MXPA98009586A - Metodo y composicion para la reconformacion de antigenos multiepitopicospara iniciar una respuestainmunitaria - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a los métodos y a las composiciones para la iniciación y/o el incremento de la respuesta inmune, poniendo e respuesta inmune, poniendo en contacto un agente de enlazamiento con un antígeno soluble, en donde el par antígenoreactivo de enlazamiento genera una respuesta inmune al antígeno.

Description

COMPOSICIÓN FARMACÉUTICA PARA LA RECONFORMACION DE ANTÍGENOS MULTI-EPITÓPICOS PARA INICIAR UNA RESPUESTA INMUNITARIA CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a una composición farmacéutica para iniciar y/o reforzar una respuesta inmunitaria in vivo .

ANTECEDENTES DE IA INVNECIÓN Todos los vertebrados tienen un sistema inmunológico. La habilidad de los vertebrados para protegerse por sí mismos contra microbios infecciosos, toxinas, virus, u otras macromoléculas extrañas se refiere como inmunidad. La inmunidad es altamente específica; tal especificidad es una característica fundamental de las respuestas inmunitarias . La mayoría de las respuestas del sistema inmunológico inician la destrucción y la eliminación de los organismos invasores y de cualquier molécula tóxica producida por el mismo organismo. Debido a que la naturaleza de estas reacciones inmunitarias son inherentemente destructivas, es esencial que la respuesta sea limitada precisamente a las moléculas extrañas y no a aquéllas propias del hospedero. Esta habilidad para distinguir entre las moléculas extrañas y las moléculas propias es otra modalidad fundamental del sistema inmunológico . La técnica distingue entre la inmunidad natural y adquirida o inmunidad específica. La inmunidad natural está comprendida por mecanismos de defensa que están activos antes de la exposición a microbios o macromoléculas extrañas, los cuales no se ven incrementados por dicha exposición y no hacen distinción entre la mayoría de las substancias extrañas al cuerpo. Los efectores de la inmunidad natural son las barreras físicas como la piel o las membranas mucosas, las células fagocíticas como los macrófagos o neutrófilos, una clase linfocitos denominados células exterminadoras (o matadoras) naturales y el sistema de complemento. El complemento es un complejo de proteínas de suero que es destructivo para ciertas bacterias y otras células sensibles a través de los anticuerpos que fijan el complemento específico, su actividad se efectúa mediante una serie de interacciones que resultan de la escisión proteolítica y que pueden seguir una de por lo menos dos rutas. En los vertebrados, los mecanismos de inmunidad natural y específica cooperan dentro del sistema de defensa del hospedero, para eliminar a los invasores extraños. En adición a los microbios, las células cancerosas, los parásitos y las células infectadas por los virus, el sistema inmunológico, a la vez, reconoce y elimina células o tejidos transplantados al sujeto a partir de un individuo genéticamente diferente de la misma especie (aloinjertos) o de especie diferente (xenoinjertos) . La inmunidad específica o adquirida comprende a los mecanismos de defensa los cuales son inducidos o estimulados mediante la exposición a substancias extrañas. Los eventos mediante los cuales los mecanismos de inmunidad específica se vuelven una defensa para combatir substancias extrañas, se denomina respuesta inmunitaria. Los vertebrados tienen dos clases amplias de respuestas inmunológicas : las respuestas con anticuerpos o inmunidad humoral, y las respuestas inmunológicas mediadas por células o inmunidad celular. La inmunidad humoral se proporciona mediante los linfocitos B que, después de la proliferación y diferenciación, producen anticuerpos (proteínas conocidas también como inmunoglobulinas) que circulan en la sangre y en el fluido linfático. Estos anticuerpos se unen específicamente al antígeno que los indujo. La unión al anticuerpo inactiva a la substancia extraña, por ejemplo un virus, al bloquear la capacidad de la substancia para unirse a los receptores de una célula. La respuesta humoral se defiende principalmente contra las fases extracelulares de las infecciones bacterianas y virales. En la inmunidad humoral, el suero por sí solo puede transferir la respuesta y los efectores de la respuesta son moléculas de proteínas solubles llamados anticuerpos . La segunda clase de respuestas inmunitarias, la inmunidad celular, implica la producción de células especializadas, por ejemplo, los linfocitos T que reaccionan con antígenos extraños en la superficie de otras células hospederas. La respuesta inmunitaria celular es particularmente efectiva contra hongos, parásitos, infecciones virales intracelulares, células cancerosas y otra materia extraña. De hecho, la mayoría de los linfocitos T desempeñan un papel regulador en la respuesta inmunitaria, actuando ya sea para aumentar o suprimir las respuestas de los otros leucocitos sanguíneos. Estas células, llamadas células T cooperadoras y células supresoras T respectivamente, son referidas conjuntamente como células de regulación. Otros linfocitos T llamados linfocitos T citotóxicas, matan a células infectadas con virus. Ambas linfocitos T citotóxicas y linfocitos B se desarrollan directamente como una defensa contra la infección y son referidas conjuntamente como células efectoras . El curso de la respuesta inmunitaria se subdivide en la fase cognitiva o de reconocimiento, durante la cual los linfocitos específicos reconocen al antígeno extraño; la fase de activación, durante la cual los linfocitos específicos responden al antígeno extraño y la fase efectora, durante la cual los linfocitos activados por antígenos intervienen en los procesos requeridos para eliminar el antígeno. Los linfocitos son células inmunitarias especializadas en regular y dirigir las respuestas inmunitarias específicas. Las linfocitos T y las células B se hacen distinguibles morfológicamente solo después de que hayan sido estimuladas mediante un antígeno. El sistema inmunológico ha evolucionado de tal forma que es capaz de reconocer las características de superficie de las macromoléculas que no son constituyentes normales del hospedero. Como se mencionó anteriormente, una molécula extraña la cual es reconocida mediante el sistema inmunológico (por ejemplo, unida a anticuerpos), sin importar si puede o no evocar una respuesta, se denomina "antígeno", y la porción del antígeno a la cual se une un anticuerpo se llama "determinante antigénico" o "epítope". Algunos antígenos, por ejemplo los antígenos asociados a tumores, tales como los antígenos del cáncer ovárico o del cáncer de mama, tienen múltiples sitios para unirse con los anticuerpos. Estos antígenos se denominan antígenos "multi-epitópicos" . Cuando el antígeno es un polipéptido, se acostumbra clasificar a los epítopes como lineales (por ejemplo, están compuestos de una secuencia continua de aminoácidos repetida a lo largo de la cadena del polipéptido) o no lineales (por ejemplo, están compuestos de aminoácidos que se ponen en proximidad, como resultado del plegado de la cadena del polipéptido) . Los epítopes no lineales también se denominan "conformacionales", debido a que surgen del plegado de la cadena del polipéptido en una conformación particular, por ejemplo una forma tridimensional distintiva. Por la naturaleza altamente específica de las uniones antígeno-anticuerpo, un medio primario para distinguir entre antígenos o entre los diferentes epítopes en el mismo antígeno, lo constituyen las propiedades de unión al anticuerpo. Para enfrentar a la inmensa variedad de epítopes encontrados, el sistema inmunológico en los individuos mamíferos contiene una variedad extremadamente grande de linfocitos, aproximadamente 2xl012. Cada clona de linfocito existente contiene receptores de superficie específicos para un epítope. Se estima que el sistema inmunológico del mamífero puede distinguir al menos 108 determinantes antigénicos distintos. Incluso un solo determinante antigénico en general activará a muchas clonas, cada una de las cuales produce un sitio de unión a antígeno con sus propias características de afinidad por el determinante. Los antígenos que estimulan la producción de cientos de especies de anticuerpos, cada uno obtenido mediante una clona de célula B diferente, se dice que producen una respuesta policlonal. Cuando solo unas pocas clonas responden, se dice que la respuesta es oligoclonal; cuando la respuesta total se hace mediante una solo clona de la célula T, se dice que la respuesta es monoclonal. La respuesta para la mayoría de los antígenos es policlonal. Una respuesta inmunitaria primaria o inicial a un antígeno extraño aumenta la habilidad del sistema inmunológico para responder otra vez a tal antígeno. Esta modalidad de la inmunidad específica se llama memoria inmunológica o respuesta inmunitaria secundaria. Las respuestas inmunitarias secundarias son frecuentemente más efectivas que las respuestas primarias. La definición convencional de un antígeno es una substancia que puede inducir, en un hospedero vertebrado, la formación de un anticuerpo específico o la generación de una población de linfocitos reactivos a la substancia. Como sucede frecuentemente en la ciencia, se sabe que esta definición, aunque precisa, no es completa. Por ejemplo, hoy día se sabe que algunas condiciones de enfermedades suprimen o inactivan la respuesta inmunitaria del hospedero. Bajo estas condiciones, un antígeno tumoral no induce un anticuerpo ni genera linfocitos específicos. Por lo tanto, no todos los antígenos son capaces de inducir una respuesta inmunitaria humana. La falla en la definición se centra en dos aspectos separados de la respuesta inmunitaria; la primera etapa en la respuesta inmunitaria es el reconocimiento de la presencia de una entidad o cuerpo extraño, la segunda etapa es una cascada compleja de reacciones, es decir, la respuesta. En el ejemplo del antígeno tumoral que se menciona antes, el sistema inmunológico puede reconocer la presencia de un antígeno extraño, pero no puede responder. En otro ejemplo, una falla en la habilidad del sistema inmunológico para distinguir entre lo propio y lo no-propio parece ser el origen de la mayoría de las enfermedades autoinmunes. Otra vez, esto es una falla en reconocimiento y no una respuesta. Por lo tanto, como se menciona en la presente, si un antígeno pude ser reconocido por el sistema inmunológico se dice que es antigénico. Sí el sistema inmunológico puede también tener una respuesta activa contra el antígeno, se dice que es inmunogénico. Los antígenos inmunogénicos son usualmente macromoléculas (como proteínas, ácidos nucleicos, carbohidratos y lípidos) de al menos 5000 Daltons de peso molecular. Las moléculas no inmunogénicas más pequeñas, por ejemplo haptenos y moléculas antigénicas pequeñas pueden estimular una respuesta inmunitaria si se asocian con una molécula acarreadora de tamaño suficiente. Los anticuerpos, los efectores de la inmunidad humoral son secretados por células plasmáticas y están entre los componentes más abundantes de la sangre. Las células plasmáticas son células de la etapa final madura que parecen tener una trayectoria de vida relativamente corta. Éstas se producen cuando un antígeno entra en el sistema inmunológico humano y, en una serie compleja de interacciones celulares, activan a los linfocitos B. Los linfocitos B luego proliferan y se diferencian para formar células plasmáticas. Cada uno de los linfocitos B se programan por su ADN para formar una molécula de anticuerpo de una sola especificidad. Los linfocitos B forman dos formas especiales de está molécula, una que permanece sujeta a la superficie exterior de la membrana de la célula como un receptor de membrana, típicamente para unir el antígeno a la célula B y una que es secretada. Los anticuerpos que también son conocidos como inmunoglobulinas, son proteínas. Estos tienen dos funciones principales. La primera es reconocer (unirse a) los antígenos extraños. La segunda es movilizar otros elementos del sistema inmunológico para destruir el cuerpo extraño. Las estructuras de reconocimiento del antígeno de un anticuerpo son dominios variable y son responsables de la unión del antígeno. Las estructuras de movilización del sistema inmunológico, la segunda función del anticuerpo, son dominios constantes; estas regiones están encargadas de las diversas funciones efectoras: estimulación de las células B para la proliferación y diferenciación, activación del complemento del sistema de lisis de la célula, opsonización, atracción de macrofagos para ingerir al invasor, etc. Los anticuerpos de diferentes isotipos tienen dominios diferentes constantes y, por lo tanto, tienen funciones efectoras diferentes. Los isotipos más estudiados son IgG y IgM. El anticuerpo por si mismo es una molécula oligomérica, clasificada, de conformidad a su estructura, en una clase (por ejemplo IgG) y subclase (por ejemplo IgGl) . Las moléculas IgG son los componentes más importantes de la respuesta inmunitaria humoral y se componen de dos cadenas pesadas (largas) y dos ligeras (cortas) unidas mediante enlaces disulfuro en una configuración "Y" . La molécula tiene dos regiones variables (en las ramas de la "Y") . Las regiones son así nombradas debido a que los anticuerpos de una subclase particular, producidos por un individuo particular en respuesta a antígenos diferentes, serán diferentes en la región variable pero no en las regiones constantes. Las regiones variables están compuestas tanto de una estructura relativamente invariable como de lazos hipervariables, los cuales proporcionan sobre el anticuerpo su especificidad a un epítope articular. Un anticuerpo se une a un epítope de un antígeno como resultado de la co plementariedad molecular. Las porciones del anticuerpo que participan directamente en la interacción se llama "sitio de unión del antígeno" o "paratopo". Los antígenos unidos mediante un anticuerpo particular son llamados "antígenos cognados". Un anticuerpo de un animal se verá como un antígeno extraño en el sistema inmunológico de otro animal y, por lo tanto, dará una respuesta inmunitaria. Algunos de los anticuerpos resultantes serán específicos para los epítopes únicos (idiotipo) de la región variable del anticuerpo inmunizante y, por lo tanto, se les denomina anticuerpos anti-idiotípicos . Éstos frecuentemente tienen características inmunológicas similares a las de un antígeno cognado al anticuerpo inmunizante. Por otra parte, los anticuerpos anti-isotípicos se unen a los epítope en la región constante del antígeno inmunizante. Como se mencionó anteriormente, las células que regulan la inmunidad mediada por células son una clase de linfocitos llamados linfocitos T. Éstos surgen finalmente de la misma célula madre de los linfocitos B, sin embargo, estos siguen una ruta muy diferente de desarrollo en la cual el timo tiene un papel importante. Los linfocitos T también expresan receptores de superficie específicos de antígeno, aunque la forma en la que reconocen a los antígenos es diferente a la empleada para las células B. Los linfocitos T existen en dos categorías funcionales: aquéllos con función determinante específica (linfocitos T citotóxicos o "CTL") y aquéllos con función reguladora. Los linfocitos T reguladores son requeridos para el desarrollo de células plasmáticas a partir de las células B. Los linfocitos T cooperadoras (TH) producen una regulación intensa específica al antígeno, en la respuesta inmunitaria. Las respuestas inmunitarias también pueden sufrir regulación disminuida específica del antígeno activo. Un gran volumen de evidencias resultado de estudios con animales y cultivos de tejidos describen la presencia de población de linfocitos T supresores (TS) que proporcionan esta regulación inhibitoria. Los linfocitos en un individuo responden específicamente a antígenos extraños, pero comúnmente no responden a las substancias antigénicas potencialmente nativas a tal individuo. La falta de respuesta inmunológica se denomina tolerancia. La auto-tolerancia se adquiere en una etapa de desarrollo anterior cuando los propios linfocitos reconocimiento potenciales se ponen en contacto .con antígenos propios, lo que evita que se desarrollen hasta una etapa en la cual serán capaces de responder positivamente a los propios antígenos. El sistema inmunológico tiene dos rutas de regulación mediadas de citocina que determinan si la respuesta a una sensibilización antigénica será principalmente una respuesta celular (ruta TH1) o principalmente una respuesta humoral (ruta TH2) . La ruta celular está caracterizada por la producción de linfocitos T cooperadoras del interleucina-2 (IL-2) o interferón-?. Esta ruta interviene en la respuesta hipersensibilidad tipo retardada (DTH) , la generación de linfocitos T citotóxicos y la activación del macrófaga. La respuesta TH2 promueve la producción, mediante los linfocitos T, de una variedad de citocinas, como interleucina-4 (IL-4) e interleucina-10 (IL-10) . Esta respuesta se identifica mediante la producción de anticuerpos específicos en un título elevado. La tendencia a predominar, ya sea de la intervención de las células o la respuesta inmunitaria humoral, se cree es una consecuencia de regulación cruzada. Por lo tanto, las linfocitos TH1 inhibirán la inducción de respuestas TH2, por ejemplo, mediante la secreción del interferon-?. Contrariamente, las linfocitos TH2 pueden inhibir la generación de las respuestas de TH-1 mediante la producción de citocinas como IL-4 y IL-10. Las respuestas TH2 pueden exacerbar el desarrollo de ciertas enfermedades. Es bien sabido en la técnica que las inyecciones de pequeñas cantidades de antígenos inmunizantes preferentemente inducirán respuestas de hipersensibilidad de tipo retardado, indicativas de la inmunidad mediada por células, mientras que la vacunación con grandes cantidades de antígeno dará por resultado una respuesta inmunitaria humoral pronunciada, como se refleje por el alto título de anticuerpos. Sin embargo, mediante este método es difícil evitar una elevada respuesta IgG y lograr una respuesta celular prolongada y elevada, y dependiendo del antígeno, las dosis pequeñas pueden ser insuficientes para obtener una respuesta CMI suficientemente fuerte para ser útil. Normalmente, una respuesta inmunitaria progresa hacia los mecanismos efectores característicos de los linfocitos B y T. Sin embargo, en el transcurso de la mayoría de las respuestas inmunitarias, ya sea los linfocitos B o T asumen un papel dominante, con menos participación substancial de los otros tipos respectivos de linfocitos. Las respuestas inmunitarias cuyos mecanismos efectores son regulados preponderantemente a través de las células B y anticuerpos, son respuestas inmunitarias humorales. Estas respuestas en donde los linfocitos T regulan las funciones efectoras más importantes son respuestas inmunitarias celulares o mediadas por células. Como se ha mencionado antes, las células que regulan la inmunidad humoral son una clase de linfocitos llamados células B. Cada una de las clonas de los linfocitos B expresan inmunoglobulinas de membrana (Ig's de membrana, moléculas de anticuerpo unidas a la superficie) que funcionan como receptores de antígeno que tienen un epítope único para una clona de linfocito B. Estas moléculas Ig de membrana son la única fuente de especificidad de las células B. Los antígenos que contienen un epítope o plementario a la Ig de membrana se unirá al receptor de antígeno. Tales antígenos también reciben el nombre de antígenos cognado del anticuerpo. La unión al receptor antígeno (Ig de membrana) resultará en la diferenciación y la proliferación clonal del linfocito-B. Una parte de su progenie se diferenciará en células plasmáticas maduras, las cuales están especializadas en la síntesis de los anticuerpos que corresponden, en la especificidad del epítope, a la Ig de membrana mediante la cual el linfocito-B se unió inicialmente el antígeno. La unión de un antígeno a un anticuerpo es reversible. Se regulará mediante la suma de las muchas fuerzas no-covalentes relativamente débiles, incluyendo los enlaces hidrógeno e hidrofóbicos, las fuerzas Van der Waals y las interreacciones iónicas. Estas fuerzas débiles son efectivas solo cuando la molécula del antígeno está lo suficientemente cerca para permitir que algunos de sus átomos se encajen en rebajes complementarios sobre la superficie del anticuerpo. Las regiones complementarias de una unidad de anticuerpo de cuatro cadenas son sus dos sitios de unión al antígeno, idénticos; la región correspondiente sobre el antígeno es un determinante antigénico. Muchas macromoléculas antigénicas tienen muchos determinantes antigénicos diferentes. Por muchos años, las vacunas vivas atenuadas han sido usadas para inducir inmunidad contra las infecciones virales como la influenza y la polio. Estas preparaciones contienen viriones vivos que causan infecciones subclínicas leves en los individuos vacunados. En el curso de tales infecciones, los vectores virales entran a ciertas células hospederas y codifican la síntesis de proteínas específicas de virus. Estas proteínas antigénicas producidas endógenamente, son procesadas en péptidos más pequeños y presentados en el contexto de los antígenos I y II de la clase MHC, con lo cual reclutan linfocitos THl e inducen respuestas inmunitarias en las que intervienen células (mediadas por células) . Las células tumorales expresan ciertos antígenos de superficie celular ("antígenos asociados al tumor"). Los antígenos asociados al tumor están presentes en el suero y en el tejido de los pacientes con cáncer. La mayoría de tales antígenos son también expresados en los tejidos embriónicos, y, a niveles bajos, en el tejido y el suero de los individuos sanos. La mayoría de los antígenos asociados al tejido son glicoproteínas, glicolípidos o mucopolisacáridos. La mayoría de los antígenos tumorales son producidos por células diferenciadas. Estas son producidas en cantidades mucho más grandes por las células tumorales que por las células normales diferenciadas. El sistema inmunológico humano reconoce los antígenos tumorales como antígenos nativos y no responde ("auto-tolerancia") . Los mecanismos que conducen la auto-tolerancia solo se comprenden parcialmente, pero ahora queda claro que se establecen ampliamente durante el desarrollo del sistema inmunológico. Si las células B inmaduras o los linfocitos T son estimulados a través de sus receptores específicos de antígeno en una etapa crítica (por ejemplo justo después de la expresión de sus receptores sobre la superficie de la célula, pero antes de empezar a madurar) son inducidos a morir en lugar de empezar a activarse. Esa etapa ocurre en la médula ósea para las células B y en el timo para los linfocitos T. Por lo tanto, se inducirá tolerancia a los propios antígenos expresados en estos ambientes, pero no para aquéllos que no son expresados. Se ha demostrado que los individuos normales tienen células B madura capaces del reconocimiento de algunos de los antígenos, pero estas células B no están activadas. Las células T cooperadoras apropiadas (TH) parecen estar ausentes . Para tumores que tienen antígenos, existen al menos cuatro teorías de por qué la respuesta inmunitaria puede fracasar en destruir un tumor: 1) no existen células B ni linfocitos T citotóxicos (CTL) capaces de reconocer el tumor; 2) no existen linfocitos TH capaces del reconocimiento del tumor; 3) los linfocitos TS empiezan a activarse antes que los linfocitos TH, previniendo así la activación de los linfocitos CTL y las células B; y 4) los genes de regulación de la proliferación del tumor pueden estar presentes desde el nacimiento, de manera que el hospedero no trata a los productos del gen como "extraños".

SOLUCIONES EXISTENTES Cuando los antígenos tumorales aparecen con selectividad suficiente sobre un tumor (por ejemplo, los antígenos tumorales están ausentes o presentes solo en cantidades pequeñas en sus duplicados celulares normales) , el antígeno tumoral puede servir como un posible blanco para un agente inmunoterapéutico . La mayoría de estos antígenos tumorales selectivos son carbohidratos o glicoproteína (mucina) de la naturaleza. Por ejemplo, la mayoría de las células del adenocarcinoma expresan y secretan abundantemente mucinas.

Esto se debe, en parte, a los defectos en la glicolización en las células cancerosas. Las mucinas de la superficie de la célula del carcinoma pueden físicamente evitar que los mecanismos efectores inmunitarios lleguen a la superficie de la célula tumoral y, por lo tanto, al antígeno tumoral. Esto es, el hospedero fracasa en reconocer el antígeno tumoral. En la mayoría de las enfermedades, los patógenos o las toxinas causantes (por ejemplo los virus de influenza, poli y rabia; las bacterias de pneumococcus, difteria y toxina tetánica) pueden ser efectivamente eliminados y neutralizados en el fluido extracelular, mediante los mecanismos de la inmunidad humoral, a través de los anticuerpos que se unen a los patógenos o toxinas y, por lo tanto, conducen a su inactivación o destrucción. En estos casos, la vacunación con las preparaciones que obtienen una respuesta inmunitaria humoral, presumiblemente reguladas por los linfocitos TH2 son generalmente suficientes para su protección. Por otra parte, para la mayoría de las infecciones intracelulares, para la recuperación contra infecciones virales y para la destrucción objetivizada de células cancerosas, la inmunidad regulada por células es la que protege al organismo contra los invasores. Tres clases de inmunoterapia están actualmente en investigación: 1) inmunoterapia pasiva; 2) inmunoterapia activa con antígenos; y 3) inmunoterapia activa con anticuerpos. Desafortunadamente, cada una se ha encontrado con éxitos limitados. Sin embargo, la inmunoterapia se prefiere sobre los agentes quimioterapéuticos antiproliferativos, como la pirimidina o análogos de la purina, en ciertas etapas del cáncer. Los análogos compiten con la pirimidina y la purina como bloque de construcción usados durante el ciclo de crecimiento de las células. Los análogos son ineficaces cuando el crecimiento es no-cíclico o está latente. La mayoría de las células micrometastásicas parecen ser no-cíclicas o estar latentes. El efecto citotóxico de la inmunoterapia opera independientemente del ciclo de la célula. La "inmunoterapia pasiva" implica la administración de antibióticos a un paciente. La terapia con anticuerpos está caracterizada convencionalmente como pasiva pues el paciente no es la fuente de los anticuerpos. Sin embargo, el término pasivo es engañoso debido a que el paciente puede producir anticuerpos secundarios anti-idiotípicos, los cuales a su vez pueden inducir una respuesta inmunitaria que presenta reactividad cruzada con el antígeno original. La "inmunoterapia activa" es la administración de un antígeno en forma de una vacuna, a un paciente, a fin de obtener una respuesta inmunitaria protectora. Las vacunas de células tumorales genéticamente modificadas transfectadas con genes que expresan citocinas y moléculas co-estimulantes también han sido usadas para disminuir la falta de idoneidad de la respuesta inmunitaria específica al tumor.

I . Inmunoterapia Pasiva (con anticuerpos) Un antígeno tumoral puede servir como un sitio reactivo en el cual los anticuerpos pueden empezar a unirse. Se han obtenido muchos anticuerpos contra antígenos tumorales. Los métodos efectores convencionales incluyen citólisis dependiente del complemento ("CDC"), citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo ("ADCC") y fagocitosis (despeje mediante el sistema reticuloendotelial después de que la célula objetivo se reviste con inmunoglobulina) . Una cantidad relativamente grande de anticuerpos se requiere para iniciar CDC, ADCC y opsonización. Además, las fuentes de los anticuerpos humanos son limitadas a la gente que ya sufre del tumor de interés, no es ético introducir una enfermedad en una persona simplemente para iniciar la producción de anticuerpos que pueden ser recolectados. Como resultado de estas dificultades, los anticuerpos de origen no humano, como los anticuerpos de ratones, han sido usados. La administración a humanos de anticuerpos de ratón, debido a que son reconocidos como "extraños" puede inducir una respuesta humana de anticuerpo anti-ratón ("HAMA") dirigida contra las porciones específicas de isotipo de ratón y específicas de ratón de la molécula de anticuerpo primaria. Esta reacción inmunitaria ocurre debido a las diferencias en las secuencias de aminoácidos primarios en las regiones constantes de las inmunoglobulinas de ratón y de humano. Ambas subclases de IgG e IgM de HAMA han sido detectadas. La respuesta IgG aparece al último, tiene una vida más larga que la respuesta típica IgM y es más resistente a la eliminación por plasmaféresis . Sin embargo, clínicamente, HAMA: 1) aumenta el riesgo de reacciones anafilácticas o reacciones similares a enfermedades séricas ante la administración subsecuente de anticuerpos del ratón; 2) pueden interferir con el efecto in unoterapéutico de los anticuerpos de ratón inyectados subsecuentemente, por la formación de complejos con esos anticuerpos, aumentando su depuración del cuerpo, reduciendo la localización del tumor, intensificando su absorción en el hígado y el bazo y/u ocultando el tumor a los agentes terapéuticos; y 3) puede interferir con los agentes de inmunodiagnóstico y ocultar el monitoreo del progreso de la enfermedad y, por lo tanto, del tratamiento. Varias pruebas clínicas han usado antibióticos como agentes terapéuticos contra tumores sólidos. Ningún patrón consistente de respuesta o supervivencia mejorada ha surgido. En contraste, la terapia con anticuerpos con frecuencia ha inducido remisiones de mayor duración y completas en leucemias y linfomas de célula B o linfocito T. Las explicaciones para el fracaso en tumores sólidos incluyen la heterogeneidad antigénica y la accesibilidad insuficiente de las células epiteliales a los anticuerpos inyectados, así como también a las moléculas efectoras secundarias, como son las células efectoras o de complemento. Como un ejemplo de la inmunidad pasiva, el anticuerpo monoclonal de ratón 17-1A (isotipo IgG2a) se utilizó para dirigirse a enfermedad residual mínima en pacientes cáncer colorrectal en etapa Duke C, a quienes se les había practicado cirugía curativa y estaban libres de manifestaciones de tumor residual. Aunque el tratamiento mejoró la supervivencia y condujo a menores índices de recurrencia, los resultados fueron menos favorables que el tratamiento sólo con quimioterapia o en combinación con radiación. Es importante notar que el antígeno blanco del 17-1A no se desprende de la membrana y no es detectable en el suero. Ver Riethmüller, y col., "Randomized trial of monoclonal antibody for adyuvant therapy of resected Dukes C colorectal carcinoma", Lacent, 343:1177-83 (1994).

II . Inmunoterapia Activa Específica ("ASI") Con Antígenos Tumorales . La ASI se define como inmunización con un antígeno definido, presentado en una manera apropiada, para inducir activamente en forma específica una respuesta inmunitaria a ese antígeno. En el contexto del cáncer, la ASI trata de a estimular una respuesta inmunitaria humana tanto humoral como mediada por células, para atacar al antígeno tumoral. La respuesta humoral y los métodos efectores convencionales de CDC, ADCC y fagocitosis (eliminación por el sistema reticuloendotelial después de que la célula blanco se recubre con inmunoglobulina) se discutieron arriba. Durante los 5 años anteriores, se han hecho progresos considerables en la caracterización del complejo molecular reconocido por el receptor específico de antígeno de los linfocitos T. Las estructuras cristalinas de las moléculas clase I del complejo mayor de histocompatibilidad ( "MHC") manifiestan no solo un canal que une un péptido simulado sino también la presencia real de un péptido en este canal. Después de la fagocitosis, las proteínas sintetizadas dentro de las células aparentemente se degradaban a péptidos mediante las enzimas celulares, se transportan al retículo endoplásmico y allí se combinan con la cadena pesada de una molécula MHC clase I . Tales complejos MHC-péptido se estabilizan con la adición de ß2-microglobulina y se transportan a la superficie de la célula en donde pueden ser reconocidos por el receptor de CTL. En teoría, un péptido antigénico se puede derivar de cualquier proteína intracelular expresada en forma específica por las células tumorales. Ver por ejemplo, Van Der Bruggen, Pierre, "The Long Standing Quest for Tumor Rejection Antigens", Clinical Immunology and Immunophatology, 71; 3:248-252(1994).

III . Inmunoterapia Específica Activa con Anticuerpos . Si un anticuerpo específico de un animal se inyecta como inmunógeno a un segundo animal adecuado, el anticuerpo inyectado inducirá una respuesta inmunitaria (por ejemplo, anticuerpos que se producen en contra de los anticuerpos inyectados "anti-anticuerpos" ) . Algunos de estos anti-anticuerpos serán específicos para los epítopes únicos (idiotopos) del dominio variable de los anticuerpos inyectados. Estos epítopes son conocidos en general como el idiotipo del anticuerpo primario; los (anti) anticuerpos secundarios que se unen a estos epítopes se conocen como anticuerpos anti-idiotípicos . La suma de todos los idiotopos presentes en la porción variable de un anticuerpo está referida como su idiotipo. Los idiotipos se definen serológicamente, ya que la inyección de un anticuerpo primario que se une a un epítope del antígeno puede inducir la producción de anticuerpos anti-idiotípicos. Cuando el enlace entre un anticuerpo primario y un anticuerpo anti-idiotípico se inhibe por el antígeno al cual se dirige el anticuerpo primario, el idiotipo es lugar de enlace o epítope relacionado. Otros anticuerpos secundarios serán específicos para los epítopes de los dominios constantes de los anticuerpos inyectados y por lo tanto se conocen como anticuerpos anti-isotípicos . Como se usan en la presente, anti-idiotipo, anticuerpo anti-idiotípico, epítope, o epitópico se emplean en el sentido conocido en la técnica. La teoría "de redes" dice que los anticuerpos que se producen al inicio durante una respuesta inmunitaria llevarán nuevos epítopes únicos a los cuales el organismo no es tolerante y. por lo tanto, inducirán la producción de anticuerpos secundarios (Ab2) dirigidos contra los idiotipos de los anticuerpos primarios (Abl) . Estos anticuerpos secundarios del mismo modo tendrán un idiotipo que inducirá la producción de anticuerpos terciarios (Ab3) y así sucesivamente.

Abi ?- Ab2 -» Ab3 La teoría de redes también sugiere que algunos de estos anticuerpos secundarios (Ab2) tendrán un lugar de enlace que es el complemento del complemento del antígeno original y así reproducirán la "imagen interna" del antígeno original. En otras palabras, un anticuerpo anti-idiotípico puede ser un antígeno sustituto. Un enfoque tradicional a la inmunoterapia del cáncer ha sido administrar a los pacientes anticuerpos anti-tumorales, por ejemplo, anticuerpos que reconocen un epítope en una célula tumoral. Sin embargo, el desarrollo de la teoría "de redes" lleva a los investigadores a sugerir la administración directa de los anticuerpos anti-idiotípicos producidos en forma exógena, es decir, anticuerpos producidos contra el idiotipo de un anticuerpo anti-tumoral. Un enfoque semejante se describe en la Patente de los Estados Unidos 5,053,224 (Koprowski, y col..) Koprowski asume que el cuerpo del paciente producirá anti-anticuerpos que no solo reconocerán estos anti-cuerpos anti-idiotípicos, sino también el epítope del tumor original. Existen cuatro tipos principales de anticuerpos anti-idiotípicos. Los del tipo alfa que se unen a un epítope lejano del parátopo del anticuerpo primario. Los del tipo beta son aquéllos cuyo parátopo simula siempre al epítope del antígeno original. Los del tipo gama que se unen al parátopo del anticuerpo primario suficientemente cerca para interferir con el enlace del antígeno. Los del tipo épsilon que reconocen un determinante idiotípico que simula una estructura antigénica de dominio constante. Por otra parte, los anticuerpos anti-isotípicos pueden ser específicos a cadenas pesadas o específicos a cadenas ligeras. Dos aplicaciones terapéuticas surgen de la teoría de redes: 1) administrar Abl que actúa como un antígeno que induce la producción de Ab2 por el hospedero; y 2) administrar Ab2 que simula funcionalmente al antígeno tumoral. Se reportó que la inmunización activa de las pacientes de cáncer ovárico con aplicaciones intravenosas repetidas de los fragmentos F (Ab')2 del anticuerpo monoclonal OC125 induce respuestas notables de anticuerpo anti-idiotípico (Ab2) en algunas de las pacientes. Los resultados preliminares sugirieron que las pacientes con concentraciones séricas elevadas de Ab2 tuvieron mejores índices de supervivencia en comparación con aquéllas en las que se detectaron niveles séricos de Ab2 bajos o nulos. Ver Wagner, U. y col.., "Cliniccal Course of Patientes with Ovarían Carcinoma After Induction of Anti-idiotypic Antibodies Against a Tumor-Associated Antigen", Tumor Diagnostic & Therapie, 11:1-4 (1990). Se ha demostrado que un anticuerpo monoclonal anti-idiotípico humano (Ab2) induce respuestas celulares anti-tumorales en animales y parece prolongar la supervivencia en pacientes con cáncer colorrectal metastásico. Ver Durrant, L.G. y col., "Enhanced Cell Mediated Tumor Killing in Patients Immunized with Human Monoclonal Anti-Idiotypic Antibody 105AD7", Cáncer Research, 54:4837-4840 (1994). El uso de anticuerpos anti-idiotípicos (Ab2) para inmunoterapia de cáncer se revisa también por Bhattacharya-Chatterje, y col; Cáncer Immunol. Immunother.38: 75-82 (1994).

EXPOSICIÓN DE LA INVENCIÓN Las vacunas son preparaciones que se administran a animales o a humanos para efectuar la profilaxis, cura o alivio de los estados de enfermedad a través de la inducción de inmunidad específica. Las vacunas profilácticas se administran a individuos sanos con la intención preparar o sensibilizar el sistema inmunológico para una defensa más efectiva contra las infecciones futuras. En el caso de una infección o infestación, el sistema inmunológico del individuo vacunado puede tener una respuesta inmunitaria secundaria y en forma más rápida reconocer y eliminar los patógenos respectivos. Las vacunas terapéuticas se administran a individuos enfermos con intención de estimular o modular el sistema inmunológico que ha dado una respuesta inmunitaria insuficientemente efectiva o ha sido completamente incapaz de responder. En el diseño de vacunas profilácticas o terapéuticas, es importante seleccionar las preparaciones que inducirán el tipo de respuesta inmunitaria que tenga más capacidad para proporcionar ya sea protección de primera línea o para efectuar una rápida recuperación. La primera etapa en el inicio de una respuesta inmunitaria es generar en el hospedero el reconocimiento del antígeno tumoral como un antígeno extraño. Por ejemplo, aunque la expresión del CA125 está asociada con el cáncer ovárico, el sistema inmunológico de la paciente es incapaz de reconocerlo como extraño. La presente invención incluye poner en contacto un antígeno soluble con una composición de la invención y hacer reaccionar un agente de enlace en la composición con el antígeno soluble. Según la invención, unir el antígeno con el agente de enlace genera en el hospedero el reconocimiento del antígeno. A su vez, generar este reconocimiento del hospedero conduce a iniciar una respuesta inmunitaria contra el antígeno. La presente invención incluye el descubrimiento de que unir un agente de enlace a un epítope predeterminado de un antígeno multi-epitópico asociado a un tumor modifica el antígeno de manera tal que el sistema inmunológico del hospedero puede reconocer e iniciar una respuesta inmunitaria al antígeno que previamente no se reconoció. En una modalidad de la invención, un agente de enlace se une a un antígeno soluble asociado a un tumor, que permite al sistema inmunológico del hospedero generar una respuesta contra el antígeno. Por ejemplo, ilustrativo de la presente invención es el B43.13, un agente de enlace de anticuerpo que se une específicamente al antígeno de cáncer ovárico CA125 en el epítope 43.13. Una vez que el B43.13 se une al antígeno CA 125, la conformación del antígeno se modifica o el antígeno se procesa y/o se distribuye de forma diferente de la reconocida por el sistema inmunológico del hospedero. Otros ejemplos incluyen, pero en forma no exclusiva, un agente de enlace que se une específicamente al CA19.9, un antígeno gastrointestinal asociado con el cáncer gastrointestinal; y un agente de enlace que se une específicamente al CA 15.3, un antígeno asociado con el cáncer de mama. Según la presente invención, se proporcionan un agente (s) de enlace y las composiciones que comprenden a tales agentes de enlace, en donde el agente de enlace se une selectivamente a un antígeno soluble predeterminado y en donde tal enlace da por resultado la presentación de un epítope diferente en el antígeno, dicho epítope diferente da por resultado una respuesta inmunitaria que inhibe o extermina las células que producen el antígeno. En una modalidad preferida de la invención, se usa una composición que comprende un anticuerpo predeterminado que específicamente se une a un antígeno predeterminado asociado a un tumor para unir un antígeno soluble producido por el tumor. Una vez que el antígeno soluble está unido, el sistema inmunológico reconoce al antígeno como "extraño" y produce una respuesta inmunitaria contra el antígeno o contra el agente de enlace unido al antígeno. Los antígenos que se pueden hacer inmunogénicos son potencialmente útiles para inducir o activar una respuesta inmunitaria, que conduce a beneficios terapéuticos y posiblemente profilácticos. Para enfermedades que se pueden caracterizar en parte por tener un antígeno que es multi-epitópico asociado a un tumor, la presente invención incluye poner en contacto un antígeno soluble con un reactivo de enlace que se une específicamente a un solo epítope en el antígeno multi-epitópico asociado al tumor. El agente de enlace puede dirigirse contra cualquier antígeno de importancia clínica, pero de preferencia se dirige contra un antígeno asociado a un tumor (TAA) . En el caso de un TAA, el cáncer puede incluir, pero no en forma exclusiva al pulmón, colon, recto, mama, ovario, próstata, cabeza, cuello, huesos, sistema inmunológico, o cualquier otra localización anatómica. El sujeto puede ser un animal o un humano. Los tumores ilustrativos y los marcadores de tumores se mencionan en la Patente de los Estados Unidos No. 5,075,218. Los métodos de la presente invención incluyen cualquier cáncer que produzcan un TAA multi-epitópico soluble. Como se usa en la presente soluble se emplea para describir cualquier antígeno que es detectable en un fluido corporal, por ejemplo, sangre, suero, ascitis, saliva, o lo semejante. Según la presente invención, los tumores que se prefieren son aquellos que: desprenden antígenos tumorales solubles, por ejemplo antígenos tumorales que se vierten a la corriente sanguínea, en comparación con un antígeno de superficie o un antígeno intracelular; presentan un antígeno multi-epitópico asociado al tumor, de preferencia de naturaleza de carbohidrato o de glicoproteína (por ejemplo mucina) ; y que pueden encontrarse en el fluido corporal del paciente a una concentración mayor a la normalmente presente en los controles sanos y este nivel elevado significa un pronóstico desafortunado para el paciente, que aún no ha iniciado una respuesta inmunitaria.

Como es bien sabido por los expertos en la técnica, un método para determinar si la concentración del TAA es tan grande que es predicción de la recurrencia de la enfermedad, es comparar la concentración del paciente con la del control de salud. Sí la concentración del TAA es mayor a la del control de salud, entonces la concentración del paciente es predicción de un pronóstico desafortunado para la enfermedad. Un agente de enlace (BA) como se usa en la presente, se refiere a un miembro de un par inmunológico, por ejemplo una fracción de enlace que es capaz de unirse a un solo epítope expresado en el antígeno tumoral. Los ejemplos de los agentes de enlace incluyen, pero en forma no exclusiva: anticuerpos monoclonales ("MAb") anticuerpos monoclonales quiméricos ("C-MAb"); anticuerpos monoclonales que se obtienen mediante ingeniería genética ("G-MAb"); fragmentos de anticuerpos monoclonales (entre los que se incluyen, pero en forma no exclusiva a "F(Ab)2 "F(Ab)" y "Dab"), cadenas únicas que representen la porción reactiva de los anticuerpos monoclonales ("SC-MAb"); péptidos de enlace a tumores; cualquiera de los anteriores unido a una molécula que sea mediadora en una función efectora; y simuladores de cualquiera de las anteriores. El anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal o policlonal. Cuando el sujeto es un humano, el anticuerpo puede obtenerse mediante la inmunización de cualquier animal que sea capaz de producir una respuesta inmunitaria utilizable al antígeno, como ratón, rata, cabra, conejo, o cualquier otro animal experimental conveniente. En el caso de un anticuerpo monoclonal, las células del animal inmunizado que producen el anticuerpo se pueden fusionar con células humanas o animales "inmortales" o "inmortalizadas" para obtener un hibridoma que produce el anticuerpo. Si se desea, los genes que codifican una o más de las cadenas de inmunoglobulina se pueden clonar en forma tal que el anticuerpo se puede producir en diferentes células hospederas, y si se desea, los genes se pueden mutar para alterar la secuencia y por lo tanto, las características inmunológicas del anticuerpo producido. Fragmentos o los fragmentos de los agentes de enlace, se pueden obtener mediante técnicas convencionales, como digestión proteolítica del agente de enlace utilizando pepsina, papaína o lo semejante, o mediante las técnicas de ADN recombinante en las cuales el ADN que codifica el fragmento deseado se clona y se expresa en una diversidad de hospederos. La irradiación de cualquiera de las entidades anteriormente mencionadas, por ejemplo, con luz ultravioleta intensificará la respuesta inmunitaria a un antígeno multi-epitópico bajo condiciones similares. En una modalidad preferida de la invención, no se requieren las funciones efectoras que son mediadoras para CDC o ADCC. En una modalidad de la invención, una composición adecuada de un antígeno asociado a un tumor ovárico contiene un agente de enlace que se une al antígeno CA 125. En otra modalidad de la invención, una composición adecuada para el cáncer gastrointestinal contiene un agente de enlace que se une al antígeno CA 19.9. Aún en otra modalidad de la invención, una composición adecuada para el cáncer de mama contiene un agente de enlace que se une al antígeno CA 15.3. Diversos agentes de enlace, anticuerpos, antígenos y métodos para preparar, aislar y usar los anticuerpos se describen en las patentes de Estados Unidos 4,471,057 (Koprowski) y en la Patente de los Estados Unidos 5,075,218 (Jette y col.,), ambas incorporadas en la presente como referencia. Además, muchos de estos anticuerpos están disponibles comercialmente de Centocor, Abbott Laboratories, Commissariat a L'?nergie Atomique, Hoffman-La Roche, Inc., Sorin Biomedica and FujiRebio. Cualquier composición que incluya un agente de enlace según la invención se puede usar para iniciar una respuesta inmunitaria in vivo . La composición puede incluir uno o más coadyuvantes, uno o más vehículos, uno o más excipientes, uno o mas estabilizantes, uno o más reactivos de imagen y/o solución salina fisiológicamente aceptable. En general, los coadyuvantes son substancias mezcladas con un inmunógeno para inducir una respuesta inmunitaria más marcada. Vacunaciones de control sin el coadyuvante dieron por resultado respuestas inmunitarias humorales. La composición también puede incluir vehículos farmacéuticamente aceptables. Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen, en forma no exclusiva: solución salina, agua estéril, solución salina reguladora de fosfato y lo semejante. Otros agentes de regulación, agentes de dispersión y substancias inertes no-tóxicas adecuadas para administrarse al paciente se pueden incluir en las composiciones de la presente invención. Las composiciones pueden ser soluciones adecuadas para la administración y típicamente son estériles y libres de material particulado indeseable. Las composiciones se pueden esterilizar mediante las técnicas de esterilización convencionales . Según un método de la invención, el agente de enlace debe estar en contacto y unirse al antígeno asociado al tumor, puede administrarse al paciente por cualquier vía inmunológicamente adecuada. Por ejemplo, el agente de enlace se puede introducir en el paciente por vías intravenosa, subcutánea, intraperitoneal, intradérmica, intramuscular o intralinfática, en la forma de: solución, tableta o aerosol. Liposomas, microesferas biodegradables, micelas, o lo semejante también se pueden usar como transportador, vehículo o sistema de administración. Además, usando los procedimientos ex vivo bien conocidos en la técnica, se puede extraer la sangre o el suero del paciente; en forma optativa, puede ser deseable purificar el antígeno en la sangre del paciente; después la sangre o el suero pueden mezclarse con una composición que incluya un agente de enlace según la invención; y la sangre o el suero tratados se retornan al paciente. El clínico puede comparar las respuestas anti-idiotípicas y anti-isotípicas asociadas con estas diferentes rutas para determinar la ruta de administración más efectiva. La invención no debe estar limitada a ningún método particular de introducción del agente de enlace en el paciente. Según la presente invención, la interacción BA-antígeno efectivamente presenta los epítopes restantes al sistema inmunológico del paciente para generar: 1) una respuesta humoral que da por resultado anticuerpos anti-tumorales humanos que pueden o no ser capaces de inhibirse por el anticuerpo inyectado, pero que son en forma definitiva capaces de inhibirse por un anticuerpo que se une a un epítope diferente del epítope reactivo con el BA inyectado; y 2) una respuesta mediada por células que da por resultado la producción de linfocitos T citotóxicos antígeno-específicas .

Los agentes de enlace de la presente invención se unen al antígeno tumoral multi-epitópico de interés y el par inmunogénico resultante puede usarse para sensibilizar o iniciar una respuesta inmunitaria a otro epítope en el antígeno. Como se mencionó con más detalle en otra parte de esta descripción, se cree que el evento de enlace entre el agente de enlace y el antígeno multi-epitópico cambia la conformación del antígeno lo suficiente para proporcionar acceso a otro epítope previamente irreconocible en el antígeno. El epítope previamente irreconocible, una vez reconocido por los agentes del sistema inmunológico, inicia la cascada del sistema inmunológico que da por resultado una respuesta inmunitaria al antígeno completo. Según una modalidad de la invención, un paciente de cáncer con fluido corporal que tiene antígeno multi-epitópico soluble, endógeno se trata mediante la inyección de un agente de enlace exógeno dirigido a un solo epítope del antígeno endógeno soluble. Después del enlace, el antígeno se reconforma o se procesa y/o se distribuye en forma diferente, permitiendo que se presente un epítope diferente en el antígeno, al sistema inmunológico del paciente. En la presentación, el sistema inmunológico del paciente inicia y desarrolla una respuesta humoral, celular o humoral/celular combinada, que conduce a la muerte del tumor y/o a estasia. Las evidencias del éxito de la presente invención se manifiestan en los ejemplos como tiempos de supervivencia mejorados. Sin la intención de estar limitado a ello, se cree que un mecanismo de acción para los métodos de la presente invención comprende una modificación conformacional en la parte del antígeno soluble unida por un agente de enlace según la presente invención. Se cree además que unir el antígeno con un agente de enlace dirigido a un primer epítope en el antígeno cambia la conformación del antígeno lo suficiente para presentar o activar un segundo epítope. Es contra este segundo epítope contra el que puede responder el sistema inmunológico del paciente. Alternativamente, la interacción agente de enlace-antígeno puede conducir al procesamiento metabólico diferencial o distribución al sistema inmunológico de forma tal que se active un segundo epítope.

DOSIFICACIÓN Según los métodos de la presente invención, una composición que comprende un agente de enlace puede ser administrada en cantidad suficiente para reconocer y unir el antígeno predeterminado asociado al tumor. En una modalidad preferida de la invención, la dosis es suficiente para generar o inducir una respuesta inmunitaria contra un TAA. Una cantidad inmunológica o terapéuticamente efectiva o aceptable del agente de enlace es una cantidad suficiente para unir un antígeno predeterminado in vivo o ex vivo y es capaz de inducir una respuesta inmunitaria al antígeno. La respuesta inhibe o extermina a las células tumorales que llevan y presentan un epítope recientemente accesible, con lo cual se mejora o se elimina la enfermedad o la condición que produce el antígeno. La respuesta inmunitaria puede tomar la forma de una respuesta humoral, una respuesta mediada por células o ambas. En una modalidad preferida de la invención, la dosis del anticuerpo monoclonal es menor a la dosis requerida para inducir ADCC o CDC. La concentración o dosis del agente de enlace o agente activo en la composición puede variar ampliamente, por ejemplo, entre aproximadamente menos de .01% a aproximadamente 15 a 20% en peso. Como se mencionó antes, la composición se administra en cantidad suficiente para estimular una respuesta inmunitaria contra el antígeno. Las cantidades efectivas para este uso dependerán en parte de la severidad de la enfermedad y del estado del sistema inmunológico del paciente. En general, la composición comprenderá entre aproximadamente 0.1 µg y aproximadamente 2 mg o más del agente de enlace por kilogramo de peso corporal, más comúnmente una dosis de entre aproximadamente 1 µg y 200 µg por kilogramo de peso corporal. La concentración usualmente será por lo menos de 0.5%; se puede seleccionar cualquier cantidad basada principalmente en el volumen del fluido, la viscosidad, antigenicidad, etc., según la forma particular de administración. La administración puede ser más de una vez, de preferencia tres veces durante un período prolongado. Ya que las composiciones de está invención se pueden usar para pacientes en un estado de enfermedad grave, por ejemplo, en amenaza de vida o en potencial amenaza de vida, se puede administrar un exceso del agente de enlace si esto es deseable. Los presentes métodos y protocolos para administrar las composiciones farmacéuticas, entre los que se incluyen las técnicas de dilución para las inyecciones de las presentes composiciones, son bien conocidos o serán evidentes para los expertos en la técnica. Algunos de estos métodos y protocolos se describen en Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Co. (1982) . Un agente de enlace se puede administrar en combinación con otros agentes de enlace o en combinación con otros protocolos o agentes de tratamiento, por ejemplo agentes quimioterapéuticos . La efectividad de los agentes de enlace de la presente invención se puede monitorear in vivo o in vi tro . Las respuestas humorales se pueden monitorear in vi tro mediante los inmunoensayos convencionales, en donde la actividad anti-tumoral de la respuesta se puede determinar por los ensayos de citotoxicidad celular mediada por el complemento y/o citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) . Las metodologías de los ensayos son bien conocidas y se describen en Handbook of Experimental Immunology, Vol. 2, Blackwell Scientific Publications, Oxford (1986). Otros ensayos pueden dirigirse a determinar el nivel del antígeno en el paciente o en el tejido. La inmunidad mediada por células se puede monitorear in vivo mediante el desarrollo de las reacciones de hipersensibilidad de tipo retardado u otros medios in vivo o in vi tro conocidos por los expertos en la técnica, entre los que se incluyen, en forma no exclusiva, el protocolo de la reacción de prueba en la piel, las pruebas de estimulación de linfocitos, la medición de la toxicidad de los linfocitos de un sujeto a células tumorales utilizando la prueba estándar de liberación radioactiva, el ensayo de dilución limitante o la medición de los niveles de IL-2 en plasma que usan las pruebas estándar ELISA.

EJEMPLOS Ejemplo 1 Verificación Experimental De La Generación De La Respuesta Del Anticuerpo Contra Epítopes Múltiples Presentes En Un Antígeno Mediante Inyección De Un Anticuerpo Contra Un Solo Epítope.

El antígeno CA 125 del cáncer, que se expresa en más del 80% de los casos de cáncer ovárico epitelial, se usa como un ejemplo para demostrar la presente invención. El CA125 tiene epítopes múltiples como OC125, Mil, B43.13, B27.1, entre otros, que son reconocidos por diferentes anticuerpos. En la presente invención, se usó MAb-B43.13 para generar una respuesta inmunitaria específica al CA 125 la cual incluye el reconocimiento del epítope B27.1 Método : 86 pacientes de cáncer ovárico con la enfermedad activa se examinaron para detectar la presencia de anticuerpos contra CA125. Ninguna de las pacientes tenían anticuerpos contra CA125 antes de la inyección de MAb-B43.13. Las pacientes se inyectaron con 2 mg de Mab-B43.13 variando los intervalos de tiempo (por ejemplo, ver la Tabla 1 para algunas de las pacientes) . Los sueros de estas pacientes se analizaron para detectar la presencia de anticuerpos humanos anti-CA125 por su capacidad para unirse al CA125 [R.Madiyalakan y col, Hybridoma, 14:199-203 1995]. Estos anticuerpos anti-CAl25 se clasificaron después con acción en contra de los epítopes B43.13 o B27.1 por su capacidad para inhibir los anticuerpos correspondientes. El fundamento para la clasificación surge del hecho de que los anticuerpos del Cal25 en estas pacientes podrían haberse generado por cualquiera de las dos formas siguientes : 1) Si los anticuerpos anti-CA125 fueran generados en la forma sugerida por la teoría de redes mencionada antes, la vía podría seguir Abl -Ab2-Ab3. Siguiendo este esquema, MAb-B43.13 (Abl) podría generar un anti-idiotipo contra MAb-B43.13 (Ab2), el cual a su vez generaría un anti-anti-idiotipo contra Mab-B43.13 (Ab3; o anticuerpo anti-CA125) . Además, los anticuerpos Ab3 generados con esta vía podrían unirse y ser inhibidos únicamente por MAb-B43.13 debido a que el epítope B43.13 es el único epítope presente. 2) Si los anticuerpos anti-CA125 fueran generados en la forma sugerida por la presente invención, la vía podría ser Abl + antígeno soluble - Ab3 ' . Siguiendo este esquema, MAb-B43.13 (Abl) podría unirse al seroantígeno CA125, el cual a su vez podría generar un anticuerpo anti-CA125 (Ab3 ' ) . Además, los anticuerpos Ab3 ' generados bajo esta vía podrían unirse y ser inhibidos por los anticuerpos B27.1, debido a que, como se mencionó antes, el CA125 es multi-epitópico y los epítopes B43.13 y B27.1 son distintos; además el Ab3 ' no se unirá a los anticuerpos anti-MAb-B43.13. De esta manera, si los sueros de las pacientes contenían los anticuerpos anti-CA125 que fueron capaces de inhibirse únicamente por MAb-B43.13, se clasificaron como sueros que contienen Ab3, aquéllos que fueron capaces de inhibirse únicamente por MAb-B27.1, se clasificaron como sueros Ab3 ' .

Resultados 14 pacientes desarrollaron anticuerpos anti-CA125 en su suero (Tabla 1) en respuesta a la inyección de MAb-B43.13. 10 de estas 14 pacientes tenían Ab3 ' mientras que solo dos pacientes tenían anticuerpos Ab3 en su suero. Dos pacientes tenían además ambos anticuerpos. La presencia de Ab3 en su suero se confirmó también por la capacidad de estos anticuerpos de unirse al anticuerpo anti-MAb-B43.13 purificado de conejo. Hubo dos pacientes (# 2 y #7) que tenían anticuerpos anti-CA125, pero no fueron capaces de inhibirse por MAb-b43.13 o MAb b27.1, lo que sugería que ellas podían tener anticuerpos contra CA125, que reconocen otros epítopes diferentes a B43.13 o B27.1. Estos resultados indican claramente que cuando se inyecta en una paciente un anticuerpo contra un solo epítope (B43.13) se genera una respuesta del anticuerpo en contra del antígeno completo la cual reconoce epítopes diferentes presentes en el antígeno. La presencia de Ab3 en algunas pacientes podría explicarse por la posible presencia de un exceso del epítope B43.13 en el CA125, debida a una insuficiente inducción para el enlace del anticuerpo al epítope o idiotipo a través de la Ruta I. Sin embargo, el mecanismo predominante de la respuesta parece ser a través de la Ruta II. En otras palabras, inyectar un anticuerpo monoclonal a un antígeno multi-epitópico soluble en un paciente que tiene el sistema inmunológico funcionando genera un anticuerpo al antígeno, en donde el anticuerpo que se genera se inhibe mediante anticuerpos a epítopes diferentes.

TABLA 1: Caracterización de los Anticuerpos Anti-CA125 en * Para considerarse significativa, la inhibición tiene que ser por lo menos de 10% ** Se usaron MAb.B43.13 de cadena única y F(ab') MAb- B27.1 en los estudios de inhibición para evitar inhibición no específica debida a la porción Fe del anticuerpo y reactividad cruzada debida a HAMA. + El Anti-MAb-b43.13 (Ab2) se purificó a partir de conejos inyectados con MAbB43.13.

Ejemplo 2 En estudios farmacéuticos, se analizaron muestras de sangre para determinar los niveles de CA125 antes de la inyección de MAb-B43.13 y a intervalos seleccionados después de ésta. En pacientes con niveles elevados de CA125 antes de la inyección, se pudo ver una caída significativa en los niveles de CA125 circulante inmediatamente después de la inyección de MAb-B43.13 (Tabla 2). Esto claramente demostró que agente de enlace al introducirse en el cuerpo interactúa y elimina el CA125 circulante.

TABLA 2 : Márgenes de CA125 después de la inyección de MAb-B43.13 Paciente # (los niveles de CA125 se dan en U/mL.) Además, el antígeno al formar el complejo con el anticuerpo se presenta al sistema inmunológico en una forma eficiente y genera una mejor respuesta celular y humoral específica al antígeno. Esto se demostró mediante los experimentos siguientes que se muestran en los Ejemplos 3 y 4.

Ejemplo 3 Los ratones balb/c se inmunizaron con 10 µg de MAb-B43.13 en PBS, i.v., 10,000 unidades de CA125 en PBS, i.v.; o con 10 µg de MAb-B43.13 y 10,000 unidades de CA125 en PBS, i.v.; cada tres semanas con un total de 3 inyecciones. La proporción de B43.13/CA125 en la inyección fue similar a la que se observó en pacientes con niveles elevados de CA125 como determinada con base en los datos farmacocinéticos que se dan en la Tabla 2. Cuando los sueros de los ratones se analizaron para determinar los niveles del anticuerpo anti-CAl25, los ratones que se inyectaron con el complejo antígeno-anticuerpo presentaron el título más elevado. La inducción anti-idiotípica en estos ratones balb/c se muestra en forma gráfica en la Figura 1. Esto apoya la observación de que la interacción agente de enlace-antígeno conduce a una mejor respuesta inmunitaria humoral específica al antígeno en comparación con el agente de enlace o el antígeno solos.

Ejemplo 4 Del mismo modo, se observó una respuesta inmunitaria celular mejor cuando el agente de enlace se presentó en asociación con el antígeno a las células-T.

Así, los macrófagos aislados de las cavidades perifonéales de ratón se estimularon con MAb-B43.13 solo; CA125 solo, un complejo MAb-B43.13-CA125, o MAb-CA125 de control y se presentaron a células-T de ratón específicas a CA125 (aisladas de ratón inyectado con CA125) . Cuando se dio seguimiento a la proliferación de las células-T monitoreada por el consumo de [3H] -timidina, se observó un índice de estimulación óptimo en los macrófagos estimulados con el complejo anticuerpo-antígeno (Figura 2).

Ejemplo 5 La conclusión en el Ejemplo 1 se soportó en forma adicional al descubrir una correlación entre los niveles de suero CA125 en los pacientes inyectados con MAb-B43.13 y la generación del anticuerpo anti-CA125 humano. Los resultados se muestran en la Tabla 3 y apoyan la conclusión de que el antígeno debe estar presente en el suero para que el agente de enlace interactúe; tal interacción conduce a una respuesta humoral específica al antígeno.

TABLA 3 : Correlación entre los Niveles séricos de CA125 y Anticuerpo en Pacientes Inyectados con MAb-B43.13 Nivel sérico de CA125 antes Título del Anticuerpo Anti- de la inyección CA125 (No. de Pacientes positivos/Total de Pacientes <100 U/mL 3/29 >100 U/mL 15/26 Ejemplo 6 El papel del antígeno sérico de inducir respuestas multi-epitópicas del anticuerpo como consecuencia de una inyección de anticuerpo se confirmó además en estudios en conejos. Los conejos que no contienen CA125 sérico, cuando se inyectan con MAb-B43.13, produjeron anticuerpos anti-CAl25 que no fueron capaces de inhibirse por B27.1. Al contrario, pacientes de cáncer ovárico con niveles elevados de antígeno sérico CA125 producen anticuerpos anti-CA125 que son capaces de inhibirse por B27.1 en respuesta a la inyección de MAb-B43.13.

Ejemplo 7 : Verificación Experimental de la Inducción de la Respuesta Anti-Tumor Específica al Antígeno Mediante la Inyección del Anticuerpo . El anticuerpo anti-CAl25 humano ocasiona lisis en las células tumorales a través de la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo ("ADCC"). Aunque el MAb-B43.13 inyectado no causa por si mismo una ADCC y/o citólisis dependiente del complemento ("CDC") es mediador en la lisis de las células tumorales ováricas, la generación de los anticuerpos anti-CAl25 en pacientes inyectadas con MAb-B43.13, conduce a la lisis de las células tumorales (ver Figura 3) . Esto se estudió en una prueba de liberación de cromo51 mediante la incubación de células tumorales ováricas marcadas con células efectoras y sueros de seis pacientes inyectados con MAb-B43.13. Esto soporta la conclusión de que la inyección de un agente de enlace conduce a su interacción con el antígeno, con una respuesta humoral específica que da por resultado anticuerpos anti-CA125 que ocasionan lisis de las células tumorales a través de ADCC. Los resultados demostraron claramente la generación de la respuesta anti-tumor específica al antígeno después de la inyección del anticuerpo.

Ejemplo 8. Generación de Linfocitos T Citotóxicos Específicos al CAÍ25 en Pacientes Inyectados con MAb- B43.13. Del mismo modo la inyección del agente de enlace a la paciente de cáncer que tiene CA125 conduce a CTL'S específicos al antígeno. Células Mononucleares de Sangre Periférica (PBMC) de ocho pacientes inyectados con MAb-B43.13 se analizaron para detectar citotoxicidad contra células tumorales ováricas CA125 negativas o CA125 positivas en un ensayo de liberación de cromo. Los resultados se muestran en la Tabla 4. La especificidad de la lisis se confirmó por la capacidad del Mab-B43.13 para inhibir esa lisis, así como por la incapacidad para exterminar las células tumorales CA125 negativas. De las ocho pacientes que recibieron MAb-B43.13, al menos en cuatro (#5 a #8) se determinó que tenían en su sangre linfocitos T citotóxicos (CTL's) específicos al CA125. Es probable que la generación de CTL's específicos al CA125 extermine a las células tumorales ováricas en pacientes.

TABLA 4 : Citotoxicidad En Pacientes Inyectadas Con Una Vacuna Que Contiene MAb-B43.13.

*ND= No determinado debido a la falta de linfocitos suficientes . Los resultados son la media de un experimento realizado por triplicado.

Ejemplo 9 El exterminio del tumor ya sea a través de un mecanismo ADCC mediado por el anticuerpo anti-CAl25 o a través de CTL's específicos al CA125, lleva a aumentar la supervivencia en las pacientes inyectadas con MAb-B43.13. Aunque los niveles séricos elevados de CA125 han sugerido ser indicadores de un pronóstico desafortunado, parecen tener un efecto benéfico en combinación con la inyección de anticuerpo anti-CA125 en estos pacientes. Por ejemplo, cuando los niveles de CA125 fueron mayores a 100 unidades/ L, la respuesta inmunitaria contra CA125 aumentó más de 20% lo cual a su vez aumentó la mediana de supervivencia en esas pacientes desde 39.1 meses a 54.5 meses (Tabla 5) . Así, la inyección de un agente de enlace a un paciente que contiene niveles elevados del antígeno soluble multiepitópico conduce a una respuesta humoral y celular específica al antígeno, que a su vez conduce a la destrucción del tumor a la que sigue una supervivencia mejorada. TABLA 5 : Correlación entre Niveles de Suero CA125, Respuesta Humana Anti-CA125 (Ab_.') y Supervivencia en Pacientes Inyectadas con MAb-B43.13 Ejemplo 10 Un paciente con cáncer pancreático diagnosticado con enfermedad metastásica se inyectó repetidamente con una composición que incluía un anti-anticuerpo CA19.9. El paciente no recibió ningún otro tratamiento y sobrevivió por 22 meses después del diagnostico original (19 meses después de la cirugía y de la inyección) . Esto se compara al período común de supervivencia estimado de seis meses de supervivencia después del diagnóstico inicial.

Ejemplo 11 Los expertos en la técnica reconocen que la dosis administrada puede variar ampliamente con base en un amplio conjunto de diferentes circunstancias. A continuación se proporciona lineamientos preliminares de dosificación. El análisis retrospectivo de más de 100 pacientes quienes habían sido inyectadas hasta diez veces con una dosis de 2 mg de MAb-B43.13 indicó que algunos de estos pacientes experimentaron a) una evolución inusual de su enfermedad, caracterizada por tiempos de supervivencia inesperadamente largos y b) ninguna reacción adversa o toxicidad significativas. Se condujeron estudios inmunológicos para entender y evaluar los mecanismos de acción de MAb-B43.13 in vivo . Estos estudios indicaron que el grado de inducción anti-idiotípica en pacientes que se inyectaron con dosis de 2 mg de MAb-B43.13 no estuvo relacionada con el número de inyecciones o con la etapa clínica de su enfermedad. Sin embargo, la inducción anti-idiotípica es dependiente de los niveles de CA125 circulante presente en el suero de los pacientes. Experimentos adicionales demostraron que la inyección de MAb-B43.13 a pacientes con suero CA125 medible lleva a la formación de complejos antígeno-anticuerpo dando por resultado la presentación del epítope del antígeno y de la respuesta celular y humoral específica del antígeno al tumor. Estos estudios indicaron que una dosis efectiva requiere únicamente anticuerpo suficiente para distribuir y presentar en forma óptima todo el antígeno CA125 circulante posible al sistema inmunológico. Los estudios in vitro indican que 1 ng de Mab-B43.13 puede unir 10 unidades de CA125. Suponiendo que 40 mL de plasma por kg de peso corporal, la inyección de 2 mg de MAb-B43.13 a un paciente de 60 kg puede aproximadamente 8333 U/mL de CA125 en el suero. Ya que todas las pacientes de cáncer ovárico examinadas hasta la fecha han presentado mucho menos de 833 U/ml de CA125 en su suero, una inyección de 2 mg de MAb-B43.13 es más que suficiente para inducir la respuesta inmunitaria requerida. Además, en pacientes que recibieron MAB-B43.13 radiomarcada para la confirmación inmunoescintográfica de la enfermedad, los resultados de imagen fueron excelentes a pesar del suero CA125 elevado, que sugiere hay un exceso de MAB-B43.13 para consumo específico del tumor. Además, inyecciones múltiples a intervalos seleccionados parecen proporcionar beneficios óptimos a los pacientes, ya que se genera CA125 durante todo el curso de la enfermedad. Finalmente, el análisis retrospectivo mostró que la dosis de 2mg parece tener eficacia terapéutica; ninguno de los pacientes (> 100) ha desarrollado ningún efecto lateral grave o reacciones adversas. Si la respuesta HAMA total es una indicación de la inducción anti-idiotípica, una dosis de 2 mg genera niveles significativos de anticuerpos anti-idiotípicos para producir el beneficio terapéutico deseado. Inyecciones múltiples de 2 mg de MAb-B43.13 en intervalos seleccionados parece mantener los anticuerpos anti-idiotípicos en los niveles deseados sin originar ninguna toxicidad isotípica inducida por HAMA. Un intervalo de dosis efectivas o una cantidad terapéuticamente aceptable de MAb-B43.13 incluye por lo tanto, pero no en forma exclusiva, 2 mg.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS . La figura 1 muestra los resultados superiores obtenidos después de inmunizar ratones con una composición de la presente invención, comparada con otras composiciones. La figura 2 muestra la estimulación superior de macrófago ocasionada por una composición de la presente invención, comparada con otras composiciones. La figura 3 muestra la lisis de las células tumorales ocasionada por administrar una composición de la presente invención.

APLICABILIDAD INDTJSTRIAL Las composiciones que comprenden un agente de enlace según esta invención son particularmente útiles en las composiciones que contienen una cantidad inmunogénica o terapéutica de por lo menos uno de los agentes de enlace de la invención. Una cantidad inmunogénica o terapéutica es una cantidad que estimula una respuesta inmunitaria de naturaleza humoral, celular o humoral y celular combinadas en el hospedero. La respuesta inmunitaria del hospedero incluye una actividad incrementada contra un epítope en un antígeno asociado a un tumor que es diferente al epítope al cual se une el agente de enlace. Las composiciones de la presente invención se administran como vacunas antitumorales a los sujetos en riesgo de desarrollar un tumor maligno o a sujetos que muestran un diagnóstico de tumor maligno. Estas composiciones pueden usarse para preparar una composición farmacéutica que induzca una respuesta inmunitaria.

Claims (15)

1. REIVINDICACIONES 1. Una composición farmacéutica para tratar el el cáncer que comprende poner en contacto un antígeno multi-epitópico asociado a un tumor, expresado en el suero del hospedero, con una composición que comprende un reactivo de enlace que específicamente se une a un solo epítope en el antígeno asociado al tumor; y permitir al reactivo de enlace unirse al antígeno para formar un par reactivo-antígeno, por lo que la formación del par reactivo-antígeno induce una respuesta inmunitaria en el hospedero.
2. 2. Una composición farmacéutica conforme la reivindicación 1, en donde el reactivo de enlace comprende un anticuerpo monoclonal.
3. 3. Una composición farmacéutica conforme la reivindicación 2, en donde el blanco que es el antígeno multi-epitópico asociado al tumor es CA125.
4. 4. Una composición farmacéutica conforme la reivindicación 2, en donde el blanco que es el antígeno multi-epitópico asociado al tumor es CA 19.9.
5. 5. Una composición farmacéutica conforme la reivindicación 2 en donde el blanco que es el antígeno multi-epitópico asociado al tumor es CA 15.3
6. 6. Una composición farmacéutica conforme la reivindicación 1, en donde el antígeno asociado al tumor es un antígeno tumoral ovárico.
7. 7. Una composición farmacéutica conforme la reivindicación 1, en donde la respuesta inmunitaria del hospedero es una respuesta inmunitaria celular.
8. 8. Una composición farmacéutica conforme la reivindicación 1, en donde la respuesta inmunitaria del hospedero es una respuesta inmunitaria humoral.
9. 9. Una composición farmacéutica conforme la reivindicación 1 en donde la respuesta inmunitaria del hospedero es tanto una respuesta inmunitaria humoral como una respuesta inmunitaria celular.
10. 10. Una composición farmacéutica para inducir una respuesta inmunitaria que comprende poner en contacto un antígeno multi-epitópico asociado a un tumor expresado en el suero del hospedero con una composición que comprende un reactivo de enlace que se une específicamente a un solo epítope en el antígeno asociado al tumor; y permitir que el reactivo de enlace se una al antígeno para formar un par reactivo-antígeno, por lo que la formación del par induce una respuesta inmunitaria del hospedero.
11. 11. Una composición farmacéutica para aumentar la inmunogenicidad de un antígeno que comprende poner en contacto un antígeno multi-epitópico asociado a un tumor expresado en el suero del hospedero, con una composición que comprende un reactivo de enlace que específicamente se une a un solo epítope en el antígeno asociado al tumor; y permitir al reactivo de enlace unirse al antígeno para formar un par reactivo-antígeno, por lo que la formación del par reactivo-antígeno induce una respuesta inmunitaria del hospedero.
12. 12. Una composición farmacéutica para reconformar un antígeno multi-epitópico asociado a un tumor expresado en un suero de hospedero y para reconocer e iniciar una respuesta inmunitaria, que comprende poner en contactó un antígeno multi-epitópico asociado a un tumor, expresado en el suero del hospedero, con una composición que comprende un reactivo de enlace que específicamente se une a un solo epítope en el antígeno asociado al tumor; y permitir al reactivo de enlace unirse al antígeno para formar un par reactivo-antígeno, por lo que la formación del par reactivo-antígeno induce una respuesta inmunitaria del hospedero.
13. 13. Un sistema de administración para un antígeno multi-epitópico asociado a un tumor expresado en el suero del hospedero, y para reconocer e iniciar una respuesta "inmunitaria, que comprende una composición que contiene un reactivo de enlace que específicamente se une a un solo epítope en un antígeno multi-epitópico asociado al tumor.
14. 14. Una composición farmacéutica conforme la reivindicación 1, en donde la formación de par reactivo-antígeno induce una respuesta inmunitaria del hospedero que supera la tolerancia del antígeno.
15. 15. Una composición farmacéutica conforme la reivindicación 1, en donde el paso de poner en contacto es ex vivo o in vivo.