ES2224382T3 - Replicones compactos del virus de epstein-barr. - Google Patents
Replicones compactos del virus de epstein-barr.Info
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Abstract
Una secuencia de ácido nucleico que permite la replicación episomal en una célula de mamífero, comprendiendo dicha secuencia de ácido nucleico: (a) una secuencia OriP y (b) una secuencia EBNA1 unida de manera operativa a un promotor, teniendo dicha secuencia de ácido nucleico una longitud de menos de 3 kb, donde dicha secuencia OriP comprende los restos 1-495 de SEQ ID NO:1 y dicha secuencia EBNA1 comprende los restos 627-1.718 de SEQ ID NO:1.
Description
Replicones compactos del virus de
Epstein-Barr.
El virus Epstein-Barr (EBV) es un
herpes virus humano con una fase latente que se caracteriza por la
propagación episomal estable de una forma circular del ADN vírico.
Se requieren dos elementos de ADN discontinuos para la replicación
en la fase latente, el origen de replicación que actúa en cis, OriP,
y el Antígeno Nuclear 1 de Epstein-Barr (EBNA1), la
única proteína codificada por el virus necesaria para la
replicación (Yates et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:
3806-10, 1984; Yates et al., Nature 313:
812-5, 1985). La mayoría de los vectores EBV son
muy grandes, del orden de 10 kb o más (sin el inserto), debido al
gran tamaño de los segmentos EBNA1 y OriP. El tamaño de la mayoría
de los segmentos EBV EBNA1 y OriP existentes ha interferido con el
desarrollo de vectores de expresión mejores y con la creación de
cassettes compactas de expresión génica y de persistencia que pueden
ser introducidas en otros vehículos de administración génica, como
retrovirus o adenovirus.
EEUU 4.939.088 describe un sistema compacto de
expresión del virus Epstein Barr que permite la replicación
episomal, donde el sistema de expresión comprende OriP y el
nucleótido EBNA1.
De manera general, la invención muestra una
secuencia de ácido nucleico que permite la replicación episomal en
una célula de mamífero. Esta secuencia de ácido nucleico incluye
(a) una secuencia delecionada OriP y (b) una secuencia EBNA1
delecionada unida de manera operativa a un promotor, y la secuencia
de ácido nucleico tiene una longitud de menos de 3 kb,
preferiblemente menos de 2 kb, y, más preferiblemente menos de 1,8
kb, donde la secuencia OriP incluye los restos
1-495 de SEQ ID NO: 1; la secuencia EBNA1 incluye
los restos 627-1718 de SEQ ID NO:1; preferiblemente
la secuencia de ácido nucleico incluye además una secuencia
consenso de poliadenilación (por ejemplo, la secuencia SEQ ID NO:
2); y el promotor es un promotor vírico.
En aspectos relacionados, la invención también
muestra vectores y células (por ejemplo, células de mamífero, y
preferiblemente células humanas) que incluyen las mencionadas
secuencias de ácido nucleico.
Se describirán en primer lugar los dibujos.
La Figura 1 es la secuencia de una cassette
acortada EBV OriP y EBNA1.
La Figura 2 es la secuencia de una secuencia
compacta sintética bidireccional de poliadenilación que puede
utilizarse junto a un replicón EBV compacto.
Después de deleción y mutagénesis extensas, se ha
visto que es posible introducir las funciones que actúan en cis y
trans necesarias para la replicación episomal de EBV en un
fragmento de menos de 2 kb. En particular, en la Figura 1 se
muestra como ejemplo un fragmento de 1.748 pares de bases que actúa
como un replicón EBV compacto (SEQ ID NO: 1). Este fragmento
contiene todas las secuencias necesarias para la expresión eficaz
de la proteína EBNA-1, con la excepción de una
secuencia consenso de poliadenilación. Este fragmento es un
segmento Bg12 a BamH1 que contiene el elemento OriP entre los restos
1 y 495, un promotor modificado del gen de la timidina quinasa del
Herpes simplex virus 1 entre los restos 496 a 616, y la secuencia
que codifica un gen EBNA1 delecionado y modificado entre los restos
627 y 1.718. Los vectores de plásmido basados en esta secuencia se
replican como episomas en el núcleo de células transfectadas de
origen no roedor (Yates et al., 1985, supra).
Con el fin de reducir la longitud total de la
secuencia, se diseñó el fragmento descrito más arriba para
insertarse más arriba de una secuencia bidireccional de
poliadenilación en un vector apropiado. En la Figura 2, se muestra
un ejemplo de una secuencia compacta sintética bidireccional de
poliadenilación (SEQ ID NO: 2).
Los replicones EBV compactos tienen utilidad en
vectores de terapia génica, por ejemplo, en vehículos de
administración génica como vectores de expresión.
Claims (8)
1. Una secuencia de ácido nucleico que permite la
replicación episomal en una célula de mamífero, comprendiendo dicha
secuencia de ácido nucleico (a) una secuencia OriP y (b) una
secuencia EBNA1 unida de manera operativa a un promotor, teniendo
dicha secuencia de ácido nucleico una longitud de menos de 3 kb,
donde dicha secuencia OriP comprende los restos
1-495 de SEQ ID NO:1 y dicha secuencia EBNA1
comprende los restos 627-1.718 de SEQ ID NO: 1.
2. La secuencia de ácido nucleico de la
reivindicación 1, teniendo dicho ácido nucleico una longitud de
menos de 2 kb.
3. La secuencia de ácido nucleico de la
reivindicación 1, teniendo dicho ácido nucleico una longitud de
menos de 1,8 kb.
4. La secuencia de ácido nucleico de cualquiera
de las reivindicaciones 1-3, comprendiendo dicha
secuencia de ácido nucleico además una secuencia consenso de
poliadenilación.
5. La secuencia de ácido nucleico de la
reivindicación 4, donde la mencionada secuencia consenso de
poliadenilación comprende SEQ ID NO: 2.
6. La secuencia de ácido nucleico de cualquiera
de las reivindicaciones 1-5, donde el mencionado
promotor es un promotor vírico.
7. Un vector que comprende la secuencia de ácido
nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1-6,
siendo dicho vector capaz de replicarse como un episoma en el
núcleo de una célula transfectada.
8. Una célula que comprende la secuencia de ácido
nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1-6
y/o el vector de la reivindicación 7.
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