ES2218272T3 - Uso anticuerpos anti-idiotipicos en calidad de vacunas contra el cancer. - Google Patents
Uso anticuerpos anti-idiotipicos en calidad de vacunas contra el cancer.Info
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Abstract
Uso de anticuerpos para la preparación de una composición farmacéutica adecuada como vacuna para la vacunación terapéutica o profiláctica contra el cáncer, caracterizado porque los anticuerpos se obtienen a partir de fluidos corporales que contienen anticuerpos por purificación de inmunoafinidad, en la que se utilizan como ligandos para la purificación de inmunoafinidad anticuerpos capaces de reconocer uno o múltiples antígenos asociados a tumores, o sus fragmentos con idéntico idiotipo, y en el que los fluidos corporales proceden de un individuo al que no se han administrado previamente anticuerpos monoclonales dirigidos contra alguno de los antígenos asociados a tumores.
Description
Uso de anticuerpos
anti-idiotípicos en calidad de vacunas contra el
cáncer.
La presente invención describe el uso de
anticuerpos que se fijan a anticuerpos contra antígenos asociados a
tumores, y que se obtienen por purificación de inmunoafinidad a
partir de fluidos corporales que contienen anticuerpos individuales,
en ligandos específicos, para la preparación de una composición para
la vacunación autóloga, profiláctica o terapéutica, e individual
contra enfermedades oncológicas. Los ligandos de la purificación de
inmunoafinidad son anticuerpos o sus derivados dirigidos contra uno
o múltiples antígenos asociados a tumores. Adicionalmente, la
invención se refiere a composiciones farmacéuticas que contienen los
anticuerpos obtenidos por purificación de inmunoafinidad o células
dendríticas pulsadas in-vitro con éstos.
El sistema inmunológico adaptativo del ser humano
está formado por dos componentes fundamentales, la inmunidad humoral
y la inmunidad celular. La inmunorrespuesta adaptativa se basa en la
selección clonal de linfocitos B y T y permite, en principio, el
reconocimiento de cualquier antígeno, así como la construcción de
una memoria inmunológica. Estas características del sistema
inmunológico adaptativo se utilizan, en general, de manera
provechosa en la vacunación.
Cada célula B produce un anticuerpo con una
determinada especificidad de fijación. Este anticuerpo se encuentra
como receptor específico también en la membrana de las células B que
lo producen. La inmunorrespuesta humoral contra antígenos
reconocidos como extraños se basa en la activación selectiva de
aquellas células B que producen estos anticuerpos capaces de fijarse
al epitopo del correspondiente antígeno. En la multiplicidad de
anticuerpos, los reordenamientos del ADN en el trascurso de la
diferenciación de las células B juegan un papel decisivo.
En el suero humano se encuentran en elevada
cantidad anticuerpos de las más diversas especificidades, isotipos y
subclases. La concentración total de todas las inmunoglobulinas en
suero asciende a 15-20 mg/ml; es decir, en la sangre
circulan permanentemente aprox. 100 g de inmunoglobulinas de las más
diversas especificidades. No resulta posible establecer el número
exacto de todos los anticuerpos con diversa especificidad. El
repertorio teóricamente posible podría estar en torno a 10^{11}.
Un determinado anticuerpo puede fijarse, en general, a diversos
antígenos similares entre sí, si bien con distinta afinidad y
avidez.
El sistema inmunológico debe mantener en
equilibrio, con la ayuda de mecanismos de regulación endógena, una
homeostasis relativa a la distribución y valoración de estas
diferentes especificidades. Un mecanismo importante, en este
sentido, es la "red idiotípica", postulada hace unos 25 años
por Niels Jerne (Jerne, Ann. Immunol. 125C (1974),
373-389): contra cada idiotipo de un anticuerpo, que
determina su especificidad de fijación, existen anticuerpos
anti-idiotípicos, que también se fijan al idiotipo
del primer anticuerpo en el sentido de un reconocimiento de
antígeno. Jerne propuso que las interacciones entre los receptores
específicos para el idiotipo en los linfocitos podrían ser
responsables de la regulación del sistema inmunológico.
Aparentemente, estas interacciones existen en la realidad, puesto
que se ha demostrado que en el trascurso de una inmunorrespuesta se
forman también anticuerpos anti-idiotípicos contra
los anticuerpos inducidos de forma primaria por la inmunorrespuesta.
Dado que existen anticuerpos anti-idiotípicos contra
cada anticuerpo, los linfocitos no toleran básicamente los idiotipos
de los anticuerpos.
En sentido inmunológico, algunos anticuerpos
anti-idiotípicos pueden representar la "imagen
interna" de un antígeno. Estos anticuerpos se pueden utilizar,
por lo tanto, como sustitutos del antígeno nominal para la
inmunización, puesto que pueden unirse en parte al antígeno nominal
a través de anticuerpos inducidos durante una inmunización. Esta
teoría se utiliza desde hace tiempo, especialmente en la
inmunoterapia del cáncer. Desde hace más de 10 años existe una serie
de proyectos preclínicos y clínicos para generar inmunorrespuestas
contra antígenos asociados a tumores mediante la vacunación con
anticuerpos anti-idiotípicos monoclonales (véase,
por ejemplo: Bhattacharya-Chatterjee, Foon;
Anti-idiotype antibody vaccine therapies of cancer;
Cancer Treat. Res. 94 (1998), 51-68). La mayor parte
de estos anticuerpos anti-idiotípicos monoclonales
tiene su origen en el ratón, si bien existen también ensayos con
anticuerpos anti-idiotípicos monoclonales humanos
(por ejemplo, Fagerberg et al., PNAS 92 (1995),
4773-4777).
Los ensayos de inmunización terapéutica de
pacientes con linfomas de células B representan un caso especial. En
estas enfermedades, degenera un determinado clon de células B que
produce una determinada inmunoglobulina con un idiotipo
característico para ella, presente también como receptor en la
membrana celular. Este anticuerpo es monoclonal y se puede
considerar como antígeno específico para el tumor en el linfoma de
células B. Se ha demostrado que estos anticuerpos autólogos,
específicos para los pacientes, preparados en cultivos celulares y
administrados como vacuna en una forma inmunogénica adecuada, pueden
generar una inmunorrespuesta contra el idiotipo de este anticuerpo,
capaz de evidenciar una acción contra el linfoma de células B
(Reichardt et al., Blood 93 (1999),
2411-2419).
En resumen, se puede afirmar que:
- \bullet
- los anticuerpos anti-idiotípicos monoclonales humanos que imitan a un antígeno asociado a un tumor, pueden desencadenar, como vacuna en pacientes de cáncer, una inmunorrespuesta que puede estar dirigida contra este antígeno asociado al tumor. Estos anticuerpos monoclonales humanos se han obtenido por tecnología de hibridación o inmortalización a partir de células B humanas de pacientes que habían recibido un anticuerpo antitumoral (a menudo, de ratón) como inmunoterapia pasiva y que habían generado una inmunorrespuesta contra el mismo. Con los anticuerpos anti-idiotípicos monoclonales humanos preparados de esta forma se ha inmunizado a otros pacientes.
- \bullet
- Los anticuerpos humanos, producidos por un linfoma de células B y que, por lo tanto, poseen un idiotipo definido, pueden desencadenar, como vacuna individual, una inmunorrespuesta específica para el paciente que puede estar dirigida contra el linfoma de células B. Estos anticuerpos específicos de pacientes se deben obtener por tecnología de hibridación o inmortalización de las células del linfoma de células B de manera individual. Su uso está limitado, evidentemente, al tratamiento de linfomas de células B.
De esta forma, se sabe que se pueden utilizar
anticuerpos anti-idiotípicos monoclonales de una
determinada especie para inmunizar también a individuos de la misma
especie de la que proceden los anticuerpos. Con este objetivo es
preciso, sin embargo, manipular y cultivar células para cada caso.
Por lo tanto, esta técnica resulta costosa y está limitada a
anticuerpos monoclonales.
En Losman et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 88 (1991), 3421-3425, se describe la
purificación de anticuerpos Ab2 a partir de un paciente de cáncer.
Este paciente había sido tratado previamente con un anticuerpo
monoclonal de ratón (NP-4) contra CEA.
Es evidente que existe, al igual que antes, la
demanda de poner a disposición métodos y medios que permitan llevar
a cabo un tratamiento eficaz, ampliamente aplicable y,
eventualmente, individualizado de tumores, así como una protección
contra enfermedades oncológicas.
La presente invención tiene, en consecuencia, la
misión de poner a punto medios y procedimientos eficaces y
aplicables individualmente en el marco de diversos tipos de tumores,
para el tratamiento del cáncer, así como para la protección contra
enfermedades oncológicas.
Esta tarea se resuelve por la puesta a
disposición de las formas de realización caracterizadas en las
reivindicaciones.
Por lo tanto, la presente invención se refiere al
uso de anticuerpos para la preparación de una composición adecuada
como vacuna para la vacunación terapéutica o profiláctica contra el
cáncer, caracterizado porque el anticuerpo se obtiene de fluidos
corporales que contienen anticuerpos por purificación de
inmunoafinidad, en los que se utilizan como ligandos para la
purificación de inmunoafinidad anticuerpos capaces de reconocer uno
o múltiples antígenos asociados a tumores, o sus fragmentos con
idéntico idiotipo, y en los que los fluidos corporales proceden de
un individuo al que no se ha administrado previamente un anticuerpo
monoclonal dirigido contra alguno de los antígenos asociados a
tumores.
El uso según la invención tiene, con respecto a
los métodos descritos en el estado de la técnica, la ventaja de que
para la preparación de los anticuerpos
anti-idiotípicos no se utilizan cultivos celulares.
De este modo, el concepto según la invención permite una amplia y
eficaz aplicación y no está limitada a anticuerpos monoclonales.
El conjunto de anticuerpos presente, por ejemplo,
en grandes cantidades en la sangre de cada persona, contiene
anticuerpos de cualquier especificidad de fijación posible. En
consecuencia, este conjunto de anticuerpos contiene fundamentalmente
también anticuerpos (Ab2) contra el idiotipo de anticuerpos
monoclonales (ya conocidos, pero también nuevos), por ejemplo, de
ratón (Ab1) contra cualquier antígeno asociado a tumores (TAA). De
acuerdo con la red inmunológica, el mismo conjunto de anticuerpos
contiene, en cada persona y en cantidades determinadas, también
anticuerpos contra los idiotipos de los Ab2 autólogos, los llamados
anticuerpos Ab3. Según la teoría de la red, los Ab2 se pueden fijar
al antígeno asociado a un tumor definido por los Ab1 externos. Un
desplazamiento del equilibrio de Ab2/Ab3 a favor de Ab3 deberá tener
como consecuencia que las células tumorales del sistema
inmunológico, portadoras de este antígeno, puedan ser mejor
reconocidas y atacadas.
La base de la presente invención consiste en que
sea posible lograr dicho desplazamiento del equilibrio inmunológico
mediante la administración de una fracción de Ab2 autólogos en forma
de una vacuna inmunogénica. Por medio de la vacunación autóloga de
este tipo es posible estimular de manera selectiva aquellas células
B que producen Ab3. Para esta vacunación se requieren sólo pequeñas
cantidades de la fracción de Ab2 que se puedan formular de forma
inmunogénica, mediante métodos en sí conocidos, con un coadyuvante
de vacuna adecuado.
Los anticuerpos utilizados según la invención
son, por lo tanto, anticuerpos Ab2 obtenidos de fluidos corporales
que contienen anticuerpos, dirigidos contra los anticuerpos
anti-TAA empleados para la purificación de
inmunoafinidad. Fluidos corporales que contienen anticuerpos son,
por ejemplo, sangre, plasma, suero, linfa, efusiones malignas, etc.
Se prefiere el suero como fluido corporal. El fluido corporal puede
proceder también de un organismo animal que posea fluidos corporales
portadores de anticuerpos. Se trata especialmente de vertebrados, de
forma muy preferida, de mamíferos y, de forma especialmente
preferida, el fluido corporal es de origen humano.
Dado que la inmunorrespuesta inducida por la
vacunación con anticuerpos autólogos está determinada por las
regiones de unión de estos anticuerpos, es decir, por su idiotipo,
en principio es posible utilizar con éxito, en lugar de fracciones
de anticuerpos intactos, fragmentos o derivados de estos anticuerpos
para la vacunación, siempre que éstos conserven el idiotipo de los
correspondientes anticuerpos de partida. El concepto de
"anticuerpo" abarca, por tanto, también fragmentos o derivados
de estos anticuerpos, con la misma especificidad de fijación. Como
ejemplos, aunque no limitado a ellos, se pueden citar: fragmentos de
F(ab)'_{2} y fragmentos de F(ab)', que se pueden
preparar, por ejemplo, mediante métodos bioquímicos en sí conocidos
(por ejemplo, por separación enzimática). El concepto de
"derivado" comprende, en este sentido, por ejemplo, derivados
de anticuerpos que se pueden preparar según métodos químicos o
bioquímicos en sí conocidos tales como, por ejemplo, con ácidos
grasos en anticuerpos amidados en funciones amino libres, para
elevar la lipofilia en su incorporación de liposomas. En especial,
el concepto comprende también productos que se pueden generar por
acoplamiento químico de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos con
moléculas capaces de potenciar la inmunorrespuesta tales como, por
ejemplo, el toxoide del tétanos, la exotoxina de Pseudomonas,
derivados del Lípido A, GM-CSF,
IL-2, o mediante acoplamiento químico de los
anticuerpos o fragmentos de anticuerpos con polipéptidos que
refuerzan la inmunorrespuesta tales como, por ejemplo,
GM-CSF, IL-2, IL-12,
C3d, etc. La purificación de los anticuerpos procedentes de fluidos
corporales que contienen anticuerpos, por ejemplo, del suero humano,
por purificación de inmunoafinidad puede tener lugar según métodos
conocidos por el especialista (Clin. Chem. 45 (1999), 593; J. Chem.
Technol. Biotechnol. 48 (1990), 105). Para ello, se inmoviliza un
anticuerpo específico de TAA, o una mezcla de anticuerpos, sobre una
fase sólida. La fase sólida puede ser, en este caso, una membrana,
un gel o un material semejante, al que se puede unir el anticuerpo
sin una pérdida importante de las propiedades de fijación. La unión
de los Ab2 a los anticuerpos inmovilizados se puede llevar a cabo de
manera discontinua o en un procedimiento continuo. La purificación
de inmunoafinidad se puede realizar automáticamente en un
dispositivo de cromatografía, o por medio de un procedimiento
manual. No obstante, también es posible llevar a cabo el
procedimiento mediante un dispositivo sencillo, que contiene los
anticuerpos inmovilizados, de forma manual, automática o
semiautomática. En una cromatografía de inmunoafinidad, descrita en
el Ejemplo 1, se obtienen, por lo general, 3-10
\mug de inmunoglobulina por ml de suero utilizado. En general, la
fracción de anticuerpos obtenida de esta manera está formada por IgM
e IgG. También es posible obtener a partir de una cantidad aceptable
para una extracción de sangre de, por ejemplo, 50 ml, que
proporciona aprox. 25 ml de suero, alrededor de
0,08-0,25 mg de Ab2. Esta cantidad es suficiente ya
para la vacunación. En caso que se deseen obtener cantidades mayores
de Ab2, se puede utilizar la técnica en sí conocida de
plasmaféresis, combinada con purificación de inmunoafinidad. Cuando
se utilicen múltiples anticuerpos de diversa especificidad, se
pueden usar simultáneamente estos anticuerpos inmovilizados, o se
pueden llevar a cabo purificaciones individuales de inmunoafinidad
de forma paralela o seriada.
Bajo el concepto de "antígeno asociado a
tumores" se entiende, en el marco de la presente solicitud, una
estructura que presentan preferentemente las células tumorales y que
permite una diferenciación de los tejidos no malignos.
Preferentemente, un antígeno asociado a tumores de este tipo se
encuentra localizado sobre o en la membrana celular de una célula
tumoral. No se puede excluir, sin embargo, que dichos antígenos
estén presentes en células que no hayan degenerado. Los antígenos
asociados a tumores pueden ser, por ejemplo, polipéptidos, en
especial proteínas glicosiladas, o patrones de glicosilación de
polipéptidos. Otras estructuras que pueden representar un antígeno
asociado a tumores son, por ejemplo, glicolípidos. A los mismos
pertenecen, por ejemplo, gangliósidos tales como, por ejemplo, GM2.
Adicionalmente, los antígenos asociados a tumores pueden estar
producidos por modificaciones de la composición de lípidos de la
membrana celular, que pueden ser características para las células
cancerosas.
Los más diversos anticuerpos contra diferentes
antígenos asociados a tumores se conocen desde hace tiempo, o se
pueden preparar mediante métodos conocidos (por ejemplo, tecnología
del hibridoma, técnica de presentación de fagos).
En una forma de realización preferida, los
anticuerpos obtenidos por purificación de inmunoafinidad se
administran en forma de una vacuna individual y autóloga al
individuo a partir de cuyos fluidos corporales han sido
obtenidos.
Un componente integral adicional de la presente
invención es, por lo tanto, que pueda tener lugar la obtención de
una fracción de Ab2 a partir de un fluido corporal, por ejemplo,
sangre, de un individuo por la purificación de inmunoafinidad de los
anticuerpos presentes en el fluido corporal. Como ligando se utiliza
uno o múltiples anticuerpos contra antígenos asociados a
tumores.
En este sentido, el individuo puede ser cualquier
organismo animal, preferentemente, un vertebrado, de forma
especialmente preferida un mamífero y, de manera muy especialmente
preferida, un ser humano al que no se haya administrado previamente
un anticuerpo monoclonal dirigido contra algún antígeno asociado a
tumores.
En una forma de realización preferida adicional,
se utilizan simultáneamente para la purificación de inmunoafinidad
múltiples anticuerpos contra diferentes antígenos asociados a
tumores y/o contra distintos epítopos de uno o varios antígenos
asociados a tumores.
Si para la purificación de inmunoafinidad de los
Ab2 presentes en los fluidos corporales, se utilizan simultáneamente
múltiples anticuerpos, especialmente monoclonales, contra diversos
antígenos asociados a tumores o contra distintos epítopos, se
obtiene una fracción de diferentes Ab2 basada sobre un conjunto
seleccionado de antígenos asociados a tumores y cuya utilización
simultánea como vacuna genera una inmunorrespuesta contra todos
estos antígenos asociados a tumores o epítopos. De esta forma, se
desplaza en un solo paso el equilibrio inmunológico hacia el
reconocimiento de un conjunto de antígenos asociados a tumores o
epítopos (a menudo, co-expresados). Esta forma de
proceder eleva, naturalmente, la eficacia de la inmunorrespuesta
inducida y reduce, de manera esencial, la formación de variantes
antígeno-negativas del tumor ("tumor escape"),
dado que es extremadamente improbable que una célula tumoral sea
capaz de desactivar simultáneamente la expresión de múltiples
antígenos.
El método anteriormente descrito se puede llevar
a cabo, básicamente, con todos los antígenos asociados a tumores,
tanto conocidos como recién descubiertos. Únicamente, se debe dar la
condición de que haya disponible uno o múltiples anticuerpos,
preferentemente, anticuerpos monoclonales, contra un antígeno de
estas características, que se pueda utilizar como ligando para una
purificación de inmunoafinidad. Resultan adecuadas,
fundamentalmente, todas las clases concebibles de anticuerpos, en
especial policlonales o monoclonales, prefiriéndose los anticuerpos
monoclonales. Asimismo, sería posible emplear mezclas de anticuerpos
policlonales y monoclonales. También se pueden utilizar tanto
anticuerpos monoclonales de ratón como anticuerpos de otras especies
(por ejemplo, de rata). Adicionalmente, se pueden emplear
anticuerpos monoclonales quiméricos de ratón-humano,
humanizados o humanos contra los antígenos asociados a tumores. La
capacidad de utilización de anticuerpos para la purificación de
inmunoafinidad está determinada por su región de fijación, es decir,
su idiotipo. Por consiguiente, y en principio, se pueden utilizar
con éxito, en lugar de anticuerpos intactos, fragmentos de dichos
anticuerpos para la purificación de inmunoafinidad, siempre que
estos fragmentos sigan conservando el idiotipo del correspondiente
anticuerpo de partida. Como ejemplos no limitantes cabe citar:
fragmentos de F(ab)'_{2}, fragmentos de F(ab)' y
fragmentos de Fv, que se pueden preparar según métodos bioquímicos
en sí conocidos (separación enzimática), o según métodos de biología
molecular también en sí conocidos. Evidentemente, se pueden usar
mezclas de las correspondientes clases de anticuerpos o sus
fragmentos.
La elección de los antígenos asociados a tumores
y, por lo tanto, de los anticuerpos contra estos antígenos
utilizados para la purificación de inmunoafinidad, está relacionada
con las características antigénicas de la indicación tumoral contra
la que se debe vacunar. Se mencionan, a modo de ejemplo, los
siguientes antígenos asociados a tumores ya conocidos, que se
expresan a menudo sobre diversos tumores, especialmente epiteliales,
pero el uso del método descrito en este documento para la vacunación
autóloga no está limitado de forma alguna a estos antígenos:
Molécula de Adhesión a Células Epiteliales
(Ep-CAM)
Antígeno carcino-embrionario
(CEA)
Carbohidrato Y de Lewis
Carbohidrato Tn de Sialilo
Carbohidrato H de Globo
Gangliósidos tales como GD2 / GD3 / GM2
Antígeno Específico de la Próstata (PSA)
CA 125
CA 19-9
CA 15-3
TAG-72
Receptor EGF
Molécula de Adhesión a Células Neuronales
(N-CAM)
Receptor de Her2/Neu
D 97
CD 20
CD 21
Contra todos los antígenos mencionados se han
descrito (a menudo, múltiples) anticuerpos, especialmente
monoclonales, que son adecuados, en principio, como ligandos para la
purificación de inmunoafinidad en la obtención de Ab2.
Se describen otros antígenos asociados a tumores
adicionales, por ejemplo, en DeVita et al. (Compiladores,
"Biological Therapy of Cancer", 2ª edición, Capítulo 3: Biology
of Tumor Antigenes, Lippincott Company, ISBN
0-397-5144116-6
(1995)).
En una forma de realización preferida, el
antígeno asociado a tumores es una molécula que se fija a la
membrana, que a menudo se expresa o co-expresa en
células cancerosas de origen epitelial, sobre células cancerosas de
origen neuro-endocrinológico o sobre células
cancerosas del sistema hematopoyético.
En una forma de realización preferida adicional,
la composición preparada según la invención es adecuada para la
administración múltiple de los anticuerpos que contiene.
El método descrito en este documento para la
obtención de una vacuna autóloga a partir de fluidos corporales de
un individuo no está limitado, lógicamente, a una sola
utilización.
El desplazamiento del repertorio inmunológico
desencadenado por una primera vacunación hacia la eficacia
antitumoral se puede seguir potenciando mediante la repetición de
este procedimiento; así, por ejemplo, tras algunas semanas después
de la obtención de la primera vacuna autóloga por purificación de
inmunoafinidad, se puede extraer nuevamente un fluido corporal, por
ejemplo, sangre, preparando y administrando nuevamente una vacuna
autóloga. De esta forma, se garantiza que se tenga siempre en
consideración la respectiva situación del equilibrio inmunológico en
la vacuna individual. Este procedimiento se puede llevar a cabo a
intervalos adecuados (por ejemplo, inicialmente cada
4-8 semanas y, durante el seguimiento, cada 6
meses).
La nueva composición y el método de vacunación
con anticuerpos autólogos, descritos en este documento, resultan
adecuados tanto para fines terapéuticos como para fines
profilácticos. Una vacunación terapéutica repetida de pacientes
oncológicos puede inhibir la formación de nuevas metástasis y, al
menos, retrasar la diseminación de la enfermedad. Las vacunaciones
autólogas terapéuticas pueden ser beneficiosas en especial en los
siguientes estadios de la enfermedad:
En estadios precoces de la enfermedad, por
ejemplo, tras la intervención con éxito de un tumor primario
(estadio adyuvante), las vacunaciones autólogas descritas en este
documento destruyen las células tumorales residuales diseminadas,
impidiendo, de este modo, el establecimiento de nuevas metástasis.
De esta forma, es posible prolongar el período de vida libre de
recurrencias y, por consiguiente, el tiempo total de supervivencia
de estos pacientes. Por medio de estas vacunaciones autólogas y de
las revacunaciones de recuerdo llevadas a cabo a intervalos
adecuados resulta posible, eventualmente, proporcionar una
protección durante toda la vida contra la formación de
metástasis.
Cuando se han producido ya metástasis, mediante
la composición o las vacunas autólogas descritas en este documento
es posible inhibir la extensión y formación de nuevas metástasis. De
esta forma, se estabiliza el cuadro clínico, consiguiendo una
prolongación de la esperanza de vida con el mantenimiento de la
calidad de vida.
La inducción intrínseca de Ab3 con potenciales
propiedades antitumorales, a través de la inducción de Ab2 por
inmunoterapia pasiva con anticuerpos de ratón contra antígenos
asociados a tumores (Ab1), que se administran por vía i.v. a
pacientes oncológicos, se viene postulando e investigando desde hace
varios años (por ejemplo, Korpowski et al., PNAS 81 (1984),
216-19).
La composición y las vacunaciones autólogas
descritas en este documento se pueden utilizar, en principio,
también de modo profiláctico, proporcionando una protección
aumentada contra la aparición de enfermedades oncológicas en
individuos sanos. Medidas de este tipo pueden resultar provechosas
especialmente en grupos de riesgo (por ejemplo, pertenecen a estos
grupos individuos con predisposición genética al desarrollo de
determinadas enfermedades oncológicas, lo que se puede determinar
con creciente frecuencia mediante los correspondientes ensayos).
Un antecedente general de la estrategia de la
vacunación autóloga individual descrita en este documento se basa en
el hecho de que es posible analizar la situación inmunológica del
individuo en relación con la red idiotípica, puesto que la
correspondiente vacuna se prepara, preferentemente, a partir del
fluido corporal del propio individuo, por ejemplo, suero.
Adicionalmente, el individuo inmunizado no entra
en contacto con antígenos ajenos, sino que se le trata de forma
adecuada sólo con componentes de su propio organismo, capaces de
producir una modulación del equilibrio inmunológico.
En una forma de realización preferida, los
anticuerpos obtenidos por purificación de inmunoafinidad se formulan
con un coadyuvante adecuado para vacunas.
Como es habitual en las vacunas, las fracciones
de anticuerpos autólogos, o sus fragmentos y derivados, se pueden
formular junto con coadyuvantes de vacunas. Por medio de estos
coadyuvantes se potencia la inmunorrespuesta. Como ejemplos de
coadyuvantes, pero sin estar limitados a los mismos, se pueden
mencionar; coadyuvantes que contienen aluminio, en especial,
hidróxido de aluminio (por ejemplo, Alu-Gel),
derivados de liposacáridos, Bacilo Calmette Guerin (BCG),
QS-21, preparaciones de liposomas, formulaciones con
antígenos adicionales, contra los cuales el sistema inmunológico
haya desarrollado ya una potente inmunorrespuesta, tales como, por
ejemplo, el toxoide del tétanos o componentes de virus de la gripe,
eventualmente en una preparación de liposomas.
La preparación de la vacuna se puede administrar
también para reforzar la inmunorrespuesta con correspondientes
citoquinas, preferentemente humanas, que potencian el desarrollo de
una inmunorrespuesta. Cabe mencionar en este contexto, aunque de
forma no excluyente, el factor estimulante de colonias de macrófagos
y granulocitos (GM-CSF). Esta citoquina estimula una
eficaz inmunorrespuesta por la activación de células que procesan
antígenos (por ejemplo, células dendríticas).
Eventualmente, las fracciones de anticuerpos
autólogos se pueden incubar con células dendríticas autólogas,
cultivadas ex-vivo, según métodos en sí
conocidos y publicados. Las células dendríticas pulsadas de esta
forma se vuelven a administrar finalmente al individuo. De este
modo, se puede alcanzar una inmunorrespuesta especialmente
eficaz.
En una forma de realización preferida del uso
según la invención, los anticuerpos que contiene la composición se
mezclan con un coadyuvante y se someten, seguidamente, a un
tratamiento térmico, preferentemente, a una temperatura entre 70 y
121ºC. El coadyuvante utilizado contiene, preferentemente, aluminio.
Es posible que el tratamiento térmico de este tipo desnaturalice el
antígeno de proteína, es decir, la parte inmunogénica de la
proteína, pero a través de la unión del coadyuvante, se puede
presentar al sistema inmunológico de forma correcta. Sin embargo, no
es imprescindible desnaturalizar las proteínas para obtener las
ventajas de un tratamiento térmico. Se sabe que la desnaturalización
térmica de proteínas no depende sólo de la temperatura, sino también
del espacio de tiempo durante el que la proteína está expuesta a
esta temperatura. Adicionalmente, la combinación de otros parámetros
físico-químicos tales como, por ejemplo, potencia
iónica, composición iónica, valor de pH, tipo y cantidad de la
superficie activa, es responsable de la desnaturalización de una
proteína. Es posible la aplicación de condiciones bajo las cuales
los anticuerpos no se desnaturalizan o lo hagan de forma incompleta
y/o se pueden aprovechar otros efectos tales como, por ejemplo, una
débil desorción de la superficie del coadyuvante.
Una ventaja adicional de la presente forma de
preparación de una formulación de vacuna con un coadyuvante y el
tratamiento térmico consecutivo es que resultaría posible debilitar
o inactivar patógenos infecciosos en toda la formulación. Esta
ventaja puede ser de importancia tanto en la preparación como
también en el almacenamiento y distribución de la formulación de
vacuna. De esta forma, se proporciona una mayor seguridad en
relación con patógenos conocidos y desconocidos de enfermedades
trasmisibles. Adicionalmente, en el correspondiente
acondicionamiento de una vacuna exenta de conservantes, es posible
llevar a cabo la conservación antimicrobiana de la vacuna por
calor.
Una ventaja adicional de una formulación de este
tipo es la posible inmunogenicidad aumentada de los anticuerpos,
puesto que el calentamiento puede producir al menos una
desnaturalización parcial de los anticuerpos. Esta antigenicidad
aumentada puede potenciar la inmunogenicidad especialmente en
proteínas que el sistema inmunológico reconoce como propias.
Una ventaja ulterior es la posible estabilización
adicional del complejo de anticuerpos-coadyuvante
por la inactivación térmica, es decir, la desorción del antígeno de
proteína no se produce de manera tan rápida como en las
formulaciones de antígeno-coadyuvante que no han
sido tratadas con calor. Esta ventaja permite, bajo ciertas
circunstancias, establecer intervalos de tiempo más prolongados
entre las distintas inmunizaciones.
La composición preparada según la invención se
puede administrar por métodos habituales, por ejemplo, como vacuna
por inyección subcutánea o intramuscular.
La presente invención se refiere, igualmente, a
composiciones farmacéuticas que contienen anticuerpos IgM e IgG,
obtenidos a partir de fluidos corporales que contienen anticuerpos
por purificación de inmunoafinidad, utilizándose como ligandos para
la purificación de inmunoafinidad anticuerpos capaces de reconocer
uno o múltiples antígenos asociados a tumores, o sus fragmentos con
idéntico idiotipo, y en los que el fluido corporal procede de un
individuo al que no se han administrado previamente anticuerpos
monoclonales dirigidos contra alguno de los antígenos asociados a
tumores.
Estas composiciones son adecuadas, como se ha
descrito anteriormente, como vacunas para la vacunación terapéutica
o profiláctica contra enfermedades oncológicas.
Para las formas de realización preferidas de la
preparación, de los componentes, de la formulación, de las formas de
administración, etc. de la composición farmacéutica es válido lo que
se ha mencionado ya anteriormente en relación con el uso según la
invención.
Por último, la presente invención se refiere
también a una composición farmacéutica que contiene células
dendríticas aisladas, cultivadas ex-vivo, de
un individuo, en la cual las células dendríticas han sido incubadas
previamente in-vitro con anticuerpos
obtenidos, como se ha descrito anteriormente, a partir de un fluido
corporal que contiene anticuerpos del mismo individuo por
purificación de inmunoafinidad.
Las preparaciones de anticuerpos anteriormente
descritas se pueden utilizar, según la invención, en un
procedimiento para la vacunación terapéutica o profiláctica contra
el cáncer, en el que se administran a un individuo anticuerpos que
se han obtenido por purificación de inmunoafinidad de fluidos
corporales que contienen anticuerpos, preferentemente, de fluidos
corporales del mismo individuo, utilizándose como ligandos para la
purificación de inmunoafinidad anticuerpos capaces de reconocer uno
o múltiples antígenos asociados a tumores, o sus fragmentos con
idéntico idiotipo y, en el que el fluido corporal procede de un
individuo al que no se han administrado previamente anticuerpos
monoclonales dirigidos contra alguno de los antígenos asociados a
tumores.
Las células dendríticas anteriormente descritas
se pueden utilizar, según la invención, en un procedimiento para la
vacunación terapéutica o profiláctica contra el cáncer, en el cual
se administran a un individuo células dendríticas autólogas y
aisladas, cultivadas ex-vivo, que se han
incubado previamente in-vitro con
anticuerpos, obtenidos por purificación de inmunoafinidad a partir
de fluidos corporales que contienen anticuerpos, en el que se
utilizan como ligandos para la purificación de inmunoafinidad
anticuerpos capaces de reconocer uno o múltiples antígenos asociados
a tumores, o sus fragmentos con idéntico idiotipo, procediendo el
fluido corporal de un individuo al que no se han administrado
previamente anticuerpos monoclonales dirigidos contra alguno de los
antígenos asociados a tumores.
Para las formas de realización preferidas es
válido lo que se ha mencionado anteriormente en relación con el uso
según la invención.
La presente invención se refiere también a un
procedimiento para la elaboración de una preparación de anticuerpos
que se distingue porque se obtienen por purificación de
inmunoafinidad anticuerpos a partir de un fluido corporal que
contiene anticuerpos, utilizándose como ligandos para la
purificación de inmunoafinidad anticuerpos capaces de reconocer uno
o múltiples antígenos asociados a tumores, o sus fragmentos con
idéntico idiotipo, en el cual el fluido corporal procede de un
individuo al que no se han administrado previamente anticuerpos
monoclonales dirigidos contra alguno de los antígenos asociados a
tumores.
Para los fluidos corporales, los anticuerpos
utilizados como ligandos, así como para los antígenos asociados a
tumores, es válido lo mismo que se ha mencionado anteriormente en
relación con el uso según la invención.
En una forma de realización preferida del
procedimiento según la invención, se utilizan para la purificación
de afinidad simultáneamente múltiples anticuerpos contra diversos
antígenos asociados a tumores y/o epítopos de dichos antígenos. En
este caso, cuando se usan múltiples anticuerpos para la purificación
de afinidad, éstos se utilizan simultáneamente o se pueden llevar a
cabo purificaciones de inmunoafinidad aisladas en paralelo o en
serie. Es decir, se pueden combinar diversas especificidades frente
a epítopos y/o antígenos de acuerdo con los requisitos. Estos
requisitos provienen de la expresión de diferentes antígenos
tumorales en distintos tumores individuales.
En una forma de realización especialmente
preferida, se utilizan como ligandos en la purificación de afinidad
anticuerpos monoclonales y, en una forma de realización muy
especialmente preferida, se utiliza suero como fluido corporal.
Por procedimiento según la invención se entiende
un procedimiento para la elaboración de una preparación de
anticuerpos que se usa para preparar una composición farmacéutica
adecuada como vacuna para la vacunación terapéutica o profiláctica
contra el cáncer.
Adicionalmente, la presente invención se refiere
a un procedimiento para la preparación de una composición
farmacéutica en el que se lleva a cabo un procedimiento
anteriormente descrito para la elaboración de una preparación de
anticuerpos, y en el cual la preparación de anticuerpos obtenida de
esta forma se formula, seguidamente, con un vehículo
farmacéuticamente aceptable y/o un coadyuvante de vacuna
adecuado.
En una forma de realización preferida, la
preparación de anticuerpos se mezcla con un coadyuvante,
preferentemente, un coadyuvante que contiene aluminio y, a
continuación, se somete a un tratamiento térmico, preferentemente a
una temperatura entre 70 y 121ºC.
Para las formas de realización preferidas de una
formulación farmacéutica o de vacunación es válido lo anteriormente
expuesto en relación con el uso según la invención.
En la descripción de la presente solicitud se
incorpora la totalidad de los contenidos de las patentes,
publicaciones e informes de bancos de datos citados en esta
solicitud.
Figura 1 muestra un cromatograma de una
purificación de inmunoafinidad (mediante el anticuerpo
17-1A inmovilizado) de la fracción de anticuerpos de
un mono Rhesus.
Figura 2 muestra un cromatograma (cromatografía
de separación de tamaños) de una fracción de anticuerpos purificada
por inmunoafinidad.
Figura 3 muestra la unión de anticuerpos séricos,
obtenidos por purificación de afinidad, al anticuerpo
17-1A: ELISA de 17-1A.
Figura 4 muestra el resultado de una vacunación
autóloga de un mono Rhesus: fijación de Ig sérica a células
tumorales KatoIII (ELISA celular).
Figura 5 muestra un cromatograma (cromatografía
de separación de tamaños) de una fracción de anticuerpos purificada
por inmunoafinidad (lecho mixto
anti-EpCAM/anti-Y de Lewis).
Figura 6 muestra un cromatograma de un estándar
de tamaño (separado por cromatografía de separación de tamaños).
En los Ejemplos siguientes, que explican de
manera más detallada la invención sin limitarla, se utilizaron los
siguientes materiales:
\newpage
| Placas de microtitulación: | Immuno Plate F96 MaxiSorp (Nunc) para ELISA |
| Cell Culture Cluster (Costar; Nº de Cat. 3598) para ELISA Celular | |
| Línea celular: | KATO III: línea celular de cáncer de estómago humano (ATCC HTB 103) |
| Tampón de acoplamiento: | NaHCO_{3} 0,1 M |
| NaCl 0,5 M | |
| Valor de pH 8,0 | |
| Tampón de purificación A: | PBS def |
| NaCl 0,2 M | |
| Tampón de purificación B: | Glicina / HCl 0,1 M |
| NaCl 0,2 M | |
| Valor de pH 2,9 | |
| Medio A: | RPMI 1640 + 2 g/l de NaHCO_{3} |
| 100 U/ml de penicilina G | |
| 100 \mug/ml de sulfato de estreptomicina | |
| Glutamina 4 mM | |
| Suero de ternero fetal al 10% (inactivado térmicamente) | |
| Tampón de fijación: | Na_{2}CO_{3} 15 mM |
| NaHCO_{3} 35 mM | |
| NaN_{3} 3 mM | |
| Valor de pH: 9,6 | |
| PBS deficiente (def): | NaCl 138 mM |
| KH_{2}PO_{4} 1,5 mM | |
| KCl 2,7 mM | |
| Na_{2}HPO_{4} 6,5 mM | |
| Valor de pH: 7,2 | |
| Solución de fijación: | Dialdehído glutárico al 0,1% en solución fisiológica de NaCl |
| Tampón de lavado A: | NaCl al 2% |
| Triton X-100 al 0,2% en PBS deficiente | |
| Tampón de lavado B: | Tween 20 al 0,05% en PBS deficiente |
| Tampón de bloqueo A: | Suero de ternero fetal al 5% (inactivado térmicamente) en PBS deficiente |
| Tampón de bloqueo B: | Albúmina de suero bovino al 1% |
| NaN_{3} al 0,1% en PBS deficiente | |
| Tampón de dilución A: | Suero de ternero fetal al 2% (inactivado térmicamente) en PBS deficiente |
| Tampón de dilución B: | PBS deficiente |
| Tampón colorante: | Ácido cítrico 24,3 mM |
| Na_{2}HPO_{4} 51,4 mM | |
| Valor de pH: 5,0 | |
| Sustrato: | 40 mg de dihidrocloruro de o-fenilendiamina |
| 100 ml de tampón colorante | |
| 20 \mul de H_{2}O_{2} (al 30%) |
| Solución de detención: | H_{2}SO_{4} 4N |
| Tampón de formulación: | PBS def. al 10%, pH = 6,0 |
| Solución fisiológica de NaCl al 90% |
Se suspendieron 7,5 g de
CH-Sepharose 4B (Pharmacia) durante 15 minutos en 20
ml de HCl 1 mM. A continuación, el gel se lavó con 1 litro de HCl 1
mM y, seguidamente, con 200 ml de tampón de acoplamiento sobre un
filtro de vidrio sinterizado AG3. Se dializaron 100 mg de anticuerpo
17-1A de ratón (Panorex, solución madre 10 mg/ml;
dirigido contra el antígeno asociado a tumor Ep-CAM)
contra 5 litros de tampón de acoplamiento y se ajustó con tampón de
acoplamiento a 5 mg/ml. Esta solución se mezcló con la suspensión de
gel en un recipiente cerrado. Una relación de gel:tampón de 1:2
proporciona una suspensión adecuada para el acoplamiento. Esta
suspensión se hizo rotar durante 24 horas a 4ºC. A continuación, el
exceso de ligando se separó por lavado con 3 x 30 ml de tampón de
acoplamiento. Los grupos reactivos remanentes se bloquearon por
incubación durante una hora a 4ºC con etanolamina 1M. Seguidamente,
se hizo rotar el gel durante una hora a temperatura ambiente con un
tampón de Tris-HCl 0,1 M. Cada ciclo está formado
por tampón de acetato sódico 0,1 M, pH 4, con NaCl 0,5 M y, a
continuación, tampón Tris-HCl 0,1 M, pH 8, con NaCl
0,5 M. El gel se conservó a 4ºC.
Se extrajeron 10 ml de sangre periférica de monos
Rhesus, recuperando el suero. Todo el procedimiento se llevó a cabo
bajo condiciones estériles:
La purificación de inmunoafinidad se efectuó
sobre un sistema FPLC (Pharmacia). Se incorporó 1 ml del gel
obtenido según el Ejemplo 1 en una columna HR5/5 de Pharmacia. Se
diluyeron 5 ml de suero a 1:10 con tampón de purificación A. Esta
solución se bombeó a un ritmo de 1 ml/minuto en la columna y se lavó
posteriormente con tampón de purificación A, hasta alcanzar
nuevamente la línea base UV del detector (280 nm). Las
inmunoglobulinas fijadas se eluyeron, entonces, con tampón de
purificación B y la fracción se neutralizó inmediatamente con
Na_{2}HPO_{4} 1 M después de la desorción. En la Figura 1
aparece el cromatograma de esta purificación (UV 280 nm).
50 \mul de la fracción de anticuerpos
purificada de esta forma se analizaron en una columna de separación
por tamaños (SEC, Zorbax 250 GF). Como eluyente se utilizaron tampón
fosfato 220 mM, pH 7, + acetonitrilo al 10%. Como se puede apreciar
en el cromatograma de este análisis (Figura 2), la fracción de
anticuerpos contiene IgM e IgG en una relación de aprox. 3:2. La
cantidad total de la fracción de anticuerpos ascendió a aprox. 40
\mug (determinada por SEC en comparación con un patrón
estándar).
La fracción de anticuerpos obtenida de esta
manera se analizó con un ensayo ELISA en relación con la fijación al
anticuerpo 17-1A (utilizado como ligando para la
purificación de afinidad).
Se incubaron partes alícuotas de 100 \mul del
anticuerpo contra un antígeno asociado a tumor (anticuerpo
17-1A; solución con 10 \mug/ml en tampón de
fijación), utilizado para la purificación de afinidad, en el pocillo
de una placa de microtitulación a 37ºC durante 1 hora. Después de
lavar seis veces la placa con tampón de lavado A, se agregaron
sendos 200 \mul del tampón de bloqueo A y se incubó durante 30
minutos a 37ºC. Después de lavar la placa de la forma anteriormente
descrita, se incubaron sendas partes alícuotas de 100 \mul de la
fracción de anticuerpos purificada por afinidad a analizar, así como
inmunoglobulina humana normal en la misma concentración, como
controles negativos, en diluciones de 1:4 hasta 1:65.000 en tampón
de dilución A durante 1 hora a 37ºC. Después de lavar la placa de la
forma anteriormente descrita, se agregaron sendos 100 \mul del
anticuerpo anti-Ig humana de cabra, conjugado con
peroxidasa (Zymed), en una dilución de 1:1000 en tampón de dilución
A, y se incubó durante 30 minutos a 37ºC. La placa se lavó cuatro
veces con tampón de lavado A y dos veces con tampón colorante. La
fijación del anticuerpo se determinó por la adición de sendos 100
\mul del sustrato específico, y la reacción de tinción se
interrumpió por la adición de sendos 50 \mul de solución de
detención después de aprox. 3 minutos. La evaluación se realizó
midiendo la densidad óptica (DO) a 490 nm (la longitud de onda de la
medición de referencia es 620 nm).
Como se ve en la Figura 3, la fracción de
anticuerpos purificada por afinidad muestra una evidente fijación al
anticuerpo 17-1A, en tanto que la inmunoglobulina
humana normal prácticamente no se fija.
La fracción de anticuerpos purificada por
afinidad se formuló con hidróxido de aluminio como coadyuvante según
el siguiente procedimiento:
3 ml de la solución de anticuerpos obtenida por
cromatografía de afinidad (que contiene aprox. 40 \mug de
anticuerpos) se mezclaron con 1 mg de hidróxido de aluminio
(suspensión acuosa; Alhydrogel, Superfos) y la suspensión se
centrifugó en un tubo de centrifugación "FILTRON" (Microsep®,
corte 10 kD) a 4000 x g durante 30 minutos. A continuación, se
separó 2 veces por gravedad con sendos 1 ml del tampón de
formulación, y se centrifugó a 4000 x g durante 30 minutos. La
suspensión se enrasó hasta 0,5 ml con tampón de formulación y la
suspensión obtenida de esta forma se envasó bajo condiciones
estériles.
El correspondiente mono Rhesus, a partir de cuyo
suero se obtuvo y preparó la vacuna como se ha descrito en los
Ejemplo 2 y 3, se vacunó por vía subcutánea en el lomo. Antes de
esta primera vacunación, se extrajeron 5 ml de sangre para
recuperación de suero (para la determinación del valor inicial para
la caracterización de la inmunorrespuesta). Dos semanas después, se
extrajeron nuevamente 10 ml de sangre para la recuperación de suero.
Con 4 ml de este suero se repitió la obtención de una vacuna
autóloga, de la forma anteriormente descrita. La vacuna obtenida de
nuevo se volvió a inyectar por vía subcutánea en el lomo del mono
Rhesus. 4 semanas después de esta vacunación, se volvieron a extraer
5 ml de sangre para la recuperación de suero (para determinar el
efecto de ambas vacunaciones).
Se analizaron el suero previo de este mono Rhesus
y el inmunosuero obtenido 4 semanas después de la 2ª vacunación en
un ELISA celular en relación con la fijación de anticuerpos a la
línea celular Kato III. Con este fin, se procedió del modo
siguiente:
Los pocillos de una placa de microtitulación se
incubaron con sendos 100 \mul de una suspensión celular de la
línea celular Kato III, a una concentración de 2x10^{6} células/ml
en Medio A, durante la noche, a 37ºC. Tras aspirar con succión el
sobrenadante, se incubó la placa con sendos 50 \mul de solución de
fijación por pocillo, durante 5 minutos, a temperatura ambiente.
Después de aspirar con succión el sobrenadante, se agregaron
mediante una pipeta sendos 200 \mul de tampón de bloqueo B y se
incubó la placa durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de
lavar dos veces con sendos 200 \mul de tampón de lavado B, se
incubaron sendas partes alícuotas de 100 \mul de los sueros de
mono a analizar en diluciones de 1:4 hasta 1:56.000 en tampón de
dilución B durante 1 hora a 37ºC. Después de lavar dos veces la
placa con sendos 100 \mul de tampón de lavado B helado, se
agregaron sendos 100 \mul de un anticuerpo anti-Ig
humana de cabra, conjugado con peroxidasa (Zymed), en una dilución
de 1:1000 en tampón de dilución A, incubando durante 45 minutos a
37ºC. La placa se lavó tres veces con sendos 100 \mul de tampón de
lavado B helado. La fijación de anticuerpos se determinó por la
adición de sendos 100 \mul del sustrato específico, y la reacción
de tinción se interrumpió mediante la adición de sendos 50 \mul de
solución de detención tras aprox. 5 minutos. La evaluación se
realizó por medición de la densidad óptica (DO) a 490 nm (la
longitud de onda de la medición de referencia es 620 nm).
Como se ve en la Figura 4, en el inmunosuero del
mono Rhesus sometido a vacunación autóloga se encuentran
inmunoglobulinas capaces de fijarse a las células tumorales Kato
III, en tanto que en el suero previo del mismo animal apenas pueden
detectarse estos anticuerpos.
Basándose en los resultados de los ensayos
anteriormente descritos se demuestra, por ejemplo, que la vacunación
con fracciones de anticuerpos autólogos individuales, obtenidos por
purificación de inmunoafinidad en un anticuerpo contra un antígeno
asociado a tumores, se desencadenó una inmunorrespuesta humoral que
se fija a células tumorales humanas que expresan este antígeno
asociado a tumores.
Se acoplaron por procedimientos estándares un
anticuerpo monoclonal de ratón, que reacciona con
Ep-CAM, y un anticuerpo monoclonal de ratón, que
reacciona con Y de Lewis, a CH-Sepharose activada 4B
(Pharmacia Biotech, Suecia): se suspendieron e hincharon 7,5 g de
CH-Sepharose 4B durante 15 minutos en 20 ml de HCl 1
mM. Entonces, el gel se lavó con 1 litro de HCl 1 mM y, a
continuación, con 200 ml de tampón de acoplamiento, sobre un filtro
de vidrio sinterizado AG3. Se dializaron 100 mg de anticuerpo de
ratón (solución madre 10 mg/ml) contra 5 litros de tampón de
acoplamiento y se ajustaron con tampón de acoplamiento a 5 mg/ml.
Esta solución se mezcló con la suspensión de gel en un recipiente
cerrado. Una relación de gel:tampón de 1:2 proporciona una
suspensión adecuada para el acoplamiento. Esta suspensión se hizo
rotar durante 24 horas a 4ºC. Seguidamente, se separó el exceso de
ligando lavando con 3x30 ml de tampón de acoplamiento. Los grupos
reactivos remanentes se bloquearon mediante incubación durante una
hora a 4ºC con etanolamina 1M. A continuación, el gel se hizo rotar
durante una hora a temperatura ambiente con un tampón de
Tris-HCl 0,1 M. Por último, se lavó el gel con 3
ciclos de tampones con pH alternante. Cada ciclo está compuesto por
tampón de acetato sódico 0,1 M, pH 4, con NaCl 0,5 M y, a
continuación, tampón de Tris-HCl 0,1 M, pH 8, con
NaCl 0,5 M. El gel se conservó a 4ºC.
Se mezclaron volúmenes iguales de ambas matrices
de afinidad y se empacaron como columna de cromatografía de
inmunoafinidad (System Äkta, Pharmacia, Suecia).
Se extrajeron aproximadamente 20 ml de sangre de
monos Rhesus no sometidos previamente a ensayos inmunológicos,
purificando sendos 9 ml de suero por medio de la columna de
cromatografía de inmunoafinidad descrita en el Ejemplo 5 (System
Äkta, Pharmacia, Suecia).
Tampón de trabajo: tampón de purificación A
Tampón de elución: tampón de purificación B
El eluato se neutralizó con solución 0,5 M de
hidrógeno-fosfato sódico.
Los eluatos se fraccionaron de manera que las
proteínas purificadas se encontraron presentes en elevadas
concentraciones.
50 \mul de la fracción de anticuerpos
purificada se analizaron en una columna de separación por tamaños
(SEC, Zorbax 250 GF). Como eluyente se utilizaron tampón fosfato 220
mM, pH 7, + acetonitrilo al 10% (caudal: 1.000 ml/min; longitud de
onda 214 nm). Como se aprecia en el cromatograma de este análisis
(Figura 5), la fracción de anticuerpos contiene IgM (tiempo de
retención 6,963 min) e IgG (tiempo de retención 8,745 min) en una
relación de aprox. 3:2. La cantidad total de la fracción de
anticuerpos ascendió a aprox. 50 \mug (determinada por SEC en
comparación con un patrón estándar, Figura 6).
La vacuna se formuló en unidades de
ultrafiltración para centrifugar (Centricon 10; Arnicon, EE.UU.).
Adicionalmente, las unidades de ultrafiltración se lavaron por
centrifugación mediante tampón de Na-fosfato 1 mM,
NaCl al 0,86%, pH 6,0, (NBK).
A continuación, se depositó 1 ml de tampón (NBK)
y se agregaron 37 \mul de Alhydrogel al 2% (Superfos Biosector,
Dinamarca).
Tras la adición del eluato neutralizado del
Ejemplo 6, se centrifugó de acuerdo con las instrucciones de
Centricon y se lavó (con 5 ml de tampón).
Seguidamente, se resuspendió la vacuna, se enrasó
hasta 550 \mul con tampón y se envasó bajo condiciones
estériles.
De forma alternativa, la vacuna se enrasó,
después de la resuspensión, con tampón hasta 545 \mul y se mezcló
con 5,5 \mul de solución madre de timerosal (10 mg/ml, Sigma,
EE.UU.).
Una tercera variante de la formulación de la
vacuna se desnaturalizó por calor (121ºC; 20 min) en un autoclave
tras su envasado estéril en viales de vidrio.
Claims (24)
1. Uso de anticuerpos para la preparación de una
composición farmacéutica adecuada como vacuna para la vacunación
terapéutica o profiláctica contra el cáncer, caracterizado
porque los anticuerpos se obtienen a partir de fluidos corporales
que contienen anticuerpos por purificación de inmunoafinidad, en la
que se utilizan como ligandos para la purificación de inmunoafinidad
anticuerpos capaces de reconocer uno o múltiples antígenos asociados
a tumores, o sus fragmentos con idéntico idiotipo, y en el que los
fluidos corporales proceden de un individuo al que no se han
administrado previamente anticuerpos monoclonales dirigidos contra
alguno de los antígenos asociados a tumores.
2. Uso según la reivindicación 1, en el que la
composición farmacéutica está destinada a la administración al
individuo a partir de cuyos fluidos corporales se han obtenido los
anticuerpos, en forma de una vacuna autóloga individual.
3. Uso según la reivindicación 1 ó 2, en el que
el fluido corporal es suero.
4. Uso según una de las reivindicaciones 1 a 3,
en el que el individuo es un ser humano.
5. Uso según una de las reivindicaciones 1 a 4,
en el que para la purificación de inmunoafinidad se utilizan,
simultáneamente, múltiples anticuerpos contra diferentes antígenos
asociados a tumores, y/o diferentes epítopos de estos antígenos.
6. Uso según una de las reivindicaciones 1 a 5,
en el que los anticuerpos utilizados con ligandos para la
purificación de inmunoafinidad son anticuerpos monoclonales.
7. Uso según una de las reivindicaciones 1 a 6,
en el que la composición farmacéutica se prepara repetidamente y
está destinada a la administración repetida y consecutiva, a
intervalos adecuados, como vacuna individual.
8. Uso según una de las reivindicaciones 1 a 7,
en el que los antígenos asociados a tumores son moléculas expresadas
y/o co-expresadas frecuentemente, situadas sobre la
membrana de células cancerosas de origen epitelial, o sobre células
cancerosas de origen neuro-endocrino, o sobre
células cancerosas del sistema hematopoyético.
9. Uso según una de las reivindicaciones 1 a 8,
en el que los anticuerpos purificados por inmunoafinidad, o sus
derivados, se formulan junto con un coadyuvante de vacuna
adecuado.
10. Uso según una de las reivindicaciones 1 a 9,
en el que la composición contiene, adicionalmente, una proteína que
potencia la inmunorrespuesta y que se administra simultáneamente con
los anticuerpos.
11. Uso según la reivindicación 10, en el que la
proteína es una proteína humana.
12. Uso según la reivindicación 11, en el que la
proteína humana es el factor estimulante de colonias de granulocitos
y macrófagos (GM-CSF).
13. Uso según una de las reivindicaciones 1 a 12,
en el que la composición es adecuada para la administración de los
anticuerpos purificados por inmunoafinidad como vacuna por inyección
subcutánea o intramuscular.
14. Uso según una de las reivindicaciones 1 a 13,
en el que los anticuerpos contenidos en la composición se mezclan
con un coadyuvante y se someten a un tratamiento térmico.
15. Uso de células dendríticas aisladas de un
individuo, cultivadas ex-vivo, para la
preparación de una composición farmacéutica adecuada como vacuna
para la vacunación terapéutica o profiláctica contra el cáncer, en
el que las células dendríticas se han incubado previamente
in-vitro con anticuerpos, obtenidos a partir
de un fluido corporal que contiene anticuerpos del mismo individuo,
por purificación de inmunoafinidad, utilizándose como ligandos para
la purificación de inmunoafinidad anticuerpos capaces de reconocer
uno o múltiples antígenos asociados a tumores, o sus fragmentos con
idéntico idiotipo, y en el que el fluido corporal procede de un
individuo al que no se han administrado previamente anticuerpos
monoclonales dirigidos contra alguno de los antígenos asociados a
tumores.
16. Preparación farmacéutica que contiene
anticuerpos IgM e IgG, obtenidos por purificación de inmunoafinidad
a partir de fluidos que contienen anticuerpos, en la que se utilizan
como ligandos para la purificación de inmunoafinidad anticuerpos
capaces de reconocer uno o múltiples antígenos asociados a tumores,
o sus fragmentos con idéntico idiotipo, y en la que los fluidos
corporales proceden de un individuo al que no se han administrado
previamente anticuerpos monoclonales dirigidos contra alguno de los
antígenos asociados a tumores.
17. Composición farmacéutica que contiene células
dendríticas aisladas de un individuo, cultivadas
ex-vivo, en la que las células dendríticas
han sido incubadas previamente in-vitro con
anticuerpos procedentes de un fluido corporal que contiene
anticuerpos del mismo individuo, obtenidos por purificación de
inmunoafinidad, utilizándose como ligandos para la purificación de
inmunoafinidad anticuerpos capaces de reconocer uno o múltiples
antígenos asociados a tumores, o sus fragmentos con idéntico
idiotipo, y en la que el fluido corporal procede de un individuo al
que no se han administrado previamente anticuerpos monoclonales
dirigidos contra alguno de los antígenos asociados a tumores.
18. Procedimiento para la elaboración de una
preparación de anticuerpos, caracterizado porque a partir de
un fluido corporal que contiene anticuerpos se obtienen anticuerpos
por purificación de inmunoafinidad, utilizándose como ligandos para
la purificación de inmunoafinidad anticuerpos capaces de reconocer
uno o múltiples antígenos asociados a tumores, o sus fragmentos con
idéntico idiotipo, y en el cual el fluido corporal procede de un
individuo al que no se han administrado previamente anticuerpos
monoclonales dirigidos contra alguno de los antígenos asociados a
tumores.
19. Procedimiento según la reivindicación 18, en
el que se utilizan simultáneamente para la purificación de
inmunoafinidad múltiples anticuerpos contra diferentes antígenos
asociados a tumores y/o epítopos de estos antígenos.
20. Procedimiento según la reivindicación 18 ó
19, en el que los anticuerpos utilizados en la purificación de
inmunoafinidad son anticuerpos monoclonales.
21. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 18 a 20, en el que el fluido corporal es suero.
22. Procedimiento para la preparación de una
composición farmacéutica, caracterizado porque se elabora una
preparación de anticuerpos según un procedimiento de acuerdo con una
de las reivindicaciones 18 a 21, y porque la preparación de
anticuerpos obtenida de esta forma se formula seguidamente con un
vehículo farmacéuticamente aceptable y/o un coadyuvante de vacuna
adecuado.
23. Procedimiento según la reivindicación 22, en
el que la preparación de anticuerpos se mezcla con un coadyuvante y,
a continuación, se somete a un tratamiento térmico.
24. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 18 a 21, en el que la purificación de
inmunoafinidad es la única etapa de purificación.
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