobre columna de
Biogel P6 y después sobre columna de Sephadex G10.
Se obtiene de esta manera las fracciones
idénticas antes mencionadas.
Según otra forma de realización ventajosa, el
medicamento según la invención presenta, a título de principio
activo, una cantidad eficaz del producto apropiada para inhibir como
mínimo parcialmente la apoptosis, constituido por la fracción DP 7
del producto I_{g}.
Según otra forma de realización ventajosa, el
medicamento según la invención presenta, a título de principio
activo, una cantidad eficaz del producto apropiado para activar las
disfunciones de la apoptosis, obtenido por extracción acuosa ácida a
partir de una alga marrón denominada Laminaria digitata, cuyo
producto está constituido por una mezcla de oligo \beta
1-3 glucanos designados L_{11} y que presentan de
1 a 50, preferentemente de 20 a 30, unidades de sacáridos,
presentando el producto en cuestión el espectro RMN mostrado en la
figura 1.
Se debe observar que el producto L_{11} puede
igualmente ser obtenido por extracción acuosa a partir de algas
marrones en general de las que la Laminaria digitata es un
representante.
La preparación del producto L_{11} se puede
efectuar del modo siguiente.
A 300 g de algas frescas del tipo Laminaria
digitata recogidas en el mes de agosto en forma fresca o seca,
se añade progresivamente 1 l de ácido sulfúrico a 0,3%.
La operación es realizada en baño maría a una
temperatura aproximada de 70ºC durante 2 horas y 30 minutos con
agitación.
Esta operación es renovada dos veces.
El extracto obtenido es clarificado por
filtración sobre un filtro de porosidad 1,2 \mum.
El líquido resultante de esta filtración es
sometido a ultrafiltración tangencial sobre una membrana de
porosidad de 50.000 Daltons.
La ultrafiltración es realizada manteniendo una
presión de 1 bar.
Se obtiene de esta manera un ultrafiltrado cuyo
pH se lleva a 5,5, presentando un volumen aproximado de 0,8 litros.
Este ultrafiltrado es sometido a diálisis sobre una membrana de
éster de celulosa con porosidad de 500 Daltons.
Se obtiene un dializado que es concentrado a un
volumen de 100 ml por evaporación a 80ºC con ayuda de un dispositivo
de tipo ROTOVAPOR, y después es liofilizado.
Se obtienen 7 g de un material en polvo de color
crema que constituye el producto L_{11}.
El análisis por cromatografía iónica acoplada a
la amperometría y utilizando una resina de intercambio de iones de
la sociedad DIONEX, muestra que los oligo \beta
1-3 glucanos constitutivos de dicho material en
polvo tienen en realidad de 1 a 50, preferentemente de 20 a 30,
unidades de sacáridos.
Las condiciones cromatográficas (método llamado
HPLC, es decir, "Chormatographie liquide sous haute pression"
(Cromatografía líquida a alta presión)) son las siguientes:
se ha obtenido la curva que se
muestra en la figura 16 y que identifica el producto
L_{11}.
El examen del espectro RMN del ^{13}C del
producto L_{11}, realizado a partir de una solución a 80 mg/ml en
D_{2}0 y representado en la figura 1, muestra un esqueleto de
\beta-D-(1\rightarrow3) glucano cuyas
resonancias de los diferentes carbonos han podido ser identificadas
(se han reunido en la tabla siguiente A) por comparación con los
valores de la literatura conocida (ver Williams y otros, 1992
"Development of a water-soluble, sulfated
(1\rightarrow3)-\beta-D-glucan
biological response modifier derived from Saccharomyces
cerevisiae", Carbohydr. Res. 235: 247:25).
Los medicamentos según la invención definidos
anteriormente presentan los coadyuvantes de formulación clásicos que
corresponden a su forma de administración y a la posología
escogida.
La invención tiene igualmente por objeto un
procedimiento de preparación de un medicamento para el tratamiento
de disfunciones de la apoptosis, caracterizado porque se hace
comportar a una composición galénica como mínimo uno de los
principios activos identificados anteriormente.
Según una forma de realización ventajosa, dicho
compuesto galénico es apropiado para una administración por vía
intravenosa.
La invención se refiere igualmente a la
utilización, a efectos de la preparación de un medicamento para el
tratamiento de disfunciones de apoptosis, de sustancias de sacáridos
del grupo que comprende los oligosacáridos derivados por vía
enzimática o química de los polímeros del grupo que comprende
\beta 1-3 glucanos que comportan eventualmente
ramificaciones \beta 1-6, y los oligosacáridos
derivados por vía enzimática o química de los galactanos sulfatados,
en especial los carragenanos, los agares y los porfiranos.
Más particularmente, se refiere a la utilización,
a efectos de preparación de un medicamento para un tratamiento de
disfunciones de la apoptosis, de los oligosacáridos de fórmula (I) y
los de fórmula (II).
Más particularmente todavía, se refiere a la
utilización de los productos indicados por I_{g} y L_{11} y de
las fracciones DP 2 y DP 7 de I_{g} a efectos de la preparación de
medicamentos para el tratamiento de las disfunciones de la
apoptosis.
La invención se comprenderá mejor con la ayuda
del complemento de descripción siguiente y de los ejemplos que no
son limitativos sino que corresponden a formas de realización
ventajosas.
En las experiencias que se describen a
continuación, se ha trabajado sobre cultivos celulares en los cuales
se ha provocado un proceso apoptótico habiendo recurrido al sistema
Fas o a la estaurosporina, y a continuación se ha estudiado los
efectos de modulación que se pueden obtener con los productos que
constituyen el principio activo de los medicamentos según la
invención.
En el marco de estos experimentos, se ha
determinado, por una parte, las cantidades apropiadas de principio
activo para obtener el efecto buscado de modulación de la apoptosis
y, por otra parte, el momento o momentos en los que es conveniente
administrar, para obtener el efecto de modulación buscado, el
principio activo o el medicamento que lo presenta.
Se ha trabajado sobre un cultivo de fibroblastos
de ratón genéticamente modificados para expresar constitutivamente
el receptor humano Fas; el principio activo controlado era el
producto designado por Ig.
En una experiencia previa se ha demostrado que
los fibroblastos murinos son destruidos por apoptosis cuando se
ponen en presencia del ligando Fas o de un anticuerpo agonista que
reconoce el receptor Fas y designado a continuación FasAb.
En otra experiencia previa, se ha determinado que
el producto I_{g} no alteraba el crecimiento celular, que no era
tóxico con respecto a fibroblastos murinos en las concentraciones
utilizadas y que podía por lo tanto ser añadido a un medio de
cultivo celular sin crear problemas.
El medio utilizado para el cultivo de los
fibroblastos murinos es el comercializado por la Sociedad Life
Technologies con la designación "Medio de Eagle Modificado de
Dulbecco", habiéndose descrito este medio en "Virology" 8,
396 (1959) por Dulbecco y otros.
Se ha añadido a este medio 5% en volumen de suero
fetal de vaca.
Este medio ha sido inoculado a continuación con
fibroblastos murinos en presencia de una cantidad suficiente de
antibióticos para eliminar las posibilidades de contaminación; la
concentración del medio de cultivo en fibroblastos ha sido de
10^{5} células por ml del medio.
El cultivo ha sido efectuado en el interior de un
incubador en el que la temperatura se ha mantenido a 37ºC;
conteniendo la atmósfera que llenaba el incubador 5% de
CO_{2}.
Después de la incubación de 24 horas, se ha
añadido el ligando Fas, o bien el FasAb directamente en el
medio.
La cantidad de FasAb que se ha añadido ha sido de
50\mug por ml de medio de cultivo.
En estas condiciones, aproximadamente el 70% de
las células del cultivo son destruidas por apoptosis después de
aproximadamente 24 horas de incubación.
Esta destrucción es demostrada por la coloración
al cristal violeta de las células supervivientes.
Se ha procedido a continuación a un cierto número
de ensayos destinados a poner en evidencia la acción del principio
activo.
En estos ensayos, se ha hecho variar, por una
parte, la concentración a la que es utilizado el principio activo en
el medio de cultivo y, por otra parte, en el momento en el que el
principio activo es añadido a este medio de forma que se determinen
las concentraciones óptimas en principio activo, así como el momento
o los momentos más oportunos de introducción del principio activo
con respecto a la adición de FasAb.
Se han hecho variar las concentraciones de
principio activo de 0,001 a 2 mg por ml.
Se ha estudiado sucesivamente el efecto obtenido,
añadiendo inicialmente el principio activo antes del FasAb, a
continuación al mismo tiempo y finalmente después del FasAb.
En un primer ensayo, se ha añadido el principio
activo 24 horas antes del FasAb.
En el marco de este ensayo, se ha observado el
efecto obtenido, utilizando sucesivamente 0, a continuación 5, a
continuación 10, a continuación 50, a continuación 100 y finalmente
500 ng de FasAb por ml de cultivo y, en cada caso concentraciones de
principio activo sucesivamente iguales a 0,25, después 0,5 y
finalmente 1 mg por ml de medio de cultivo, debiéndose entender que
se ha observado igualmente el efecto obtenido en ausencia del
principio activo, es decir, para una concentración de 0%.
Después de 24 horas de incubación, se procede al
análisis de supervivencia.
El resultado de este análisis se materializa por
el histograma de la figura 2.
Sobre el eje de abscisas de este histograma,
figura la concentración del medio en FasAb expresado en ng/ml y, en
un eje de ordenadas, la proporción de supervivencia expresada en
%.
Para cada una de las concentraciones en FasAb, se
ha materializado la proporción de supervivencia para cada una de las
cuatro concentraciones de principio activo, es decir 0 mg/ml, 0,25
mg/ml, 0,5 mg/ml y 1 mg/ml, para cuatro rectángulos paralelos al eje
de ordenadas, materializándose el desplazamiento tipo cada vez con
un segmento que sobrepasa el rectángulo correspondiente
paralelamente al eje de las ordenadas.
El rectángulo correspondiente a 0 mg/ml de
principio activo es, en cada caso, el situado más hacia la
izquierda, el que corresponde a 0,25 mg/ml de principio activo está
situado a su derecha, el que corresponde a 0,5 mg/ml está situado a
la derecha del anterior y así sucesivamente.
Los cuatro rectángulos se identifican cada vez
por rallados, puntos o marcas específicas.
El examen de los resultados reunidos de este modo
en el histograma de la figura 2 muestra que en ausencia de
principio activo, la proporción de supervivencia disminuye con el
aumento de la concentración de FasAb y que esta relación de
supervivencia se mejora sensiblemente por adición de principio
activo.
En un segundo ensayo, se ha añadido el medio de
cultivo al mismo tiempo el FasAb y el principio activo.
En este segundo ensayo, se ha observado el efecto
obtenido utilizando sucesivamente las mismas concentraciones en
FasAb y en principio activo que en el primer ensayo.
Después de 24 horas de incubación, se ha
procedido al análisis de supervivencia.
Los resultados registrados se han reunido en el
histograma de la figura 3 que está constituido según los mismos
principios que se han expuesto con respecto a la figura 2.
El examen de estos resultados demuestra que la
proporción de supervivencia evoluciona de manera análoga a la que se
ha observado en el primer ensayo.
En la tercera serie de ensayos, se ha añadido el
principio activo después del FasAb, es decir, sucesivamente:
al inicio, 1 hora después del FasAb,
a continuación, 3 horas después del FasAb, y
finalmente, 6 horas después del FasAb,
haciendo variar en todos los casos
la concentración de FasAb de 0 a 500 ng por ml de
cultivo.
En el caso de la adición de principio activo
efectuada 1 hora después del FasAb,
- -
- se ha reunido sobre el histograma de la figura 4 los resultados indicados para las concentraciones en I_{g} de 0 mg/ml de 0,005 mg/ml, de 0,01 mg/ml y finalmente de 0,05 mg/ml,
- -
- se han reunido sobre el histograma de la figura 5 los resultados indicados para concentraciones en I_{g} de 0 mg/ml, de 0,1 mg/ml, de 0,25 mg/ml y finalmente de 0,5 mg/ml, y
- -
- se han reunido sobre el histograma de la figura 6 los resultados indicados para concentraciones en I_{g} de 0 mg/ml, de 0,25 mg/ml, de 0,5 mg/ml y finalmente de 1 mg/ml.
Los histogramas de las figuras 4 a 6 están
constituidos según los mismos principios que los expuestos a
propósito del de la figura 2.
En el caso de la adición de principio activo
efectuado 3 horas después de la adición de FasAb, se ha reunido
sobre el histograma de la figura 7 los resultados indicados para
concentraciones en I_{g} de 0 mg/ml, de 0,25 mg/ml, de 0,5 mg/ml y
de 1 mg/ml.
En el caso de la adición de principio activo
efectuado 6 horas después de la adición de FasAb, se ha reunido
sobre el histograma de la figura 8 los resultados indicados para
concentraciones en I_{g} de 0 mg/ml, de 0,25 mg/ml, de 0,5 mg/ml y
de 1 mg/ml.
Los histogramas de las figuras 7 y 8 están
constituidos según los mismos principios que los expuestos a
propósito del correspondiente de la figura 2.
El examen de conjunto de los resultados reunidos
sobre los histogramas de las figuras 4 a 8 demuestra que, en el caso
de la adición del principio activo después de la adición de FasAb,
la proporción de supervivencia aumenta siempre; este efecto tiene
siempre tendencia a disminuir cuando aumenta el tiempo transcurrido
entre las adiciones sucesivas de FasAb y de principio activo; por
otra parte, es sensible a la concentración en principio activo
cuando ésta es inferior a 0,25 mg/ml; no se obtienen mejoras
sensibles para concentraciones superiores a 0,25 mg/ml.
En el experimento que se ha descrito, la
apoptosis era inducida por el sistema FasAb.
Se ha efectuado otra experiencia induciendo
apoptosis por el inhibidor de kinasa constituido por la
estaurosporina.
Se ha recordado que la estaurosporina induce
muerte apoptótica en el caso de la mayoría de las células con dosis
que varían de 0,5 a 5 \muM.
En este experimento, la adición de estaurosporina
y de I_{g} era simultánea.
Se han utilizado dos dosis de I_{g}, ha saber,
0,2 mg/ml y 0,5 mg/ml.
La estaurosporina se ha utilizado a razón de 0,5
\muM y a continuación de 1 \muM y finalmente de 1,5 \muM.
La proporción de supervivencia de las células
tratadas se ha determinado en cada caso 18 horas después de
incubación.
Los resultados registrados aparecen en el
histograma representado en la figura 9 que muestra la proporción de
supervivencia expresada en % en función de la concentración de
estaurosporina y para las dosis de I_{g} identificadas
anteriormente.
Se ha efectuado una experiencia testigo para una
concentración de estaurosporina de 0 \muM.
El examen de los resultados que aparecen en el
histograma demuestra que la utilización de I_{g} atenúa la
apoptosis inducida por la estaurosporina.
Resulta de las dos experiencias que se han
descrito que el medicamento según la invención permite obtener una
atenuación significativa de la apoptosis cuando ésta es inducida por
diferentes agentes.
En este ejemplo, el cultivo celular estudiado era
un cultivo de células humanas inmortalizadas, constituidas por
linfocitos T (Tipo Jurkat).
El medio del cultivo utilizado es el
comercializado por la sociedad Life Technologies con la designación
"RPMI 1640 Medium"; este medio se describe por Moore y otros,
en la publicación "A.M.A." 199,519 (1967).
Se añade a este medio 10% en volumen de suero
fetal de vaca y antibióticos para eliminar las posibilidades de
contaminación.
Se inocula este medio con una cantidad de
10^{6} linfocitos T por ml de medio.
La temperatura de incubación es de 37ºC y la
atmósfera que llena el incubador contiene 5% de CO_{2}.
Después de una incubación de 24 horas, se añaden
simultáneamente el FasAb y el principio activo.
La cantidad de FasAb (se trata del fabricado por
la Sociedad Upstate Biotechnology y comercializado con el número de
catálogo 05-201 por la Sociedad Euromedex) añadida
es de 50 ng/ml de cultivo.
El principio activo está constituido
sucesivamente por el producto I_{g} y el producto L_{11}.
Las cantidades utilizadas son, en cada caso, de
0,5 mg/ml.
El análisis de supervivencia se efectúa 18 horas
después del inicio del experimento.
Este análisis de supervivencia consiste en hacer
pasar un volumen de cultivo que contiene 10^{4} células en un
aparato del tipo de los que funcionan por citometría de flujo, en
este caso el comercializado por la Sociedad Beckton Dickinson con la
designación "FAC Scan cytometer".
Este aparato utiliza una sonda que detecta la
presencia de fosfatidil serina en la superficie de las células; la
presencia de este producto muestra que las células en cuestión son
apoptóticas.
Los resultados de este análisis aparece en las
figuras 10 a 13 en cada una de las cuales se han representado tres
polígonos, respectivamente (A), (B) y (C) cuyos contornos se han
definido para ser representativos de poblaciones celulares
distintas; el polígono (A) encierra un conjunto de células vivas, el
polígono (B) un conjunto de células apoptóticas y el polígono (C) un
conjunto de células muertas.
En la siguiente tabla II se han reunido los
porcentajes de células vivas, de células apoptóticas y el porcentaje
de células muertas en el caso de cada una de las figuras 10 a 13 que
se comentarán posteriormente.
La figura 10 muestra el análisis de supervivencia
efectuado en una muestra de un medio de cultivo en el que no se ha
añadido FasAb ni tampoco principio activo; se trata de un testigo;
en este caso, se aprecia que sustancialmente solo hay células vivas
que se encuentran en el polígono (A) (ver línea 1 de la tabla
II).
La figura 11 muestra el análisis de supervivencia
efectuado en una muestra de un medio de cultivo, en el que no se ha
añadido más que FasAb; en este caso, se aprecia que el polígono (B)
contiene 21% de células apoptóticas (ver línea 2 de la tabla
II).
La figura 12 muestra el análisis de supervivencia
efectuado en una muestra de un medio de cultivo que ha recibido la
adición simultánea de FasAb y del principio activo I_{g} (0,5
mg/ml); en este caso, se aprecia que el polígono (B) no contiene
prácticamente células apoptóticas (2%), el polígono (A) contiene
muchas células vivas y el polígono (C) una cierta concentración (6%)
de células muertas (ver línea 3 de la tabla II).
La figura 13 muestra el análisis de supervivencia
efectuado en una muestra de un medio de cultivo que ha recibido la
adición simultánea de FasAb y el principio activo L_{11} (0,5
mg/ml); en este caso, se aprecia que el polígono (B) contiene una
cantidad importante (13%) de células apoptóticas y el polígono (C)
una cantidad no despreciable (9%) de células muertas (ver fila 4 de
la tabla II).
Las conclusiones susceptibles de ser extraídas
del examen de las figuras 10 a 13 y del análisis del porcentaje de
células presentes en los diferentes polígonos hacen, como
consecuencia, que el principio activo I_{g}, en el marco de esta
experiencia, inhiba la apoptosis de FasAb (se pasa de 21% a 2% de
células apoptóticas). No obstante, se observa un ligero aumento del
número de células muertas (este número pasa de 1% a 6%). Si se
considera el número de células vivas, se observa una protección de
13% (se pasa de 77% a 90%).
En lo que respecta al principio activo, L_{11},
se observa un aumento del número de células muertas (se pasa de 1% a
9%) con respecto al efecto inducido por FasAb únicamente. El
principio L_{11} si bien no induce un efecto importante sobre el
número de células vivas, actuaría por lo tanto como potenciador de
la muerte celular.
Con el objetivo de optimizar la acción de
L_{11}, se han realizado los experimentos siguientes.
Se administra, utilizando el mismo cultivo que
anteriormente:
- \ding{226}
- en un primer caso, 50 ng/ml de FasAb solo (procedente de Euromedex identificado más arriba)
- \ding{226}
- en un segundo experimento, la misma cantidad del mismo FasAb simultáneamente con 0,5 mg/ml de producto L_{11} y
- \ding{226}
- en un tercer experimento 0,5 mg/ml del producto L_{11} y posteriormente, 24 horas más tarde, 50 ng/ml del mismo FasAb.
Los resultados obtenidos después de 18 horas de
incubación son los siguientes en comparación con lo observado sobre
un cultivo testigo que no haya recibido la adición FasAb ni de
L_{11}, siendo la magnitud tomada en consideración el número de
células vivas:
- \blacktriangleright
- en el caso de la añadidura de FasAb solamente: el número de células vivas disminuye en 3,6%,
- \blacktriangleright
- en el caso de la adición simultánea de FasAb y L_{11}, el número de células vivas disminuye en 6,4% y
- \blacktriangleright
- en el caso de adición diferida de FasAb y L_{11}, el número de células vivas disminuye en 13,7%.
Se deduce de lo anterior que L_{11} es mucho
más activo cuando es administrado antes de FasAb.
Se indica que se han obtenido resultados análogos
sustituyendo el FasAb identificado anteriormente por un FasAb de
otro origen, es decir, el fabricado por la Sociedad Alexis
Corporation (San Diego, U.S.A.) y comercializado por la Sociedad
Coger S.A. (París).
Del examen de los resultados de los experimentos
anteriores, resulta que un medicamento a base del producto L_{11}
permite potenciar la apoptosis; por lo tanto se puede prever su
utilización en el tratamiento de enfermedades del tipo autoinmunes y
de cáncer.
Otros experimentos han permitido verificar los
efectos producidos por la administración del producto I_{g}, por
una parte, en cultivos de linfocitos en los que se ha inducido una
apoptosis Fas de baja intensidad y, por otra parte, en el caso de
cultivos de linfocitos en los que se ha inducido una apoptosis Fas
de fuerte intensidad.
La apoptosis de Fas de baja intensidad puede ser
inducida utilizando un FasAb de procedencia Euromedex; una apoptosis
de este tipo puede ser del orden de 3 a 10%.
La apoptosis Fas de fuerte intensidad puede ser
inducida utilizando un FasAb de procedencia Alexis Corporation; una
apoptosis de este tipo puede ser del orden de 20 a 50%.
Las experiencias realizadas utilizando una dosis
de 0,2 mg/ml del producto I_{g} se han mostrado en la figura 14
que muestra los efectos registrados, es decir, la estimulación o la
inhibición de la apoptosis (expresadas en %) en función de la
intensidad de la apoptosis (en %) inducida solamente por FasAb
(concentración de 50 a 200 ng/ml).
La figura 14 muestra que
- \blacktriangleright
- en el caso de apoptosis de baja intensidad, del orden de 3 a 10%, materializadas en el eje de abscisas por los puntos a, b, c, d, e, f, g, h, i, la administración de I_{g} provoca una potenciación de 20 a 40% de la apoptosis con respecto a la apoptosis por FasAb solamente y
- \blacktriangleright
- en el caso de apoptosis de fuerte intensidad, del orden de 20 a 50%, materializada sobre el eje de abscisas por los puntos l, m, p, q, la administración de la misma cantidad de I_{g} provoca una inhibición de la apoptosis de 5 a 20% con respecto a la apoptosis producida por FasAb solamente.
Sabiendo que es posible determinar en un sujeto
determinado la apoptosis inducida a nivel de los linfocitos, resulta
por lo tanto posible modular ésta según la intensidad comprobada de
dicha apoptosis en el sentido de la potenciación o en el sentido de
la inhibición administrando a este sujeto un medicamento a base de
I_{g}.
Como consecuencia, este medicamento podrá
permitir la corrección de la apoptosis en el sentido de la
potenciación cuando el sujeto está afectado por una enfermedad de
tipo cáncer o de enfermedad autoinmune correspondiente a una
apoptosis reducida y en el sentido de una inhibición cuando el
sujeto sufre una afección de tipo síndrome
inmuno-deficiente que corresponde a una apoptosis
fuerte.
En esta situación, se precisa que los linfocitos
T tipo Jurkat presentes en los cultivos sometidos a los experimentos
anteriores, sean células cuyo gen supresor de tumor p53 o proteína
p53 (Bing An y otros, 1998, "Cell Death and Differentiation" 5,
1062-1075) ha mutado y, por este hecho, es
inactivo.
Los efectos observados con los productos
utilizados según la invención, especialmente con I_{g} y L_{11},
son probablemente independientes de p53; dicho de otro modo, los
productos I_{g} y L_{11} son capaces de potenciar la
estimulación o la inhibición de la apoptosis por su única presencia
e independientemente de la presencia o ausencia del gen p53
activo.
No obstante, en la mayor parte de los cánceres
humanos (ver Hollstein y otros, 1994, "Nucl. Acid Res.", 22,
3551), la proteína p53 ha mutado, y por lo tanto es inactiva; se
deduce de ello que la utilización de un medicamento a base de uno de
los productos de acuerdo con la invención, y en particular los
productos I_{g} y L_{11}, permite solucionar las disfunciones de
la proteína p53 y tratar las enfermedades de tipo cáncer y
enfermedades de tipo autoinmune.
La invención permite, como consecuencia, tratar
las enfermedades en cuestión por una vía fundamentalmente distinta y
más simple que la terapia génica que se basa en el principio que se
refiere especialmente a la reintroducción de un gen p53 normal en el
genoma de las células mutadas de un sujeto enfermo.
Es sabido que la mayor parte de las células
cancerosas han perdido su sensibilidad a la apoptosis FasAb y que la
mayor parte de los agentes anticancerosos actualmente utilizados
actúan activando el gen p53 que, por su parte, actúa positivamente
sobre el sistema FasAb. No obstante, estos sistemas dejan de
funcionar si existe mutación de p53 (Müller y otros, 1998, J. Exp.,
Med. 188, 2033-2043). Según las observaciones
recientes, el sistema FasAb es esencial para la destrucción de las
células cancerosas, bien sea por el sistema inmunitario o por acción
de medicamentos anticancerosos; se deduce de ello que el hecho de
que los productos utilizados según la invención y especialmente
I_{g} y L_{11} modulen la apoptosis de dichas células cancerosas
de manera independiente de p53 reviste una importancia considerable
y permite prever la utilización de una nueva generación de
medicamentos especialmente
anticancerosos.
anticancerosos.
El producto I_{g} se compone, tal como se ha
indicado anteriormente, de una mezcla de
oligo-iota-carragenanos.
Se ha comprobado el efecto inducido por
diferentes constituyentes de esta mezcla, en particular de las
fracciones DP 2, DP 3, DP 4, DP 5 y DP 7.
Igualmente se ha comprobado el polímero que
constituye la materia prima de I_{g}, así como, el producto
denominado KIK (hexasacárido de tipo
kapa-iota-kappa).
Para estos experimentos, se ha procedido tal como
se ha indicado en el ejemplo 1, introduciendo simultáneamente, por
una parte, 0,2 mg/ml de cada una de dichas fracciones de I_{g} y,
por otra, 100 ng/ml de FasAb de origen Euromedex.
Después de 24 horas de incubación, se han hecho
las comprobaciones que se resumen a continuación.
Las fracciones DP 2, DP 3, DP 4 y DP 5 son
inactivas y no estimulan la apoptosis inducida por una dosis
reducida (100 ng/ml) de FasAb de procedencia Euromedex que induce
por sí misma 6% de muerte celular después de 18 horas de
incubación.
Por el contrario, se obtiene un efecto
estimulador muy fuerte por la fracción DP 7 (50%) y por el producto
I_{g} (70%), lo que muestra que uno de los componentes activos de
la mezcla I_{g} puede estar constituido por la fracción DP 7; por
otra parte, el producto KIK no tiene actividad.
Finalmente, se ha descubierto que el polímero que
constituye la materia prima para la preparación de I_{g} antes del
fraccionamiento o clivado por la enzima iotasa es, por su parte,
activo y estimula una apoptosis Fas de reducida intensidad. Por el
contrario, la encima iotasa, que por su parte es utilizada en 50
unidades, no tiene actividad cuando es incubada con las células.
Se deduce de ello que el principio activo
I_{g}, que no tiene actividad apoptótica intrínseca, induce una
estimulación muy fuerte en el caso de una apoptosis FasAb de
reducida intensidad.
Se ha procedido a un experimento complementario
que confirma los resultados traducidos por la figura 14.
En el caso de los fenómenos apoptóticos inducidos
por Fas, la primera de las caspasas de la cascada de caspasas
activadas es la caspasa 8.
Se ha procedido a la medición de la actividad de
esta caspasa 8, que es una enzima protoelítica, después de lisis de
las células Jurkat tratadas o no con FasAb sólo y con FasAb al mismo
tiempo que con I_{g}.
Para ello, se ha producido la medición de
- \blacktriangleright
- la actividad de la caspasa 8 en una primera fracción de un cultivo de células Jurkat en ausencia de FasAb y de I_{g}; el porcentaje de células vivas en el cultivo es de 93%;
- \blacktriangleright
- la actividad de la caspasa 8 en una segunda fracción del mismo cultivo, 18 horas después de incubación con 500 ng/ml de FasAb de procedencia Euromedex (que, tal como se ha indicado anteriormente, induce una apoptosis reducida, del orden de 13%); siendo el porcentaje de células vivas en el cultivo de 80%;
- \blacktriangleright
- la actividad de la caspasa 8 en una tercera fracción del mismo cultivo, 18 horas después de incubación con 500 ng/ml de FasAb de procedencia Euromedex y de 0,2 mg/ml de I_{g}; siendo el porcentaje de células vivas en el cultivo de 50%;
- \blacktriangleright
- la actividad de la caspasa 8 en una cuarta fracción del mismo cultivo, 18 horas después de la incubación con 25 ng/ml de FasAb de procedencia Alexis (que, tal como se ha indicado anteriormente, induce una apoptosis intensa, del orden de 40%); el porcentaje de células vivas en el cultivo es de 53%;
- \blacktriangleright
- la actividad de la caspasa 8 en una quinta fracción del mismo cultivo, 18 horas después de incubación con 25 ng/ml de FasAb de procedencia Alexis y de 0,2 mg/ml de I_{g}; siendo el porcentaje de células vivas en el cultivo de 59%;
La medición de la actividad caspasa se ha
efectuado cada una de las veces con ayuda de un equipo o kit
comercializado por la sociedad Ozyme con la denominación "Apo
Alert Flice Fluor" N^{0} K2028-2.
Los resultados de estas mediciones se han reunido
en el histograma de la figura 15.
El examen de este histograma muestra que
- \ding{226}
- la actividad caspasa 8 es débilmente estimulada (factor próximo de 1,37) por FasAb Euromedex sólo, induciendo la administración simultánea de I_{g} una estimulación fuerte (factor próximo de 3,93),
- \ding{226}
- la actividad caspasa 8 es fuertemente estimulada (factor próximo de 4,96) por FasAb Alexis sólo, disminuyendo esta estimulación fuerte (factor próximo de 4,05) cuando se introduce I_{g} simultáneamente con FasAb Alexis.
Existe, como consecuencia, una correlación neta
entre la apoptosis y la actividad caspasa 8.
El producto I_{g} representa por lo tanto un
producto capaz de modular la actividad de la caspasa 8.
El hecho que se muestre que esta enzima se
encuentre esencialmente en la vía bioquímica de la apoptosis
inducida por Fas (Juo y otros, Curr. Biol. 8,
1001-1008, 1998), permite prever nuevos medicamentos
a base de oligosacáridos que permiten captar las enzimas de tipo
caspasa.
Estos productos representan por lo tanto una
alternativa a una terapia basada en péptidos que llevan la secuencia
reconocida por la caspasa 8 ("substrato suicida" de caspasa
8).
Claims (10)
1. Medicamento, caracterizado por
presentar, como principio activo, una cantidad eficaz de como mínimo
una sustancia de oligosacárido apropiada para modular las
disfunciones de la apoptosis y que comporta eventualmente, por lo
menos en ciertos de sus motivos unitarios, como mínimo un
sustituyente del grupo que comprende las agrupaciones sulfato,
metilo y acetilo, escogiéndose la sustancia en el grupo que
comprende
- los oligosacáridos derivados por vía enzimática
o química de los polímeros del grupo que comprende los \beta
1-3 glucanos que comportan eventualmente
ramificaciones \beta 1-6, y
- los oligosacáridos derivados por vía enzimática
o química de los carragenanos, de los agares y de los
porfiranos.
2. Medicamento, caracterizado por
comportar, como principio activo, una cantidad eficaz como mínimo de
un oligosacárido apropiado para modular las disfunciones de la
apoptosis y que responde a la fórmula
en la que n representa un número
entero de 1 a 50, preferentemente de 5 a 10 y en la que el número de
ramificaciones varía de 0 a 3 por unidad de
repetición.
3.Medicamento, caracterizado por
presentar, como principio activo, una cantidad eficaz de como mínimo
un disacárido de repetición apropiado para modular las disfunciones
de la apoptosis y que responde a la fórmula
en la que n representa un número
entero de 1 a 50, preferentemente de 1 a 20, pudiendo como mínimo
algunos de los disacáridos de repetición de fórmula (II) presentar
uno o varios grupos
sulfato.
4. Medicamento, caracterizado por
comportar, a título de principio activo, una cantidad eficaz del
producto apropiado para inhibir como mínimo parcialmente la
apoptosis y que es obtenido por hidrólisis a partir de
iotacarragenato sódico, estando constituido este producto por una
mezcla de oligo-iota-carragenanos
indicado por I_{g}, cuyo contenido en osas totales (determinado
según Tillmans y Philippi) es de 62% y cuyo perfil de distribución
por medida, estimado por electroforesis sobre gel de poliacrilamida
según Zablakis y Pérez, es de:
5. Medicamento, caracterizado por
comportar, como principio activo, una cantidad eficaz del producto
apropiado para activar disfunciones de la apoptosis, obtenido por
extracción acuosa ácida, a partir de algas marrones y más
particularmente de una alga marrón denominada Laminaria
digitata, cuyo producto está constituido por una mezcla de oligo
\beta 1-3 glucanos designados por L_{11} y que
presentan de 1 a 50, preferentemente de 20 a 30 unidades de
sacáridos, presentando el producto en cuestión el espectro RMN
mostrado en la figura 1.
6. Medicamento, caracterizado por
comportar, como principio activo, una cantidad eficaz del producto
apropiado para activar las disfunciones de la apoptosis y
constituido por la fracción DP7 del producto I_{g} según la
reivindicación 4.
7. Procedimiento para la preparación de un
medicamento para el tratamiento de las disfunciones de la apoptosis,
caracterizado por el hecho que se hace que un compuesto
galénico comporte por lo menos uno de los principios activos de los
medicamentos según, como mínimo, una de las reivindicaciones 1 a
6.
8. Utilización, para la preparación de un
medicamento para el tratamiento de las disfunciones de la apoptosis,
como mínimo de una de las sustancias de oligosacáridos que presentan
eventualmente, por lo menos en algunos de sus motivos unitarios,
como mínimo un sustituyente del grupo que comprende los grupos
sulfato, metilo y acetilo, escogiéndose la sustancias apropiadas
para modular las disfunciones de la apoptosis en el grupo que
comprende
- los oligosacáridos derivados por vía enzimática
o química de los polímeros del grupo que comprende los \beta
1-3 glucanos que comportan eventualmente
ramificaciones \beta 1-6, y
- los oligosacáridos derivados por vía enzimática
o química de los carragenanos, de los agares y de los
porfiranos,
9. Utilización, para la preparación de un
medicamento para el tratamiento de las disfunciones de la apoptosis,
de los oligosacáridos de fórmula (I) y de los de fórmula (II).
10. Utilización de los productos indicados por
I_{g} y L_{11} y del producto que constituye la fracción DP 7
del producto I_{g}, según la reivindicación 4, para la preparación
de medicamentos para el tratamiento de las disfunciones de la
apoptosis.
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