ES2225834T3 - Compuestos y composiciones farmaceuticas para el tratamiento y profilaxis de infecciones bacterianas. - Google Patents
Compuestos y composiciones farmaceuticas para el tratamiento y profilaxis de infecciones bacterianas.Info
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Abstract
SE DESCRIBEN NUEVOS METODOS PARA EL TRATAMIENTO Y/O PROFILAXIS DE ENFERMEDADES CAUSADAS POR BACTERIAS QUE SE ADHIEREN A LOS TEJIDOS. INTERACTUANDO CON CHAPERONES MOLECULARES PERIPLASMICOS SE CONSIGUE QUE EL ENSAMBLAJE DE PILI SE PREVENGA O INHIBA Y, POR TANTO, SE DISMINUYA LA INFECCIOSIDAD DE LA BACTERIA. TAMBIEN SE DESCRIBEN METODOS PARA LA SELECCION DE FARMACOS, ASI COMO METODOS PARA EL NUEVO DISEÑO DE TALES FARMACOS, METODOS QUE DEPENDEN DE LOS NUEVOS METODOS DE MODELADO DE FARMACOS POR ORDENADOR, QUE IMPLICAN UN CALCULO APROXIMADO DE LA ENERGIA LIBRE DE UNION ENTRE MACROMOLECULAS. FINALMENTE, TAMBIEN SE DESCRIBEN NUEVAS PIRANOSIDAS QUE SE CREE SON CAPACES DE INTERACTUAR CON CHAPERONES PERIPLASMICOS MOLECULARES.
Description
Compuestos y composiciones farmacéuticas para el
tratamiento y profilaxis de infecciones bacterianas.
La presente invención se refiere a sustancias
para uso en el tratamiento y/o profilaxis de enfermedades provocadas
por bacterias que forman pilus que se adhieren al tejido por
interacción con la unión entre las subunidades de pilus y las
chaperonas periplásmicas. La invención también se refiere a
procedimientos para identificar/diseñar sustancias capaces de
interactuar con las chaperonas periplásmicas y a procedimientos para
identificar los sitios de unión en las chaperonas periplásmicas.
Finalmente, la invención se refiere a nuevas sustancias capaces de
interactuar con las chaperonas periplásmicas así como a
preparaciones farmacéuticas que comprenden sustancias capaces de
interactuar con las chaperonas periplásmicas.
La bacteria patogénica
Gram-negativa provoca diversas afecciones
patológicas tales como bacteremia, diarrea relacionada con
bacterias, meningitis y (muy comúnmente) infecciones del tracto
urinario, es decir, pielonefritis, cistitis, uretritis, etc.
Las infecciones del tracto urinario son una de
las causas principales de morbididad en las mujeres. A pesar de la
gran importancia de las infecciones del tracto urinario en las
mujeres, se han hecho pocos esfuerzos para aplicar nuevas
estrategias con el fin de tratar y/o prevenir estas enfermedades.
Frecuentemente, se usan antibióticos convencionales para tratar
estas infecciones, tales como el tratamiento con penicilinas,
cefalosporinas, aminoglicósidos, sulfonamidas y tetraciclinas; en el
caso especial de infecciones del tracto urinario, también se emplean
antisépticos urinarios tales como nitrofuranotoína y ácido
nalidíxico. Sin embargo, en el futuro la resistencia emergente a los
antibióticos dificultará la capacidad para tratar satisfactoriamente
las infecciones del tracto urinario. Está aumentando la resistencia
a múltiples antibióticos entre estos uropatógenos. Se ha estimado
que el coste anual para la evaluación y el tratamiento de mujeres
con infecciones del tracto urinario supera el billón de dólares.
Además, aproximadamente un cuarto del coste anual de 4 billones de
dólares atribuidos a infecciones nosocomiales es una consecuencia de
las infecciones del tracto urinario. Entre los agentes que causan
las infecciones del tracto urinario, Escherichia coli
predomina claramente entre las bacterias
Gram-negativas.
Las bacterias patogénicas gram negativas,
notablemente Escherichia coli, Haemophilus influenzae,
Salmonella enteriditis, Salmonella typhimurium, Bordetella
pertussis, Yersinia pestis, Yersinia enterocolitica Helicobacter
pylori y Klebsiella pneumoniae deben parte de su
infectabilidad a su capacidad para adherirse a diversos tejidos
epiteliales. De esta manera, por ejemplo E. coli se adhiere a
las células epiteliales en el tracto urinario superior a pesar del
efecto aclarador del flujo unidireccional de orina de los
riñones.
Como se ha indicado anteriormente, las bacterias
mencionadas anteriormente están implicadas en diversas enfermedades:
Infecciones del tracto urinario (E. coli), diarrea aguda
(E. coli, Y. eterocolitica y Salmonella spp),
meningitis (E. coli y H. influenzae), tos convulsiva
(B. pertussis), peste (Y. pestis), neumonía y otras
infecciones del tracto respiratorio (K. pneumoniae, H.
influenzae) y úlcera péptica (H. pylori).
Se cree que el inicio y persistencia de muchas
infecciones bacterianas tales como las descritas anteriormente
requieren la presentación de adhesinas en la superficie del microbio
en configuraciones accesibles que promueven los eventos de unión que
dictan si se producirá la colonización extracelular, internalización
u otras respuestas celulares. Las adhesinas normalmente son
componentes de los anexos proteicos heteropoliméricos largos, finos
y filamentosos conocidos como pili, fimbrias o fibrillas (estos tres
términos se usarán indistintamente en este documento). El evento de
unión bacteriana normalmente es el resultado de un ajuste
estereoquímico entre una adhesina frecuentemente localizada en la
punta del pilus y las arquitecturas de un receptor específico en las
células huésped, que comprende normalmente estructuras carbohidrato
en glicoconjugados asociados a la membrana.
Las cepas uropatogénicas de E. coli P
expresan los pili P y de tipo 1 que se unen a los receptores
presentes en células uroepiteliales. La adhesina presente en la
punta del pilus P, PapG (polipéptido G asociado al pilus), se
une al resto Gal\alpha(1-4)Gal
presente en las globoseries de glicolípidos, mientras que la
adhesina de tipo 1, FimH, se une a la
D-manosa presente en glicolípidos y glicoproteínas.
Los pili P adhesivos son determinantes virulentos asociados con
cepas pielonefríticas de E. coli mientras que los pilus de
tipo 1 parecen ser más comunes en E. coli provocando
cistitis. Al menos once genes están implicados en la biosíntesis y
expresión de los pili P funcionales; se ha determinado la secuencia
de ADN del grupo del gen pap entero. Los pili P están compuestos de
fibras heteropoliméricas compuestas de fibrillas adhesivas flexibles
unidas de extremo a extremo a los bastoncillos del pilus. El
bastoncillo del pilus se compone de subunidades proteicas
PapA repetidas organizadas en un cilindro helicoidal a mano
derecha. Se descubrió que las fibrillas terminales que se extienden
de los extremos distales de cada bastoncillo del pilus están
compuestas mayormente de subunidades repetidas de PapE
organizadas en una conformación helicoidal abierta. La adhesina
PapG se localizó en los extremos distales de las fibrillas
terminales, un lugar que se asume que maximiza su capacidad para
reconocer los receptores de glicolípidos en células eucariotas. Dos
componentes minoritarios del pilus, PapF y PapK, son
proteínas de adaptoras especializadas que se encuentran en la
fibrilla terminal. PapF se une al residuo adhesina en la
fibrilla mientras que PapK une la fibrilla al bastoncillo del
pilus. La composición de la arquitectura de la fibra del pilus P
revela la estrategia usada por E. coli uropatogénico para
presentar la adhesina PapG a los receptores eucariotas. El
bastoncillo PapA rígido extiende la adhesina lejos de la
interferencia provocada por LPS y otros componentes en la superficie
celular bacteriana mientras que la fibrilla flexible permite a
PapG una libertad estérica para reconocer y unirse al residuo
digalactósido en el uroepitelio. Con unas pocas excepciones, la
organización estructural de los pili de tipo 1 es muy similar a la
descrita para los pili P. En los pili de tipo 1, la manosa que se
une a la adhesina terminal fibrilar se conoce como FimH.
La unión de los pili asociados con virulencia en
patógenos Gram-negativos requiere la función de
chaperonas periplásmicas. Las chaperonas moleculares son componentes
vitales de todas las células vivas, procariotas y eucariotas. Las
chaperonas ofrecen diversas funciones celulares incluyendo
plegamiento, importación y exportación de proteínas en diversos
compartimentos celulares (Gething y Sambrook, 1992). De esta manera,
una chaperona periplásmica es una chaperona molecular que ejerce su
acción en el espacio periplásmico en las bacterias.
PapD y FimC son las chaperonas
periplásmicas que median la unión de los pili P y de tipo 1,
respectivamente. Los análisis estructurales detallados han revelado
que PapD es el miembro prototipo de una familia conservada de
chaperonas periplásmicas en bacterias
Gram-negativas. Estas chaperonas tienen una función
que es parte de una estrategia general usada por bacterias para
tapar y repartir las subunidades interactivas importadas en el
espacio periplásmico en los complejos de componentes de unión, sin
realizar interacciones productivas desfavorables. La determinación
de la estructura tridimensional de PapD revela que ésta se
compone de dos dominios de tipo inmunoglobulina orientados en un
configuración en forma de bumerang de tal manera que se forma una
hendidura. PapD se une a cada uno de los tipos de subunidad
de pilus ya que emergen de la membrana citoplásmica y las acompaña
en el componente de unión, conformaciones de tipo natural de la
membrana citoplásmica a los sitios de unión exterior de la membrana
compuestos de PapC. PapC se refiere a un acomodador molecular ya que
recibe los complejos chaperona-subunidad e
incorpora, o hace pasar, las subunidades del complejo de chaperonas
en el pilus creciente en un orden definido.
Con la excepción de la clase de tipo IV de los
pili, todos los otros sistemas del pilus bien caracterizados
genéticamente en procariotas Gram-negativas
contienen un gen análogo a PapD (Normark y col., 1986;
Hultgren y col., 1991); véase también la tabla A. FanE, faeE,
sfaE, ClpE y f17-D se han secuenciado
(Lintermans, 1990; Schmoll y col., 1990; Bertin Y y col., 1993;
Bakker y col., 1991) y codifica las chaperonas del pilus requeridas
para la unión de los pili K99, K88, S y f17, respectivamente, en
E. coli. La unión de los pili Klebsiella pneumoniae de
tipo 3 y pili Haemophilus influenzae de tipo B requiere los
productos genéticos mkrb y hifB, respectivamente
(Gerlach y col., 1989; Allen y col., 1991). Las relaciones entre
estructura-función de todas estas chaperonas se ha
analizado usando sus secuencias de aminoácidos y la información de
la estructura cristalina de PapD (Anders Holmgren y col.,
1992). Los resultados han proporcionado una nueva percepción de las
complejidades moleculares que se han conservado evolutivamente en
esta clase de proteínas y sugieren similitudes estructurales
significativas con las inmunoglobulinas.
De esta manera, PapD es el miembro
prototipo de una familia de proteínas chaperona periplásmicas que
son necesarias para la correcta unión supramolecular de los pili
bacterianos. Las chaperonas tales como PapD en E. coli
se requieren para unir las proteínas del pilus mencionadas
anteriormente importadas en el espacio periplásmico, para
repartirlas en los complejos de unión competentes y para prevenir la
agregación no productiva de las subunidades en el periplasma (Dodson
y col., 1993).
En ausencia de una interacción con la chaperona,
las subunidades de pilus se agregan y se degradan proteolíticamente
(Kuehn, Normak y Hultgren, 1991). Se ha descubierto recientemente
(Strauch, Johnson y Beckwith, 1989) que la proteasa DegP es
responsable en gran medida de la degradación de las subunidades de
pilina en ausencia de la chaperona. Este descubrimiento ha permitido
la aclaración del destino de las subunidades de pilus expresadas en
presencia o ausencia de la chaperona usando antisuero monoespecífico
en transferencias de western de la membrana citoplásmica, de la
membrana exterior y de las proteínas periplásmicas preparadas de
acuerdo con los procedimientos convencionales. La expresión de papG
o papA en la cepa degP41 (una cepa DegP^{-} de E. coli) en
ausencia de una chaperona fue tóxica para la bacteria debido a la
acumulación de estas proteínas en la membrana citoplásmica, lo que
sugiere que la chaperona se requirió para importar la subunidad en
el espacio periplásmico. La gravedad del defecto en el crecimiento
se relacionó con el nivel de expresión de la subunidad de pilina, y
generalmente fue más dramático con PapG que con PapA.
La co-expresión de PapD bajo el control del
promotor de arabinosa inducible recuperó el defecto de crecimiento
asociado con la expresión de la subunidad en la cepa ddegP41
y permitió que se importase PapG en el periplasma.
Hasta la fecha, se ha aclarado poco sobre los
motivos del reconocimiento molecular de las chaperonas. Las
chaperona citoplásmicas tales como SecB, GroEL y DNaK
se unen a un grupo diverso de proteínas diana no plegadas en una
secuencia de manera independiente (Gething y Sambrook, 1992).
Recientemente, se ha sugerido que DNaK se une principalmente
mediante el esqueleto peptídico de la diana (Landry y col., 1992) y
que GroEL puede depender más de la hidrofobicidad de cadena lateral
y de la capacidad de la secuencia diana para formar una hélice
\alpha anfipática (Landry y Gierasch, 1991). PapD difiere,
sin embargo, en que parece que se une a sus proteínas diana en
conformaciones plegadas (Kuehn y col., 1991).
La estructura tridimensional de PapD se ha
resuelto previamente (Holmgren y Branden, 1989). Esto ha demostrado
que PapD consta en dos dominios globulares posicionados de
tal forma que la configuración global de la molécula se parece a un
bumerang con una hendidura entre los dos dominios. Cada dominio es
una estructura de barril \beta formado por dos láminas plegadas
\beta antiparalelas, envasadas fuertemente para formar un núcleo
hidrófobo, con una topología similar a la de un pliegue de
inmunoglobulina. El dominio del extremo N de PapD se parece
mucho a un dominio de variable Ig mientras que el dominio del
extremo C de PapD se parece a CD4 (Wang y col., 1990, Ryu y
col., 1990) y al receptor de la hormona de crecimiento humano (de
Vos y col., 1992).
Una alineación estructural entre PapD y
varias chaperonas periplásmicas que se pronostica que tienen una
estructura similar de tipo inmunoglobulina ha identificado residuos
invariantes, altamente conservados y variables en esta familia
proteica (Holmgren y col., 1992). Los residuos más conservados
parecen participarse manteniendo la estructura y orientación
globales de unos dominios hacia otros. Sin embargo, dos residuos
conservados, ARg-8 y Lys-112 son de
superficie expuesta y orientada hacia la hendidura entre los
dominios. La mutagénesis dirigida al sitio del aminoácido
Arg-8 ha demostrado que forma al menos parte de la
cavidad que se une a la subunidad de pilus (Holmgren y col., 1992;
Kuehn y col., 1993).
A partir de un análisis secuencial de varias
proteínas de la subunidad de pilus mencionadas anteriormente, se ha
observado que poseen diversas características comunes incluyendo
homologías en los extremos C (véase también el ejemplo 2). Se cree
que estas similitudes en la secuencia pueden ser responsables de
alguna función común a todas las proteínas del pilus, tales como la
unión a su chaperona periplásmica. De hecho, ya se ha demostrado que
la región C-terminal de la adhesina de los pili P
PpaG es importante en la unión in vivo a PapD
(Hultgren y col., 1989). La Tabla A enumera 16 proteínas
periplásmicas, todas implicadas en la unión de las estructura
celulares superficiales en bacterias patogénicas y todas con
homología significativa con PapD.
- * Esta chaperona está presente en todas las Enterobacateriaceae, ya que todos los miembros de esta familia producen pili de tipo 1.
En resumen, se conocen la estructura
tridimensional de PapD así como la función de PapD y
otras chaperonas periplásmicas, mientras que se sigue desconociendo
el motivo exacto de la unión entre PapD y las subunidades de
pilus.
De acuerdo con la presente invención, se ha
comprendido que las características mencionadas anteriormente de
PapD y de otras chaperonas relacionadas las hacen dianas
interesantes para los fármacos diseñados principalmente para reducir
la patogenicidad de bacterias que se adhieren mediante pili; por
ejemplo, un fármaco que bloquea la unión entre una chaperona y las
subunidades de pilus (interfiriendo, por lo tanto, con el ensamblaje
del pilus intacto) interferirá con la formación de los pili
intactos, reduciendo por lo tanto la capacidad bacteriana para
adherirse al epitelio del huésped.
Con el fin de diseñar tal fármaco es de gran
valor que se conozca con detalle el motivo de la unión entre la
chaperona y la(s) proteína(s) del pilus, con el fin de
desarrollar el procedimiento para identificar eficazmente los
compuestos capaces de bloquear esta unión.
Un aspecto de la presente invención se refiere a
una sustancia para uso en el tratamiento y/o profilaxis de
enfermedades provocadas por bacterias que forman pilus que se
adhieren al tejido, que comprende prevenir, inhibir o mejorar la
unión entre al menos un tipo de subunidad de pilus y al menos un
tipo de chaperona molecular en bacterias que forman pilus, cuya
chaperona molecular se une a las subunidades de pilus durante el
transporte de estas subunidades de pilus a través del espacio
periplásmico y/o durante el procedimiento de ensamblaje de pilus
intacto, donde el sitio de unión es un sitio de unión al que se
puede unir la parte carboxilo terminal de una subunidad de pilus, y
que comprende puntos del sitio sustancialmente idénticos a los
residuos invariantes Arg-8 y Lys-112
en PapD, y un fragmento polipeptídico que puede interactuar
con una cadena \beta de la parte carboxilo terminal de la
subunidad de pilus estabilizando, por lo tanto, la unión de dicha
subunidad en los puntos del sitio Arg-8 y
Lys-112 del sitio de unión. Un aspecto especialmente
preferido de la invención es un procedimiento como se ha descrito
anteriormente, donde el lado de unión es el sitio de unión a la
proteína G de PapD como se describe en este documento.
Como se usa en este documento, el término
"pilus", "fimbria" o "fimbrilla" se refiere a
estructuras heteropoliméricas fibrilares incrustadas en la membrana
externa de muchas bacterias patogénicas que se adhieren a tejidos,
notablemente la bacteria patogénica gram negativa. En la presente
memoria descriptiva, los términos pilus, fibrilla y fimbria se
usarán indistintamente. Un pilus, como se ha explicado
anteriormente, se compone de varias "subunidades de pilus", que
constituyen distintas partes funcionales del pilus intacto. Una
subunidad de pilus muy importante es la "adhesina", la
subunidad de pilus que es responsable de la capacidad de unión a
tejidos de la bacteria.
Por el término "chaperona molecular" se
entiende una molécula que en las células vivas tiene la
responsabilidad de unirse a los péptidos con el fin de madurar los
péptidos de varias formas. Muchas chaperonas moleculares están
implicadas en el procedimiento de plegamiento de péptidos en su
conformación nativo mientras que otras chaperonas moleculares están
implicadas en el procedimiento de exportación o importación de la
célula de los péptidos. Las chaperonas moleculares especializadas
son "chaperonas periplásmicas", que son chaperonas moleculares
bacterianas que ejercen sus acciones principales en el "espacio
periplásmico" (el espacio entre la membrana bacteriana interior y
exterior). Las chaperonas periplásmicas están implicadas en el
procedimiento de corregir la unión de los pili intactos. Como se usa
en este documento, el término simple "chaperona" designa una
chaperona periplásmica molecular si no se indica otra cosa.
Cuando se usa la frase "un tipo de" se
quiere decir que la subunidad de pilus o la chaperona en cuestión es
de una especie distinta. Sin embargo, especialmente el hecho de que
haya una amplia homología entre las diferentes especies de
chaperonas periplásmicas moleculares hace probable que la
interferencia con un tipo de chaperona usando por ejemplo un
compuesto haga posible también el uso del compuesto en la
interferencia con otras chaperonas.
La frase "prevenir, inhibir o mejorar la unión
entre las subunidades de pilus y al menos una chaperona molecular en
las bacterias que forman pilus" indica que la interacción normal
entre una chaperona y su ligando nativo, es decir, la subunidad de
pilus, está afectada por estar completamente o sustancialmente
completamente prevenida, o por inhibirse o por expresarse de otra
manera, reducida a tal punto que la unión de las subunidades de
pilus a la chaperona es menos medible que en el caso en el que la
chaperona interactúa con la subunidad de pilus en condiciones
sustancialmente idénticas (con respecto al pH, concentración de
iones y otras moléculas) a las condiciones naturales en el espacio
periplásmico. De igual forma, la mejora de la unión entre la
chaperona y la subunidad de pilus debe ser tal que la unión de las
subunidades de pilus a la chaperona sea más medidle que en el caso
en el que la chaperona interactúa con la subunidad de pilus en
condiciones que son sustancialmente idénticas (con respecto a pH,
concentración de iones y otras moléculas) a las condiciones
naturales en el espacio periplásmico. La medición del grado de unión
puede determinarse in vitro mediante procedimientos conocidos
para el especialista en la técnica (microcalorimetría,
radioinmunoensayos, inmunoensayos basados en enzimas, etc.).
Debería estar claro, en función de lo explicado
anteriormente, que la prevención o inhibición de la interacción
normal entre una subunidad de pilus y una chaperona debería tener un
efecto sustancialmente limitante en el ensamblaje de pilus. Sin
embargo, también puede probarse que una mejora de la unión entre las
subunidades de pilus y las chaperonas es devastadora para una
bacteria. Como aparecerá a partir del ejemplo 2, diferentes
subunidades de pilus se unen a PapD con diferentes afinidades
y afectar a este sistema por poco equilibrado también puede provocar
una limitación en la velocidad y eficacia del ensamblaje de
pilus.
Se cree que incluso cambios leves en la unión
entre las subunidades de pilus y las chaperonas pueden tener un
impacto dramático en la eficacia del ensamblaje de pilus, y por
tanto en la capacidad de las bacterias para adherirse. Por ejemplo,
si el cambio en la unión entre una chaperona y una subunidad de
pilus es tal que el orden normal de afinidades entre las chaperonas
y las subunidades de pilus que se unen normalmente a ellas se
altera, entonces la unión normal del pilus debería alterarse, ya que
el orden de ensamblaje de pilus puede depender i.a. de las
afinidades entre las subunidades de pilus y la chaperona: Las
subunidades de pilus con más afinidades a la chaperona pueden
incorporarse antes de otras subunidades de pilus con menos
afinidades.
De esta manera, la prevención, inhibición o
mejora de la unión entre las subunidades de pilus y una chaperona
periplásmica molecular tienen un efecto de alteración del ensamblaje
de pilus, por lo que se reduce la infectividad del microorganismo
que expresa normalmente los pili.
La prevención, inhibición o mejora de la unión
entre las subunidades de pilus puede realizarse de diversas formas.
Un procedimiento preferido de acuerdo con la invención de
tratamiento y/o profilaxis de enfermedades provocadas por bacterias
que forman pilus que se adhiere a tejidos es administrar una
cantidad eficaz de una sustancia a un sujeto en necesidad de la
misma, siendo la sustancia capaz de interactuar con al menos un tipo
de chaperona molecular que se une a las subunidades de pilus durante
el transporte de estas subunidades de pilus a través del espacio
periplásmico y/o durante el procedimiento de ensamblaje de pilus
intacto, de tal manera que la unión de las subunidades de pilus a la
chaperona molecular se previene, inhibe o mejora.
La sustancia puede ser cualquier compuesto que
tenga uno o más de los efectos mencionados anteriormente en la
interacción entre chaperonas y subunidades de pilus y por lo tanto
sobre el ensamblaje de pilus. Las sustancias especialmente
interesantes son las que es probable que interactúen con la parte de
la chaperona que se une a la subunidad de pilus, aunque la
interacción con otros sitios en las chaperonas también puede
provocar la prevención, inhibición o mejora de la unión entre las
subunidades de pilus y la chaperona. Esto puede tener un efecto de
bloqueo estérico directo de la unión normal entre la subunidad y la
chaperona, pero también puede tener un efecto de cambio
conformacional en la chaperona. Más adelante se describe un
procedimiento para identificar sustancias para usar en el
procedimiento de la invención.
La interacción entre la sustancia y la chaperona
puede ser una unión covalente así como una unión no covalente a la
chaperona por parte de la sustancia.
Por el término "sujeto en necesidad del
mismo" se entiende, en el presente contexto, un sujeto, que puede
ser cualquier animal, incluyendo un ser humano, que está infectado
con, o que es probable que esté infectado con, bacterias que forman
pilus que se adhieren a tejidos que se cree que son patogénicas.
Por la expresión "una cantidad eficaz" se
entiende una cantidad de la sustancia en cuestión que tendrá en la
mayoría de los pacientes el efecto de curar la enfermedad provocada
por bacterias patogénicas o, si la sustancia se ha dado
profilácticamente, el efecto de prevenir la manifestación de la
enfermedad. La expresión "una cantidad eficaz" también implica
que la sustancia se da en una cantidad que sólo provoca efectos
leves o no adversos en el sujeto al que se administra, o que los
efectos adversos pueden tolerarse desde un punto de vista médico y
farmacéutico en vista de la gravedad de la enfermedad para la que se
ha suministrado la sustancia.
La vía de administración de la sustancia podría
ser cualquier vía de administración convencional, es decir, oral,
intravenosa, intramuscular, intradérmica, subcutánea, etc. Se
prefiere la vía oral.
Se espera que la dosificación de tal sustancia
sea la dosificación que se emplea normalmente cuando se administran
fármacos antibacterianos a pacientes o animales, es decir, 1
\mug-1000 \mug por kilogramo de peso corporal al
día. La dosificación dependerá parcialmente de la vía de
administración de la sustancia. Si se emplea la vía oral, la
absorción de la sustancia será un factor importante. Una absorción
lenta supondrá que el tracto gastro-intestinal serán
necesarias concentraciones más altas, y por tanto serán
dosificaciones más altas. Además, la dosificación de tal sustancia
cuando se tratan infecciones del sistema nervioso central (SNC)
dependerá de la permeabilidad de la barrera hematoencefálica para la
sustancia. Como se bien se sabe en el tratamiento de la meningitis
bacteriana con penicilina, son necesarias dosificaciones muy altas
con el fin de obtener concentraciones eficaces en el SNC.
Se entenderá que la dosificación apropiada de la
sustancia deberá evaluarse adecuadamente realizando ensayos en
modelos animales, donde el nivel de dosis eficaz (por ejemplo,
DE_{50}) y el nivel de dosis tóxica (por ejemplo, DT_{50}) así
como el nivel de dosis letal (por ejemplo, DL_{50} o DL_{10}) se
establecen en modelos animales adecuados y aceptables. Además, si se
ha probado que una sustancia es eficaz en tales modelos animales,
deberán realizarse ensayos clínicos controlados. Es innecesario
establecer que tales ensayos clínicos deberán realizarse de acuerdo
con los patrones de la Práctica Clínica Adecuada.
Aunque la vía preferida de prevención, inhibición
o mejora de la unión entre las subunidades de pilus y las chaperonas
es administrar una sustancia con los efectos mencionados
anteriormente en la chaperona, también son posibles otras vías. Por
ejemplo, las sustancias que interactúan con un tipo de subunidad de
pilus también podrían tener los efectos descritos anteriormente, y
por las mismas razones. Sin embargo, como es probable que la
interacción con la chaperona ejerza efectos en la unión en el pilus
de la mayor parte, si no de todas, las subunidades de pilus que
constituyen el pilus intacto, se espera que la interacción con la
chaperona sea lo más eficaz en términos de dificultar la
infectividad bacteriana.
Como será obvio a partir de los ejemplos
mostrados más adelante, la mayor parte de los datos sobre la unión
entre las chaperonas y las subunidades de pilus se han obtenido
estudiando la interacción entre la chaperona PapD de E.
coli. Sin embargo, como se ha descubierto que muchas bacterias
que se adhieren a tejidos expresan los pili que comparten homologías
sustanciales en su parte C-terminal, y como se ha
demostrado las homologías sustanciales entre las diversas chaperonas
periplásmicas que se habían aislado hasta ahora (véase la tabla),
está justificado asumir que alguna sustancias y clases de sustancias
serán capaces de interactuar con la mayor parte de las chaperonas
periplásmicas existentes y de esta manera ser útiles en el
tratamiento y/o profilaxis de enfermedades provocadas por las
bacterias que esconden estas chaperonas cuando la sustancia se
administra al paciente infectado con las bacterias.
De esta manera, la sustancia de la invención para
uso en el tratamiento y/o profilaxis se desea especialmente en
pacientes que están infectados por bacterias seleccionadas entre el
grupo compuesto por Haemophilus spp, Helicobacter spp,
Pseudomonas aeruginosa, Mycoplasma spp y todos los miembros de
la familia Enterobacteriacieae, incluyendo Escherichia
spp, Salmonella spp, Bordetella spp, Yersinia spp, Proteus spp
y Klebsiella spp. A este respecto, especialmente las
bacterias seleccionadas entre el grupo compuesto por E. coli, Y.
pestis, Y. enterocolitica, B. pertussis, K. pneumoniae, S.
typhimurium, S. typhi, S. paratyphii, Helicobacter pylori, Proteus
mirabilis y Haemophilus influenzae se consideran como
infectantes que provocan infecciones que pueden tratarse y/o
prevenirse mediante el uso del procedimiento de acuerdo con la
invención.
Por consiguiente, en aspectos importantes de la
invención, se previene, inhibe o mejora la unión de una subunidad de
pilus con una chaperona seleccionada entre el grupo compuesto por
PapD, FimC, SfaE, FaeE, FanE, Cs3-1, F17D, ClpE,
EcpD, Mrkb, FimB, SefB, HifB, MyfB, PsaB, PefD, YehC, MrpD, CssC,
NfaE, AggD y Caf1M. Se prefiere especialmente que esté
afectada la unión de PapD con al menos una subunidad de
pilus.
Como se ha indicado anteriormente, en una
realización preferida de la invención, la prevención, inhibición o
mejora de la unión se realiza por la interactuación con, en la
chaperona molecular, un sitio de unión que normalmente está
implicado en la unión a las subunidades de pilus durante el
transporte de estas subunidades de pilus a través del espacio
periplásmico y/o durante el procedimiento de la unión al pilus.
Como se ha mencionado, con relación a la presente
invención, se ha determinado el motivo de la unión entre PapD
y un péptido que constituye los 19 aminoácidos del extremo
C-terminal de PapG (G1'-19'),
una subunidad de pilus. Como se describe con detalle en este
documento, otras chaperonas comparten homologías sustanciales con
PapD en este sitio de unión. De esta manera, tal sitio de
unión es de gran interés como diana para fármacos que pretenden
interactuar con las chaperonas periplásmicas. Por lo tanto, en una
realización preferida de los procedimientos descritos anteriormente
de la invención, el sitio de unión que está afectado es uno que une
G1'-G19'.
El término "punto del sitio" se refiere a un
grupo químico con características físicas/químicas bien definidas
tales como el tamaño, carga, hidrofobicidad/hidrofilicidad,
polaridad, dirección de los enlaces hidrógeno así como una posición
tridimensional (distancia y ángulo) relativa a otro de tales grupos
químicos. De esta manera, los puntos del sitio que son
"sustancialmente idénticos" a Arg-8 y
Lys-112, son grupos químicos que comparten
sustancialmente las mismas características físicas/químicas bien
definidas de estos dos aminoácidos.
El término "residuos invariantes" se refiere
a residuos aminoácidos que pueden encontrarse en varias proteínas
sin que haya ninguna variación con respecto al tipo preciso del
aminoácido y sin que haya ninguna variación sustancial en su función
en las proteínas. La presencia de residuos invariantes en un gran
número de proteínas relacionadas normalmente es una indicación de la
importancia biológica de tales residuos, ya que las mutaciones que
carecen de residuos aparentemente carecen también de la función de
la proteína intacta. Como se ha descrito en este documento, se ha
descubierto que todas las chaperonas periplásmicas moleculares
comparten los residuos aminoácidos que son equivalentes a
Arg-8 y Lys-112. Por lo tanto, se
cree que estos dos residuos son de considerable importancia para las
bacterias que forman pilus.
"Un fragmento de polipéptidos capaz de
interactuar con una cadena \beta de la parte carboxilo terminal de
una subunidad de pilus" indica que parte de la chaperona (que
también es parte del sitio de unión) es capaz de interactuar con una
cadena \beta de la subunidad de pilus. Esta interacción sirve como
factor estabilizante en la unión entre la subunidad de pilus y la
chaperona y se considera una parte muy importante del motivo total
de la unión entre la chaperona y la subunidad del pilus. Además,
recientemente, se ha hecho verosímil por los inventores que la
cadena \beta sirve como plantilla para el correcto plegamiento de
la subunidad de pilus (véase el ejemplo 10).
Como se explica en este documento, la parte
C-terminal de muchas, si no de todas, las
subunidades de pilus conocidas, comparte homologías sustanciales,
que es otro indicio de la importancia de la estructura
tridimensional de la subunidad de pilus así como también de la
chaperona con el fin de que tenga lugar la unión y de que sea
estable.
Como se observa a partir de los ejemplos, se ha
identificado otro sitio de unión que reside en el dominio 2 de
PapD. Este sitio de unión interactúa con la proteína de
fusión MBP-G1'-140' así como con un
péptido corto compuesto por los residuos del aminoácido
C-terminal de 125' a 140' de PapG. De esta
manera, este sitio de unión es también de gran interés como diana
para los fármacos que pretenden interactuar con las chaperonas
periplásmicas. Por lo tanto, una realización preferida de los
procedimientos descritos anteriormente de la invención es un
procedimiento en el que el sitio de unión afectado es uno que une
cualquiera de los dos péptidos descritos anteriormente.
Se entenderá que las sustancias descritas
anteriormente para uso en el tratamiento y/o prevención de
enfermedades depende de la identificación o del diseño de
novo de sustancias que son capaces de ejercer los efectos que
conducirán a la prevención, inhibición o mejora de la interacción
entre las subunidades de pilus y las chaperonas periplásmicas
moleculares. También es importante que estas sustancias tengan una
gran oportunidad de ser terapéuticamente activas.
De esta manera, un aspecto de la invención se
refiere a un procedimiento para identificar una sustancia
potencialmente terapéuticamente útil capaz de interactuar con una
chaperona periplásmica molecular, que por lo tanto, previene, inhibe
o mejora la interacción entre una chaperona periplásmica molecular y
una subunidad de pilus, comprendiendo el procedimiento al menos una
de las siguientes etapas:
1) ensayar una sustancia candidata en un ensayo
en el que la posible prevención, inhibición o mejora mediante la
sustancia de la interacción entre la chaperona periplásmica
molecular y la subunidad de pilus se determine mediante
a) la adición de la sustancia a un sistema que
comprende la chaperona periplásmica molecular o un análogo de la
misma en una forma inmovilizada y la subunidad de pilus o un
equivalente de la misma en una forma solubilizada y la determinación
del cambio en la unión entre la subunidad de pilus o equivalente de
la misma y la chaperona periplásmica molecular o el análogo de la
misma provocado por la adición de la sustancia, o
b) la adición de la sustancia a un sistema que
comprende la subunidad de pilus o un equivalente de la misma en una
forma inmovilizada y la chaperona periplásmica molecular o un
análogo de la misma en una forma solubilizada y la determinación del
cambio en la unión entre la subunidad de pilus o el equivalente de
la misma y la chaperona periplásmica molecular o el análogo de la
misma provocado por la adición de la sustancia, o
c) la adición de la sustancia a un sistema que
comprende la subunidad de pilus o un equivalente de la misma así
como la chaperona periplásmica molecular o un análogo de la misma en
una forma solubilizada y la determinación del cambio en la unión
entre la subunidad de pilus o el equivalente de la misma y la
chaperona periplásmica molecular o el análogo de la misma provocada
por la adición de la sustancia, o
d) la adición de la sustancia a un sistema que
comprende la subunidad de pilus o un equivalente de la misma así
como la chaperona periplásmica molecular o un análogo de la misma en
forma solubilizada y la medición del cambio en la energía de unión
provocado por la adición de la sustancia, y la identificación de la
sustancia como potencialmente terapéuticamente útil si se observa un
cambio en la energía de unión entre la subunidad de pilus o el
equivalente de la misma y la chaperona periplásmica molecular o un
análogo de la misma,
e identificar la sustancia como potencial y
terapéuticamente útil si se observa un cambio significativo en la
unión o en la energía de la unión entre la subunidad de pilus o el
equivalente de la misma y la chaperona periplásmica molecular o el
análogo de la misma;
2) ensayar una sustancia candidata en un ensayo
en el que la posible prevención, inhibición o mejora de la
interacción entre la chaperona periplásmica molecular y la subunidad
de pilus se determine mediante
- la adición de la sustancia a un sistema que comprende bacterias vivas que forman pilus que se adhieren a tejidos seguido de la determinación de la velocidad de crecimiento de las bacterias, siendo indicativo de prevención, inhibición o mejora de la unión entre la chaperona periplásmica molecular y la subunidad de pilus una reducción en el crecimiento en comparación con un sistema correspondiente en el que la sustancia no se ha añadido, o
- la adición de la sustancia a un sistema que comprende bacterias que forman pilus que se adhieren adhesión a tejidos seguido de una determinación de la adhesión al tejido de las bacterias, siendo indicativo de prevención, inhibición o mejora de la unión entre la chaperona periplásmica molecular y la subunidad de pilus una reducción en la adhesión al tejido en comparación con un sistema correspondiente en el que no se ha añadido la sustancia,
e identificar la sustancia como potencialmente
terapéuticamente útil si se observa una reducción de la velocidad de
crecimiento o de adhesión al tejido después de la adición de la
sustancia; y
3) identificar si una sustancia es capaz de
interactuar in vivo con una chaperona periplásmica molecular
mediante el uso de una sustancia, donde dicha sustancia se ha
establecido in vitro para prevenir, inhibir o mejorar la
interacción entre una chaperona periplásmica molecular y una
subunidad de pilus, para la administración a un animal experimental,
donde las bacterias que forman pilus que se adhieren a tejidos del
animal se ha inoculado antes, a la vez o después de la
administración de la sustancia, para la identificación de si la
sustancia es capaz de prevenir y/o curar y/o aliviar la enfermedad
provocada por las bacterias.
Por la expresión "un equivalente de una
subunidad de pilus" se entiende un compuesto que se ha
establecido que se une a la chaperona de manera que es comparable
con la forma en la que se une la subunidad de pilus a la chaperona,
por ejemplo, mediante la demostración de la subunidad de pilus y el
equivalente que compite por la unión con la chaperona. Los
equivalentes preferidos de las subunidades de pilus son
G1'-19'WT,
MBP-G1'-140' y
G125'-140', que se describen con detalle en este
documento.
La expresión "un análogo de una chaperona"
indica cualquier sustancia que puede unirse a al menos una subunidad
de pilus de manera que corresponda con al unión de dicha chaperona a
una subunidad de pilus. Tal análogo de la chaperona puede ser una
forma truncada de la chaperona intacta (por ejemplo, uno de los dos
dominios de PapD) o puede ser una forma modificada de la
chaperona que puede, por ejemplo, acoplarse a una sonda, marcador u
otro residuo. Finalmente, el análogo de la chaperona puede ser un
sitio de unión aislado, pero parcialmente del sitio de unión
completamente funcional, de la chaperona o una sustancia sintética
que imite a tal sitio de unión.
La inmovilización mencionada anteriormente puede
ser una unión no covalente simple a una superficie de adhesión o una
molécula huésped o receptora tal como un anticuerpo, o una unión
covalente a una molécula espaciadora tal como un polímero o un
péptido.
En la etapa 1a) mencionada anteriormente, la
subunidad de pilus o el equivalente de la misma que se une a la
chaperona periplásmica molecular o a un análogo de la misma puede
detectarse de diversas formas, por ejemplo marcando la subunidad de
pilus o el equivalente de la misma, o por medio de un ligando
marcado (tal como un anticuerpo) capaz de reaccionar con la
subunidad de pilus o el equivalente de la misma, o por medio de una
determinación basada en el índice refractivo de la extensión de la
unión, tal como el ensayo Pharmacia BioCore®.
Por consiguiente, en la etapa 1b) la chaperona
periplásmica molecular o el análogo de la misma que se une a la
subunidad de pilus o al equivalente de la misma puede detectarse
marcando la chaperona periplásmica molecular o el análogo de la
misma, por medio de un ligando marcado (por ejemplo anticuerpo)
capaz de reaccionar con la chaperona periplásmica molecular o el
análogo de la misma, o por medio de una determinación basada en el
índice refractivo de la extensión de la unión, tal como el ensayo
Pharmacia BiaCore®.
En la etapa 1c) la chaperona periplásmica
molecular o el análogo de la misma que se une a la subunidad de
pilus o al equivalente de la misma puede detectarse por la
separación de los complejos subunidad de pilus/chaperona (por
ejemplo, por ultracentrifugación/ultrafiltración, cromatografía
líquida, tal como cromatografía por oclusión del tamaño, o
electroforesis). A continuación se describe un procedimiento que
depende de los cambios en la fluorescencia de un fragmento corto de
PapG cuando este fragmento se une a PapD. Este
procedimiento es un ensayo preferido en el procedimiento de la
invención.
La determinación de la energía de unión en la
etapa 1c) se realiza preferiblemente en un sistema
microcalorimétrico usando la técnica bien conocida de
microcalorimetría.
Las etapas indicadas anteriormente sirven para 3
propósitos. Los tipos de ensayo de la etapa 1) pretenden arrojar luz
sobre la capacidad de la sustancia candidata de interactuar con la
chaperona. En los ejemplos en los que se usan sustancias, chaperonas
o anticuerpos marcados, el marcador podría ser un marcador
radiactivo, un marcador fluorescente o un marcador que absorba la
luz, una enzima tal como peroxidasa de rábano picante, un ligando
tal como biotina o cualquier otro sistema de marcación convencional
conocido para un especialista en la técnica. La detección del
compuesto marcado depende de la elección del marcador: la
radiactividad puede medirse en un contador de escintilación líquida,
un contador gamma, o cualquier otro sistema de detección conveniente
para la radiactividad, los marcadores enzimáticos se detectan por la
presencia o ausencia de un sustrato específico para la enzima
(ensayo de densidad óptica, reactividad química del sustrato
restante o del producto, etc.), los marcadores fluorescentes pueden
detectarse por microscopía de fluorescencia o por la simple medición
de la emisión de fluorescencia, los marcadores que absorben la luz
pueden detectarse mediante la medición de la absorción de la luz de
una longitud de onda característica y la biotina puede detectarse
por su unión a estreptavidina.
La separación de los altos complejos moleculares
por ultracentrifugación o ultrafiltración en 1) puede detectarse
mediante uno de los componentes del complejo que se marca como se ha
descrito anteriormente; de esta manera, es posible detectar la
relación entre la subunidad/equivalente del pilus no unido y unida,
pero la etapa de detección también puede depender de la unión de los
anticuerpos a uno de los componentes del complejo, y la posterior
detección de este anticuerpo. Puede emplearse cualquier técnica
cromatográfica convencional (HPLC, FPLC, exclusión del tamaño,
etc.). La separación por electroforesis puede realizarse por ejemplo
por electroforesis capilar.
Todos los ensayos de la etapa 2) están
relacionados con los efectos de la sustancia candidata en la
actividad bacteriana in vitro. La demostración de una
reducción en la velocidad de crecimiento de las bacterias o una
demostración de la menor adherencia a las células o a superficies
sintéticas en un ensayo no podrá contribuir únicamente, por
supuesto, al efecto de la interacción con las chaperonas, sino que
una demostración de este tipo podría proporcionar una buena
estimación de la gran utilidad terapéutica de tal sustancia.
La determinación de la velocidad de crecimiento
puede realizarse contando las colonias en placas de ágar sólidas
destiladas con las bacterias, contando la densidad bacteriana en el
medio de crecimiento líquido (determinación de DO_{600}), midiendo
la fluorescencia de sustancias tales como NAD(P)H, ATP
o aminoácidos, que están contenidos únicamente en células
bacterianas, o mediante cualquier otro sistema de detección
conveniente conocido para un especialista en la técnica. La
determinación de la adherencia de las bacterias puede realizarse de
una forma similar después de que se hayan aislado las bacterias de
adhesión. Una determinación de la adherencia se realiza
preferiblemente midiendo la capacidad de las bacterias para
aglutinar glóbulos rojos o perlas de látex recubiertas con receptor,
midiendo la adhesión bacteriana a las placas de microtitulación
recubiertas con receptor, o midiendo la adhesión bacteriana a otras
superficies sintéticas.
En una realización preferida del procedimiento
descrito anteriormente, las bacterias vivas que forman pilus que se
adhieren a tejidos son de una cepa deficiente de proteasa, siendo la
proteasa una que al menos es parcialmente responsable de la
degradación de las subunidades de pilus. Un tipo de cepa
especialmente preferido es la cepa degP41 de E. coli.
Como se describe en este documento, la cepa degP41 carece de
la actividad de la proteasa DegP que es responsable de la
degradación de las subunidades de pilus en la E. coli cuando
éstas no se recuperan en el espacio periplásmico por PapD, y
de esta manera, las cepas degP41 son especialmente sensibles
a los cambios en la eficacia de papD, ya que la acumulación
de las subunidades de pilus es tóxica para la célula. Se cree que
existen proteasas equivalentes en otras bacterias que expresan
pilus.
El estudio animal en la etapa 3) se realiza con
el fin de demostrar la gran utilidad terapéutica de la sustancia
candidata in vivo. Además, como ya se ha mencionado
anteriormente, tales estudios animales también deben establecer unos
valores a priori con respecto a la dosificación eficaz y a la
toxicidad antes de que la sustancia candidata se ensaye finalmente
en seres humanos en ensayos clínicos controlados. Los estudios con
animales también deben proporcionar información con respecto a la
formulación conveniente de la sustancia en una preparación
farmacéutica así como a la vía preferida de administración, ya que
es posible obtener, a partir del modelo animal, datos para la
absorción de la sustancia así como datos para el metabolismo y
excreción de la sustancia. El animal experimental es preferiblemente
un ratón, una rata, un gato, un perro, un mono, un caballo, una
cabra, un cerdo o un pollo.
La expresión "adecuadamente capaz de
interactuar con una chaperona molecular" pretende indicar que una
sustancia, aparte de ser capaz de interactuar con una chaperona
molecular, también es capaz de ejercer efectos en un sistema in
vivo, es decir, que la sustancia además de su capacidad de unión
también muestra una compatibilidad con un sistema biológico, i.a.
un paciente.
Aunque los estudios in vivo indicados
anteriormente, especialmente los experimentos en modelos animales,
son los mejores indicadores de la gran utilidad terapéutica de una
sustancia en la prevención, inhibición o mejora de la unión entre
una chaperona y una subunidad de pilus, no debería olvidarse que los
ensayos in vitro indicados anteriormente sirven como
indicaciones importantes cuando se desarrollan compuestos con un
potencial terapéutico. Si se confía sólo en los ensayos in
vivo, es muy probable que los compuestos que de hecho muestran
el efecto deseado sobre la interacción chaperona/subunidad de pilus
sean seleccionados por ensayos in vivo, ya que estos
compuestos podrían carecer por ejemplo de la capacidad de penetrar
las membranas biológicas. Cuando se usan los ensayos in vivo,
se mantiene una oportunidad mucho mayor de encontrar un compuesto de
indicación.
La evaluación del efecto de una sustancia
ensayada en los ensayos in vitro descritos en este documento
(véanse a este respecto especialmente los ejemplos) depende de
varios factores. Se entenderá por parte del especialista en la
técnica que puede añadirse una pequeña molécula en concentraciones
molares más altas con el fin de ejercer un efecto sobre la
interacción chaperona/subunidad de pilus (e incluso entonces la
pequeña molécula puede seguir siendo un interesante compuesto de
indicación), al tiempo que las moléculas más grandes pueden ejercer
efectos marcados incluso en concentraciones molares bajas. En
general, cuando cualquier ensayo in vitro descrito en este
documento se considera que tiene un resultado positivo cuando se
ensaya una sustancia candidata (es decir, que la sustancia ensayada
muestra un efecto "significativo"), deberá considerarse la
siguiente condición: El compuesto deberá ejercer un efecto
significativo en la interacción subunidad de pilus/chaperona (o
sobre una interacción en un sistema equivalente que se correlacione
bien con la interacción subunidad de pilus/chaperona), siendo el
efecto significativo tal que no pueda atribuirse ninguna duda a la
interacción entre la sustancia y la chaperona y que no sea una
interacción inespecífica entre la chaperona y la sustancia (debido
a, por ejemplo, cambios radicales en el medio físico y químico
cuando se añade la sustancia). Una manera de excluir las
interacciones inespecíficas como razón para el efecto ejercido es
usar al menos un control que es una sustancia químicamente
comparable (con respecto a la masa molecular, carga/polaridad y
conformación del grosor tridimensional (globular, fibrilar, etc.).
Si el control no da como resultado sustancialmente el mismo efecto
en el ensayo que la sustancia, puede concluirse que la sustancia
debería considerarse como una sustancia positiva para ensayo.
Los ensayos descritos en los ejemplos son todos
buenos ejemplos de tipos de ensayo, que podrían servir como sistema
de ensayo en el procedimiento de la invención descrito
anteriormente. Sin embargo, se prefiere que en la etapa 1c) se use
el procedimiento descrito en el ejemplo 10 que emplea una variante
marcada fluorescente de una subunidad de pilus. Este ensayo puede
describirse brevemente como se indica a continuación:
- añadir la sustancia a un primer sistema que
comprende la chaperona periplásmica molecular o un análogo de la
misma,
- posteriormente, añadir una subunidad de pilus o
un equivalente de la misma que se ha marcado con una sonda
fluorescente medioambientalmente sensible,
- determinar la emisión de fluorescencia a una
longitud de onda particular que indica la cantidad de unión entre la
chaperona periplásmica molecular o el análogo de la misma y la
subunidad de pilus o el equivalente de la misma, y
- comparar la emisión de fluorescencia
determinada con la emisión de fluorescencia determinada en un
segundo sistema correspondiente que contiene sustancialmente las
mismas concentraciones de la chaperona molecular o del análogo de la
misma y la subunidad de pilus o el equivalente de la misma pero
sustancialmente sin sustancia,
una diferencia significativa en la emisión de
fluorescencia entre el primer y el segundo sistema que indica la
interacción entre la chaperona periplásmica molecular o el análogo
de la misma y la sustancia.
La ventaja de este ensayo es que puede emplearse
para determinaciones cuantitativas del efecto de la sustancia
ensayada en el sistema chaperona/subunidad de pilus. Usando este
ensayo, los inventores han determinado por ejemplo la constante de
unión entre un análogo de PapG y PapD. Las
determinaciones cuantitativas pueden realizarse realizando la
determinación de la emisión de fluorescencia en el segundo sistema
muchas veces a relaciones molares variantes entre la subunidad de
pilus o el equivalente de la misma y la chaperona periplásmica y el
equivalente de la misma, con lo cual la constante de unión entre la
subunidad de pilus o el equivalente de la misma y la chaperona
periplásmica molecular o el análogo de la misma se valora a partir
de los datos de emisión de fluorescencia determinados. A partir de
los datos obtenidos de esta manera también es posible determinar la
constante de unión de la sustancia de manera paralela, lo que se
verá a partir de la reivindicación 11.
Se entenderá que el procedimiento indicado
anteriormente para identificar una sustancia potencial y
terapéuticamente útil depende de la presencia real de la sustancia.
Normalmente, es necesario purificar o sintetizar la sustancia
candidata antes de que se someta al procedimiento mencionado
anteriormente. Sin embargo, como es probable que muchas de tales
sustancias candidatas se ensayen antes de que se identifique una
sustancia que puede, de forma adecuada, interactuar con una
chaperona, es de interés identificar tales sustancias antes de que
se sometan al procedimiento anterior, disminuyendo por lo tanto las
fuentes agotadas en las etapas de purificación y/o síntesis.
Por lo tanto, la invención también se refiere a
un procedimiento para identificar y/o diseñar una sustancia, X,
capaz de interactuar con una chaperona, por ejemplo de unirse a la
chaperona, con una energía de unión pronosticada igual a o mejor que
un valor umbral predeterminado, donde el procedimiento comprende
1) seleccionar una sustancia, A, que podría
interactuar en gran medida con un sitio en la chaperona, y
proporcionar una representación estructural tridimensional de la
misma,
2) predecir la energía libre de unión entre la
sustancia A y el sitio en la chaperona,
3) si la energía de unión pronosticada entre la
sustancia A y el sitio en la chaperona es igual a o mejor que el
valor umbral predeterminado, entonces identificar la sustancia A
como la sustancia X,
4) si la energía libre de unión pronosticada
entre la sustancia A y el sitio en la chaperona no es igual a o
mejor que el valor umbral predeterminado, entonces modificar la
representación estructural tridimensional, entonces modificar la
representación estructural tridimensional y predecir la energía
libre de unión entre la sustancia modificada de esta manera, B, y el
sitio en la chaperona, y
5) repetir la etapa 4 hasta que la energía libre
de unión pronosticada determinada entre la sustancia resultante, X,
y el sitio en la chaperona sea igual a o mejor que el valor umbral
predeterminado.
Es posible ampliar el procedimiento mencionado
anteriormente con dos etapas más, donde se determina la energía
libre de unión exacta, con el fin de establecer que la energía libre
de unión experimental también es mejor que el valor umbral
predeterminado. Realizando las siguientes dos etapas
6) proporcionar una muestra de la sustancia
química X y una muestra de la chaperona y medir la energía libre de
unión entre la sustancia química X y la chaperona (por ejemplo, por
microcalorimetría como se ha mencionado anteriormente), y establecer
que la energía libre de unión medida entre la sustancia química X y
la chaperona es igual a o mejor que el valor umbral predeterminado,
y opcionalmente
7) someter la sustancia X al procedimiento
mencionado anteriormente para identificar una sustancia que puede,
de forma adecuada, interactuar con una chaperona, con el fin de
verificar que la sustancia X es una sustancia potencial y
terapéuticamente útil capaz de interactuar con una chaperona, de
esta manera se verifica que la energía libre de unión entre la
sustancia candidata y la chaperona realmente es mejor que el valor
umbral predeterminado. La etapa 7) además establece que la sustancia
candidata tiene muchas oportunidades de ser terapéuticamente
útil.
La frase "predecir la energía libre de
unión" pretende implicar que la energía libre de unión se
determina calculando en lugar de realizando el tratamiento
experimental que determina la energía libre de unión real. Una
manera (teórica) de predecir la energía libre de unión es realizar
cálculos de perturbación de la energía libre (FEP) sobre las
sustancias que interactúan, pero a causa de la gran cantidad de
cálculos que esta aproximación conllevaría como resultado, se
prefiere emplear el procedimiento aproximativo empírico descrito más
adelante.
El término "mejor que" pretende significar
que la energía libre de unión tiene un valor que es superior a de la
energía libre de unión que se ha elegido como valor umbral, lo que
significa que \DeltaG es numéricamente mayor que el valor umbral
seleccionado. O en otras palabras: El término pretende significar
que la unión entre la sustancia y la chaperona es energéticamente
más favorable que la situación en la que la sustancia y la chaperona
se suspenden independientemente en solución.
Con el fin de predecir la energía de unión en el
procedimiento indicado anteriormente, de acuerdo con la invención se
prefiere especialmente usar el siguiente procedimiento:
Valorar la diferencia de la energía media,
<\DeltaV^{el}_{X-s}>, definida como
<V^{el}_{X-s}>_{B} -
<V^{el}_{X-s}>_{A}, entre la
contribución de las interacciones polares a la energía potencial,
entre la sustancia química X y la que la rodea (denominada S) en dos
estados, un estado (A) en donde la sustancia química está rodea por
el disolvente y el otro estado (B) en donde la sustancia química,
unida a una chaperona periplásmica molecular o a un análogo de la
misma, está rodea por el disolvente,
ensayar la diferencia de la energía media,
<\DeltaV^{vdw}_{X-s}> definida como
<\DeltaV^{vdw}_{X-s}>_{B} -
<\DeltaV^{vdw}_{X-s}>_{A}, entre la
contribución de las interacciones no polares a la energía potencial
entre la sustancia química X y la que la rodea (denominada S) en
dos estados, un estado (A) en donde la sustancia química está rodea
por el disolvente y el otro estado (B) en donde la sustancia
química, unida a una chaperona periplásmica molecular o a un
análogo de la misma, está rodea por el disolvente, y
calcular la energía libre de unión absoluta como
combinación ajustada de las dos diferencias de la energía media
mencionadas anteriormente.
En las ecuaciones matemáticas que se muestran en
este documento, el símbolo < > significa media dinámica
molecular. El índice X-s significa
compuesto-disolvente (o
compuesto-agente que rodea), la letra "X"
indica la sustancia química X. Normalmente, la sustancia X
funcionará como inhibidor de la unión entre la chaperona
periplásmica y las subunidades de pilus, pero como se ha analizado
en este documento, también existe la posibilidad de que el compuesto
o fármaco afecte a la chaperona de tal forma que se mejore la unión
entre las subunidades de pilus y la chaperona. El superíndice
"el" indica la energía polar o electrostática, mientras que el
superíndice "vdw" indica "van der Waals", otra
denominación para las interacciones no polares. El símbolo \Delta
indica que la cantidad en el estado A se resta de la cantidad en el
estado B.
En el presente contexto, por la frase "un
análogo de una chaperona periplásmica molecular" deberá
entenderse, en un sentido amplio, cualquier sustancia que imite (con
respecto a las características de unión) a una parte interesante de
una chaperona periplásmica molecular (por ejemplo, la parte o las
partes que se unen a la subunidad de pilus) y cuya interacción con
una sustancia química o un grupo o varias sustancias químicas, por
ejemplo candidatos a fármacos, se va a estudiar. De esta manera, el
análogo puede ser simplemente cualquier otro compuesto químico
considerado capaz de interactuar con la sustancia química de manera
que imite la unión entre la chaperona y una subunidad de pilus in
vivo, pero de forma más frecuente el análogo será una molécula
relativamente grande, en otras palabras una macromolécula tal como
una proteína o un oligonucleótido, que es relativamente grande en
comparación con la sustancia química; aunque la sustancia química
que interactúa con el análogo, en sí misma es, por supuesto, una
macromolécula. En el presente contexto, la chaperona periplásmica
molecular o análogo de la misma es preferiblemente la chaperona
periplásmica o un análogo de la misma que muestra al menos una
característica de unión interesante relevante para la unión de los
pili.
La base del enfoque indicado anteriormente para
determinar la energía libre de unión se explica a continuación:
Como punto de partida se toma la aproximación de
la respuesta lineal para fuerzas electrostáticas que, como
resultado, para soluciones polares produce funciones cuadráticas de
energía libre en respuesta al desarrollo de las cargas. Esto es, por
ejemplo, el resultado común de la teoría de Marcus de reacciones de
transferencia de electrones (Marcus, 1964). Para un sistema con dos
estados, A y B, dados por dos funciones de energía potencial V_{A}
y V_{B} uno obtiene la relación en la aproximación de las
funciones armónicas de energía libre de igual curvatura (véase Lee y
col., 1992 y las referencias en ese documento):
(a)\lambda =
<V_{B} - V_{A}>_{A} - \Delta G_{AB} = <V_{A} -
V_{B}>_{B} + \Delta
G_{AB}
donde \DeltaG_{AB} es la
diferencia de energía libre entre B y A, \lambda es la energía de
reorganización correspondiente y < >_{I} indica una media
evaluada cerca del mínimo del potencial i. De esta
manera,
(b)\Delta
G_{AB} \cong \ ^{1}/_{2} (<\Delta V>_{A} + <\Delta
V>_{B})
donde \DeltaV ahora indica la
diferencia de energía V_{B} - V_{A}. Si se considera la
hidración de un único ión, esto puede mostrarse para dar
\DeltaG^{el}_{sol} = ½
<V^{el}_{X-s}>, es decir, que la
contribución electrostática a la energía de solvatación es igual a
la mitad de la energía de interacción del
ión-disolvente correspondiente (Warshel y Russell,
1984; Roux y col., 1990). Volviendo ahora al problema de la unión,
este resultado puede interpretarse de la siguiente manera: Para cada
procedimiento de solvatación, es decir, solvatación de la sustancia
en agua y dentro de la proteína, se consideran dos estados en los
que el primero tiene la sustancia al vacío y una cavidad no polar
(dada, por ejemplo, por el potencial de
Lennard-Jones) ya fabricada en el medio dado. El
segundo estado se corresponde con la sustancia intacta rodeada por
agua o la proteína solvatada. Después, la aproximación de la
respuesta lineal volverá a dar que \DeltaG^{el}_{unión}
\cong ½ <V^{el}_{X-s}>, donde
V^{el}_{X-s} es el término electrostático del
soluto-disolvente. Por tanto, la contribución
electrostática a la energía libre de unión puede aproximarse
mediante \DeltaG^{el}_{unión} \cong ½
V^{el}_{X-s}> (donde \Delta ahora se
refiere a la diferencia entre la proteína y el agua) y de esta
manera puede obtenerse a partir de dos simulaciones MD de la
sustancia solvatada y del complejo
sustancia-proteína.
Se ha confirmado la validez de los resultados de
respuesta lineal en el caso de la solvatación iónica, por ejemplo en
el estudio de Roux y col. (1990). También se realizaron más cálculos
sobre sistemas simples que corroboran la aproximación de la ecuación
b. Estos ensayos se realizaron comparando la energía libre obtenida
de las simulaciones FEP/MD de cargar iones Na^{+} y Ca^{2+} en
un sistema de agua esférico (Aqvist, 1990) con el correspondiente
<V^{el}_{X-s}> a partir de trayectorias MD
de 75 ps. Esto produjo factores que relacionaban
<V^{el}_{X-s}> con
\DeltaG^{el}_{sol} de 0,49 para Na^{+} y 0,52 para
Ca^{2+}, siendo ambos valores afines al resultado pronosticados de
½. Un ensayo similar sobre la carga de una molécula de metanol, dado
para el potencial OPLS (Jorgensen, 1986) en agua dio una relación
\DeltaG^{el}_{sol}/<V^{el}_{X-s}> de
0,43.
Una cuestión crucial es cómo cuantificar la
contribución de las interacciones no polares y de los efectos
hidrófobos a la energía libre de unión que se denominó
\DeltaG^{vdw}_{unión}. En el caso ideal, debería ser posible
estimar esta contribución a partir de energías de interacción no
polares (o van der Waals). Las teorías sobre líquidos de Chandler y
colaboradores (Chandler y col., 1983; Pratt y Chandler, 1997) se han
usado satisfactoriamente para analizar los efectos hidrófobos y para
calcular las energías libres de transferencia para algunas moléculas
no polares (Pratt y Chandler, 1977), pero no parece posible el
tratamiento analítico de ese tipo para la solvatación en un medio no
homogéneo tal como un sitio activo de una proteína. Sin embargo, se
ha observado que la energía libre experimental de la solvatación
para diversos compuestos de hidrocarburos, tales como
n-alcanos, depende aproximadamente linealmente de la longitud
de ambas cadena de carbono en sus propios líquidos así como en agua
(Ben-Naim y Marcus, 1984). Se han realizado
simulaciones MD de n-alcanos solvatados en agua y en van der
Waals no polar, lo que indica que también las energías de
interacción medias soluto-disolvente varían
aproximadamente linealmente con el número de carbonos en la cadena
(siendo las relaciones diferentes en disolventes diferentes, por
supuesto). De esta manera, parece posible que una aproximación
lineal sencilla de \DeltaG^{vdw}_{unión} a partir de
<\DeltaV^{vdw}_{X-s}> pueda ser capaz de
justificar la contribución de unión no polar. Por ejemplo, si
\sigma se considera una medición apropiada del tamaño del soluto
y si las energías de interacción van der Waals
soluto-disolvente y las correspondientes
contribuciones de energía libre no polar (ambas en agua y proteína)
dependen linealmente de \sigma, de tal forma que
<V^{vdw}{}_{p}> = \alpha
_{p}\sigma , <V^{vdw}{}_{w}> = \sigma _{w}\sigma , \Delta
G^{vdw}{}_{p} = \beta _{p}\sigma y \Delta G^{vdw}{}_{w} = \beta
_{w}\sigma
entonces se obtiene
3 Ya que parece difícil derivar un factor que
relacione las dos cantidades de una manera fiable a partir de
consideraciones puramente teóricas, el enfoque se toma para intentar
determinar empíricamente tal relación que es capaz de producir los
datos de unión experimentales. De esta manera, la energía libre de
unión se aproxima en una realización de la invención
mediante
(1)\Delta
G_{unión} = \ ^{1}/_{2} <\Delta
V^{el}{}_{X-s}> + \alpha <\Delta
V^{vdw}{}_{X-s}>
determinándose el parámetro
\alpha por calibración
empírica.
Aunque, como se ha analizado anteriormente, una
predicción teórica del coeficiente para
<\DeltaV^{el}_{X-s}> es ½, también puede
ser prácticamente útil tratar este coeficiente como un parámetro
empírico. Esto conduciría a que la energía libre de unión se
aproximase mediante
(1b)\Delta
G_{unión} = \beta <\Delta V^{el}{}_{X-s}> +
\alpha <\Delta
V^{vdw}{}_{X-s}>
donde ambos parámetros, \alpha y
\beta, se determinan por calibración
empírica.
Finalmente, en algunos casos, parece adecuado
añadir un término constante más a la Ecuación 1, para que la
ecuación se convierta en
(2)\Delta
G_{unión} = \ ^{1}/_{2} <\Delta
V^{el}{}_{X-s}> + \alpha <\Delta
V^{vdw}{}_{X-s}> +
c
donde c es una constante que
refleja la extrapolación a tamaño cero de la sustancia química, esto
es, donde la regresión lineal se compensa claramente desde el origen
cuando se mueve hacia el tamaño cero de la sustancia química. El
parámetro c también puede usarse para corregir posibles errores
sistemáticos debidos a, por ejemplo, la negligencia de la
polarización inducida, posibles deficiencias en el campo de fuerza,
etc. En estos casos, c asumirá normalmente un valor entre -10 y 10
kcal/mol, típicamente entre -3 y 3 kcal/mol, de tal forma que esté
entre -2 y 2 kcal/mol, por ejemplo entre -1 y 1 kcal/mol. Sin
embargo, se anticipa que en muchos casos, c puede establecerse
adecuadamente a cero, ya que el alcance de la derivación será de
menor importancia para la utilidad de los valores
pronosticados.
Si el coeficiente electrostático i también se
trata como un parámetro empírico, la aproximación de la energía
libre de unión asume su forma más general, denominada
(2b)\Delta
G_{unión} = \beta <\Delta V^{el}{}_{X-s}> +
\alpha <\Delta V^{vdw}{}_{X-s}> +
c
donde ahora \alpha, \beta y c
se determinan por calibración
empírica.
Aunque el disolvente usado en el procedimiento
anterior es adecuadamente y más normalmente un disolvente acuoso tal
como agua, está dentro del alcance de la invención tomar cualquier
otro disolvente adecuado como punto de partida, incluyendo, por
ejemplo, metanol, etanol, acetona, acetonitrilo, cloroformo, hexano,
etc., o mezclas de los mismos o combinaciones de tales disolventes o
mezclas de los mismos con agua. La selección del disolvente será de
poca importancia para los valores pronosticados siempre que el
disolvente sea capaz de disolver o solvatar la molécula receptora y
la sustancia (en el presente contexto esto significa que una
cantidad suficiente de la chaperona periplásmica molecular o el
análogo de la misma puede mezclarse homogéneamente con el disolvente
sin precipitación para permitir la determinación de las energías de
unión mediante algún procedimiento adecuado), pero puede haber casos
en los que sea ventajoso modificar el medio disolvente (por ejemplo,
modulando la fuerza iónica) donde tendrá lugar la interacción de la
sustancia y la molécula receptora. Si el medio en el que va a tener
lugar la interacción entre la sustancia química, tal como un
fármaco, y una chaperona periplásmica molecular o un análogo de la
misma en el uso real del fármaco es el cuerpo humano, debería ser
particularmente adecuado imitar por ejemplo el plasma humano como
disolvente.
En la Solicitud de Patente Internacional Nº
PCT/IB94/00257 y en Aqvist y col., 1994 puede encontrase un análisis
minucioso del procedimiento indicado anteriormente para determinar
la energía libre de unión entre dos moléculas. Estos dos documentos
se incorporan en este documento por referencia.
El procedimiento indicado anteriormente para
determinar la energía libre de unión se ha empleado en el ejemplo 3
con el fin de identificar compuestos que tienen una elevada
probabilidad de unirse al sitio de unión de PapD; esto
significa que los cálculos como los descritos anteriormente se han
realizado como la última etapa teórica antes de que los compuestos
se hayan sintetizado realmente.
Se entenderá que los procedimientos mencionados
anteriormente para identificar sustancias capaces de interactuar con
chaperonas probarán ser especialmente eficaces en la identificación
de sustancias que son de gran valor farmacéutico si se sabe que el
sitio al que se unen está implicado en el ensamblaje de pilus.
Por lo tanto, se prefiere que el sitio con el que
puede interactuar potencialmente la sustancia, y del que se
pronostica la energía libre de unión, sea la parte de unión a la
subunidad de pilus de una chaperona molecular, tal como el sitio de
unión a la subunidad de pilus de una chaperona molecular
seleccionada entre el grupo compuesto por PapD, FimC, SfaE, FaeE,
FanE, Cs3-27, F17D, ClpE, EcpD, Mrkb, FimB, SefB,
HifB, MyfB, PsaB, PefD, YehC, MrpD, CssC, NfaE, AggD y
Caf1M, o un análogo de tal sitio de unión a la subunidad de
pilus, ya que los sitios de unión a la subunidad de pilus en estas
chaperonas muestran amplias homologías. Se prefiere especialmente
que el sitio de unión sea el sitio de unión a la subunidad de pilus
de PapD o un análogo del mismo.
Como se verá a partir de los ejemplos, se ha
descubierto una parte importante del motivo de unión a la chaperona
y un péptido correspondiente a este motivo se ha sintetizado y
co-cristalizado con PapD para proporcionar
una base estructural para el mecanismo de acción de PapD. Los
detalles moleculares de la interfaz de reconocimiento de
PapD-adhesina demuestran claramente la función de la
hendidura conservada en toda la superfamilia de chaperonas con pilus
en unión de la subunidad y en el traslado de los determinantes de
virulencia a la superficie de bacterias patogénicas. La estructura
cristalina de PapD-péptido representa esencialmente una
"instantánea" de un procedimiento fundamental en la patogénesis
bacteriana: la interacción de una adhesina con una chaperona, que es
un prerrequisito para la presentación de la adhesina en la
superficie microbiana.
De esta manera, los inventores de la presente
invención han aclarado mediante el uso de cristalografía de rayos X
el mecanismo de unión entre PapD y la subunidad de pilus
PapG identificando, por lo tanto, una parte esencial de un
sitio de unión definido responsable de la unión entre las
subunidades de pilus y sus chaperonas periplásmicas, y
proporcionando de esta manera un procedimiento para permitir el
diseño de fármacos de chaperonas que inhiben los compuestos
anti-bacterianos.
Habiendo determinado la localización de un sitio
prometedor de unión para ligandos inhibidores como se ha descrito
anteriormente (véanse detalles en los ejemplos 1 y 2), se han usado
los programas informáticos "PLIM" y "PLIM_DBS"
(desarrollados por Symbicom AB) para encontrar plantillas para las
familias de compuestos capaces de unirse al sitio de unión.
PLIM es un modelador de la interacción
proteína-ligando que construye supuestos ligandos
para una proteína usando criterios termodinámicos. Este programa
calcula la energía de interacción entre la proteína y las sondas de
muestra que se colocan sucesivamente en diferentes puntos sobre una
cuadrícula red alrededor de la molécula. Para cada posición y
orientación se calcula la energía de interacción entre la sonda y
los átomos de la proteína. Las energías se almacenan, y se escriben
las mejores posiciones para una sonda particular (los cálculos
básicos se describen por Goodford (1985) y Boobyer (1989) y se
aplican en el programa GRID disponible en el mercado; La aplicación
de PLIM es algo diferente en el sentido de que los valores
energéticos se convierten en puntos discretos que se asocian con la
sonda química, permitiendo un fácil rendimiento para, por ejemplo,
programas que buscan bases de datos). Después, el programa construye
el ligando incorporando átomos de sonda seleccionados en posiciones
de mínima energía sobre la red. El usuario selecciona los átomos y
grupos que deberían usarse como sondas, y los criterios que deberían
usarse para determinar los que se incorporarán en el ligando. La
energía se calcula como la suma de Van der Waals electrostático y
las contribuciones de la unión a hidrógeno como se describe en este
documento.
Los datos de PLIM dan como resultado un número de
posiciones y orientaciones sugeridas de grupos químicos favorables
en la región cercana al sitio de unión. Estos grupos que tienen
propiedades físicas como carga, direccionalidad de unión a hidrógeno
y radio atómico amplio, se denominarán en lo sucesivo "puntos del
sitio".
Después se realiza una búsqueda de ligandos
potenciales buscando una base de datos para estructuras moleculares
conocidas que cuadran con las posiciones de estos grupos de los
puntos del sitio, usando PLIM_DBS.
El núcleo de PLIM_DBS es un algoritmo para el
isomorfismo subgráfico (véase Ullman (1976) y Brint (1987)), en el
que se representan tres puntos del sitio como una matriz de
distancia ("la matriz patrón"). El programa busca el patrón de
distancia en la matriz de distancia formada a partir de cada entrada
de la base de datos. Si se encuentra el patrón, la entrada se
superpone en los puntos del sitio y si los tipos de átomo
correspondientes cuadran con la entrada su orientación se guarda en
una lista de aciertos. Además de este esquema básico pueden usarse
diversas opciones con respecto a la superficie complementaria, es
decir, sólo se guardan las entradas que cuadran con la superficie de
la proteína con respecto a las propiedades hidrófobas y
estéricas.
De esta manera, PLIM_DBS es un buscador de bases
de datos que busca a través de un grupo de lotes coordinados de
moléculas tridimensionales, buscando entradas que contienen un
cierto patrón de átomos. Este patrón se especifica en términos de
tipo de átomo y de posición y orientación espacial; por ejemplo,
puede realizarse una búsqueda para compuestos que contengan un átomo
de carbono sp3 que está a 4,2 \ring{A} de un oxígeno sp2 y a 5,1
\ring{A} de un grupo hidroxilo que a su vez está a 5,6 \ring{A}
del oxígeno. El usuario puede ajustar la rigurosidad de la búsqueda
variando la tolerancia de los criterios de distancia y la
correspondencia con el tipo de átomo, determinando por ejemplo, si
un carbono sp2 que es un poco más de 4,2 \ring{A} de uno de
oxígeno debería considerarse como acierto. Esos aciertos que se han
encontrado después se clasifican de acuerdo con una puntuación que
refleja cómo de bien se superponen los átomos diana en la molécula
real, y también cómo es de complementaria la superficie de la
molécula del compuesto para la cavidad de unión de la proteína.
El resultado de una búsqueda PLIM_DBS es una
lista de estructuras moleculares y sus coordenadas atómicas,
superpuestas en los puntos del sitio, y a las que se les da una
puntuación ("calidad de ajuste").
El procedimiento no intenta optimizar el
posicionamiento de las estructuras, ni tampoco realiza cualquier
cálculo mecánico o dinámico molecular. Tanto la proteína como las
estructuras extraídas se tratan como cuerpos rígidos.
Las estructuras de la búsqueda en la base de
datos se muestran en el contexto de la proteína y su superficie en
un sistema de gráficos usando un grupo de modelado molecular
habitualmente disponible. Normalmente, las estructuras muestran
algunas interacciones desfavorables con la proteína, o carecen de
grupos para completarse, por ejemplo, cavidades hidrófobas. Por lo
tanto, las estructuras de la búsqueda en la base de datos se
consideran plantillas, que se modificarán y mejorarán por un químico
orgánico. Este procedimiento también implica elegir compuestos que
sean fáciles de sintetizar, lo que es de particular interés si la
capacidad de síntesis es limitada.
De esta manera, los mejores de estos aciertos en
la base de datos se examinan visualmente usando un sistema de
modelación gráfica por ordenador, y los más prometedores de éstos se
seleccionan en función de la abundancia de razonamiento
físico-químico.
Las plantillas se modifican usando un constructor
en 3D de moléculas pequeñas (MacMimic). Cada plantilla da lugar a
una clase de compuesto, por ejemplo, denominado "hdo". A cada
modificación se le asigna un número específico (por ejemplo hdo_3) y
las coordenadas y una descripción se almacenan en una estructura en
forma de árbol, usando el programa ARVS-JAKT
desarrollado por Symbicom. El diseño se realiza en colaboración
entre los expertos de estructura proteica y químicos orgánicos, con
el fin de proporcionar las mejores herramientas posibles para los
químicos que realmente sintetizarán los compuestos.
La eficacia de estas modificaciones se evalúa
finalmente usando cálculos dinámicos moleculares de energía libre
como se describen en este documento para estudiar la estabilidad del
complejo proteína-ligando (Aqvist y col., 1994;
Aqvist y Medina, 1993).
Con el fin de maximizar la eficacia de los
procedimientos mencionados anteriormente para identificar/diseñar
sustancias que sean capaces de interactuar con una chaperona
molecular, se prefiere que la sustancia A sea probablemente una
sustancia capaz de unirse al sitio de unión seleccionado.
En vista del modus operandi descrito
anteriormente para seleccionar sustancias que deben interactuar con
chaperonas como PapD, se puede realizar, de acuerdo con la
invención, cuando la sustancia A se selecciona mediante la
realización de las siguientes etapas:
- -
- co-cristalizar la chaperona periplásmica molecular o el análogo de la misma con un ligando capaz de interactuar con un sitio en la chaperona periplásmica molecular o el análogo de la misma y establecer la conformación tridimensional de la chaperona periplásmica molecular o del análogo de la misma y el ligando cuando interactúan por medio de cristalografía de rayos X,
- -
- usar la conformación establecida anteriormente de la chaperona periplásmica molecular o del análogo de la misma para establecer la representación tridimensional del sitio en la chaperona periplásmica molecular o el análogo de la misma que interactúa con el ligando durante la unión,
- -
- seleccionar varios grupos químicos distintos, X1, y determinar las posibles distribuciones espaciales de los grupos químicos X1 que maximizan la energía libre de unión entre los grupos químicos y el sitio en la chaperona o el análogo que interactúa con el ligando,
- -
- extraer, de una base de datos que comprende representaciones tridimensionales de moléculas, una molécula que tenga los grupos químicos X1 en las posibles distribuciones espaciales determinadas anteriormente,
- -
- modificar opcionalmente la representación tridimensional de la molécula extraída de la base de datos, e identificar la molécula opcionalmente modificada como la sustancia A.
De acuerdo con la invención, las etapas indicadas
anteriormente se prefieren especialmente cuando el ligando es una
subunidad de pilus o una parte de la misma con la que la chaperona
actúa normalmente durante el transporte de la subunidad de pilus a
través del espacio periplásmico y/o durante la unión al pilus.
Mediante el uso del procedimiento mencionado
anteriormente para identificar sustancias capaces de interactuar con
las chaperonas periplásmicas, se han identificado varias clases de
sustancias que han demostrado ser prometedoras en la fase de
diseño.
Los esfuerzos en el diseño de fármacos para
inhibidores/mejoradores de PapD se han concentrado en la
región de la molécula en la que se observa que se une el péptido G.
Esta región ahora se describirá con detalle, usando uno de los
supuestos inhibidores (bpy_9, véase más adelante) como estructura de
referencia.
El sitio de unión se domina por las cadenas
laterales cargadas centrales de Arg-8 y
Lys-112, que se unen al resto sulfato de bpy_9.
Adyacente a éste está una pequeña cavidad hidrófoba poco profunda
formada por las cadenas laterales de Ile-154,
Ile-194 y Thr-7, frente al grupo
2-etilo de los paquetes bpy_9 (Cavidad 1). Un grupo
tan largo como el anillo fenilo podría acomodarse aquí, unirse a la
posición 2 del azúcar y con posibles sustituyentes que podrían
recibir o donar un enlace hidrógeno a Thr-7, o donar
el esqueleto carbonilo de 198.
También hay una gran cavidad que comprende los
residuos Leu-4, Ile-111,
Thr-7 y Thr-109, en los que el
anillo fenilo de bpy_9 se acomoda (Cavidad 2). Un grupo tan grande
como naftaleno podría estar sustituido en la posición 6 del estrado
carbohidrato para rellenar este sub-sitio, con
sustituyentes que podrían formar un enlace hidrógeno a
Thr-109, o a cualquiera de los átomos del esqueleto
polar de los residuos Leu-4, Arg-6 o
Lys-110. Entonces, hay un gran parche llano que
incluye Tyr-87, y las regiones alifáticas de
Lys-110 y Lys-112, que podrían
acomodar un sistema tricíclico tal como 2-fenantrilo
sustituido en la posición 3 del azúcar (Parche 3). Pueden
considerarse los sustituyentes del hidrógeno unido a
Tyr-87 o el esqueleto de Lys-110,
así como grupos cargados negativamente para complementar las cadenas
laterales de Lys-110 y Lys-112.
Tyr-87 es un donador de transferencia de carga
potencial a un sistema \pi deficiente de electrones tal como
nitroarilo.
Se han fabricado modelos de varias chaperonas
homólogas (SfaE, MrkB, HifB y FimC) a partir de la
estructura de PapD, y las diferencias entre los modelos
estructurales han influenciado el diseño de inhibidores, de tal
forma que los ligandos propuestos deben unirse a todas las
estructuras examinadas. Por ejemplo, es tentador complementar la
cadena lateral cargada de Arg-200 con un grupo ácido
en el ligando, pero como dos de las otras estructuras tienen un Asp
en esta posición, el residuo no se considera un buen candidato.
Arg-8 se conserva completamente, como
Lys-112, Thr-7 e
Ile-11. Tyr-87 se convierte en Trp
en tres estructuras, pero la naturaleza global del parche 3 no se
carga mediante éste. PapD está realmente sólo con su
secuencia Thr-Lys en 109-110, siendo
las otras cuatro estructuras Ser-Arg aquí, pero de
nuevo, estos cambios conservativos no alteran de forma significativa
los criterios de diseño.
Aunque las sustancias que interactúan con el
sitio de unión responsable de la unión a las proteínas G son
candidatos obvios como inhibidores/mejoradores de las chaperonas
periplásmicas, se entenderá que las moléculas capaces de interactuar
con otros sitios en chaperonas periplásmicas también son
interesantes en este aspecto. Es muy posible que una interacción con
otro sitio diferente de una proteína de unión G en i.e. PapD
pueda hacer que se prevenga, inhiba o mejore PapD en su
acción como chaperona periplásmica.
Como se ha mencionado anteriormente, una familia
de sustancias (denominadas en este documento familia bpy) es un
aspecto importante de la invención. De esta manera, la invención se
refiere a nuevos compuestos de fórmula general
en la
que
V_{1} es O, S, SO, SO_{2}, CH_{2},
C(OH)H, CO o CS;
W_{1} es O, S, SO_{2}, SO_{3}, CH_{2} o
NH;
R_{1} es H; alquilo C_{1-24},
alquenilo C_{1-24} o alquinilo
C_{1-24}, donde el alquilo, alquenilo y alquinilo
pueden estar sustituidos con uno o más sustituyentes seleccionados
entre OH, -CONH_{2}, -CSNH_{2}, -CONHOH, -CSNHOH, -NHCHO,
-NHCONH_{2}, -NHCSNH_{2}, -NHSO_{2}NH_{2} y
-SO_{2}NH_{2}; acilo; o
-(CH_{2}CH_{2}O)_{s}-H, donde s = 1, 2,
3;
R_{2} es un grupo de la fórmula
en la
que
A es -CH-(CH_{2})_{n}- o
-CH=CH-(CH_{2})_{n-1}- (n > 0) o
-
\delm{C}{\delm{\dpara}{Y _{2} }}H-(CH_{2})_{n}-;
B es -(CH_{2})_{m}- o
=CH-(CH_{2})_{m-1}- (m > 0);
X_{2} es N, CH o C (donde B es
=CH-(CH_{2})_{m-1}-; e
Y_{2} es O, S, NH, H_{2} o H (n = 1); y
4 > m + n > 0, n < 3 y m < 3;
o R_{2} es un grupo de fórmula
en la
que
A es -CH-(CH_{2})_{n}- o
-CH=CH-(CH_{2})_{n-1}- (n > 0) o
-
\delm{C}{\delm{\dpara}{Y _{2} }}H-(CH_{2})_{n}-;
B es -(CH_{2})_{m}- o
=CH-(CH_{2})_{m-1}- (m > 0); y
X'_{2} es O, NH, CH_{2} o S (cuando p = 0); N
o CH (p = 1);
o C (cuando p = 1 y B es
=CH-(CH_{2})_{m-1}-);
V_{2}, Z_{2} y W_{2} son independientemente
H, OH, -CONH_{2}, -CSNH_{2}, -CONHOH, -CSNHOH, -NHCHO,
-NHCONH_{2}, -NHCSNH_{2}, -NHSO_{2}NH, -SO_{2}NH_{2}, o
V_{2} y Z_{2}, o Z_{2} y W_{2} juntos forman
-NHC(O)NH-, -C(O)NHC(O)-,
-NHS(O_{2})NH-, -C(O)NHO-,
-C(S)NHO-, -S(O_{2})NHO- o
-S(O_{2})NHC(O)-;
4 > m + n > 0, n < 3 y m < 3;
o R_{2} es un grupo -W_{5}-(alquilo
C_{1-5} o alquenilo C_{2-5} o
alquinilo C_{2-5}) donde W_{5} es un enlace o se
selecciona entre -O-, -S-, -SO_{2}- y -NHC(O)- y el resto
alquilo C_{1-5}, alquenilo
C_{2-5} o alquinilo C_{2-5}
puede estar sustituido con hasta tres grupos seleccionados
independientemente entre OH, -CONH_{2}, -CSNH_{2}, -CONHOH,
-CSNHOH, -NHCHO, -NHCONH_{2}, -NHCSNH_{2}, -NHSO_{2}NH_{2} y
-SO_{2}NH_{2};
-Z_{1}-R_{3} es
-SO_{2}(OH), -PO(OH)_{2},
-OSO_{2}(OH), -NHSO_{2}(OH),
-NH-CO-COOH,
-SPO(OH)_{2}, -CH_{2}COOH,
tetrazol-5-ilo o
tetrazol-5-ilmetilo, o sales de los
mismos;
o Z_{1} es -O-, -S-, -NH- o -CH_{2}- y
R_{3} es un grupo de fórmula:
D es -CH_{2}-, -CO-, -SO_{2}-,
-NH-SO_{2}-, -NH-CO-,
-O-PO(OH)- o una sal de los mismos;
Z_{3} es H, OH, -CONH_{2}, -CSNH_{2},
-CONHOH, -CSNHOH, -NHCHO, -NHCONH_{2}, -NHCSNH_{2},
-NHSO_{2}NH_{2}, -SO_{2}NH_{2}, -SO_{2}(OH),
-PO(OH)_{2}, -OSO_{2}(OH),
-NHSO_{2}(OH), -COOH,
tetrazolil-5-ilo o
tatrazolil-5-ilmetilo o una sal de
los mismos,
con la condición de que cuando D sea -CH_{2},
-CO-, -SO_{2}-, -NHSO_{2}- o -NHCO-, entonces Z_{3} sea
-SO_{2}(OH), -PO(OH)_{2},
-OSO_{2}(OH), -NHSO_{2}(OH), -COOH,
tetrazolil-5-ilo o
tetrazolil-5-ilmetilo o una sal de
los mismos;
X_{3} e Y_{3} son independientemente H,
NO_{2}, SO_{2}NH_{2}, CONH_{2}, CF_{3} o F; y
U_{4}-W_{4} es -CHCH-,
-CH_{2}CH_{2}-, -C(OH)CH-, -CHC(OH)-,
-CH(OH)CH_{2}-, -CH_{2}CH(OH)-,
-CH(OH)CH(OH)-, -C(O)NH-,
-NHC(O)-;
Y_{1} es -OH- o -S-;
R_{4} es H o, cuando Y_{1} es S,
S(CH_{2})_{q}N(R_{9})_{3}^{+}
y q es un número entero de 2-4, donde R_{9} es H o
CH_{3};
R_{5} es H; alquilo C_{1-6},
alquenilo C_{2-6} o alquinilo
C_{2-6}, y el reto alquilo
C_{1-6}, alquenilo C_{2-6} o
alquinilo C_{2-6} puede estar sustituido con OH,
-CONH_{2}, -CSNH_{2}, -CONHOH, -CSNHOH, -NHCHO, -NHCONH_{2},
-NHCSNH_{2}, -NHSO_{2}NH_{2} o -SO_{2}NH_{2}; o arilo,
aril-alquilo (C_{1-2}),
heterociclilo o heterociclil-alquilo
(C_{1-2}) que pueden estar opcionalmente
sustituidos en los restos arilo o heterociclilo con uno, dos o tres
sustituyentes seleccionados independientemente entre OH, F, Cl,
NH_{2}, CONH_{2}, NHCOH y SO_{2}NH_{2};
X_{1} es -O-, -S- o -NH-;
R_{6} es H o, cuando X_{1} es NH, acilo,
HOCNH-Val-Met-,
HOCNH-Ile-(S,S)-dioxo-metionil-
o
HOCNH-Val-(piran-4-on-2-il)-alanil-;
o una sal de tal compuesto;
También se ha sintetizado otra familia de
sustancias llamadas familia hdo. Por tanto, la invención también se
refiere a nuevos compuestos de fórmula general
en la
que
X es O, P, P(O), S, SO, SO_{2},
CH_{2}, C(OH)H o un grupo NQ_{11}, donde Q_{11}
es H, OH, acilo C_{1-24} o alquilo
C_{1-24};
Z_{11} es un enlace, O, CH_{2}, S, SO,
SO_{2} o un grupo NQ_{1}, donde Q_{12} es H, acilo
C_{1-24} o alquilo C_{1-24};
R_{11} es H; alquilo
C_{1-24}, alquenilo C_{2-24} o
alquinilo C_{2-24}, que puede estar sustituido con
uno o más sustituyentes seleccionados independientemente entre -OH,
-COOH, -F, -Cl, -CONH_{2}, -CSNH_{2}, -CONHOH, -CSNHOH, -NHCHO,
-NHCONH_{2}, -NHCSNH_{2}, -NHSO_{3}NH_{2} y
-SO_{2}NH_{2}; acilo; o
-(CH_{2}CH_{2}O)_{s}-H, donde s = 1, 2
ó 3;
o R_{11} es
CH=CH-(CH_{2})_{n'}-Q_{13} o
-(CH_{2})_{n'}-Q_{13}, donde Q_{13}
es un grupo arilo o heteroarilo sustituido con -OH, -COOH, -F, -Cl,
-CONH_{2}, -CSNH_{2}, -CONHOH, -CSNHOH, -NHCHO, -NHCONH_{2},
-NHCSNH_{2}, -NHSO_{3}NH_{2} y -SO_{2}NH_{2}, y donde n'
\geq 0;
R_{12} y R_{13} son independientemente OH, H,
F, Cl, OW_{11} u O(CO)W_{11}, donde W_{11} es
alquilo C_{1-24}, alquenilo
C_{2-24} o alquinilo C_{2-24}, o
un grupo arilo o heteroarilo sustituido con -OH, -COOH, -F, -Cl,
-CNH_{2}, -CSNH_{2}, -CONHOH, -CSNHOH, -NHCHO, -NHCONH_{2},
-NHCSNH_{2}, -NHSO_{3}NH_{2} y -SO_{2}NH_{2};
Z_{12} es un enlace, O, S o CH_{2};
R_{14} es
-(CH_{2})_{n''}-Q_{14}, donde Q_{14}
es un grupo arilo o un grupo heteroarilo sustituido con -OH, -COOH,
-F, -Cl, -CONH_{2}, -CSNH_{2}, -CONHOH, -CSNHOH, -NHCHO,
-NHCONH_{2}, -NHCSNH_{2}, -NHSO_{3}NH_{2} y
-SO_{2}NH_{2}, y donde n'' = 0, 1, 2 ó 3;
Z_{13} es un enlace, O, CH_{2}, S, SO,
SO_{2}, NQ_{14}Q_{15}, donde Q_{14} es H, acilo
C_{1-24} o alquilo C_{1-24}, y
Q_{15} es CO o -C(O)W_{12}, donde W_{12} es O o
NW_{13}, donde W_{13} es H, OH, acilo C_{1-24}
o alquilo C_{1-24};
R_{15} es H; alquilo
C_{1-24}, alquenilo C_{2-24} o
alquinilo C_{2-24}, donde el alquilo, alquenilo o
alquinilo pueden estar sustituidos con uno o más sustituyentes
seleccionados independientemente entre -OH, -COOH, -F, -Cl
-CONH_{2}, -CSNH_{2}, -CONHOH, -CSNHOH, -NHCHO, -NHCONH_{2},
-NHCSNH_{2}, -NHSO_{3}NH_{2} y -SO_{2}NH_{2}; acilo o
-(CH_{2}CH_{2}O)
\hbox{ _{s} -H,}donde s = 1, 2 ó 3;
o R_{15} es
CH=CH-(CH_{2})_{n'}-Q_{13} o
-(CH_{2})_{n'}-Q_{13}, donde Q_{3} es
como se ha definido anteriormente y donde n' \geq 0;
o una sal de tal compuesto.
En el presente contexto, los términos "alquilo
C_{1-5}, C_{1-6} y
C_{1-24}" pretenden significar grupos alquilo
con 1-5, 1-6 y 1-24
átomos de carbono, respectivamente, que pueden ser lineales,
ramificados o cíclicos tales como metilo, etilo, propilo,
isopropilo, butilo, isobutilo, terc-butilo, hexilo, octilo,
dodecilo, ciclopentilo, ciclohexilo, etc.
Además, como se usan en este documento, los
términos "alquenilo C_{2-5},
C_{2-6} y C_{2-24}"
pretenden significar grupos alquilo mono- o poliinsaturados con
2-5 y 2-24 átomos de carbono,
respectivamente, que pueden ser lineales, ramificados o cíclicos
donde pueden estar presentes dobles enlaces en cualquier sitio de la
cadena o del anillo, por ejemplo, vinilo,
1-propenilo, 2-propenilo, hexenilo,
decenilo, 1,3-heptadienilo, ciclohexenilo, etc.
Algunos de los sustituyentes existen tanto en la configuración cis
como en trans. El alcance de estas invenciones comprende las formas
cis y trans.
En el presente contexto, los términos
"alquinilo C_{2-5}, C_{2-6} y
C_{2-24}" pretenden significar un grupo alquilo
lineal o ramificado con 2-5 y 2-24
átomos de carbono, respectivamente, e incorporan uno o más triples
enlaces, por ejemplo, etinilo, 1-propinilo,
2-propinilo, 2-butinilo,
1,6-heptadinilo, etc.
Los términos "alcoxi C_{1-6}
y C_{1-24}" indican grupos alquilo como se han
definido anteriormente que comprenden una función oxi.
En el presente contexto, el término "arilo"
pretende significar fenilo y naftilo. El término "heteroarilo"
pretende significar un sistema aromático cíclico, en el que al menos
un átomo que no es carbono contribuye al sistema de unión \pi.
Los ejemplos de grupos arilo sustituidos son:
3-nitrofenilo, 3-hidroxifenilo,
4-hidroxifenilo,
3,4-dihidroxifenilo,
3-carboxamidofenilo,
3-formamidilfenilo,
3-acetamidilfenilo,
3-fluoronaftil-2-ilo,
7-fluoronaftilo,
3,7-difluoronaftilo,
3-hidroxinaftilo, 7-hidroxinaftilo,
3,7-dihidroxinaftilo,
3-fluoro-7-hidroxinaftilo,
7-fluoro-3-hidroxinaftilo,
4-fluoronaft-2-ilo,
6-fluoronaft-ilo,
8-fluoronaft-2-ilo,
4,6-difluoronaft-2-ilo,
etc.
Los ejemplos de grupos heterocíclicos y
heteroarilo son pirrolilo, furanilo,
2,3-dihidrofuranilo, tetrahidrofuranilo, tienilo,
2,3-dihidrotienilo, tetrahidrotienilo, imidazolilo,
oxazolilo, tiazolilo, pirazolilo, indolilo, pirazinilo, dioxolanilo,
dioxanilo, 1,3,5-trioxanilo, tetrahidrotiopiranilo,
ditiolanilo, pirazolidinilo, iminazolidinilo,
sim-triazinilo, sim-tetrazinilo, quinazolinilo,
pteridinilo, isoindolilo, 1,2,4-triazolilo,
1,2,3-triazolilo, bencimidazolilo, indazolilo,
benzofuranilo, isobenzofuranilo, benzotiofenilo, tienotiofenilo,
isoxazolilo, 1,2,5-oxadiazolilo, isotiazolilo,
1,3,4-tiadiazolilo, benzoxazolilo, benzotiazolilo,
azaindolilo, oxoindolilo, hidroxiindolilo, N-oxiisoquinolilo,
etc.
En el presente contexto, el término "acilo"
(por ejemplo, acilo C_{1-24}) pretende indicar el
residuo acilo de un resto ácido carboxílico o un ácido sulfónico que
comprende un grupo carbonilo o sulfonilo y un resto orgánico. Los
ejemplos de grupos acilo incluyen alcanoílo
C_{1-24} (por ejemplo, formilo, acetilo,
propionilo, butirilo, isobutirilo, valerilo, isovalerilo, pivaloílo
y hexanoílo), alquenoílo C_{1-24} (por ejemplo,
acriloílo, metacriloílo, crotonoílo, iso-crotonoílo,
2-pentenoílo, 3-pentenoílo,
2-metilpentenoílo, 3-pentenoílo,
3-fenilpropenoílo,
2-fenil-trans-propenoílo,
2,4-hexadienoílo), alquinoílo
C_{1-24} (por ejemplo, propionoílo,
2-butinoílo, 3-butinoílo,
2-metil-3-butinoílo,
2,2-dimetilbutinoílo, 2-pentinoílo,
3-pentinoílo,
2-pentin-4-trans-enoílo),
alcoxicarbonilo C_{1-24} (por ejemplo,
metoxicarbonilo, etoxicarbonilo, propoxicarbonilo, butoxicarbonilo
y t-butoxicarbonilo), alqueniloxicarbonilo
C_{1-24} (por ejemplo
cis-2-buteniloxicarbonilo,
1-metil-2-propeniloxicarbonilo,
1,1-dimetil-2-propeniloxicarbonilo,
trans-2-buteniloxicarbonilo), aroílo (por
ejemplo, benzoílo), heterociclilcarbonilo (por ejemplo,
2-furoílo, 3-furoílo,
2-furanoílo, 3-furanoílo,
2-pirrolcarboxilo,
3-pirrolcarboxilo, 2-tenoílo,
3-tenoílo, 2-indolcarboxilo,
3-indolcarboxilo, 1-naftanoílo y
2-naftanoílo),
etc.
etc.
El término "sal" pretende comprender una sal
tal como una sal de adición de ácidos orgánicos (por ejemplo,
acetato, valerato, salicilato, galacturonato, gluconato, tannato,
trifluoroacetato, maleato, tartrato, metanosulfonato,
bencenosulfonato, formiato, tiocianato y toluenosulfonato), una sal
de adición de ácidos inorgánicos (por ejemplo, clorhidrato,
bromhidrato, yodhidrato, diclorhidrato, dibromhidrato, diyodhidrato,
sulfato, hidrogenosulfato, halosulfato tal como yodosulfato,
nitrato, fosfato y carbonato) o una sal con un aminoácido (por
ejemplo, arginina, ácido aspártico y ácido glutámico) o una sal
metálica tal como una sal de metal alcalino (por ejemplo, sal sódica
y sal potásica) y una sal de metal alcalinotérreo (por ejemplo, sal
de calcio y sal de magnesio), una sal amónica, una sal álcali
orgánica (por ejemplo, sal trimetilamina, sal trietilamina, sal
piridina, sal picolina, sal diciclohexilamina y sal
N,N'-dibenciletilenodiamina), y los hidratos de las
mismas.
Cuando el sustituyente R_{5} indica
heterociclilo, se prefiere que el sustituyente indique un grupo
heterociclilo de fórmula
en la que 'X es -CH-, -CH_{2}-,
-O-, -N-, -S-, -S\rightarrowO, -N\rightarrowO o -CO-, Y es -CH-
o -NH-, y Z es -CH-, -CH_{2}-, -O-, -S-, -N-, -CO-,
-S\rightarrowO o -N\rightarrowO, especialmente un grupo
seleccionado entre el grupo compuesto por
inden-7-ilo,
benzofuran-4-ilo,
isobenzofuran-4-ilo,
tionaften-4-ilo,
isotionaften-4-ilo,
2-oxo-inden-7-ilo,
2-oxo-inden-4-ilo,
inden-4-ilo,
benzofuran-7-ilo,
isobenzofuran-7-ilo,
tionaften-7-ilo,
isotionaften-7-ilo,
1-oxo-tionaften-4-ilo,
1-oxo-tionaften-7-ilo,
antran-4-ilo,
antran-7-ilo,
tioantran-4-ilo,
tioantran-7-ilo,
benzotiozol-4-ilo,
benzotiozol-7-ilo,
2H-2-isobenzo-1,3-dion-7-ilo,
isobenzofuran-5-ilo,
isobenzofuran-6-ilo,
3H-2-oxo-benzofuran-5-ilo,
3H-2-oxo-benzofuran-6-ilo,
3H-2-oxotionaften-5-ilo,
3H-2-oxotionaften-6-ilo,
indol-5-ilo,
indol-6-ilo,
3H-2-oxoindol-5-ilo,
3H-2-oxoindol-6-ilo,
3H-2-oxobenzoxazol-5-ilo,
3H-2-oxobenzoxazol-6-ilo,
benzotiazol-5-ilo,
benzotiazol-6-ilo,
2-oxobenzo-1,3-ditiol-5-ilo,
2-oxobenzo-1,3-ditiol-6-ilo,
3H-2-oxobencimidazol-5-ilo,
3H-2-oxobencimidazol-6-ilo,
benzoxatiol-5-ilo,
benzoxatiol-6-ilo,
3H-2-oxobenzotiazol-5-ilo
y
3H-2-oxobenzotiazol-6-ilo.
También se prefiere que el sustituyente R_{5}
sea un grupo de fórmula
\vskip1.000000\baselineskip
o que R_{5} sea un grupo de la
fórmula
\vskip1.000000\baselineskip
Con respecto al sustituyente R_{2} que es
heterociclilo, se prefiere especialmente que se seleccione entre el
grupo compuesto por
isobenzofuran-5-ilo,
isobenzofuran-6-ilo,
3H-2-oxo-benzofuran-5-ilo,
3H-2-oxo-benzofuran-6-ilo,
3H-2-oxotionaften-5-ilo,
3H-2-oxotionaften-6-ilo,
indol-5-ilo,
indol-6-ilo,
3H-2-oxoindol-5-ilo,
3H-2-oxoindol-6-ilo,
3H-2-oxobenzoxazol-5-ilo,
3H-2-oxobenzoxazol-6-ilo,
benzotiazol-5-ilo,
benzotiazol-6-ilo,
2-oxobenzo-1,3-ditiol-5-ilo,
2-oxobenzo-1,3-ditiol-6-ilo,
3H-2-oxobencimidazol-5-ilo,
3H-2-oxobencimidazol-6-ilo,
benzoxatiol-5-ilo,
benzoxatiol-6-ilo,
3H-2-oxobenzotiazol-5-ilo
y
3H-2-oxobenzotiazol-6-ilo.
El número exacto de sustituyentes presentes sobre
un resto alquilo, alquenilo o alquinilo R_{1} dependerá de la
longitud de la cadena de carbonos, siendo el propósito de los
sustituyentes hacer que el grupo entero R_{1} sea compatible con
agua ya que, en el complejo chaperona-ligando tal
como el complejo PapD-ligando, el grupo R_{1} se extenderá
en el medio acuoso que lo rodea. De esta manera, para una cadena de
carbono bastante corta tal como hasta de cuatro carbonos, se
contempla que será suficiente uno de los sustituyentes polares
anteriores, en particular cuando el sustituyente se encuentra en el
extremo mientras que, para las cadenas más largas, puede requerirse
un gran número de sustituyentes, tales como un sustituyente para
cada átomo de carbono.
Los glicósidos
4,6-O-(4'-metoxi)fenilmetiliden-\alpha-D-glucohexopiranósido
o
4,6-O-(4'-metoxi)fenilmetiliden-\beta-D-glucohexopiranósido:
(se usan aquí como ejemplos
preferidos, pero también pueden usarse otros arilmetiliden o
viniliden acetales) pueden prepararse como se indica a continuación:
La glucosa peracilada se hace reaccionar con, por ejemplo, bromuro
de hidrógeno o cloruro de hidrógeno en un disolvente adecuado tal
como, por ejemplo, ácido acético o diclorometano, formando bromuro o
cloruro de glicosilo per-O-acilado (O-acilación y
síntesis de haluro de glicosilo: M. L. Wolfrom y A. Thompson,
Methods in Carbohydrate Chemistry, Vol. 2,
211-215, ed. por R. L. Whistler y L. Wolfrom,
Academic Press, Nueva York, 1963; G. Hewit y G. Fletcher Jr.,
ibid, 226-228; y R. U. Lemieux, ibid,
223-224).
El alcohol o tiol de aglicona protegido de forma
adecuada, cuando es necesario
(H-W_{1}R_{1}-PG_{1} o
H-W_{1}R_{1}) (grupos protectores: Protective
Groups in Organic Synthesis, Editores T. W. Greene y P. G. M.
Wuts, John Wiley y Sons, Inc., Nueva York, 1991) se hace reaccionar
con la glucosa per-O-acilada usando un ácido de Lewis tal
como eterato de trifluoruro de boro (R. J. Ferrier y R. H. Furneaux,
Carbohydr. Res., 52 (1976) 63-68; J. Dahmén,
T. Frejd, G. Gronberg, T. Lave, G. Magnusson y G. Noori,
Carbohydr. Res 116 (1983) 303-307) o
trifluorometanosulfonato de trimetilsililo (T. Ogawa, K. Beppu, S.
Nakabayashi, Carbohydr. Res., 93 (1981)
C6-C9) como promotores. La reacción se realiza en un
disolvente adecuado tal como cloroformo, diclorometano o tolueno.
Cuando el derivado de monosacárido en cuestión es un bromuro o
cloruro de glicosilo per-O-acilado, pueden usarse promotores
tales como trifluorometanosulfonato de plata o sales de mercurio
(II) (H. Paulsen, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 21 (1982)
155-173) y las reacciones se realizan en un
disolvente adecuado tal como diclorometano o tolueno. La glucosa
W_{1}R_{1} o los glicósidos W_{1}R_{1}PG_{1} se obtienen
después de la des-O-acilación usando metóxido sódico (A.
Thompson, M. L. Wolfrom y E. Pascu, páginas 215-220,
Methods in Carbohydrate Chemistry, Vol. II, Editores: R. L.
Whistler y M. L., E. Wolfrom, Academic Press, Nueva York, 1963) en
metanol en un co-disolvente que contiene metanol tal
como diclorometano o
tetrahidrofurano.
tetrahidrofurano.
Después, se obtienen los
4,6-(4'-metoxi)bencilideno acetales por
reacción con 4-metoxibenzaldehído dimetil acetal y
ácido en un disolvente polar no prótico tal como por ejemplo
dimetilformamida, acetonitrilo o tetrahidrofurano (J. J. Patroni y
col., Aust. J. Chem. 1988, (41), 91-102; para
otros procedimientos de formación de acetales, véase por ejemplo A.
N. de Belder, 1979, adv. Carbohydr. Chem. Biochem., 34, 179 y
las referencias citadas en ese documento).
Después, se obtienen los epóxidos B1 o B2
a través de ésteres sulfonato: Los
manno epóxidos B1 pueden prepararse haciendo reaccionar el
derivado de glucósido A con hidruro sódico y
p-toluenosulfonilimidazol en dimetilformamida (D. Hicks y B.
Fraser-Reid; Synthesis 1974, 203) o con
hidruro sódico y cloruro de p-toluenosulfonilo en
tetrahidrofurano (V. S. Murthy y col., Synthetic Commun.
1993, 23 (3),
285-289).
Los allo epóxidos B2 pueden prepararse
haciendo reaccionar el derivado de glucósido A con metilsulfonilo o
cloruro de p-toluenosulfonilo en piridina y tratando el
diéster de metilsulfonato resultante con etóxido sódico en etanol
(Y. Ali, A. C. Richardson, Carbohydrate Res. 1967, 5,
441-448; N. Richtmeyer, Methods in Carbohydrate
Chemistry, Vol. 1, 107).
Los epóxidos B1 o B2 pueden hacerse reaccionar
con reactivos nucleófilos adecuados, produciendo las allo
hexopiranósidos diaxialmente sustituidas C1 y C2
\vskip1.000000\baselineskip
(para referencias generales sobre
el uso de epóxidos, véase por ejemplo J. Gorzynski Smith,
Synthesis, 1984, 8, 629-656 Masamune S., Choy
W., Petersen J y Sita L R, Angew. Chem. Int. Ed. Engl.,
1985, 24, 1-76; A. S. Rao y col., Tetrahedron
Lett., 1983, 39,
2323).
Cuando el primer átomo de R_{2} y Z_{1} (como
se ha definido anteriormente) conectado al resto carbohidrato en el
producto final deseado es un nitrógeno (= el átomo nucleófilo),
entonces el nucleófilo preferido Nu_{1} o Nu_{2} es azida
(N_{3}^{-}). El epóxido se trata con azida sódica y cloruro
amónico en ebullición
2-metoxi-etanol (R. D. Guthrie y D.
Murphy; J. Chem. Soc. 1963, 5288-5294).
Cuando el átomo nucleófilo es oxígeno o azufre,
el procedimiento general preferido de apertura del epóxido implica
tratamiento con un alcohol o tiol protegido adecuadamente en
presencia de alúmina neutra en éter (G. H. Posner y D. Z. Rogers,
J. Am. Chem. Soc. 1977, 99, 8208; G. H. Posner, D. Z. Rogers
y A. Romero, Isr. J. Chem. 1979, 18, 259; y G. W. Posner, M.
Hulce y R. K. Rose, Synth. Commun. 1981, 11, 737).
Cuando el átomo nucleófilo es carbono, los
reactivos usados más comúnmente son compuestos de organomagnesio,
organolitio, organocobre, organoaluminio y organoboro (J. Gorzynski
Smith, Synthesis, 1984, 8, 629-656 y las
referencias citadas en ese documento).
Cuando el producto es una allo
hexopiranósido C1, la función 2-hidroxi puede
bloquearse con un grupo protector que permite la introducción de la
funcionalidad R_{2} en la última etapa (se prefiere si R_{2} es
un éster, no mostrado en la figura) o se introduce la funcionalidad
R_{2} protegida adecuadamente, cuando es necesario, para producir
D1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Por ejemplo, los grupos OH a éteres o ésteres
(Protective Groups in Organic Synthesis, Editores T. W.
Greene y P. G. M. Wuts, John Wiley y Sons, Inc., Nueva York, 1991);
grupos OH a carbonatos (J. March, Advanced Organic
Chemistry-Reaction Mechanisms, and Structure, 3ª
ed. John Wiley y Sons, Nueva York, 347 (1985) y las referencias
citadas en ese documento); grupos OH a carbamatos (J. March,
Advanced Organic Chemistry-Reaction Mechanisms,
and Structure, 3ª Ed. John Wiley y Sons, Nueva York,
791-792 (195) y las referencias citadas en ese
documento); grupos OH a grupos alquilo mediante derivados de
exometileno y posterior hidrogenación o mediante otras vías (H. O.
H. House, Modern Synthetic Reactions, 2ª Ed. W. A. Benjamin,
Inc., Menlo Park, C. A., 1-130 (1972) y las
referencias citadas en ese documento; J. Yoshimura, Adv.
Carbohydr. Chem. Biochem., 42 (1984) 69-134); e
intercambio de grupos heterocíclicos por grupos OH, mediante
diferentes vías (A. R. Katritzky, Handbook of Heterocyclic
Chemistry, Pergamon Press, Oxford, 1985).
Cuando el producto es una allo
hexopiranósido C2, la función 3-hidroxi se bloquea
con un grupo protector que permite la introducción de la
funcionalidad Z_{1}-R_{3} en la última etapa
dando como resultado intermedios de tipo
D2
D2
(Protective Groups in Organic
Synthesis, Editores T. W. Greene y P. G. M. Wuts, John Wiley y
Sons, Inc., Nueva York, 1991) o se transforman en un intermedio de
manno hexopiranósido
D3
donde Nu_{1} es una forma
protegida o enmascarada de la funcionalidad Z_{1}. Grupos OH a
éteres o ésteres (Protective Groups in Organic Synthesis,
Editores T. W. Greene y P. G. M. Wuts, John Wiley y Sons, Inc.,
Nueva York, 1991); grupos OH a grupos azido: J. March, Advanced
Organic Chemistry-Reaction Mechanism, and
Structure, 3ª Ed. John Wiley y Sons, Nueva York, 380, (1985) y
las referencias citadas en ese documento; H. H. Baer, Pure Appl.
Chem., 61 (7) (1989) 1217-1234 y las
referencias citadas en ese documento; grupos OH a grupos amino
mediante azidas u otras vías (March, Advanced Organic
Chemistry-Reaction Mechanisms, and Structure, 3ª
Ed. John Wiley y Sons, Nueva York, 1106, 798-800
(1985) y las referencias citadas en ese documento; H. H. Baer,
Pure Appl. Chem., 61 (7) (1989) 1217-1234 y
las referencias citadas en ese
documento).
Después, la función 4,6-O-acetal se abre
reductivamente, produciendo la función R_{6} en el caso en el que
R_{6} es un éter, o los intermedios F1, F2 o F3 con una función
hidroxi en la posición 6 (apertura reductiva de acetales, véase
Garegg P J y Hultberg H, Carbohydr. Res. 1981, 93,
c10-11; Garegg P J, Hultberg H y Wallin S,
Carbohydr. Res. 1982, 108, 97-101; Liptak A,
Jodal I, Nanasi P, Carbohydr. Res. 1975, 44,
1-11; Baker D C, Horton D, Tindall C G, Methods
in Carbohydr. Chem., 1976 Vol. 6, 3-6; Mikami T,
Asano H, Mitsunobu O, Chem. Lett. 1987, 10,
2003-2036; Ed M, Garegg P J, Hulberg H, Oscarsson S,
J. Carbohydr. Chem. 1983, 2, 305-311; Hunter
R, Bartels B, Michael J P, Tetrahedron Lett. 1991, 32,
1095-1098; Rao S P, Grindley T B, Carbohydr. Res.
1991, 218, 83-93; Hunter, R. Bartels, B. J.
Chem. Soc. Chem. Commun. 1991, 2887-2888).
Por ejemplo, los intermedios de tipo D1, D2 o D3
se tratan con cianoborohidruro sódico y clorotrimetilsilano en
acetonitrilo, (R. Johansson y B. Samuelsson, J. Chem. Soc. Perkin
Trans. 1, 1984, 2371-2374) o complejo de
borano-trimetilamina y tricloruro de aluminio. El
resultado regioquímico de la reacción normalmente depende del
disolvente (Ek M, Garegg P J, Hultberg H, Oscarsson S, J.
Carbohydr. Chem. 1983, 2, 305-311).
Los intermedios aldehído de tipo G1, G2 o G3
se obtienen por oxidación de los
correspondientes intermedios de 6-alcohol de tipo
D1, D2 o D3, preferiblemente mediante el procedimiento de Swern.
(Mancuso A J, Swern D, Synthesis, 1981,
165-185; Tidwell T, Synthesis, 1990,
857-870; para otros procedimientos de oxidación,
véase A. H. Haines, 1988, Methods for the Oxidation of Organic
Compounds, Capítulo 2, Academic Press, San Diego y las
referencias citadas en ese
documento).
En la siguiente etapa se añade un nucleófilo de
carbono a la función aldehído de los intermedios de tipo G1, G2 o
G3. Preferiblemente, se añade un reactivo de alquillitio o arillitio
protegido adecuadamente o un reactivo de grignard al aldehído en un
disolvente de éter o hidrocarburo, produciendo los alcoholes
secundarios H1, H2 o H3:
Para las reacciones de los aldehídos con
compuestos de organolitio y organomagnesio, véase J. March,
Advanced Organic Chemistry-Reaction Mechanisms, and
Structure, 3ª Ed. John Wiley y Sons, Nueva York, 347 (1985) y
las referencias citadas en ese documento.
Para las reacciones de los aldehídos con
organolitio y organomagnesio y otros nucleófilos de carbono, véase
Evans D A, Aldrichim. Acta, 1982, 15, 23 y las referencias
citadas en ese documento.
Para ejemplos específicos sobre el uso y
preparación de reactivos fenillitio sustituidos con arilo y de
grignard, véase Ames M M, Castagnoli Jr. N, J. Labelled
Compd., 1974, 10 (2), 195-205; documento DE
3807910 A1; Mills R J, Snieckus V, Polynucl. Aromat.
Hydrocarbons, [Pap. Int. Symp.], 8ª, Meeting 1983,
913-24. Editado por: Cooke M y Dennis A J, Battelle
Press 1985: Columbus, Ohio; Iriye R, Furukawa K, Nishida R, Kim C,
Fukami H, Biosci. Biotechnol. Biochem. 1992, 56 (11),
1773-5; Comber M F, Sargent M V U, J. Chem. Soc.,
Chem. Commun., 1991, (3), 190-2; Hirai T,
Yoshizawa A, Nishiyama I, Fukumasa M, Shiratori N, Yokoyama A,
documento EP 341686 A2; Leeson P D, Emmet J C, Shah V P,
Showell G A, Novelli R, Prain H D, Benson M G, Ellis D, Pearce N J,
Underwood A H, J. Med. Chem. 1989, 32 (2),
320-36); Meltzer P C, Liang A Y, Brownell A L,
Elmaleh D R, Madras B K, J. Med. Chem., 36 (7),
855-62; Willard A K, Novello F C, Hoffman W F,
Cragoe Jr E J., documento US 4.459.423.
Para reactivos de fenillitio sustituidos que
también pueden elaborarse en compuestos heterocíclicos, véase: Lang
H J, Muschaweck R, documento AU 514406 B2; Lang H J, Muschaweck R,
Hropot M, documento HU 19761; Lang H J, Muschaweck R, Hropot M,
documento DE 2737195.
Para reactivos de arillitios heteroaromáticos y
de grignard, véase: Yang Y, Martin A R, Nelson D L, Regan J,
Heterocycles, 1992, 34 (6), 1169-75.
Para ejemplos de otros reactivos organometálicos
para la síntesis estereoselectiva de alcoholes secundarios a partir
de aldehídos:
- Homoalilalcoholes con complejos de crotilmolibdeno: Faller J W, John J A, Mazzieri M R, Tetrahedron Lett. 1989, 30, 1769-1772.
- Homoalilalcoholes con complejos de titanio: Riediker M, Duthaler R O, Angew. Chem. Int. Ed. Eng., 1989, 28, 494-495.
- 3-Pirrolilalcoholes con 3-litiopirrol protegido con sililo: Bray B L, Mathies P H, Naef R, Solas D R, Tidwell T T, Artis D R, Muchowski J M, J. Org. Chem., 1990, 55, 6317-6328.
- Alcoholes alílicos con E-vinilalano: A P Kozikowski y Jiang-Ping Wu, Tetrahedron Lett. 190, 30, 4309-4312 y las referencias citadas en ese documento.
- Dioles trans-alílicos con vinilestanos: Corey E J, Wollenberg R H, J. Org. Chem., 1975, 40, 2265-2266.
- Carbinoles de pirrolidina con \alpha-litio pirrolidina amidinas: Sanner M A, Tetrahedron Lett. 1989, 30, 1909-1912.
- Reactivos de Organocinc: Furstner A, Synthesis, 1989, 571-590 y las referencias citadas en ese documento.
En lo sucesivo, el sustituyente de la posición 3
(Nu_{1} u OPG_{1}) se transforma en un nucleófilo con el fin de
instalar la funcionalidad cargada negativamente
Z_{1}-D-R_{3}.
Los 6-alcoholes secundarios H1,
H2 y H3 se protegen primero, (Protective Groups in Organic
Synthesis, Editores T. W. Greene y P. G. M. Wuts, John Wiley y
Sons, Inc., Nueva York, 1991) o se transforman en funciones amino en
los casos en los que X_{1}-R_{6} forma una
funcionalidad peptídica (grupos OH a grupos amino mediante azidas u
otras vías: Véase por ejemplo March, Advanced Organic
Chemistry-Reaction Mechanisms, and Structure, 3ª
Ed., John Wiley y Sons, Nueva York, 1106, 798-800
(1985) y las referencias citadas en ese documento; H. H. Baer,
Pure Appl. Chem., 61 (7) (1989) 1217-1234, y las
referencias citadas en ese documento).
Para la síntesis de péptidos, véase Gross y
Meienhofer, The Peptides, vol. 3, Academic Press, Nueva York,
1979-1981; Grant G A y col., Synthetic Peptides,
A Users Guide, 1991, W. A. Freeman y Compañía, Nueva York, y las
referencias citadas en ese documento.
La posición 3 se desprotege para un intermedio de
alcohol, tiol o amina I1, I2 o I3
(Protective Groups in Organic
Synthesis, Editores T. W. Greene y P. G. M. Wuts, John Wiley y
Sons, Inc., Nueva York, 1991, y las referencias citadas en ese
documento).
Por ejemplo, el tratamiento de I1, donde
R_{2}-PG_{1} es una combinación de funciones
éter y Q_{1} es azuda, con sulfito de hidrógeno gaseoso en
piridina y agua (T. Adashi, Y. Yamada, I. Inoue y M. Saneyoshi,
Synthesis, 1977, 45). Para otros procedimientos de
reducciones de azida, véase Poopeiko N E, Pricota T I, Mikhailopulo
I A, Synlett, 1991, 5, 342; Samano M C, robins M J,
Tetrahedron Lett. 1991, 32, 6293-6296;
Rakotomanomana N, Lacombe J-M, Pavia A,
Carbohydr. Res., 1990, 197, 318-323; Malik A
A, Preston S B, Archibald T G, Cohen M P, Baum K, Synthesis,
1989, 450-451; Maiti S, Spevak P, Reddy N, Synt.
Commun. 1988, 18, 1201-1206; Bayley H, Standring
D N, Knowles J R, Tetrahedron Lett., 1978, 39,
3633-3634).
Los intermedios I1, I2 o I3 se sulfatan con
complejo trióxido de azufre-piridina o
-trietilamina, obteniendo los intermedios J2, J4 y J6
(véase, por ejemplo J. Basten, G.
Jaurand, B. Olde-Hanter, M. Petitou y C. A. A. van
Boeckel, Bioorg. Med. Chem. Lett., 1992, 2 (9),
901-904 y las referencias citadas en ese documento;
J. Basten, G. Jaurand, B. Olde-Hanter, P.
Duchaussoy, M. Petitou y C. A. A. van Boeckel, Bioorg. Med. Chem.
Lett., 1992, 2 (9), 905-910 y las referencias
citadas en ese documento; Bocker, T. Lindhorst, TK. Thiem, J. Vill,
V. Carbohydr. Res. 1992, 230, 245-256) o se
acoplan para formar los intermedios fosfoéster J1, J3 y
J5
Como se sabe que el enlace
fósforo-nitrógeno es ácido lábil, se prefieren los
intermedios que conducen a productos finales fosfodiéster (M. Selim
y T. N. Thanh, C. R. Seances Acad. Sci, 1960, 250, 2377).
Por ejemplo, los intermedios alcohol I1, I2 o I3
se tratan con 2-clorofenilfosfocloridato de
2,2,2-tricloroetilo en cloroformo y piridina para
formar los triésteres fosfato. El grupo
2,2,2-tricloroetilo se retira por tratamiento con
polvo de cinc y el diéster fosfato resultante se activa con
3-nitro-1-(2,4,6-triisopropilbencenosulfonil)-1,2,4-triazol
y se acopla con el alcohol R_{3}-OH para formar
los intermedios J1, J3 y J5. El grupo 2-clorofenilo
se retira por tratamiento con
piridina-2-aldoxima y
N,N,N,N-tetrametilguanidina en piridina húmeda (véase por
ejemplo P. J. Garegg, R. Johansson, I. Lindh y B. Samuelsson,
Carbohydr. Res. 1986, 150, 285-289).
Como alternativa, mediante el enfoque del
triéster fosfito, los intermedios alcohol I1, I2 o I3 se tratan con
fenil-cloro-N,N-diisopropilfosforamidito en
acetonitrilo para formar fosfoamiditos carbohidrato. Después de la
purificación por cromatografía, éstos se exponen a un alcohol
R_{3}-OH en presencia de un ácido medio, tal como
p-toluenosulfonato de piridinio y se tratan con hidroperóxido
de terc-butilo para formar los diésteres fosfato J1, J3 y J5
(PG_{3} = H) (H-N. Caro, M.
Martín-Lomas y M. Bernabé, Carbohydr. Res.
1993, 240, 119-131 y las referencias citadas en ese
documento).
Para una revisión de fosfodiésteres en síntesis
de ADN, véase Narang S, Tetrahedron, 1983, 39,
1-22 y D.W. Hutchinson, 1991, Capítulo 3 en
Chemistry of Nucleosides and Nucleoties, vol. 2, ed. B.
Townsend, Plenum Press, Nueva York, y todas la referencias citadas
en ese documento. Para otros ejemplos sobre síntesis del
fosfodiéster carbohidrato, véase por ejemplo Ichikawa Y, Sim M M,
Wong C H, J. Org. Chem. 1992, 57, 2943-2946
en Schmidt R R, Braun H, Jung K-H, Tetrahedron
Lett. 1992, 33, 1585-1588. Para la síntesis de
engarces fosfodiéster modificados, véase R.S. Varma, 1993,
Synlett, 621-636, y las referencias citadas
en ese documento.
Para obtener ésteres de ácido arilfosfónico y
amidas J1, J3 y J5, donde R_{3} es un grupo alquilo o aromático,
el ácido arilfosfónico R_{3}-PO_{3}H_{2} se
acopla a los intermedios de alcohol y I1, I2 o I3, por ejemplo, con
un reactivo carboodiimida, o mediante del tratamiento de los
dicloruros fosfónicos con los intermedios de alcohol I1, I2 o I3 en
piridina (T. H. Siddal III y C. A. Prohaska, J. Am. Chem.
1962, 84, 3467).
Los triésteres alquilfosfónicos se forman a
partir de trialquilfosfitos y haluros de alquilo mediante la
reacción de Arbuzov (Arbuzov, Pure Appl. Chem. 1964, 9,
307-335, J. March, Advanced Organic
Chemistry-Reaction Mechanisms, and Structure, 3ª
Ed. John Wiley & Sons, Nueva York, 347 (1985), y referencias
citadas en ese documento).
Para la preparación de triésteres aril fosfónicos
mediante tricloruro de fósforo, véase por ejemplo: K. Sasse,
Methoden der Organichem Chemie (Houben-Weyl),
4ª ed., Vol. 12/1, Georg Thieme, Stuttgart, 1963, p. 314 y p. 392 y
referencias citadas en ese documento; G. M. Kosolopoff, Org.
React. 6, 273 (1951), y referencias citadas en ese documento;
L.D. Freedman y G. O. Doak, Chem. Rev. 1957, 57, 479, y
referencias citadas en ese documento.
Para la preparación de triésteres arilfosfónicos
mediante reactivos de organomagnesio u organolitio, véase por
ejemplo: K. Sasse, Methoden der Organichen Chemie
(Houben-Weyl), 4ª ed. Vol. 12/1, Georg Thieme,
Stuttgart, 1963, p. 372, y referencias citadas en ese documento; G.
M. Kosolapoff, Org. React. 6, 273 (1951), y referencias
citadas en ese documento.
Los intermedios J1, J2, J3, J4, J5 y J6 se
desprotegen para formar los productos finales (Protective Groups
in Organic Synthesis, Editors T. W. Greene y P. G. M. Wuts, John
Wiley & Sons, Inc., Nueva York, 1991, y referencias citadas en
ese documento) y se transforman en sales sódicas o potásicas.
Esta justificado asumir que los compuestos
descritos anteriormente pueden interactuar con sitios en PapD
y otras chaperonas periplásmicas. Para establecer que éste es
realmente el caso, pueden realizarse ensayos parecidos a los
descritos en los ejemplos.
De esta forma, un compuesto preferido de la
invención es un compuesto como se describe más adelante, que provoca
la prevención, inhibición o mejora de la unión de
G1'-19'WT a PapD y/o provoca la prevención,
inhibición o mejora de la unión del péptido de fusión
MBP-Gl'-140' a PapD y/o
provoca la prevención, inhibición o mejora de la unión del péptido
G125'-140' (que tiene la secuencia SEC ID Nº: 20) a
PapD y/o pueden inhibir la restauración del complejo
PapD-PapG normalmente provocado por la adición de
PapD de acceso.
El ensayo usado para establecer que una sustancia
muestra uno de los efectos anteriores es preferiblemente uno de los
ensayos descritos en los ejemplos que se muestran en este documento.
Por supuesto, pueden utilizarse otros ensayos como los analizados
anteriormente en los procedimientos de la invención para establecer
que el compuesto realmente puede inhibir la unión al pilus.
Un punto importante que debería tenerse en cuenta
cuando se lleva a cabo un ensayo, es el papel que desempeñan la
chaperonas in vivo. Se unen a las subunidades de pilus
durante el transporte a lo largo de la membrana celular de la
subunidades y por lo tanto se asume que las subunidades de pilus
están más o menos sin plegar, (es decir, no en su conformación
plegada final) cuando se unen a la chaperona. Se ha observado por
parte de los inventores que la cinética de la unión entre
subunidades de pilus completamente plegadas (o análogos de las
mismas) y la chaperona PapD está un procedimiento lento,
aunque se sabe que el procedimiento de la unión al pilus es
relativamente rápido in vivo. Para acelerar la velocidad de
unión del complejo chaperona/subunidad de pilus in vitro, se
contempla que podrían imponerse condiciones desnaturalizantes más o
menos severas en las subunidades de pilus (o análogos de las mismas)
antes del ensayo. Tal desnaturalización podría obtenerse sometiendo
las subunidades de pilus a una fuerza física (por ejemplo a una
temperatura elevada, cambios de presión, radicación, etc). o a
cambios en el medio químico (por ejemplo cambios en la fuerza
iónica, cambios en el pH o la adición de compuestos
desnaturalizantes o compuestos que reducen la cantidad de
disulfuro).
La expresión "compuesto desnaturalizante" se
refiere a un compuesto que cuando está presente en forma de uno de
los solutos en una fase líquida que comprende moléculas
polipeptídicas puede desestabilizar los estados plegados de las
moléculas polipeptídicas lo que lleva a un no plegamiento completo o
parcial de las cadenas polipeptídicas. El efecto desnaturalizante
ejercido por un compuesto desnaturalizado aumenta cuando aumenta la
concentración del compuesto desnaturalizante en la solución, pero
además puede mejorarse o moderarse debido a la presencia de otros
solutos de la solución, o mediante cambios en los parámetros
físicos, por ejemplo temperatura o presión.
Como ejemplos de compuestos desnaturalizantes
adecuados para uso pueden mencionarse urea,
guanidina-HCl, di-alquilformamida
C_{1}-C_{6} tales como dimetilformamida y
di-alquilsulfonas
C_{1}-C_{6}.
Son ejemplos de compuestos que reducen el nivel
de disulfuro, disulfuro de glutation
il-2-tiopiridilo, disulfuro de
2-tiocolil-2-tiopiridilo,
disulfuro de
2-mercaptoetanol-2-tiopiridilo
y disulfuro de
mercaptoacetato-2-tiopiridilo.
Una serie de observaciones confirman la
suposición de que las subunidades de pilus están más o menos sin
plegar aunque están unidas a la chaperona: como se describen en
Kuehn y col., 1991, es posible restaurar el complejo
PapD-PapG después de la desnaturalización
añadiendo un exceso de PapD. Además, los resultados
preliminares obtenidos por electroforesis capilar demuestran que la
desnaturalización de la proteína de fusión
MBP-G1'-140' proporciona una forma
sencilla de la proteína de fusión, mientras que las dos formas de la
proteína de fusión se observan en la electroforesis capilar antes de
la desnaturalización; una importante que no puede interactuar con
PapD y una inferior que puede interactuar con PapD es
capaz de interactuar con PapD. Por lo tanto se contempla que la
proteína de fusión desnaturalizada puede servir como sustrato
superior en los diferentes ensayos competitivos descritos en este
documento igual que lo hace la forma no desnaturalizada de la
proteína de fusión.
De esta forma, en una realización preferida de la
invención, el compuesto de la invención provoca la prevención,
inhibición o mejora de la unión de una forma desnaturalizada de una
subunidad de pilus o de un análogo de la misma a PapD, y/o
provoca la prevención, inhibición o mejora de la unión de la forma
desnaturalizada de MBP-G1'-140' a
PapD y/o provoca la prevención, inhibición o mejora de la
unión de una forma desnaturalizada de G125'-140' a
PapD.
Como se observará a partir de los ejemplos, los
compuestos que pueden interactuar con PapD y otras chaperonas
ya se han identificado y sintetizado. Estos compuestos que son todos
piranósidos también son una parte importante de la invención:
2,3-O-Dibenzoil-4-O-bencil-1-tio-\beta-D-glucohexopiranósida
de etilo;
6-O-Acetil-2,3-O-dibenzoil-4-O-bencil-1-tio-\beta-D-glucohexopiranósido
de etilo;
6-O-Acetil-2,3-O-dibenzoil-4-O-bencil-\beta-D-glucohexopiranósido
de metilglicolilo;
4-O-Bencil-\beta-D-glucopiranósido
de 2-(hidroxi) etilo;
4-O-Bencil-\beta-D-glucohexopiranósido
de glicolil sódico;
2-O-Etil-4,6-O-(4'-metoxi)fenilmetilen-\alpha-D-mannohexopiranósido
de metilo;
2-O-Etil-3-O-dimetil-t-butilsilil-4,6-O-(4'-metoxi)fenilmetilen-\alpha-D-mannohexopiranósido
de metilo;
2-O-etil-3-O-dimetil-t-butilsilil-4,-O-(4'-metoxi)-bencil-\alpha-D-mannohexopiranósido
de metilo;
2-O-Etil-3-O-dimetil-t-butilsilil-6-O-(4'-metoxi)-bencil-\alpha-D-mannohexopiranósido
de metilo;
2-O-Etil-3-O-dimetil-t-butilsilil-4,-O-(4'-metoxi)-bencil-6(S)-fenil-\alpha-D-mannohexopiranósido
de metilo;
2,3-Anhidro-4,6-O-p-metoxibenciliden-\alpha-D-mannopiranósido
de metilo;
3-Azido-4,6-O-p-metoxibenciliden-\alpha-D-altropiranósido
de metilo;
3-Azido-2-O-etil-4,6-O-p-metoxibenciliden-\alpha-D-altropiranósido
de metilo;
3-Azido-3-desoxi-2-O-etil-4-O-p-metoxibencil-\alpha-D-altropiranósido
de metilo;
3-Azido-6-O-benzoil-3-desoxi-2-O-etil-4-O-p-metoxi-bencil-\alpha-D-altropiranósido
de metilo;
Sal sódica de
6-O-benzoil-3-desoxi-2-O-etil-4-O-p-metoxibencil-3-sulfamino-\alpha-D-altropiranósido
de metilo;
Sal de amonio de
6-O-benzoil-3-desoxi-2-O-etil-3-sulfamino-\alpha-D-altropiranósido
de metilo;
3-Azido-6-O-pivaloil-3-desoxi-2-O-etil-4-O-p-metoxi-bencil-\alpha-D-altropiranósido
de metilo;
Sal sódica de
6-O-pivaloil-3-desoxi-2-O-etil-4-O-p-metoxibencil-3-sulfamino-\alpha-D-altropiranósido
de metilo;
Sal de amonio de
6-O-pivaloil-3-desoxi-2-O-etil-3-sulfamino-\alpha-D-altropiranósido
de metilo;
6-O-pivaloil-3-desoxi-2-O-etil-4-O-p-metoxibencil-3-t-butiloxamido-\alpha-D-altropiranósido
de metilo;
Sal de amonio de
6-O-pivaloil-3-desoxi-2-O-etil-3-oxamido-\alpha-D-altropiranósido
de metilo;
3-Azido-6-O-pirrol-3'-ilcarboxil-3-desoxi-2-O-etil-4-O-p-metoxibencil-\alpha-D-altropiranósido;
y
Sal de amonio de
6-O-pirrol-3'-ilcarboxil-3-desoxi-2-O-etil-3-sulfamino-\alpha-D-altropiranósido
de metilo.
Por supuesto, también son posibles otros
compuestos en forma de interactores con sitios de chaperonas. Como
es evidente a partir del ejemplo 7, los péptidos modificados también
pueden ser útiles en los procedimientos de la invención.
Como será evidente a partir de lo indicado
anteriormente, la identificación de un sitio en la chaperona que
puede estar afectado de forma interfiere con la agrupación de pilus
es un punto de partida importante en los procedimientos descritos en
este documento para la identificación, aislamiento y síntesis de
compuestos que pueden interactuar con chaperonas periplásmicas.
De esta forma la invención también se refiere a
un procedimiento para identificar un sitio de unión en una chaperona
molecular, que comprende:
co-cristalizar la chaperona
molecular periplásmica o un análogo de la misma con un ligando de
unión a la chaperona molecular periplásmica o al análogo de la
misma,
resolver la estructura tridimensional de la
interacción chaperona/ligando, resolviendo por tanto la estructura
tridimensional de la chaperona molecular periplásmica o el análogo
de la misma cuando se une al ligando,
determinar los puntos de los sitios implicados en
la interacción intermolecular entre la chaperona molecular
periplásmica o el análogo de la misma y el ligando, e
identificar los puntos de los sitios determinados
de esta forma de la chaperona molecular periplásmica o del análogo
de la misma como sitio de unión en la chaperona molecular
periplásmica o análogo de la misma.
Por el término "ligando", como se usa en
este documento se entiende una sustancia que muestra la unión a un
huésped o molécula receptora (en su conexión con una chaperona). La
unión no es una interacción no específica, lo que significa que
existe un motivo de unión entre el ligando y el huésped o molécula
receptora. En otra palabras, cuando se ponen en contacto una muestra
del ligando y una muestra del huésped o molécula receptora, los
complejos formados entre el ligando y el huésped o molécula
receptora reflejarán sustancialmente todos las mismas interacciones
intermoleculares.
Como se ha mencionado anteriormente, una
realización de la invención es administrar una sustancia que pueda
prevenir, inhibir o mejorar la unión entre las subunidades de pilus
y las chaperonas moleculares.
Por consiguiente, la invención se refiere a una
composición farmacéutica, que comprende, como compuesto activo, una
sustancia que puede interactuar con al menos un tipo de chaperona
molecular periplásmica que une las subunidades de pilus durante el
transporte de esas subunidades de pilus a lo largo del espacio
periplásmico y/o durante el procedimiento de unión de los compuestos
de pilus intacto, de tal forma que la unión de las subunidades de
pilus a la chaperona molecular periplásmica se previene, inhibe o
mejora, en combinación con al menos un vehículo o excipiente
farmacéuticamente aceptable. Preferiblemente, tal sustancia es una
sustancia de acuerdo con la invención o una sustancia
identificada/diseñada de acuerdo con los procedimientos de la
invención.
De esta forma los agentes farmacéuticos
analizados en este documento son, de acuerdo con la invención, para
el tratamiento y/o profilaxis de las mismas afecciones que las
analizadas cuando se describe el procedimiento de tratamiento de la
invención y provocadas por las mismas especies bacterianas.
Por lo tanto, una composición farmacéutica, que
comprende, como compuesto activo, un sustancia usada en los
procedimientos terapéuticos de la invención, una sustancia de
acuerdo con la invención o una sustancia identificada de acuerdo con
los procedimientos de la invención, en combinación con al menos un
vehículo excipiente farmacéuticamente aceptable, es una parte de la
invención.
Tales composiciones farmacéuticas de la invención
también podrían comprender al menos una sustancia farmacéutica
adicional, que entre otros podrían mejorar los efectos farmacéuticos
ejercidos por la sustancia de la invención o la sustancia
identificada de acuerdo con la invención.
Las sustancias farmacéuticas adicionales podrían
ser hormonas esteroideas, desinfectantes,
anti-piréticos, etc. Preferiblemente tal sustancia
adicional podría ser un agente anti-bacteriano.
Tal agente antibacteriano podría seleccionarse
convenientemente entre el grupo compuesto por penicilinas,
cefalosporinas, aminoglicósidos, sulfonamidas, tetraciclinas,
cloranfenicol, polimixinas, fármacos antimicobacterianos y
antisépticos urinarios.
La invención también se refiere a una sustancia
empleada en los procedimientos de la invención así como a una
sustancia de la invención y a una sustancia identificada de acuerdo
con los procedimientos de la invención para uso como agente
farmacéutico. Se prefiere que el agente farmacéutico sea para
tratamiento anti-bacteriano y/o profilaxis,
especialmente tratamiento y/o profilaxis de enfermedades causadas
por bacterias que forman subunidades de pilus que se adhieren al
tejido, y se prefiere especialmente que el agente farmacéutico sea
para el tratamiento y/o profilaxis de la infección del tracto
urinario.
Finalmente, la invención se refiere al uso de una
sustancia empleada en los procedimientos de la invención así como a
una sustancia de la invención y a una sustancia identificada de
acuerdo con los procedimientos de la invención para la preparación
de una composición farmacéutica para el tratamiento y/o profilaxis
de una infección bacteriana.
Fig. 1: PapD se une a los péptidos
relacionados con subunidades de pilus recubiertos en placas de
microtitulación ELISA y en solución. Las secuencias de los péptidos
purificados sintéticos usados en este estudio se describen por
separado en Flemmer K, Walse B. Roy S, y Kihlberg J. A y B: los
péptidos de la tabla 1 se recubrieron en pocillos de microtitulación
y se ensayaron con respecto a su capacidad para unirse a PapD
en un ensayo ELISA descrito en el ejemplo 2. Se disolvieron péptidos
insolubles en agua en ácido acético (AA) al 2,5% que no tuvo efecto
en la unión de G1'-19'WT a PapD en este
ensayo. Cada gráfico representa la media de pocillos duplicados.
Fig. 2: La unión de péptidos relacionados con
subunidades de pilus proporciona protección contra proteolisis
enzimática y bloquea la unión de PapD a PapG.
A Superior: PapD (15 \mug) se incubó con
PBS (calle D) o con 1,5 \mug de tripsina (calle D y Tr) a 37ºC
durante 20 minutos y se aplicó a SDS-PAGE al 20%.
Se identificaron bandas teñidas con azul de Coomassie
correspondientes a PapD de longitud completa (PapD),
tripsina (Tr, el fragmento NH_{2}-terminal de
PapD (N), y el fragmento COOH-terminal de
PapD que comienza el residuo 100 (C).
A Inferior: el porcentaje de escisión de tripsina
de PapD disminuyó después de la preincubación con los
péptidos G1'-19'WT, G1'-16'WT o
K1'-19'WT, pero el péptido
G2'-21'amida no tuvo efecto. Se preincubaron 50
\mug de PapD purificado durante 15 minutos a 25ºC con un
exceso molar de 20 veces de péptidos
G1'-19'-WT,
G1'-16'WT, K1'-19'Wt o
G2'-21'amida (cualquier sitio de escisión de
tripsina en estos péptidos se produce en sus extremos amino donde se
pronosticó que no interferían con PapD), o un equivalente
molar de agua. Después, cada muestra se incubó a 37ºC con 3,2 \mug
de tripsina. Las alícuotas se retiraron después de 0,5, 10, 20, 30 y
40 minutos y se hirvieron en un tampón de muestra
SDS-PAGE para interrumpir la digestión. Las
muestras se aplicaron a geles SDS-PAGE al 15% y la
cantidad de PapD de longitud completa restante se determinó
por densitometría de bandas teñidas con azul de Coomassie
correspondientes a PapD de longitud completa que se
muestran.
B: PapD incubado con la
G1'-19'WT, G1'-16'WT,
K1'-19'WT y G2'-21'amida se añadió a
PapD-PapG desnaturalizada reducida y la
cantidad del complejo PapD-PapG restaurado en
cada muestra se cuantificó como se describe en el ejemplo 2. El % de
inhibición representa la cantidad del complejo
PapD-PapG restaurado con PapD tratado
con péptido en comparación con la cantidad del complejo
PapD-PapG restaurado con PapD no
tratado. El gráfico representa la media de 4 experimentos.
PapD y el complejo PapD-PapG se
prepararon como se describe en F. Lindberg y col, J.
Bacteriol. 171, 6052 (1989) y S. J. Hultgren y col.,
Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 86, 4357 (1989).
Fig. 3 Vista estereoscópica de la estructura
tridimensional de PapD co-cristalizada con el
péptido G1-19WT determinado a una resolución de 3,0
\ring{A}. El péptido se une en una conformación extendida a lo
largo de la cadena G1 \beta en la hendidura de PapD con el
grupo carboxilato terminal formando enlaces de hidrógeno con restos
Arg-8 y Lys-112 de PapD.
Fig. 4 Vista estereoscópica de la densidad de
electrones a una resolución de 3,0 \ring{A} del extremo COOH del
péptido G1-19WT y los restos PapD cercanos
superpuestos en la estructura refinada. El mapa de densidad de
electrones se calculó con coeficientes (2 |Fo|-|Fc|) y se
contabilizó en 1s.
Fig. 5 Vista estereoscópica de un complejo
PapD-péptido que muestra su interacción con un complejo o no
cristalográficamente relacionado dos veces.
Fig. 6 Superposición de los dominios
COOH-terminal de PapD nativo (líneas gruesas)
y PapD complejado (líneas finas) que muestra 13º de
diferencia en el ángulo de plegamiento en bisagra entre las dos
estructuras. Las estructuras se superpusieron usando el programa O
opción LSQ. Los rms resultantes para átomos de 98 Ca del dominio
COOH terminal fueron de 0,66 \ring{A}.
Fig. 7: Capacidad de mutantes
Arg-8, Lys-112 y
Thr-7 de PapD para unir PapG y
restaurar el complejo PapD-PapG in
vitro. Se redujeron 0,4 \mug del complejo
PapD-PapG y se desnaturalizó como se describe
en la fig. 2B. Después, el complejo
PapD-PapG desnaturalizado se diluyó con
0-630 ng de PapD purificado mutante o de tipo
silvestre (WT). La cantidad de PapD-PagG
restaurada en las muestras se determinó como en la fig. 2B y se
estableció en un gráfico como porcentaje de la cantidad más grande
PapD-PapG restaurado. Los valores indicados
en el gráfico representan la media de 3 experimentos. PapD
mutante o de tipo silvestre y el complejo
PapD-PapG se purificaron como se describe en
F. Lindberg y col, J. Bacteriol. 171, 6052 (1989) y S. J. Hultgren y
col., Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 86, 4357 (1989).
Fig. 8: 6-hidroxidopamina, hdo_0,
y otros miembros de la familia hdo. Se usó hdo_0 como punto de
partida para la construcción de una familia de compuestos que
pretenden unirse al sitio de unión de PapD. hdo_4:
"Arilo" indica 3,4-dihidroxifenilo.
hdo_6: "Arilo" es un grupo
3,4-dihidroxifenilo.
hdo_7: "Arilo" es un grupo
3-hidroxifenilo.
hdo_8: "Arilo" es un grupo
3-nitrofenilo.
hdo_9: "Arilo" es un grupo fenilo.
Fig. 9 La familia hdo y su interacción con
PapD.
A: "Arilo" es un grupo fenilo, un anillo
heteroaromático, o un grupo fenilo sustituido con sustituyentes
polares no simétricos para obtener por un lado contacto hidrófobo
con la proteína y por otro lado interacción con el agua del
disolvente.
B: Ejemplos de "arilo" donde R es hidrógeno
o alquilo; "X" es un átomo de oxígeno, un átomo de azufre, o un
grupo amino; y "CG" es un grupo cargado negativamente, tal como
un grupo carboxilo, un grupo tetrazoílo, un grupo fosfato, un éster
fosfato o un grupo sulfato.
C: Ejemplos del grupo CG.
Fig. 10: Esquema de reacción general para la
producción de diversos miembros de la familia hdo.
Fig. 11: Esquema de reacción general para la
producción de diversos miembros de la familia bpy.
Fig. 12: Esquema de reacción general para la
producción de diversos miembros de la familia bpy.
Fig. 13: Esquema de reacción general para la
producción de diversos miembros de la familia bpy.
Fig. 14: Esquema de reacción general para la
producción de diversos miembros de la familia bpy.
Fig. 15: Esquema de reacción general para la
producción de diversos miembros de la familia bpy.
Fig. 16: Esquema de reacción general para la
producción de diversos miembros de la familia bpy.
Fig. 17: Gráfico sobre el efecto inhibidor de
diferentes longitudes de los fragmentos del péptido
C-terminal de PapG en la unión entre
PapD y la proteína de fusión
MBP-G1'-140'.
El fragmento G1'-8' muestra un
efecto inhibidor significativamente más alto en la unión que los
fragmentos G1'-6' y G1'-7' más
cortos.
Fig. 18: Gráficos sobre el efecto inhibidor de
diferentes análogos de G1'-8' (donde los 8 residuos
aminoacídicos a la vez se han reemplazado por serina (S) 0 alanina
(A)) en la unión entre PapD y la proteína de fusión
MBP-Gl'-140'.
El efectos de los reemplazamientos de los restos
4', 5' y 6' en G1'-8' revela que los restos son
importantes en la interacción con PapD, ya que el reemplazo
de estos residuos da lugar a péptidos menos inhibidores.
Fig. 19: Gráficos sobre el efecto inhibidor de
diferentes análogos de G1'-8' (donde los 8 residuos
aminoacídicos a la vez se han suprimido simultáneamente con la
adición de una serina N-terminal) en la unión entre
PapD y la proteína de fusión
MBP-G1'-140'.
También en este experimento, el significado de
los restos de aminoácido 4', 5' y 6' se enfatizan, ya que las
deleciones de estas posiciones dan lugar a péptidos que son menos
inhibidores.
Fig. 20: Construcciones de la fusión MBP/G,
péptidos sintéticos y truncados con PapG usados en el ejemplo
10.
El cuadrado abierto indica la secuencia primaria
de PapG. Se muestran las posiciones de los cuatro restos Cys.
La barra sombreada representa MBP. Los restos del principio y del
final de PapG fusionado en el extremo COOH de MBP se indican
para cada fusión. El resto del final para cada PapG-truncado
también se indica. Se indican los nombres de las proteínas de fusión
MBP/G. En la parte más baja de la figura, se indican los recuadros
rellenos que localizan los sitios interactivos de PapD y las
secuencias de los cuatro péptidos usadas en el ejemplo (véase
también SEC ID Nº: 19-22).
Fig. 21: Interacciones de PapD-MBP/G in
vivo.
Se sometieron extractos periplásmicos que
contienen PapD y cada fusión de MBP/G a cromatografía por
afinidad de amilosa. Los eluidos se analizaron en A) un gel de
poliacrilamida SDS teñido con azul de Coomassie al 12,5%; B) una
transferencia de western usando un antisuero anti-PapD; o C)
un gel IEF teñido con plata. En la figs. 21A, B y C, las muestras se
purificaron a partir de extractos periplásmicos que contenían
PapD y MBP (calle 1), PapD y
MBP-G1'-19' (calle 2), PapD y
MBP-G1'-81' (calle 3), PapD y
MBP-G1'-140' (calle 4). Se indica la
posición de PapD co-purificado. MBP sola y
truncada de fusión de MBP/G también se
co-purificaron con las fusiones de MBP/G. El peso
molecular de las bandas de migración más bajas en
SDS-PAGE corresponden a cada longitud de la proteína
de fusión MBP/G. En el gen IE F (C) pueden observarse diversas
bandas para las mismas reacciones. Se detectó una única banda pI 5,2
en la fig. 2C, calle 4. Esta banda se extrajo, se hirvió en tampón
de muestra SDS y se analizó mediante transferencia de western con
antisuero anti-PapD y anti-MBP. Estaba
compuesto tanto de MBP-G1'-140' como
de PapD (Fig. 2D, calle 1).
Fig. 22: Inhibición de la función de la chaperona
mediante la expresión de fusiones MBP/G in vivo.
Las cepas que llevan pFJ22 (papDJKEFGA) y
plásmidos que codifican las fusiones MBP/G se indujeron con IPTG 1
mM. Los extractos periplásmicos que contenían subunidades de pilus y
MBP (calle 1), o MBP-G1'-19' (calle
2), o MBP-G1'-81' (calle 3), o
MBP-G1'-140' (calle 4) se analizaron
mediante transferencia de western usando un antisuero
anti-PapA (A), o un antisuero
anti-PapD-PapG (B), o un
anti-suero contra fibrillas terminales (C). En este
ensayo, la presencia de la subunidad indica que las interacciones
entre chaperona-subunidad producidas a partir de las
subunidades se degradan en ausencia de una interacción con la
chaperona. Obsérvese que la presencia de las subunidades
PapA, PapG y PapF disminuye significativamente
cuando se co-expresan con
MPB-G1'-140'.
Fig. 23: Unión de PapD a proteínas de
fusión MBP/G in vitro.
(A) PapD se incubó con 1 \mug de MBP
purificado con afinidad a amilosa (calle),
MBP-G1'-19' (calle 2),
MBP-G1'-81' (calle 3), o
MBP-G1'-140' (calle 4) y la
formación del complejo se evaluó en un gel IEF teñido con plata. Se
indican las posiciones de las fusiones MBP/G, PapD y el
complejo
PapD-MBP-G1'-140'.
(B) Se recubrieron proteínas de fusión MBP/G
purificadas con afinidad a la amilosa en pocillos de placa de
microtitulación. Se indica la concentración de las proteínas MBP/G
en los pocillos. La unión de 50 pmol/50 ml de PapD a las
proteínas inmovilizadas se determinó mediante el ensayo ELISA usando
un antisuero anti-PapD.
Fig. 24: Identificación del complejo
PapD-PapG2 truncado mediante electroforesis
de gel nativo ácido.
El periplasma que contiene PapD y
PapG, PapG2 o PapG3 (calle 2, 3 y 4
respectivamente) se sometió a cromatografía Gal
\alpha(1-4) Gal y se analizaron ocho
eluidos en electroforesis de gel nativo ácido después de la
transferencia de western usando antisueros anti-PapD (A) y
anti-PapD (B). El complejo PapD- PapG
purificado se cargó en la calle 1.
Fig. 25: Caracterización de un segundo sitio en
PapG reconocido por PapD.
Se recubrieron cuatro péptidos sintéticos que
superponían la región PapG del resto 156' a 120' (indicado en
la Fig. 20) en pocillos de placa de microtitulación). Se indica la
concentración de cada péptido en los pocillos. La unión de 200
pmol/50 ml de PapD al péptido inmovilizado se determinó
mediante el ensayo ELISA usando antisuero anti-PapD.
PapD se preparó como se describe por A.
Holmgren y col. en J. Mol. Biol. 203, 279 (1988) y se
obtuvo a partir del Departamento de Microbiología Molecular,
Washington University School of Medicine, St. Louis, Estados
Unidos.
El péptido G1'-19'WT se preparó
usando síntesis en fase sólida de Fmoc seguido de purificación por
HPLC de fase inversa. El péptido se obtuvo del Departament of
Chesmistry, University of Lund, Lund, Suecia. La tabla 1 indica los
péptidos usados en el ensayo de unión en esta solicitud.
En la presente solicitud, los restos de
aminoácido o fragmentos peptídicos que se originan a partir de otros
péptidos en lugar de PapD (por ejemplo de PapG o de
PapK) se indicaran con ', por ejemplo
"G1'-19'WT" o "Pro-1' ",
para distinguir tales restos de los restos de aminoácido de
PapD. Además, la numeración es del extremo
C-terminal del péptido que no es PapD, es
decir G1'-19' indica los 19 restos de aminoácido de
terminal de PapG.
Se obtuvieron cristales del complejo
PapD-péptido mediante difusión de vapor contra PEG8000 al
20%, tampón cacodilato 0,1 M a pH 5,0, y acetato de calcio 0,2 M.
Las gotas de cristalización contenían los mismos volúmenes del
depósito y de las soluciones proteicas. La solución proteica (17
mg/ml) contenía una relación molar 1:1 entre PapD y el
péptido en MES 20 mM (ácido 2-[N-morfolino]etano
sulfónico) a pH 6,5 con glucósido \beta-octilo al
1,0%.
Los cristales obtenidos del complejo entre
PapD y la proteína se colocaron dentro de tubos capilares de
cuarzo-vidrio e inicialmente se caracterizaron
examinándolos en una cámara de precisión de rayos X obteniendo por
lo tanto imágenes del modelo de difracción de rayos X en la película
fotográfica que representa imágenes espacialmente no distorsionadas
del enrejado recíproco de los cristales. Usando análisis
convencionales de las imágenes, se determinó que los cristales
tenían un grupo de espacio monoclínico, C2, con dimensiones
celulares: a = 130,7 \ring{A}, b = 83,5 \ring{A}, c = 59,2
\ring{A} y \beta= 117,2º, dos moléculas en la unidad asimétrica
y que presentan difracción a una resolución de 2,9 \ring{A} en una
fuente de rayos X de laboratorio con un ánodo giratorio y objetivo
de Cu K_{\alpha }.
Para resolver la estructura atómica de moléculas
mediante cristalografía de rayos X, tienen que medirse las
posiciones e intensidades de la máxima de difracción. Los datos de
intensidad para los cristales de PapD-péptido se recogieron
en un sistema de detector de área multicable
Huong-Hamlin (Xuong y col., 1985). Todos los datos
se obtuvieron a partir de un único cristal e inicialmente el
procesamiento se realizó usando el paquete de software MADNES
(Messerschmit y Pflugrath, 1987). La fusión y la ampliación a escala
de los datos se realizó usando ROTAVATA y AGROVATA a partir del
paquete CCP4 (véase CCP4, The SERC (UK) Collaborative Project No.4,
A Suite of Programs for Protein Crystallography, Darebury
Laboratory, UK). El conjunto de datos finales contenían 9592
reflexiones independientes con un Rsym del 6,8% para los datos entre
20,0 y 3,0 \ring{A} de resolución
(Rsym = SS
\frac{(|I_{hi}| - |I_{h}|)}{S_{hi}
I_{hi}},
donde I_{hi} e I_{h} son las
intensidades de los factores individuales y de estructura media,
respectivamente).
La estructura del complejo PapD-péptido se
resolvió usando el programa XPLOR que realiza el procedimiento
convencional de reemplazo molecular. El modelo de búsqueda usado fue
la estructura de resolución refinada de 2,0 \ring{A} de
PapD. Usando los datos de resolución entre 8,0 \ring{A} y
4,0 \ring{A}, la función de auto-rotación
proporcionó un eje doble plegado no cristalográfico transparente, y
los dos picos más altos de la interrotación dieron la solución
exacta que se mejoró usando el refinamiento de correlación de
Patterson (PC). La solución correcta también se obtuvo a partir los
picos más altos en las funciones de traducción, siendo el factor R
del 39,0% para los datos de resolución de 8,0 a 4,0 \ring{A} (el
factor R definido como
factor R =
\frac{S(|Fo| - |Fc|)}{S
Fo},
El refinamiento se obtuvo con un posterior
refinamiento del cuerpo rígido en el que los cuatro dominios de las
dos moléculas PapD en la unidad asimétrica se dejaron refinar
dando lugar de forma independiente a un factor R del 36,4% para los
mismos datos.
El examen de un mapa de densidad de electrones
|Fo| - |Fc| a este nivel usando el programa de gráficos 0 mostró una
clara densidad correspondiente al péptido en la hendidura de
PapD y a lo largo de la superficie de la proteína. La
orientación del péptido se determinó fácilmente a partir de la
densidad del electrón, pero inicialmente sólo pudo modelarse en
cuanto a la densidad 10 aminoácidos C-terminal
finales del péptido.
En esta etapa se inició un refinamiento de
templado simulado con XPLOR. Se realizaron diversos ciclos
adicionales del modelo de construcción y refinamiento añadiéndose 4
aminoácidos peptídicos adicionales para producir un factor R para el
actual modelo del 18,2% para datos de resolución de 8,0 a 3,0
\ring{A}. El modelo en la presente etapa de refinamiento (que no
contiene moléculas de agua y que no incluye los 5 primeros
aminoácidos N-terminal del péptido) tiene
derivaciones de media cuadrática (rms) de geometría ideal de 0,020
para longitudes de enlaces y de 4,2º para ángulos de enlaces.
Se observa que el péptido se une en una
conformación amplia con la pro-1'
C-terminal anclada en la hendidura del interdominio
y sitio de unión de la subunidad propuesto (6). Los enlaces de
hidrógeno se forman entre los extremos carboxi peptídicos y dos
restos cargados positivamente invariantes de PapD,
Arg-8 y Lys-112. Ahora la
mutagénesis dirigida al sitio ha confirmado que
Arg-8 y Lys-112 son esenciales para
la unión de subunidades de pilina tanto in vitro como en
in vivo (cf. ejemplo 2). La cadena lateral
Pro-1' hace contactos van der Waals en la hendidura
con restos de ambos dominios de PapD: Thr-7,
Thr-152, Ile-154,
Thr-170 y Ile-194. El resto
peptídico próximo, Phe-2', se encuentra en una
cavidad poco profunda formada entre las lámina \beta y el dominio
N-terminal y realiza interacciones hidrófobas con
Leu-4, Thr-7,
Thr-109 e Ile-111. Después, el
péptido recorre la superficie del dominio
N-terminal, formando una interacción paralela de
cadena \beta con la cadena G1. De esta manera, se forman 7 enlaces
de hidrógeno de cadena principal entre Met-8' y
Phe-2' del péptido y entre Gln-104 y
Lys-110 de PapD, ampliándose de esta forma la
lámina \beta de PapD en el péptido.
Además de los restos C-terminal
Phe-2' y Pro-1', hay relativamente
pocos contactos entre las cadenas laterales del péptido y
PapD. Las interacciones principales se proporcionan mediante
enlaces de hidrógeno de cadena principal a la cadena G1. Sin
embargo, hay diversas interacciones hidrófobas en la lámina \beta,
en particular entre Met-8' y
Met-6'del péptido con Leu-103,
Ile-105 y Leu-107 de cadena G1.
Los cálculos revelaron que las cuatro cadenas
laterales peptídicas hidrófobas de los restos 2', 4', 6' y 8'
aportan el 20% del área superficial oculta total (582
\ring{A}^{2}) entre el péptido y la proteína. Por lo tanto,
incluso aunque la principal estabilización del complejo se
proporciona mediante la unión de hidrógeno, las interacciones
hidrófobas no son insignificantes y se cree que proporcionan parte
de la explicación para la especificidad de PapD para péptidos
y subunidades relacionados con pilus. La base experimental de esta
teoría se posiciona mediante la unión reducida de PapD al
péptido G2'-21' amida en comparación con el péptido
G1'-19'WT (Fig. 1B y tabla C). La unión de hidrógeno
del extremo COOH de la G2'-21' amida (que carece de
Pro-1') a Arg-8 y
Lys-112 de PapD permite la unión de hidrógeno
de cadena principal, pero trastoca las cuatro cadenas laterales
hidrófobas en el péptido a partir de sus subsitios en PapD,
dando lugar a una reducción de la resistencia de la unión.
En el cristal, la lámina \beta
PapD-péptido se amplió incluso aún más como resultado de una
simetría plegada dos veces no cristalográfica que colocó un segundo
complejo PapD-péptido adyacente al primero de forma que la
dos cadenas peptídicas unidas interactuaron como cadenas \beta
antiparalelas. En el presente modelo, se forman ocho enlaces de
hidrógeno de cadena entre los dos péptidos; véase la siguiente
tabla:
De esta forma, se crea una lámina \beta
mezclada entre los dos complejos y alcanza más de 10 cadenas \beta
(Fig. 5). No se observan contactos entre las dos moléculas
PapD no relacionadas cristalográficamente, las cuales se
colocaron en medios similares en el cristal y poseían un número
similar de contactos intermoleculares. El área superficial oculta
calculada entre los dos péptidos no relacionados
cristalográficamente fue de 520 \ring{A}^{2}, un valor similar
al del área superficial oculta entre la proteína y el péptido. Esta
"dimerización" parece ser una consecuencia del envasado de
cristal, ya que todas las pruebas muestran que PapD forma
complejos monoméricos con péptidos y con PapG intacto en
solución.
El modelo de unión de hidrógeno entre PapD
y el péptido se rompe en Ser-9', aunque el péptido
permanece en contacto van der Waals con PapD hasta
Ser-11' donde el péptido se dirige más allá del
bucle F1-G1, pero el hidrógeno permanece unido al
péptido no relacionado cristalográficamente hasta
Glu-13' (tabla B). El último aminoácido resuelto del
péptido es Gly-14' que se coloca cerca de la
hendidura de unión del PapD no relacionado
cristalográficamente. Los primeros cinco aminoácidos terminales,
incluyendo tres restos cargados positivamente, no tuvieron densidad
y por lo tanto deben de haberse desordenado en la estructura de
cristal. De acuerdo con esto, el extremo amino del péptido no es
importante para la unión a PapD en la solución, ya que se ha
descubierto que el péptido G1'-7'WT que carece de
los doce aminoácidos amino terminal es un inhibidor eficaz de la
unión de PapD al péptido G1'-19'WT
inmovilizado (tabla C y ejemplo 2).
Las estructuras de los dominios PapD
individuales en el complejo peptídico son esencialmente las mismas
que PapD nativo (Holmgren y Branden, 1989). Sin embargo,
existe un movimiento significativo de los dominios con respecto a
los dominios entre sí haciendo el movimiento de plegamiento en
bisagra de 13º o el cierre en mandíbula que el ángulo del bumerang
de PapD sea más agudo (Fig. 6). Independientemente de que
este cambio conformacional sea o no el resultado de la unión del
péptido o de diferentes cristales, el envasado entre las dos
estructuras de cristal no está claro.
En la estructura PapD natural, la densidad
del electrón obtenida para el bucle F1-G1 largo es
escasa entre los residuos 96 y 102, lo que sugiere que es poco
flexible y está desordenado en el cristal. En el complejo peptídico,
sin embargo, este bucle se resuelve mejor, lo que indica que la
unión del péptido hace que este bucle sea más rígido. La
superposición de los dominios NH_{2}-terminal de
PapD nativo y el complejo peptídico demuestra que también
existe una diferencia significativa en la posición del bucle
F1-G1 entre las dos estructuras (rms para los 110
átomos C\alpha NH_{2}-terminal es de 1,84
\ring{A}, con un movimiento de cadena principal máximo de
aproximadamente 9 \ring{A} para Leu-103). En el
complejo peptídico, se observa que el bucle se enrolla en un extremo
lejos del barril \beta del dominio
NH_{2}-terminal facilitando de esta forma un
contacto más amplio entre la cadena G1 y el péptido. Como con el
plegamiento en bisagra de los dos dominios, todavía no posible decir
con exactitud si el cambio del bucle es una consecuencia de la unión
peptídica o del envasado del cristal; la gran conformación abierta
del bucle F1-G1 sugiere que puede ser en gran parte
el último. Sin embargo, se proporcionan pruebas de que la
interacción similar entre PapD y péptidos o subunidades de
pilus se produce en solución mediante experimentos de protección de
proteasa después de que se proteja el bucle F1-G1 de
PapD de la escisión tríptica por la unión tanto de
PapG nativo como del péptido G1'-19'WT
(ejemplo 2 y Fig. 2A).
Se sintetizaron péptidos
G1'-19'WT, E1'-19'WT,
F1'-19'WT, K1'-19'WT y
H1'-19'WT (véase tabla 1) que correspondían a los
19 residuos carboxilo terminal de proteína de subunidad de pilus P
Papg, PapE, PapF, PapK y PapH, respectivamente (véase:
Grant y col., 1992, y referencias citadas en ese documento).
Los residuos en los péptidos se enumeraron
comenzando con el residuo carboxilo terminal como 1, y terminando
con el residuo amino terminal. Los péptidos también se sintetizaron
que se desviaron en cuanto a longitud (G1'-16'WT,
G1'-11'-WT,
G1'-7'WT) o secuencia (G2'-21'amida,
G1'-19'SV, G1'-19'NH_{2}) de la
secuencia carboxi terminal PapG de tipo silvestre. Usando un
ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA), se ensayó la
capacidad de PapD para unirse a cada péptido recubierto en
pocillos de placas de microtitulación:
Se diluyeron 5 mg/ml de soluciones madre de
péptidos en agua o ácido acético al 50% a una concentración de 2,5
pmol/50 \mul en PBS. Se recubrieron 50 \mul de la solución
peptídica durante una noche en pocillos de microtitulación
(Nunc-Immuno Plate Maxisorp) a 4ºC. Las soluciones
en las placas se desecharon, y los pocillos se bloquearon con 200
\mul de albúmina de suero bovino al 3% (BSA, Sigma) en PBS (NaCl
120 mM/KCl 2,7 mM/sales de tampón fosfato 10 mM, pH 7,4) durante 2
horas a 25ºC. Las placas se lavaron vigorosamente tres veces con PBS
y se incubaron con 50 \mul de la cantidad indicada de PapD
purificado (Lindberg y col, 1989). Después de 3 lavados con PBS, los
pocillos se incubaron con una dilución 1:500 de antisuero de conejo
anti-PapD (Lindberg y col, 1989) en BSA al 3%/PBS durante 45
minutos a 25ºC. Después de 3 lavados con PBS, los pocillos se
incubaron con una dilución 1:1000 de IgG de cabra
anti-conejo acoplada a fosfatasa alcalina (Sigma) en
BSA al 3%/PBS durante 45 minutos a 25ºC. Después de 3 lavados con
PBS y 3 lavados con tampón de revelado (dietanolamina 10 mM, pH 9,5,
MgCl_{2} 0,5 mM), se añadieron 50 \mul de sustrato de
p-nitrofenil fosfato filtrado (Sigma) en tampón de revelado
(10 mg/ml). La absorbancia a 405 nm se leyó después de 60 minutos de
incubación en la oscuridad a 25ºC.
Además, se ensayó la capacidad de los péptidos
solubles en agua para inhibir la unión de PapD a pocillos
recubiertos con G1'-19'WT en un ensayo ELISA de
inhibición soluble, ya que las conformaciones peptídicas pueden
haber sido afectadas por la unión de la unión a las placas de
microtitulación de plástico:
Se recubrieron pocillos de microtitulación
durante una noche a 4ºC con 50 \mul de 2,5 pmol/50 \mul del
péptido G1'-19'WT. Los pocillos se lavaron con PBS y
se bloquearon con albúmina de suero bovino al 3% (BSA). Se
pre-incubó un exceso molar de 25 veces de cada
péptido de ensayo con 100 pmoles de PapD durante 30 minutos y
después se añadió la solución PapD-péptido a los pocillos
recubiertos y se incubó a 25ºC durante 45 minutos en presencia de
BSA al 3%/PBS. El anticuerpo primario posterior, anticuerpo
secundario y etapas de revelado se han descrito anteriormente. La
capacidad de los péptidos para inhibir la unión de PapD al
péptido G1'-19'WT se calculó dividiendo la cantidad
de la unión de PapD en presencia del péptido con la cantidad
de la unión de PapD en presencia de agua. La inhibición al 0%
incluye valores en los que la unión fue superior a la de PapD
pre-incubado con H_{2}O.
Los resultados de la unión de PapD a los
péptidos de longitud variable y diferente de tipo silvestre se
muestran en la Figs. 1A, B y C.
Como puede observarse, los péptidos se unieron
bien al péptido PapG, moderadamente a PapE,
PapF y PapK, al tiempo que no hubo unión a PapH
y el péptido hidrófobo aleatorio, MS. (Fig. 1A). Estos resultados
sugieren que la chaperona reconoce PapG, PapE, PapF y
PapK en parte por la unión al extremo carboxilo de estas
subunidades. La incapacidad de PapD para interactuar con el
péptido PapH indica que PapD se une de forma diferente
a PapH, posiblemente debido a la función de PapH como
terminador de polimerización (Baga y col., 1987). La capacidad del
péptido para inhibir la unión de PapD a
G1'-19'WT inmovilizado generalmente se correspondía
con la afinidad que PapD tenía para el péptido inmovilizado
respectivo (Fig. 1, % de inhibición), lo que argumenta que la
interacción de PapD con péptidos solubles inmovilizados es
similar.
Como puede observarse a partir del ejemplo 1, las
bases moleculares de las interacciones PapD-péptido se han
estudiado mediante co-cristalización de PapD
con el péptido G1'-19'WT. En resumen, el péptido de
19 aminoácidos se ancla en la hendidura de la chaperona mediante
enlaces de hidrógeno entre el extremo carboxi del péptido y
Arg-8 y Lys-112 que son invariantes
en todas las chaperonas periplásmicas (Holmgren y col., 1992). El
péptido se unió a la cadena G1 de PapD en forma de una cadena
\beta paralela, formando al menos 10 enlaces de hidrógeno en el
esqueleto, y dio lugar a una ordenación del bucle F1 a G1.
El reemplazo de la prolina carboxilo terminal en
el péptido con una amida (G2'- 21' amida) suprimió la unión a
PapD en solución y redujo la unión de PapD al péptido
inmovilizado en aproximadamente un 75% (Fig. 1B). Por el contrario,
al sustituir sólo el grupo carboxilato con una amida para crear
G1'-19'NH_{2}, el péptido no afectó a la unión a
PapD en los ensayos de ELISA de inhibición soluble e
inmovilizada (Fig. 1B). Estos resultados indican que la prolina
terminal probablemente se requiera para colocar el grupo carboxilato
de forma que pueda formar enlaces de hidrógeno con el
Arg-8 invariante y los residuos de la hendidura
Lys-112.
PapD también se une a los péptidos más
cortos inmovilizados G1'-16'WT y
G1'-11'WT y los péptidos G1'-16'WT
y G1'-7'WT inhibieron la unión de PapD al
péptido G1'-19'WT inmovilizado en solución. La
tabla C muestra la capacidad de un exceso molar de 25 veces de los
péptidos solubles en agua para inhibir la unión de 100 pmol/pocillo
de PapD a pocillos recubiertos con G1'-19'WT.
El % de inhibición representa el porcentaje de unión de PapD
en presencia de agua y son la media del experimento realizados por
duplicado:
PapD no se une al péptido
G1'-7'WT inmovilizado, probablemente porque este
péptido es demasiado corto para unirse a los pocillos de
microtitulación así como a PapD. De esta forma, parece que al
menos se necesitan 7 residuos carboxilo terminal para la unión de
PapD de un péptido. Conjuntamente, estos resultados avalan un
modelo, además de la interacción del anclaje del grupo carboxilato
en la hendidura PapD, se requiere 7 residuos carboxilo
terminal para el péptido "en cremallera" junto con la cadena G1
del PapD durante la formación del complejo
PapD-péptido.
Se sustituyeron residuos conservados de
fenilalanina y residuos de glicina en las posiciones 2 y 14 de los
extremos carboxilo mediante serina y valina, respectivamente, para
crear el péptido G1'-19'SV y se disminuyó la unión a
PapD en un 36%. Esto pudo dar lugar a un recubrimiento menos
eficiente o un recubrimiento o presentación menos eficiente en la
placa de microtitulación ya que G1'-19' SV era un
inhibidor de PapD soluble tan eficiente como el péptido
G1'-19'WT (Fig. 1B). Como estos residuos son
importantes para la incorporación de PapG en la subunidad de
pilus, se cree que pueden ser más importantes para la interacciones
de polimerización entre subunidades y la unión de subunidades de
pilus que en las interacciones de las subunidad PapD in
vivo.
La digestión parcial con tripsina escinde
PapD en el bucle F1-G1 en los residuos
Leu-103 y Lys-99,
respectivamente:
Se digirieron parcialmente 400 \mug de
PapD por incubación con 4,5 \mug de tripsina o 0,45 \mug
de quimotripsina en PBS durante 20 minutos a 37ºC. Los productos de
digestión de PapD se aplicaron a una columna de HPLC
C-18 (Beckman) y se eluyeron 2 fragmentos
principales con un gradiente de acetonitrilo de
0-100% en ácido trifluoroacético al 0,01%. Los
fragmentos de PapD se identificaron por su peso molecular en
SDS-PAGE y por secuenciación
amino-terminal. Las secuencias de aminoácidos
N-terminales de los fragmentos trípticos y
quimiotrípticos de aproximadamente 14 kDa se identificaron como los
residuos 100-108 y 104-109 de
PapD, respectivamente, correspondientes a la escisión después
de Lys-99 (en el caso de la tripsina) y
Ley-103 (en el caso de la quimotripsina). Las
secuencias N-terminales de la bandas de 11 y 12 kDa
en los productos de digestión fueron idénticas a la secuencia
N-terminal de PapD.
Los péptidos G1'-19'WT,
G1'-16'WT y K1'-19'WT, pero no el
péptido G2'-21'amida, redujeron la velocidad de
escisión tríptica de PapD a lo largo del tiempo (Fig. 2A).
Estos datos indican que la unión de PapD al péptido alteraba
el contacto del bucle y por lo tanto la protección para formar la
escisión. Este efecto puede estar relacionado con el orden del bucle
F1-G1 de PapD observado en la estructura
cristalina del péptido PapD y sugiere, que en solución, los
dos péptidos se extienden a lo largo de la cadena \beta de G1 e
interaccionan con el bucle F1-G1 de PapD.
Como se describe en Kuehn et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. ESTADOS UNIDOS 88, 10586 (1991), el PapD
nativo puede unirse a PapG desnaturalizado o reducido y
restaurar el complejo PapD-PapG in
vitro.
Este ensayo de reconstitución se usó para
determinar la capacidad de los péptidos para inhibir la actividad de
PapD in vitro. La solubilidad limitada del péptido
G1'-7'WT desafortunadamente ha impedido el ensayo de
este péptido en el análisis. Cantidades crecientes de los péptidos
G1'-19'WT, G1'-16'WTy
K1'-19'WT inhiben la restauración del complejo
PapD-PapG por PapD, mientras que el
péptido G2'-21'-amida no tiene
ningún efecto (Fig. 2B). La capacidad de los péptidos
G1'-19'WT, G1'-16'WT y
K1'-19'WT para impedir la unión de PapD a
PapG indicó que estos péptidos se unen al sitio de unión de
la subunidad de PapD.
La capacidad de los péptidos para inhibir la
restauración del complejo PapD-PapG por
PapD se ensayó como se indica a continuación: se redujeron
0,3 \mug de complejo PapD-PapG y se desnaturalizaron
por incubación a 25ºC durante 20 minutos con urea 4 M/ditiotreitol
(DTT) 10 mM, 1,2 \mug (50 pmol) de PapD se incubaron a 25ºC
durante 10 minutos con 5-14,5 \mug
(2,5-7,25 mmol) de péptido. Después, la solución de
PapD con péptido se añadió a PapD-PapG
desnaturalizado reducido, se incubó a 25ºC durante 10 minutos y se
aplicó a un gel IEF 3-9 (Pharmacia). La cantidad de
PapD-PapG restaurado en cada muestra se
cuantificó por densitometría de la banda de IEF teñida con plata
correspondiente al pI del complejo DG.
Se construyeron mutaciones de localización
dirigida en residuos escindidos estrictamente conservados de
PapD que, según se había previsto, eran críticas en la
interacción PapD-péptido para ensayar si la estructura
cristalina de PapD-péptido es una reflexión de parte de la
interfaz de interacción de PapD-subunidad de pilus (las
posiciones de la mutaciones se indican en la Fig. 3). La
Thr-7 muy conservada se cambió a una valina
(Thr-7-Val) para ensayar si su grupo
hidroxilo formaba enlaces de hidrógeno críticos para la unión de
PapD a las subunidades.
Esta mutación retiró el grupo hidroxilo mientras
que mantenía el volumen estérico de la cadena lateral. Se diseñaron
mutaciones en Lys-112 y Arg-8 para
ensayar si la formación de enlaces de hidrógeno con el grupo
carboxilado terminal de la subunidades de pilus es una
característica crítica del procedimiento de reconocimiento de
chaperona. El residuos Lys-112 invariantes se
cambiaron a una alanina
(Lys-112-Ala) para retirar la cadena
lateral cargada y a una metionina (Lys-112 -Met)
para reemplazar el grupo cargado con un grupo hidrófilo mientras se
mantenía el empaquetamiento de la cadena lateral. Previamente se ha
demostrado que se requiere el mantenimiento de la
Arg-8 para que PapD pueda unirse a la
subunidades y mediar el ensamblaje del pilus in vivo (Slonim
y col, 1992). Glu-167/E167, un residuo variable en
el dominio 2 de PapD (Fig. 3), no parece estar implicado en
la interacción entre PapD y el péptido en la estructura
cristalina y se ha demostrado que las mutaciones en este residuo
tienen un efecto pequeño o nulo sobre la función de PapD in
vivo (Slonim y col, 1992). E167 se cambió a histidina (E167H)
para ensayar si este residuo cargado negativamente en el borde del
dominio 2 tiene algún papel en la interacción PapD-péptido.
Todos los mutantes se secretaron en el espacio periplásmico como
proteínas estables similares a PapD de tipo silvestre.
Además, el perfil de elución forma una columna de FPLC de
intercambio catiónico y las propiedades electroforéticas de los
PapD mutantes purificados fueron similares a las de la
proteína del tipo silvestre, soportando la predicción de que esta
mutaciones no afectarían a la estructura global de PapD
(datos no mostrados).
La capacidad de las chaperonas mutantes para
unirse a subunidades de pilus y modular el ensamblaje del pilus
in vivo se correlacionó con su capacidad de unirse al péptido
G1'-19'WT y PapG in vitro. El
PapD de tipo silvestre unido al péptido
G1'-19'-WT produce un cambio de
movilidad hacia el electrodo negativo en un ensayo de gel de
poliacrilamida nativo (Lam y Calderwood, 1992), probablemente debido
a un aumento de carga positiva neta en el complejo
PapD-péptido. Por el contrario, cuando se incubaron mutantes
de PapD Arg-8-Gly,
Arg-8-Ala y
Lys-112-Ala con péptido
G1'-19'WT no produjeron un cambio de movilidad en el
ensayo PAGE-nativo, lo que indica que esta
mutaciones en PapD anulaban la unión del péptido. De forma
similar, las mutaciones en Arg-8 y
Lys-112 anulaban la capacidad de PapD de
unirse a PapG y reconstituir el complejo de PapD-
PapG in vitro (Fig. 7) y de unirse a la subunidades de
pilus y mediar el ensamblaje de pilus in vivo (véase la tabla
2).
* La titulación de hemaglutinación (HA) se
cuantificó después de la inducción con IPTG 0,01 mM. La titulación
de HA representa la mayor dilución bacteriana que aún aglutina
eritrocitos. HB101/pPAP37 que expresa PapD de tipo silvestre
tiene una titulación de HA de 128.
+ La cantidad de pili ensamblados se liberaron de
las células y se cuantificaron después de la inducción con IPTG 0,01
mM. "-" indica que no se detectaron pili; el grado de formación
o de liberación de pili de HB101/pPAP37 que expresa PapD de
tipo silvestre corresponde a "++++".
# La estabilización periplásmica ayudada por
chaperona de subunidades de pilus PapA, PapE, PapF, PapK y
PapG se determinó como se ha descrito anteriormente (Slonim y
col., 1992); "-" indica que no hay estabilización de la
subunidad; el número de símbolos + indica el grado de estabilización
de la subunidad en comparación con PapD de tipo silvestre. ND
indica no determinado.
\NAK X indica mutaciones en His, Asp, Thr o
Gly.
La notable consistencia de los resultados in
vitro e in vivo y la estructura cristalina indican que el
anclaje de la subunidades de pilus por residuos conservados
Arg-8 y Lys-112 es una parte crítica
de la interacción entre chaperonas de tipo PapD y la
biogénesis de pilus.
Se realizó una mutagénesis de localización
dirigida usando el Bio-Rad en el kit de mutagénesis
in vitro siguiendo las instrucciones de los fabricantes. Para
introducir mutaciones en el gen papD (SEC ID Nº: 1) se usaron
los siguiente cebadores (cadena no codificante):
Thr-7-Val
5'-GTCAAACACCGCCGGAACTCGTCCAGGCGA-3'
SEC ID Nº: 3
Lys-112-Ala
5'CGGGCGATAAAAAAGAGCTATTTTGGTCTG-3' SEC ID Nº: 4
Lys-112-Met
5'-GCGATAAAAAAGCATTATTTTCCTCTG-3'
SEC ID Nº: 5
Las mutaciones en papD se confirmaron por
secuenciación y los genes PapD alterados se clonaron en el
vector pMMB91 bajo el promotor P_{tac} inducible como se ha
descrito previamente para otras mutaciones de papD (Slonim y
col, 1992). Los plásmidos se denominaron
pThr-7-Val,
pLys-112-Ala y
pLys-112-Met de acuerdo con el
número de residuos y los aminoácidos mutados. El plásmido pLS101 es
una construcción isogénica que contiene el gen papD de tipo
silvestre; los plásmidos pE167H, pR8G y pR8A contienen genes que
codifican PapD con mutaciones puntuales que cambian
Glu-167 a His y Arg-8 a Gly y Ala,
respectivamente.
Los datos presentados en este ejemplo y en el
ejemplo 1 demuestran que las interacciones PapD-péptido
encontradas en la estructura cristalina reflejan la interacción
PapD-subunidades de pilus que reflejan la interfaz de
interacción PapD-subunidad de pilus in vivo. Estas
interacciones definen por primera vez un mecanismo por el cual la
chaperonas utilizan sus dominios de tipo inmunoglobulina en un nuevo
paradigma de reconocimiento para unirse a un grupo variado de
proteínas. Los residuos Arg-8 y
Lys-112 de PapD, localizados en cadenas
\beta en el fragmentos escindidos entre los dos dominios, juegan
papeles cruciales en el reconocimiento de chaperona sirviendo como
anclajes moleculares para el extremo carboxilo de las proteínas de
los pili. El hecho de que Arg-8 y
Lys-112 estén muy conservadas entre las chaperonas
periplásmicas indica que probablemente tengan un papel universal en
la formación de "sitio activo" que se une al grupo carboxilato
terminal de otras subunidades proteicas. Los enlaces de hidrógeno de
esqueleto a lo largo de la cadena \beta de PapD
posteriormente proporcionan interacciones fuertes independientes de
la secuencia a lo largo del extremo carboxilo de la subunidad. La
interacción "en cremallera" de los residuos hidrófobos alternos
conservados del extremo carboxilo de la subunidad del pilus con los
residuos hidrófobos alternos conservados en la cadena \beta de G1
de la chaperona añade resistencia y especificidad a la unión. Por lo
tanto, a diferencia de otras proteínas parecidas a inmunoglobulina
(Amit y col, 1988 y de Vos y col, 1992), PapD utiliza la
cadena \beta y las características de hendidura interdominio de su
estructura parecida a la inmunoglobulina para proporcionar un
mecanismo de reconocimiento para unirse a varias proteínas
diferentes. Los residuos variables en las regiones del bucle de los
anticuerpos proporcionan la especificidad exquisita necesaria de un
amplio repertorio de unión de anticuerpos. De forma similar, los
residuos en el bucle F1-G1 de PapD pueden
proporcionar especificidad por la unión de chaperona, ya que se ha
descubierto que estos residuos varían en longitud y composición
entre los diversos miembros de la familia de chaperonas
periplásmicas (Holmgren y col, 1992).
Habiendo determinado la localización de un sitio
de unión prometedor para ligandos inhibidores como se describe en
los ejemplos 1 y 2, se usaron los programas informáticos 'PLIM' y
'PLIM_DBS' (creados por Symbicom AB) para encontrar plantillas para
familias de compuestos capaces de unirse al sitio de unión (véase la
descripción general anterior).
PLIM se ejecutó en una caja de 20 \ring{A}
alrededor de la región Arg-8 de la estructura de
alta resolución de PapD, buscando posiciones de unión de baja
energía para sondas NH, NH_{2}, O, OH y C. Las ejecuciones de PLIM
dieron como resultado varias posiciones sugeridas y orientaciones de
grupos químicos favorables (puntos de sitio) en la región cerca de
Arg-8 y Lys-112.
Se identificaron aproximadamente 50 sitios y
después se seleccionaron tripletes y cuadrupletes de estos puntos de
sitio con respecto a su compatibilidad mutua, es decir debían tener
relaciones geométricas apropiadas - distancias de orientaciones que
podrían encontrarse en una molécula real.
Después se realizó una búsqueda de ligandos
potenciales buscando en una base de datos estructuras moleculares
conocidas que correspondieran a las posiciones de esos grupos de
puntos de sitio, usando PLIM_DBS.
Los mejores de estos aciertos de la base de datos
se examinaron visualmente usando un sistema de formación de modelos
gráficos por ordenador, y los más prometedores de estos se
seleccionaron según la abundancia de razonamiento
físico-químico.
Se realizaron modificaciones como se ha descrito
anteriormente para mejorar la unión y simplificar la síntesis. Por
ejemplo, se añadieron anillos de fenilo para proporcionar una mejor
complementariedad con la superficie hidrófoba del sitio de unión, se
añadieron grupos cargados para unirse a los grupos cargados
presentes en la proteína que habían estado fuera del alcance de
Plim, se retiraron sub-estructuras frecuentemente
tóxicas y se reemplazaron grupos por grupos funcionalmente similares
por razones de síntesis. Se realizaron muchos de tales juicios,
dando como resultado dos familias de compuestos (hdo y bpy) con
diferentes combinaciones de características.
La eficacia de estas modificaciones finalmente se
evaluó usando cálculos de energía libre de dinámica molecular como
se describe en este documento para estudiar la estabilidad del
complejo proteína-ligando (\ring{A}qvist y col.,
1994).
Posteriormente, dos estructuras de una familia y
una de la segunda familia de consideraron dignas de síntesis y
ensayo.
El desarrollo de varios de los miembros de estas
familias de compuestos se describirá a continuación con detalle.
La primera familia (denominada en este documento
hdo) se obtuvo a partir de una base de datos para
6-hidroxidopamina, denominada hdo_0 (Fig. 8). La
molécula se une a las cadenas laterales de PapD de
Arg-8 y Lys-112, y al esqueleto de
Lys-110 a través de una donación de enlaces de
hidrógeno desde los grupos hidroxilo. Los enlaces de hidrógeno del
grupo amino primario se unen a la cadena lateral de
Thr-170.
A partir de esta estructura básica se creó el
derivado hdo_1 (Fig. 8) reemplazando un grupo hidroxilo por un ácido
carboxílico que puede tener una interacción de carga con
Arg-8 y Lys-112, y reemplazando el
hidroxilo en posición para con respecto a esta posición por un nuevo
anillo de fenilo, para rellenar la hendidura hidrófoba en la
proteína formada por los residuos Ile-111,
Leu-4 y parte de Thr-7. Se creó
hdo_4 (Fig. 8) a partir de hdo_1 reemplazando el anillo aromático
original por un azúcar, uniendo los sustituyentes de hidroxilo, la
amina primaria y ácido carboxílico de tal forma que se mantuviera
geometría relativa similar, y después añadiendo grupos hidroxilo a
un lado del nuevo anillo de benceno para que presentara una cara
hidrófila al disolvente en esta región.
En este punto, la estructura parecía
suficientemente convincente como para invertir tiempo en una
simulación de dinámica molecular, cuyos resultados sugirieron que el
grupo amino efectivamente no se unía al carbono gamma de
Thr-7 de PapD, sino que preferentemente se
disolvería, satisfaciendo sus requisitos de unión de hidrógeno con
moléculas de agua en lugar de con la cadena lateral de la proteína.
De esta manera, el grupo amina se reemplazó por el grupo hidroxilo
donante individual, una etapa que también simplificaba la síntesis,
siendo el resultado la estructura hdo_6 (Fig. 8).
Debido a la probabilidad percibida de la
toxicidad debido al modelo de sustitución de hidroxilo en el anillo
de benceno, el grupo para-hidroxilo se retiró para
dar una estructura hdo_7 (Fig. 8) y el grupo hidroxilo restante en
este anillo se reemplazó por un grupo nitro para facilitar
adicionalmente la síntesis (hdo_8, Fig. 8).
También se consideró una posibilidad un compuesto
final con un compuesto final en el que el grupo nitro previo se
había dejado fuera, y se denominó hdo_9 (Fig. 8).
Se realizó otra simulación de dinámica molecular
sobre hdo_9, cuyos resultados sugirieron que ahora, podrían
realizarse las interacciones previstas y mantenerse en solución. Un
análisis estadístico de las trayectorias con el programa
"Miss_Fit" demostró que la conformación del ligando no cambiaba
sustancialmente durante el procedimiento, y los cambios que se
produjeron se compensaron por desplazamientos complementarios en la
estructura proteica que mantenían todas las interacciones
significativas.
La simulación dinámica de hdo_8 se complicó por
la falta de disponibilidad de parámetros de mecánica molecular
adecuados para el anillo sustituido con nitro en posición meta, lo
cual hizo que fuera más difícil basarse en la evaluación por medio
de simulaciones de dinámica molecular, y esto influye sobre la
decisión de realizar un seguimiento.
El intervalo de posibilidades que se consideraron
durante la fase de diseño de la familia hdo se resumen en la Fig.
9.
La segunda familia, conocida como bpy, se derivó
de una entrada de la base de datos para
(metil-O,N,N-azoxi)-metil-\beta-D-glucopiranósido-cicasina
(Kawaminami y col., 1981) denominada bpy_0 en este documento:
La conformación almacenada en la base de datos no
fue óptima para la unión al sitio PpaD, aunque se aproximó lo
suficiente como para ser recogida por la búsqueda de Plim_DBS. Los
pequeños ajustes realizados para los ángulos de torsión internos
mejoraron de alguna manera el patrón de unión.
Es interesante observar que hay precedentes para
el enfoque de usar un carbohidrato central como estrado al que se
unen las funcionalidades como para imitar un péptido (Hirschmann y
col., 1992).
Después, se creó el derivado
bpy1-benzopiran-3-carboxílico
añadiendo un anillo fenilo a la posición 6, con el fin de rellenar
la hendidura hidrófoba de la proteína. El grupo 4-OH
debería formar una interacción dipolar favorable con el centro rico
en electrones del grupo 6-fenilo, y junto con el
hidrógeno intramolecular 6-OH..O5 debería
estabilizar el rotámero C5-C6 deseado.
Se decidió que las cadenas laterales
Lys-112 y Arg-8 que deben
interactuar con el grupo hidroxilo en la posición 2 del ligando lo
hagan más con un grupo cargado, y por lo tanto se creó bpy_2
reemplazando este hidroxilo con un sulfato, bpy_3 reemplazándolo con
un fosfato cíclico y bpy_5 reemplazándolo con un fosfato no
cíclico.
Se creó bpy_4 retirando el grupo
3-hidroxilo de BPY_2 para que el grupo sulfato
tuviera una mejor oportunidad de interactuar con la cadena lateral
Arg-8, y se creó de forma análoga bpy_6 retirando el
grupo 3-hidroxilo de bpy_5. La siguiente fórmula
muestra bpy_1-bpy_6:
Después, se tomó en consideración una pequeña
cavidad hidrófoba y parches o residuos hidrófobos expuestos al
disolvente cerca de la posición 1 del ligando. Se buscó una aglicona
que pudiera contactar con estas partes de la proteína y
preferiblemente también interactuar con el disolvente. Estas
consideraciones condujeron al reemplazo del grupo azoxi en la
posición 1 con un grupo
2-hidroxi-4-metilciclopentilo,
dando como resultado bpy_7:
En este punto, se hicieron realizaciones
moleculares dinámicas, cuyos resultados sugirieron que la estructura
se enlazó bien, pero que los contactos hidrófobos esperados entre el
ciclopentano y la proteína no se mantuvieron.
De esta manera, se creó bpy_9 a partir de bpy_7
con el grupo ciclopentano retirado, reemplazado con un grupo
\alpha-metilo para la estabilidad interna. En
cambio, se intentaron contactos hidrófobos adicionales mediante la
adición de un grupo etoxi axial en la posición 2. La carga se movió
de la ecuatorial 2 al axial 3, un movimiento establecido por la
inclusión de un enlace NH que puede donar un enlace hidrógeno al
oxígeno en el axial 1. La reorganización estereoquímica de las
funcionalidades en las posiciones 1-3 ahora confiere
rigidez conformacional a la estructura, así como una simplificación
de la síntesis.
Se hicieron más realizaciones dinámicas, esta vez
sugiriendo que bpy_9 formaría un complejo estable con la proteína,
similar a la manera en la que se preveía durante el diseño.
Usando el razonamiento en línea con lo descrito
anteriormente, se han diseñado más compuestos (a partir de la
familia hdo y de la familia bpy). Los compuestos de interés son los
descritos por las fórmulas generales I y II en este documento. Se
han sintetizado los compuestos más prometedores que resultan de los
análisis, cf. ejemplo 4.
En el desarrollo adicional de los compuestos
diseñados usando los procedimientos descritos anteriormente, se ha
descubierto de forma interesante que la estabilidad de la unión
entre los compuestos diseñados y PapD parece depender
únicamente de la interacción entre el compuesto y el residuo
Arg-8, incluso aunque Arg-8 es
esencial para la función in vivo de PapD. Por otra
parte, la estabilidad de la interacción entre los compuestos
diseñados y PapD aún depende mucho de la interacción con
Lys-112 así como con la cadena \beta. Estas
observaciones confirman la sorprendente observación de que la unión
estable entre PapD y las subunidades de pilus depende mucho
más de la interacción entre las láminas \beta de las dos
moléculas.
Los espectros ^{1}H y ^{13}C RMN se
registraron en CDCl_{3} a 300 y 75 MHz respectivamente en un
espectrómetro Varian Gemini 300 a menos que se indique otra cosa.
Las señales del disolvente no deuterado a 7,25 y 77,0 ppm
respectivamente se usaron como señales de referencia interna. Se
midieron las rotaciones ópticas usando un polarímetro Perkin Elmer
241.
La cromatografía de capa fina se realizó en un
Merck DC-Fertig-platten
(Kiselgel 60 F_{254} 0,25 mm) y las manchas se visualizaron
pulverizándolas con ácido sulfúrico al 10% seguido de carbonización
a temperatura elevada y/o pulverización con ácido molibdatofosfórico
hidrato/Ce(SO_{4})_{2}/H_{2}SO_{4} diluido
seguido de calentamiento (ácido molibdatofosfórico hidrato = H_{3}
[P(Mo_{3}O_{10})_{4}] x H_{2}O, E. Merck,
Darmstadt, Alemania).
Se disolvió
2,3-O-dibenzoil-4,6-O-benciliden-1-tio-\beta-D-glucohexopiranósido
de etilo (150 mg,0,29 mmol) junto con complejo de
borano-dimetilamina (68 mg, 1,16 mmol) en tolueno
seco (20 \ring{A}). Se añadieron tamices moleculares de 4
\ring{A} en polvo (180 mg) y la mezcla se agitó a temperatura
ambiente durante 20 minutos. Se añadió tricloruro de aluminio (154
mg, 1,16 mmol) y después de la desaparición del material de partida
(aprox. 10 mn, ccf sobre sílice con 4:1 de tolueno/acetonitrilo) la
mezcla se filtró, se trató con resina de intercambio iónico Dowex
(H^{+}) hasta que la solución fue transparente y se filtró de
nuevo. El filtrado se concentró y se co-evaporó dos
veces con metanol, produciendo 200 mg de residuo que después de la
cromatografía sobre gel de sílice (8:1 de
tolueno-acetonitrilo) dio 60 mg, 40% de
2,3-O-dibenzoil-4-O-bencil-1-tio-\beta-D-glucohexopiranósido
de etilo.
^{1}H RMN (CDCl_{3}, \delta):
8,0-7,2 (mm, 15H), 5,75 (t, 9,4 Hz, 1H, H3), 5,37
(t, 9,8 Hz, 1H, H2), 4,74 (d, 9,8 Hz, 1H, H1), 4,61 (s, 2H)
4,02-3,95 y 3,85-3,76 (2 m a, 2H,
2H6), 3,94 (t, 9,5 Hz, 1H, H4), 3,63 (ddd, 9,7 Hz, 3,9 Hz, 2,6 Hz,
1H, H5), 2,74 (2c, 7,5 Hz, 2H), 1,25 (t; 7,5, 3H).
Se disolvió
2,3-O-dibenzoil-4-O-bencil-1-tiol-\beta-D-glucohexopiranósido
de etilo (200 mg, 0,38 mmol) en una mezcla enfriada con hielo de
piridina y anhídrido acético (1:1, 6 \ring{A}). La mezcla se agitó
y se puso a temperatura ambiente durante una noche. La mezcla se
diluyó con diclorometano, se lavó con carbonato ácido sódico sat.
ac. y agua y se secó sobre sulfato sódico. Los disolventes se
retiraron a presión reducida y el residuo se sometió a cromatografía
ultrarrápida sobre gel de sílice (6:1 de
tolueno-acetonitrilo), produciendo 204 mg, 93% de
6-O-acetil-2,3-O-dibenzoil-4-O-bencil-1-tio-\beta-D-glucohexopiranósido
de etilo.
^{1}H RMN (CDCl_{3}, \delta):
8,0-7,2 (mm, 15H), 5,75 (t, 9,2 Hz, 1H, H3), 5,40
(t, 9,8 Hz, 1H, H2), 4,71 (d, 10,0 Hz, 1H, H1), 4,59 y 4,55 (2d,
10,8 Hz, 2H, bzl-CH_{2}), 4,44 (dd, 12,0 Hz, 1,9
Hz, 1H, H6), 4,27 (dd, 12,2 Hz, 4,6 Hz, 1H, H6'), 3,87 (t, 9,5 Hz,
1H, H4), 3,77 (ddd, 9,7 Hz, 4,6 Hz, 1,9 Hz, 1H, H5), 2,73 (m,
2H),2,09 (s, 3H), 1,26 (t, 3H).
Se disolvieron
6-O-acetil-2,3-O-dibenzoil-4-O-bencil-1-tio-\beta-D-glucohexopiranósido
(600 mg, 1,04 mmol) y N-yodosuccinimida (468 mg, 2,08 mmol,
secada durante 3 h, < 0,1 mbar) en acetonitrilo seco (7
\ring{A}, pasado a través de alúmina) a temperatura ambiente. Se
añadió glicolato de metilo (161 \mul, 2,08 mmol) y la mezcla se
agitó durante 25 min a temperatura ambiente y después se enfrió en
un baño de hielo. Se añadió cuidadosamente ácido
trifluorometilsulfónico (18 \mul, 0,21 mmol). La completa
conversión del material de partida tuvo lugar después de 10 minutos
(ccf: sílice 4:1 de tolueno-acetonitrilo). La
reacción se inactivó mediante la adición de trietilamina y la mezcla
se diluyó con diclorometano, se lavó con agua y carbonato ácido
sódico y se secó sobre sulfato sódico. Los disolventes se retiraron
a presión reducida y el residuo se sometió a cromatografía sobre
sílice (11:1 de tolueno-acetonitrilo), produciendo
560 mg, 86% de
6-O-acetil-2,3-O-dibenzoil-4-O-bencil-1-tio-\beta-D-glucohexopiranósido
de etilo.
Se disolvió
2,3-O-dibenzoil-4,6-O-benciliden-1-tiol-\beta-D-glucohexopiranósido
de etilo (Chemical Abstracts, RN
149563-08-6 o Hallgren y Widmalm,
1993) junto con complejo de borano-dimetilamina (68
mg, 1,16 mmol) en tolueno seco (20 ml) (reacción "a" en la Fig.
6). Se añadieron tamices moleculares 4 \ring{A} en polvo (180 mg)
y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 20 minutos. Se
añadió tricloruro de aluminio (154 mg, 1,16 mmol) y después de la
desaparición del material de partida (aprox. 10 min, la ccf sobre
sílice, 4:1 de tolueno/acetonitrilo) la mezcla se filtró, se trató
con resina de intercambio iónico Dowex (H^{+}) hasta que la
solución fue transparente y se filtró de nuevo. El filtrado se
concentró y se co-evaporó dos veces con metanol,
produciendo 200 mg de residuo que después de la cromatografía sobre
gel de sílice (8:1 de tolueno:acetonitrilo) dio 60 mg, 40% de
hdo_9:1.
^{1}H RMN (CDCl_{3}, \delta):
8,0-7,2 (mm, 15H), 5,75 (t, 9,4 Hz, 1H, H3), 5,37
(t, 9,8 Hz, 1H, H2), 4,74 (d, 9,8 Hz, 1H, H1), 4,61 (s, 2H),
4,02-3,95 y 3,85-3,76 (2 m a, 2H,
2H6), 3,94 (t, 9,5 Hz, 1H, H4), 3,63 (ddd, 9,7 Hz, 3,9 Hz, 2,6 Hz,
1H, H5), 2,74 (2c, 7,5 Hz, 2H), 1,25 (t; 7,5 Hz, 3H).
Se disolvió
2,3-O-dibenzoil-4-O-bencil-1-tio-\beta-D-glucohexopiranósido
de etilo (hdo_9:1) (200 mg, 0,38 mmol) en una mezcla enfriada con
hielo de piridina y anhídrido acético (1:1, 6 ml). La mezcla se
agitó y se dejó alcanzar la temperatura ambiente durante una noche.
La mezcla se diluyó con diclorometano y se lavó con carbonato ácido
sódico saturado acuso y agua y se secó sobre sulfato de magnesio.
Los disolventes se retiraron a presión reducida y el residuo se
sometió a cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice (6:1 de
tolueno-acetonitrilo), produciendo 204 mg, 93% de
hdo_9:2.
^{1}H RMN (CDCl_{3}, \delta):
8,0-7,2 (mm, 15H), 5,75 (t, 9,2 Hz, 1H, H3), 5,40
(t, 9,8 Hz, 1H, H2), 4,71 (d, 10,0 Hz, 1H, H1), 4,59 y 4,55 (2d,
10,8 Hz, 2H, bzl-CH2), 4,44 (dd, 12,0 Hz, 1,9 Hz,
1H, H6), 4,27 (dd, 12,2 Hz, 4,6 Hz, 1H, H6'), 3,87 (t, 9,5 Hz, 1H,
H4), 3,77 (ddd, 9,7 Hz, 4,6 Hz, 1,9 Hz, 1H, H5), 2,73 (m, 2H), 2,09
(s, 3H), 1,26 (t, 3H).
Se disolvieron
6-O-acetil-2,3-O-dibenzoil-4-O-bencil-1-tio-\beta-D-glucohexopiranósido
(hdo_9:2) (600 mg, 1,04 mmol) y N-yodosuccinimida (hdo_9:2)
(468 mg, 2,08 mmol, secada durante 3 h, < 0,1 mbar) en
acetonitrilo seco (7 ml, pasado a través de alúmina) a temperatura
ambiente. Se añadió glicolato de metilo (161 \mul, 2,08 mmol) y la
mezcla se agitó durante 25 min a temperatura ambiente y después se
enfrió en un baño de hielo. Se añadió cuidadosamente ácido
trifluorometilsulfónico (18 \mul, 0,21 mmol). La completa
conversión del material de partida tuvo lugar después de 10 minutos
(ccf: sílice, 4:1 de tolueno-acetonitrilo). La
reacción se inactivó mediante la adición de trietilamina y la mezcla
se diluyó con diclorometano, se lavó con agua y carbonato ácido
sódico y se secó sobre sulfato sódico. Los disolventes se retiraron
a presión reducida y el residuo se sometió a cromatografía sobre gel
de sílice (11:1 de tolueno-acetonitrilo),
produciendo 560 mg, 86% de (hdo_9:3).
Se disolvió
6-O-acetil-2,3-O-dibenzoil-4-O-bencil-\beta-D-glucohexopiranósido
de metilglicolilo (hdo_9:3) (350 mg, 0,59 mmol) en metóxido sódico
25 mM 7 \ring{A} (metanol) y se agitó a temperatura ambiente
durante 20 h o hasta que sólo se pudo detectar un pequeño punto de
movimiento lento por ccf mediante carbonación de ácido sulfúrico
(sílice, 4:1 de tolueno-acetonitrilo). Se retuvo una
pequeña muestra de esta solución (= i) como referencia de ccf antes
de la hidrólisis con glicolato de metilo. Se añadieron hidróxido
sódico (15 mg) y agua (200 \mul) y la agitación se continuó
durante 8 h o hasta que se consumió toda la "i" (ccf sobre
sílice, 8:3:1 de acetato de etilo-etanol-ácido
acético). La reacción se inactivó llevando el pH a 4,2 con ácido
acético. Los disolventes se retiraron a presión reducida y el
residuo (650 mg) se sometió a cromatografía ultrarrápida sobre gel
de sílice (8:3:1 de acetato de etilo-etanol-ácido
acético). El material en el intervalo R_{f} de
0,15-0,25 se recogió y se concentró, produciendo 178
mg, 92% de un sólido blanco amorfo.
^{1}H RMN (CD_{3}OD, \delta relativo a
metanol a 3,31 ppm): 7,45 (m, 5H), 4,65 (d, 11,0 Hz, 1H), 4,36 (d,
16,0 Hz, 1H), 4,32 (d, 7,9 Hz, 1H, H1), 4,11 (d, 15,8 Hz, 1H), 3,82
(dd, 2,0 Hz, 12,1 Hz, 1H, H6), 3,65 (dd, 4,8 Hz, 12,1 Hz, 1H, H6),
3,59 (t, 9,0 Hz, 1H, H3 o H4), 3,40 (t, 9,1 Hz, 1H, H3 o H4).
Este material aún contenía mucho ácido acético,
así que se disolvieron de nuevo 50 mg en agua y se liofilizaron,
dando 30 mg de sustancia libre de ácido acético pero con un
contenido de agua (^{1}H RMN) de 24,5 equiv. mol.
Este material se redisolvió en agua y se le
añadió 1 equivalente de hidróxido sódico y la solución se liofilizó,
dando 22 mg del compuesto del título.
^{1}H RMN (CD_{3}OD, \delta relativo a
metanol a 3,31 ppm): 7,40-7,22 (m, 5H), 4,95 (d,
10,8 Hz, solapamiento por HDO residual a 4,93), 4,65 (d, 11,0 Hz,
1H), 4,34 (d, 16,0 Hz, 1H), 4,32 (d, 7,5 Hz, 1H, H1), 4,10 (d, 15,8
Hz), 3,82 (dd, 1,8 Hz, 11,9 Hz, 1H, H6), 3,66 (dd, 4,8 Hz, 12,1 Hz,
1H, H6), 3,59 (t, 8,8 Hz, 1H, H3), 3,41 (t, 9,7 Hz, 1H, H4),
3,15-3,06 (m, 2H, H5, H2).
^{13}C RMN (CD_{3}OD, \delta relativo a
metanol a 49,0 ppm): 176,1, 140,0, 129,3, 129,1, 128,6, 104,3, 79,1,
78,1, 77,2, 75,7, 75,2, 68,4, 62,3.
Una mezcla de N-yodosuccinimida (0,109 g,
0,484 mmol) y ácido tríficlo (6,6 \mul, 0,0744 mmol) en
diclorometano-éter dietílico (2 ml, 1:1) se añadió a una mezcla
agitada de
6-O-acetil-2,3-O-benzoil-4O-bencil-1-tio-\beta-D-glucopi-
ranósido de tioglicosidoetilo (hdo_9:2) (0,210 g, 0,372 mmol), etilen glicol (0,125 ml, 2,232 mmol) y tamices moleculares (0,3 g, 4 \ring{A}) en diclorometano-éter dietílico (3 ml, 1:2) a temperatura ambiente durante 5 min. Después de 25 min, la CCF mostró una conversión de aprox. el 20% del tioglicósido, así que se añadió más N-yodosuccinimida (0,109 g, 0,484 mmol) y ácido tríflico (6,6 \mul, 0,0744 mmol) en diclorometano-éter dietílico (2 ml, 1:1) durante 5 min. Después de 30 min más, la mezcla de reacción se filtró a través de una capa de Celite en una solución acuosa de carbonato ácido sódico y bisulfito sódico. La fase orgánica se separó, se lavó con agua, se secó (Na_{2}SO_{4}) y se concentró. El residuo se coevaporó dos veces con tolueno, se disolvió en metanol que contenía metóxido sódico (10 ml, 0,2 M), se mantuvo durante 1 h a 50ºC y se evaporó. La cromatografía en columna (SiO_{2}, cloroformo-metanol-agua, 100:15:1) del residuo dio hdo_23 (33 mg, 30%).
ranósido de tioglicosidoetilo (hdo_9:2) (0,210 g, 0,372 mmol), etilen glicol (0,125 ml, 2,232 mmol) y tamices moleculares (0,3 g, 4 \ring{A}) en diclorometano-éter dietílico (3 ml, 1:2) a temperatura ambiente durante 5 min. Después de 25 min, la CCF mostró una conversión de aprox. el 20% del tioglicósido, así que se añadió más N-yodosuccinimida (0,109 g, 0,484 mmol) y ácido tríflico (6,6 \mul, 0,0744 mmol) en diclorometano-éter dietílico (2 ml, 1:1) durante 5 min. Después de 30 min más, la mezcla de reacción se filtró a través de una capa de Celite en una solución acuosa de carbonato ácido sódico y bisulfito sódico. La fase orgánica se separó, se lavó con agua, se secó (Na_{2}SO_{4}) y se concentró. El residuo se coevaporó dos veces con tolueno, se disolvió en metanol que contenía metóxido sódico (10 ml, 0,2 M), se mantuvo durante 1 h a 50ºC y se evaporó. La cromatografía en columna (SiO_{2}, cloroformo-metanol-agua, 100:15:1) del residuo dio hdo_23 (33 mg, 30%).
[\alpha ]^{22}{}_{D} + 0,9º (c 1,4,
metanol)
CCF: Rf 0,29
(cloroformo-metanol-agua,
100:15:1).
^{13}C RMN (CD_{3}OD, \delta: relativo a
metanol a 49,0 ppm) \delta: 139,9, 129,2, 129,0, 128,6, 104,4
(C-1), 79,2, 78,2, 77,0, 75,7, 75,4, 72,3, 62,3,
62,3 ppm.
^{1}H RMN (CD_{3}OD, \delta: relativo a
metanol a 3,31 ppm) \delta: 7,45-7,25 (m, 5H),
4,95 (d, 11,0 Hz, 1H, bencílico), 4,65 (d, 11,0 Hz, 1H, bencílico),
4,29 (d, 7,7 Hz, 1H, H-1) ppm.
(Véase: Patroni y col., 1988).
Se disolvieron
\alpha-D-mannohexopiranósido de metilo (38,8 g, 200 mmol) y
ácido p-toluenosulfónico (200 mg) en dimetilformamida (300
ml) y se agitaron a 100ºC en una atmósfera de nitrógeno. Se añadió
gota a gota 4-metoxi-benzaldehído
dimetil acetal (37,7 g, 240 mmol) en dimetilformamida (300 ml)
durante 3 h. Como aún quedaba material de partida (ccf, sílice,
acetato de etilo), la agitación y el calentamiento se continuaron
durante 2 h. La composición de la mezcla de reacción no mostró
cambios visibles en ese momento (ccf, sílice, acetato de etilo) y la
reacción se inactivó con carbonato potásico (2,15 g). El disolvente
se retiró a presión reducida y el residuo se filtró a través de
sílice (acetato de etilo) para retirar los monoacetales depositados
(^{1}H RMN) tras la trituración con metil t-butil éter (11
g, 18%), que se recogió por filtración. Los filtrados se sometieron
a cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice, produciendo 20 g
de la mezcla monoacetal (rendimiento del 51%) y 17 g de los
2,3;4,6-diacetales (endo/exo \cong 1:1).
Se disolvieron
4'-metoxifenilmetileno-\alpha-D-mannohexopiranósido
de metilo, mezcla de 4,6-, 2,3-endo y
2,3-exo-monofenilmetilenacetales
(11,3 g, 36,2 mmol), yoduro de etilo (4,35 ml, 54,3 mmol) e
hidrogenosulfato de tetrabutilaminio (2,48 g, 7,24 mmol) en cloruro
de metileno (500 ml). A esto se le añadió una solución de hidróxido
sódico (2,5 g, 140 mmol) en agua (50 ml) y la mezcla se calentó a
reflujo durante 4 días, con adiciones diarias de yoduro de etilo
(2,4 ml) e hidróxido sódico al 20% (1 ml). Después de esto, no
podrían detectarse cambios visibles en la composición de la mezcla
de reacción por ccf (2:1 de tolueno-acetato de
etilo). La mezcla se dejó enfriar, las fases se separaron y la fase
orgánica se lavó con agua (3 x) y se secó sobre sulfato sódico. El
disolvente se retiró a presión reducida y el residuo se sometió a
cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice (6:1 de
tolueno-acetato de etilo). Las fracciones que
contenían el componente con Rf = 0,4 tras la ccf (2:1 de
tolueno-acetato de etilo) se concentraron y
re-cromatografiaron como antes, produciendo 3,15 g,
26% del compuesto del título. Se descubrió que las fracciones que
contenían los componentes con R_{f}= 0,32 tras la ccf consistían
en una mezcla de regioisómeros monofenilmetilenacetal monoetilados
(^{1}H RMN).
[\alpha ]^{20}{}_{D} = +11,2º (c 1,02,
CHCl_{3})
^{1}H RMN (CDCl_{3}, \delta): 7,42 (m. sim,
2H), 6,88 (m. sim, 2H), 5,53 (s, 1H), 4,77 (d, 1,3 Hz, 1H, H1), 4,24
(dd, 4,2 Hz, 9,7 Hz, 1H, H6), 4,02 (dt, 4,0 Hz, 8,8 Hz, 1H, H5),
3,83 (dd, 1,8 Hz, 9,7 Hz, 1H, H6), 3,80-3,69 (s y
solapamiento de m, 6H, 1-OMe, H3, H4,
2-O-CHHCH_{3}), 3,69 (s,
3H, Ar-OMe), 2,48 (d, 1H, OH), 1,26 (t, 7,0 Hz, 3H;
2-O-CH_{2}CH_{3}).
^{1}H RMN (CDCl_{3}, con Cl_{3}CCONC
añadido, \delta): 8,54 (s, 1H, acilcarbamato NH), 7,38 (m. sim,
2H), 6,88 (m. sim, 2H), 5,52 (s, 1H), 5,27 (dd, 3,5 Hz, 10,3 Hz, 1H,
H3), 4,76 (d, 1,6 Hz, 1H, H1), 4,32-4,20 (m, 1H),
4,13 (m. sim, 1H, H5), 3,97 (dd, 1,8 Hz, 3,5 Hz, 1H, H2),
3,91-3,80 (m, 1H), 3,79 (s, 3H,
1-OMe), 3,77-3,54 (m, 3H), 3,41 (s,
3H, Ar-OMe), 1,23 (t, 7,0 Hz, 3H).
^{13}C RMN (CDCl_{3}, \delta): 160,1,
129,9, 127,6, 113,6, 102,0, 99,3, 79,4, 78,8, 68,7, 68,3, 67,2,
63,2, 55,2, 54,9, 15,4.
Calc. para C_{17}H_{25}O_{7}: C, 59,8 H,
7,38,
Se disolvió
2-O-etil-4,6-O-(4'-metoxi)fenilmetileno-\alpha-D-mannohexopiranósido
de metilo (bpy_9:1) (0,98 g, 2,88 mmol) en cloruro de metileno seco
(18 ml) junto con trietilamina (600 \mul, 4,32 mmol) y la mezcla
se enfrió con hielo. Se añadió gota a gota trifluorometilsulfonato
de t-butildimetilsililo (795 \mul, 3,45 mmol) en cloruro de
metileno (2 ml) y la mezcla de reacción con el baño de enfriamiento
se dejó a temperatura ambiente durante una noche (ccf sobre sílice,
4:1 de tolueno-metil t-butil éter). El exceso
de reactivo de sililación se destruyó mediante la adición de metanol
(3 ml), la mezcla se concentró a presión reducida y el residuo se
sometió a cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice (40:1 de
tolueno-metil t-butil éter), produciendo 1,40
g, 100% de (bpy_9:2).
^{1}H RMN (CDCl_{3}, \delta): 7,40 (m. sim,
2H), 6,87 (m. sim, 2H), 5,53 (s, 1H), 4,70 (d, 1,3 Hz, 1H, H1), 4,21
(dd, 4,6 Hz, 9,9 Hz, 1H, H6), 4,10 (dd, 3,3, Hz, 9,7 Hz, 1H, H3),
3,91 (t, 9,5 Hz, 1H, H4), 3,90-3,79 (s solapado con
m, 5H, H6, 2-OCHHCH_{3};
1-OMe), 3,76-3,63 (m, 2H, H5,
2-OCHHCH_{3}), 3,55 (dd, 1,5 Hz, 3,3 Hz,
1H, H2), 3,67 (s, 3H, Ar-OMe), 1,24 (t, 7,0 Hz, 3H),
0,88 (s, 9H), 0,08 (s, 3H), 0,03 (s, 3H).
^{13}C RMN (CDCl_{3}, \delta): 159,9,
130,3, 127,5, 113,4, 101,8, 101,2, 79,9, 79,1, 70,3, 68,8, 68,2,
64,1, 55,2, 54,8, 25,8, 18,3, 15,6, -4,4, -4,9.
Se disolvió
2-O-etil-3-O-dimetil-t-butilsilil-4,6-O-(4'-metoxi)fenilmetilen-\alpha-D-mannohexopiranósido
de metilo (bpy_9:2) (3,61 g, 7,95 mmol) en acetonitrilo (150 ml,
secado sobre tamices moleculares 4 \ring{A}), se añadieron tamices
moleculares 3 \ring{A} en polvo (6 g) y la mezcla se enfrió a
-30ºC en una atmósfera de nitrógeno y se agitó durante 15 min. Se
añadió cianoborohidruro sódico (3,04 g, 47,7 mmol) y se añadió gota
a gota una solución de clorotrimetilsilano (7,95 ml, 47,7 mmol) en
acetonitrilo seco (50 ml, secado sobre tamices moleculares 4
\ring{A}) en 1 h. La agitación se continuó durante 2 h a -30ºC,
tras lo cual la temperatura se dejó aumentar a 0ºC. Después de 1 h,
la ccf (4:1 de tolueno:acetato de etilo) mostró la completa
conversión del material de partida. La mezcla se filtró a través de
una capa de Celite® y el Celite® se lavó minuciosamente con acetato
de etilo. Los filtrados combinados se lavaron con carbonato ácido
sódico ac. sat. y cloruro sódico ac. sat., se concentraron a presión
reducida, se redisolvieron en tolueno y se concentraron a presión
reducida. El residuo se sometió a cromatografía ultrarrápida sobre
gel de sílice (4:1 de tolueno-acetato de etilo,
después 1:1), obteniendo 578 mg de bpy_9:8 (= bpy_21:1), 16% y 2,34
g de (bpy_9:3), 65%.
bpy-9:3 (algunas tareas de COSY,
HETCOR):
^{1}H RMN (CDCl_{3}, \delta): 7,25 (m. sim,
2H), 6,87 (m. sim, 2H), 4,81 (d, 11,0 Hz, 1H), 4,66 (d, 1,8 Hz, 1H,
H1), 4,51 (d, 10,8 Hz, 1H), 4,02 (dd, 3,1 Hz, 5,9 Hz, 1H, H3), 3,80
(s, 3H, 1-OMe), 3,79-3,60 (m, 5H;
H4, 2H6, 2-OCH_{2}CH_{3}), 3,54 (ddd, 2,9 Hz,
4,8 Hz, 9,7 Hz, 1H, H5), 3,46 (dd, 2,0 Hz, 3,3 Hz, 1H, H2), 3,33 (s,
3H, Ar-OMe), 2,210 y 1,86 (2 s muy a, \cong 1H,
6-OH), 1,23 (t, 6,8 Hz, 3H), 0,95 (s, 9H), 0,12 (s,
6H).
^{1}H RMN (CDCl_{3}, con Cl_{3}CCONC
añadido, \delta): 8,40 (s, 1H, acilcarbamato NH), 7,24 (m. sim,
2H, Ar H3',5'), 6,86 (m. sim, 2H, Ar H2', H6'), 4,82 (d, 11,2 Hz,
1H), 4,67 (d, 2,0 Hz, 1H, H1), 4,43-4,32 (m, 2H,
2H6), 4,08-3,98 (m, 1H, H3), 3,78 (s, 3H,
4,43-4,32 (m, 2H, 2H6), 4,08-3,98
(m, 1H, H3), 3,78 (s, 3H, 1-OMe),
3,77-3,61 (m, 4H, H5,
2-OCH_{2}CH_{3}, H4), 3,46 (dd, 1,8 Hz,
3,1 Hz, 1H, H2), 3,34 (s, 3H, Ar-OMe), 1,22 (t, 7,0
Hz, 3H), 0,96 (s, 9H), 0,14 (s, 3H), 0,13 (s, 3H).
^{13}C RMN (CDCl_{3}, \delta): 159,1,
130,7, 129,3, 113,8, 99,8, 79,5, 75,7, 74,7, 73,0, 72,2, 67,4, 62,5,
55,2, 54,7, 18,0, 15,7, -4,3, -4,6.
^{13}C RMN (CDCl_{3}, con Cl_{3}CCONC
añadido, \delta): 159,3 (Ar C4'), 157,4, 149,3, 130,2, (Ar C2'),
129,6 (Ar C3',C5'), 113,8 (Ar C2',C6'), 99,6 (C1), 79,2 (C2), 74,56*
(4-OCH_{2}Ar o 2-CH_{2}CH_{3}), 74,54*
(4-OCH_{2}Ar o 2-CH_{2}CH_{3}), 73,2
(C3), 69,7 (C5), 67,2 (C4), 66,3 (C6), 55,2 (1-OMe),
54,9 (Ar-OMe), 25,9 (CMe_{3}), 18,0
(CMe_{3}), 15,6, -4,3, -4,7.
bpy_9:8:
^{1}H RMN (CDCl_{3}, \delta): 7,28 (m. sim,
2H), 6,86 (m. sim, 2H), 4,70 (d, 1,8 Hz, 1H, H1), 4,55 (d, 11,7 Hz,
1H, H6), 4,51 (d, 11,6 Hz, 1H, H6), 3,89-3,55 y 3,79
(m y s, 7H, H3, H4, H5, 2-OCH_{2}CH_{3},
1-OMe), 3,44 (dd, 1,8 Hz, 2,9 Hz, 1H, H2), 3,56 (s,
3H, Ar-OMe), 3,44 (dd, 1,8 Hz, 2,9 Hz, 1H, H2), 3,56
(s, 3H, Ar-OMe), 2,29 (d, 2,0 Hz, 1H,
4-OH), 1,20 (t, 7,0 Hz, 3H), 0,92 (s, 9H), 0,13 (s,
3H), 0,12 (s, 3H).
^{13}C RMN (CDCl_{3}, \delta): 159,1,
130,3, 129,3, 113,7, 99,7, 78,9, 73,19*, 73,16*, 71,3, 70,3, 69,1,
67,2, 55,2, 54,8, 25,8, 18,2, 15,6, -4,5, -4,6.
*resuelto multiplicando FID con una función de
peso gaussiana.
(Oxidación ref. D. F. Taber y col., J. Org. Chem.
52, 5621-2, 1987) Se disolvieron
2-O-etil-3-O-dimetil-t-butilsilil-4,-O-(4'-metoxi)bencil-\alpha-D-mannohexopiranósido
de metilo (bpy_9:3) (200 mg, 0,438 mmol) y dimetilsulfóxido (64,0
\mul, 0,876 mmol) en diclorometano (2,5 ml, secado sobre tamices
moleculares 4 \ring{A}) y la solución se enfrió en un baño de
hielo. Se añadió rápidamente pentóxido de fósforo (124 mg, 0,876
mmol) y se dejó que la suspensión agitada resultante alcanzara la TA
(1 h). La mezcla se enfrió de nuevo con hielo y se le añadió
trietilamina (214 \mul, 1,53 mmol) provocando una inmediata
disolución de la suspensión de tipo gel. El baño de hielo se retiró
y la mezcla se agitó a TA durante 1 h, se diluyó con acetato de
etilo, se lavó con dihidrogenofosfato sódico 0,2 M ac., se secó
sobre sulfato sódico y se concentró a presión reducida (<0,02
mbar). El residuo se disolvió en tetrahidrofurano (2 ml, se secó
sobre tamices moleculares 4 \ring{A}), se agitó y se enfrió a
-20ºC. Se añadió gota a gota cloruro de fenilmagnesio en
tetrahidrofurano (345 \mul de una solución al 25% en peso, 0,657
mmol, Janssen, Bélgica) (3 min). La reacción se controló con ccf
(4:1 de tolueno-acetato de etilo) y se inactivó con
sulfato amónico ac. al 10% (3 ml). La mezcla se diluyó con acetato
de etilo y se lavó dos veces con agua, se secó sobre sulfato sódico
y se concentró a presión reducida. El residuo se sometió a
cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice (20:1 de
tolueno-metil t-butil éter). Las fracciones
que contenían el componente con un R_{f} = 0,44 sobre ccf (4:1 de
tolueno-acetato de etilo) se reunieron y se
concentraron a presión reducida, produciendo 65 mg, 30% del
compuesto del título.
Los cálculos de mecánica molecular con
MM2(91) (Burkert y Allinger, 1982) de los diastereómeros R y
S y los posteriores cálculos con la ecuación de Karplus
(Bothner-By, 1965) predijeron que la ^{1}H RMN
J_{5-6} sería de 4,8 y 6,2 respectivamente. Esta
diferencia es demasiado pequeña para ser sólo una indicación de la
estereoquímica. Además, la señal H6 se resuelve pobremente y la
señal H5 se solapa severamente por otras resonancias. El pico
cruzado ^{1}H-COSY H4-H5, sin
embargo, contiene la suma de J_{4-5} +
J_{5-6} y ya que J_{4-5} puede
observarse en la resonancia de H4, a J_{5-6} se le
puede asignar el valor de 6,8 Hz. Esto indica que el producto
aislado tiene la estereoquímica 6-(S).
Después de la retirada del grupo
4-metoxibencilo, las constantes de acoplamiento
calculadas se convirtieron en 5,5 Hz y 12,9 Hz, respectivamente.
^{1}H RMN (CDCl_{3}, \delta):
7,44-7,19 (m, 7H), 6,89 (m. sim, 2H), 5,00 (m a, 1H,
H6), 4,90 (d, 10,8 Hz, 1H), 4,66 (d, 10,8 Hz, 1H), 4,58 (d, 1,8 Hz,
1H, H1), 4,04 (dd, 3,1 Hz, 9,0 Hz), 3,99 (t, 9,2 Hz, 1H, H4), 3,81 y
3,82-3,56 (s y m, 6H, 1-OMe,
2-CH_{2}CH_{3}), H5), 3,44 (dd, 2,0 Hz,
2,9 Hz, 1H, H2),2,84 (s, 3H, Ar-OMe), 1,24 (t, 3H),
1,97 (s, 9H), 0,15 (s, 3H), 0,13 (s, 3H).
^{13}C RMN (CDCl_{3}, \delta): 159,0, 14
2,5, 130,8, 129,2, 127,7, 126,7, 1 26,6, 125,7, 113,7, 99,5, 79,8,
76,1, 74,5, 73,0, 70,9, 67,9, 55,1, 54,1, 25,8, 17,9, 15,4, -4,5,
-4,8.
A una suspensión agitada de hidruro sódico (2,6
g, 65 mmol, dispersión al 65% en aceite mineral) en
N,N-dimetilformamida (150 ml) se le añadió con agitación una
solución de
4,6-O-p-metoxibenciliden-\alpha-D-glucopiranósido
(9,36 g, 30 mmol) en N,N-dimetilformamida (65 ml). La mezcla
se agitó durante 45 minutos y se le añadió
p-toluenosulfonilimidazol (7,24 g, 33 mmol). La agitación se
continuó durante 2 horas y la mezcla se vertió en agua enfriada con
hielo. El precipitado se retiró por filtración y se secó al vacío,
dando bpy_9:8 bruto (7,7 g).
Recristalización dos veces en metanol (250 ml
dieron bpy_9:9 (3,59 g). La cromatografía (SiO_{2}, acetato de
etilo-heptano, 2:3) del agua madre seguida de
cristalización en metanol (150 ml) dio más bpy_9:9 (1,87 g). El
rendimiento total de bpy_9:9 fue de 5,45 g (61%).
p.f. 152-153,5ºC (metanol)
[\alpha ]^{22}{}_{D}: 96,4º (c 1,8,
cloroformo)
^{1}H RMN (CDCl_{3}) \delta: 7,43 y 6,91
(patrón AB, acoplado adicionalmente, 2H, J_{AB} = 8,7 Hz), 5,53
(s, 1H, ArCH), 4,90 (s, 1H, H-1),
4,30-4,19 (sim. m, 1H), 3,82 (s, 3H, CH_{3}OAr),
3,78-3,64 (3H), 3,49-3,46 (4H), 3,48
(s, 3H, CH_{3}O), 3,18 (d, 1H, J = 3,7 Hz,
H-2/H-3) ppm.
^{13}C RMN (CDCl_{3}) \delta: 160,3, 129,6,
127,5, 113,7, 102,4, 96,9, 74,8, 69,4, 61,7, 55,7, 53,8 y 50,5
ppm.
Se agitaron
2,3-anhidro-4,6-O-p-metoxibenciliden-\alpha-D-mannopiranósido
de metilo (bpy_9:9, 2,35 g, 8 mmol), azida sódica (2,08 g, 32 mmol)
y cloruro amónico (0,86 g, 16 mmol) durante 5 horas a 110ºC en una
mezcla de 2-metoxietanol (25 ml) y agua (5 ml). La
suspensión se disolvió gradualmente, dando una solución turbia.
Después, la mezcla se repartió entre acetato de etilo y NaOH acuoso
(0,25 M, 100 ml). La fase acuosa se extrajo dos veces con acetato de
etilo y las fases orgánicas combinadas se lavaron dos veces con agua
y otras tantas con NaCl saturado acuoso, se secaron
(Na_{2}SO_{4}), se filtraron y se concentraron. La cromatografía
(SiO_{2}) con acetato de etilo-heptano,
2:3-2:1) dio bpy_9:10 (1,97 g, 73%). Se cristalizó
una muestra analítica en acetato de
etilo-heptano.
p.f. 91-93ºC (EtOAc/Heptano)
[\alpha]^{22}_{D}: +26,1º (c
1,1, cloroformo)
^{1}H RMN (CDCl_{3}) \delta: 7,44 y 6,91
(patrón AB acoplado adicionalmente, 2H, J_{AB} = 8,6 Hz), 5,57 (s,
1H, ArCH), 4,56 (s, 1H, H-1),
4,43-4,21 (2H), 4,16-4,08 (1H), 4,03
(dd sin resolver, 1H, J_{1} = J_{2} = 3 Hz), 3,91 (s a, 1H,
H-2), 3,83-3,74 (4H), 3,80 (s, 3H,
CH_{3}O), 3,43 (s, 3H, CH_{3}O), 2,36 (s a, 1H, OH) ppm.
^{13}C RMN (CDCl_{3}) \delta: 160,3, 129,5,
127,5, 113,7, 102,3, 101,4, 75,8, 69,8, 69,0, 60,1, 59,0, 55,7 y
55,3 pm.
La acetilación (anhídrido
acético-piridina, 3:5) de una muestra de bpy_9:10
dio un acetato que tenía el siguiente espectro ^{1}H RMN (las
asignaciones se confirmaron por el correspondiente espectro
mononuclear COSY):
^{1}H RMN (CDCl_{3}) \delta: 7,43 y 6,91
(patrón AB acoplado adicionalmente, 2H, J_{AB} = 8,8 Hz), 5,59 (s,
1H, ArCH), 4,97 (dd, 1H, J = 2,2 y 0,9 Hz,
H-2), 4,57 (s, 1H, H-1), 4,36 (2H,
H-6 y H-4),
4,09-4,01 (2H, H-6 y
H-3), 3,84-3,74 (2H, CH_{3}O y
H-5), 3,81 (s, 3H, CH_{3}O), 3,44 (s, 3H,
CH_{3}O), 2,15 (s, 3H, CH_{3}CO) ppm.
Se agitaron
3-azido-4,6-O-p-metoxibenciliden-\alpha-D-altropiranósido
de metilo (bpy_9:10, 1,7 g, 5 mmol), óxido de bario (3,0 g, 19,6
mmol) y yoduro de etilo (5 ml, 62 mmol) en dimetilsulfóxido (5 ml).
Se añadió agua (10 \mul) y la agitación se continuó durante 16
horas. Después, la mezcla se repartió entre acetato de etilo y agua.
La fase acuosa se extrajo dos veces con acetato de etilo y las fases
orgánicas combinadas se lavaron dos veces con agua y después con
NaCl saturado acuoso, se secaron (Na_{2}SO_{4}), se filtraron y
se concentraron. La cromatografía (SiO_{2}, acetato de
etilo-heptano, 1:3) dio bpy_9:11 en forma de un
aceite (1,7 g, 92%).
[\alpha]^{22}_{D}: 19,1º (c
1,6, cloroformo).
^{1}H RMN (CDCl_{3}) \delta: 7,44 y 6,91
(patrón AB, acoplado adicionalmente, 2H, J_{AB} = 8,6 Hz), 55,57
(s, 2H, ArCH), 4,63 (s a, 1H, H-1),
4,14-4,06 (2H), 3,85-3,75 (4H), 3,81
(s, 3H, CH_{3}O), 3,73-3,56 (sim. m, 2H), 3,52
(dd, 1H, J = 2,4 y 0,9 Hz, H-3), 3,34 (s, 3H,
CH_{3}O), 1,25 (t, 3H, J = 6,9 Hz, CH_{3}CH_{2})
ppm.
^{13}C RMN (CDCl_{3}) \delta: 160,1, 129,6,
127,4, 113,6, 102,1, 99,6, 77,0, 76,1, 69,0, 66,5, 58,7, 58,1, 55,5,
55,2 y 15,3 ppm.
(Cf. R. Johansson y B. Samuelsson; J. Chem.
Soc. Commun. 1984, 201-202).
Se agitaron
3-azido-3-desoxi-2-O-etil-4,6-O-p-metoxibenciliden-\alpha-D-altropiranósido
de metilo (bpy_9:11) (2,41 g, 6,6 mmol), cianoborohidruro sódico
(2,5 g, 39,6 mmol) y tamices moleculares triturados (5 g) en
acetonitrilo (130 ml) a 0ºC. Se añadió una solución de cloruro de
trimetilsililo (5,0 ml, 40 mmol) en acetonitrilo (45 ml) durante 5
min. Después de 1,5 h más de agitación, el baño de refrigeración se
retiró y la agitación se continuó durante 21 h. La mezcla se filtró
a través de celite y el filtrado se repartió entre acetato de etilo
y NaHCO_{3} saturado acuoso. La fase orgánica se lavó dos veces
con NaHCO_{3} saturado acuoso y después con NaCl saturado acuoso,
se secó (Na_{2}SO_{4}+NaHCO_{3}), se filtró y se evaporó. La
cromatografía dos veces (SiO_{2}, 2:7 \rightarrow 2:1 de acetato
de etilo-heptano y 1:2 \rightarrow 2:1 de acetato
de etilo-tolueno) dio el compuesto del título (2,23
g, 92%) en forma de un aceite.
[\alpha]^{22}_{D}: +113,6º (c 1,4,
cloroformo)
Datos de ^{1}H RMN (CDCl_{3}) \delta: 7,30
y 6,89 (patrón AB, acoplado adicionalmente, 4H, J = 8,8 Hz), 4,62 y
4,56 (patrón AB, 2H, J = 11,3 Hz, H bencílico), 4,58 (d sin
resolver, acoplado virtualmente, 1H, J <2 Hz,
H-1), 4,00-3,84 (3H,
H-3, H-4 y H-5),
3,81 (s, 3H, CH_{3}OAr), 3,84-3,7 (2H,
H-6), 3,62-3,43 (3H,
CH_{2}CH_{3} y H-2), 3,38 (s, 3H,
CH_{3}O), 1,99 (s a, 1H, OH) y 1,19 (t, 3H, J = 7,0 Hz,
CH_{2}CH_{3}) ppm.
Datos de ^{13}C RMN (CDCl_{3}) \delta:
159,6, 129,9, 129,6, 113,9, 99,9, 76,9, 72,2, 71,9, 67,7, 66,3,
62,4, 58,6, 55,4, 55,3 y 15,4 ppm.
Una solución de
3-azido-3-desoxi-2-O-etil-4-O-p-metoxi-bencil-\alpha-D-altro-piranósido
de metilo (1,47 g, 4 mmol) en piridina (35 ml) se agitó a 0ºC. Se
añadió cloruro de benzoílo (1,2 ml, 10,3 mmol) y la temperatura se
aumentó a temperatura ambiente. La agitación se continuó durante 1,5
h y después la mezcla se enfrió a 0ºC. Se añadió metanol (10 ml) y
la mezcla se agitó durante 20 min más a temperatura ambiente, se
evaporó y se repartió entre acetato de etilo y agua. La fase
orgánica se lavó posteriormente con agua, NaHCO_{3} saturado
acuoso, agua y NaCl saturado acuoso, se secó (Na_{2}SO_{4}), se
filtró y se evaporó. La cromatografía (SiO_{2}, 1:4 de acetato de
etilo-heptano) dio el benzoato (1,64 g, 87%).
[\alpha]^{22}_{D}: +0,95º (c
1,0, cloroformo)
Datos de ^{1}H RMN (CDCl_{3}) \delta:
8,04-7,98 (m, 2H), 7,56 (tt, 1H, J = 7,5 y 1,3 Hz),
7,43 (t, acoplado adicionalmente, 2H, J = 7,5 Hz), 7,26 y 6,83
(patrón AB, acoplado adicionalmente, 4H, J = 8,6 Hz), 4,62 y 4,50
(patrón AB, 2H, J = 11,3 Hz, ArCH_{2}) 4,63 (d, acoplado
adicionalmente, J = 1,3 Hz, H-1), 4,54 (parte A de
un sistema ABX, 1H, J = 11,8 y 2,7 Hz, H-6_{a}),
4,47 (parte B de un sistema ABX, 1H, J = 11,8 y 5,5 Hz,
H-6_{b}), 4,27 (ddd, 1H, J = 8,4, 5,5 y 2,7 Hz,
H-5), 3,99-3,92 (2H,
H-3 y H-4), 3,74 (s, 3H,
CH_{3}OAr), 3,67-3,48 (3H, CH_{2}CH_{3}
y H-2) y 1,22 (t, 3H, J = 7,0 Hz,
CH_{2}CH_{3}) ppm.
Datos de ^{13}C RMN (CDCl_{3}) \delta:
166,2, 159,5, 132,9, 130,1, 129,9, 129,6, 129,2, 128,3, 113,9, 99,6,
76,72, 72,0, 71,7, 62,3, 62,2, 64,1, 58,5, 55,4, 55,2 y 15,4
ppm.
(Cf. H. P. Wessel; J. Carbohydr. Chem. 11
(8), (1992), 1039-1052).
A una solución agitada de
3-azido-6-O-benzoil-3-desoxi-2-O-etil-4O-p-metoxibencil-\alpha-D-altopiranósido
de metilo (620 mg, 1,31 mmol) en tetrahidrofurano (40 ml) se le
añadieron agua (265 ml) y trifenilfosfina (1,7 g, 6,5 mmol). La
solución se agitó durante 24 h y después se concentró hasta 12 ml.
El residuo se diluyó con metanol (10 ml) y agua (3 ml). Después, a
la solución agitada se le añadió complejo de
trimetilamina-trióxido de azufre (370 mg, 2,7 mmol).
El pH se ajustó a 8,5 mediante NaOH acuoso 1 M. Después de unos
minutos se formó un precipitado que se disolvió añadiendo
tetrahidrofurano (3 ml) y metanol (4 ml). La mezcla de reacción se
agitó durante 0,5 h, después de lo cual se añadió más complejo de
trimetilamina-trióxido de azufre (86 mg). La
agitación se continuó durante 15 min. Durante el transcurso de la
reacción, el pH se mantuvo a 8-9 mediante la adición
de NaOH acuoso 1 M. Después, la mezcla se diluyó con agua (7 ml) y
los disolventes orgánicos se evaporaron a presión reducida. Se
añadió más agua (5 ml) y la suspensión se liofilizó y se
cromatografió (SiO_{2}, 100:15:1 \rightarrow 70:30:5 de
cloroformo-metanol-agua), dando el
compuesto sulfamino, presumiblemente en forma de sal sódica (668 mg,
92%) después de la liofilización en agua. Se cristalizó una muestra
en acetona acuosa.
p.f. 112-115ºC (acetona
acuosa).
[\alpha]^{22}_{D}: +156,4º (c
0,5 agua)
Datos de ^{1}H RMN (CD_{3}OD) \delta:
7,94-7,89 (m, 2H), 2H, 7,64-7,56 (m,
1H), 7,44 (m, 2H), 7,28 y 6,73 (patrón AB, acoplado adicionalmente,
4H, J = 8,6 Hz), 4,71 y 4,49 (patrón AB, 2H, J = 11,4 Hz,
ArCH_{2}), 4,68 (s a, 1H, H-1), 4,51 (dd,
1H, J = 11,6 y 2,4 Hz, H-6_{a}), 4,44 (dd, 1H, J =
11,6 y 4,4 Hz, H-6_{b}), 4,09 (ddd sin resolver,
1H, J \cong 4, 3 y 1 Hz, H-3),
4,00-3,92 (2H, H-5 y
H-2), 3,86 (dd, 1H, J = 9,9 Hz y 4,2 Hz,
H-4), 3,71-3,54 (5H,
CH_{2}CH_{3} y CH_{3}OAr), 3,65 (s, CH_{3}OAr), 3,40
(s, 3H, CH_{3}O) y 1,17 (t, 3H, J = 7,0 Hz,
CH_{2}CH_{3}) ppm.
Datos de ^{13}C RMN (CD_{3}OD) \delta:
167,8, 160,8, 134,2, 131,4, 130,9, 130,6, 129,5, 114,7, 101,6,
77,03, 70,02, 69,2, 67,0, 66,4, 65,2, 55,6, 55,5, 50,6 y 15,8
ppm.
Se hidrogenó la sal sódica de
6-O-benzoil-3-desoxi-2-O-etil-4-O-p-metoxibencil-3-sulfamino-\alpha-D-altro-piranósido
de metilo (334 mg, 2,0 mmol) durante 6 h en ácido acético glacial
(55 ml) a 0,23 MPa y a temperatura ambiente, usando paladio al 5%
sobre carbón como catalizador. El filtrado y la liofilización dieron
un residuo que se cromatografió (SiO_{2}, 100:15:1 \rightarrow
70:30:5 de cloroformo-metanol-agua).
El producto se disolvió en agua y se pasó a través de una resina de
intercambio de cationes (BIO-REX® 70, malla
200-400, en forma de amonio) y se liofilizó, dando
el compuesto del título (222 mg, 86%).
[\alpha]^{22}_{D}: +55,7º (c
1,3, agua)
Datos de ^{1}H RMN
(piridina-d_{5}) \delta:
8,23-8,17 (2H), 7,52-7,45 (1H),
7,42-7,35 (2H), 5,09 (dd, 1H, J = 11,65 y 1,54 Hz,
H-6_{a}), 4,82 (dd, 1h, J = 11,43 y 6,81 Hz,
H-6_{b}), 4,82 (s, 1H, H-1), 4,66
(dd sin resolver, 1H, J \cong 3,5 y 3,5 Hz, H-3),
4,36 (dd, 1H, J = 10,11 y 3,96 Hz, H-4),
4,32-4,23 (1H, H-5), 4,18 (d, 1H, J
= 3,08 Hz, H-2), 3,60-3,44 (2H,
CH_{2}CH_{3}), 3,16 (s, 3H, CH_{3}O) y 1,00 (t, 3H, J =
7,0 Hz, CH_{2}CH_{3}) ppm.
Datos de ^{1}H RMN (D_{2}O, ref. acetona a
2,35 ppm) \delta: 8,22-8,17 (2H), 7,83 (tt, 1H, J
= 7,5 y <2 Hz), 7,72-7,65 (2H), 4,97 (HDO), 4,93
(s, 1H, H-1), 4,81 (dd, acoplado virtualmente, 1H, J
= 12 y 1,7 Hz, H-6_{a}), 4,65 (dd, acoplado
virtualmente, 1H, J = 12 y 5,5 Hz, H-6_{b}),
4,18-4,15 (2H, H-4 y
H-5), 4,05 (dd, 1H, J = 3,3 y 1,4 Hz,
H-2), 3,95-3,75 (sim. m, 2H,
CH_{2}CH_{3}), 3,94-3,91 (m, 1H,
H-3), 3,54 (s, 3H, CH_{3}O) y 1,35 (t, 3H, J = 7
Hz, CH_{2}CH_{3}) ppm (las asignaciones de las señales
del espectro ^{1}H RMN se hicieron sobre la base de un experimento
COSY).
Datos de ^{13}C RMN (D_{2}O, ref.: acetona a
33,19 ppm) \delta 171,4, 136,9, 132,5, 132,1, 131,7, 102,5, 78,4,
69,9, 69,1, 67,4, 65,7, 58,1, 56,0 y 17,5 ppm.
Una solución de
3-azido-3-desoxi-2-O-etil-4-O-p-metoxi-bencil-\alpha-D-altro-piranósido
de metilo (476 mg, 1,3
mmol) en piridina (8 ml) se agitó a 0ºC. Se añadió cloruro de pivaloílo (390 \mul, 3,25 mmol) y la temperatura se aumentó a temperatura ambiente. La agitación se continuó durante 1,5 h y después la mezcla se enfrió a 0ºC. Se añadió metanol (10 ml) y la mezcla se agitó durante 20 min más a temperatura ambiente, se evaporó y se repartió entre acetato de etilo y agua. La fase orgánica se lavó posteriormente con agua, NaHCO_{3} saturado acuoso, agua y NaCl saturado acuoso, se secó (Na_{2}SO_{4}), se filtró y se evaporó. La cromatografía (SiO_{2}, 1:4 de metil terc-butil éter-heptano) y (C-18 Lobar, Merck, 4:1 de agua con acetonitrilo) dio el pivaloato (431 mg, 75%).
mmol) en piridina (8 ml) se agitó a 0ºC. Se añadió cloruro de pivaloílo (390 \mul, 3,25 mmol) y la temperatura se aumentó a temperatura ambiente. La agitación se continuó durante 1,5 h y después la mezcla se enfrió a 0ºC. Se añadió metanol (10 ml) y la mezcla se agitó durante 20 min más a temperatura ambiente, se evaporó y se repartió entre acetato de etilo y agua. La fase orgánica se lavó posteriormente con agua, NaHCO_{3} saturado acuoso, agua y NaCl saturado acuoso, se secó (Na_{2}SO_{4}), se filtró y se evaporó. La cromatografía (SiO_{2}, 1:4 de metil terc-butil éter-heptano) y (C-18 Lobar, Merck, 4:1 de agua con acetonitrilo) dio el pivaloato (431 mg, 75%).
Datos de ^{1}H RMN (CDCl_{3}) \delta: 7,28
y 6,89 (patrón AB, acoplado adicionalmente, 4H, J = 8,6 Hz,), 4,60 y
4,49 (patrón AB, 2H, J = 11,0 Hz, ArCH_{2}), 4,57 (s, 1H,
H-1), 4,39 (dd, 1H, J = 14,5 y 5,3 Hz,
H-6_{a}), 4,57 (s, 1H, H-1), 4,39
(dd, 1H, J = 14,5 y 5,3 Hz, H-6_{a}), 4,13 (2H,
H-6_{b} y H-4), 3,93 (m, 1H,
H-3), 3,84-3,78 (4H,
H-5 y MeOAr), 3,64-3,45 (3H,
CH_{2}CH_{3} y H-2) 3,39 (s, 3H,
1-OMe) y 1,22-1,15 (s y t, 12H, J =
7,0 Hz, C(CH_{3})_{3} y CH_{2}CH_{3})
ppm.
Datos de ^{13}C RMN (CDCl_{3}) \delta:
178,1, 159,6, 129,9, 129,3, 113,9, 99,5 (C-1), 76,7
(C-2), 72,5 (C-5), 71,9
(ArCH_{2}), 66,4 (C-4), 66,2
(CH_{2}CH_{3}), 63,6 (C-6), 58,5, 55,3,
55,2, 38,8, 27,2 y 15,4 ppm.
(Cf. H. P. Wessel; J. Carbohydr. Chem. 11
(8), (1992), 1039-1052).
A una solución agitada de
3-azido-6-O-pivaloil-3-desoxi-2-O-etil-4-O-p-metoxibencil-\alpha-D-altopiranósido
de metilo (300 mg, 0,683 mmol) en tetrahidrofurano (20 ml) se le
añadieron agua (150 ml) y trifenilfosfina (0,90 g, 3,3 mmol). La
solución se agitó durante 24 h y después se concentró hasta 5 ml. El
residuo se diluyó con metanol (5 ml) y agua (1 ml). Una mitad de
esta solución se usó para preparar el correspondiente oxamato (véase
48,182). A la mitad restante de la solución agitada (0,342 mmol) se
le añadió después complejo de trimetilamina-trióxido
de azufre (99 mg, 0,719 mmol). El pH se ajustó a 8,5 mediante NaOH
acuoso 1 M. Después de unos minutos se formó un precipitado que se
disolvió mediante la adición de tetrahidrofurano (0,7 ml) y metanol
(1 ml). La mezcla de reacción se agitó durante 0,5 h, después de lo
cual se añadió más complejo de
trimetilamina-trióxido de azufre (45 mg). La
agitación se continuó durante 15 min. Durante el transcurso de la
reacción el pH se mantuvo a 8-9 mediante la adición
de NaOH acuoso 1 M. Después, la mezcla se diluyó con agua (2 ml) y
los disolventes orgánicos se evaporaron a presión reducida. Se
añadió más agua (5 ml) y la suspensión se liofilizó y se
cromatografió (SiO_{2}, 100:15:1 \rightarrow 80:20:1 de
cloroformo-metanol-agua), dando el
compuesto sulfamino, presumiblemente en forma de la sal sódica (161
mg, 80%) después de la liofilización en agua.
Datos de ^{1}H RMN
(dmso-D_{6}) \delta: 7,24 y 6,87 (patrón AB,
acoplado adicionalmente, 4H, J = 8,8 Hz), 4,69 y 4,24 (patrón AB,
2H, J = 10,8 Hz, ArCH_{2}), 4,58 (s, 1H,
H-1), 4,29 (dd, 1H, J = 11,4 y 1,7 Hz,
H-6_{a}), 4,05-3,96 (2H,
H-6_{b} y NH), 3,83-3,76 (m, 2H,
H-2 y H-3),
3,76-3,73 (4H, s y m, H-5 y MeOAr),
3,54-3,40 (3H, CH_{2}CH_{3} y
H-4), 3,27 (s, 3H, 1-OMe) y
1,12-1,02 (s y t, 12H, J = 7,0 Hz,
C(CH_{3})_{3} y CH_{2}CH_{3}) ppm.
Se hidrogenó la sal sódica de
6-O-pivaloil-3-desoxi-2-O-etil-4-O-p-metoxibencil-3-sulfamino-\alpha-D-altro-piranósido
de metilo (153 mg, 0,259 mmol) durante 6 h en ácido acético glacial
(8 ml) a 0,23 MPa y a temperatura ambiente, usando paladio al 5%
sobre carbono como catalizador. El filtrado y la liofilización
dieron un residuo que se cromatografió (SiO_{2}, 80:20:1 de
cloroformo-metanol-agua con NH_{3}
al 0,1%), dando el compuesto del título (77,2 mg, 74%).
Datos de ^{1}H RMN (D_{2}O, ref. acetona a
2,35 ppm) \delta: 4,83 (HDO), 4,78 (s, 1H, H-1),
4,43 (dd, acoplado virtualmente, H, J = 11,5 y 1,1 Hz,
H-6_{a}), 4,30 (dd, acoplado virtualmente, 1H, J =
11,5 y 5,1 Hz, H-6_{b}), 3,95-3,91
(2H, H-4 y H-5), 3,89 (dd, 1H, J =
3,3 y 1,3 Hz, H-2), 3,80-3,62 (m,
3H, H-3 y CH_{2}CH_{3}), 3,42 (s, 3H,
CH_{3}O) y 1,24-1,21 (s y t, 12H, J = 7 Hz,
^{t}Bu y CH_{2}CH_{3}) ppm (las asignaciones de las
señales del espectro ^{1}H RMN se hicieron sobre la base de un
experimento COSY).
Datos de ^{13}C RMN (D_{2}O, ref.: acetona a
33,19 ppm) \delta 188,3, 106,2, 82,2, 73,8, 72,8, 70,6, 69,3,
61,9, 59,8, 45,6 37,1 y 21,3.
Se enfrió cloruro de oxalilo (120 \mul, 1,37
mmol) disuelto en tetrahidrofurano (1 ml) a -26ºC. Se añadió gota a
gota una solución de t-butanol (131 mg, 1,77 mmol) y piridina
(154 \mul, 1,91 mmol) en tetrahidrofurano (2 ml) y la mezcla se
agitó a -26ºC durante 15 min, mientras el precipitado amarillento
formado inicialmente se volvía blanco.
Los disolventes se retiraron a presión reducida
de la solución en tetrahidrofurano a partir de la reducción de
3-azido-6-O-pivaloil-3-desoxi-2-O-etil-4-O-p-metoxibencil-\alpha-D-altropiranósido
(150 mg, 0,342 mmol). El residuo se disolvió de nuevo en
tetrahidrofurano (2,5 ml) y piridina (154 \mul) y se añadió gota a
gota a la solución enfriada anterior y se agitó a -26ºC durante 1 h.
Se añadió agua (2 ml) y la mezcla se diluyó con t-butil metil
éter (15 ml) y se lavó con agua, carbonato ácido sódico saturado y
salmuera. La solución orgánica se secó sobre sulfato sódico y los
disolventes se retiraron a presión reducida. El residuo se
cromatografió (SiO_{2}, 1:8 de t-butil metil
éter-tolueno), produciendo 187 mg, 100% del
compuesto del título.
Datos de ^{1}H RMN (CDCl_{3}) \delta: 8,25
(d, 1H, 10,1 Hz, 3-NH), 7,26 y 6,85 (patrón AB,
acoplado adicionalmente, 4H, J = 8,6 Hz), 4,82-4,71
(m y d, 2H, 10,5 Hz, H-3 y ArCH_{2}), 4,69
(s, 1H, H-1), 4,42 (dd, 1H, 1,7 y 11,7 Hz,
H-6_{a}), 4,31 (d, 1H, 10,5 Hz,
ArCH_{2}), 4,16 (dd, 1H, 6,2 y 11,7 Hz,
H-6_{b}), 3,88 (ddd, 1H, 1,8, 5,9 y 10,3 Hz,
H-5), 3,81-3,75 (dd y s, 4H,
H-4 y ArOMe), 3,64-3,49 (m, 2H,
CH_{2}CH_{3}), 3,47-3,43 (dd y s, 4H,
1,3 y 3,1 Hz, H-2 y 1-OMe), 1,55 (s,
9H, oxamato C(CH_{3})_{3}), 1,19 y 1,18 (s y t,
12H, 7 Hz, 6-O pivaloato ^{t}Bu y
CH_{2}CH_{3}) ppm.
Datos de ^{13}C RMN (CDCl_{3}) \delta:
178,1, 159,4, 159,1, 157,4, 130,3, 129,4, 113,8, 98,9, 84,2, 77,2,
75,9, 70,8, 69,5, 65,8, 65,7, 63,4, 55,2, 55,1, 45,7, 38,8, 27,7,
27,1, 15,3 ppm.
Se disolvió
6-O-pivaloil-3-desoxi-2-O-etil-4-O-p-metoxibencil3-^{t}butiloxamido-\alpha-D-altropiranósido
de metilo
(180 mg, 332 \mumol) en una mezcla de ácido acético-etanol (1:1, 6 ml), se le añadió paladio sobre carbono (5%, 250 mg) y se sometió a hidrogenolisis a 268,895 kPa (39 psi) durante una noche. El catalizador se filtró sobre una capa de celite y se lavó con etanol. El filtrado se concentró a presión reducida y se redisolvió en diclorometano (2,4 ml). Se añadió ácido trifluoroacético (960 \mul) y la mezcla se agitó durante 4,5 h a temperatura ambiente. Se añadieron agua (3 ml) y amoniaco (3 M, 300 \mul) y la mezcla de reacción se concentró a presión reducida y se liofilizó. El residuo se cromatografió (SiO_{2}, 80:20:1 de cloroformo-metanol-agua con NH_{3} al 0,1%), dando el compuesto del título, 117,1 mg, 89%.
(180 mg, 332 \mumol) en una mezcla de ácido acético-etanol (1:1, 6 ml), se le añadió paladio sobre carbono (5%, 250 mg) y se sometió a hidrogenolisis a 268,895 kPa (39 psi) durante una noche. El catalizador se filtró sobre una capa de celite y se lavó con etanol. El filtrado se concentró a presión reducida y se redisolvió en diclorometano (2,4 ml). Se añadió ácido trifluoroacético (960 \mul) y la mezcla se agitó durante 4,5 h a temperatura ambiente. Se añadieron agua (3 ml) y amoniaco (3 M, 300 \mul) y la mezcla de reacción se concentró a presión reducida y se liofilizó. El residuo se cromatografió (SiO_{2}, 80:20:1 de cloroformo-metanol-agua con NH_{3} al 0,1%), dando el compuesto del título, 117,1 mg, 89%.
Datos de ^{1}H RMN (D_{2}O, ref. acetona a
2,35 ppm) \delta: 4,80 (HDO), j 4,78 (s, 1H, H-1),
4,45-4,35 (m, 2H, H-3 y
H-6_{a}), 4,26 (dd, 1H, 4,4 y 12,1 Hz,
H-6_{b}), 4,07-3,96 (m, 2H,
H-4 y H-5),
3,77-3,58 (m, 3H, CH_{2}CH_{3} y
H-2), 3,45 (s, 3H, 1-OMe),
1,20-1,13 (s y t, 12H, 6-O-pivaloato ^{t}Bu
y CH_{2}CH_{3}) ppm.
Datos de ^{13}C RMN (D_{2}O, ref.: acetona a
33,19 ppm) \delta: 188,1, 171,9, 171,4, 105,7, 82,4, 73,7, 72,9,
70,3, 69,7, 62,0, 56,1, 45,9, 37,0, 21,2 ppm.
Una solución de
3-azido-3-desoxi-2-O-etil-4-O-p-metoxi-bencil-\alpha-D-altro-piranósido
de metilo (476 mg, 1,3
mmol) en piridina (496 \mul) y diclorometano (2 ml) se agitó a 0ºC. Se añadió cloruro de metanosulfonilo (380 \mul, 4,90 mmol) y la temperatura se aumentó a temperatura ambiente. La agitación se continuó durante 5 h y después la mezcla se enfrió a 0ºC. Se añadió agua (1 ml) y la mezcla se agitó durante 20 min más a temperatura ambiente, se evaporó y se repartió entre acetato de etilo y agua. La fase orgánica se lavó posteriormente con agua, NaHCO_{3} saturado acuoso, agua y NaCl saturado acuoso, se secó (Na_{2}SO_{4}), se filtró y se evaporó. La cromatografía (SiO_{2}, 1:9 de metil terc-butil éter-tolueno) produjo 216 mg (79%) del mesilato en forma de un aceite amarillento.
mmol) en piridina (496 \mul) y diclorometano (2 ml) se agitó a 0ºC. Se añadió cloruro de metanosulfonilo (380 \mul, 4,90 mmol) y la temperatura se aumentó a temperatura ambiente. La agitación se continuó durante 5 h y después la mezcla se enfrió a 0ºC. Se añadió agua (1 ml) y la mezcla se agitó durante 20 min más a temperatura ambiente, se evaporó y se repartió entre acetato de etilo y agua. La fase orgánica se lavó posteriormente con agua, NaHCO_{3} saturado acuoso, agua y NaCl saturado acuoso, se secó (Na_{2}SO_{4}), se filtró y se evaporó. La cromatografía (SiO_{2}, 1:9 de metil terc-butil éter-tolueno) produjo 216 mg (79%) del mesilato en forma de un aceite amarillento.
Se disolvieron ácido
N-triisopropilsilil-pirrolo-3-carboxílico
(484 mg, 1,81 mmol) y
1,8-diazabiciclo[5,4,0]undec-7-eno
(255 \mul) en dimetilformamida (1 ml) y se añadieron a una
solución del mesilato anterior en dimetilformamida (1 ml). La mezcla
se calentó a 90ºC durante una noche y se sometió a cromatografía
(Lober C-8 de 210 g, Merck, 3:2 de
acetonitrilo:agua), produciendo 30 mg, 16% del éster de
pirroloílo.
Datos de ^{1}H RMN (CDCl_{3}) \delta: 8,73
(s a, 1H, pirrol NH), 7,39 (m. sim, 1H, pirrol H-4),
7,27 y 6,85 (patrón AB, acoplado adicionalmente, 4H, J = 8,8 Hz),
3,74 (m. sim, 1H, pirrol H-2), 3,64 (m. sim, 1H,
pirrol H-5), 4,63-4,49 (s y 2 d, 3H,
H-1 y ArCH_{2}), 4,48-4,36
(m, 2H, 2 H-6), 4,22 (m. sim, 1H,
H-5), 3,94-3,84 (m, 2H,
H-3 y H-4), 3,78 (s, 3H, ArOMe),
3,68-3,55 (m, 3H, CH_{2}CH_{3} y
H-2), 3,40 (s, 3H, 1-OMe), 1,20 (t,
3H, 6,8 Hz, CH_{2}CH_{3}) ppm.
Datos de ^{13}C RMN (CDCl_{3}) \delta:
164,6, 159,5, 129,9, 129,4, 123,6, 11,7, 116,1, 113,9, 109,9, 99,9,
76,9, 72,5, 72,0, 66,8, 66,3, 63,0, 58,9, 55,3, 55,2, 15,4 pm.
A una solución agitada de
3-azido-6-O-pivaloil-3-desoxi-2-O-etil-4-O-p-metoxibencil-\alpha-D-altropiranósido
de metilo (30 mg, 61 \mumol) en tetrahidrofurano (1 ml) se le
añadieron agua (11 \mul) y trifenilfosfina (83 mg, 305 \mumol).
La solución se agitó durante 24 h y se diluyó con agua (1 ml).
Después, se añadió complejo de
trimetilamina-trióxido de azufre (9 mg, 0,72
\mumol). El pH se ajustó a 8,5 mediante NaOH acuoso 1 M. Después
de unos minutos, se formó un precipitado que se disolvió mediante la
adición de tetrahidrofurano (0,7 ml) y metanol (1 ml). La mezcla de
reacción se agitó durante 0,5 h, después de lo cual se añadió más
complejo de trimetilamina-trióxido de azufre (9 mg).
La agitación se continuó durante 15 min. Durante el transcurso de la
reacción, el pH se mantuvo a 8-9 mediante la adición
de NaOH acuoso 1 M. Después, la mezcla se diluyó con agua (2 ml), se
lavó con t-butil metil éter, se liofilizó y se cromatografió
(SiO_{2}, 80:20:1 de
cloroformo-metanol-agua), dando el
compuesto sulfamino, presumiblemente en forma de sal sódica, (30,6
g, 93%) después de la liofilización en agua.
Datos de ^{1}H RMN (CD_{3}OD) \delta: 7,35
(dd sin resolver, x parte del patrón ABX, 1H, J_{AX}+J_{BX} =
3,5 Hz, pirrol H-2), 7,29 y 6,79 (patrón AB,
acoplado adicionalmente, 4H, J = 8,6 Hz), 6,75 (dd, 1H, 2,0 y 2,9
Hz, pirrol H-4), 6,51 (dd, 1H, 1,3 y 2,9 Hz, pirrol
H-5), 4,71 y 4,46 (patrón AB, 2H, J = 11,4 Hz,
ArCH_{2}), 4,66 (s a, 1H, H-1), 4,39 y 4,33
(2 dd, 2H, 2,6, 5,1 y 11,7 Hz, 2 H-6), 4,04 (m, 1H,
H-3), 3,97-3,87 (m y dd, 2H; 1,1 y
3,1 Hz, H-5 y H-2), 3,80 (dd, 1H,
4,4 y 10,1 Hz, H-4), 3,73 (s, 3H, ArOMe),
3,68-3,52 (m, 2H, CH_{2}CH_{3}), 3,39 (s,
3H, 1-OMe), 1,15 (t, 3H, 7,0 Hz,
CH_{2}CH_{3}) ppm.
Datos de ^{13}C RMN (CD_{3}OD) \delta:
167,32, 160,9, 131,3, 131,0, 125,3, 120,1, 116,3, 114,7, 110,2,
101,7, 77,2, 10,4, 69,9, 67,2, 66,4, 55,6, 55,5, 50,9 y 15,8
ppm.
El residuo se disolvió en metanol (15 ml), se le
añadió paladio sobre carbono (5%, 50 mg) y la mezcla se hidrogenó a
206,842 (30 psi) durante 3 h. El catalizador se retiró por
filtración, se redisolvió en amoniaco (2%) en
metanol-agua (1:1, 0,6 ml) y se cromatografió
(Supelco C-18 de 3 ml, 2:3 de
metanol-agua). El metanol se retiró a presión
reducida de las fracciones reunidas que contenían el producto y el
residuo se liofilizó, dando 6,2 g del compuesto del título en forma
de sal amónica.
Datos de ^{1}H RMN (CD_{3}OD) \delta: 7,35
(m, 1H, pirrol H-2), 6,75 (dd, 1H, 2,0 y 2,9 Hz,
pirrol H-4), 6,55 (dd, 1H, 1,3 y 11,4 Hz,
H-6_{a}), 4,31 (dd, 1H, 5,9 y 11,6 Hz,
H-6_{b}), 3,86-3,76 (m, 4H,
H-2, H-3, H-4,
H-5), 3,75-3,56 (m, 2H,
CH_{2}CH_{3}), 3,40 (s, 3H, 1-OMe), 1,21
(t, 3H, Hz, CH_{2}CH_{3}) ppm.
Para identificar de forma concluyente péptidos o
miméticos de péptidos que se unan fuertemente a PapD, se
requiere un buen ensayo. Los inventores han obtenido por ingeniería
genética la proteína de unión a maltosa (MBP) de forma que se
reconoce por PapD. Se usó el plásmido disponible en el
mercado pMAL-P2 que codifica MBP con un brazo de
engarce que codifica una secuencia fusionada al extremo 3' del gel.
MBP se secreta en el espacio periplásmico y se purifica fácilmente
por cromatografía de afinidad usando una resina de amilosa. MBP se
eluye de la columna con maltosa 20 mM. PapD no se
co-eluye con MBP cuando se
co-expresa con MBP, mientras que la fusión del
extremo COOH de PapD a MBP da como resultado la unión de
PapD a MBP para formar un complejo que se
co-eluye a partir de la columna de afinidad. Usando
esta estrategia, se ha descubierto que la fusión de los aminoácidos
carboxi terminales 140
(MBP-G1'-140') y 134
(MBP-G134') de PapD a MBP se obtiene la
formación de un complejo PapD-MBP fuerte que se purifica por
cromatografía de afinidad de maltosa. Se ha demostrado que el
complejo entre la fusión de MBP y PapD es estable en urea
hasta 3 m similar a la estabilidad del complejo PapD- PapG,
lo que indica que los aminoácidos COOH-terminales
134 de PapG probablemente tienen la mayor parte del motivo de
reconocimiento de chaperona. Además, la unión a la proteína de
fusión MBP ha resultado estar dependiente de los residuos de anclaje
de chaperona universales, Arg-8 y
Lys-112, como se describe en este documento, ya que
la mutaciones en estos dos residuos anulaban la unión de PapD
a la proteína de fusión MBP.
También es interesante ensayar la capacidad de
fusiones MBP-G para inhibir el ensamblaje del pilus
y de esta manera la unión de bacterias por
co-expresión de las proteínas de fusión en células
productoras de pili P. Si PapD se une a la fusión
MBP-G, es titulará a partir de subunidades de pilus
y de esta manera reducirá o anulará la formación del pilus. Esta
técnica será un mecanismo para validar el concepto de que los
péptidos de unión a chaperona pueden anular la virulencia de un
patógeno impidiendo el ensamblaje de las adhesinas localizadas en la
superficie. Usando este análisis, se ha descubierto que en cepas
productoras de pili P, la co-expresión de la fusión
MBP-G1'-140' y
MBP-G134' anula completamente la capacidad de las
bacterias para unirse a los glóbulos rojos y producir
hemaglutinación. Además, los inventores han demostrado recientemente
que después de la co-expresión de la fusión
MBP-G1'-140' en bacterias
HB101/pPAP5, no fue posible detectar ningún signo visual de pili
sobre la superficie de las bacterias por microscopía electrónica.
Esto es una evidencia de la teoría expresada en esta invención, de
que la prevención/inhibición de la unión entre las subunidades del
pilus y las chaperonas moleculares también previene el ensamblaje de
los pili intactos.
Estos resultados confirman la relevancia
biológica de la estructura cristalina descrita en la Fig. 3, que
demuestra que pueden obtenerse por ingeniería genética otras
proteínas para ser reconocidas por PapD por fusión del sitio
de reconocimiento carboxi terminal sobre esa proteína. Se han
purificado las fusiones MBP-G134' y
MBP-G1'-140' para establecer ensayos
in vitro para medir interacciones con PapD. Las
proteínas de fusión purificadas se aplican como un recubrimiento
sobre pocillos de placas de microtitulación y la capacidad de
PapD de unirse a las proteínas de fusión se ensaya en un
procedimiento ELISA. Este ensayo es crítico ya que permite ensayar
la capacidad de los compuestos para inhibir la unión de PapD
al dominio en PapG reconocido por la chaperona. Además, las
proteínas de fusión purificadas pueden usarse en el ensayo Pharmacia
BiaCore® para cuantificar la unión a PapD y establecer
ensayos de inhibición para compuestos de la invención. Ya se ha
sugerido que ciertos péptidos carboxi terminales corresponden a
parte del motivo de reconocimiento de la chaperona. De esta manera,
se puede investigar si los péptidos carboxi terminales pueden
inhibir la unión de PapD a la fusión
MBP-G1'-140' en el ensayo ELISA. El
desarrollo de este ensayo de alto rendimiento hace que sea posible
seleccionar bibliotecas peptídicas, bibliotecas químicas, compuestos
nativos y miméticos de péptidos con respecto a su capacidad de
inhibir la unión de chaperona. Además, este ensayo puede usarse para
ensayar si las chaperonas periplásmicas conocidas utilizan
paradigmas de reconocimiento comunes.
Además de ensayar los compuestos con respecto a
su capacidad de inhibir la unión a la fusión MBP-G,
se han establecido otros ensayos que miden las interacciones
PapD-péptido. Por ejemplo, se ha creado un ELISA para medir
la unión de PapD a péptidos aplicados como recubrimientos
sobre pocillos de placas de microtitulación. En este ensayo, el
péptido octamérico G1'-8'WT fue un inhibidor
igualmente eficaz que el 19-mero
G1'-19'WT, revelando que el octámero era un punto
de partida óptimo para el diseño de compuestos modificados con una
mayor afinidad para el sitio de unión de PapD (véase el
Ejemplo 7).
Además, como se ha descrito previamente, el
PapD nativo puede unirse a PapG desnaturalizado
reducido y restaurar el complejo de PapD-PapG
in vitro en un ensayo de reconstitución (Kuehn y col., 1991).
Este ensayo se ha propuesto para reflejar la fusión de
reconocimiento de PapD in vivo y se usará para
determinar la capacidad de los compuestos para inhibir la unión de
PapD a PapG in vitro. Por ejemplo, se ha demostrado
que el péptido PapG carboxi terminal inhibe la unión de
PapD a PapG en este ensayo, estableciendo que ocupa el
sitio de unión de la seguridad de pilus de PapD. Otra forma
de localizar las interacciones PapD-péptido es ensayar la
capacidad de los compuestos para reducir la proporción de
acontecimientos de escisión proteolítica bien definidos. Por
ejemplo, la digestión parcial con tripsina escinde PapD en el
bucle de P1-G1 en el residuo Lys-99
(véase el sitio "T" indicado en la Fig. 3). La velocidad de
escisión tríptica de PapD se redujo por preincubación de
PapD con péptidos PapG y PapK (véase el ejemplo
2). La protección observada de PapD por lo péptidos unidos
puede deberse a un cambio en la conformación local del bucle
F1-G1, o debido al contacto físico del bucle por el
péptido. De esta manera, estos ensayos pueden usarse como
investigación inicial de la capacidad de nuevos compuestos para
unirse a PapD e interferir con su función de reconocimiento.
Los compuestos de unión fuerte que inhiben la unión de PapD a
la fusión MBP-G1'-140' se
co-cristalizaran con PapD para proporcionar
la base estructural de la superficie de reconocimiento usada por
PapD. Como se dispone de nuevos datos cristalográficos, la
relevancia de las interacciones críticas PapD-inhibidor
PapD-potenciador se ensayará determinando el efecto de
mutaciones de localización dirigida sobre la capacidad de la
chaperona para unirse a subunidades de pilus y mediar el ensamblaje
del pilus. Esta importante información conducirá a definir cómo las
chaperonas reconocen la subunidades y la función de las
interacciones chaperona-subunidad.
También se ha desarrollado un ensayo cuantitativo
de unión de chaperona: se ha sintetizado un péptido PapG
modificado, donde la Ser-9' está sustituida con una
Cys. A partir de la estructura cristalina del PapD unido al
péptido, no se predijo que la cadena lateral de
Ser-9' interaccionaría con PapD. En su lugar,
esta cadena lateral se orientaba hacia el disolvente, pero la
Ser-9' esta adyacente al último aminoácido de la
cremallera interactiva entre PapD y el péptido. Después, la
sonda fluorescente sensible ambientalmente 5-IAF
(5-yodoacetamidofluoresceína) se acopló
covalentemente al péptido a través del grupo sulfhidrilo en el
residuo Cys y el péptido marcado se purificó; por supuesto, puede
emplearse cualquier otra sonda fluorescente ambientalmente sensible
adecuada. Se descubrió que la adición de PapD al péptido
produce una notable reducción en la intensidad de la fluorescencia y
un cambio en el máximo de emisión. Esta información se usó para
calcular una constante de unión para la interacción
PapD-péptido. Se determinó el cambio en la intensidad de
fluorescencia a 514 nm después de la adición de concentraciones
recientes de PapD. Representando las intensidades de
fluorescencia frente a las concentraciones de PapD, se
calculó una constante de unión de 2,5 x 10^{-6} M (Los cálculos se
realizaron en el programa informático disponible en el mercado
"Kaleidagraph").
De esta manera, es posible evaluar las constantes
de unión de otras sustancias que se unen a PapD de una manera
cuantitativa, ya que la adición de una sustancia que se une
competitivamente a PapD dará como resultado una mayor
fluorescencia en comparación con una situación en la que está
presente menos sustancia competitiva, o no está presente nada de
dicha sustancia en el sistema.
Se desarrollará un sistema de ensayo similar
usando MBP-G1'-140' en lugar del
péptido PapD como se ha descrito en este documento. Como se
ha descubierto que esta proteína de fusión interacciona con dos
sitios de unión en PapD, será posible 1) cuantificar la
afinidad de unión con el segundo sitio de unión (en el dominio 2) y
2) seleccionar compuestos que interaccionen con cualquiera de los
dos sitios de unión y cuantificar la interacción. Por supuesto, el
marcaje del péptido del sitio 2 con una sonda ambientalmente
sensible permitiría la determinación de la constante de unión usando
la misma metodología que se ha descrito anteriormente.
El descubrimiento de que la proteasa DegP es
responsable en gran medida de la degradación de las subunidades de
pilina en ausencia de una chaperona hace que la cepa degP41 sea un
candidato interesante para un sistema de ensayo in vivo de
los efectos ejercidos sobre PapD por compuestos de la
invención.
Cuando se administra una sustancia que previene,
inhibe o mejora la unión entre la chaperona y la subunidades de
pilus a un sistema que contiene la cepa de degP41, la
sustancia, incluso en pequeñas cantidades, debería ser tóxica para
la bacteria, ya que la bacteria DegP^{-} será incapaz de degradar
las subunidades de pilus que se acumulan. Debe indicarse que se usó
una cepa degP41 para identificar un sitio de unión
desconocido hasta ahora en el dominio 2 de PapD, véase el
ejemplo 10.
Sin embargo, tal ensayo requiere que la sustancia
ensayada pueda entrar en el espacio periplásmico o antes de que
pueda ejercer su efecto; este hecho hace que este tipo de ensayo sea
menos adecuado como ensayo de selección para compuestos de plomo, ya
que "ignorará" sustancias que tienen los efectos deseados sobre
la interacción chaperona-subunidad, pero que, por
ejemplo, son demasiado hidrófilos para entrar en el espacio
periplásmico. Por otra parte, el sistema será adecuado para evaluar
el potencial clínico de sustancias que ya han resultado
satisfactorias en los ensayos in vitro descritos en este
documento.
Una vez que está en su sitio el sistema modelo
PapD, por supuesto, los experimentos descritos anteriormente
pueden expandirse para incluir los otros miembros de la familia de
tipo PapD de las chaperonas. De esta forma, será posible
establecer los requisitos generales para el reconocimiento de
chaperona y la base molecular del paradigma de reconocimiento de
chaperona en bacterias gram negativas.
En el Ejemplo 10 se describen con detalle algunos
ensayos específicos para determinar las interacciones con chaperonas
moleculares.
Para proporcionar más información sobre las
interacciones chaperona-subunidad, se contempla la
síntesis de péptidos solapantes con la proteína PapG entera y
otras subunidades de pilus. Además, debe realizarse un sondeo de
péptidos que se unen a chaperonas disponibles usando tanto una
biblioteca de péptidos químicos como una biblioteca de presentación
de fagos. Las dos bibliotecas son complementarias ya que los
péptidos se presentan en diferentes medios que podrían influir de
manera importante sobre la unión a las chaperonas. En la práctica,
la biblioteca química está limitada a todos los hexapéptidos
posibles y a hepta- y octapéptidos si algunos de los aminoácidos
nativos se excluyen o si uno o dos residuos se mantienen constantes.
Esta biblioteca puede evaluarse por unión directa de la chaperona a
las perlas de resina y secuenciación de los péptidos interesantes.
La biblioteca de presentación de fagos contiene aproximadamente
10^{10} péptidos en la proteína PIII del denominado "fago de
fusión" que retiene la función del fago y presenta los péptidos
extraños en la superficie. La capacidad de los fagos que contienen
péptidos de unirse a PapD aplicado como un recubrimiento en
pocillos de placas de microtitulación puede detectarse en un ELISA
usando las técnicas descritas en el Ejemplo 6. Los fagos de unión
positiva se amplificarán, purificarán y se volverán a ensayar con
respecto a su capacidad de unirse a PapD. Se determinará la
secuencia del inserto de péptido de fagos de unión positiva y los
correspondientes péptidos se sintetizarán y se ensayarán con
respecto a su capacidad para inhibir la unión de PapD a la
fusión MBP-G como se describe en el Ejemplo 6.
Los resultados de los estudios indicados
anteriormente serán de máxima importancia para el diseño y
evaluación de ligandos que actúan como "inhibidores de
chaperona". A pesar de esto, la estructura cristalina del
complejo peptídico 19-mero PapD- PapG
proporciona una perspectiva suficiente en las interacciones de
chaperona-ligando para iniciar los estudios
sistemáticos de pequeños péptidos y miméticos de péptidos como
inhibidores de chaperona que ya están en el presente estado. El alto
poder inhibidor del péptido 8-mero PapG a
PapD (igual péptido 19-mero PapG, cf.
Ejemplo 6) revela la viabilidad de tales estudios y las
características conservadas del sitio de unión propuesto en las
chaperonas indica que tales inhibidores podrían tener una amplia
especificidad.
Se ha sugerido que la especificidad en el
reconocimiento del 19-mero PapG por
PapD se proporciona por el anclaje del extremo carboxilo del
péptido a los residuos Arg-8 y
Lys-112 de la hendidura de PapD y las
posteriores interacciones "de cremallera" entre residuos
hidrófobos alternos en el péptido y residuos hidrófobos
complementarios en PapD. Los siguientes experimentos
confirman esta hipótesis. En primer lugar, las mutaciones en los
residuos de anclaje Arg-8 y Lys-112
han anulado la unión de la subunidad in vivo. En segundo
lugar, la deleción del residuo C-terminal en el
19-mero PapG conduce a una reducción
sustancial de la unión a PapD ya que las interacciones "de
cremallera" hidrófobas entre el péptido y PapD después se
pusieron fuera de registro cuando el extremo
C-terminal del péptido de deleción se ancló a
Arg-8 y Lys-112. La hipótesis "de
cremallera" para la especificidad en la unión entre PapD y
péptidos (o subunidades de pilus) se ha investigado preliminarmente
realizando los siguientes experimentos:
Se preparó una serie de longitudes de péptidos
que forman el extremo C de PapG que consta de
G1'-5', G1'-6',
G1'-7', G1'-8',
G1'-11', G1'-16' y
G1'-19'. También se sintetizó una serie de reemplazo
y una serie de deleción de G1'-8'. En la serie de
reemplazo se reemplazaron Pro-1',
Phe-2', Leu-4',
Val-5', Met-6' y
Met-8' por Ser, mientras que Ser-3'
y Thr-7' se reemplazaron por Ala (es decir los
aminoácidos hidrófobos se reemplazaron por la Ser polar y los
aminoácidos hidrófilos se reemplazaron por Ala). En la serie de
deleción, un residuo en un momento en G1'-8' se
delecionó con la adición simultanea de serina (se encuentra en la
posición 9' en PapG nativo) para mantener la longitud del
péptido a 8 aminoácidos. Todos los péptidos se sintetizaron por la
estrategia en fase sólida Fmoc y se purificaron por HPLC de fase
inversa.
Después se investigó la capacidad de los péptidos
para inhibir la unión de PapD a la proteína de fusión
MBP-G1'-140' usando el siguiente
ensayo ELISA.
Se diluyeron soluciones madre de proteínas
MBP-G1'-140' en PBS a 0,1 \muM con
PBS. Los pocillos de placas de microtitulación se recubrieron con 50
\mul de las soluciones de proteína durante una noche a 4ºC. Los
pocillos se lavaron con PBS y se bloquearon con 200 \mul de
albúmina de suero bovino (BSA) al 3% en PBS durante 2 horas a 25ºC.
Las placas se lavaron vigorosamente tres veces con PBS y se
incubaron con 50 \mul de proteínas PapD 1-5
\muM en BSA-PBS al 3% durante 45 minutos a 45ºC.
El PapD se preincubó con cada uno de los péptidos a una
relación 1:25 durante 30 minutos antes de añadirse a los pocillos.
Después de tres lavados con PBS, los pocillos se incubaron con una
dilución 1:500 de antisuero anti- PapD de conejo en
BSA-PBS al 3% durante 45 minutos a 25ºC. Después de
tres lavados con PBS, los pocillos se incubaron con una dilución
1:1000 de antisuero de cabra contra IgG de conejo acoplado a
fosfatasa alcalina en BSA-PBS al 3% durante 45
minutos a 25ºC. Después de 3 lavados con PBS y 3 lavados con el
tampón revelado (dietanolamina 10 mM, MgCl_{2} 0,5 mM), se
añadieron 500 \mul de p-nitrofenil fosfato a 1
mg/ml filtrado en tampón de revelado, la reacción se incubó durante
1 hora o más si era necesario en la oscuridad a 25ºC y se leyó la
absorbancia de 405 nm.
En las Figs. 17-19 se presentan
las potencias inhibidoras de los péptidos en las tres series y en
las figuras se proporciona el número de experimentos realizados con
cada serie. Las líneas verticales para cada péptido en las figuras
son intervalos de confianza del 95% obtenidos después de un análisis
estadístico de los datos experimentales. Como se revela por la
evaluación de la serie de longitud, los péptidos
G1'-8', G1'-11' y
G1'-16' son significativamente más potentes que los
péptidos G1'-6' y G1'-7' más cortos
(Fig. 17). Esta observación se ajusta muy bien con la estructura
cristalina de PapD complejado con G1'-19' que
demuestra que los 8 residuos C-terminales en
G1'-19' presentan unión de hidrógeno a PapD.
Los péptidos G1'-6' y G1'-7' más
cortos no pueden satisfacer este modelo de unión de hidrógeno y, por
lo tanto, son péptidos inhibidores menos activos (Fig. 18). La serie
de reemplazo revela que los residuos 4', 5' y 6' en
G1'-8' forman contactos importantes con PapD,
ya que su reemplazo produce péptidos inhibidores menos activos (Fig.
18). La serie de deleción de nuevo indicó un papel importante para
los residuos 4', 5' y 6' en G1'-8' para la formación
del complejo con PapD (Fig. 19). Sin embargo, los resultados
obtenidos con la serie de deleción no confirmaron la hipótesis "de
cremallera" según la cual los miembros de la serie de deleción
mostrarían una potencia inhibidora creciente ya que la deleción se
mueve desde el extremo C hacia el extremo N de
G1'-8'.
Como parece a partir de estos resultados
preliminares, los resultados obtenidos en el ensayo presentan
grandes desviaciones de la media en cada experimento. Como se
analiza en este documento, una razón de esto podría ser la lenta
cinética de unión entre PapD y proteínas de subunidad de
pilus plegadas correctamente y análogos de tales proteínas de
subunidad plegadas correctamente. Por lo tanto, se contempla
modificar el ensayo introduciendo influencias desnaturalizantes
suficientemente poderosas como para desplegar al menos parcialmente
la subunidad de pilus (análogos). Es de esperar que esto reduzca las
desviaciones en los resultados de ensayo. Otra razón de las grandes
desviaciones podría ser la unión de los péptidos a BSA usados en el
ELISA. Por lo tanto, se investigará el reemplazo de BSA con otras
macromoléculas.
En el caso de que pueda confirmarse el
"mecanismo de cremallera" para la unión de péptidos a
PapD, la unión del péptido chaperona puede optimizarse usando
una biblioteca de péptidos sintéticos limitada en la que
Pro-1', Phe-2',
Leu-4', Met-6' y
Met-8' del 8-mero PapG se
reemplazan por los aminoácidos hidrófobos Val, Leu, Ile, Met, Phe,
Trp, Tyr e His. También se incorporarán en la biblioteca química
aminoácidos no nativos tales como D-aminoácidos y
aminoácidos N-metilados, así como aminoácidos que
contienen cadenas laterales alifáticas y diversas cadenas laterales
aromáticas. En la síntesis de los inhibidores de chaperona descritos
más adelante en este ejemplo se usaran combinaciones de aminoácidos
óptimas para estas cinco posiciones. Si el "mecanismo de
cremallera" no se confirma, las estrategias indicadas se
aplicarán a residuos que se han demostrado que son importantes para
la unión a PapD.
Se crearán inhibidores de chaperona que forman
enlaces covalentes con la chaperona después del acoplamiento en su
sitio activo. La estructura cristalina del complejo
PapD-péptido demuestra que el grupo carboxilo
C-terminal del péptido forma enlaces de hidrógeno
con Lys-112 y Arg-8 en la chaperona
y que la cadena lateral de Val-5' en el péptido está
próxima al grupo amino de la cadena lateral de otra Lys en
PapD. La introducción de grupos reactivos tales como haluros
de alquilo, aldehídos, haluros de ácido y ésteres activos en estas
posiciones del péptido 8-mero optimizado conducirá a
la formación de enlaces covalentes con las lisinas en PapD, y
los derivados de péptidos constituyen, de esta manera, inhibidores
de alta afinidad. Los inhibidores se basan en péptidos nonaméricos o
más cortos en los que el residuo 5 (desde el extremo C) y/o el grupo
carboxilo C-terminal se han modificado como se
indica:
-COX, X como se ha indicado anteriormente
-CH_{2}Y, Y como se ha indicado
anteriormente
Tales interacciones entre aldehídos y cadenas
laterales de lisina han proporcionado potentes candidatos de fármaco
para la anemia de células facilformes.
En el cristal del péptido PaPD, el péptido
forma una extensión de un lámina \beta en la chaperona. Las
restricciones que proporcionan al péptido un conformación de tipo
lámina \beta por lo tanto darán como resultado un cambio favorable
en la entropía de unión. Se prepararán péptidos conformacionalmente
restringidos que constituyen láminas \betacíclicas miniatura o
péptidos que tienen las cadenas laterales de aminoácidos separadas
por un aminoácido unido covalentemente a otro. Los péptidos con
cadenas laterales unidas covalentemente tendrán los tres aminoácidos
consecutivos reemplazados por los fragmentos mostrados a
continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
AA = cualquier aminoácido nativo o no nativo
R_{a}, R_{b} = todas las combinaciones
posibles de H, Me, Et, C_{3}H_{7}, C_{4}H_{9},
C_{6}H_{5}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
AA = cualquier aminoácido nativo o no nativo
R_{a}, R_{b} = todas las combinaciones
posibles de H, Me, Et, C_{3}H_{7}, C_{4}H_{9},
C_{6}H_{5}
Los inhibidores interesantes se
co-cristalizarán con chaperonas y los complejos
también se investigarán por espectroscopía de RMN.
Los péptidos y miméticos de péptidos usados como
fármacos pueden metabolizarse rápidamente por enzimas proteolíticas
que escinden los enlaces peptídicos. La quimotripsina escinde
selectivamente el enlace peptídico en el lado carboxilo de
aminoácidos con cadenas laterales aromáticas e hidrófobas largas. En
8-mero PapG, los enlaces amida de
met-8', Thr-7',
Met-6', Val-5' y
Phe-2' Pro-1' por lo tanto, son
especialmente sensibles a la proteolisis y deben reemplazarse por
isósteros peptídicos metabólicamente estables. A continuación se
proporcionan ejemplos de tales isósteros peptídicos:
Reemplazos para el fragmento
35 :
-CH_{2}CH_{2}-
El papel específico del ensamblaje del pilus
ayudado por chaperona en la virulencia puede determinarse comparando
la adherencia y patogenia del tipo silvestre con pili y mutantes
isogénicos que no presentan pili debido a mutaciones de localización
dirigidas en el sitio activo de la chaperona. En el cromosoma
bacteriano de la cepa de aislado clínico DS17 pueden recombinarse
mutaciones en residuos tales como Arg-8 y
Lys-112 que constituyen el sitio de unión a la
subunidad de papG usando el mismo procedimiento que ha sido
satisfactorio para introducir mutaciones puntuales en el gen
papG en el cromosoma de la misma cepa. La cepa DS17 de E.
coli se propaga epidérmicamente dentro de una sala de neonatos,
produciendo varios casos de pielonefritis. Además, se ha descubierto
que la cepa produce infecciones renales agudas en un modelo de
pielonefritis de mono cynomolgus. DS17 contiene un agrupamiento de
gen papG con un gen papG que expresa una adhesina
papG típica. También expresa pili típicos de tipo 1 que
contienen la adhesina de unión a manosa, FimH. Se ha sugerido que
los pili de tipo I son determinantes de la virulencia importantes en
la cistitis. Por lo tanto, para ensayar este concepto también se
generarían mutantes de localización dirigida en el sitio de unión a
la subunidad de la chaperona FimC.
Se contempla que un compuesto que se une al sitio
activo de la chaperona bloquearía el ensamblaje del pilus y de esta
forma prevendría la unión. Si este concepto es válido, los mutantes
de chaperona bien definidos tales como en Arg-8 y
Lys-112 anularían también la unión al receptor. La
actividad de unión al receptor de diversos mutantes de chaperona
debe medirse en los ensayos ELISA de unión a receptores descritos en
los ejemplos 2 y 6. Para medir la unión mediada por pilus de tipo 1,
se unirá manosa a los pocillos de la placas de microtitulación. La
adherencia de diversos mutantes de chaperona FimC y
PapD a los receptores inmovilizados se cuantificará usando
anticuerpos contra E. coli DS17 en un experimento ELISA.
Además, se ensayará la capacidad de pequeños péptidos de unión a
PapD para bloquear el ensamblaje del pilus en DS17 y, de esta
manera, para anular la unión del receptor. La cepa DS17 crecerá en
presencia de péptidos cortos que se unen o que no se unen a
PapD y después se ensayará con respecto a su capacidad para
unirse al receptor en el experimento ELISA. Estos experimentos
realizarán pasos importantes en la validación del concepto de que
los inhibidores anti-chaperona prevendrían la unión
bacteriana in vitro.
Entonces, se establecerá el papel de las
adhesinas ensambladas a chaperona en la aparición de enfermedades.
La causalidad entre E. coli que expresa pili P y
pielonefritis hasta hace poco se ha basado únicamente en datos
epidemiológicos. Se ha demostrado que la cepa DS17 con pili P
produce pielonefritis en el tracto urinario normal de monos
cynomolgus. Se generó una mutación en el gen PapG de la cepa
DS17 por reemplazo alélico para crear la cepa derivada
DS17-8 para ensayar el requisito de la adhesina
PapG en la producción de la enfermedad.
DS17-8 contiene una deleción de un par de bases
después del codón 37 en PapG dando como resultado la
expresión de pili P que carecen de la adhesina terminal PapG.
Este mutante no podía unirse al receptor de globósido in
vitro aunque no podía unirse al tejido renal de seres humanos o
monos cynomolgus en el modelo de unión in situ de los
presentes solicitantes. Se comparó la virulencia entre DS17 y su
mutante de PapG DS17-8 en el mono cynomolgus.
Para estudiar el papel de la adhesina PapG en la
pielonefritis, se infectaron cinco monos con la cepa DS17 de E.
coli mientras que seis monos recibieron la cepa mutante
DS17-8 a través de un catéter uretral insertado
citoscópicamente y se demostró que había una diferencia
significativa entre los dos grupos. Los monos que recibieron la cepa
DS17 de tipo silvestre tuvieron una bacteruria media de 21 días en
comparación con los 6,8 días de los monos que recibieron la cepa
mutante DS17-8. El aclaramiento renal también fue
significativamente menor para la cepa de tipo silvestre y la función
renal se redujo significativamente los monos que recibieron la cepa
de tipo silvestre, pero no en los monos que recibieron la cepa
mutante de PapG isogénica. La evaluación patológica del mono
infectado confirmó los estudios funcionales que demostraban una
inflamación de cambios patológicos significativamente menores en el
grupo mutante en comparación con los monos que recibieron el tipo
silvestre.
Por lo tanto, se concluye que la adhesina
PapG de unión a Gal\alpha1-4Gal en extremo
de pili P es necesaria para que se produzca pielonefritis en el
tracto urinario normal de primate. Hasta ahora, no se ha realizado
ninguna demostración directa del papel de una adhesina asociada a
pilus en una infección bacteriana específica.
Resulta interesante que en los experimentos
descritos anteriormente no se encontraron pruebas de que la adhesina
PapG fuera necesaria para la colonización del tracto urinario
inferior o para el desarrollo de la cistitis aguda. Las dos cepas
colonizaron la vagina, persistieron en el intestino y produjeron
infección de vejiga. Aunque PapG era un determinante de
virulencia crítico en la aparición de pielonefritis, no parecía ser
crucial en la cistitis. Sin embargo, esto no excluyó la posibilidad
de que otros componentes del pilus P o que otro tipo de pilus, tales
como el tipo 1, fueran necesarios para la cistitis.
Estas hipótesis se investigarán ensayando la
virulencia de cepas mutantes de DS17 isogénicas que contienen
mutaciones de localización dirigida en Arg-8 de
PapD o FimC. Los mutantes presumiblemente serán
defectuosos en su capacidad de ensamblar pili P y de tipo 1. Si el
mutante de papD es no virulento en el modelo de cistitis de
mono, puede indicar que algún componentes del pilus P distinto de
PapG es esencial para E. coli para generar infección
de vejiga. Por ejemplo, se ha demostrado que el componente principal
de la fribilla del extremo, PapE, se une a fribonectina y la
fibronectina podría ser un factor importante en la cistitis. De
forma similar, si el mutante fimC no es virulente,
confirmaría el papel de pili de tipo de unión a manosa en la
aparición de la cistitis. La capacidad estas mutaciones puntuales de
anular la virulencia de DS17 en la aparición de pielonefritis o
cistitis validaría los potenciales terapéuticos para un inhibidor de
chaperona.
Para confirmar la generalizad del modelo de unión
para péptidos C-terminales de subunidades de pilina
a PapD como se observa en la estructura cristalina
PapD-G1'-19'WT (véase el Ejemplo 1) se
investigó un segundo complejo PapD-péptido por cristalografía
de rayos X. Como se ha observado una unión fuerte para el péptido de
derivado de los 19 aminoácidos C-terminales de tipo
silvestre de PapK (K1'-19'WT, SEC ID Nº: 18 y
numerado en este documento des de la Arg-1'
C-terminal hasta las Lys-19'
N-terminal), se decidió usar éste como péptido para
el segundo complejo de PapD.
Se preparó PapD como se ha descrito
previamente (Holmgren y col., 1988) y se obtuvo a partir del Dr.
Scott Hultgren, Departamento de Microbiología Molecular, Escuela de
Medicina de la Universidad de Washington, St. Louis Estados Unidos.
El péptido K1'-19'WT se preparó por síntesis en
fase sólida Fmoc, se purificó por HPLC de fase inversa y se obtuvo a
partir de Dr. Jan Kihlberg, Departamento de Química, Universidad de
Lund, Lund, Suecia.
Después de haber explorado varias condiciones
experimentales diferentes alrededor de las usadas previamente para
obtener cristales PapD-G1'-19'WT, los mejores
cristales del complejo PapD-K1'-19'WT se
desarrollaron por difusión de vapor contra PEG8000 al 20%, MES 0,1 M
pH 6,5. La gota de cristalización contenía volúmenes iguales de
solución de depósito de proteína. La solución de proteína (15 mg/ml)
contenía una relación molar 1:1 entre PapD a péptido en MES
20 mM, p 6,5 con \beta-octilo
(\beta-OG) al 1,0%.
Estos cristales se montaron dentro de tubos
capilares de cuarzo-vidrio cerrados herméticamente y
se caracterizaron inicialmente examinándolos en una cámara de
precisión de rayos X. A partir de análisis convencionales de tales
imágenes, se determinó que los cristales mencionados anteriormente
tienen un grupo espacial ortorrómbico, C2221 (difiriendo de esta
manera de los cristales PapD-G1'-19'WT que
eran C2), con dimensiones de celda A=57,1 \ring{A}, b=153,2
\ring{A}, c=135,4 \ring{A} y \alpha=\beta=\gamma=90º, 2
moléculas en la unidad asimétrica y presentaban una difracción a una
resolución de 2,7 \ring{A} en una fuente de rayos X de laboratorio
con ánodo giratorio y objetivo de Cu K_{\alpha }.
Los datos de intensidad para los cristales de
PapD-K-péptido se recogieron en un sistema
detector de área R-AXIS II (de
R-AXIS) en Symbicom Ab., Uppsala. Todos los datos se
obtuvieron a partir de un solo cristal y se procesaron inicialmente
con el paquete de software DENZO (Otwinsky, 1993). La fusión y la
ampliación a escala de los datos, sin embargo, se realizó usando
ROTAVATA y AGROVATA del paquete CCP4 (CCP4, 1979). La serie de datos
finales contenía 15.989 reflexiones independientes con un Rsym del
8,7% para los datos con una resolución entre 20,0 y 2,7
\ring{A}.
La estructura del complejo se solucionó por el
procedimiento convencional de reemplazo molecular usando el programa
XPLOR (Brunger, 1992). El modelo de búsqueda usado fue la estructura
de resolución refinada de 2,0 \ring{A} de PapD (Holmgren y
Branden, 1989). Usando datos de resolución de 8,0 a 4,0 \ring{A},
la función de auto-rotación de nuevo proporcionó un
eje doble plegado no cristalográfico claro. Los picos superiores en
las funciones de traducción también proporcionaron las soluciones
correctas. Después de las funciones de traducción, el factor R era
del 36,7% para los datos de resolución de 8,0 a 4,0 \ring{A}. El
refinado de cuerpos rígidos posterior en el que se permitió que se
refinaran los cuatro dominios de las dos moléculas de PapD en
la unidad asimétrica independientemente dio como resultado un factor
R del 33,6% para los mismos datos.
El examen de un mapa de densidad electrónica |Fo|
- |Fc| en esta fase usando el programa de gráficas O (Jones y
Kjeldgaard, 1994) demostró una clara densidad correspondiente al
péptido K en la hendidura de PapD y que corría a lo largo de
la superficie de la proteína de una manera análoga a la encontrada
para el péptido G. La orientación del péptido se determinó
fácilmente a partir de la densidad electrónica, pero inicialmente
sólo pudieron moderarse en densidad los 12 aminoácidos
C-terminales del péptido.
Se inició un refinado de templado simulado con
XPLOR (Brunger, 1992) en esta etapa. Se realizaron varios ciclos
adicionales de construcción de modelos y refinado añadiéndose dos
aminoácidos adicionales del péptido al extremo
N-terminal del péptido para producir un factor R
para el modelo actual del 19,2% para los datos de resolución de 8,0
a 2,7 \ring{A}. El modelo en la presente fase de refinado (que no
contiene ninguna molécula de agua y no incluye los primeros cinco
aminoácidos N-terminales del péptido) tiene
desviaciones de raíz-mínimos cuadrados (rms) de la
geometría ideal de 0,019 para longitudes de enlaces y 3,8º para
ángulos de enlace.
A pesar de que los dos complejos de
PapD-péptido se solucionaban en diferentes grupos espaciales,
se descubre que las estructuras globales son muy similares con el
péptido que interacciona con PapD de una manera esencialmente
idéntica a la observada previamente para la estructura
PapD-G1'-19'WT. De esta manera, se ha
observado de nuevo que el péptido K1'-19'WT se une
en una conformación extendida con la Arg-1'
C-terminal anclada dentro de la hendidura
interdominio y el sitio de unión a la subunidad. También se forman
enlaces de hidrógeno entre el extremo carboxilo del péptido y dos
residuos cargados positivamente invariantes de PapD,
Arg-8 y Lys-112. El péptido
K1'-19'WT después corre a lo largo de la superficie
del dominio N-terminal, formando una interacción de
cadena \beta paralela para la cadena G1. De esta forma, entre 9
cadenas principales se forman enlaces de hidrógeno entre los
residuos 10' a 2' del péptido y Val-102 a
Lys-110 de PapD y de esta manera se extiende
la lámina \beta de PapD dentro del péptido.
Además, se observa una asociación dimérica entre
los dos complejos PapD-péptido dentro de la célula unitaria
similar a la observada en la estructura cristalina de
PapD-G1'-19'WT. De nuevo, la lámina \beta
se extiende como resultado de una simetría plegada dos veces no
cristalográfica que pone un segundo complejo PapD-péptido
adyacente al primero de tal forma que las dos cadenas peptídicas
unidas interaccionan como cadena \beta antiparalelas con una
lámina \beta mixta de nuevo que se crea entre los dos complejos
implicados en un total de 10 cadenas \beta. La única diferencia
importante entre los dos complejos PapD-péptido es el hecho
de que en la estructura PapD-K1'-19'WT los
péptidos de los complejos relacionados no cristalográficamente estén
colocados dos residuos más cerca del extremo COOH de su homólogo. De
esta manera, aunque se forman ocho enlaces de hidrógeno entre los
péptidos en el complejo PapD-G1'-19'WT, se
observa un total de 10 en PapD-K1'-19'WT.
Además de los residuos
C-terminales Try-2' y
Arg-1', hay relativamente pocos contactos entre las
cadenas laterales del péptido y PapD. Las interacciones
principales se proporcionan por los enlaces de hidrógeno de la
cadena principal con la cadena G1. Sin embargo, hay varias
interacciones hidrófobas dentro de la lámina \beta, en particular
entre la Tyr-6' del péptido con
Ile-105 y Leu-107 de la cadena
G1.
Se desarrolló un ensayo de unión de chaperona
para delinear interacciones PapD-PapG usando fusiones
MBP/G, que contenían longitudes crecientes del extremo COOH de
PapG. También se examinó la capacidad de PapD para
unirse a proteínas truncadas PapG que carecen de longitudes
crecientes del extremo COOH de PapG.
En los estudios en los que están implicadas las
proteínas de fusión MBP/G se usó la cepa de E. coli HB101
(Maniatis y col., 1982) como cepa hospedadora. Como hospedador para
construir proteínas de fusión MBP/G (Hanaban, 1983) y truncados
PapG se usó la cepa de DH5\alpha. KS474 (degP::kan)
(Strauch y col., 1989) se proporcionó amablemente por J. Beckwith y
se usó para la expresión de las proteínas truncadas PapG.
Para la construcción de pMAL-p4,
pMAL/G1'-19', pMAL/G1'-81' y
pMAL/G1'-140' se usó el plásmido de expresión de
E. coli pMAL-p2 (New England Biolabs,
Beverly, MA, Estados Unidos) usando procedimientos esencialmente de
Maniatis (Maniatis y col., 1982). El gen maIE codificado por
pMAL-p2 tiene una secuencia lacZ\alpha
fusionada al extremo 3'. El plásmido pMAL-p2 se
digirió con SalI y se rellenó con Klenow (Maniatis y col.,
1982). El fragmento se volvió a unir y el plásmido resultante se
denominó pMAL-p4 y tenía un codón stop entre las
secuencias maIE y lacZ\alpha. El plásmido
p-MAL-p4 se digirió con HindIII
y se rellenó con Klenow y el fragmento resultante se unió con un
engarce ClaI, 5'CCATCGATGG\cdot' (New England Biolabs,
Bervely, MA, Estados Unidos) para producir el plásmido
pMAL-p5. Para las Reacciones en Cadena de la
Polimerasa (PCR) se usaron los cebadores 23969
(5'CCCCCCTGCAGATCAGATTAAGCAGCTACCTGC3' SEC ID Nº: 23) y el cebador
23557 (5'CCCCTGCAGTAAAAATATCTCTGCTCAGAAATAC3', SEC ID Nº: 24) y el
cebador 23559 (5'CCATCGATGAACAGCCAGTCAGATAATC3', SEC ID Nº: 25)
usando pPAP5 (Hull y col., 1981; Lindberg y col., 1984) como
plantilla. Los fragmentos de ADN que codificaban la región de los
residuos aminoacídicos 1'-81' y
1'-140' de PapG se obtuvieron por las
reacciones de PCR usando los cebadores 23557 y 23559; y los
cebadores 23969 y 23559, respectivamente. Los fragmentos de ADN
amplificados se purificaron y se restringieron con PstI y
ClaI y se unieron al fragmento de pMAL-p5
sometido a restricción con PstI y ClaI para construir
pMAL/G1'-81' y pMAL/G1'-140',
respectivamente. Para crear pMAL/G1'-19', se
sintetizaron químicamente dos oligómeros de nucleótidos
(5'GGAAAGAGAAAACCCGGGGAGCTATCTGGTTCTATGACTATGGTTCTGAGTTTCCCCTGAT3',
SEC ID Nº: 26 y 5'
CGATCAGGGGAAACTCAGAACCATAGTCATAGAACCAGATAGCCCCGGGTTTTCTCTTTCCTGCA3',
SEC ID Nº: 27) y se templaron. El fragmento de ADN templado
contenía la secuencia de los residuos aminoacídicos
1'-19' carboxi terminales de PapG se unió al
fragmento PstI-ClaI de
pMAL-p5 para producir pMAL/G1'-19'.
Todas las construcciones usadas en este estudio se confirmaron por
análisis de la secuencia de ADN usando Sequenase Version 2,0 de
acuerdo con las instrucciones del fabricante (USB, Cleveland, OH,
Estados Unidos). pHJ14 (PapG3) se creó por digestión de pHJ8
(PapG wt en el plásmido del promotor P_{tac},
pMMB66) con BamHI y BglII, eliminación de
aproximadamente 500 nucleótidos, purificación del fragmento grande y
unión de nuevo. pHJ23 (PapG 2) se creó clonando primero
papG en pUC19 en EcoRI y BamHI, digiriendo con
HincII para retirar los últimos aproximadamente 300
nucleótidos y volviendo a unir. El fragmento EcoRI
HindII después se clonó en pMM66 para crear pHJ23.
Se indujeron cepas que llevaban plásmidos de MBP
o plásmido del gen de fusión MBP/G en cultivo con caldo de LB con
isopropil tiogalactósido (IPTG) 1 mM se prepararon extracto
periplásmicos como se describe (Slonim y col., 1992). Se añadió un
décimo de volumen de solución salina tamponada con fosfato 10 X
(PBS, NaCl 120 mM, KCl 2,7 mM, Na_{2}HPO_{4} 10 mM y
KH_{2}PO_{4} 2 mM, pH 7,4) al extracto periplásmico. Después se
añadió resina de amilosa a los extractos periplásmicos a una
relación de 1:5. La mezcla se agitó a 4ºC durante una noche y las
perlas posteriormente se lavaron 5 veces con PBS. MBP o las
proteínas de fusión MBP/G se eluyeron con maltosa 20 mM en PBS por
agitación a 4ºC durante 1 hora. Las concentraciones de proteína se
determinaron usando el kit de ensayo de proteínas
Bio-Rad DC (Bio-Rad Laboratories,
Hercules, CA, Estados Unidos). La concentración de proteína de
fusión de longitud completa se cuantificó adicionalmente por el gel
SDS-PAGE teñido con Coomassie con concentraciones
conocidas de albúmina bovina (BSA) como patrones seguido de
exploración por densitometría.
Las preparaciones de MBP o de fusión MBP/G de
HB101/pLS101/pMAL-p4,
HB101/pLS101/pMAL/G1'-19',
HB101/pLS101/pMAL/G1'-81' y
BH101/pLS101/pMAL/G1'-140' se aplicaron a geles pI
3-9 en enfoque isoeléctrico (IEF) (Pharmacia Phast
System, Pharmacia, Suecia) o SDS-PAGE al 12,5%
seguido de tinción con plata, tinción con azul de Coomassie o
inmunotransferencia con antisuero anti-PapD como se ha
descrito (Kuehn, y col., 1991).
La estabilidad del complejo
PapD-MBP/G1'-140' en urea se determinó
incubando 1 \mug de preparación MBP/G1'-140'
parcialmente purificada procedente de
HB101/pLS101/pMAL-G140 en urea 0,5 M durante 5
minutos a 25ºC (Kuehn, y col., 1991). Las proteínas se analizaron
por IEF (pI 3-9) con tinción con plata. El complejo
PapD-MBP/G1'-140' en el gel IEF se cuantificó
por densitometría (Digital Imaging System,
Is-1000).
La interacción entre PapD y la fusión de
MBP/G in vitro se ensayó incubando PapD purificado (1
\mug) y proteína de fusión MBP/G purificada por afinidad en perlas
de amilosa (1 \mug) en 4 \mul de PBS durante 30 minutos y
después aplicándolos a IEF (pI 3-9), seguido de
tinción con plata. Otro ensayo in vitro que es más
cuantitativo es ELISA descrito más adelante.
Se co-expresaron PapD y
los truncados de PapG en KS474, los truncados se indujeron a
DO_{600} de 0,6 con IPTG 0,5 mM y PapD bajo el control del
promotor de arabinosa se indujo con arabinosa al 0,2%. Después de
una hora de inducción, se prepararon extractos periplásmicos y se
agitaron con perlas de Gal \alpha (1-4) Gal
durante una noche a 4ºC y se eluyeron con 15 \mug/ml de solución
Gal \alpha (1-4) Gal-TMSET como se
ha descrito previamente (Hultgren y col., 1989; Kuehn y col., 1991).
Los eluidos se analizaron por electroforesis en gel nativo ácido
(Striker y col., 1994) seguido se transferencia de western usando
antisuero anti-PapD y anti-PapG.
HB101/pFJ3 que llevaba diversos plásmidos de
fusión MBP/G se pasó sobre Agar Tripticasa de Soja (TSA; Becton
Dickinson, Cockeysville, MD, Estados Unidos) tres veces para inducir
la expresión de pili P. En el último pase, la expresión de las
fusiones MBP/G se indujo en TSA que contenía IPTG 100 \muM.
Después, se recogieron las células de diferentes cepas y se
determinaron las titulaciones de HA como se ha descrito
(Jacob-Dubuisson y col., 1993b).
Se recogieron las células obtenidas a partir de
placas de TSA. Se prepararon pili a partir de las mismas cantidades
de células usando el procedimiento descrito previamente
(Jacob-Dubuisson, y col., 1993b). Estas
preparaciones de pili se hirvieron en tampón de muestra de Lammeli
con urea 4 M, y después se analizaron en geles de
SDS-poliacrilamida con azul de Coomassie. La
cantidad relativa de formación de pili se cuantificó por exploración
citométrica de las bandas de PapA.
Se diluyeron soluciones madre de proteínas de
fusión MBP/G en PBS a 40 pmol/50 \mul con PBS. Las soluciones de
las proteínas de fusión MBP/G 40 pmol/50 \mul se diluyeron en
serie en PBS y se usaron 50 \mul de cada solución para recubrir
los pocillos de una Nunc Immunoplate de 96 pocillos (Inter Med,
DK-4000 Roskilde, Dinamarca) durante una noche a
4ºC. Los pocillos después se lavaron con PBS y se bloquearon con 200
\mul de BSA al 3% en PBS durante 2 horas a 25ºC. Las placas se
lavaron vigorosamente tres veces con PBS y se incubaron con 50
\mul de PapD diluido en 50 pmol de PapD en 50 \mul
de BSA-PBS al 3% durante 45 minutos a 25ºC. Después
de tres lavados con PBS, los pocillos se incubaron con una dilución
1:500 de antisuero de conejo anti-PapD en
BSA-PBS al 3% durante 45 minutos a 25ºC. Después de
tres lavados con PBS, los pocillos se incubaron con una dilución
1:1000 de antisuero de cabra contra IgG de conejo acoplada a
fosfatasa alcalina en BSA-PBS al 3% durante 45
minutos a 25ºC. Después de tres lavados con PBS y tres lavados con
tampón de desarrollo (dietanolamina 10 mM, MgCl_{2} 0,5 mM), se
añadieron 50 \mul de p-nitrofenil fosfato a 1
mg/ml filtrado (Sigma, St. Louis, MO, Estados Unidos) en tampón de
revelado. La reacción se incubó durante 1 hora en la oscuridad a
25ºC y se leyó la absorbancia de 405 nm.
Para ensayar los péptidos del segundo sitio,
todos los péptidos se disolvieron en dimetil sulfóxido (DMSO, Sigma,
St. Louis, MO, Estados Unidos) hasta una concentración final de 2
mM. Las soluciones madre se diluyeron a una concentración apropiada
en PBS y se aplicaron como un recubrimiento en pocillos de
microtitulación a 4ºC. Todas las soluciones de péptidos se ajustaron
a la misma concentración de DMSO. Las etapas posteriores siguieron
el procedimiento descrito anteriormente.
Para identificar determinantes sobre PapG
esenciales para la interacción con PapD, los presentes
solicitantes construyeron tres fusiones en fase entre el gen
MalE, que codifica la proteína de unión a maltosa, y
secuencias que codifican los residuos
COOH-terminales 1'-19',
1'-81' y 1'-140' de PagG
(Fig. 20). Las proteínas quiméricas resultantes se denominaron
MBP/G1'-19', MBP/G1'-81' y
MBP/G1'-140', respectivamente, para indicar las
regiones de PapG presentes en las fusiones MBP/G. Se creó
MBP/G1'-19' ya que recientemente se había mostrado
que PapD se unía a un péptido que constaba de los 19
aminoácidos C-terminales de PapD in
vitro (Kuehn y col., 1993). MBP/G1'-81' y
MBP/G1'-140' se crearon para ensayar el requisito
del enlace disulfuro (C196-C228 en PapG) para
el reconocimiento por PapD. Prácticamente en todas las
subunidades de pilus se encuentra un enlace disulfuro localizado de
forma similar (Simons y col., 1990). MBP/G1'-81' los
dos restos de cisteína mientras que MBP/G1'-140'
contiene el enlace disulfuro (Fig. 20).
La capacidad de PapD para unirse a las
fusiones MBP/G se investigó usando cromatografía de afinidad de
amilosa (Kellermann y Ferenci, 1982). Se co-expresó
PapD a partir del plásmido pLS101 (Slonim y col., 1992) con
cada una de las fusiones MBP/G. Se sometieron extractos
periplásmicos de cada cepa que contenía las proteínas MBP/G y
PapD a cromatografía de afinidad de amilosa y los eluidos se
analizaron por SDS-PAGE (Fig. 21A) y por
transferencia de western con antisuero anti-PapD (Fig. 21B).
En este ensayo, la co-elución de PapD
significaba la capacidad de PapD para interaccionar con la
proteína MBP/G. La transferencia de western reveló que PapD
co-eluía con las tres proteínas de fusión (Fig. 21B,
calles 2, 3 y 4) pero no con el control MBP (Fig. 21A y 21B, calle
1). Sin embargo, PapD interaccionaba muchos más fuertemente
con la fusión MBP/G1'-140' como puede verse en la
transferencia de western (Fig. 21B, calle 4) así como en el gel
teñido con azul de Coomassie de los eluidos (Fig. 21A, calle 4). De
esta manera, PapD interaccionaba fuertemente con la proteína
MBP/G1'-140' y sólo débilmente con las proteínas
MBP/G1'-19' y MBP/G1'-81'.
El análisis de los eluidos en geles de enfoques
isoeléctrico (IEF) teñidos con plata reveló que el complejo
PapD-MBP/G1'-140' migraba en un punto
isoeléctrico (pI) de 5,2 (Fig. 21C, calle 4) que era intermedio
entre los pI de MBP/G1'-140' (\sim4,4) y PapD
(\sim9,1). Se confirmó que esta banda contenía tanto
PapD como MBP/G1'-140' por escisión de la
banda no teñida, aplicación de los materiales a
SDS-PAGE y análisis de los mismos por transferencia
de western usando antisueros anti-PapD y
anti-MBP (Fig. 21D). No fue posible detectar
complejos estables en los eluidos de MBP,
MBP/G1'-19' o MBP/G1'-81 cuando se
co-expresaron con PapD (Fig. 21C, calles 1, 2
y 3).
La estabilidad del complejo
PapD-MBP/G1'-140' se midió como una función
de la concentración de urea en presencia de DTT 15 mM. Tanto el
complejo PapD-PapG como el complejo
PapD-MBP/G1'-140' se comportaron de manera
similar en estas condiciones y se disociaron después de la
incubación en urea 2 M (datos no mostrados). Por estos criterios, el
complejo PapD-MBP/G1'-140' era tan estable
como el complejo PapD-PapG.
PapD es esencial para ensamblaje del pilus
p (Hultgren y col., 1991). Se ha demostrado que una reducción en la
concentración de PapD en el periplasma produce una reducción
concomitante en la formación de pili (Slonim y col., 1992). Se
ensayó la capacidad de las fusiones MBP/G para bloquear la formación
del pilus por inhibición de la formación del complejo
chaperona-subunidad cuando se
co-expresaba en trans con el operon
pap. Se utilizaron plásmidos pMAL-p4,
pMAL/G1'-19', pMAL/G1'-81' y
pMAL/G1'-140' para transformar la cepa HB101/pFJ3
que contiene el operon pap bajo el control de su propio
promotor en el vector pACYC184 (Jacob-Dubuisson y
col., 1993b). Cada proteína de fusión MBP/G se localizó en el
periplasma como se determina por SDS-PAGE y
transferencia de western con antisuero anti-MBP
(datos no mostrados). Se realizaron ensayos de hemaglutinación (HA)
sobre las células que co-expresaban el operon
pap con MBP (pMAL-p4) o con cada una de las
fusiones MBP/G. La co-expresión de las fusiones
MBP/G1'-140' con el operon pap redujo la
titulación de HA 30 veces en comparación con el control de MBP
(véase la tabla 3).
\begin{minipage}[t]{150mm} ^{a} Se utilizaron plásmidos pMAL-p4, pMAL/G1'-19', pMAL/G1'-81' y pMAL/G1'- 140', que codificaban MBP, MBP-G1'-19', MBP-G1'-81' y MBP-G1'-140' respectivamente, para transformar la cepa HB1010/pFJ3 y la expresión del operon pap y cada una de las fusiones MBP/G se indujo en cada cepa\end{minipage} |
^{b} Máxima dilución de suspensión de células que produce HA detectable |
\begin{minipage}[t]{150mm} ^{c} Las preparaciones de pili se analizaron en geles teñidos con azul de Coomassie y las bandas PapA se exploraron por un densitómetro. La formación de pili relativa se determinó igualando el valor densitométrico de PapA al 100% del control (HB101/pFJ3/pMAL-p4).\end{minipage} |
La co-expresión de las fusiones
MBP/G1'-81' y MBP/G1'-19' con el
operon pap sólo tuvo efectos débiles sobre la titulación de
HA (tabla 3). La co-expresión de
MBP/G1'-140' con el operon pap redujo la
cantidad de pili que podía purificarse a partir de las células en un
90%, mientras que MBP/G1'-19' y
MBP/G1'-81' redujeron la cantidad de pili formados
en aproximadamente 50% en comparación con MBP solo (tabla 3). La
microscopía electrónica confirmó que las células que expresaban la
fusión MBP/G1'-140' tenían pocos o ningún pilus en
comparación con las células con pili completos que
co-expresaban MBP (datos no mostrados).
Los presentes solicitantes sugirieron la
hipótesis de que la co-expresión de la fusión
MBP/G1'-140' con el operon pap inhibía la
formación del pilus por titulación de PapD lejos de las
subunidades, llevando de esta manera a las subunidades a rutas
muertas de agregación y degradación proteolítica (Hultgren y col.,
1989); Holmgren y col., 1992). Esta hipótesis se ensayó como se
indica a continuación. Se utilizaron pMAL-p4,
pMAL/G1'-19', pMAL/G1'-81' o
pMAL/G1'-140', para transformar BH101 que llevaba
pFJ22 (Jacob-Dubuisson y col., 1994). El plásmido
pFJ22 codifica papDJKEFGA bajo el control del promotor
P_{tac}. En HB101/pFJ22, las subunidades del pilus se acumulan en
el espacio periplásmico debido a la ausencia del acomodador,
PapC. El efecto de la expresión de cada fusión sobre el
destino de cada tipo de subunidad del pilus se determinó por
transferencia de western (Fig. 22). Se detectó una reducción
significativa en la cantidad de PapG, PapA y PapF en células
que co-expresaban la fusión
MBP/G1'-140', lo que indica que la fusión
MBP/G1'-140' bloqueaba la formación del complejo
chaperona/subunidad por interacción con PapD y las separaba
de las subunidades del pilus. No hubo ningún efecto sobre la
estabilidad de PapK y PapE por razones que no se entienden. Sin
embargo, la fusión pudo bloquear la formación del pilus por
interferencia con la formación de complejos críticos
chaperona-subunidad.
La unión de PapD a las proteínas de fusión
MBP/G se investigó adicionalmente usando dos ensayos in vitro
diferentes. En el primer ensayo, se incubaron proteínas de fusión
MBP/G purificadas o MBP con PapD y se analizó la formación de
complejos en geles IEF teñidos con planta. PapD se unión a la
proteína de fusión MBP/G1'-140' y formó un complejo
estable que migraba a un pI idéntico (5,2) que el observado para el
complejo formado in vivo (Fig. 23A, calle 4). Por el
contrario, no se detectaron complejos entre PapD y
MBP/G1'-81', MBP/G1'-19' o el
control de MBP (Fig. 23A, calle 1, 2 y 3). En el segundo ensayo, los
presentes solicitantes investigaron la capacidad de PapD para
unirse a las tres proteínas de fusión MBP/G diferentes inmovilizadas
en pocillos de microtitulación y se cuantificaron las interacciones
en un ensayo de inmunoabsorbente con enzima unida (ELISA) usando
antisuero anti-PapD (Fig. 23B). PapD se unión
débilmente a MBP/G1'-19', ligeramente mejor a
MBP/C1'-81' pero muy fuertemente a
MBP/G1'-140'. PapD no se unió al control de
MBP. El aumento dramático en la afinidad de PapD por la
fusión MBP/G1'-140' en comparación con las fusiones
MBP/G1'-81 y MBP/G1'-19' sugirieron
que los residuos 81' a 140' en PapG era críticos para la
fuerte unión a PapD.
Se ha demostrado que los residuos de la hendidura
invariantes Arg-8 y Lys-112 en
PapD forman un anclaje molecular en la hendidura de chaperona
necesario para la unión a las subunidades del pilus (Slonim y col.,
1992; Kuehn y col., 1993). Las mutaciones en estos residuos anulaban
o reducían en tal medida la capacidad de PapD para unirse a
las subunidades y mediar el ensamblaje del pilus (Kuehn y col.,
1993). Las proteínas PaPD de mutantes en
Arg-8 A y Lys-112A demostraron una
capacidad muy reducida para unirse a la proteína de fusión
MBP/G1'-140' tanto in vivo como in
vitro (datos no mostrados). Estos resultados indican que las
interacciones entre PapD y la fusión
MBP/G1'-140' son biológicamente relevantes.
Los presentes solicitantes ensayaron la capacidad
de PapD para unirse a tres proteínas truncadas COOH
terminales PapG (mostradas en la Fig. 20) para delinear los
límites del sitio de unión de PapD cadena arriba y para
ensayar si podía funcionar como sitio independiente. Las proteínas
truncadas se co-expresaron con PapD en la
cepa KS474 (Strauch y col., 1989) que lleva un cassette de
canamicina en el locus degP (mutante degP41). Tanto el
truncado PapG2 como el truncado PapG3 se expresaron y
fueron estables en KS474, sin embargo el truncado PapG1
(retirando los últimos 14 residuos) se sometió una degradación
limitada (datos no mostrados). La formación de complejos se ensayo
analizando extractos periplásmicos en geles de poliacrilamida
nativos ácidos (Striker y col., 1994). Se usaron antisueros
anti-PapD y anti-PapG para detectar los complejos
PapD-PapG después de transferencia de western
(Fig. 24). Los complejos PapD-PapG se
resuelven a partir de PapD solo en estos geles debido a sus
diferencias en tamaño, forma y carga (Striker y col., 1994).
PapD formó un complejo con PapG de longitud completa
así como con el truncado PapG2 (Fig. 24A, calles 2 y 3). La
banda compleja también se reconoció por el antisuero anti
PapG (Fig. 24B, calles 2 y 3). PapD no formo un
complejo con el truncado PapG3 (Fig. 24A y B, calle 4) que
termina en el aminoácido 145. Esta información de línea un punto
final para el segundo sitio de unión de PapD (como se indica
en la Fig. 20).
La combinación de los datos del truncado
PapG y la fusión MBP/G (mostrados en la Fig. 20) sugirieron
que el segundo sitio en PapG reconocido por PapD
residía en una región entre los residuos 117' a 141' de PapG.
Se sintetizaron cuatro péptidos solapantes correspondientes a la
región entre los residuos 120' a 156' y se ensayaron con respecto a
su capacidad para unirse a PapD en un ensayo ELISA. Tal
estrategia resultó satisfactoria en el estudio del sitio de unión a
PapD COOH-terminal (Kuehn y col., 1993). El
péptido correspondiente a los residuos 125' a 140', pero no los
otros tres péptidos, se unieron a PapD en el ELISA (Fig. 25).
Estos datos indican que PapD reconoce dos superficies en
PapG. PapD forma una interacción de cremallera de
cadena \beta con el extremo COOH, pero también reconoce una región
que contiene los residuos 125'-140'.
En conclusión, se creó un ensayo de unión de
chaperona usando fusiones del extremo carboxilo de PapG a la
proteína de unión a maltosa (fusiones MBP/G) para investigar si la
formación del complejo chaperona-subunidad requiere
interacciones adicionales. PapD se unía fuertemente a una
fusión MBP/G que contenía los 140 aminoácidos
C-terminales de PapG
(MBP-G1'-140'), pero sólo se unía
débilmente a MBP-G1'-81', lo que
indica que la región entre los residuos C-terminales
81' y 140' contiene información adicional que se requiere para
interacciones fuertes PapD-PapG. Se ha demostrado
adicionalmente que PapD interacciona con el truncado C
terminal de PapG que contiene los residuos
117'-314' (correspondientes a un truncado que consta
de los primeros 198 residuos aminoacídicos N terminales de
PapG), pero no con un truncado que contiene los residuos
170'-314' (correspondiente a un truncado que consta
de los primeros 145 residuos aminoacídicos N terminal de
PapG).
Estos resultados conjuntamente sugieren que
existe un segundo sitio interactivo de PapD independiente que
no interacciona con el extremo C de la subunidad del pilus. Esta
suposición se confirma adicionalmente por el hecho de que uno de los
cuatro péptidos que solapaban con la región del segundo sitio de
PapG se reconoció por PapD. Este último resultado
también indica que la función del sitio cadena arriba era ejercer
efectos secundarios sobre el sitio de unión de chaperona COOH
terminal ya que esta región era independientemente capaz de
facilitar la unión de PapD.
A diferencia de lo que ocurre en el caso de las
subunidades nativas, se demostró que
MBP-G1'-140' es capaz de plegarse
incluso en ausencia de PapD y permanece soluble en el espacio
periplásmico; este plegamiento implica la formación de un enlace
disulfuro intramolecular. Esto es coherente con los datos previos
que demuestran que las propias subunidades están muy plegadas cuando
se unen a PapD (Kuehn y col., 1991; Striker y col., 1994).
sin embargo, aún no se sabe si PapD se une a las subunidades
in vivo después de plegarse o si el plegamiento se produce en
el contexto de una interacción con PapD.
Finalmente, las expresión de las fusiones MBP/G
en células que producen pili P inhibía el ensamblaje de pilus en
diversas medidas por la unión a PapD e impedía la formación
del complejo chaperona-subunidad. La capacidad de
las fusiones para bloquear el ensamblaje del pilus aumentó según
aumentaba la longitud de la proteína de fusión.
MBP-G1'-140' era un fuerte inhibidor
del ensamblaje de pilus mientras que
MBP-G1'-81' y
MBP-G1'-19' eran inhibidores
débiles. Estos es coherente con el hallazgo de que los residuos
140'-81' contienen una región necesaria para
interacciones fuertes entre PapD y PapG.
Una investigación reciente por los inventores ha
revelado adicionalmente que la expresión simultánea in vivo
de PapG y un polipéptido PapD modificado que carece
del dominio 1 en una cepa degP41 (KS474) que expresa este
PapD truncado da como resultado 1) la supresión de la
toxicidad de PapG en esta línea celular y 2) una división
eficaz en el espacio periplásmico de PapG. Sin embargo, la
subunidad del pilus no se pliega correctamente después de la
liberación desde PapD.
De esta manera, los inventores sugieren que la
unión entre subunidades del pilus y PapD tiene lugar por la
unión de las subunidades de pilus al dominio 1 y 2 de PapD.
La unión entre la subunidad y el dominio 1 es importante para el
plegamiento correcto de la subunidad, y la unión entre la subunidad
y el dominio 2 es importante para el transporte de la subunidad al
interior del periplasma. No se sabe si el dominio 2 de PapD
también participa en el plegamiento de las subunidades.
Como los resultados anteriores son indicadores
fuertes de la existencia de al menos un sitio de unión a parte del
que implica la Arg-8 y Lys-112 de
PapD, y como parece ser que este nuevo sitio de unión también
es muy importante en la interacción lenta entre PapD y la
subunidades del pilus, se contempla que también este sitio de unión
tendrá los efectos antibacterianos descritos en este documento.
De esta manera, este es el plan para esclarecer
el motivo de unión entre este segundo sitio de unión de PapD
de una manera similar a las descritas en este documento, y
adicionalmente es el plan para diseñar/identificar compuestos de
interaccionar con este segundo sitio de unión para sintetizar
finalmente compuestos capaces de interaccionar con este sitio de tal
manera que se impida, inhiba o mejore el ensamblaje de pili
intactos.
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Willems R J L y col., 1992,
Molec. Microbiol., 6, 2661.
Xuong N-H y col.,
1985, J. Appl. Crystallogr., 18, 342.
Aqvist J, 1990, J. Phys.
Chem., 94, 8021-8024.
Aqvist J y Medina C, 1993,
206th ACS National Meeting, Phys: 124, Catalogue of
Abstracts.
Aqvist J y col., 1994, Protein
Engineering, 7 (3), 385-391.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Washington University
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 724 South Euclide Avenue
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: St. Louis
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: Missouri
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Estados Unidos de América
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: MO 63110
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Symbicom Aktiebolag
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Tvistevaegen 48
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Umea
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Suecia
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: S-907 36 Umea
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: TRATAMIENTO O PROFILAXIS DE ENFERMEDADES CAUSADAS POR BACTERIAS QUE FORMAN PILUS
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 27
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disco flexible
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC IBM compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release Nº 1.0, Versión Nº 1.25 (EPO)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 874 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Escherichia coli
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..720
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: sig_peptide
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..63
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: matpeptide
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 64..717
\vskip0.800000\baselineskip
- (x)
- INFORMACIÓN DE LA PUBLICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- AUTORES: Nogren, M.
\hskip4,7cmBaga, M.
\hskip4,7cmTennet, J.M.
\hskip4,7cmNormark, S.
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- REVISTA: Mol. Biol. Rep.
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- VOLUMEN: 12
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- PÁGINAS: 169-178
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- FECHA: 1987
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 239 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (sintético)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTCAAACACC GCCGGAACTC GTCCAGGCGA
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (sintético)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGGGCGATAA AAAAGAGCTA TTTTGGTCTG
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (sintético)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCGATAAAAA AGCATTATTT TCCTCTG
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Lys Arg Lys Pro Gly Glu Leu Ser Gly Ser
Met Thr Met Val Leu}
\sac{Ser Phe Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 16 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Pro Gly Glu Leu Ser Gly Ser Met Thr Met
Val Leu Ser Phe Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 11 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Gly Ser Met Thr Met Val Leu Ser Phe
Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 7 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Thr Met Val Leu Ser Phe Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Lys Arg Lys Pro Val Glu Leu Ser Gly Ser
Met Thr Met Val Leu}
\sac{Ser Ser Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Lys Arg Lys Pro Gly Glu Leu Ser Gly Ser
Met Thr Met Val Leu}
\sac{Ser Phe Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu Glu Gly Lys Arg Lys Pro Gly Glu Leu Ser
Gly Ser Met Thr Met}
\sac{Val Leu Ser Phe}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Asn Leu Ile Ala Gly Pro Phe Ser Ala Thr
Ala Thr Leu Val Ala}
\sac{Ser Tyr Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Lys Leu Glu Ala Gly Asn Tyr Phe Ala Val
Leu Gly Phe Arg Val}
\sac{Asp Tyr Glu}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Ser Val Val Pro Gly Asp Tyr Glu Ala Thr
Ala Thr Phe Glu Leu}
\sac{Thr Tyr Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Ile Leu Asn Gly Gly Asp Phe Gln Thr Thr
Ala Ser Met Ala Met}
\sac{Ile Tyr Asn}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 16 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Tyr Ala Leu Ala Pro Asn Ala Val Ile Pro Thr
Ser Leu Ala Leu Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 18:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Ser Val Val Pro Gly Asp Tyr Glu Ala Thr
Ala Thr Phe Glu Leu}
\sac{Thr Tyr Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 19:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 16 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 19:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Pro Ala Thr Asn Thr Leu Met Leu Ser Phe
Asp Asn Val Gly Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 20:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 16 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 20:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Gln Ile Lys Gln leu Pro Ala Thr Asn Thr
Leu Met Leu Ser Phe}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 21:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 16 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 21:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Tyr Lys Met Pro Tyr Asp Gln Ile Lys Gln Leu
Pro Ala Thr Asn Thr}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 22:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 15 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 22:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln His His Tyr Tyr Asp Leu Trp Gln Asp His
Tyr Lys Met Pro Tyr}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 23:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (sintético)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 23:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCCCCCTGCA GATCAGATTA AGCAGCTACC TGC
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 24:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 34 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (sintético)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 24:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCCCTGCAGT AAAAATATCT CTGCTCAGAA ATAC
\hfill34
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 25:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (sintético)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 25:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCATCGATGA ACAGCCAGTC AGATAATC
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 26:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 61 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (sintético)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 26:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGAAAGAGAA AACCCGGGGA GCTATCTGGT TCTATGACTA TGGTTCTGAG TTTCCCCTGA
\hfill60
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipT
\hfill61
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 27:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 67 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (sintético)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 27:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGATCAGGGG AAACTCAGAA CCATAGTCAT AGAACCAGAT AGCTCCCCGG GTTTTCTCTT
\hfill60
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCCTGCA
\hfill67
Claims (28)
1. Un procedimiento para identificar y/o diseñar
una sustancia, X, capaz de interactuar con una chaperona molecular
periplásmica, por ejemplo uniéndose a la chaperona molecular
periplásmica, con una energía de unión libre pronosticada igual a o
mejor que un valor umbral predeterminado, comprendiendo el
procedimiento
- 1)
- seleccionar una sustancia, A, que podría interactuar en gran medida con un sitio en la chaperona molecular periplásmica, siendo dicho sitio el sitio de unión de la subunidad de pilus de dicha chaperona molecular, y proporcionar una representación estructural tridimensional de la misma,
- 2)
- predecir la energía libre de unión entre la sustancia A y el sitio en la chaperona molecular periplásmica o sitio análogo a tal dicho, siendo dicho sitio, el sitio de unión de la subunidad de pilus de dicha chaperona molecular,
- 3)
- si la energía libre de unión pronosticada entre la sustancia A y el sitio en la chaperona molecular periplásmica o el sitio análogo es igual a o mejor que el valor umbral predeterminado, entonces identificar la sustancia A como la sustancia X,
- 4)
- si la energía libre de unión pronosticada entre la sustancia A y el sitio en la chaperona molecular periplásmica o el sitio análogo no es igual a o mejor que el valor umbral predeterminado, entonces modificar la representación estructural tridimensional y predecir la energía libre de unión entre la sustancia modificada de esta manera, B, y el sitio en la chaperona, y
- 5)
- repetir la etapa 4 hasta que la energía libre de unión pronosticada determinada entre la sustancia resultante, X, y el sitio en la chaperona molecular periplásmica sea igual a, o mejor que, el valor umbral predeterminado.
2. Un procedimiento para identificar y/o diseñar
una sustancia, Y, capaz de interactuar con una chaperona molecular
periplásmica, por ejemplo uniéndose a la chaperona molecular
periplásmica, con una energía de unión libre igual a, o mejor que,
un valor umbral predeterminado, comprendiendo el procedimiento
- 1)
- identificar una sustancia, X, de acuerdo con el procedimiento de la reivindicación 1, y
- 2)
- proporcionar una muestra de la sustancia química X y una muestra de la chaperona molecular periplásmica o un análogo de la misma y medir la energía libre de unión entre la sustancia química X y la chaperona molecular periplásmica o análogo de la misma, y establecer que la energía libre de unión medida entre la sustancia química X y la chaperona molecular periplásmica o análogo de la misma es igual a o mejor que el valor umbral predeterminado, y entonces, identificar la sustancia X como la sustancia Y.
3. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 2, en el que el procedimiento someter la sustancia Y
a al menos una de las siguientes etapas del procedimiento para
verificar que la sustancia Y es una sustancia potencial y
terapéuticamente útil capaz de interactuar con una chaperona
molecular periplásmica:
1) ensayar una sustancia candidata en un ensayo
en el que la posible prevención, inhibición o mejora mediante la
sustancia de la interacción entre la chaperona periplásmica
molecular y la subunidad de pilus se determine mediante
la adición de la sustancia a un sistema que
comprende la chaperona periplásmica molecular o un análogo de la
misma en una forma inmovilizada y la subunidad de pilus o un
equivalente de la misma en una forma solubilizada y la determinación
del cambio en la unión entre la subunidad de pilus o equivalente de
la misma y la chaperona periplásmica molecular o el análogo de la
misma provocado por la adición de la sustancia, o
la adición de la sustancia a un sistema que
comprende la subunidad de pilus o un equivalente de la misma en una
forma inmovilizada y la chaperona periplásmica molecular o un
análogo de la misma en una forma solubilizada y la determinación del
cambio en la unión entre la subunidad de pilus o el equivalente de
la misma y la chaperona periplásmica molecular o el análogo de la
misma provocado por la adición de la sustancia, o
la adición de la sustancia a un sistema que
comprende la subunidad de pilus o un equivalente de la misma así
como la chaperona periplásmica molecular o un análogo de la misma en
una forma solubilizada y la determinación del cambio en la unión
entre la subunidad de pilus o el equivalente de la misma y la
chaperona periplásmica molecular o el análogo de la misma provocada
por la adición de la sustancia, o
la adición de la sustancia a un sistema que
comprende la subunidad de pilus o un equivalente de la misma así
como la chaperona periplásmica molecular o un análogo de la misma en
forma solubilizada y la medición del cambio en la energía de unión
provocado por la adición de la sustancia, y la identificación de la
sustancia como potencialmente terapéuticamente útil si se observa un
cambio en la energía de unión entre la subunidad de pilus o el
equivalente de la misma y la chaperona periplásmica molecular o un
análogo de la misma,
e identificar la sustancia como potencial y
terapéuticamente útil si se observa un cambio significativo en la
unión o en la energía de la unión entre la subunidad de pilus o el
equivalente de la misma y la chaperona periplásmica molecular o el
análogo de la misma;
2) ensayar una sustancia candidata en un ensayo
en el que la posible prevención, inhibición o mejora de la
interacción entre la chaperona periplásmica molecular y la subunidad
de pilus se determine mediante
la adición de la sustancia a un sistema que
comprende bacterias vivas que forman pilus que se adhieren a tejidos
seguido de la determinación de la velocidad de crecimiento de las
bacterias, siendo indicativo de prevención, inhibición o mejora de
la unión entre la chaperona periplásmica molecular y la subunidad de
pilus una reducción en el crecimiento en comparación con un sistema
correspondiente en el que la sustancia no se ha añadido, o
la adición de la sustancia a un sistema que
comprende bacterias vivas que forman pilus que se adhieren a tejidos
seguido de una determinación de la adhesión al tejido de las
bacterias, siendo indicativo de prevención, inhibición o mejora de
la unión entre la chaperona periplásmica molecular y la subunidad de
pilus una reducción en la adhesión al tejido en comparación con un
sistema correspondiente en el que no se ha añadido la sustancia,
e identificar la sustancia como potencial y
terapéuticamente útil si se observa una reducción de la velocidad de
crecimiento o de adhesión al tejido después de la adición de la
sustancia; y
3) identificar si una sustancia es capaz de
interactuar in vivo con una chaperona periplásmica molecular
mediante el uso de una sustancia, donde dicha sustancia se ha
establecido in vitro para prevenir, inhibir o mejorar la
interacción entre una chaperona periplásmica molecular y una
subunidad de pilus, para la administración a un animal experimental,
donde las bacterias que forman pilus que se adhieren a tejidos del
animal se ha inoculado antes, a la vez o después de la
administración de la sustancia, para la identificación de si la
sustancia es capaz de prevenir y/o curar y/o aliviar la enfermedad
provocada por las bacterias.
4. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 3, en el que el ensayo en la etapa 1 comprende
- añadir la sustancia a un primer sistema que
comprende la chaperona periplásmica molecular o un análogo de la
misma,
- posteriormente, añadir una subunidad de pilus o
un equivalente de la misma que se ha marcado con una sonda
fluorescente medioambientalmente sensible,
- determinar la emisión de fluorescencia a una
longitud de onda particular que indica la cantidad de unión entre la
chaperona periplásmica molecular o el análogo de la misma y la
subunidad de pilus o el equivalente de la misma, y
- comparar la emisión de fluorescencia
determinada con la emisión de fluorescencia determinada en un
segundo sistema correspondiente que contiene sustancialmente las
mismas concentraciones de la chaperona molecular o del análogo de la
misma y la subunidad de pilus o el equivalente de la misma pero
sustancialmente sin sustancia,
una diferencia significativa en la emisión de
fluorescencia entre el primer y el segundo sistema que indica la
interacción entre la chaperona periplásmica molecular o el análogo
de la misma y la sustancia.
5. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 4, en el que la determinación de la emisión de
fluorescencia en el segundo sistema se realiza muchas veces a
diversas proporciones molares entre la subunidad de pilus o el
equivalente de la misma y la chaperona periplásmica y el equivalente
de la misma, después de lo cual, la constante de unión entre la
subunidad de pilus o el equivalente de la misma y la chaperona
molecular periplásmica o análogo de la misma se evalúa a partir de
los datos de emisión fluorescente determinados.
6. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 3 ó 4, en el que la determinación de la emisión
fluorescente en el primer sistema se realiza muchas veces a diversas
proporciones molares entre la sustancia y la chaperona periplásmica
y el equivalente de la misma, después de lo cual, la constante de
unión entre la sustancia y la chaperona molecular periplásmica o
análogo de la misma se evalúa a partir de los datos de emisión
fluorescente determinados.
7. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 3-6, en el que el equivalente
de la subunidad de pilus es G1'-19'WT,
MBP-G1'-140', o
G125'-140' y la chaperona molecular periplásmica es
PapD.
8. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 3-7, en el que las bacterias
vivas que forman pilus que se adhieren al tejido son de una cepa
deficiente de proteasa, siendo la proteasa una que es al menos
responsable de la degradación de las subunidades de pilus.
9. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 8, en el que la cepa deficiente de proteasa es una
cepa degP41.
10. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 1-9, donde la energía de unión
libre se pronostica
evaluando la diferencia de la energía media,
<\DeltaV^{el}_{X-s}> definida como
<\DeltaV^{el}_{X-s}>_{B} -
<\DeltaV^{el}_{X-s}>_{A}, entre la
contribución de las interacciones no polares a la energía potencial
entre la sustancia química X y la que la rodea (denominada S) en dos
estados, un estado (A) en donde la sustancia química está rodea por
el disolvente y el otro estado (B) en donde la sustancia química,
unida al sitio en la chaperona periplásmica molecular o unida a un
sitio análogo de tal sitio, está rodea por el disolvente,
evaluando la diferencia de la energía media,
<\DeltaV^{vdw}_{X-s}> definida como
<\DeltaV^{vdw}_{X-s}>_{B} -
<\DeltaV^{vdw}_{X-s}>_{A}, entre la
contribución de las interacciones no polares a la energía potencial
entre la sustancia química X y la que la rodea (denominada S) en dos
estados, un estado (A) en donde la sustancia química está rodea por
el disolvente y el otro estado (B) en donde la sustancia química,
unida al sitio en la chaperona periplásmica molecular o unida a un
sitio análogo de tal sitio, está rodea por el disolvente, y
calculando la energía libre de unión absoluta
como combinación ajustada de las dos diferencias de la energía media
mencionadas anteriormente.
11. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 10, en el que el sitio en la chaperona molecular
periplásmica es el sitio de unión a la subunidad de pilus de una
chaperona molecular periplásmica seleccionada entre el grupo
constituido por PapD, FimC, SfaE, FaeE, FanE,
Cs3-1, F17D, ClpE, EcpD, Mrkb, FimB, SefB, HifB,
MyfB, PsaB, PefD, YehC, MrpD, CssC, NfaE, AggD y Caf1M, o
un análogo de tal sitio de unión a la subunidad de pilus.
12. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 11, en el que el sitio en la chaperona molecular
periplásmica es un sitio de unión a la subunidad de pilus de
PapD o análogo del mismo.
13. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 1-12, en el que la sustancia A
se elige realizando las siguientes etapas:
- -
- co-cristalizar la chaperona periplásmica molecular o el análogo de la misma con un ligando capaz de interactuar con un sitio en la chaperona periplásmica molecular o el análogo de la misma y establecer la conformación tridimensional de la chaperona periplásmica molecular o del análogo de la misma y el ligando cuando interactúan por medio de cristalografía de rayos X,
- -
- usar la conformación establecida anteriormente de la chaperona periplásmica molecular o del análogo de la misma para establecer la representación tridimensional del sitio en la chaperona periplásmica molecular o el análogo de la misma que interactúa con el ligando durante la unión,
- -
- seleccionar un número de grupos químicos distintos, X1, y determinar las posibles distribuciones espaciales de los grupos químicos X1 que maximizan la energía libre de unión entre los grupos químicos y el sitio en la chaperona o el análogo que interactúa con el ligando,
- -
- extraer, de una base de datos que comprende representaciones tridimensionales de moléculas, una molécula que tenga los grupos químicos X1 en las posibles distribuciones espaciales determinadas anteriormente,
- -
- modificar opcionalmente la representación tridimensional de la molécula extraída de la base de datos,
e identificar la molécula opcionalmente
modificada como la sustancia A.
14. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 13, en el que el ligando es una subunidad de pilus o
una parte de la misma cuya chaperona molecular periplásmica
normalmente interactúa durante el transporte de la subunidad de
pilus a través del espacio periplásmico y/o durante el ensamblaje de
pilus.
15. Un compuesto nuevo de fórmula general:
en la
que
V_{1} es O, S, SO, SO_{2}, CH_{2},
C(OH)H, CO o CS;
W_{1} es O, S, SO_{2}, SO_{3}, CH_{2} o
NH;
R_{1} es H; alquilo C_{1-24},
alquenilo C_{1-24} o alquinilo
C_{1-24}, donde el alquilo, alquenilo y alquinilo
pueden estar sustituidos con uno o más sustituyentes seleccionados
entre OH, -CONH_{2}, -CSNH_{2}, -CONHOH, -CSNHOH, -NHCHO,
-NHCONH_{2}, -NHCSNH_{2}, -NHSO_{2}NH_{2} y
-SO_{2}NH_{2}; acilo; o
-(CH_{2}CH_{2}O)_{s}-H, en el que s =
1, 2, 3;
R_{2} es un grupo de la fórmula
en la
que
A es -CH-(CH_{2})_{n}- o
-CH=CH-(CH_{2})_{n-1}- (n > 0) o
-C(=Y_{2})H-(CH_{2})_{n}-;
B es -(CH_{2})_{m}- o
=CH-(CH_{2})_{m-1}- (m > 0);
X_{2} es N, CH o C (donde B es
=CH-(CH_{2})_{m-1}-; e
Y_{2} es O, S, NH, H_{2} o H (n = 1); y
4 > m + n > 0, n < 3 y m < 3;
o R_{2} es un grupo de fórmula
en la
que
A es -CH-(CH_{2})_{n}- o
-CH=CH-(CH_{2})_{n-1}- (n > 0) o
-C(=Y_{2})H-(CH_{2})_{n}-;
B es -(CH_{2})_{m}- o
=CH-(CH_{2})_{m-1}- (m > 0); y
X'_{2} es O, NH, CH_{2} o S (cuando p = 0); N
o CH (p = 1); o C (cuando p = 1 y B es
=CH-(CH_{2})_{m-1}-);
V_{2}, Z_{2} y W_{2} son independientemente
H, OH, -CONH_{2}, -CSNH_{2}, -CONHOH, -CSNHOH, -NHCHO,
-NHCONH_{2}, -NHCSNH_{2}, -NHSO_{2}NH, -SO_{2}NH_{2}, o
V_{2} y Z_{2}, o Z_{2} y W_{2} juntos forman
-NHC(O)NH-, -C(O)NHC(O)-,
-NHS(O_{2})NH-, -C(O)NHO-,
-C(S)NHO-, -S(O_{2})NHO- o
-S(O_{2})NHC(O)-;
4 > m + n > 0, n < 3 y m < 3;
o R_{2} es un grupo -W_{5}-(alquilo
C_{1-5} o alquenilo C_{2-5} o
alquinilo C_{2-5}) donde W_{5} es un enlace o se
selecciona entre -O-, -S-, -SO_{2}- y -NHC(O)- y el resto
alquilo C_{1-5}, alquenilo
C_{2-5} o alquinilo C_{2-5}
puede estar sustituido con hasta tres grupos seleccionados
independientemente entre OH, -CONH_{2}, -CSNH_{2}, -CONHOH,
-CSNHOH, -NHCHO, -NHCONH_{2}, -NHCSNH_{2}, -NHSO_{2}NH_{2} y
-SO_{2}NH_{2};
-Z_{1}-R_{3} es
-SO_{2}(OH), -PO(OH)_{2},
-OSO_{2}(OH), -NHSO_{2}(OH),
-SPO(OH)_{2}, -CH_{2}COOH,
tetrazol-5-ilo o
tetrazol-5-ilmetilo, o sales del
mismo;
o Z_{1} es -O-, -S-, -NH- o -CH_{2}- y
R_{3} es un grupo de fórmula:
D es -CH_{2}-, -CO-, -SO_{2}-,
-NH-SO_{2}-, -NH-CO-,
-O-PO(OH)- o una sal del mismo;
Z_{3} es H, OH, -CONH_{2}, -CSNH_{2},
-CONHOH, -CSNHOH, -NHCHO, -NHCONH_{2}, -NHCSNH_{2},
-NHSO_{2}NH_{2}, -SO_{2}NH_{2}, -SO_{2}(OH),
-PO(OH)_{2}, -OSO_{2}(OH),
-NHSO_{2}(OH), -COOH,
tetrazolil-5-ilo o
tatrazolil-5-ilmetilo o una sal del
mismo,
con la condición de que cuando D es -CH_{2},
-CO-, -SO_{2}-, -NHSO_{2}- o -NHCO-, entonces Z_{3} es
-SO_{2}(OH), -PO(OH)
\hbox{ _{2} ,}-OSO_{2}(OH), -NHSO_{2}(OH), -COOH, tetrazolil-5-ilo o tetrazolil-5-ilmetilo o una sal del mismo;
X_{3} e Y_{3} son independientemente H,
NO_{2}, SO_{2}NH_{2}, CONH_{2}, CF_{3} o F; y
U_{4}-W_{4} es -CHCH-,
-CH_{2}CH_{2}-, -C(OH)CH-, -CHC(OH)-,
-CH(OH)CH_{2}-, -CH_{2}CH(OH)-,
-CH(OH)CH(OH)-, -C(O)NH-,
-NHC(O)-;
Y_{1} es -OH- o -S-;
R_{4} es H o, cuando Y_{1} es S,
S(CH_{2})_{q}N(R_{9})_{3}^{+}
y q es un número entero de 2-4, donde R_{9} es H o
CH_{3};
R_{5} es H; alquilo C_{1-6},
alquenilo C_{2-6} o alquinilo
C_{2-6}, y el resto alquilo
C_{1-6}, alquenilo C_{2-6} o
alquinilo C_{2-6} puede estar sustituido con OH,
-CONH_{2}, -CSNH_{2}, -CONHOH, -CSNHOH, -NHCHO, -NHCONH_{2},
-NHCSNH_{2}, -NHSO_{2}NH_{2} o -SO_{2}NH_{2}; o arilo,
aril-alquilo (C_{1-2}),
heterociclilo o heterociclil-alquilo
(C_{1-2}) que pueden estar opcionalmente
sustituidos en los restos arilo o heterociclilo con uno, dos o tres
sustituyentes seleccionados independientemente entre OH, F, Cl,
NH_{2}, CONH_{2}, NHCOH y SO_{2}NH_{2};
X_{1} es -O-, -S- o -NH-;
R_{6} es H o, cuando X_{1} es NH, acilo,
HOCNH-Val-Met-,
HOCNH-Ile-(S,S)-dioxo-metionil-
o
HOCNH-Val-(piran-4-on-2-il)-alanil-;
o una sal del mismo.
16. Un compuesto nuevo de fórmula general
en la
que
X es O, P, P(O), S, SO, SO_{2},
CH_{2}, C(OH)H o un grupo NQ_{11}, donde Q_{11}
es H, OH, acilo C_{1-24} o alquilo
C_{1-24};
Z_{11} es un enlace, O, CH_{2}, S, SO,
SO_{2} o un grupo NQ_{12}, donde Q_{12} es H, acilo
C_{1-24} o alquilo C_{1-24};
R_{11} es H; alquilo
C_{1-24}, alquenilo C_{2-24} o
alquinilo C_{2-24}, que puede estar sustituido con
uno o más sustituyentes seleccionados independientemente entre -OH,
-COOH, -F, -Cl, -CONH_{2}, -CSNH_{2}, -CONHOH, -CSNHOH, -NHCHO,
-NHCONH_{2}, -NHCSNH_{2}, -NHSO_{3}NH_{2} y
-SO_{2}NH_{2}; acilo; o
-(CH_{2}CH_{2}O)_{s}-H, donde s = 1, 2
ó 3;
o R_{11} es
CH=CH-(CH_{2})_{n'}-Q_{13} o
-(CH_{2})_{n'}-Q_{13}, donde Q_{13}
es un grupo arilo o heteroarilo sustituido con -OH, -COOH, -F, -Cl,
-CONH_{2}, -CSNH_{2}, -CONHOH, -CSNHOH, -NHCHO, -NHCONH_{2},
-NHCSNH_{2}, -NHSO_{3}NH_{2} y -SO_{2}NH_{2}, y donde n'
\geq 0;
R_{12} y R_{13} son independientemente OH, H,
F, Cl, OW_{11} u O(CO)W_{11}, donde W_{11} es
alquilo C_{1-24}, alquenilo
C_{2-24} o alquinilo C_{2-24}, o
un grupo arilo o heteroarilo sustituido con -OH, -COOH, -F, -Cl,
-CNH_{2}, -CSNH_{2}, -CONHOH, -CSNHOH, -NHCHO, -NHCONH_{2},
-NHCSNH_{2}, -NHSO_{3}NH_{2} y -SO_{2}NH_{2};
Z_{12} es un enlace, O, S o CH_{2};
R_{14} es
-(CH_{2})_{n''}-Q_{14}, donde Q_{14}
es un grupo arilo o un grupo heteroarilo, dicho grupo arilo o
heteroarilo está sustituido con -OH, -COOH, -F, -Cl, -CONH_{2},
-CSNH_{2}, -CONHOH, -CSNHOH, -NHCHO, -NHCONH_{2}, -NHCSNH_{2},
-NHSO_{3}NH_{2} y -SO_{2}NH_{2}, y donde n'' = 0, 1, 2 ó
3;
Z_{13} es un enlace, O, CH_{2}, S, SO,
SO_{2}, NQ_{14}Q_{15}, donde Q_{14} es H, acilo
C_{1-24} o alquilo C_{1-24}, y
Q_{15} es CO o -C(O)W_{12}, donde W_{12} es O o
NW_{13}, donde W_{13} es H, OH, acilo C_{1-24}
o alquilo C_{1-24};
R_{15} es H; alquilo
C_{1-24}, alquenilo C_{2-24} o
alquinilo C_{2-24}, donde el alquilo, alquenilo o
alquinilo pueden estar sustituidos con uno o más sustituyentes
seleccionados independientemente entre -OH, -COOH, -F, -Cl
-CONH_{2}, -CSNH_{2}, -CONHOH, -CSNHOH, -NHCHO, -NHCONH_{2},
-NHCSNH_{2}, -NHSO_{3}NH_{2} y -SO_{2}NH_{2}; acilo o
-(CH_{2}CH_{2}O)
\hbox{ _{s} }-H, donde s = 1, 2 ó 3;
o R_{15} es
CH=CH-(CH_{2})_{n'}-Q_{13} o
-(CH_{2})_{n'}-Q_{13}, donde Q_{3} es
como se ha definido anteriormente y donde n' \geq 0;
o una sal del mismo.
17. Un compuesto de la reivindicación 15 ó 16,
que provoca la prevención, inhibición o mejora de la unión de
G1'-19'WT a PapD, y/o provoca la prevención,
inhibición o mejora de la unión de MBP-G140' a
PapD, y/o provoca la prevención, inhibición o mejora de la
unión de G125'-140' a PapD, y/o provoca la
prevención, inhibición o mejora de una subunidad de pilus a
PapD.
18. Un nuevo piranósido o una sal del mismo, que
se selecciona entre el grupo constituido por
2,3-O-Dibenzoil-4-O-bencil-1-tio-\beta-D-glucohexopiranósida
de etilo;
6-O-Acetil-2,3-O-dibenzoil-4-O-bencil-1-tio-\beta-D-glucohexopiranósido
de etilo;
6-O-Acetil-2,3-O-dibenzoil-4-O-bencil-\beta-D-glucohexopiranósido
de metilglicolilo;
4-O-Bencil-\beta-D-glucopiranósido
de 2-(hidroxi) etilo;
4-O-Bencil-\beta-D-glucohexopiranósido
de glicolil sódico;
2-O-Etil-4,6-O-(4'-metoxi)fenilmetilen-\alpha-D-mannohexopiranósido
de metilo;
2-O-Etil-3-O-dimetil-t-butilsilil-4,6-O-(4'-metoxi)fenilmetilen-\alpha-D-mannohexopiranósido
de metilo;
2-O-etil-3-O-dimetil-t-butilsilil-4,-O-(4'-metoxi)-bencil-\alpha-D-mannohexopiranósido
de metilo;
2-O-Etil-3-O-dimetil-t-butilsilil-6-O-(4'-metoxi)-bencil-\alpha-D-mannohexopiranósido
de metilo;
2-O-Etil-3-O-dimetil-t-butilsilil-4,-O-(4'-metoxi)-bencil-6(S)-fenil-\alpha-D-mannohexopiranósido
de metilo;
2,3-Anhidro-4,6-O-p-metoxibenciliden-\alpha-D-mannopiranósido
de metilo;
3-Azido-4,6-O-p-metoxibenciliden-\alpha-D-altropiranósido
de metilo;
3-Azido-2-O-etil-4,6-O-p-metoxibenciliden-\alpha-D-altropiranósido
de metilo;
3-Azido-3-desoxi-2-O-etil-4-O-p-metoxibencil-\alpha-D-altropiranósido
de metilo;
3-Azido-6-O-benzoil-3-desoxi-2-O-etil-4-O-p-metoxi-bencil-\alpha-D-altropiranósido
de metilo;
Sal sódica de
6-O-benzoil-3-desoxi-2-O-etil-4-O-p-metoxibencil-3-sulfamino-\alpha-D-altropiranósido
de metilo;
Sal de amonio de
6-O-benzoil-3-desoxi-2-O-etil-3-sulfamino-\alpha-D-altropiranósido
de metilo;
3-Azido-6-O-pivaloil-3-desoxi-2-O-etil-4-O-p-metoxi-bencil-\alpha-D-altropiranósido
de metilo;
Sal sódica de
6-O-pivaloil-3-desoxi-2-O-etil-4-O-p-metoxibencil-3-sulfamino-\alpha-D-altropiranósido
de metilo;
Sal de amonio de
6-O-pivaloil-3-desoxi-2-O-etil-3-sulfamino-\alpha-D-altropiranósido
de metilo;
6-O-pivaloil-3-desoxi-2-O-etil-4-O-p-metoxibencil-3-t-butiloxamido-\alpha-D-altropiranósido
de metilo;
Sal de amonio de
6-O-pivaloil-3-desoxi-2-O-etil-3-oxamido-\alpha-D-altropiranósido
de metilo;
3-Azido-6-O-pirrol-3'-ilcarboxil-3-desoxi-2-O-etil-4-O-p-metoxibencil-\alpha-D-altropiranósido;
y
Sal de amonio de
6-O-pirrol-3'-ilcarboxil-3-desoxi-2-O-etil-3-sulfamino-\alpha-D-altropiranósido
de metilo.
19. Una a una composición farmacéutica, que
comprende, como compuesto activo, una sustancia que puede
interactuar con al menos un tipo de chaperona molecular periplásmica
que une las subunidades de pilus durante el transporte de esas
subunidades de pilus a través del espacio periplásmico y/o durante
el procedimiento de ensamblaje de los compuestos de pilus intacto,
de tal forma que la unión de las subunidades de pilus a la chaperona
molecular periplásmica se previene, inhibe o mejora, donde la
prevención, inhibición o mejora de la unión se realiza por la
interacción con, en la chaperona molecular periplásmica, un sitio de
unión que es un sitio de unión al que la parte carboxilo terminal de
una subunidad de pilus es capaz de unirse, y que comprende puntos de
sitio sustancialmente idénticos a los residuos invariantes
Arg-8 y Lys-112 en PapD y un
fragmento polipeptídico que es capaz de interactuar con una cadena
\beta de la parte carboxilo terminal de la subunidad de pilus,
estabilizando por lo tanto la unión de dicha subunidad en los puntos
de sitio Arg-8 y Lys-112 del sitio
de unión, en combinación con al menos un vehículo o excipiente
farmacéuticamente aceptable, siendo la sustancia un compuesto de
acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones
15-18.
20. Una composición farmacéutica de acuerdo con
la reivindicación 19, que además comprende al menos una sustancia
farmacéutica adicional.
21. Una composición farmacéutica de acuerdo con
la reivindicación 20, donde al menos una sustancia farmacéutica
adicional es un agente antibacteriano seleccionado entre el grupo
constituido por penicilinas, cefalosporinas, aminoglicósidos,
sulfonamidas, tetraciclinas, cloranfenicol, polimixinas, fármacos
anti-micobacterianos y antisépticos urinarios.
22. Una sustancia para uso farmacéutico, siendo
la sustancia capaz de interactuar con al menos un tipo de chaperona
molecular periplásmica que une las subunidades de pilus durante el
transporte de esas subunidades de a través del espacio periplásmico
y/o durante el procedimiento de ensamblaje de los compuestos de
pilus intacto, de tal forma que la unión de las subunidades de pilus
a la chaperona molecular periplásmica se previene, inhibe o mejora,
donde el sitio de unión es un sitio de unión al que la parte
carboxilo terminal de una subunidad de pilus es capaz de unirse, y
que comprende puntos de sitio sustancialmente idénticos a los
residuos invariantes Arg-8 y Lys-112
en PapD y un fragmento polipeptídico que es capaz de
interactuar con una cadena \beta de la parte carboxilo terminal de
la subunidad de pilus, estabilizando por lo tanto la unión de dicha
subunidad en los puntos de sitio Arg-8 y
Lys-112 del sitio de unión, donde la sustancia es un
compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones
15-18.
23. La sustancia de acuerdo con la reivindicación
22, en el que la sustancia provoca la prevención, inhibición o
mejora de la unión de G1'-19'WT a PapD, y/o
causa la prevención, inhibición o mejora de la unión de
MBP-G140' a PapD, y/o provoca la prevención,
inhibición o mejora de la unión de G125'-140' a
PapD, y/o provoca la prevención, inhibición o mejora de una
subunidad de pilus a PapD.
24. El uso de una sustancia para la preparación
de una composición farmacéutica para el tratamiento y/o profilaxis
de enfermedades provocadas por bacterias que forman pilus que se
adhieren al tejido, siendo dicha sustancia capaz de prevenir,
inhibir o mejorar la unión entre al menos un tipo de subunidad de
pilus y al menos un tipo de chaperona molecular periplásmica en las
bacterias que forman pilus, siendo la chaperona molecular
periplásmica una que une subunidades de pilus durante el transporte
de dichas subunidades de pilus a través del espacio periplásmico y/o
durante el procedimiento de ensamblaje del compuesto de pilus
intacto, donde la prevención, inhibición o mejora de la unión se
realiza por la interacción con, en la chaperona molecular
periplásmica, un sitio de unión al que la parte carboxilo terminal
de una subunidad de pilus es capaz de unirse, y que comprende puntos
de sitio sustancialmente idénticos a los residuos invariantes
Arg-8 y Lys-112 en PapD y un
fragmento polipeptídico que es capaz de interactuar con una cadena
\beta de la parte carboxilo terminal de la subunidad de pilus,
estabilizando por lo tanto la unión de dicha subunidad en los puntos
de sitio Arg-8 y Lys-112 del sitio
de unión, siendo la sustancia un compuesto de acuerdo con cualquiera
de las reivindicaciones 15-18.
25. El uso de acuerdo con la reivindicación 24,
en el que las bacterias se seleccionan entre el grupo constituido
por Haemophilus spp, Helicobacter spp, Pseudomonas aeruginosa,
Mycoplasma spp y todos los miembros de la familia
Enterobacteriacieae, incluyendo Escherichia spp,
Salmonella spp, Bordetella spp, Yersinia spp, Klebsiella spp.,
y Proteus spp.
26. El uso de acuerdo con las reivindicaciones
24-25, en el que la chaperona molecular periplásmica
es una proteína seleccionada entre el grupo constituido por PapD,
FimC, SfaE, FaeE, FanE, Cs3-1, F17D, ClpE, EcpD,
Mrkb, FimB, SefB, HifB, MyfB, PsaB, PefD, YehC, MrpD, CssC, NfaE,
AggD y Caf1M.
27. El uso de acuerdo con la reivindicación 24,
en el que el sitio de unión es uno al que es capaz de unir el
péptido G125'-140' y/o el péptido de fusión
MBP-140' y/o el péptido G1'-19'.
28. El uso de una sustancia para la preparación
de una composición farmacéutica para el tratamiento y/o profilaxis
de enfermedades provocadas por infecciones bacterianas, siendo dicha
sustancia capaz de interactuar con al menos un tipo de chaperona
molecular periplásmica que une subunidades de pilus durante el
transporte de dichas subunidades de pilus a través del espacio
periplásmico y/o durante el procedimiento de ensamblaje del
compuesto de pilus intacto, de tal forma que la unión de las
subunidades de pilus a la chaperona molecular periplásmica se
previene, inhibe o mejora, siendo el sitio de unión un sitio de
unión al que la parte carboxilo terminal de una subunidad de pilus
es capaz de unirse, y que comprende puntos de sitio sustancialmente
idénticos a los residuos invariantes Arg-8 y
Lys-112 en PapD y un fragmento polipeptídico
que es capaz de interactuar con una cadena \beta de la parte
carboxilo terminal de la subunidad de pilus, estabilizando de dicha
forma la unión de dicha subunidad en los puntos de sitio
Arg-8 y Lys-112 del sitio de unión,
siendo la sustancia un compuesto de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 15-18.
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