ES2217304T3

ES2217304T3 - Matriz extracelular capaz de resorberse para la reconstruccion del tejido cartilaginoso.

Info

Publication number: ES2217304T3
Application number: ES96903128T
Authority: ES
Inventors: Peter Geistlich; Myron-Dep.Orth.Surg.-Brigham Hospital SPECTOR; Zdenek Eckmayer
Original assignee: Ed Geistlich Soehne AG fuer Chemische Industrie
Current assignee: Ed Geistlich Soehne AG fuer Chemische Industrie
Priority date: 1995-02-22
Filing date: 1996-02-22
Publication date: 2004-11-01
Anticipated expiration: 2016-02-22
Also published as: US20020048595A1; ATE265240T1; US6326029B1; CA2213533C; CA2213533A1; DE69632313D1; EP0810888A1; GB9503492D0; EP0810888B1; US6676969B2; WO1996025961A1; US7208177B2; DE69632313T2; US20020090391A1; JP3643381B2; JPH11503338A

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A UNA MATRIZ EXTRACELULAR REABSORBIBLE PARA LA RECONSTRUCCION DE TEJIDO CARTILAGINOSO FORMADA PRIMORDIALMENTE POR FIBRAS DE COLAGENO II.

Description

Matriz extracelular capaz de resorberse para la reconstrucción del tejido cartilaginoso.

La presente invención se refiere a un procedimiento para la preparación de una matriz extracelular capaz de resorberse para la reconstrucción del tejido cartilaginoso, a productos matriciales, por tanto, capaces de obtenerse, y a la utilización de dichos productos en la fabricación de injertos dirigidos de regeneración tisular.

En la ingeniería tisular, han habido dificultades durante mucho tiempo para reconstruir el cartílago. La reconstrucción tisular, en general, comprende el suministro de una matriz que sirve como guía para que las células crezcan a lo largo y entre las fibras matriciales. Hasta ahora, los intentos para la reconstrucción del cartílago, que utilizaban matrices basadas en el ácido poliláctico, ácido poliglicólico y colágeno I ó III, requerían que éstas fueran cargadas in vitro con condrocitos, antes del injerto de la matriz cargada en un sitio in vivo apropiado. No se ha demostrado que fuera posible injertar simplemente las matrices de este tipo en el sitio in vivo y confiar en el crecimiento de los condrocitos nativos sobre la superficie de la matriz. La necesidad de cargar la matriz con condrocitos in vitro antes del injerto, dio lugar a complicaciones y dificultades en términos del cultivo estéril de los condrocitos.

Es por tanto necesario un injerto matricial para la reconstrucción del tejido cartilaginoso, que permita el crecimiento interno de los condrocitos nativos después del injerto in vivo. Se ha encontrado que estos requerimientos pueden cumplirse con una matriz que incluya predominantemente fibras de colágeno II y la cual puede prepararse sometiendo el tejido colágeno a un desengrasado, seguido por tratamiento con una base.

El colágeno se encuentra en varias formas en el organismo animal y tejidos distintos contienen proporciones diferentes de los tipos respectivos. Así, mientras que el colágeno óseo comprende predominantemente colágeno I y III, el cartílago comprende predominantemente colágeno II junto con cantidades más pequeñas de colágenos VI, IX, X, XI y XIII. Dicho material difiere significativamente del material esponjoso de colágeno utilizado en medicina y en cosméticos, el cual, derivándose de la piel y de los tendones, está formado por colágeno I y/o III.

Según un aspecto de la presente invención, se proporciona un procedimiento para la preparación de una matriz extracelular capaz de resorberse que comprende predominantemente fibras de colágeno II y que es apropiada para la reconstrucción del tejido cartilaginoso, el cual procedimiento comprende el sometimiento del tejido cartilaginoso a un desengrasado, seguido por el tratamiento con una base.

La invención proporciona además una matriz extracelular capaz de resorberse obtenible mediante el procedimiento anteriormente definido.

Tal como se indicó antes, dicha matriz puede contener cantidades poco importantes de colágenos VI, IX, X, XI y XIII. La matriz que puede obtenerse según la invención contiene también, de modo deseable, un material tipo hidrogel, por ejemplo, que comprende glicosaminoglicanos tales como condroitín sulfato, queratan sulfato, dermatan sulfato y ácido hialurónico, que proporcionan un medio natural en el que los condrocitos pueden empotrarse (o fijarse) y desarrollarse. En general, la matriz que puede prepararse según la invención contiene preferentemente entre el 0,1 y el 40% en peso de glicosaminoglicano, por ejemplo 5-15%, por ejemplo, alrededor del 10% en peso. Otros aditivos, tales como por ejemplo, la condronectina o la ancorina II, pueden introducirse para colaborar en la fijación de los condrocitos a las fibras del colágeno II.

Es deseable someter la matriz colágena a algún grado de entrecruzamiento, con objeto de restringir el grado de hinchazón cuando la matriz se pone en contacto con fluidos acuosos, mientras se conserva su capacidad para ser resorbida, ya que el hinchamiento lleva a la pérdida de la fuerza y de la forma. Sin embargo, el entrecruzamiento químico puede presentar desventajas fisiológicas en términos del tamaño del poro, que podría influenciar negativamente las propiedades del colágeno; el tamaño del poro podría opcionalmente tener alrededor de 40 \mum, con objeto de promover la quimiotaxis y otras funciones de las células.

El material cartilaginoso utilizado en el procedimiento de la invención será normalmente de fuentes animales disponibles fácilmente, tales como de ganado, cabras o cerdos. El material preferido es el cartílago hialino de los cerdos. Este contiene el tipo correcto de colágeno y de glicosaminoglicano en proporciones deseables y está disponible en cantidades apropiadamente abundantes.

El cartílago se congela preferentemente después del sacrificio y se somete a reducción del tamaño, por ejemplo hasta un diámetro de partícula de alrededor de 8 mm. Antes de la reducción del tamaño, el cartílago se empapa preferentemente en agua y se separa mecánicamente de la carne, hueso y otros materiales no deseados.

El cartílago en partículas se somete entonces preferentemente a deshidratación mediante tratamiento con un disolvente orgánico miscible en agua tal cómo la acetona, que también sirve para eliminar algo de grasa. La deshidratación encoge las fibras de colágeno y las separa una de otra de forma que la etapa de desengrasado posterior es optimizada. El material se somete entonces a desengrasado con un disolvente de las grasas tal como un hidrocarburo (por ejemplo, hexano) o un hidrocarburo halogenado.

Después del desengrasado, el material se lava a fondo preferentemente; esto se continúa preferentemente hasta que una gran cantidad de agua ha sido absorbida, tal como se encontraba originariamente. Mediante este procedimiento, el material es optimizado para el tratamiento con una base que se realiza a continuación.

Este tratamiento con una base puede realizarse con un álcali fuerte, por ejemplo un hidróxido metálico alcalino, por ejemplo, hidróxido sódico, por ejemplo, a una concentración del 1-8% en peso. El tiempo de tratamiento, que variará según el material en bruto y la concentración del álcali, es generalmente de 10-48 horas. La temperatura del tratamiento estará generalmente por debajo de los 20ºC. El valor del pH es normalmente del orden de 12-14. Las condiciones anteriores son las que son óptimas para el tratamiento con el hidróxido sódico. El tratamiento con otras bases puede requerir condiciones ligeramente modificadas.

El tratamiento con una base posee los efectos siguientes:

cantidades pequeñas de grasa residual son saponificadas;

las proteínas no colágenas solubles en álcalis son desnaturalizadas, destruidas, disueltas y eliminadas;

los grupos amida en el colágeno son saponificados, cambiando por ello la carga eléctrica y el punto isoeléctrico del colágeno; y

las bacterias, priones y virus son inactivados y el colágeno, de este modo, es esterilizado.

Se ha encontrado que mediante este tratamiento, los proteoglicanos experimentan una modificación útil que puede caracterizarse de la siguiente forma:

El enlace covalente de los glicosaminoglicanos a la proteína nuclear en los proteoglicanos, es escindido. De esta manera los glicosaminoglicanos pueden ser liberados a partir de la proteína de los proteoglicanos. A esto se denomina la \beta-eliminación.

Mediante el tratamiento con la base, la proteína nuclear es dividida en pequeños péptidos que pueden ser eliminados a partir de la mezcla reactiva mediante diálisis o ultrafiltración.

Debido a la fuerte carga negativa, los glicosaminoglicanos forman sales solubles en agua que pueden arrastrarse parcialmente a partir del colágeno. Estas no son separadas, sin embargo, o, sólo ligeramente separadas por el tratamiento con la base, y pueden ser separadas de los péptidos mediante diálisis. Una parte de los glicosaminoglicanos (alrededor del 3% en peso del colágeno) se unen a éste.

Los glicosaminoglicanos purificados pueden obtenerse mediante diálisis o ultrafiltración del extracto resultante de la etapa de tratamiento con la base.

Según el procedimiento de la presente invención, el tratamiento enzimático no se utiliza, en general, teniendo en cuenta la variedad de distintas sustancias que están presentes. Sin embargo, etapas opcionales posteriores incluyen el tratamiento del material con un ácido orgánico o inorgánico, tal como el clorhídrico. Este tiene los efectos siguientes:

los materiales no deseados, sensibles al ácido, son eliminados; y la estructura fibrosa se afloja.

A continuación, el material puede lavarse, generalmente hasta que el valor del pH del material se encuentra entre 2,5 y 4,0. El valor del pH del material se controla de forma segura preferentemente y será uniforme a través del corte transversal del cartílago.

Después de tal tratamiento ácido, el cartílago se encuentra en una situación de hinchamiento acuoso, y puede someterse a una reducción mecánica del tamaño, por ejemplo, utilizando un triturador coloidal. La concentración del colágeno en el medio acuoso es entonces de 2,5-3,5% aproximadamente, en peso. El valor del pH de esta mezcla será algo ácido, por ejemplo, 3,5-4,5.

En este momento, los glicosaminoglicanos pueden añadirse a la masa de colágeno purificado, por ejemplo, del orden de 0,1-40%, preferentemente de 5 a 15%, del peso del colágeno.

Es preferible que tales glicosaminoglicanos añadidos al colágeno se extraigan a partir del cartílago natural, como se apuntó anteriormente en relación con el tratamiento con la base; tal utilización de los glicosaminoglicanos del cartílago es preferible a su incorporación a partir de distintas fuentes que no tienen la misma composición, peso molecular y propiedades fisiológicas que los glicosaminoglicanos del cartílago. La matriz contendrá entonces, además de colágeno II, los glicosaminoglicanos ácido hialurónico, condroitín sulfato y queratán sulfato. El condroitín sulfato y el queratán sulfato están unidos covalentemente a la proteína nuclear, mientras que el ácido hialurónico también está unido a los proteoglicanos pero no covalentemente. Mediante la acción de la base, la unión a la proteína nuclear se escinde y el glicosaminoglicano es liberado de la proteína. Además, la proteína nuclear se escinde a pequeños péptidos que son fácilmente eliminados mediante diálisis o ultrafiltración. Es importante que la proteína nuclear se elimine, ya que puede ser inmunológicamente activa. Esta capacidad para eliminar la proteína nuclear constituye, pues, una ventaja importante del procedimiento de la presente invención.

La recuperación de los glicosaminoglicanos a partir del extracto básico puede realizarse de la siguiente forma:

el medio se neutraliza a un valor pH del orden de 6-8;

las proteínas no colágenas se eliminan mediante tratamiento con un adsorbente, tal como el caolín;

se lleva a cabo la ultrafiltración del líquido, utilizando una membrana que permite el paso de moléculas de un peso menor que 10000 daltons; y

la concentración del líquido se realiza a un contenido en sólidos de alrededor del 2-5% en peso.

Después de la mezcla del glicosaminoglicano con el colágeno II, el material es homogenizado posteriormente de modo preferente, todavía, en un triturador coloidal, y el contenido sólido se ajusta a un porcentaje del 1,5-2,5 en peso. Esta masa puede servir entonces para la producción de dos tipos de producto, especialmente una esponja o una lámina de colágeno.

Para la producción de una esponja, la masa que resulta de la homogenización es congelada. El congelamiento debe controlarse de modo preciso, por lo que el tiempo de congelamiento, el valor del pH y el tamaño de las partículas se conservan exactamente con objeto de proporcionar un tamaño de poro reproducible. El producto congelado se liofiliza entonces. Después de la liofilización, la esponja se calienta hasta 120-140ºC durante por lo menos 2 horas. De esta forma, el material se estabiliza mediante un entrecruzamiento ligero. Después de la liofilización, el material se corta hasta un grosor deseado, se señala la forma requerida, se esteriliza y se empaqueta.

A causa de que la utilización de esponjas está limitada en algunos campos debido a la fuerza insuficiente, la matriz de colágeno capaz de prepararse según la invención, puede utilizarse con ventaja para la producción de láminas de colágeno, que son apropiadas para utilizar en una amplia gama de indicaciones médicas.

Para la producción de láminas de colágeno, la concentración de las fibras de colágeno II purificado en la suspensión líquida deberá ser del orden de 0,2- 3% en peso, ventajosamente del 0,5-2% en peso. El aire preferentemente se elimina.

Se forma entonces un gel como etapa intermedia. La producción del gel de colágeno puede llevarse a cabo mediante varias técnicas conocidas para la formación del gel.

El gel se seca entonces, normalmente sobre una placa. De esta forma, no sólo se elimina el agua, sino que se forman productos colágeno- glicosaminoglicanos insolubles, que son muy beneficiosos para el crecimiento de las células.

Para los productos mencionados, la matriz que puede prepararse según la invención puede completarse con sustancias activas. De este modo, puede utilizarse cualquier sustancia fisiológicamente activa que sea soluble o dispersable en agua. Así, la matriz puede contener ventajosamente sustancias medicinales tales como antibacterianos, por ejemplo, la taurolidina, o antibióticos tales como tetraciclinas y gentamicinas.

La invención proporciona también la utilización de una matriz capaz de prepararse según la invención en la fabricación de un injerto dirigido de regeneración tisular y en la de un injerto para uso en un procedimiento para la regeneración del tejido cartilaginoso en un organismo animal humano o no humano.

Los ejemplos siguientes se dan sólo como ilustrativos.

Ejemplo 1

Se empapó en agua fría cartílago congelado procedente de cerdos recién sacrificados, lavándose a fondo y purificándose mecánicamente a partir de los residuos de carne, huesos y trozos duros. Posteriormente, se lavó el material durante 30 minutos bajo agua corriente.

A continuación, el material se pulverizó tres veces en un homogenizador. El tamaño óptico de las partículas al final de la reducción de dicho tamaño fue de alrededor de 8 mm.

Los trozos de cartílago se deshidrataron lavándolos 4 veces con acetona, 8 horas cada vez. El cartílago se desengrasó entonces extrayéndolo cuatro veces con n-hexano. Cada tratamiento tardó como mínimo 8 horas. La proporción del hexano al cartílago fue de 1:10.

Después del desengrasado, el cartílago se hinchó en agua de bebida. La proporción de agua:material fue de 10:1. El tiempo de tratamiento fue de 24 horas.

El material se trató entonces con NaOH (5% en peso), y por ello la proporción del cartílago al líquido fue de 1:4 y el tiempo de tratamiento fue de 32 horas. Durante el tratamiento, los trozos de cartílago se agitaron bien. A continuación, se eliminó el álcali del cartílago. El pH original de 14 se redujo por tanto a 9-11. Las impurezas disueltas se eliminaron y se separaron del cartílago. El líquido resultante del tratamiento alcalino se recogió para la recuperación del glicosaminoglicano.

El material de colágeno se trató entonces con HCl fuerte (alrededor del 3% en peso), con un valor pH inicial inferior a 1,0. El tiempo de tratamiento fue de 4-6 horas.

Posteriormente, se lavó el material con agua fría el tiempo suficiente para que el valor del pH se elevara a 3-3,5. Todas las impurezas se eliminaron y el producto se convirtió en una masa de colágeno sin sales, apropiada para la producción de una esponja u de otro material de colágeno. A este propósito, la masa cartilaginosa puede ser, según el resultado que se persiga, desgaseada, congelada o liofilizada.

Ejemplo 2

El extracto que resulta del tratamiento alcalino en el Ejemplo 1 contenía glicosaminoglicanos, álcalis, proteínas desnaturalizadas y sales. El extracto se neutralizó en primer lugar con HCl, siendo 6 el valor del pH después de la neutralización. El extracto se trató entonces con un filtro ayuda, principalmente tierra de diatomeas, que tuvo el efecto de eliminar las proteínas desnaturalizadas. Se introdujo un 0,5% en peso de tierra de diatomeas en el extracto y se eliminó mediante filtración, junto con las proteínas desnaturalizadas.

El sobrenadante se sometió entonces a ultrafiltración, utilizando una membrana que muestra una extinción del peso molecular a alrededor de 10000 daltons. De esa forma, las sales se eliminaron para dejar glicosaminoglicanos purificados.

La solución de glicosaminoglicanos así obtenida se mezcló con el material colágeno anterior para proporcionar una matriz de colágeno II que contiene glicosaminoglicanos.

Ejemplo 3 (1) Determinación de residuos de hexosamina y aminoácidos en las esponjas de colágeno y en la piel de animales

Cada muestra, exactamente pesada (de alrededor de 10 mg), se hidrolizó en 10 ml de 3M ó 6M HCl a 1,05ºC durante 15 ó 20 horas, bajo nitrógeno purificado en un tubo precintado. Después de enfriar el tubo en una nevera y abrirlo, el contenido se transfirió a un matraz de cuello largo de 25 ml y se secó a 40ºC en un secador de rotación al vacío (Rotavapor RE120, Büchi, Suiza), bajo vacío por chorro de agua. Después de disolver el residuo en 5 ml de agua, éste se secó otra vez bajo vacío por chorro de agua. A continuación, el residuo se transfirió a un tampón de carga de 5 ml (0,2 M respecto a Na^{+}) a un pH de 2,2. Para la determinación de los valores de galactosamina y glucosamina, después de la dilución previa de una alícuota con el tampón de carga (1 + 10), 150 \mul de la muestra hidrolizada en 3M HCl se inyectaron en el cartucho de un analizador de aminoácidos (AlphaPlus, tipo 4151, Pharmacia-LKB, Freiburg) y se evaluaron comparándolos con un estándar con la ayuda de un ordenador (Shimadzu, Dusseldorf). El mismo procedimiento se llevó a cabo con la muestra hidrolizada en 6M HCl, en el que 50 \mul se inyectaron en un cartucho de una prueba posterior. La hidrólisis doble en 3M y 6M HCl es necesaria para la optimización del análisis de la hexosamina y de los aminoácidos, ya que los valores máximos para la hexosamina y también la tirosina, se obtienen solamente después de la hidrólisis en 3M HCl, mientras que los valores máximos se obtienen sólo para la valina, isoleucina y leucina, después de la hidrólisis en 6M HCl.

2. Determinación del contenido de colágeno nativo en las esponjas de colágeno y en la piel de animales

25-30 mg (exactamente pesados) de la muestra se introdujeron en 30 ml de una solución de carbonato ácido de sodio 0,1M (pA, Merck, Darmstadt), pH 8,2, a la que se añadieron 1,5 ml de una solución de tripsina de 6 mg/ml (preparación liofilizada procedente del páncreas bovino, Boehringer, Mannheim), incubándose durante 8 horas a 23 \pm 1ºC en un baño acuoso con agitación (Julabo SWI, Seelbach). Después de enfriar la muestra en un habitáculo a una temperatura de 4ºC, se centrifugó a 4ºC en un 60 Ti-Rotor (Beckman, Munich) a 32000 RpM durante 30 minutos. El residuo se filtró en una célula de ultra filtración agitada (Mod 8010, Amicon, Witten) mediante un Filtro PM 10 Diaflow (Amicon, Witten), de 25 mm de diámetro, hidrolizándose 1 ml del filtrado en 6M HCl durante 20 horas a 105ºC. El procesamiento posterior y el análisis del hidrolizado es idéntico que el descrito anteriormente (1), con la excepción de que la absorción ulterior de la muestra después de realizar la evaporación dos veces hasta sequedad, fue en un tampón de carga de 150 \mul y por ello 150 \mul se inyectaron en el cartucho de prueba del analizador de aminoácidos. El valor de la hidroxiprolina obtenido después del análisis de los aminoácidos (en \mumol/g de la sustancia de inicio), representa la parte del colágeno degradable en la muestra. Cuando el valor de la hidroxiprolina de una hidrólisis paralela (6M HCl) y la muestra analizada (véase (1) antes) que representa el contenido total de colágeno, se compara con el valor de hidroxiprolina, se indica la proporción del porcentaje del "nativo", que es colágeno no degradable por la tripsina.

Los resultados se muestran en la tabla siguiente.

TABLA

	\mumol/g	mol/1000 mol

hidroxiprolina	795,4	97
ácido aspártico	381,7	47
treonina	190,1	23
serina	257,0	31
ácido glutámico	691,3	84
prolina	913,12	112
glicina	2614,6	320
alanina	864,9	106
cisteína/2	11,5	2
valina	195,7	24
metionina	62,7	8
isoleucina	92,8	11
leucina	229,9	28
tirosina	27,0	3
fenilalanina	119,9	15
histidina	39,8	5
hidroxilisina	126,4	15
lisina	173,5	21
arginina	395,5	48

Total	8182,9	1000

Glucosamina	9,68	1,18
galactosamina	46,30	5,66

Hidroxiprolina total	795,4 \mumol/g
Hidroxiprolina degradable por la tripsina	36,9 \mumol/g

Contenido de colágeno "nativo"	95,4%

Claims

1. Procedimiento para la preparación de una matriz extracelular capaz de resorberse que comprende predominantemente fibras de colágeno II y que es apropiada para la reconstrucción del tejido cartilaginoso, el cual procedimiento comprende someter el tejido cartilaginoso a un desengrasado, seguido por el tratamiento con una base.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, que comprende además la etapa de añadir entre 0,1 y 40% en peso, por ejemplo 5-15% en peso, de un glicosaminoglicano a la matriz.

3. Procedimiento según la reivindicación 2, en el que el glicosaminoglicano es condroitín sulfato, queratan sulfato, dermatan sulfato o ácido hialurónico.

4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende además la etapa de añadir condronectina y/o ancorina II a la matriz.

5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el colágeno se somete a entrecruzamiento sin que se transforme en no reabsorbible.

6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho tejido cartilaginoso se deriva del cartílago natural.

7. Procedimiento según la reivindicación 6, en el que dicho tejido cartilaginoso se deriva del ganado, de cabras o de cerdos.

8. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que dicho tejido cartilaginoso es cartílago hialino de cerdos.

9. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho tejido cartilaginoso se somete a desengrasado con un disolvente de las grasas.

10. Procedimiento según la reivindicación 9, en el que dicho disolvente de grasas, es un hidrocarburo o un hidrocarburo halogenado.

11. Procedimiento según la reivindicación 10, en el que dicho disolvente de grasas, es hexano.

12. Matriz extracelular capaz de resorberse, que puede obtenerse mediante el procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.

13. Utilización de una matriz, según la reivindicación 12, en la fabricación de un injerto dirigido de regeneración tisular.

14. Utilización de una matriz según la reivindicación 12, en la fabricación de un injerto para su empleo en un procedimiento de regeneración del tejido cartilaginoso en el organismo animal humano o no humano.