KR100548187B1 - 헬퍼바이러스 없이 유전자 벡터dna를 패키징하는 방법 - Google Patents

Abstract

개시된 내용은, DNA바이러스의 바이러스입자들 내로 유전자벡터DNA를 헬퍼바이러스 없이 패키징 하기 위한 방법 및 DNA헬퍼바이러스의 바이러스입자들 내로 유전자벡터DNA를 헬퍼바이러스 없이 패키징 하기 위한 진핵헬퍼세포에 관한 것이며, 상기에서 DNA바이러스는 게놈이 100kbp이상인 것이 채택된다.

Description

헬퍼바이러스 없이 유전자벡터ＤＮＡ를 패키징하는 방법

본 발명은, 헬퍼바이러스 없이 DNA바이러스의 바이러스입자 내로 유전자벡터 DNA를 패키징하기 위한 방법 및 헬퍼바이러스 없이 DNA헬퍼바이러스들의 바이러스입자들 내로 유전자벡터DNA를 패키징 하기 위한 진핵헬퍼세포에 관한 것으로, 상기에서 DNA바이러스는 게놈이 100kbp이상인 것이 사용된다.

엡스타인-바 바이러스(EBV)는 알려진 8종의 인체내의 헤르페스 바이러스들 중 하나이다. 분리한 EBV B95.8의 DNA서열은 결정되어 있으며(Baer등, 1984), 상세한 과학적 증거가, 두 가지의 EBV상태에서 중요한 역할을 하는 DNA성분에 관해서 주로 작업이 이루어져 왔다. 소위 "잠복단계(latent phase)"에서, 바이러스들은 숙주세포의 생명력이 영향을 받지 않는 동안 숙주세포와 안전한 관계를 성립하나, 바이러스DNA게놈이 숙주세포 내에서 염색체외의 플라스미드의 형태로 복제되어서 낭세포(daughter cells) 내로 들어가게 된다. 이 잠복단계는 잠복방식으로 감염된 세포의 형질전환 또는 불멸화(immortalization)와 각각 결합될 수 있다. 플라스미드의 복제기점 oriP는 잠복단계에서 EBV게놈의 보존 및 복제에 필수적인 DNA성분이다(Yates등 1985). 또한 이런 DNA성분은 재조합 플라스미드에서도 활성을 가지며, 여러 방법에서 사용되고 있다.

소위 "세포용해나 생산단계"에서는, 바이러스가, 유전자조절 또는 구조바이러스 성분의 생산에 각각 필요한 거의 모든 바이러스 단백질들의 발현을 포함해서 해리되었다. 또, 이 용해단계는 2개의 다른 DNA성분들: 바이러스DNA의 증폭에 책임이 있는 용해 복제기점 oriLyt(Hammerschmidt 및 Sugden, 1988), 증폭된 EBV DNA의 포막화에 필요 불가결한 패키징신호들인 말단반복 TR(Hammerschmidt 및 Sugden, 1989)을 필요로 한다.

EBV유전자벡터 뿐만 아니라, EBV기능들, 재조합 EBV게놈들의 구조를 유전적으로 분석함에 있어서는 큰 흥미로운 점이 있다. 부가적인 치료학적으로 관련있는 유전자들이 적절한 수용체세포 내로 도입될 수 있기 때문에, 유전자벡터들이 특히 흥미있다. 그러나, 원치 않는 EBV유전자들의 표적세포들(target cells) 내로의 동시-이동은 배제되어야만 한다. 이러한 문제는 새로운 치료형태의 안정성을 달성하고 인체의 유전자치료에 있어서 헤르페스바이러스 유전자벡터를 사용할 수 있기 위해 해결되어져야 한다.

유전자벡터들의 생산에 있어서의 정책은, 소위 헬퍼바이러스들의 해리는 방지하면서, 바이러스 캡시드를 가진 유전자벡터들만을 제공하도록 방향을 설정한다. 이러한 것은, 헬퍼바이러스 그 자체의 생산을 위해 필요한 헬퍼바이러스게놈의 시스-활성 DNA성분들을 제거하거나 또는 돌연변이 시키는 것에 의해 달성된다. 지금까지는 바이러스입자들의 성숙을 위해 필요 불가결한 EBV게놈부분을 유전적으로 대량생산하는 것은 불가능하였다. 그래서, 예를 들어, 바이러스게놈의 패키징에 절대적으로 요구되는 EBV 또는 다른 헤르페스바이러스들의 기능들을 제거하는 것은 불가능하였다. 지금까지는, 유전자벡터 증폭에 대한 모든 바이러스기능들을 이용하기 위해, 타깃방식(targeted manner)으로 헤르페스바이러스들에 의해 감염된 세포계들이 보편적으로 사용되어 왔다. 감염성 바이러스들의 동시 증폭 및 이 게놈의 바이러스 캡시드 내로의 패키징은 피할 수 없었다. 비슷하게 지금까지는 잠복 방식으로 EBV에 의해 감염된 세포계들을 사용해왔다. 또, 이 경우에서도, 바이러스의 용해기능들은 적절한 유전자벡터들의 패키징에 필수적이어서, 헬퍼바이러스게놈의 증폭 및 연이은 패키징은 피할 수 없었다(Hammerschmidt 및 Sugden, 1989; Kempkes 등, 1995b).

바이러스유전자 벡터들은 유전자치료에 중요한 도구이다. 그러나, 이들의 제조 및 치료학상 이용하는 바이러스유전자 벡터들이 어떠한 바이러스도 포함하지 않도록 제조되는 것이 보장되어야만 한다. 어떤 바이러스유전자의 기능들은 바이러스 유전자벡터의 생산에 필요 불가결하기 때문에, 소위 헬퍼바이러스들 또는 그 기능적 분절들(segments)의 이용을 피하는 것이 중요하다. 특히, 이것은 수많은 바이러스로 코딩되는 기능들에 따라서 복잡한 바이러스계를 혼합하기 위해 적용된다. 그래서, 예를 들어, 80유전자 이상을 코딩하는 EBV 중에서, 약 50개가 바이러스합성에 필수적이다. 이러한 유전자들이 전체적으로 단일 DNA분자의 바이러스게놈상에 존재하기 때문에, 어떤 특성들은 이것의 게놈이 바이러스입자들 내로 패키징되고 유전자벡터와 함께 해리되는 것을 방지하기 위해 유실되어야 한다. 이런 헬퍼바이러스의 해리를 방지할 수 있는 하나의 가능성이, 헬퍼바이러스게놈 그 자체의 패키징에 필수적인 게놈의 시스-활성부분을 제거하는 것이다. EBV에서, 이러한 게놈영역은 TR(TR=terminal repeats)서열로 언급되며, 다른 헤르페스바이러스에서는 pac서열(pac=packaging)이라 언급된다. 또한, 시스에서 헬퍼바이러스게놈의 복제에 필수적인 다른 영역들 또는 그들의 기능들이 제거될 수 있다. EBV에서, 이것은 용해 복제기점, oriLyt일 수 있으며, 이것과 기능이 동등한 것이 다른 헤르페스바이러스들에서는 oriS 또는 oriL이라 불린다.

이러한 영역들의 제거가 헬퍼바이러스의 해리를 방지하나; 또한 헬퍼바이러스 그 자체를 감염을 통해 바이러스 유전자벡터를 패키징 할 것으로 생각되는 세포내로 발생 또는 심지어 도입할 가능성도 방지된다. 이러한 특성들이 상호 서로 배타적이기 때문에, 지금까지는 헬퍼바이러스들을 해리하지 않고 헤르페스바이러스 유전자벡터들을 생산할 수 있는 세포계를 확립하는 것이 불가능하였다. 바이러스 게놈의 크기가 100kbp이상인 다른 바이러스계로부터 유래된 유전자벡터에 대해서도 동일하다. 또한, 헬퍼바이러스들과 유전자벡터의 생화학적분리에 의한 불이익을 피하는 것도 불가능하며, 이는 양 입자들이 외부나 물리적 조성이 아닌 유전적면에 대해서만 서로 다르기 때문이다. 우리의 발명은 먼저 상기 단점을 극복할 수 있게 한다.

본 발명의 목적은, 한편으로는 게놈이 100kbp이상인 DNA바이러스의 바이러스입자들을 생산하기 위한 단백질들을 이용하며, 다른 한편으로는 바이러스입자 내로 헬퍼바이러스DNA의 패키징을 피하는, DNA바이러스의 바이러스입자 내로 유전자벡터DNA를 패키징하는 방법을 제공하는데 있다.

본 목적은 다음의 단계들을 포함하는 방법에 의해 해결된다:

(a) 적어도 다음의 특징들을 갖는 하나 이상의 분자들상의 DNA헬퍼바이러스 벡터DNA를 진핵세포 내로 도입하는 단계:

(α) 총크기가 100kbp이상이며;

(β) DNA헬퍼바이러스 벡터DNA의 패키징을 위한 하나 이상의 시스-활성 신호 서열을 비기능적으로 만들기 위해 선정된 적어도 하나의 돌연변이를 지니며;

(γ) 헬퍼바이러스게놈을 포함하지 않는 DNA헬퍼바이러스들의 DNA바이러스입자들의 생산을 위한 정보를 지님;

(b) 적어도 다음을 갖는 패키징될 유전자벡터DNA를 상기 진핵세포 내로 도입하는 단계:

(α) 상기 DNA헬퍼바이러스들의 바이러스입자 내로 상기 유전자벡터DNA의 패키징을 위한 시스-활성 신호서열;

(β) 흥미있는 유전자;

(c) 상기 DNA헬퍼바이러스들의 용해단계의 유도 및 상기 DNA헬퍼바이러스들의 패키징에 중요한 단백질들을 생산하는 단계;

(d) 상기 DNA헬퍼바이러스들의 바이러스입자들 내로 유전자백터DNA를 패키징하는 단계; 선택적으로

(e) 상기 유전자벡터DNA를 포함하는 바이러스입자들을 해리하는 단계; 및/또는 선택적으로

(f) 상기 바이러스입자들을 정제하는 단계

본 발명에 따라서, 상기 DNA헬퍼바이러스 벡터DNA는 하나의 분자상 뿐만 아니라, 예를 들어 2이상의 분자상에도 존재할 수 있으며, 그 분자들의 총크기는 100kbp이상이다.

상기 DNA헬퍼바이러스 벡터DNA는 돌연변이 되어서, DNA를 패키징하기 위한 하나 이상의 시스-활성 신호서열들이 비기능적이 되며, 즉, 헬퍼바이러스DNA가 바이러스입자들의 생산에 필요한 정보들을 제공하나 바이러스입자 그자체 내로 패키지 되지는 않을 것이다.

패키징 될 유전자벡터DNA는 DNA헬퍼바이러스의 바이러스입자 내로 패키징 하는데 필요한 시스-활성 신호서열을 포함한다. 또, 패키징 될 DNA는 흥미있는 유전자를 포함한다. 본 발명의 또 다른 실시형태에서는, 원핵 및/또는 진핵생물에서 선택가능한 적어도 하나의 마커유전자가 부가적으로 존재할 수 있다.

DNA헬퍼바이러스의 용해단계의 유도에 이어서, 패키징에 필수적인 DNA헬퍼바이러스의 단백질이 생산되고, 연속하는 단계에서 유전자벡터DNA가 형성된 DNA헬퍼바이러스의 바이러스 입자들 내로 패키징된다. 이 DNA헬퍼바이러스 벡터DNA가 패키징을 위한 신호서열들이 부족하기 때문에, 이 헬퍼바이러스DNA가 바이러스입자들 내로 패키징 되지 않는다.

패키징 될 유전자벡터DNA를 가진 DNA헬퍼바이러스들의 바이러스입자들을 포함하는 진핵헬퍼세포는 그대로의 형태로 사용될 수 있으나, 또한, 이 바이러스입자들은 해리되고 선택적으로 정제되고, 분리 및/또는 농축될 수도 있다.

본 발명의 바람직한 실시형태에서, DNA헬퍼바이러스 벡터DNA는, 적어도 EBV DNA의 일부분을 포함한다. EBV가 DNA헬퍼바이러스인 경우에 있어서는, 이 헬퍼바이러스DNA에서 시스-활성 신호서열로서, EBV의 말단반복서열, EBV의 용해 복제기점, EBV의 플라스미드의 복제기점 oriP, 또는 EBV의 EBNA1이 돌연변이 되어서, 이들이 패키징을 위한 시스-활성 신호서열로서의 그들의 기능을 더 이상 발휘할 수 없다. 한편, 이러한 신호서열들은 기능을 갖는 형태(functional form)의 패키징신호로서 패키징될 유전자벡터DNA에서 채택될 수 있다.

원핵세포들 및/또는 진핵세포들에서 선택될 수 있는 마커유전자들은 그 자체가 알려져 있다. 예를 들어, 항생내성 유전자들 또는 형광에 의해 검출가능한 단백질을 코딩하는 유전자들이 있다.

상기 채택되는 진핵세포는 DNA헬퍼바이러스 벡터DNA와 양립할 수 있는 어떤 세포일 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시형태에서, 유전자는 DNA헬퍼바이러스의 세포트로피즘(cell tropism)에 영향을 주기 위해 진핵세포 내로 도입되며, 여기에서, 이 유전자는 이 유전자벡터DNA와는 다른 플라스미드 상에 위치하거나 또는 이 유전자벡터DNA 상에 배열된다. 이 유전자는 바이러스입자 내로 통합되는 단백질을 코딩해서, 그것의 세포트로피즘이 변경된다. 만일 원하거나 필요하다면, 세포트로피즘을 변경하기 위해 여러 개의 단백질들을 코딩하는 여러 개의 유전자들을 사용할 수 있다는 것도 이해될 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시형태에서, 진핵헬퍼세포들이, 유전자벡터DNA를 헬퍼바이러스 없이 DNA헬퍼바이러스들의 바이러스입자들 내로 패키징하기 위해 제공되며, 여기에서 상기 헬퍼세포는 적어도 다음을 포함한다:

(a) 100kbp이상이며, 패키징을 위한 하나 이상의 시스-활성 신호서열을 비기능적으로 만들기 위해 선정된 돌연변이를 운반하고, 헬퍼바이러스게놈을 포함하지 않는 DNA바이러스 입자들의 생산을 위한 정보를 지니는 하나 이상의 분자(들) 상의 DNA헬퍼바이러스 벡터;

(b) 적어도 다음을 갖는 유전자벡터DNA:

(α) 상기 DNA헬퍼바이러스들의 바이러스입자 내로 상기 유전자벡터DNA의 패키징을 위한 시스-활성 신호서열;

(β) 흥미있는 유전자,

본 발명의 또 다른 실시형태에서는, 이 유전자벡터DNA가 원핵생물 및/또는 진핵생물들에서 선택가능한 하나 이상의 마커유전자를 더 포함한다.

진핵헬퍼세포가 예를 들어 플라스미드 형태의 DNA분절을 더 포함할 수 있다는 것을 이해할 수 있다. 이 진핵헬퍼세포에 존재하는 DNA헬퍼바이러스 벡터DNA 및 유전자벡터DNA는 상술한 것과 같이 개발될 수 있다.

본 발명의 진핵헬퍼세포는, 예를 들어 DNA헬퍼바이러스 벡터DNA로서, 헤르페스바이러스DNA 바람직하게 EBV DNA 또는 적어도 그 일부분을 포함할 수 있다. 그러나, 예를 들어, 인체세포일 수 있으나, 이미 상술한 것과 같이 헬퍼바이러스들과 양립할 수 있는 어떤 세포들도 사용될 수 있다.

본 발명에 따라서, 바람직하게 헤르페스바이러스, 특히, EBV가 DNA헬퍼바이러스로 사용된다.

게놈이 100kbp이상인 DNA바이러스의 캡시드 내로 유전자벡터DNA를 헬퍼바이러스 없이 패키징 하는 것이 처음으로 가능하며, 이것은 100kbp이상의 DNA바이러스의 전체적인 게놈을 원핵생물 내로 클로닝 하고 진핵생물 및 원핵생물에서 이 큰 DNA게놈들의 분절을 변형하게 하는 기술을 확립하는 것에 의해 가능하였다. 그래서, 진핵세포에서 바이러스 기능들에 절대적으로 필요한, 100kbp이상의 DNA바이러스들의 분절들을 유전적으로 변경하는 것이 처음으로 가능해졌다. 예를 들어, EBV에서 이러한 기능들의 예로서, EBV의 DNA복제기점, oriLyt 및 oriP과, 바이러스DNA의 패키징신호들, 소위 말단반복들이다.

이 기술에 의해, 타깃방식에서 헬퍼바이러스 게놈의 패키징 및/또는 DNA복제를 위한 기능들을 없앨 수 있었다. 출발점은, EBV와 같이, 100kbp이상의 DNA바이러스들의 게놈을 재조합플라스미드의 형태로 E.coli와 같은 원핵세포 내로 클로닝하는 것이다. 이것은 원핵생물에서 종래의 재조합DNA법을 통해 100kbp이상의 DNA바이러스들의 모든 분절들의 변형에 필요한 이정표였다. 또, 이 변형은 진핵세포에서 바이러스게놈의 복제 및 그 패키징에 필수적인 DNA바이러스들의 게놈분절들을 포함한다. 원핵세포에서 이런 게놈분절들의 기능의 결실 또는 손실은 원핵세포에서 전혀 중요하지 않으며, 이는 예를 들어 EBV분절이, E.coli에서 리플리콘의 복제 및 보존에 전혀 중요하지 않는, E.coli리플리콘에서의 단지 -매우 큰- 삽입만을 나타내기 때문이다. 이렇게 원핵세포에서 변형된 바이러스게놈이 플라스미드DNA의 형태로 분리될 수 있으며, 그리고 나서, 종래의 DNA트랜스펙션법을 통해 이것이 적절한 진핵세포들 내로 도입될 수 있다. 이러한 제조방법이 바이러스유전자벡터들을 바이러스 캡시드 내로 패키지 할 수 있으나 더 이상 해리되지는 않는 헬퍼바이러스게놈들의 확립을 가능하게 한다. 다음에서 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 본 설명은 특히 플라스미드로서 전체적인 EBV게놈이 E.coli세포 내로 클로닝 되는 것에 근거를 둔다. 그러나, EBV의 클로닝 및 EBV캡시드를 제공하는 헬퍼세포 없는 패키징의 제조는, 단지 본 발명의 예시적인 실시형태로서 이해되어야 한다. 일반적으로, 본 발명은 100kbp이상의 게놈을 가진 다른 DNA바이러스들, 예를 들어 다른 헤르페스바이러스들 또는 폭스바이러스들, 바큐로바이러스 또는 이리디오바이러스들에도 적용될 수 있다.

다음으로, 본 발명을 실시예 및 도면들과 관련하여 보다 상세히 설명한다. 본 발명을 EBV헬퍼바이러스 벡터DNA와 관련하여 설명한다. 그러나, 이것은 단지 본 발명의 예시적인 실시형태를 나타낸다는 것을 이해해야 한다. 본 발명에 따라서, 다른 헬퍼바이러스들, 또 다른 유전자벡터DNA 등이 사용될 수 있다. 본 발명은 다음의 실시예들로 제한되지 않는다.

헤르페스바이러스 유전자벡터들에 대한 세포계를 패키징 하는데 적절한 헬퍼바이러스게놈의 제조를 위한 시발물질로서, B95.8 EBV종의 전체적인 EBV게놈을 운반하는 E.coli로부터의 플라스미드가 공급되었다. 이러한 EBV/F인자 플라스미드의 제조를 이하에서 설명한다.

바이러스의 패키징에 중요한 시스-활성 분절들을 제거하기 위해, 말단반복들을 E.coli에서의 EBV/F인자 플라스미드로부터 결실시키거나 또는 원핵선택마커 카나마이신 포스포트랜스퍼아제를 이 부위에 각각 삽입하였다. 본 발명의 각 단계들을 도 1에 나타내었다. 또한, 이 시스-활성성분의 결실은 다른 방법들을 사용해서도 성취될 수 있다. 또, 패키징에 필수요건인 바이러스게놈의 복제 중간체가 전혀 생산되지 않도록, EBV의 소위 용해기점을 비기능적으로 만드는 것에 의해, 상기 문제점을 해결할 수 있다.

이렇게 변형된 재조합 EBV/F인자 플라스미드를 E.coli에서 분리해서, 종래의 방법들을 사용해서 DNA분자들을 제조할 수 있다. 그리고 나서, DNA운반법을 이용해서 이러한 DNA분자들을 안정하게 또는 일시적으로 진핵세포 내로 운반한다. 이 재조합 EBV게놈들은, 잠복방식으로 EBV에 의해 감염된 세포계들과 비슷하게, 이러한 세포들에서 염색체외 복제를 행한다. 이런 세포계들에서, EBV의 용해단계는 바이러스 합성에 중요한 모든 단백질들의 발현을 이끌면서 유도될 수 있다. 기본적으로, 이러한 세포들에서, DNA복제를 위한 트랜스 및 다른 재조합 플라스미드, 소위 미니 EBV플라스미드 또는 유전자벡터들의 바이러스입자들 내로의 패키징을 위해 이러한 단백질들은 자동으로 이용될 수 있다(Hammerschmidt and Sugden, 1988; Hammerschmidt and Sugen, 1989).

상기 변형된 EBV/F인자 플라스미드는 패키징에 필수적인 시스-활성 DNA성분이 부족하기 때문에, 어떠한 유전적 정보도 지니지 않으나 세포 배양의 상층액 내로 해리될 수 있는, 속이 비고 불안전한 엡스타인-바 바이러스 입자가 합성된다. 그래서, 헬퍼바이러스 게놈으로서 EBV/F인자 플라스미드의 패키징이 불가능한 것을 제외하고는, 바이러스 유전자벡터의 패키징에 필요한 모든 기능들을 제공하는 세포계가 발생된다. 이러한 세포계들을 헬퍼바이러스 없이 패키징 하는 세포계들이라고 말한다.

바이러스유전자 벡터들은 종래의 분자생물학 클로닝법들에 의해 일반적으로 생산되는 재조합 플라스미드이다. 이 유전자벡터들의 대부분에서, 적어도 2개의 바이러스게놈 영역들이 재조합 플라스미드상의 시스에서 필요하다. 이러한 2영역들은 바이러스입자들 내로 유전자벡터DNA가 포막화되는데 필수적인 패키징신호들이다. 한편, 복제기점은 DNA분자상에 존재해야만 한다. 복제기점에 의해 영향을 받는 유전자벡터DNA의 증폭은 DNA복제 및 유전자벡터DNA의 복제수의 증가에 필수적일 뿐만 아니라 복제DNA 중간체를 합성하는데도 주로 필요하다. 헤르페스바이러스의 경우에, 이러한 DNA중간체들은 탠덤방식(tandem-like manner)으로 배열된 많은 시발 DNA분자들의 복사체로 구성되는 콘카테머DNA분자들이다. 일반적으로, 이러한 복제DNA중간체들이 핵산분자들의 바이러스입자들 내로의 포막화에 필요하다고 알려져 있다. 그러나, 이 패키징신호들도 상술한 것과 같이 포막화 단계에 중요하다.

EBV의 경우에, E.coli의 증식에 필요한 플라스미드의 원핵부분 이외에, 패키징신호 TR 및 용해 복제기점 oriLyt를 운반하는 바이러스유전자 벡터가 EBV바이러스 캡시드 내로 패키징 되기에 기본적으로 적절하다. 이러한 유전자벡터 플라스미드가 일시적 또는 안정한 형태로 헬퍼 바이러스 도움없이 패키징하는 세포계 내로 도입되고, EBV의 용해단계가 유도된다. 헬퍼바이러스게놈으로서 EBV/F인자 플라스미드에 의해 공급되는 바이러스 단백질은, 바이러스유전자 벡터플라스미드의 DNA복제, 이 유전자벡터DNA를 바이러스입자 내로 패키징 및 그들의 유리를 유도한다.

[실시예]

1. 헬퍼바이러스게놈으로서 EBV/F인자 플라스미드상에서의 TR영역의 결실

명칭이 p2010인 EBV/F인자 플라스미드를 종래의 방법을 이용하여 E.coli에서 변형시켜서, TR패키징신호들을 결실하고 원핵마커유전자 카나마이신 포스포트랜스퍼아제를 그 부위에 도입하였다. 도 1에 모식적으로 도시하듯이, EBV/F인자 플라스미드에서의 이런 변경은 선택적인 통합으로 언급되는 기술에 의해 발생되었다. 앞선 과정들이 도 1에 상세히 포함되어 있으며, 본 문서에서는 이 도를 참조하여 각각 설명한다. 변형 EBV/F인자 플라스미드의 명칭은 p2083이다.

F인자 내로 클론된 게놈 EBV DNA를 유전적으로 변형하기 위해 다른 방법을 이용할 수 있으며, 이를 이하에서 설명한다. 재조합에 적용하기 위한 어떤 항생내성마커 및 서열도 사용할 수 있다.

TR마이너스 EBV/F인자 플라스미드 p2083을 E.coli에서 분리하여 종래의 DNA트랜스펙션기술을 이용하여 인체 293세포계 내로 이동시켰다. 이 TR마이너스 EBV/F인자 플라스미드는 진핵선택마커 하이그로마이신 포스포트랜스퍼아제에 대한 유전자를 포함하고 있다. 이 트랜스펙션 된 293세포들을 적절한 하이그로마이신 농도로 선택하였다. 단일 세포클론들로 이들의 특성들의 기능적 분석을 행하였다.

2. 헬퍼바이러스 없이 패키징하는 세포계의 특성

도 2에 도시하듯이 종래의 DNA클로닝법을 사용하여 플라스미드로서 바이러스유전자벡터 p2186.31을 만들었다. 이 플라스미드는 TR마이너스 EBV/F인자 플라스미드를 운반하는 293세포들의 패키징기능의 특징을 지닌 리포터 플라스미드로서 작용한다. 상기 TR패키징서열 및 용해 복제기점 OriLyt 이외에, 바이러스유전자벡터는 수용체 세포에서 유전자벡터의 염색체외 복제에 필수적인 다른 바이러스서열들도 포함한다. 이러한 서열들은 플라스미드의 복제기점, oriP와 EBNA1유전자 이다(도 2). 더욱이, 유전자벡터들은 "그린형광단백질"에 대한 유전자와 하이그로마이신에 대한 내성을 나타내는 유전자를 품고 있다. 이 바이러스유전자 벡터는 도 3에 도시하듯이 일시적인 방식으로 이러한 세포들 내로 도입되고, 동시에, 상술한 것과 같이 BZLF1 바이러스유전자에 대한 발현플라스미드를 사용하여 EBV의 용해사이클이 유도된다(Hammerschmidt과 Sugden, 1989). 이러한 세포들의 상층액은 EBV캡시드 내로 패키지 되는 유전자벡터를 포함한다. 이 유전자벡터 농도의 분석 및 측정은 EBV수용체를 지닌 적절한 세포들, 예를 들어 Raji세포들의 감염에 의해 수행된다. 유전자벡터 p2186.31를 지닌 Raji세포들의 성공적인 감염은, 이 유전자벡터로 감염된 세포들이 UV광 하에서 광현미경으로 조사했을 때 녹색을 나타내기 때문에, "그린형광단백질"의 형광성에 의해 간단하게 결정될 수 있다.

또한, 유전자벡터DNA p2186.31의 성공적인 이동은 감염된 Raji세포들을 하이그로마이신으로 선택하는 것에 의해 결정할 수 있다. 이어서 하이그로마이신-내성 Raji세포들을 써던블롯팅과 적절하게 방사선 표지된 DNA프로브를 사용하여 DNA분석하는 것에 의해, 손상되지 않은 유전자벡터DNA의 존재와 TR마이너스 EBV/F인자 플라스미드 또는 그 일부분의 부재를 확인한다.

또, 바이러스유전자 벡터로서, oriP 및 EBNA1분절이 부족하거나 또는 "그린형광단백질" GFP에 대한 유전자 대신에 하나 이상의 치료학상 흥미있는 유전자들을 운반하는 플라스미드가 사용될 수 있다. 덧붙여, 하이그로마이신 포스포트랜스퍼아제 선택마커를 선택적으로 생략하거나 또는 다른 유전자에 의해 대체할 수 있다.

또, 바이러스유전자 벡터로서, oriLyt, TR, EBNA1 및 oriP에 대한 바이러스서열 외에 인체 B세포들의 불멸화에 필요한 다른 유전자들을 포함하는 미니 EBV플라스미드가 사용할 수 있다. 이러한 미니 EBV플라스미드들의 특성은 본 문서에 의해 설명되어져 있으며, 일 예로서 도 4에 도시되어 있다(Hammerschmidt과 Sugden, 1989; Kempkes등, 1995a; Kempkes등, 1995b). 이 미니 EBV플라스미드는 일시적 또는 안정한 형태로 패키징 세포계 내로 도입될 수 있으며, EBV용해사이클이 유도되고, 세포상층액이 패키징된 미니 EBV플라스미드들에 대해 조사되었다. 이 상층액은 인체의 일차 B림프구를 감염시키기 위해 사용되며, 그리고 나서 불멸화된 영구적으로 분화하는 B세포계로서 성장한다. 모든 B세포계들은 하나 이상의 미니 EBV 플라스미드 복사체를 포함하나 TR마이너스 EBV/F인자 플라스미드 또는 이들의 일부분이 부족하다.

3. 특정 세포들 내로의 형질도입을 위한 유전자벡터

유전자벡터들은 상응하는 헬퍼바이러스들에 의해 정상적으로 감염된 세포들 내에 유전자들을 운반한다. 헬퍼세포계들에 의해 소위 세포트로피즘에 영향을 줄 수 있다. 어떤 세포들(EBV의 경우에는 당연히 B세포와 일부 상피세포들임)의 감염에 책임이 있는 헤르페스바이러스들의 당단백질들은, E.coli에서 F인자 내로 클론된 EBV게놈들을 돌연변이 시키는 것에 의해 변경되거나 또는 다른 것에 의해 치환될 수 있다. 확장된 세포트로피즘의 일 예가 수포성 구내염 바이러스 당단백질 G이며, 거의 독점적으로 다능성 혈구모세포에 대한 극단적으로 특이한 세포트로피즘의 일 예는 간세포상의 간세포인자 수용체의 리간드, 막-결합 간세포 인자 리간드(mSCF리간드)이다. 이 공정을 슈도-타입이라 칭하고, 특히 헤르페스바이러스 벡터들의 경우에 눈에 띈다. 헤르페스바이러스에서, 감염에 중요한 당단백질이 핵막에서 유래한 인지질막에 파묻혀있다. 이 막은 본질적으로 구조를 형성하지 않고, 비리온의 엄격한 기학학적 캡시드를 단지 느슨하게 캡슐화 한다. 캡시드가 없는 바이러스들(예를 들어, 아데노바이러스들, 아데노-관련 바이러스(AAV)) 또는 다른 포막된(encapsidation) 바이러스들(예를 들어, 레트로바이러스들)과 대조적으로, 헤르페스바이러스들 및 다른 큰 DNA바이러스들의 캡시드는 유연하고, 바이러스 돌연변이 및 조합을 방해할 수도 있는 특정한 구조, 단백질구조나 접힘은 요구하지 않는다. 이것은 유전자벡터들에 다른 당단백질과 이들의 세포트로피즘에 대해서 새로운 특성들을 제공하는데 필요불가결한 것이다.

EBV의 경우, 두 개의 당단백질들이 세포들의 감염에 중요하다고 생각된다. gp350/220 당단백질은 바이러스입자들이 세포 수용체에 흡착하는데 중요하다(Moore등, 1987; Nemerow등, 1989). 이 수용체는 CD21이라 칭한다. 이 바이러스 당단백질인 gp85는 세포의 원형질막과 헤르페스바이러스 캡시드의 융합에 관여되어 있다. 이 세포상의 카운터-수용체는 MHC부류Ⅲ로 보여진다. 세포를 타깃하는 데는 주로 gp350/220이 중요하다.

우리들은 헤르페스바이러스 유전자벡터들의 세로트로피즘의 변경을 위해 2가지의 방법들을 사용하였다. 양 방법들은 바이러스유전자 벡터들의 패키징 동안 헬퍼세포에서 다른 특징들을 지니는 당단백질들의 발현에 기초한다. 이 당단백질들은, 이 당단백질들의 특정 단백질도메인에 의해 보장되는, 유전자벡터들의 캡시드 내로 통합되는 특성을 지녀야만 한다. 한편, 다른 세포트로피즘을 지닌 당단백질들의 발현은, 헬퍼세포에서 용해사이클의 유도를 동시에 수행할 수 있는 발현플라스미드의 트랜스펙션에 의해 일시적으로 이루어질 수도 있다. 한편, 다른 세포트로피즘을 지닌 당단백질들의 유전자들은 헬퍼바이러스게놈 또는 유전자벡터들의 패키징 동안 이용될 수 있는 헬퍼바이러스게놈 또는 세포염색체 내로 통합될 수 있다. 이들 양 방법들은 비슷한 결과를 이끌어낸다. 헬퍼바이러스게놈상에서 기능적으로 비슷한 EBV의 gp350/220당단백질은 결실될 수 있으나, 반드시 결실되지는 않는다.

종래기술에 비교되는 이점

상술한 방법은 헤르페스바이러스 캡시드 내로 패키지 되는 유전자벡터들의 제조를 가능하게 한다. 이 방법은 유전자벡터의 패키지 동안 어떤 헬퍼바이러스들을 해리하지 않는 헬퍼세포계를 사용한다는데 이점이 있다. 지금까지는, 아데노바이러스들(36kbp) 보다 큰 게놈들을 지닌 바이러스들로 이 방법들을 이용하는 것은 불가능하였다. 본 발명이 모든 큰 DNA바이러스들 및 거기서 유래한 헬퍼세포계들(예를 들어, 폭스바이러스들, 이리디오바이러스들, 바큐로바이러스들 및 다른 헤르페스바이러스들)로 확장할 수 있을 것으로 확실하게 기대된다. 이러한 헬퍼세포계들의 제조는, 바이러스분절들의 타깃변경을 가능하게 하기 위해, 다른 유기체, 예를 들어 E.coli내로 이런 바이러스게놈들을 클로닝 할 것이 요구된다. 이런 방식으로 제조된 바이러스게놈들은, 헬퍼바이러스들이 해리되지 않으면서, 바이러스유전자벡터들의 증폭 및 패키징을 위한 모든 바이러스유전자 산물들을 생산할 수 있는 특성들을 나타낸다. 이러한 유전자벡터들은 또한 정상적으로 헬퍼바이러스들에 의해 감염되지 않거나 단지 비효율적으로 감염되는 세포형태(들) 만을 감염하기 위해 새로운 특성들을 나타낸다. 이런 세포트로피즘의 선택은 유전자치료에 있어서 유전자벡터들의 사용에 중요한 필수조건이다. 치료학상 흥미있는 유전자들의 벡터-중재 형질도입이 어떤 세포들이 아니라 미리 결정한 세포들 내에서만 발생되는 것이 보장되어야만 한다.

다음으로, 또한 생각될 수 있는 실시예들의 용도들을 제시한다.

·"그린형광단백질"의 유전자 대신에 하나 이상의 유전자들을 운반하는 헤르페스바이러스 유전자벡터들을 인체의 유전자 치료를 위해 사용할 수 있다. 치료학적 유전자들은 수용체 세포 또는 전체적인 유기체에 새로운 특징들을 전달하는 것들일 수 있다. 이러한 유전자들은 유전적 질병들(예를 들어, ADA, 탈라세미아. 리소솜성 축적병, 응고 인자ⅤIII 등)을 고치기 위해 작용한다.

·면역을 위한 유전자벡터들(예를 들어, B 및 T세포 림포종에 대한 세포 항발암성 백신 등)에 의해 형질전환된 세포들을 적용하는데 특정 항원의 발현을 사용할 수 있다.

·유전자벡터들은 만성관절통과 다른 질병들에서 국소적으로 민감한 방식으로 사용될 수 있는 특징들(항염증 사이토킨 등)을 지닌 하나 이상의 사이토킨 또는 다른 신호 중재자들을 포함할 수 있다.

이미 상술했듯이, 본 발명의 필수적인 실용가능성은 DNA헬퍼바이러스 벡터DNA를 제공하는 가능성이다. 이하에서, 100kbp 이상의 DNA바이러스게놈을 포함하는 본 형태의 헬퍼바이러스 벡터의 제조를 보다 상세히 설명한다.

지금까지는, 100kbp이상 되는 DNA바이러스들의 유전자, 예를 들어 EBV의 유전자들을 높은 효율로 변경 또는 결실하는 것은 불가능하였다. 그래서, E.coli에서 클론된 EBV분절과 잠복방식으로 감염된 세포계에 존재하는 내인성 EBV(endogenous EBV)와의 상동재조합은 부정확하며, 제어하기 어렵고, 동시-트랜스펙션된 마커분절이나 선택 가능한 유전자들에 의해 검출할 수 있게 만들어야만 한다. 종래의 기술에서, 이러한 접근은 보편적으로 적용할 수 없고 느리며, 그리고, 감염된 세포에서 EBV바이러스의 잠복단계를 유지할 필요가 있기 때문에 EBV의 100kbp이상의 DNA바이러스들의 유전자 또는 유전자분절들을 변경할 수 없다.

그래서, 기능단위 형태로 100kbp이상의 크기를 가지는 바이러스들의 전체 DNA바이러스게놈을 클로닝하는 것에 의해 종래의 단점들을 극복하였다. 제조합분자로서, 예를 들어, E.coli에서 클로닝의 필수조건은, 소위 원핵유전자 분절을 완전한 DNA바이러스게놈 내로 통합할 수 있는 능력이다. E.coli에 대한 복제기능과 선택마커를 함유하는 이 분절의 통합에 의해, 100kbp이상의 크기를 가진 상기 재조합분자를 예를 들어 E.coli내로 감염시킬 수 있고, 그곳에서 안정하게 복제될 수 있게 한다. 또한, 이것이, 예를 들어 E.coli에서 어떤 DNA바이러스 분절의 변형을 종래의 재조합 DNA기술수단에 의해 가능하게 한다.

다음으로, 본 발명의 방법을, 예로서, 헤르페스바이러스, 즉, EBV과 관련하여 설명한다.

상술한 방법은 E.coli에서 클론으로서 증폭될 수 있는 재조합 헤르페스바이러스게놈들의 제조를 가능하게 한다. 이를 확실하게 완성하는 것에 의해, 본 방법을 모든 큰 DNA바이러스들(예를 들어 폭스바이러스, 이리디오 바이러스, 다른 헤르페스바이러스, 바큐로바이러스)에 적용할 수 있을 것이다. 이러한 바이러스게놈들을, 예를 들어 E.coli에서 클로닝하는 것에 의해, 바이러스유전자들의 사이트-디렉티드 변경(site-directed alteration), 흥미 있는 다른 유전자들의 결실 또는 부가에 의한 간단한 변형을 가능하게 한다. 그 결과, 바이러스게놈들은, 예를 들어, 바이러스들의 해당 표적세포들에서 외래단백질들의 발현을 가능하게 하는 유전적 변형에 따라서 새로운 특징들을 가질 것이다.

예를 들어 E.coli에서 클론된 바이러스게놈들은, 재조합 플라스미드 또는 서브게놈 바이러스 분절들의 포막화에 적절한 것과 같은, 바이러스 입자들의 제조에 유용한 산물을 제시한다.

본 방법은, 원핵세포 및 진핵세포에서 복제 가능한 DNA바이러스 벡터들의 제조에 유용하고, 다음:

a) 100kbp이상의 DNA바이러스게놈을 진핵의 타깃세포 내로 도입해서, 적어도 염색체외의 형태로 이 바이러스 DNA게놈을 함유하는 세포들을 확립하는 단계;

b) 상기 진핵표적세포 내로, 실시 가능하게 서로 연결되어 있고, 원핵세포에서 바이러스 DNA게놈의 복제에 대한 정보 및 원핵세포에서 선택 가능한 적어도 하나의 마커유전자를 적어도 포함하며, 재조합을 가능하게 하는 길이를 가진 상기 DNA바이러스게놈의 DNA분절들(상동분절들)이 측면에 위치되어 있는, DNA분절을 도입하는 단계;

c) 상기 (b)에서 정의된 분절들을 재조합에 의해 상기 DNA바이러스게놈 내로 통합하는 단계와; 선택적으로

d) 염색체외의 재조합 바이러스 DNA게놈을 함유하는 이러한 표적세포들을 선택하는 단계; 및 선택적으로

e) 상기 재조합 DNA바이러스 벡터게놈을 정제하고 분리하는 단계를

적어도 포함한다.

본 방법은 지금까지 알려진 DNA바이러스 벡터들을 제조하기 위한 방법들과는, 특히, 먼저 100kbp이상의 크기를 가지는 DNA바이러스들로부터 이러한 벡터들을 제조할 수 있게 되었다는 점에서 다르다. 예를 들어, 지금까지 사용해온 방법에서는, 약 40kbp정도의 크기를 가진 아데노바이러스들과 같은 DNA바이러스들이 클론되었다. 100kbp이상, 특히 120kbp이상, 바람직하게 150kbp이상 또는 특히 바람직하게 170kbp이상의 크기를 가지는 DNA바이러스 벡터들의 제조는 종래에 알려진 방법으로는 불가능하였다.

본 방법은, 진핵세포 및 원핵세포에서 복재가능한 재조합 헤르페스바이러스 게놈들의 제조에 유용할 뿐만 아니라, 예를 들어, 재조합 폭스바이러스 또는 이리디오바이러스 또는 바큐로바이러스 게놈들의 제조에도 유용하다.

이 헤르페스바이러스는 알파 헤르페스바이러스, 베타 헤르페스바이러스 또는 감마 헤르페스바이러스 이여도 좋다. 이러한 바이러스들 중에서, 알파 헤르페스바이러스: 헤르페스심플렉스바이러스(herpes simplex virus: HSV), 배리셀라조스터바이러스(varicella zoster virus: VZV); 베타 헤르페스바이러스: 사이토메가로바이러스(cytomegalovirusCMV); 감마 헤르페스바이러스: 엡스타인-바 바이러스(EBV)를 예로 들 수 있다.

DNA바이러스를 진핵표적세포 내로 도입하는 것은 알려진 방법들에 의해 달성할 수도 있으며; 이러한 방법들 중에서, 감염, 트랜스픽션, 또는 일렉트로포레이션(electroporation)을 예로 들 수 있다. 동일한 방법을 단계 (b)에서 진력표적세포내로 DNA분절을 도입하는데 적용한다.

상기 DNA바이러스를 진핵표적세포 내로 도입하는 단계 (a)의 변형으로서, 이러한 세포들이 염색체외의 형태로 DNA바이러스를 미리 함유하고 있을 수 있다.

본 발명에 따른 표적세포(target cell)란, 바이러스 수용체들을 지니는 어떤 세포를 의미하며, 이런 바이러스는 복제 할 수 있다.

또한, DNA바이러스 외에, 원핵세포에서 바이러스게놈의 복제를 위한 정보와, 원핵세포에서 선택될 수 있는 마커유전자를 적어도 포함하는 DNA분절이 진력표적세포 내로 도입된다. 이러한 유전자분절들은 상기 DNA바이러스와 재조합 할 수 있는 길이를 가진 DNA분절들이 측면에 위치하게 된다. 이 측면 DNA분절들은 재조합, 특히 상동재조합이 가능한 DNA바이러스와 상동성을 가진다. 이 측면 DNA서열들의 길이는, 바람직하게 300bp이상이며, 더욱 바람직하게는 1kbp이상이고, 특히 2kbp이상이 바람직하다.

바람직하게, 단계 (b)에서 설명한 분절들의 DNA바이러스게놈 내로의 통합은 DNA바이러스 표적세포에서 상동재조합에 의해 수행된다. 그러나, 불합리한 재조합이 바람직한 결과를 이끌 가능성도 또한 있다. 그러나, 정상적으로는, 상동재조합이 재조합 DNA바이러스게놈을 달성하기 위해 사용된다.

단계 (b)에서의 DNA분절은 진핵표적세포 내로 도입되기 전에 선형화 될 수 있다. 이 방식에서는, 그 말단이 내인성 뉴클리아제에 의해 분해되는 것을 방지할 수 있을 것이다.

본 발명의 바람직한 실시형태에서는, 바이러스 DNA게놈의 복제를 위한 정보가 원핵생물 내에 위치할 것이며, 원핵세포에서 선택 가능한 마커유전자에 대한 정보는 E.coli F플라스미드 상에 있을 것이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 실시형태에서는, 단계 (b)의 DNA분절이 진핵세포에서 선택 가능한 적어도 하나의 마커유전자를 부가적으로 포함할 것이다. 선택 가능한 마커로서는, 원핵세포 또는 진핵 세포에서 각각 선택할 수 있는 어떤 마커들이 사용될 수 있다. 이러한 마커들의 예로서, 특히, 항생내성유전자 및 형광마커유전자들이 있다.

약 5kbp의 F인자-유래의 플라스미드는 다음의 분절들을 포함하며, 그 안에서 자연적으로 발생하는 형태인 E.coli F인자 플라스미드의 유전자들은 약 100kbp: 약 1∼2복제/E.coli세포의 복제수를 유지하기 위한 필수적인 유전자 parA 및 parB, DNA복제를 위해 필요한 oriS 및 유전자 repE를 형성한다. 모든 이러한 요소들은 예를 들어 EBV/F인자 구조의 발생을 위해 사용되는 F인자 플라스미드 상에 존재한다.

본 발명의 다른 실시형태에서는, 단계 (b)의 공정에서의 DNA분절이, 예를 들어 혈액응고 캐스케이드의 단백질, 예를 들어, 인자 VⅢ유전자를 코딩하는 하나의 흥미로운 유전자를 적어도 포함한다. 지금까지 알려진 유전자들은 DNA분절 상에 위치할 것이며, 본 발명의 방법에 의해 DNA바이러스 셔틀벡터 내로 도입될 수 있다. 이 방법에서는, 진핵세포 또는 원핵세포에서 흥미 있는 유전자를 발현할 수 있을 것이다.

본 방법은 100kbp이상의 크기를 가진 완전한 DNA바이러스게놈들의 클로닝을 가능하게 한다. 특히 바람직한 예는, 약 170kbp의 크기를 가지는 EBV게놈이다.

일 실시형태에서, 단계 (b)에서의 상동영역은 돌연변이를 바이러스 게놈 내로 도입하기 위한 방식으로 선택된다. 본 발명에 따른 돌연변이란, 점 돌연변이, 수개의 뉴클레오티드에 영향을 주는 돌연변이, 뉴클레오티드의 결실, 부가 또는 교환을 의미한다. 또한, 뉴클레오티드의 부가는 예를 들어 흥미로운 유전자, 주로 치료학상 의미가 있는 유전자를 코딩하는 하나 이상의 유전자들을 도입하는 것을 포함한다.

본 방법의 일 실시형태에 있어서, 공정단계 (b)의 측면영역들(flanking regions)은 헤르페스바이러스 게놈에서 말단반복을 결실하기 위해 선택된다. DNA 바이러스게놈과의 재조합에 이어서, 패키징이 부족한 바이러스게놈이 발생되며, 이어서, 표적세포에서 EBV의 용해단계의 유도에 의해, 동시에, 그러나, 모든 바이러스 단백질들 및 DNA분자들을 패키징하는 기능들이 자동으로 이용되면서, 비감염성 입자들이 해리될 것이다.

또 다른 실시형태에서는, 상기 획득된 재조합 DNA바이러스 벡터게놈이 또 다른 공정단계들에서 돌연변이될 것이다. '돌연변이'의 정의는 본 발명에 따라 이미 상기에서 정의하였다. 돌연변이들의 도입은, 상술한 것과 같은 방법 또는 DNA바이러스 벡터 게놈을 원핵세포 또는 또 다른 진핵세포 내로 도입하고 이러한 세포들에서 돌연변이들을 도입하는 것, 예를 들어 또 다른 재조합에 의해 영향을 받을 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시형태에서는, 돌연변이가 바이러스 DNA게놈의 패키지를 변경하는 곳의 바이러스 DNA게놈에서의 하나 이상의 시스-활성 분절에, 돌연변이가 도입된다.

본 발명에 의해 특히 바람직한 본 발명의 일 실시형태에서는, 단계 (b)에서 DNA분절의 원핵부분은, 상동재조합을 가능하게 하는 길이를 가지며 서로 적어도 부분적 상동성을 가진 서열이 선택되어서, 단계 (b)의 DNA분절의 원핵부분이 제거된다. 이런 상동재조합에 의해, 본 발명의 방법에 의해 도입된 원핵부분이 이어지는 공정단계들에서 제거된다. 이 방법에서는, 예를 들어 DNA분절의 도입에 의해 진핵 표적세포 내로 도입된 항생내성 및 다른 원핵부분은 제거되어서, 원핵 외래서열의 비가 가능한 한 낮은 유전자 치료에 유용한 DNA바이러스 벡터를 발생할 것이다. 이런 예를 실시예에서 보다 상세히 설명한다.

또한, 본 발명에 따라서, 서로 작동 가능하게 연결된, 적어도 100kbp이상의 DNA바이러스게놈, 적어도 원핵세포에서 선택 가능한 마커유전자 및 원핵세포에서 바이러스 DNA게놈의 복제에 대한 정보를 포함하는 DNA바이러스 벡터가 제공된다.

잠복방식으로 2개의 다른 EBV종(B95.8 및 P3HR1/HH514)으로 감염된 2개의 다른 세포계 내로, 복제를 위한 기능과 E.coli에서 선택 가능한 마커를 포함하는 E.coli 플라스미드 F인자의 분절을 도입하였다. F인자분절이 2번의 상동재조합을 통해 상기 세포계에서 내인성 EBV게놈에 대해 타깃이 될 수 있도록, F인자 플라스미드의 선형영역의 각 오른쪽 및 외측에 EBV영역들이 위치되었다. 이 측면 EBV영역들에 부가해서, 이 DNA단편은 진핵세포에서 선택(예를 들어 하이그로마이신 포스포트랜스퍼아제) 또는 표현형 특성(예를 들어 그린형광단백질, GFP)을 위한 적절한 마커유전자를 적어도 포함한다. 이런 구조가, 내인성 EBV게놈과 상동재조합이 일어나고 마커유전자와 함께 F인자분절의 사이트-디렉티드 통합이 일어나는 곳의 EBV-감염 세포 내로 트랜스펙션 된다. 그 후에, 이렇게 변형된 세포계들이 셔틀시스템에서 E.coli내로 이동될 수 있는 재조합 EBV게놈을 품고 있게 된다. 이 재조합 EBV게놈은 원핵선택마커를 운반하는 F인자부분을 통해서 E.coli에서 복재할 것이다. 재조합 EBV게놈의 다른 유전적 변경은 E.coli에서 종래의 유전학적 기술을 사용해서 실시될 수도 있다.

재조합 EBV게놈은 E.coli로부터 분리될 수 있으며, DNA분자는 종래의 기술을 사용해서 제조될 수 있다. 그리고 나서, 이러한 DNA분자들은 DNA운반기술에 의해 안전하게 또는 일시적으로 진핵세포 내로 도입된다. 이 재조합 EBV게놈들은 잠복방식으로 감염된 세포계 B95.8 및 P3HR1/HH514와 같은 세포들에서 염색체외로 복제할 것이다. 자발적으로 또는 연이은 화학적유도 또는 EBV의 용해단계에 의해 영향을 받는 유도에 의해, 세포배지 상층액 내로 해리 되어서 다른 용도로 이용될 수 있는, 재조합 엡스타인-바 비리온들의 합성이 일어날 것이다.

제조방법

상술한 방법을 사용해서, F인자분절이, 작용기 F인자성분에 부가해서 진핵선택마커 하이그로마이신 포스포트랜스퍼아제 및 표현형 마커유전자 GFP를 포함하는 B95.8 바이러스게놈 내로 도입된다. 재조합 B95.8게놈을 발생해서, E.coli내로 이동시켜서, 재조합 EBV DNA를 E.coli로부터 제조하였다. 이 DNA가 여러 개의 EBV-음성 세포들(293, EBV-음성 아카타, 신경세포)내로 도입되었다. 용해사이클을 유도한 결과, 유전정보로서 재조합 EBV게놈을 포함하는 감염 비리온들이 해리 되었다. 이러한 재조합 EBV게놈들은 예를 들어 1차 인체 B림포사이트를 불멸화 할 수 있다.

2개의 다른 실험에서, 2개의 다른 F인자 분절들이 2개의 다른 게놈 위치 내에서 P3HR1/HH514 바이러스게놈 내로 도입되었다. 이러한 게놈위치에 대한 대상선정은 다른 EBV측면영역들을 사용해서 수행하였다. 제 1실험에서, 또 다른 EBV유전자를 도입하였으며, 제 2실험에서 EBV측면영역을 선택하는 것에 의해 EBV영역의 사이트-디렉티드 결실을 행하였다.

P3HR1/HH514 바이러스게놈들 및 재조합 B95.8을, 결실 혹은 새로운 유전자들을 도입하는 것에 의해 E.coli에서 더 변형하였다.

실시예

1. B95.9종의 전 작용 게놈의 클로닝

p1944.12(표 1)로 언급되는 F인자 플라스미드를 종래의 DNA클로닝법을 사용해서 E.coli에서 생성되었다. 도 5에 모식적으로 도시하듯이, 이 플라스미드는 B95.8게놈의 서브게놈영역들을 나타내는 2개의 영역 A 및 B를 포함한다. 이런 분절들의 뉴클레오티드 서열좌표를 표 1에 나타낸다. 이 영역 A 및 B는 선택 가능한 원핵 마커유전자 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼아제(cam)와 함께 F인자의 원핵 복제기점을 포함하는 pMBO131 리플리콘(O'Connor등, 1989)의 측면에 위치한다. 또한, SV40 초기 프로모터/인헨서에 의해 발현되는 진핵마커유전자 하이그로마이신 포스포트랜스퍼아제(Hyg)와 인체의 사이토메가로바이러스의 즉각적인 초기 프로모터/인헨서의 마커유전자 그린형광단백질(GFP)이 플라스미드 p1944.12에 포함되어 있다(표 1 및 도 5). 작용에 중요한 p1944.12 플라스미드 부분은 EBV분절들이며, pMBO131부분 및 Hyg, GFP유전자들은 선택적이다.

p1944.12상의 B95.8게놈의 영역들 A 및 B가 선택되어져서, B95.8게놈에서의 자연적 결실의 왼쪽 및 오른쪽 측면에 부착된다. 이 플라스미드를 B95.8게놈 내로 도입하기 위해, 이것을 NotI제한효소로 선형화하고, 유리 DNA말단을 T4 DNA리가아제를 사용해서 소위 헤어핀 올리고뉴클레오티드에 의해 봉지해서, 엑소뉴클리아제로부터 보호한다. 이렇게 변형된 플라스미드 DNA를 일렉트로포레이션에 의해 B95.8세포 내로 트랜스펙션 시켜서, 그 세포들을 100㎍/㎖의 하이그로마이신의 존재 하에서 선택하였다. 이런 선택조건 하에서는, 단지 p1944.12 DNA를 숙주세포의 게놈 또는 B95.8 EBV종의 염색체외의 게놈 복제물 내로 취해서 통합하고 있는 세포만이 생존한다. 이러한 2개의 가능성들간을 구별하기 위해, 단일세포 클론들을 가델라 아가로즈 겔(Gardella agarose)과 이어서 써던블롯 하이브리다이제이션에 의해 조사하였다. 이러한 분석법들에 의해, B95.8 EBV주의 게놈 복제물 내로 p1944.12가 통합되어 있는 수많은 세포 클론들을 확인할 수 있었다.

E.coli에서 유전적으로 변경된 이러한 EBV게놈들을 클로닝하기 위해, 플라스미드 DNA를 세포클론에서 분리하여, 일렉트로포레이션법을 사용하여 E.coli주 DH10B 내로 이동시키고, 클로람페니콜 내성에 의해 선택하였다. 이어서 E.coli로부터 플라스미드DNA를 분리하여, DNA를 제조하였으며, 이어서, 여러 개의 제한효소로 분해한 DNA단편은 통합된 p1944.12부분을 포함하는 B98.8 DNA의 조성과 정확하게 대응하였다. 이러한 EBV게놈들의 총 크기는 170kbp이상이었으며, 2010으로 칭하였다.

2010 DNA는 E.coli로부터 마이크로그램의 크기로 분리되었으며, 여러 개의 DNA트랜스펙션법을 통해 EBV-음성 진핵세포 내로 도입되었다. 이러한 세포들은 예를 들어 EBV음성 아카타 세포, 293세포 및 섬유아세포들 또는 세포계일 수 있다. 이러한 세포들은 상기 세포들 내로의 2010 DNA의 안정한 도입을 보장하기 위해 조절된 하이그로마이신 농도 하에서 선택되어졌다. 이 EBV 용해단계는 BZLF1 발현플라스미드 pCMV-BZLF1의 트랜스펙션에 의한 것과 같은, 여러 기술들에 의해 유도되였다(Hammerschmidt 및 Sugden, 1988). 이러한 세포들에서 EBV 용해단계를 유도한 결과, 1차 인체 B림프구를 불멸화할 수 있는 감열성 바이러스들이 해리된다. 이러한 2010 EBV의 특성을 검출하기 위해, 용해적으로 유도된 세포로부터의 세포-유리 상층액을 획득해서 1차 인체 B림프구들을 감염하기 위해 사용하였다. 이러한 세포들의 감염 후 4∼6주일 후에, 다른 기술들(써던블롯 하이브리다이제이션, PCR분석)을 통해 증명되었듯이, 2010 EBV DNA를 포함하는 영구적으로 분화하는 세포계를 확립할 수 있었다.

2. E.coli에서 패키징이 부족한 P3HR1/HH514 게놈의 클로닝

p2061.2(표 1)로 불리는 F인자 플라스미드를 종래의 DNA클로닝법을 사용해서 E.coli에서 발생하였다. 도 6에 모식적으로 도시하듯이, 이 플라스미드는 P3HR1/HH514 게놈의 서브게놈 영역들을 나타내는 2개의 영역 A 및 B를 포함한다. 이런 분절들의 뉴클레오티드 서열의 좌표는 표 1에 나타낸다. 이 영역 A 및 B는 선택 가능한 원핵 마커유전자 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼아제(cam)와 함께 F인자의 원핵 복제기점을 포함하는 pMBO131 리플리콘(O'Connor등, 1989)의 측면에 위치한다. 또한, SV40 초기 프로모터/인헨서에 의해 발현되는 진핵마커유전자 하이그로마이신 포스포트랜스퍼아제(Hyg)가 플라스미드 p2061.2에 포함되어 있다(표 1 및 도 6). 작용에 중요한 p2061.2 플라스미드 부분들은 EBV분절들, pMBO131/F 인자 부분 및 Hyg유전자 이다.

p2061.2의 P3HR1/HH514 게놈의 영역 A 및 B가 선택되어져서, P3HR1/HH514 게놈에서 "말단반복"의 왼쪽 및 오른쪽 측면에 위치된다. 이 "말단반복(TR)"은, 바이러스 게놈 DNA을 EBV캡시드 내로 패키징 하는데 필요한 신호서열을 포함하는 것에 특징이 있다. p2061.2를 구성하는 목적은, TR신호서열들을 결실해서, 이것을 p2061.2의 pMBO131 및 Hyg부분들로 대체하는데 있다. p2061.2를 P3HR1/HH514 게놈 내로 도입하기 위해, 이를 SacI제한효소로 선형화하고, 유리 DNA말단을 엑소뉴클리아제로부터 보호하기 위해, T4 DNA리가아제를 사용하는 소위 헤어핀 올리고뉴클레오티드에 의해 봉지하였다. 이렇게 변형된 플라스미드DNA를 일렉트로포레이션에 의해 P3HR1/HH514 세포들 내로 이동시키고, 그 세포들을 200㎍/㎖의 하이그로마이신의 존재 하에서 선택하였다. 이러한 선택 조건들 하에서는, 단지 p2061.2 DNA를 숙주세포 게놈 또는 P3HR1/HH514 EBV주의 염색체외의 게놈 복사물들 내로 취해서 통합하고 있는 세포들만이 생존한다. 이런 두 가지 가능성들간을 구별하기 위해, 단일의 세포클론들을, 가델라 아가로즈 겔과 이어서 써던블롯 하이브리다이제이션에 의해 조사하였다. 이러한 분석들에 의해, P3HR1/HH514 EBV종의 게놈 복사물 내로 p2061.2가 통합된 많은 세포 클론들을 식별할 수 있었다.

이렇게 E.coli에서 유전적으로 변형된 EBV게놈들을 클로닝 하기 위해, 플라스미드 DNA를 세포 클론들에서 분리하고, 이를 일렉트로포레이션법을 사용해서 E.coli주 DH10B 내로 이동시켜서, 클로람페니콜 내성에 의해 선택하였다. 이어서 플라스미드 DNA를 E.coli로부터 분리해서 DNA를 제조하고, 이것을 여러 개의 제한효소들로 분해한 결과, DNA단편들은 TR신호서열들은 없으나 통합된 p2061.2부분을 포함하는, P3HR1/HH514 게놈 DNA의 조성과 정확하게 대응하였다. 이러한 EBV게놈들의 총 크기는 170 kbp이상이며, 2087.2a로 칭하였다.

2087.2a DNA는 마이크로그램의 크기로 분리되었으며, 여러 개의 DNA트랜스펙션법들에 의해 EBV-음성 진핵세포 내로 도입되었다. 이러한 세포들은 예를 들면 EBV 음성 아카타 세포, 293세포들 및, 섬유아세포 또는 세포계들일 수 있다. 이러한 세포들은 세포들 내로 2087.2a DNA의 안정한 도입을 보장하기 위해 조절된 하이그로마이신 농도 하에서 선택되어졌다. EBV용해단계는 BZLF1 발현플라스미드 pCMV-BZLF1에 의한 트랜스펙션과 같은 여러 기술에 의해 유도되었다(Hammerschmidt 및 Sugden, 1988). 상술한 실시예 1과 비교하면, 이런 세포들에서의 EBV용해단계의 유도는, TR패키징신호의 부재에 기인해서 EBV 게놈DNA의 패키징이 일어나지 않기 때문에, 결과적으로 감염 바이러스들이 해리되지 않는다. 그러나, 이러한 세포계들은, 소위 헬퍼바이러스를 해리하지 않고, p554(Hammerschmidt 및 Sugden, 1988) 또는 미니 EBV플라스미드들(Kempkes, 1995a; Kempkes, 1995)의 포막에 필요한 것과 같이, DNA분자들을 패키징 하기 위한 모든 바이러스 기능들을 자동으로 제공한다(Hammerschmidt 및 Sugden, 1988).

3. E.coli에서 유전적 보강에 의한 P3HR1/HH514 게놈의 클로닝

p1820.15(표 1)로 불리는 F인자 플라스미드를 종래의 DNA클로닝법을 사용해서 E.coli에서 발생하였다. 도 7에 모식적으로 도시하듯이, 이 플라스미드는 B95.8 게놈의 서브게놈 영역들을 나타내는 2개의 영역 A 및 B를 포함한다. 이런 분절들의 뉴클레오티드 서열의 좌표는 표 1에 나타낸다. 이 영역 A 및 B는 선택 가능한 원핵 마커유전자 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼아제(cam)와 함께 F인자의 원핵 복제기점을 포함하는 pMBO131 리플리콘(O'Connor등, 1989)의 측면에 위치한다. 또한, 작용영역으로서, EBV유전자 EBNA2와 EBV유전자 EBNA-LP의 두 엑손들이 p1820.15플라스미드에 포함된다(Hammerschmidt 및 Sugden, 1989)(표 1 및 도 7). 작용에 중요한 p1820.15 플라스미드 부분들은 pMBO131부분뿐만 아니라, 측면 EBV분절들, 유전자 EBNA2 및 EBNA-LP유전자 부분들이다.

p1820.15상의 B95.8 게놈의 영역 A 및 B가 선택되어져서, P3HR1/HH514 게놈에서 2개의 EBNA-LP엑손들 및 전체적인 EBNA2유전자를 포함하는 결실의 왼쪽 및 오른쪽측에 위치한다. 이 플라스미드를 P3HR1/HH514 게놈 내로 도입하기 위해, 이를 NheI제한효소로 선형화해서, 유리 DNA말단을 엑소뉴클리아제로부터 보호하기 위해, T4 DNA 리가아제를 사용하여 소위 헤어핀 올리고뉴클레오티드에 의해 봉지하였다. 이렇게 변형된 플라스미드 DNA를, 이러한 세포들에서 EBV 용해사이클을 유도하는 발현플라스미드 pCMV-BZLF1과 함께 일렉트로포레이션에 의해 P3HR1/HH514 세포 내로 트랜스펙션 시켰다. 세포가 없는 배지의 상층액을 획득해서 1차 인체 B림프구를 감염하기 위해 사용하였다. 이러한 세포들의 감염 후 4-6주 후에, 영구적으로 분화하는 세포계들이 확립될 수 있다. 전체적인 EBNA2 유전자 및 EBNA-LP유전자의 2개의 엑손들을 포함하는 P3HR1/HH514에서의 결실이 B세포의 불멸화를 제거한다. p1820.15상의 상기 영역이, 상술한 것과 비슷하게 P3HR1/HH514 DNA와 p1820.15 DNA간의 상동재조합에 의해 P3HR1/HH514 바이러스게놈에서의 결실을 보충한다(Hammerschmidt 및 Sugden, 1989). 상동재조합 후의 EBV게놈들은, 1차 인체 B림프구를 불멸화할 수 있는 복귀된 능력에 의해 특징지어진다. p1820.15의 F인자 부분의 통합과 동시에, pMB0131 리플리콘을 재조합 EBV게놈의 구성성분으로 만든다.

이렇게 유전적으로 변경된 EBV게놈들을 E.coli에서 클로닝하기 위해, 세포 클론에서 플라스미드 DNA를 분리하고, 이를 일렉트로포레이션법을 사용해서 E.coli즈 DH10B 내로 이동시켜서, 클로람페니콜 내성에 의해 선택하였다. 이어서 플라스미드 DNA를 E.coli로부터 분리해서 DNA를 제조하고, 이것을 여러 개의 제한효소들로 분해한 결과, DNA단편들은 통합된 p1820.15부분을 포함하는, P3HR1/HH514 게놈 DNA의 조성과 정확하게 대응하였다. 이러한 EBV게놈들의 총 크기는 170kbp보다 컸으며, 1947(K클론)로 칭하였다.

4. 대립형질 교환에 의해 F인자 내로 클론된 게놈 EBV DNA내로의 돌연변이들의 도입

E.coli에서 게놈 EBV DNA의 클로닝이, 본 발명에 따른 특정 조건들에 대해서, 각각 확립되거나 적응되는 방법들에 의해 간단한 유전적 변형을 가능하게 한다.

클론된 EBV게놈 1947(표 1)에서 패키징신호들을 교환하는 것에 의해, 재조합 플라스미드 p2060.1을 다음의 구성성분들:

1. 예를 들어, pMB096 기재 상에서 온도에 민감한 복제기점(Tet 셔틀 플라스미드)과 원핵선택마커 테트라사이클린 내성을 지닌 원핵 벡터 플라스미드(O'Connor등, 1989),

2. P3HR1/HH514주의 EBV서열, 뉴클레오티드 위치 #165,840에서 #169.924(A) 및 #1에서 #3955(B)까지를 포함하는 측면영역들 A 및 B,

3. SV40 초기 프로모터/인헨서에 의해 발현되는 진핵선택마커 하이그로마이신 포스포트랜스퍼아제

로 구성되어 있는 E.coli에서 발생시켰다(도 8). 이런 유전자는 EBV부분들 A와 B사이에 위치하고, 도 8에서 "mut"로 표시한다.

F인자 플라스미드 1947(표 1)을 재조합 가능한 (recA+) E.coli주 내로 트랜스펙션 시키고, 이 트랜스펙션을 클로람페니콜 내성에 의해 확인한다. 두 번째 단계에서, Tet 셔틀플라스미드 p2060.1을 트랜스펙턴트 하버링 1947내로 트랜스펙션 시키고, 클로람페니콜 및 테트라사이클린에 대한 이중 내성에 대해서 이 박테리아를 30℃에서 선택한다. 양 플라스미드들이 동일한 E.coli 세포에서 서로 독립적으로 복제한다. A를 통한 상동재조합(이것은 B를 통해서도 가능함)이, 온도를 42℃까지 상승시키고, 클로람페니콜과 테트라사이클린에 대한 내성을 선택하는 것에 의해 행해지며, 이는 Tet 셔틀플라스미드 p2060.1이 상기 온도에서는 복제를 할 수 없기 때문이다. 도 8에 도시하듯이 동시-통합(co-integrate)이 발생한다. 또 다른 상동재조합에 의해, 이번에는 B를 통해, 동시-통합이 해결되며, Tet 셔틀플라스미드가 손실되어서, 돌연변이 "mut"(이 경우에는 하이그로마이신 포스포트랜스퍼아제)가 EBV서열 "wt"(이 경우는 패키징신호 TR)를 대체한다. 마지막 단계가, 통계학적 분포에 따라서, 즉, 돌연변이 "mut"가 도입되거나(도 8에 도시된 것) 또는 출발상태 "wt"가 복구되는 동시-통합의 해결동안 발생한다.

후술하는 실시예 5와 비교되는 본 방법의 이점은, 다른 외래서열들을 도입할 필요 없이, 타깃방식으로 클론된 EBV게놈에서 신호 뉴클레오티드까지도 교환할 가능성이 있다는 것이다.

5. 선택적인 통합에 의해 F인자 내로 클론된 게놈 EBV DNA에서의 돌연변이의 도입

F인자 내로 클론된 게놈 EBV DNA의 유전적 변형을 위한 제 2의 다른 방법은, 도 9에 모식적으로 도시하듯이, 상동재조합에 의해 선형 DNA단편들을 통합하는 것이다.

EBV유전자 LMP2A를 돌연변이 하기 위해, 도 9에 도시하듯이, 먼저 Kan셔틀단편을 공통 pBR-유래의 플라스미드 내로 클론한다. 플라스미드 p2120내의 Kan셔틀단편은, 뉴클레오티드 위치 #163,473∼#166,180(A) 및 #166,938∼#172,281/#1∼#649(B)의 B95.8주의 EBV서열들을 포함하는 2개의 EBV분절들 A 및 B를 포함한다. 도 9에 표시된 돌연변이 "mut"는 LMP2A EBV유전자(EBV 뉴클레오티드 위치 #166,181∼#166,937)의 엑손을 부착하고 있는 소위 2개의 loxP서열모티프들로 구성되어 있다. 이 2개의 loxP서열모티프 중 하나와 인접하여, FRT서열모티프에 의해 결합된 항생 카나마이신에 대해 내성을 가지는 선택마커가 클론되어 있다. 도 9에서 왼쪽 상측 상에 도시하듯이 단편들이 제한효소들에 의해 pBR부분과 분리되며, 선형의 Kan셔틀단편 DNA가 분리된다. F인자 내로 클론된 EBV게놈 2010과 함께 선형 DNA단편의 동시-트랜스펙션이, 바람직하게 엑소뉴클리아제 V-음성인; 예를 들어 E.coli종 BJ5183(Hanahan. 1983)인 E.coli종 내에서 행해진다. 클로람페니콜 및 카나마이신에 대한 내성에 대해서 트랜스펙션된 박테리아를 선택하는 것에 의해, 양 DNA분자들간의 상동재조합을 행하며, 이상적인 경우에, 도의 상측 오른쪽에 도시된 EBV F인자플라스미드가 된다. 이 카나마이신 내성유전자는 E.coli에서 FLP재조합효소에 의해 FRT를 통해 사이트-디렉티드 재조합에 의해 제거될 수 있다(Cherepanov 및 Wackernagel, 1995). 결과적으로, 돌연변이된 EBV F인자플라스미드가 발생된다. 상기 4에서 나타낸 상황과의 기본적인 차이점은, 외래서열, 즉, FRT서열모티프의 잔존이다.

사이트-디렉티드 재조합에 사용되는 항생내성마커들 및 서열들은 원하는 대로 선택할 수 있다. 이것은 4에서 상술한 접근방법에도 비슷하게 적용된다.

더욱이, 유전 라이브러리의 확립은, E.coli에서 트랜스포슨-중재의 돌연변이과정에 의해 제조될 수 있을 것으로 생각되며, 그래서 많은 수의 개개가 돌연변이된 EBV게놈들을 나타낼 수 있다. 클론된 EBV게놈들 내로 트랜스포슨을 랜덤하게 통합하는 것에 의해, 통합부분에서, 돌연변이과정, 예를 들어 EBV유전자의 리딩플레임의 파괴가 발생된다. 이런 형태의 EBV 게놈 라이브러리의 이점은, 어떤 표현형에 대해서 생물학적으로 선택할 수 있는 가능성이 있다는 것이다. 돌연변이된 헤르페스바이러스 게놈들을 포함하는 게놈 라이브러리는 예를 들어 항바이러스성 기질에 대한 스크리닝 시스템으로서 사용될 수 있다.

그래서, 본 발명에 따른 방법은 다음:

(f) 재조합 DNA바이러스 벡터게놈을 원핵세포 내로 도입하는 단계;

(g) 서로 작동 가능하게 연결되어져 있는, DNA바이러스 벡터 게놈 상의 상동서열과 비교되는 돌연변이를 포함하는 DNA서열과, DNA바이러스 벡터게놈과 재조합할 수 있는 충분한 길이의 DNA분절들이 측면에 부착되는 선택 가능한 마커유전자를 적어도 포함하는 플라스미드를 상기 원핵세포 내로 도입하는 단계;

(h) 상기 (g)에서 설명한 분절을 재조합에 의해 상기 DNA바이러스 게놈 내로 통합하는 단계;

(i) 상기 재조합 DNA벡터의 선택적인 정제 및 분리하는 단계

에 의해 더 변형될 수 있다.

또 다른 실시형태에서는, 상기 단계(g)에서의 플라스미드가, 재조합효소에 의해 인식될 수 있는 서열모티프를 더 포함하며; 단계 (e)전에, 재조합에 의해 도입된 내성유전자가 재조합효소에 의해 인식되는 서열모티프를 통해 사이트-디렉티드 재조합에 의해 제거된다.

E.coli에 클론된 헤르페스바이러스 게놈으로부터 원핵리플리콘 및 다른 외래부분을 제거한다.

이 유전자벡터들을 이용해서, 타깃세포 내로 도입된 유전정보 부분을 가능한 한 작게 유지하고, 필수적인 특징으로 한정하는 것이 바람직하다. 특히, 항생내성과 같은 원핵마커유전자를 보유하거나 그렇지 않으면 잠재적으로 안정 위험을 나타내는 서브게놈 분절들은, 이것들이 여러 개의 박테리아와 상동재조합을 할 수 있기 때문에, 바람직하지 않다. F인자 리플리콘을 이용해서 클론된 EBV게놈들은 하이브리드 분자 등이다. 이 F인자 부분은 E.coli에서 DNA분자의 분화에 필수적이나, E.coli에서 변형된 EBV/F인자 리플리콘이 유전적으로 변형된 EBV를 제조하기 위해 도입되는 진핵세포에서는 완전하게 비기능적이다.

놀랍게도, 더 많은 유전적 조작 없이 이 F인자부분의 완전한 제거를 위한 편리한 방법이 발견되었다.

E.coli에서 B95.8종의 전 기능 게놈의 클로닝에 있어서, 명칭이 p1944.12(표 1)인 F인자 플라스미드가 사용되어 왔다. 이것은 종래의 DNA 클로닝법을 사용해서 E.coli에서 제조되었다. 도 5에 모식적으로 도시하듯이, 이 플라스미드는, B95.8게놈의 서브게놈 영역들을 나타내는 2개의 분절들 A와 B로 구성된다. 이런 영역들의 뉴클레오티드 서열좌표는 표 1에 나타내며; 이것들은 EBV좌표, 영역 A에서는 #143,458에서 #152,636까지 그리고 B영역에서는 #149,930에서 #159,880까지 확장한다. 이 영역 A 및 B는 선택 가능한 원핵마커유전자 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼아제(cam) 및 다른 유전자들과 함께 F인자의 원핵 복제기점을 포함하는 pMBO131 리플리콘의 측면에 위치한다(O'Connor et al, 1989). 양 EBV부분들은 동일한 DNA서열영역, 실질적인 예로서 2.7kbp(#149,930에서 #152,636까지)의 부분적 중복부분을 포함하기 위해 선택된다. E.coli에서 이런 실험들로부터 클론된 F인자 플라스미드는 2010(표 1)으로 명명되었다. 이 2010 DNA를 293세포 내로 트랜스펙션 한 후, 상동재조합이 이런 세포들에서 영역 A 및 B의 중복 부분들 사이에서 자발적으로 일어나서, 원핵 클로닝 단계로부터 유도된 모든 서열들의 결실을 이끈다.

이 점에서, 실시예들은 이하의 다른 용도와 관련하여 사용될 수 있을 것으로 생각된다.

·특별한 악성유전자가 부족하고, 특별하게 약화된 백신종으로서 사용될 수 있는, 특별하게 변형된 DNA바이러스의 확립. 이 경우에 가능한 EBV 악성유전자들은 EBVN2, LMP1, LMP2A일 수 있으며, 백신종의 약화를 위해 결실될 수 있다.

·EBV캡시드가 제공되는 패키징 세포계 및 생체외 또는 생체 내에서 인체세포 또는 다른 포유동물들의 세포 내로의 유전자 이동에 사용될 수 있는 재조합 EBV벡터들의 발생. 이러한 패키징 세포계는 EBV게놈 또는 EBV벡터를 패키지하기 위해 바이러스 구조단백질들의 생산에 필요한 필수부분을 안정하게 포함한다. 이 패키징 세포계는, 바람직하지 않는 소위 헬퍼 바이러스들의 해리를 방지하기 위해, 자신의 패키징신호(도 6 및 실시형태들을 참조)들이 부족한 EBV게놈이 바람직하게 제공된다. 패키징 될 수 있는 EBV벡터들은, 그들의 DNA증폭(oriLyt), 패키징(TR) 및, 수용세포에서 안정한 염색체외의 존재(oriP 및 EBNA1)에 필요한 모든 성분들을 포함하는 종래의 재조합 DNA플라스미드에 기초할 것이다. 또한, 이러한 벡터들은 치료학상 흥미로운 유전자, 예를 들어, 유전적 교정의 의미에서 인자 ⅤⅢ를 포함할 수 있다.

또한, 어떤 표적세포들에 대한 이러한 벡터들의 친화성은 변경될 수 있다. 특정 세포들(정상적으로 B세포 및 몇몇의 상피세포)의 감염에 책임 있는 EBV당단백질들은, E.coli의 F인자 내로 클로된 EBV게놈의 돌연변이에 의해 변경될 수 있으며, 또는 다른 것들에 의해 치환될 수 있다. 확장된 세포트로피즘의 일 예는, 소포성의 구내염 바이러스 당단백질 G일 수 있으며, 거의 배타적으로 다능성 혈액모세포들에 대한 극단적으로 특정한 세포트르피즘의 예는, 이런 간세포상의 간세포인자 수용체에 대한 리간드, 막과 결합된 간세포 인자 리간드(mSCF리간드)일 것이다. 이런 소위 슈도-타입은, 감염에 중요한 당단백질이 핵막으로부터 유도된 인지 질막 내로 파묻히기 때문에, 헤르페스바이러스 벡터들에 있어서 특히 눈길을 끈다. 이 막은 본질적으로 구조가 형성되어 있지 않고, 비리온의 엄격한 기학학적 캡시드를 단지 느슨하게 캡슐화한다. 많은 더 작은 바이러스들(예를 들어, 아데노바이러스, 아데노-결합 바이러스(AAV), 레트로바이러스)과는 반대로, 헤르페스바이러스들 및 다른 큰 DNA바이러스들의 캡시드는 유연하고, 특별한 단백질 구조나 바이러스의 성숙 및 조립을 방해할 수도 있는 접힌 구조를 요구하지 않는다.

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표 1

설명: EBV로커스는 선형화된 F인자 플라스미드 p1820.15, p1944.12 또는 p2061.2가 상동재조합에 의해 도입된 게놈위치를 가리킨다. EBV주로는 원형주 B95.8 또는 P3HR1/HH514주를 사용하였다. 상동 EBV게놈 단편으로서 선형화 플라스미드의 측면에 부착하는 EBV영역들은, 원형주 B95.8과 관계되고 또한 P3HR1/HH514와 비슷한 형태로 존재하는 EBV좌표로 표시된다. pMBO131은 E.coli F인자 플라스미드 부분을 가리킨다. 하이그로마이신 포스포트랜스퍼아제 및 EBNA2/EBNA-LP는, EBV주(B95.8 또는 P3HR1/HH514)과 선형화된 F인자 플라스미드 p1820.15, p1944.12 또는 p2061.2 사이의 상동재조합을 선택하게 하는 유전자들을 말한다. 그린형광단백질은 표현형 마커유전자이다.

상술한 방법은, 예를 들어, E.coli에서 클론에 의해 증폭될 수 있는 재조합 헤르페스바이러스 게놈의 제조를 가능하게 한다. 본 방법은 모든 큰 DNA바이러스들(예를 들어, 폭스바이러스, 이리디오 바이러스, 다른 헤르페스바이러스들)에 적용할 수 있을 것으로 확실하게 기대된다. 이런 바이러스게놈들을, 예를 들어 E.coli에서 클로닝하는 것에 의해, 바이러스유전자의 목표로 한 변경, 그들의 결실 또는 흥미로운 다른 유전자들의 첨가에 의한 단순한 변형이 가능하다. 이런 방식으로 제조된 바이러스게놈들은 바이러스의 각각의 표적세포들의 단백질의 발현을 허락하는 것과 같은 유전적 변형에 따른 새로운 특징들을 나타낸다.

E.coli에서 클론된 바이러스게놈들은 예를 들어 재조합 플라스미드 또는 서브게놈바이러스 영역의 포막화에 유용한 산물을 제공한다.

도 1은 B95.8/F 인자 플라스미드 p2010에서의 패키징 신호서열 TR의 결실 및 E.coli에서 선택가능한 마커에 대한 교환을 나타내며,

도 2는 시스-활성 헤르페스바이러스 성분들 oriP, oriLyt, TR, 선택가능한 마커 하이그로마이신 포스포트랜스퍼아제 HYG, "그린형광단백질"에 대한 유전자 GFP 및, 진핵세포에서 유전자벡터의 염색체외 복제를 위한 바이러스유전자 EBNA1을 나타내는 p2186.31유전자벡터의 유전자지도를 나타내며,

도 3은 헬퍼바이러스 없이 패키징 하는 세포계에서의 헤르페스바이러스 유전자벡터들의 패키징을 나타내며,

도 4는 헤르페스바이러스 유전자벡터인, 시스-활성 성분들 oriP, oriLyt, TR을 나타내는 EBV 미니 플라스미드 p1495.4의 유전자지도를 나타내며,

도 5는 F인자 플라스미드를 이용하는 E.coli에서의 게놈 B95.8 DNA의 클로닝을 나타내며,

도 6은 F인자 플라스미드를 이용하는 E.coli에서의 패키징신호(TR)가 부족한 게놈 P3HR1 DNA의 클로닝을 나타내며,

도 7은 F인자 플라스미드를 이용하는 E.coli에서의 게놈 P3HR1 DNA의 클로닝을 나타내며,

도 8은 대립유전자 교환에 의해 F인자 내로 클론된 EBV DNA내로의 돌연변이의 도입을 나타내며,

도 9는 선택적인 통합에 의해 F인자 내로 클론된 EBV DNA내로의 돌연변이의 도입을 나타낸다.

Claims (18)

1. 다음의 단계들을 포함하는 헤르페스헬퍼바이러스의 바이러스입자들 내로 유전자벡터 DNA를 헤르페스헬퍼바이러스 없이 패키징하는 방법:

   (a) 다음의 특징을 가지는 하나 또는 둘의 DNA 분자상의 헤르페스헬퍼바이러스의 DNA를 진핵세포내로 도입하는 단계:

   (α) 총크기가 100kbp이상이고;

   (β) 헤르페스헬퍼바이러스의 상기 DNA의 패키징을 위한 적어도 하나의 비기능적 시스-활성 신호서열을 가지며;

   (γ) 입자들이 헤스페스헬퍼바이러스게놈을 포함하지 않는 헤르페스헬퍼바이러스들의 바이러스입자들을 코딩하는 DNA를 가지며;

   (δ) 진핵세포내에서 선택가능한 마커유전자를 위한 서열을 포함하고;

   (b) 헤르페스헬퍼바이러스의 DNA를 포함하는 세포계열을 성립하는 단계;

   (c) 다음을 포함하는 패키징될 유전자벡터DNA를 진핵세포내로 도입하는 단계:

   (α) 헤르페스헬퍼바이러스들의 바이러스입자내로 유전자벡터DNA의 패키징을 위한 시스-활성 신호서열;

   (β) 단백질 코딩하는 흥미있는 유전자;

   (d) 헤르페스헬퍼바이러스의 용해단계의 유도 및 헤르페스헬퍼바이러스의 패키징에 중요한 단백질들을 생산하는 단계;

   (e) 헤르페스헬퍼바이러스의 바이러스입자들 내로 유전자벡터DNA를 패키징 하는 단계;
2. 제1항에 있어서, 상기 헤르페스헬퍼바이러스는 게놈의 크기가 120kbp 이상으로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 헤르페스헬퍼바이러스는 원핵세포에서 바이러스 DNA 게놈의 복제를 조절하는 서열를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제1항에 있어서, 헤르페스헬퍼바이러스의 상기 DNA는 엡스타인-바 바이러스 (EBV)DNA를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제1항에 있어서, 상기 시스-활성 신호서열은 EBV의 말단반복서열, 또는 EBV의 용해 복제기점을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제1항에 있어서, 상기 진핵세포는 인체세포인 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제 1항에 있어서, 상기 흥미있는 유전자는 치료학상 가치가 있는 유전자인 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제1항에 있어서, 진핵세포내로 헤르페스헬퍼바이러스의 세포트로피즘에 영향을 주기 위한 유전자가 도입되는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제8항에 있어서, 세포트로피즘에 영향을 주는 유전자가 유전자벡터DNA 상에 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
10. 다음을 포함하는 헤르페스헬퍼바이러스의 바이러스입자들 내로 헤르페스헬퍼바이러스 없이 유전자벡터DNA를 패키징 하기 위한 진핵헬퍼세포:

    (a) 총 크기가 100kbp이상이며, 패키징을 위한 적어도 하나의 비기능적 시스-활성 신호서열을 포함하고, 헤르페스헬퍼바이러스게놈를 포함하지 않는 바이러스 입자들의 생산을 조절하는 서열을 포함하고, 진핵세포에서 선택가능한 마커유전자를 위한 서열을 포함하는, 하나 또는 둘의 분자(들) 상의 헤르페스헬퍼바이러스;

    (b) 적어도 다음을 포함하는 유전자벡터DNA:

    (α) 헤르페스헬퍼바이러스의 바이러스입자 내로 유전자벡터DNA의 패키징을 위한 시스-활성 신호서열;

    (β) 단백질 코딩하는 흥미있는 유전자.
11. 제10항에 있어서, 헤르페스헬퍼바이러스의 상기 DNA는 EBV DNA를 포함하는 것을 특징으로 하는 진핵헬퍼세포.
12. 제10항에 있어서, 상기 세포가 인체세포인 것을 특징으로 하는 진핵헬퍼세포.
13. 제3항에 있어서, 원핵세포에서 선택할 수 있는 적어도 하나의 마커유전자를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
14. 제2항에 있어서, 상기 게놈의 크기가 150kbp이상으로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
15. 제14항에 있어서, 상기 게놈의 크기가 170kbp이상으로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
16. 제11항에 있어서, 헤르페스헬퍼바이러스의 상기 DNA는 EBV DNA인 것을 특징으로 하는 진핵헬퍼세포.
17. 제1항에 있어서, 단계(e) 다음으로 유전자벡터DNA를 포함하는 바이러스입자들이 해리되는 것을 특징으로 하는 방법.
18. 제17항에 있어서, 해리된 바이러스 입자들이 정제되는 특징으로 하는 방법.