ES2218518T3

ES2218518T3 - Multimeros de las formas solubles de receptores de tnf, su preparacion y composiciones farmaceuticas que los contienen.

Info

Publication number: ES2218518T3
Application number: ES92113463T
Authority: ES
Inventors: David Wallach; Cord Brakebusch
Original assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Current assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Priority date: 1991-08-07
Filing date: 1992-08-07
Publication date: 2004-11-16
Anticipated expiration: 2012-08-07
Also published as: DE69233351T2; ZA925904B; AU2090992A; JPH07145068A; DK0526905T3; EP0526905A2; ATE266724T1; US5478925A; DE69233351D1; PT526905E; CA2075358A1; CA2075358C; EP0526905B1; EP0526905A3; IL99120A0; AU661008B2

Abstract

SE PRESENTAN MULTIMEROS DE LAS FORMAS SOLUBLES DE LOS RECEPTORES DEL FACTOR DE LA NECROSIS DE TUMORES (TNF-RS). ESTOS MULTIMEROS SE PRODUCEN BIEN MEDIANTE METODOS QUIMICOS O RECOMBINANTES. LOS MULTIMEROS DE LAS FORMAS SOLUBLES DE LOS TNFRS SON UTILES PARA PROTEGER A LOS MAMIFEROS (INCLUIDOS LOS SERES HUMANOS) DE LOS EFECTOS DELETEREOS DEL TNF.

Description

Multímeros de las formas solubles de receptores de TNF, su preparación y composiciones farmacéuticas que los contienen.

La presente invención se refiere a multímeros de las formas solubles de los receptores del factor de necrosis tumoral, a su preparación y a composiciones farmacéuticas que los contienen.

El factor de necrosis tumoral (TNF) es una citoquina producida por una serie de tipos celulares, principalmente por fagocitos mononucleares. En la actualidad se han identificado dos TNF diferentes: TNF-\alpha y TNF-\beta (linfotoxina). Ambos TNF-\alpha y TNF-\beta inician sus efectos uniéndose a receptores de la superficie celular específicos.

Se sabe que TNF-\alpha y TNF-\beta (en lo sucesivo se denominan "TNF") ejercen efectos beneficiosos, así como perjudiciales, sobre una serie de células diana diferentes implicadas en la respuesta inflamatoria. Entre sus muchos efectos, el TNF, por ejemplo, estimula el crecimiento de fibroblastos e induce en estas células la síntesis de colagenasa, prostaglandina E2 e IL-6. El TNF también disminuye, en adipocitos, la actividad de la lipoproteína-lipasa, activa osteoclastos y aumenta, en células endoteliales, la adhesividad por leucocitos sanguíneos.

Sin embargo, el TNF también tiene efectos extremadamente perjudiciales: la sobreproducción de TNF puede desempeñar un papel patógeno importante en varias enfermedades, por ejemplo, se sabe que el TNF-\alpha es una causa principal para los síntomas del choque séptico. En algunas enfermedades el TNF puede provocar una pérdida excesiva de peso (caquexia) suprimiendo actividades en adipocitos y provocando anorexia (el TNF-\alpha, por tanto, se denominó caquectina). Véase, por ejemplo, Beutler et al., Annu. Rev. Biochem., 57, pp. 507-518 (1988), y Old, Sci. Am., 258, pp. 41-49 (1988). También se ha demostrado una excesiva producción de TNF en pacientes con SIDA.

Para contrarrestar los efectos citotóxicos del TNF se buscaron medios para antagonizar o eliminar el TNF formado de modo endógeno o administrado de modo exógeno. Además se están buscando medios para inducir específicamente sólo algunos de los muchos efectos del TNF, o restringir su acción a un tipo específico de células diana. El primer intento en esta dirección fue el desarrollo de anticuerpos monoclonales que neutralizan la actividad citotóxica del TNF-\alpha. Estos anticuerpos monoclonales se describen en el documento EP-186833, y en la patente de Israel nº 73883.

Como se indicó anteriormente, el TNF inicia su función uniéndose a receptores de la superficie celular específicos. Se conocen dos de estos receptores de TNF (en lo sucesivo "TNF-R") que se expresan diferencialmente en células de diferente tipo, el receptor p55-TNF y el receptor p75-TNF (p55-TNF-R y p75-TNF-R). Se ha demostrado que dos proteínas denominadas TBP-I y TBP-II, que se unen de forma específica al TNF, reaccionan inmunológicamente de forma cruzada con los dos receptores. Ambas proteínas proporcionan protección contra el efecto citocida del TNF in vitro, y ambas se unen al TNF-\beta con menos eficacia que el TNF-\alpha. Se descubrió que la formación de las TBP se produce mediante ruptura proteolítica de los TNF-R de la superficie celular, produciendo una liberación de una parte importante de su dominio extracelular (véase el documento EP 308378, 398327 y la solicitud EP 90124133.1). En efecto, se descubrió que las secuencias de los aminoácidos en TBP-I y TBP-II eran totalmente idénticas a las secuencias encontradas en los dominios extracelulares de los receptores de la superficie celular, pero no contienen ninguna parte del dominio intracelular de los receptores.

Estos descubrimientos implican que la inhibición de la función del TNF por TBP-I y TBP-II refleja la conservación, en TBP-I y TBP-II, de parte de las características estructurales de los TNF-R de la superficie celular, que son importantes para la unión del TNF por los receptores y, con ello, el inicio de la respuesta celular al TNF. Debido a esta conservación de la estructura, las TBP-I y TBP-II tienen la capacidad de competir con los TNF-R de la superficie celular por el TNF y, por tanto, bloquean su función.

Se sabe que el TNF, en su estado natural, existe como un multímero (trímero) que consiste en tres cadenas polipeptídicas idénticas, cada una con un tamaño molecular de aproximadamente 17.000 D.

Para producir sus efectos, el TNF debe unirse a los receptores de TNF en su forma trímera. Aunque el monómero de TNF también se une a las células (pero con una afinidad menor cuando se compara con el trímero de TNF), no tiene efecto.

La presente invención ahora proporciona multímeros de las formas solubles de los TNF-R, y sus sales o derivados funcionales. Estos multímeros interfieren de forma eficaz con la unión del TNF a los receptores de la superficie celular y, por tanto, no permiten que el TNF ejerza su efecto perjudicial.

El término "multímeros", tal como se utiliza en la presente, se refiere a cualquier combinación de monómeros que están unidos entre sí, por ejemplo, mediante enlace covalente, formación de liposomas, la incorporación de monómeros de la forma soluble de TNF-R en una única molécula recombinante, o cualquier otra combinación de monómeros.

Los multímeros pueden estar en forma dímera, trímera u otra forma multímera y pueden comprender, por ejemplo, TBP-I, TBP-II o sus mezclas.

\newpage

La invención también proporciona métodos para producir estos multímeros mediante entrecruzamiento covalente de las formas solubles de los TNF-R.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a moléculas de DNA que comprenden las secuencias de nucleótidos que codifican los multímeros de las formas solubles de los TNF-R, a vehículos de expresión que los comprenden, a células hospedantes transformadas con ellos, y a procesos para producir los multímeros mediante el cultivo de células transformadas en un medio de cultivo adecuado.

La invención también se refiere a moléculas de DNA que se hibridan con las anteriores moléculas de DNA y que codifican un multímero de las formas solubles de los TNF-R, o un derivado funcional de éste. La expresión "derivados funcionales" se define en la presente a continuación.

Los multímeros según la invención y sus sales y derivados funcionales pueden comprender el ingrediente activo de las composiciones farmacéuticas para proteger a mamíferos de los efectos perjudiciales del TNF. Estas composiciones son otro aspecto de la presente invención.

Como se indicó en la presente anteriormente, el TNF existe y ejerce su acción biológica como un trímero. Sin embargo, no se sabe nada hasta la fecha de la forma de los TNF-R que se unen al TNF, es decir, si el trímero de TNF se une a moléculas individuales de los TNF-R o si los receptores, en sí mismos, existen también como multímeros o se transforman en multímeros después de la unión del TNF, que se adaptan mejor a los trímeros de TNF.

Los inventores ahora han descubierto que los TNF-R existen en formas agregadas en células expuestas al TNF.

Esto se demostró mediante el análisis de las formas truncadas C-terminales y de longitud completa de los p55-TNF-F humanos, marcados mediante entrecruzamiento con TNF marcado. Con este objetivo, se produjeron formas truncadas del p55-TNF-R humano mediante mutagénesis dirigida específica de sitio del cDNA y su expresión en células A9 murinas. El TNF marcado de modo radiactivo se aplicó a estas células y se entrecruzó químicamente con los TNF-R. Los TNF-R se solubilizaron con un detergente, y se aplicaron anticuerpos específicos de los receptores humanos para inmunoprecipitar los receptores humanos, estudiando, con ello, si los receptores murinos se asocian de modo no covalente con el receptor humano como consecuencia de la agregación de los receptores.

Los monómeros de TBP-I y TBP-II deben administrarse en una dosis muy alta para producir una inhibición eficaz de la unión de TNF a las células en el cuerpo humano. Se cree que los multímeros de las formas solubles de los TNF-R según la invención son más eficaces para inhibir la actividad del TNF a dosis bajas, puesto que pueden competir de modo eficaz con los trímeros de TNF por los sitios de unión en los agregados de los TNF-R de la superficie celular.

Los multímeros de las formas solubles de los TNF-R pueden producirse de modo químico utilizando métodos conocidos que dan como resultado la formación de dímeros o multímeros superiores de las formas solubles de los TNF-R.

Otra forma de producir los multímeros de las formas solubles de los TNF-R es mediante técnicas recombinantes. De esta forma, la producción masiva de multímeros con una actividad de unión a TNF óptima puede ser posible.

Las composiciones farmacéuticas que contienen los multímeros de las formas solubles de los TNF-R pueden emplearse para antagonizar los efectos perjudiciales del TNF en mamíferos, es decir, actúan para tratar trastornos en los que el exceso de TNF se forma de modo endógeno o se administra de modo exógeno.

Estas composiciones comprenden los multímeros de las formas solubles de los TNF-R según la invención, o sus sales o derivados funcionales, como ingrediente activo. Las composiciones farmacéuticas están indicadas para cualquier trastorno de exceso de TNF, producido de modo endógeno, como en el choque séptico, caquexia, reacciones del receptor frente al injerto, enfermedades autoinmunológicas como artritis reumatoide y similares, o administrado de modo exógeno, es decir, la administración de sobredosis de TNF.

Tal como se utiliza en la presente, el término "sales" se refiere a las sales de los grupos carboxilo y a las sales de adición de ácidos de los grupos amino de la molécula de proteína. Las sales de un grupo carboxilo pueden formarse por medios conocidos en la técnica, e incluyen sales inorgánicas, por ejemplo sales de sodio, calcio, amonio, férricas o de cinc y similares, y sales con bases orgánicas como las formadas, por ejemplo, con aminas, como trietanolamina, arginina o lisina, piperidina, procaína y similares. Las sales de adición de ácidos incluyen, por ejemplo, sales con ácidos minerales como, por ejemplo, ácido clorhídrico o ácido sulfúrico, y sales con ácidos orgánicos como, por ejemplo, ácido acético o ácido oxálico.

Los "derivados funcionales", tal como se utilizan en la presente, incluyen derivados que puede prepararse a partir de los grupos funcionales que aparecen como cadenas laterales sobre los restos o los grupos N- o C-terminales, por medios conocidos en la técnica, y se incluyen en la invención con la condición de que sigan siendo farmacéuticamente aceptables, es decir, que no destruyan la actividad de la proteína ni confieran propiedades tóxicas a las composiciones que los contienen

Estos derivados pueden incluir, por ejemplo, ésteres alifáticos de los grupos carboxilo, amidas de los grupos carboxilo mediante reacción con amoniaco o con aminas primarias o secundarias, derivados de N-acilo de los grupos aminoácido libres de los restos aminoácidos formados con restos acilo (por ejemplo, grupos alcanoílo o aroílo carboxíclico) o derivados de O-acilo de grupos hidroxilo libres (por ejemplo, los de los restos serilo o treonilo) formados con restos acilo.

Los "derivados funcionales" también comprenden multímeros formados con las formas solubles de los TNF-R, en los que se han introducido cambios en la secuencia de los aminoácidos que forman los TNF-R solubles mediante cualquier método convencional. Estos cambios pueden comprender el alargamiento o truncamiento de la molécula de TNF-R soluble, o la deleción o sustitución de uno o más aminoácidos que forman el TNF-R soluble. Se entiende que ninguno de los anteriores cambios puede afectar a las propiedades biológicas de los TNF-R.

Las composiciones farmacéuticas según la invención se administran dependiendo del trastorno que se va a tratar, a través de las vías aceptadas de administración. Por ejemplo, en el caso del choque séptico, se prefiere la administración intravenosa, mientras que en el caso de la artritis, puede resultar indicada la inyección local. Las composiciones farmacéuticas también pueden administrarse de modo continuo, es decir, mediante infusión o por vía oral. La formulación y dosis dependerá del trastorno que se va a tratar, la vía de administración, y el trastorno y peso corporal del paciente que se va a tratar. El médico encargado determinará la dosis exacta.

Las composiciones farmacéuticas según la invención se preparan de la manera habitual, por ejemplo, mezclando el ingrediente activo con vehículos y/o estabilizantes y/o excipientes farmacéutica y fisiológicamente aceptables, como puede ser el caso, y se preparan en formas de dosificación, por ejemplo, mediante liofilización en viales de dosificación.

Cuando la composición farmacéutica comprende una composición de liposomas, ésta se ajusta para asegurar la interacción óptima del liposoma con las células fagocíticas, la accesibilidad óptima de los liposomas hacia la circulación y/u otros compartimientos del cuerpo, y las velocidades óptimas de eliminación de los liposomas de estos compartimientos.

Figuras 1A y 1B: muestran los diferentes tamaños de los receptores después del entrecruzamiento covalente con TNF marcado, la inmunoprecipitación y el análisis de SDS-PAGE. Los patrones formados son los siguientes:

Fig. 1A: precipitación con acidificación anterior para romper la asociación no covalente entre receptores. Precipitación de los receptores de células HeLa (carril 1), precipitación de extractos de células A9 no transfectadas (carril 2), de extractos de células A9 que expresan el p55-TNF-R humano de tipo salvaje (carril 3), y de extractos de células A9 que expresan mutantes del p55-TNF-R humano: el \Delta:310-426 de p55-TNF-R humano (carril 4), el \Delta:244-426 del p55-TNF-R humano (carril 5), y el \Delta:215-426 del p55-TNF-R humano (carril 6). El carril marcado como "Mr" es el de los marcadores de peso molecular.

Fig. 1B: muestra el mismo análisis del tamaño del receptor pero sin la acidificacion anterior a la inmunoprecipitación.

La figura 2 ilustra de forma esquemática la estructura del p55-TNF-R humano de tipo salvaje y de tres formas truncadas de éste, es decir, truncadas en el aminoácido 310 (el mutante \Delta:310-426 del p55-TNF-R humano), en el aminoácido 244 (el mutante \Delta:244-426 del p55-TNF-R humano) y en el aminoácido 215 (el mutante \Delta:215-426 del p55-TNF-R humano).

La figura 3A ilustra los efectos citocidas del TNF en células A9 que expresan el p55-TNF-R humano de longitud completa, y en células A9 que expresan sus mutantes de deleción citoplásmicos (\Delta:310-426, \Delta:244-426 y \Delta:215-426 del p55-TNF-R humano).

La figura 3B ilustra los efectos citocidas de anticuerpos monoclonales contra el p55-TNF-R humano en las mismas células que la figura 3A.

Las figuras 4A, 4B y 4C demuestran que el tratamiento de células A9 que expresan un mutante de deleción citoplásmico del p55-TNF-R humano con anticuerpos contra los receptores restablece su sensibilidad al efecto citocida del TNF.

Los siguientes ejemplos ilustran la invención sin limitarla a éstos.

Ejemplo 1 Detección de agregados de TNF-R humanos en el análisis de sus tamaños

Células A9, así como células que expresan las formas mutantes y de tipo salvaje del p55-TNF-R humano, y células HeLa se desprendieron mediante incubación en PBS que contiene EDTA 5 mM, y después de enjuagar con tampón de unión, se suspendieron en partes alícuotas de 5 x 10^{7} células en 1 ml de medio de unión, que contiene TNF marcado de modo radiactivo. Después de una incubación con agitación de vez en cuando durante 4 horas en hielo, las células se lavaron una vez con disolución salina equilibrada de Dulbecco (PBS+) y se incubaron durante 20 minutos en el mismo tampón que contiene bis(sulfosuccinimidil)suberato 1 mM (Pierce). El entrecruzamiento se detiene mediante la adición de Tris-HCl y glicina-HCl, pH 7,4 (ambos a una concentración final de 100 nM), seguido de dos lavados con PBS+. Las células entonces se extrajeron durante 1 hora a 4ºC, utilizando 600 \mul de un tampón de lisis que contiene Hepes 20 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, Triton X-100 desionizado al 1%, leupeptina 1 \mug/ml, y fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM. Después de una centrifugación durante 30 minutos a 10.000 x g, los extractos celulares se dividieron en dos porciones iguales. Una porción (porción A) se acidificó añadiendo 90 \mul de tampón de glicina-HCl 1 M, pH 2,5, y después de una hora de incubación en hielo, se neutralizó con 30 \mul de NaOH 1 M. A esta porción de los extractos, así como a la otra (B), se le añadieron anticuerpos monoclonales contra el p55-TNF-R humano. Después de 12 horas de otra incubación a 4ºC se añadieron 20 \mul de esferas de proteína-A Sepharose (Pharmacia) equilibradas con PBS+, y después de una incubación de 60 minutos a 4ºC, se lavaron tres veces con el tampón de lisis que contiene KCl 2 M y dos veces con PBS. Las esferas se resuspendieron en 15 \mul de tampón de la muestra que contiene SDS al 4% (p/v) y \beta-mercaptoetanol al 6% (v/v), y se hirvieron durante 3 minutos. El sobrenadante se analizó mediante SDS-PAGE (poliacrilamida al 10%), seguido de una autorradiografía.

Tal como se muestra en las figuras 1A y 1B, los receptores para TNF existen en formas agregadas en células expuestas al TNF. Estas figuras presentan los análisis de SDS-PAGE de las formas truncadas y de longitud completa de los p55-TNF-R humanos (véase la representación esquemática de las diferentes formas en la figura 2) expresadas en células A9 murinas y marcadas aplicando TNF marcado de modo radiactivo a las células, seguido de entrecruzamiento.

Los receptores se inmunoprecipitaron a partir de extractos de detergente de las células después de la acidificación de los extractos, para disociar los agregados no covalentes de las proteínas (A), o sin esta acidificación (B). Los patrones de las proteínas marcadas, precipitadas de extractos de células HeLa (carril 1), de extractos de células A9 no transfectadas (carril 2), de extractos de células A9 que expresan el p55-TNF-R humano de tipo salvaje (3), y de extractos de células A9 que expresan los mutantes de \Delta:310-426 del p55-TNF-R humano (4), \Delta:244-426 del p55-TNF-R humano (5), y \Delta:215-426 del p55-TNF-R humano (6) se muestran en comparación con la migración de los marcadores de peso molecular (Mr). Las bandas marcadas cuyos tamaños se corresponden con los receptores humanos expresados, marcados mediante entrecruzamiento con una o dos moléculas de TNF marcadas, se indican con flechas en negro (tamaños de 72 y 89 kD para el receptor de longitud completa, 59 y 76 kD para el \Delta:310-426 del p55-TNF-R humano, 51 y 68 kD para el \Delta:244-426 del p55-TNF-R humano, y 48 y 65 kD para el \Delta:215-426 del p55-TNF-R humano). Las bandas marcadas cuyos tamaños se corresponden con los receptores murinos de longitud completa, entrecruzados con uno o dos moléculas de TNF (72 y 89 kD) se indican con flechas en blanco, y las bandas que se corresponden con monómeros, dímeros y trímeros entrecruzados de TNF (17, 34 y 51 kdaltons) mediante flechas discontinuas.

Los anticuerpos aplicados para la inmunoprecipitación en este análisis del tamaño del receptor reconocen específicamente los receptores de origen humano (flechas en negro). Estos anticuerpos no precipitan los receptores de TNF de los extractos de células A9 no transfectadas (comparar los carriles 1 y 2). Sin embargo, tras la aplicación de estos anticuerpos a extractos de células A9 que expresan el p55-TNF-R humano, se descubrió que, junto con los receptores humanos, los anticuerpos precipitaban también algunos de los receptores murinos, que se distinguían con facilidad de los receptores humanos truncados por su tamaño de longitud completa (flechas en blanco) (carriles 3-6 en la figura 1B), lo cual implica que los receptores de TNF existen en las células como agregados, conteniendo ambos receptores de origen humano y murino. En coherencia con esta idea, se descubrió que si antes de la inmunoprecipitación, los extractos celulares se exponen a un pH bajo para romper la asociación no covalente entre los receptores, los receptores humanos aún pueden precipitar, pero sin embargo, la precipitación de los receptores murinos no se produce (comparar la figura 1A con la figura 1B).

Ejemplo 2 A. Construcción de p55-TNF-R mutantes

El cDNA del TNF-R1 humano (véase la solicitud EP 90124133.1) se cortó con BanII (en los nucleótidos 216-222) y NheI (en los nucleótidos 1723 y 1728), produciendo la eliminación de partes grandes de las regiones no codificadoras, incluyendo un ATG en la región no codificadora 5' y un GTn múltiple (n = 4-8) en la región no codificadora 3'. Se realizó una mutagénesis dirigida específica de sitio de esta forma acortada del cDNA utilizando el kit "Altered Sites" (mutagénesis) de Promega. Se introdujeron codones de terminación en los siguientes puntos: después de la leucina 309 (mutante \Delta:310-426) utilizando el oligonucleótido:

5'-CCC CAA CCC CCT CTA GAA GTG GGA GG-3'

y después de la leucina 214 (mutante \Delta:215-426) utilizando el oligonucleótido:

5'-AGT CCA AGC TCT AGA CCA TTG TTT GTG G-3'

(figura 1). Los cDNA de tipo salvaje y mutado se introdujeron en un vector de expresión eucariota. Para la generación del mutante \Delta:244-426, el vector de expresión que contiene el cDNA de tipo salvaje se cortó con HindIII. El fragmento de 3,9 kD se aisló y después, tras el relleno de los extremos colgantes, se reacopló, sustituyendo, con ello, el aminoácido 244 por un codón de terminación.

B. Expresión de los receptores de tipo salvaje y mutantes en células cultivadas

Células de las líneas murinas A9, L929, NIH3T3 y de hámster BHK se cultivaron con medio esencial mínimo de Dulbecco (DMEM), que contiene suero de ternera fetal al 10%, 100 unidades/ml de penicilina y estreptomicina 100 \mug/ml. Los constructos de expresión que codifican los receptores de tipo salvaje y mutante se cotransfectaron junto con el plásmido que confiere resistencia a la neomicina pSV2neo en estas células, utilizando el método de precipitación de fosfato de calcio. Después de 10 a 14 días de selección en medio de crecimiento que contiene G418 500 \mug/ml, las colonias resistentes se aislaron y se comprobaron para detectar la expresión del p55-TNF-R humano midiendo la unión de TNF a las células.

La figura 2 ilustra la estructura del p55-TNF-receptor humano de tipo salvaje. Consiste en iconos que muestran el p55-TNF-R humano de longitud completa y las formas truncadas de este receptor creadas mediante mutagénesis dirigida específica de sitio. Utilizando estos oligonucleótidos se introdujeron codones de terminación en el dominio intracelular del receptor en los aminoácidos 310 (el mutante \Delta:310-426 del p55-TNF-R humano), 244 (el mutante \Delta:244-426 del p55-TNF-R humano), y 215 (el mutante \Delta:215-426 del p55-TNF-R humano).

Las figuras 3 y 4 proporcionan más pruebas de la existencia del TNF-R de la superficie celular en forma de agregados, así como de otros dos puntos, es decir, que la agregación de receptores funcionales es necesaria para la actividad de estos receptores, así como que la implicación de receptores no funcionales en esta agregación produce una inhibición eficaz de la función del TNF.

La figura 3 ilustra los efectos citocidas del TNF (A) y de anticuerpos monoclonales contra el p55-TNF-R humano (B) en células A9, en células A9 que expresan el p55-TNF-R humano de longitud completa, y en células A9 que expresan los mutantes de deleción citoplásmicos del p55-TNF-R humano (el \Delta:310-426 del p55-TNF-R humano, el \Delta:244-426 del p55-TNF-R humano, y el \Delta:215-426 del p55-TNF-R humano).

Las células se sembraron en placas de 96 pocillos, 24 horas antes del ensayo, a una densidad de 30.000 células/pocillo. El TNF y los anticuerpos monoclonales se aplicaron simultáneamente con CHI (50 \mug/ml). Después de otras 11 horas de incubación a 37ºC, se ensayó la viabilidad de las células en un ensayo de captación de rojo neutro. Los dos anticuerpos monoclonales se aplicaron en cantidades iguales, que suman la concentración especificada en la figura.

Volviendo a la figura 4, se estudió el efecto citocida del TNF, aplicado junto con CHI (50 \mug/ml) a células A9 (A), a células A9 que expresan el \Delta:310-426 de p55-TNF-R humano (B), y a células A9 que expresan el \Delta:215-426 de p55-TNF-R humano (C), en presencia y ausencia de anticuerpos contra el p55-TNF-R humano. Se observó una sensibilización similar por los anticuerpos al efecto citocida del TNF en células A9 que expresan el mutante \Delta:244-426 de p55-TNF-R humano.

Por tanto, aunque tienen un efecto citocida pronunciado en células A9 que expresan el p55-TNF-R humano de longitud compelta, los anticuerpos no tienen ningún efecto en células que expresan cualquiera de las tres formas truncadas del receptor, lo cual sugiere que estas formas truncadas no son funcionales. Además, el ensayo del efecto sobre las células del TNF en sí mismo reveló que, por contraste con los receptores p55-TNF-R humanos de longitud completa, cuya expresión produce una mayor sensibilidad de las células A9 al TNF, las formas truncadas de los receptores transmiten una disiminución en el grado de respuesta al efecto citocida del TNF.

Esta disminución puede observarse en clones de células A9, que expresan una de las formas truncadas de los receptores, a un grado que parece aproximadamente proporcional al grado de expresión del receptor. La sensibilidad al TNF puede recuperarse aplicando a estas células los anticuerpos contra el h-p55-TNF-R, confirmando que la disminución en la respuesta al TNF refleja un efecto inhibidor de los receptores humanos truncados sobre la función de los receptores de roedor de longitud completa.

Ejemplo 3 Creación de multímeros de las formas solubles de los TNF-R mediante entrecruzamiento químico de estas proteínas a) Introducción de cisteína o, como alternativa, de biotina en los extremos C-terminales de los receptores solubles

Procedimiento I

Se incuban muestras de las formas solubles del p55-TNF-R humano o del p75-TNF-R humano con la amida de la cisteína o, como alternativa, con la amida de la biotina,

biotina---

\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}

---NH(CH_{2})_{4}---

\uelm{C}{\uelm{\para}{NH _{2} }}

---CH---CONH_{2}

y con carboxipeptidasa Y. En presencia de un exceso de la amida de la cisteína o de la amida de la biotina, la reacción enzimática conduce principalmente a la incorporación de estos compuestos a los extremos C-terminales de los receptores solubles.

Procedimiento II

Las reacciones se realizan como anteriormente, excepto que el aminoácido dentro del receptor elegido para que sea el C-terminal de los receptores solubles es lisina, y que se aplica lisina-endopeptidasa en lugar de carboxipeptidasa. El uso de esta enzima asegura que, además de la eliminación de un único aminoácido del C-terminal del receptor soluble, no se produce otro truncamiento del receptor soluble.

b) Uso de receptores solubles, en los que se introdujo la cisteína C-terminal, para la formación de dímeros de los receptores solubles

Los receptores en los que se introdujeron cisteínas N-terminales como se describió anteriormente se entrecruzaron para formar dímeros, utilizando conectores activados con una de las siguientes fórmulas:

1

Pueden emplearse conectores de longitudes diferentes. La función de los productos se compara entre sí y, por tanto, se define la longitud óptima del conector. En el caso de cisteínas libres que resultan estar presentes dentro de los receptores solubles, se bloquearán antes de la introducción de la cisteína en el C-terminal, mediante alquilación.

c) Uso de receptores solubles, en los que se introdujo la biotina C-terminal, para la formación de tetrámeros de los receptores solubles, así como estructuras más complejas de los receptores

Los receptores solubles en los que se introdujo la biotina C-terminal, como se describió anteriormente, se entrecruzan con avidina. Cada avidina contiene cuatro sitios de unión a la biotina. De esta manera se forman tetrámeros de los receptores. Como alternativa, parte de los cuatro sitios de unión en la avidina actúa para la unión de otras proteínas a las cuales estaba unida la biotina. De esta manera, se unen varias moléculas de avidina entre sí, dando como resultado la formación de agregados superiores de las formas solubles de los TNF-R humanos. Este enfoque también permite la unión de otras moléculas a las formas solubles de los TNF-R (por ejemplo, porciones Fc de anticuerpos).

Como alternativa, la avidina puede sustituirse por estreptavidina, permaneciendo el procedimiento, en sí mismo, igual.

d) Formación de multímeros de los receptores solubles mediante el entrecruzamiento de cisteínas localizadas dentro de la secuencia de los receptores

Estos multímeros de los receptores de TNF se forman uniendo las moléculas de las formas solubles de los TNF-R entre sí utilizando reactivos de entrecruzamiento específicos de grupos amina o de tioles (estos últimos después de la reducción parcial de las cisteínas en los receptores solubles con \beta-mercaptoetanol o ditiotreitol).

e) Formación de liposomas que contienen múltiples moléculas de los receptores truncados

Procedimiento I

Para este fin, pueden aplicarse liposomas que expresan cualquier proteína que contenga biotina sobre su superficie. Las formas solubles de los TNF-R a cuyos C-terminales se unió biotina, se unen a estos liposomas con el uso de avidina (tetravalente).

Procedimiento II

Se producen receptores de TNF recombinantes, truncados en los dominios intracelulares, pero que contienen los dominios transmembrana, como se describe en el ejemplo 2. Entonces se incorporan en liposomas mediante una disociación en detergentes, seguido de su reconstitución en presencia de lípidos mediante la eliminación de los detergentes.

f) Aislamiento de multímeros del receptor soluble con mayor efecto inhibidor sobre la función del TNF

Preparaciones de dímeros o multímeros del receptor soluble se fraccionan de modo cromatográfico, y las fracciones que muestran los mayores efectos inhibidores sobre la función de TNF se analizan más a fondo, para definir las estructuras óptimas para la inhibición del TNF. Como alternativa, se realiza una purificación de afinidad de los inhibidores óptimos, aplicando preparaciones de dímeros o multímeros del receptor soluble a columnas de afinidad de TNF.

Ejemplo 4 Creación de moléculas de DNA recombinante que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican los multímeros de los TNF-R solubles y su expresión

Los dímeros y multímeros superiores de los receptores solubles también pueden prepararse mediante técnicas de ingeniería genética, y su preparación incluye todas las herramientas utilizadas en estas técnicas. Por tanto, se proporcionan moléculas de DNA que comprenden la secuencia de nucleótidos que codifica estos dímeros u oligómeros. Estas moléculas de DNA pueden ser DNA genómico, cDNA, DNA sintético y sus combinaciones.

La creación de moléculas de DNA que codifican un dímero de los receptores solubles se realiza acoplando la secuencia de cDNA que codifica las formas solubles de un TNF-R con una secuencia que codifica un péptido conector y, después, con un polinucleótido sintético que codifica la traducción del receptor soluble en la orientación inversa (desde el C-terminal original al N-terminal) y que carece de la secuencia del péptido conductor.

Las formas poliméricas de los receptores solubles pueden crearse, como se mencionó anteriormente, formando receptores truncados recombinantes, que no tengan los dominios intracelulares pero que contengan dominios transmembrana, e incorporándolos, mediante técnicas de reconstitución de membrana, en liposomas.

La expresión de las proteínas recombinantes puede realizarse en células eucariotas, bacterias o levaduras, utilizando los vectores de expresión apropiados. Puede emplearse cualquier método conocido en la técnica.

Por ejemplo, las moléculas de DNA que codifican los multímeros de las formas solubles de los TNF-R obtenidas mediante los métodos anteriores se insertan en vectores de expresión construidos de forma apropiada, mediante técnicas muy conocidas en la técnica (véase Maniatis et al., op. cit.). Se une cDNA bicatenario a vectores de plásmido mediante colas homopolímeras o unión de restricción que implica el uso de conectores de DNA sintético o técnicas de acoplamiento de extremos romos. Se utilizan DNA-ligasas para acoplar las moléculas de DNA, y se evita la unión no deseada mediante un tratamiento con fosfatasa alcalina.

Para ser capaz de expresar una proteína deseada, un vector de expresión debe comprender también secuencias de nucleótidos específicas que contengan información reguladora transcripcional y traducccional unidas al DNA que codifica la proteína deseada, de tal forma que se permite la expresión génica y la producción de la proteína. En primer lugar, para que el gen se transcriba, debe estar precedido de un promotor reconocible por la RNA-polimerasa, al cual se une la polimerasa y, por tanto, se inicia el proceso de transcripción. Existe una amplia variedad de estos promotores en uso, que actúan con diferentes eficacias (promotores fuertes y débiles). Son diferentes para células procariotas y eucariotas.

Los promotores que pueden utilizarse en la presente invención pueden ser constitutivos, por ejemplo, el promotor int del bacteriófago \lambda, el promotor bla del gen de \beta-lactamasa de pBR322, y el promotor CAT del gen de cloranfenicol-acetil-transferasa de pPR325, etc., o inducible, como los promotores procariotas, incluyendo los promotores principales derecho e izquierdo del bacteriófago \lambda (P_{L} y P_{R}), los promotores trp, recA, lacZ, lacI, ompF y gal de E. coli, o el promotor híbrido trp-lac, etc. (Glick, B.R. (1987), J. Ind. Microbiol., 1:277-282).

Además del uso de promotores fuertes para generar grandes cantidades de mRNA, para lograr unos niveles de expresión elevados en células procariotas, es necesario utilizar también sitios de unión a ribosomas para asegurarse de que el mRNA se traduce de forma eficaz. Un ejemplo es la secuencia Shine-Dalgarno (secuencia SD), colocada de forma apropiada desde el codón de iniciación y complementaria con la secuencia 3'-terminal de RNA 16S.

Para hospedantes eucariotas, pueden emplearse diferentes secuencias reguladoras transcripcionales y traduccionales, dependiendo de la naturaleza del hospedante. Pueden derivarse de fuentes víricas, como adenovirus, virus del papiloma bovino, virus de simio o similares, en los que las señales reguladoras están asociadas con un gen concreto que tiene un alto nivel de expresión. Los ejemplos son el promotor TK de herpesvirus, un promotor temprano de SV40, el promotor del gen ga14 de levadura, etc. Pueden seleccionarse señales reguladoras de la iniciación de la transcripción que permitan la represión y activación, de forma que puede modularse la expresión de los genes.

La molécula de DNA que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica los multímeros de TNF de la invención, y las señales reguladoras trancripcionales y traduccionales operativamente unidas, se insertan en un vector que es capaz de integrar las secuencias génicas deseadas en el cromosoma de la célula hospedante. Las células que han integrado de forma estable el DNA introducido en sus cromosomas pueden seleccionarse introduciendo también uno o más marcadores que permiten la selección de células hospedantes que contienen el vector de expresión. El marcador puede proporcionar prototrofía a un hospedante auxotrópico, resistencia a biocidas, por ejemplo, antibióticos, o a metales pesados, como cobre, o similares. El gen del marcador seleccionable puede unirse directamente a las secuencias génicas del DNA que se va a expresar, o puede introducirse en la misma célula mediante cotransfección. También pueden ser necesarios otros elementos para la síntesis óptima de mRNA monocatenario de la proteína de unión. Estos elementos pueden incluir señales de ruptura, así como promotores de la transcripción, potenciadores y señales de terminación. Los vectores de expresión de cDNA que incorporan estos elementos incluyen los descritos por Okayama, H. (1983), Mol. Cel. Biol., 3:280.

En una realización preferida, la molécula de DNA introducida se incorporará en un vector de plásmido o vírico capaz de realizar una replicación autónoma en el hospedante receptor. Los factores de importancia para la selección de un vector de plásmido o vírico concreto incluyen: la facilidad con la que las células receptoras que contienen el vector pueden reconocerse y seleccionarse de las células receptoras que no contienen el vector; el número de copias del vector que se desea en un hospedante particular; y si es deseable ser capaz de "transferir" el vector entre células hospedantes de diferentes especies.

Los vectores procariotas preferidos incluyen plásmidos como aquellos capaces de replicación en E. coli, por ejemplo, pBR322, ColEI, pSC101, pACYC 184, etc. (véase Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, op. cit.); plásmidos de Bacillus, como pC194, pC221, pT127, etc. (Gryczan, T., The Molecular Biology of the Bacilli, Academic Press, Nueva York (1982), pp. 307-329); plásmidos de Streptomyces, incluyendo pIJ101 (Kendall, K.J. et al. (1987), J. Bacteriol., 169:4177-4183); bacteriófagos de Streptomyces como \diameterC31 (Chater, K.F. et al., en: Sixth International Symposium on Actinomycetales Biology, Akademiai Kaido, Budapest, Hungría (1986), pp. 45-54); y plásmidos de Pseudomonas (John, J.F. et al. (1986), Rev. Infect. Dis., 8:693-704), e Izaki, K. (1987), Jpn. J. Bacteriol., 33:729-742).

Los plásmidos eucariotas preferiods incluyen BPV, vaccinia, SV40, círculo de 2 micras, etc., o sus derivados. Estos plásmidos son muy conocidos en la técnica (Botstein, D., et al. (1982), Miami Wint. Symp., 19:265-274; Broach, J.R., en: The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces: Life Cycle and Inheritance, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York, pp. 445-470 (1981); Broach, J.R. (1982), Cell, 28:203-204; Bollon, D.P. et al. (1980), J. Clin. Hematol. Oncol., 10:39-48; Maniatis, T., en: Cell Biology: A Comprehensive Treatise. Vol. 3: Gene Expression, Academic Press, Nueva York, pp. 563-605 (1980)).

Cuando el vector o la secuencia de DNA que contiene el(los) constructo(s) se ha preparado para la expresión, el(los) constructo(s) puede(n) introducirse en una célula hospedante apropiada mediante una cualquiera de una diversidad de medios adecuados: transformación, trasfección, conjugación, fusión de protoplastos, electroporación, precipitación con fosfato de calcio, microinyección directa, etc.

Las células hospedantes para utilizar en esta invención pueden ser procariotas o eucariotas. Los hospedantes procariotas preferidos incluyen bacterias como E. coli, Bacillus, Streptomyces, Pseudomonas, Salmonella, Serratia, etc. El hospedante procariota más preferido es E. coli. Los hospedantes bacterianos de particular interés incluyen E. coli K12 cepa 294 (ATCC 31446), E. coli X1776 (ATCC 31537), E. coli W3110 (F^{-}, lambda^{-}, prototrópico (ATCC 27325)), y otras enterobacterias como Salmonella typhimurium o Serratia marcescens y diversas especies de Pseudomonas. Bajo estas condiciones, la proteína no se glicosila. El hospedante procariota debe ser compatible con el replicón y las secuencias de control en el plásmido de expresión.

Los hospedantes eucariotas preferidos son células de mamífero, por ejemplo, células de ser humano, mono, ratón y ovario de hámster chino (CHO), porque proporcionan modificacioens postraduccionales a las moléculas de la proteína, incluyendo el plegamiento correcto o la glicosilación en los sitios correctos. Además, las células de levadura pueden realizar modificaciones postraduccionales en el péptido, incluyendo la glicosilación. Existe una serie de estrategias de DNA recombinante que utilizan secuencias de promotores fuertes y plásmidos de alto número de copias que pueden utilizarse para la producción de las proteínas deseadas en levaduras. La levadura reconoce las secuencias conductoras en productos de genes de mamífero clonados y segrega péptidos que portan secuencias conductoras (es decir, pre-péptidos).

Después de la introducción del vector, las células hospedantes se cultivan en un medio selectivo, que selecciona el crecimiento de células que contienen el vector. La expresión de la(s) secuencia(s) del gen clonado da como resultado la producción de los multímeros deseados de las formas solubles de los TNF-R.

La purificación de las proteínas recombinantes se realiza utilizando anticuerpos monoclonales contra las formas solubles de los TNF-R, o mediante purificación de afinidad en columnas de ligando (TNF).

Claims

1. Un método para la preparación de multímeros de las formas solubles de los TNF-R o sus sales, que tienen la capacidad de interferir con la unión del TNF a sus receptores, y de bloquear los efectos del TNF, en el que dichos multímeros comprenden TBP-I o una mezcla de TBP-I y TBP-II, comprendiendo dicho método acoplar covalentemente los monómeros de las formas solubles de los TNF-R o sus sales.

2. El método de la reivindicación 1, en el que el multímero está en forma dímera.

3. El método de la reivindicación 1, en el que el multímero está en forma trímera.

4. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el multímero está encapsulado en un liposoma.

5. Un método para la preparación de una composición farmacéutica que comprende (combinar) un multímero definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 de una forma soluble de un TNF-R o su sal, con un vehículo y/o excipiente y/o estabilizante farmacéuticamente aceptable.

6. El método de la reivindicación 5, en el que la composición farmacéutica comprende liposomas que contienen múltiples moléculas de los TNF-R solubles.

7. El método según la reivindicación 5 ó 6, en el que la composición farmacéutica es para proteger a mamíferos de los efectos perjudiciales del TNF.

8. Los multímeros de las formas solubles de los TNF-R o sus sales, que tienen la capacidad de interferir con la unión del TNF a los receptores, y de bloquear los efectos del TNF, en los que dichos multímeros comprenden TBP-I o una mezcla de TBP-I y TBP-II.

9. Un multímero según la reivindicación 8 en forma dímera.

10. Un multímero según la reivindicación 8 en forma trímera.

11. Un multímero según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en el que el multímero está encapsulado en un liposoma.

12. Una composición farmacéutica que comprende un multímero según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11 de una forma soluble de un TNF-R o su sal, junto con un vehículo y/o excipiente y/o estabilizante farmacéuticamente aceptable.

13. Una composición farmacéutica según la reivindicación 12, que comprende liposomas que contienen múltiples moléculas de los TNF-R solubles.

14. Una composición farmacéutica según la reivindicación 12 ó 13, para proteger a mamíferos de los efectos perjudiciales del TNF.