ES2212796T3

ES2212796T3 - Mutantes del virus de la hepatitis b, reactivos y metodos de deteccion.

Info

Publication number: ES2212796T3
Application number: ES94917325T
Authority: ES
Inventors: William Carman; Richard H. Decker; Lesley Wallace; Larry T. Mimms; Larry R. Solomon
Original assignee: University of Glasgow; Abbott Laboratories
Current assignee: University of Glasgow; Abbott Laboratories
Priority date: 1993-05-07
Filing date: 1994-05-09
Publication date: 2004-08-01
Anticipated expiration: 2014-05-09
Also published as: US5595739A; CA2162132A1; DE69433285T2; JP3813168B2; US5925512A; CA2162132C; DE69433285D1; EP0745128A4; EP0745128B8; AU6908294A; EP0745128B1; JPH08510129A; WO1994026904A1; US5593825A; EP0745128A1; US5591440A

Abstract

LAS SECUENCIAS MUTANTES DE ACIDO NUCLEICO DEL VIRUS DE LA HEPATITIS B (VHB) UTILES PARA UNA VARIEDAD DE APLICACIONES DIAGNOSTICAS Y TERAPEUTICAS, EQUIPOS PARA USAR LAS SECUENCIAS DE ACIDO NUCLEICO DEL VHB, PARTICULAS INMUNOGENICAS DEL VHB Y UN METODO PARA PRODUCIR ANTICUERPOS PARA EL VHB. TAMBIEN SE PROPORCIONAN METODOS PARA PRODUCIR ANTICUERPOS, POLICLONALES O MONOCLONALES, A PARTIR DE LAS SECUENCIAS DE ACIDO NUCLEICO DEL VHB.

Description

Mutantes del virus de la hepatitis B, reactivos y métodos de detección.

Antecedentes de la invención

Esta invención se refiere en general a mutantes del virus de la hepatitis B (HBV), y más particularmente, se refiere a nuevos mutantes de HBV, su importancia en aplicaciones clínicas, su uso como reactivos en la detección de infecciones de HBV e inmunidad y su uso en vacunas.

Se sabe que HBV causa varios estados de enfermedad, desde leves infecciones subclínicas hasta hepatitis crónica activa y fulminante. El genoma de la hepatitis B es un ADN circular, parcialmente de doble hebra de aproximadamente 3.200 pares de base que codifica para siete proteínas virales. P. Tiollais et al., Nature 317:489-495 (1985). El gen de la polimerasa solapa completamente con los genes PreS1, PreS2 y S de la envuelta viral, y solapa parcialmente con los genes X y del núcleo. La envuelta del virión de la hepatitis B está formada por tres proteínas y sus derivados glicosilados. Estas proteínas, denominadas proteínas de superficie de la hepatitis B (HB) pequeñas (S), medianas (M) y grandes (L) contienen la secuencia génica S. W. H. Gerlich et al., en Viral Hepatitis and Liver Disease, F. B. Hollinger et al., Eds. Williams-Wilkens, Baltimore, MD páginas 121-134 (1991). Las MHB contienen la secuencia Pre2 (55 aminoácidos [a.a.]) y la proteína L contiene la secuencia PreS1 (108 ó 119 a.a., dependiendo del subtipo) más la secuencia PreS2. Sólo una porción muy pequeña del total del antígeno de superficie de la hepatitis B existe como viriones completos o partículas Dane. Otras dos formas morfológicas, las partículas esféricas de 20 nm y los filamentos de 22 nm de diámetro y longitud variable, carecen de cápside o de ADN y se producen en gran exceso sobre los virones de HBV.

Los genes centrales codifican para las proteínas de la nucleocápside (183 o 185 a.a.), antígeno del núcleo de la hepatitis B (HBcAg). Inmediatamente secuencia arriba del gen principal está la región preprincipal que consiste en 87 nucleótidos que codifican para 29 a.a. en fase con el gen del núcleo. Los primeros 19 a.a. de la región prenucleo sirven como señal para la translocación de membrana y eventualmente, secreción de producto del gen prenucleo, denominado HBeAg. La función de HBe es enigmática pero puede ayudar al virus a escapar de la vigilancia inmune para inducir tolerancia inmune.

Debido a la compactación genómica y los solapamientos funcionales extensos, sería de esperar que esta restricción en la divergencia de la secuencia del ADN ocurriera para mantener una capacidad genómica de replicación y transmisión eficaz. El virus de la hepatitis B, sin embargo, muestra mayor mutabilidad de la que se apreció previamente. Similar a la del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), HBV usa la transcriptasa inversa (RT) como una etapa esencial del ciclo de replicación. RT tiene poca capacidad para corregir, llevando a una alta proporción de incorporación errónea de nucleótidos. Los cálculos sugieren que esta propensión al error en la replicación lleva a un punto de sustitución, deleción o inserción por cada 1.000 a 10.000 nucleótidos copiados. W. Carman et al., Lancet 341:349-353 (1993). La variabilidad en el virus se descubrió por primera vez a través de estudios clásicos de subtipaje de HBsAg. A. M. Courouce et al., Bibliotecha Haematológica 42:1 (1976).

Las mutaciones pueden no localizarse de forma aleatoria en el genoma. Publicaciones recientes han documentado la aparición de otras mutaciones en las proteínas de los genes del prenúcleo, núcleo y envuelta, PreS y S, que presumiblemente dan a estos mutantes una ventaja selectiva sobre el tipo salvaje (WT) para evadir al sistema inmune.

Las pruebas sugieren que el aclaramiento viral y el daño de las células hepáticas en infección por HBV están mediados por una respuesta de linfocitos T citotóxico (CTL) hacia uno o más antígenos codificados por HBV expresados en la superficie del hepatocito. M. Peters et al., Hepatology 13:977-994 (1991). Se encontró una fuerte respuesta de células T contra antígenos HBcAg y HBeAg, pero no contra los antígenos de la envoltura, en hepatitis B aguda. La persistencia de la replicación viral correlaciona con un despunte de la respuesta de células T a HBcAg. Aunque la respuesta de la célula T al antígeno viral puede eliminarse en HBV crónica, la respuesta CTL puede persistir en portadores crónicos.

También hay pruebas de respuesta humoral en curso en portadores de la hepatitis B sintomáticos y asintomáticos. Se observan altos niveles de anti-HBc en prácticamente todos los portadores de HBV. El veinte por ciento de muestras al azar positivas para HBsAg tienen HBeAg y anti-HBe detectables, y del 10 al 20% tiene niveles detectables pero bajos de anti-HBs. Una publicación reciente que usa métodos de detección muy sensibles indica que prácticamente todos los pacientes HBV con enfermedad hepática y aproximadamente el 50% de los pacientes con hepatitis B crónica sin enfermedad hepática tienen respuesta inmunes humorales específicas demostrables contra HBeAg y anti-HBsAg y Ag PreS. Sin embargo, la mayoría de las respuestas anti-HBs pueden darse debido a las diferentes especificidades finas de HBsAg y anti-HBs y, probablemente, no es neutralizante. Estos datos mantienen la teoría de que está en curso una vigilancia inmune contra los productos de los genes del prenúcleo, núcleo y envuelta en portadores crónicos de HBV que puede proporcionar una presión selectiva para la aparición de los variantes de HBV.

Las regiones de la envoltura de HBV abarcan PreS1 y PreS2, y la región de 120 a 160 a.a. de S que están expuestos en la superficie de las partículas virales, y por tanto, se esperaría que fueran objetivo de la vigilancia inmune. W. H. Gerlich et al., supra. Algunos mutantes S descritos hasta la fecha tiene afectada significativamente la antigenicidad del o de los epítopos "a" que es un determinante o determinantes comunes específicos de grupo de SHB. W. Carman et al., Gastroenterology 102:711-719 (1992). Los determinantes "a" son complejos, conformacionales y dependen de puentes disulfuro entre restos de cisteína altamente conservados. La inmunoreactividad de "a" puede mimetizarse parcialmente por péptidos sintéticos cíclicos. Aunque el o los epítopos "a" tradicionalmente se han definido por reactividad con antisueros policlonales, el uso de anticuerpos monoclonales ha mostrado que la región "a" consiste en al menos cinco epítopos que no solapan. D. Peterson et al., J. Immunol. 132:920-927 (1984). Se ha descrito que la variación genética del determinante "a" lleva a un escape inmune en vacunas en Italia y Japón en pacientes de trasplante hepático bajo terapia con anticuerpo monoclonales anti-a. Véase, por ejemplo, W. F. Carman et al., Lancet 336:325-329 (1990); H. Okamoto et al., Pediatric Research 32:264-268 (1992); G. McMahon et al., Hepatology 15:757-766 (1992); H. Fujii et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 184:1152-1157 (1992); y T. J. Harrison et al., J. of Hepatology 13:5105-5107 (1991). El mutante más común descrito hasta la fecha es una sustitución en un único nucleótido que lleva a la sustitución de una glicina por una arginina (G-R 145). Esta mutación destruye alguno, pero no todos los epítopos "a". No ha sido problemática la detección de anti-HBs con un anticuerpo monoclonal.

Otra mutación en la región "a" lleva a la pérdida de determinante específicos de subtipo o tipo, y/d y w/r. Varios artículos recientes han documentado la aparición de deleciones mayores o mutaciones puntuales en la región PreS1/PreS2 lo que sugiere que la producción de estos productos de los genes de la envuelta también está bajo la selección inmune en individuos crónicamente infectados. Se han publicado mutantes HBV que no pueden replicarse debido a las deleciones en los genes env, C o P en el plasma de portadores de HBV. Todos coexisten con formas de HBV que tienen replicación competente. Okamoto et al. (supra) demuestran que los genomas mutantes con deleciones groseras en los genes PresS/S, C y P derivados del plasma de portadores asintomáticos puede complementarse en un sistema de expresiones transitorias con células de hepatoma. La complementación se midió como la capacidad para secretar partículas virales con genomas mutantes en los medios de cultivo. Sorprendentemente, todos los mutantes tenían una señal de encapsulación intacta. Se demostró la complementación con virus WT predecesores, otros mutantes e incluso con secuencias de ADN de HBV integrado en los cromosomas del hospedador en este sistema in vitro. Por tanto, se hizo la sugerencia de que los mutantes HBV actúan como partículas deficazs que interfieren pueden atenuar la replicación del virus WT y, de ese mono, ayudar a mantener la persistencia de la infección.

La detección de mutantes de antígenos de la superficie de hepatitis B, por tanto, es importante. Los mutantes pueden desarrollarse a lo largo del tiempo debido a factores como la administración de una vacuna o una infección. La identificación y detección de mutante o mutantes de los virus de la Hepatitis B puede llevar al desarrollo de vacunas y sistemas de detección para determinar la presencia de estos mutantes en muestras problema. Por tanto, no sólo existe una necesidad de identificar estas cepas mutantes, sino también de sistemas de detección capaces de determinar la presencia de los mutantes en una muestra de ensayo. También existe una necesidad adicional para desarrollar una vacuna para dicha cepa o cepas de mutantes.

Resumen de la invención

Esta invención describe un mutante del virus de la hepatitis B que tiene un determinante "a" modificado en el que hay una inserción de dos aminoácidos en la posición 122 de la secuencia de HBsAg, cuya inserción corresponde con una inserción de seis nucleótidos en la posición 366 del genoma de HBsAg. Los dos aminoácidos insertados en la posición 122 son N y T, mientras que la correspondiente secuencia de nucleótidos que aparece en la posición 366 de la secuencia de nucleótidos es -A-A-C-A-C-A-.

Esta invención proporciona a un polipéptido purificado del mutante HBV que comprende un determinante "a" modificado en el que hay una inserción de seis nucleótidos en la posición 366 del genoma de HBsAg, un polinucleotido recombinante del mutante HBV que comprende un determinante "a" modificado en el que hay una inserción de dos aminoácidos en la posición 122 de la secuencia de HBsAg, una células hospedadora y vectores recombinantes que enumeran esta inserción. Los dos aminoácidos insertados en la posición 122 son N y T, mientras que la correspondiente secuencia de nucleótidos que aparece en la posición 366 de la secuencia de nucleótidos es -A-A-C-A-C-A-. El polipéptido recombinante del HBV mutante comprende una secuencia derivada de un genoma de HBV mutante. También, el polinucleotido recombinante de HBV mutante comprende un epítopo de HBV mutante. La invención también proporciona un sistema de expresión recombinante que comprende un marco abierto de lectura de ADN derivado del genoma de HBV mutante, en donde el marco abierto de lectura está unido operativamente a una secuencia control compatible con un hospedador deseado, células transformadas con dicho sistema de expresión recombinante y los polipéptidos producidos por dichas células. La invención además proporciona un HBV mutante purificado, que puede comprenden una preparación de polipéptido de HBV mutante. Todas las realizaciones enumeran la modificación del determinante "a" que tiene una inserción de dos aminoácidos en el aminoácido 122 y una inserción de seis nucleótidos en el 366.

Adicionalmente, la presente invención proporciona un polipéptido recombinante que comprende una secuencia derivada del genoma de un HBV mutante, y un polipéptido recombinante que comprende un epítopo de HBV mutante, También proporciona un anticuerpo dirigido contra al menos un epítopo del HBV mutante. El anticuerpo es policlonal o monoclonal. La invención además proporciona un polipéptido de fusión que comprende un polipéptido de HBV mutante.

La invención también proporciona una partícula que es inmunogénica contra una infección de HBV mutante, que comprende un polipéptido de HBV no mutante que tiene una secuencia de aminoácidos capaz de formar una partícula cuando dicha secuencia se produce en un hospedador eucariótico o procariótico, y un epítopo de HBV mutante, una sonda polipeptídica del HBV mutante y varios kit de prueba para llevar a cabo varios método para detectar el antígeno HBV mutante o el anticuerpo HBV mutante.

Además, la invención proporciona un método para producir un polipéptido que contiene un epítopo de HBV mutante que comprende la incubación de las células hospedadoras transformadas con un vector de expresión que contiene una secuencia que codifica para un polipéptido que contiene un epítopo de HBV, bajo las condiciones y por el tiempo que permiten la expresión de dicho polipéptido.

Además, se proporciona un método de detección de ácidos nucleicos de HBV mutante en una muestra de ensayo sospechosa de contener un HBV mutante, en donde el método comprende la reacción de la muestra de ensayo con una sonda de un polinucleotido de HBV mutante bajo condiciones y por el tiempo que permitan la formación de un complejo entre la sonda y el ácido nucleico del HBV mutante de la muestra de ensayo; y la detección del complejo que contiene la sonda. Un método adicional para detectar antígenos de HBV mutante en una muestra de ensayo sospechosa de contener HBV mutante comprende poner en contacto una muestra de ensayos con un anticuerpo dirigido contra el antígeno HBV mutante que ha de ser detectado un el tiempo y bajos las condiciones suficientes para permitir la formación de complejos anticuerpo/antígeno; y detectar dichos complejos que contienen el anticuerpo. Aún otro método para la detección de anticuerpo HBV mutantes en una muestra de ensayo sospechosa de contener dichos anticuerpos, comprende poner en contacto la muestra de ensayo con un polipéptido sonda en donde dicho polipéptido contiene un epítopo de HBV mutante, durante el tiempo y bajo las condiciones suficientes para permitir la formación de los complejos antígeno/anticuerpo; y detectar dichos complejos que contiene el polipéptido
sonda.

También se proporciona una vacuna para el tratamiento de la infección por HBV mutante que comprende una dosis farmacológicamente eficaz de un polipéptido inmunogénico de HBV mutante que contiene un epítopo de HBV mutante en un excipiente farmacéuticamente aceptable. La vacuna para el tratamiento de la infección por HBV mutante también puede comprender un mutante HBV inactivado o atenuado en una dosis farmacológicamente eficaz en un excipiente farmacéuticamente aceptable.

Además, la invención proporciona Células desarrolladas en cultivo tisular infectadas con HBV mutante y un método para producir anticuerpos contra el HBV mutante que comprende administrar a un individuo un polipéptido inmunogénico aislado que contiene un epítopo de HBV mutante en cantidad suficiente para producir una respuesta inmune.

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona la caracterización de un mutante recién establecido de HBV que tiene una inserción de dos aminoácidos (N-T) en la posición 122 de la región de la envuelta de HBV. La presente invención proporciona métodos para determinar la presencia del mutante HBV en una muestra de ensayo, y reactivos útiles en estos métodos. Todos los aspectos proporcionan una modificación del determinante "a" en el cual hay una inserción de dos aminoácidos en la posición 122 de la secuencia de HBsAg, que corresponde con una inserción de seis nucleótidos en la posición 366 del genoma de HBsAg.

La secuencia del ácido nucleico derivado del HBV mutante, o una porción de éste, es útil como sonda para determinar la presencia de HBV mutantes en las muestras problema. La secuencia también hace que dispongamos de las secuencias de polipéptidos del antígeno o antígenos de HBV mutante codificados por el genoma o los genomas de tal mutante HBV y permite la producción de polipéptidos que son útiles como estándar o reactivos en las pruebas de diagnóstico y/o como componentes de vacunas. Los anticuerpos monoclonales y policlonales dirigidos contra un epítopo contenido en estas secuencias polipeptídicas, también son útiles para las pruebas diagnósticas, así como agentes terapéuticos, para la selección de agentes antivirales, y para el aislamiento de los HBV mutantes a partir de los que se derivan esos ácidos nucleicos.

Según uno de los aspectos de la invención, se proporcionará un polipéptido purificado de HBV mutante, un polipéptido recombinante de HBV mutante, un polipéptido recombinante que comprende una secuencia derivada de un genoma de HBV mutante; un polipéptido recombinante que codifica para un epítopo de HBV mutante; un vector recombinante que contiene cualquiera de los polipéptidos recombinante descritos anteriormente, y una célula hospedadora transformada con uno de estos vectores. Todos los aspectos proporcionan una modificación del determinante "a" en el cual hay una inserción de dos aminoácidos en la posición 122 de la secuencia de HBsAg, que se corresponde con una inserción de seis nucleótidos en la posición 366 de genoma del genoma de HBsAg.

En otro aspecto de la invención, se proporcionará un antígeno purificado del HBV mutante; una preparación de polipéptidos a partir del HBV mutante purificado; un polipéptido purificado del HBV mutante; un polipéptido purificado que comprende un epítopo que es inmunológicamente identificable con un epítopo contenido en el HBV mutante.

Aún en otro aspecto de la invención se proporcionará un sistema de expresión recombinante que comprende un marco abierto de lectura (ORF) de ADN derivado del genoma de un HBV mutante, en donde el ORF está unido de forma operativa a una secuencia control compatible con un hospedador deseado, una célula transformada con el sistema de expresión recombinante y un polipéptido producido por la célula transformada.

Aspectos adicionales de la presente invención incluyen un polipéptido recombinante de HBV mutante, un polipéptido recombinante comprendido en una secuencia derivada de un genoma de HBV mutante; un polipéptido recombinante que comprendido en un epítopo de HBV mutante y un polipéptido de fusión que comprende un polipéptido de HBV mutante.

La presente invención también proporciona métodos para producir un anticuerpo monoclonal que une específicamente al menos un epítopo de HBV mutante; una preparación purificada de anticuerpos policlonales que específicamente unen al menos a un epítopo de HBV mutante; y métodos para usar estos anticuerpos, que incluyen usos diagnósticos, pronósticos y terapéuticos.

Aún en otro aspecto de la invención se proporcionara una partícula que es inmunogénica contra la infección por HBV mutante que comprende un polipéptido de HBV no mutante con una secuencia de aminoácidos capaz de formar una partícula cuando dicha secuencia se produce en un hospedador eucariótico y un epítopo de HBV mutante.

También se proporcionará una sonda polinucleotídica de HBV mutante.

La presente invención proporciona kits que contienen reactivos que puede usarse para la detección de la presencia y/o cantidad de polinucleótidos derivados de HBV mutante, comprendiendo tales reactivos una sonda polinucleotídica que contiene una secuencia de nucleótidos de HBV mutante de aproximadamente 8 o más nucleótidos en recipiente adecuado y cuyos nucleótidos codifican para la inserción de dos aminoácidos de la posición 122; un reactivo para detectar la presencia y/o cantidad de un antígeno de HBV mutante que comprende un anticuerpo dirigido contra el antígeno de HBV mutante que ha de detectarse en un recipiente apropiado; un reactivo para la detección de la presencia y/o cantidad de anticuerpos dirigidos contra un antígeno de HBV mutante que comprende un polipéptido que contiene un epítopo de HBV mutante presente en el antígeno HBV mutante, proporcionado en un contenedor adecuado. También se proporcionan otros formatos de kits para varios ensayos en la presente invención como se describe aquí.

Otros aspectos de la presente invención incluyen un polipéptido que comprende un epítopo de HBV mutante unido a una fase sólida y un anticuerpo contra un epítopo de HBV mutante unido a una fase sólida. También incluye métodos para producir un polipéptido que contiene un epítopo del HBV mutante que comprende la incubación de las células hospedadoras transformadas con un vector de expresión que contiene una secuencia que codifica para un polipéptido que contiene un vector de expresión que contiene una secuencia que codifica para un polipéptido que contiene un epítopo de HBV mutante bajo condiciones que permiten la expresión del polipéptido, y un polipéptido que contiene un epítopo de HBV mutante producido por este método.

La presente invención también proporciona ensayos en los que se utilizan los polipéptidos recombinante o sintético proporcionados por la invención, así como los anticuerpos descritos en la presente invención en varios formatos, cualquiera de los cuales puede emplear un compuesto que genera una señal en el ensayo. También se proporcionan los ensayos que no utilizan compuestos que generan señal para proporcionar un medio de detección. Todos los ensayos descritos generalmente detectan el antígeno o el anticuerpo, o ambos, e incluyen poner en contacto una muestra de ensayo con al menos un reactivo proporcionado en la presente invención para formar al menos un complejo antígeno/anticuerpo y detectar la presencia del complejo. Estos ensayos se describen en detalle en la presente
invención.

Se incluyen en la presente invención vacunas para el tratamiento de la infección por HBV mutante que comprende un péptido inmunogénico que contiene un epítopo de HBV mutante, o una preparación inactivada de HBV mutante, o un preparación atenuada de HBV mutante. También se incluye en la presente invención un método para la producción de anticuerpos contra HBV mutante que comprende administrar a un individuo un polipéptido inmunogénico aislado que contiene un epítopo de HBV mutante en una cantidad suficiente para producir una respuesta inmune en el individuo inoculado.

También la presente invención proporciona una célula crecida en un cultivo tisular infectada con HBV mutante.

Definiciones

Nota: Todas las definiciones incluyen la modificación del determinante "a" en el que hay una inserción de dos aminoácidos en la posición 122 de la secuencia de HBsAg, que corresponde con una inserción de seis nucleótidos en la posición 366 del genoma de HBsAg. El término "HBV mutante" significa un aislado viral que tiene esta modificación en el determinante "a".

Un polipéptido "derivado a partir de" una secuencia designada, del genoma del HBV mutante se refiere a una secuencia polinucleotídica que se compone de una secuencia de aproximadamente al menos unos 6 nucleótidos, preferiblemente al menos aproximadamente unos 8 nucleótidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 10 a 12 nucleótidos, e incluyo más preferiblemente al menos aproximadamente 15 a 20 nucleótidos correspondiente, es decir, homólogos a o complementarios de, una región de la secuencia nucleotídica deseada. Preferiblemente, la secuencia de la región a partir de la cual se deriva el nucleótido es homologa o complementaria con una secuencia que es único en el genoma de HBV mutante. Si una secuencia es complementaria u homóloga o no con una secuencia que es única para un genoma de HBV mutante puede determinarse por técnicas conocidas por los especialistas en la técnica. Las comparaciones de secuencias en bancos de datos, por ejemplo pueden usarse como método para determinas la singularidad de una secuencia designada.

El polipéptido derivado no necesariamente será derivado físicamente a partir de la secuencia de nucleótidos de HBV mutante, ya que puede generarse de cualquier otra manera, incluyendo, pero no de forma limitante por síntesis química, replicación o transcripción inversa o transcripción, que se basa en la información proporcionada por la secuencia de bases de la región o regiones a partir de las cuales se deriva el polinucleotido. Además, combinaciones de regiones correspondientes con las de la secuencia designada pueden modificarse de maneras conocidas en la técnica para ser consecuente con el uso deseado.

Un polipéptido o secuencia de aminoácidos derivado a partir de una secuencia de ácido nucleico designada o a partir de un genoma de HBV mutante referido a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a la de un polipeptídico codificado en la secuencia, o una porción de ésta en donde la porción consiste en al menos 2 a 5 aminoácidos y más preferiblemente al menos 8 a 10 aminoácidos, e incluso más preferiblemente de 15 a 20 aminoácidos, o el cual es inmunológicamente identificable con un polipéptido codificado en la secuencia.

Una "proteína recombinante" ("polinucleotido recombinante") como se usa en la presente invención significa al menos un polipéptido de origen genómico, semisintético o sintético que en virtud de su origen o manipulación no está asociado con toda o una parte del polinucleotido con el cual se asocia en la naturaleza o en forma de una librería y/o está unido a otro polinucleotido distinto al cual está unido en la naturaleza. No se traduce necesariamente un polipéptido recombinante o derivado a partir de la secuencia de ácido nucleico designada del HBV mutante o del genoma de mutante HBV. También puede generarse de alguna forma, incluso por síntesis química o expresión de un sistema de expresión recombinante, o aislamiento del HBV mutado.

El término "polinucleotido" como se usa en la presente invención significa una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos. Este término de refiere sólo a la estructura primaria de la molécula. Por tanto, el término incluye ADN de hebra doble y sencilla, así como ARN de hebra doble y sencilla. También incluye modificaciones, por metilación y/o por encapuchado, y formas no modificadas del polinucleotido.

"Polinucleotido viral purificado" se refiere a un genoma de HBV mutante o fragmento de éste que es básicamente libre, es decir, contiene menos de aproximadamente un 50%, preferiblemente menos de aproximadamente el 70%, e incluso más preferentemente, menos de aproximadamente el 90% de polipéptidos con el cual el polipéptido viral se asocia naturalmente. Las técnicas para purificar los polinucleótidos virales son bien conocidas en la técnica e incluyen, por ejemplo, la interrupción de la partícula con un agente caotrópico, la separación del polinucleotido o polinucleótidos y polipéptidos por cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad y sedimentación según densidad. De este modo, "polipéptido viral purificado" significa un polipéptido de HBV mutante o fragmento de éste que es básicamente libre, esto es, contiene menos de aproximadamente el 50%, preferiblemente menos de aproximadamente el 70%, e incluso mas preferiblemente, menos de aproximadamente el 90% de los componentes celulares con el que el polipéptido viral está asociado naturalmente. Los métodos para la purificación son conocidos por los
especialistas.

"Polipéptido" como se usa en la presente invención indica una cadena molecular de aminoácidos y no se refiere a un producto de longitud específica. De este modo, péptidos, oligopéptidos, y proteínas se incluyen en la definición de polipéptido. Sin embargo, no se pretende que este término se refiera a modificaciones posteriores a la expresión del polipéptido, por ejemplo, glicosilaciones, acetilaciones, fosforilaciones y similares.

"Células hospedadoras recombinantes", "células hospedadores", "líneas celulares", "cultivos celulares" y otros términos tales que denotan microorganismos o líneas celulares eucarióticas superiores cultivadas como entidades unicelulares se refiere a células que pueden ser, o han sido, usadas como receptores de vector recombinante u otra ADN transferido, e incluye la progenie original de la célula origina que se ha transfectado.

Como se usa en la presente invención "replicón" significa cualquier elemento genético, tal como un plásmido, un cromosoma, un virus, que se comporta como unidad autónoma de replicación del polinucleotido en una célula. Esto es, es capa de replicación bajo su propio control.

Un "vector" es un replicón al cual se ha unido otro segmento polinucleotídico, como para provocar la replicación y/o expresión del segmento unido.

El término "secuencia control" se refiere a las secuencias polinucleotídicas que son necesarias para lograr la expresión de las secuencias codificadoras a las cuales están ligadas. La naturaleza de tales secuencias control difiere dependiendo del organismo hospedador. En procariotas, tales secuencias control generalmente incluyen promotor, sitios de unión ribosomal y terminadores; en eucariotas, tales secuencias control generalmente incluyen promotores, terminadores y, en algunos casos, potenciadores. El término "secuencia control" de este modo se desea que incluya como mínimo todos los componentes cuya presencia es necesaria para la expresión, y también puede incluir componentes adicionales cuya presencia es ventajosa, por ejemplo, secuencias líder.

"Unido de forma operativa" se refiere a una situación en donde los componentes descritos están en una relación que les permite funcionar en su forma deseada. De este modo, por ejemplo, una secuencia control "unida de forma operativa" a una secuencia codificadora se liga de tal manera que se alcanza la expresión de la secuencia codificadora bajo condiciones compatibles con las secuencias control.

El término "marco abierto de lectura" u "ORF" se refiere a una región de una secuencia polinucleotídica que codifica para un polipéptido; esta región puede representar una porción de una secuencia codificadora o una secuencia codificadora total.

Una "secuencia codificadora" es una secuencia polinucleotídica que se transcribe en un ARNm y/o se traduce en un polipéptido cuando se sitúa bajo el control de unas secuencias reguladoras apropiadas. Los límites de la secuencia codificadora se determinan por un codón de iniciación de la traducción en el extremo 5' y un codón de terminación de la traducción en el extremo 3'. Una secuencia codificadora puede incluir, pero no de forma limitante, secuencias de ARNm y polipéptidos recombinantes.

El término "inmunológicamente identificable con/como" se refiere a la presencia de un epítopo(s) y polipéptido(s) que también están presentes y son únicos del polipéptido(s) designados, normalmente proteínas de HBV mutante. La identidad inmunológica puede determinarse por unión a anticuerpo y/o por competencia de unión. Estas técnicas son bien conocidas por el especialista y también se describen en la presente invención. La singularidad de un epítopo también puede determinarse mediante búsquedas de ordenador en bancos de datos conocidos, tales Genebank, de las secuencias polinucleotidas que codifican para el epítopo, y por comparaciones de la secuencia de aminoácidos con otras proteínas conocidas.

Como se usa en la presente invención, "epítopo" significa un determinante antigénico de un polipéptido. Posiblemente, un epítopo puede contener tres aminoácidos en una conformación espacial que es única para el epítopo. Generalmente, un epítopo consta de al menos cinco de tales aminoácidos, y normalmente, consta de al menos 8 a 10 aminoácidos. Los métodos para determinar la conformación espacial se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, rayos X, cristalografía y resonancia magnética nuclear bidimensional.

Un polipéptido es "inmunológicamente reactivo" con un anticuerpo cuando se une a un anticuerpo debido al reconocimiento por parte del anticuerpo de un epítopo específico contenido en el polipéptido. Las reactividad inmunológica puede determinarse por unión al anticuerpo, más en particular por las cinéticas de unión al anticuerpo, y/o competición por la unión usando como competidor(es) un polipéptido(s) que contiene un epítopo contra el que se dirige el anticuerpo. Los métodos para determinar si un polipéptido es inmunológicamente reactivo o no con el anticuerpo se conocen en la técnica.

Como se usa en la presente invención, el término "polipéptido inmunogénico que contiene un epítopo de HBV mutante", significa un polipéptido que aparece de forma natural en HBV mutante o fragmentos de éste, así como polipéptidos preparado por otros medios, por ejemplo síntesis química o la expresión del polipéptido en un organismo recombinante.

El término "transformación" se refiere a la inserción de un polinucleotido en una células hospedadora, sin tomar en consideración el método usado para la inserción. Por ejemplo, se incluyen captación directa, transducción, o apareamiento f. El polipéptido endógeno puede mantenerse como un vector no integrado, por ejemplo, un plásmido, o alternativamente, puede integrarse en el genoma del hospedador.

"Tratamiento" se refiera a profilaxis y/o terapia.

El término "individuo" como se usa en la presente invención se refiere a vertebrados, especialmente a miembros de las especies de mamíferos e incluye, pero no de forma limitante, a los animales domésticos, animales deportivos, primates y humanos; más especialmente, el término se refiere a chimpancés y humanos.

El término "hebra positiva" como se usa en la presente invención indica un ácido nucleico que contiene la secuencia que codifica para el polipéptido. El término "hebra negativa" indica un ácido nucleico que contiene una secuencia que es complementaria a la de la "hebra positiva".

"Genoma de hebra positiva" de un virus indica que el genoma es de hebra sencilla y codifica para un polipéptido o polipéptidos virales.

El término "componente corporal que contiene anticuerpo" (o muestra de ensayo) se refiere a un componente del cuerpo de un individuo que es fuente de los anticuerpos de interés. Estos componentes son bien conocidos en la técnica. Estas muestras incluyen muestras biológicas que pueden testarse por los métodos de la presente invención descritos aquí e incluyen fluidos corporales humanos y animales tales como sangre completa, suero, plasma, fluido cerebro espinal, orina, fluido linfoide, y varias secreciones externas del tracto respiratorio, intestinal y genitourinal, lágrimas, saliva, leche, células blancas de la sangre, mielomas y similares, fluidos biológicos tales como sobrenadantes de cultivo celular, muestras de tejido fijadas y muestras de células fijadas.

"HBV mutante purificado" se refiere a una preparación de HBV que se ha aislado a partir del constituyente celular al cual el virus normalmente se asocia, y a partir de otros tipos de virus que pueden estar presentes en el tejido infectado. Las técnicas de aislamiento de virus son conocidas por los especialistas en la técnica e incluyen, por ejemplo, centrifugación y cromatografía de afinidad. Un método para la preparación de HBV purificado se describe en la presente invención.

Usos generales

Tras la preparación de proteínas recombinantes, péptidos sintéticos o polipéptidos virales purificados elegidos según se describe en la presente invención, pueden usarse los péptidos sintéticos o recombinantes para desarrollar ensayos únicos como se describe en la presente invención para detectar la presencia de antígeno o anticuerpo contra HBV mutante. Estas composiciones también pueden usarse para desarrollar anticuerpos monoclonales y/o policlonales con una proteína recombinante específica y péptido sintético que se une específicamente al epítopo inmunológico de HBV mutante deseado por el especialista. También, se contempla que al menos un polinucleotido de la invención puede usarse para desarrollar vacunas por los siguientes métodos conocidos en la técnica.

Se contempla que los reactivos empleados para el ensayo puedan proporcionarse en forma de kit con uno o más recipientes tales como viales o botellas, conteniendo cada recipiente un reactivo separado tal como un anticuerpo monoclonal, o un combinado de anticuerpos monoclonales, o un polipéptido (recombinante o sintético) empleado en el ensayo.

Las "fases sólidas" ("soportes sólidos") son conocidas por los especialistas en la técnica e incluyen las paredes de los pocillos de una placa de reacción, tubos de ensayo, bolitas de poliestireno, bolitas magnéticas, tiras de nitrocelulosa, membranas, micropartículas, tales como partículas de látex y otras. Las "fase sólida" no es crítica y puede seleccionarla un especialista en la técnica. De este modo, las partículas de látex, micropartículas, bolitas magnéticas o no magnéticas, membranas, tubos de plástico, paredes de pocillos de microtitulación, astillas de vidrio o silicona y eritrocitos de sangre de carnero también son ejemplos adecuados. Métodos adecuados para la inmovilización de péptidos en fases sólidas incluyen interacciones iónicas, hidrofóbicas, covalentes y similares. Una "fase sólida" como se usa en la presente invención, se refiere a cualquier material que es insoluble, y puede ser hecho insoluble por una reacción posterior. La fase sólida puede elegirse por su capacidad intrínseca para atraer e inmovilizar el reactivo capturado. Alternativamente, la fase sólida puede retener un receptor adicional que tiene la capacidad para atraer e inmovilizar al reactivo capturado. El receptor adicional puede incluir una sustancia cargado que está opuestamente cargada con respecto al reactivo de captura en sí o a una sustancia cargada conjugada con el reactivo capturado. Aún como otra alternativa, la molécula receptora puede ser cualquier miembro de unión específica que se inmoviliza en (se une a) la fase sólida y que tiene la capacidad para inmovilizar el reactivo capturado a través de una reacción específica de unión. La molécula receptora permite la unión indirecta del reactivo capturado a un materia de fase sólida antes de llevar a cabo el ensayo o durante la realización del ensayo. De este modo, la fase sólida puede ser un plástico, un derivado del plástico, un metal magnético o no, la superficie de vidrio o de silicona de un tubo de ensayo, pocillo de microtitulación, láminas, partículas, micropartículas, fragmentos, y otras configuraciones conocidas por los especialistas en la técnica.

Se contempla y está dentro del ámbito de la invención que la fase sólida también puede contener cualquier material poroso con suficiente porosidad para permitir el acceso por anticuerpos de detección y una afinidad de la superficie adecuada para unir antígenos. Generalmente se prefieren estructuras microporosas, pero también pueden usarse los materiales con estructura de gel en estado hidratado. Tales soportes sólidos eficaces incluyen: carbohidratos poliméricos naturales y sus modificaciones sintéticas, derivados entrecruzados o sustituidos, tales como agar, agarosa, ácido algínico entrecruzado, gomas arábigas sustituidas y entrecruzada, ésteres de celulosa, especialmente con ácido nítrico y ácido carboxílico, ésteres de celulosa mezclados, y éteres de celulosa; polímeros naturales que contienen nitrógeno, tales como proteínas y derivados, incluyendo gelatinas entrecruzadas o modificadas; polímero de hidrocarburos naturales, tales como el látex y el caucho; polímeros sintéticos que pueden prepararse con estructuras porosas adecuadas, tales como polímero de vinilo, incluyendo polietileno, polipropileno, poliestireno, policiniocloruro, polivinilacetato y sus derivados parcialmente hidrolizados, poliacrilamidas, polimetacrilatos, copolímeros y terpolímeros de los policondensados anteriores, tales como poliésteres, poliamidas y otros polímeros, tales como poliuretanos y poliepóxidos; materiales inorgánicos porosos tales como sulfatos o carbonatos de metales alcalinotérreos y magnesio, incluyendo sulfato de bario, sulfato cálcico, carbonato cálcico, silicatos de alcali y metales alcalinotérreos, aluminio y magnesio; y óxidos o hidratos de aluminio y silicona, tales como arcillas, alúmina, talco, caolín, zeolita, sílica gel o vidrio (estos materiales puede usarse como filtros con los materiales poliméricos anteriores); y mezclas o copolímeros de las clases anteriores, tales como copolímeros de injerto obtenidos iniciando la polimerización de un polímero sintéticos sobre un polímero natural preexistente. Todos estos materiales pueden usarse en formas adecuadas; tales como películas, hojas, o placas y puede recubrir o unirse o laminar un apropiado vehículo inerte, tal como papel, vidrio, películas de plástico o tejidos.

La estructura porosa de nitrocelulosa tiene una absorción excelente y propiedades de adsorción para una amplia variedad de reactivos incluyendo los anticuerpos monoclonales. El nylon también posee características similares y también es adecuado. Se contempla que tales soportes sólidos porosos descritos anteriormente preferiblemente estén en forma de hojas de grosor de aproximadamente 0,01 a 0,5 mm, preferiblemente aproximadamente 0,1 mm. El tamaño de poro puede variar entre límites amplios, y preferiblemente es de aproximadamente 0,025 a 15 micras, especialmente de aproximadamente 0,15 a 15 micras. Las superficies de tales soportes pueden activarse por procesos químicos que causan la unión covalente del antígeno o el anticuerpo al soporte. La unión irreversible del antígeno o el anticuerpo se obtiene, sin embargo, en general por adsorción al material poroso por fuerzas hidrofóbicas mal entendidas. También se describen soportes sólidos adecuados en la solicitud de patente de Estados Unidos con Nº de serie 227, 272, la cual se incorpora a la presente invención como referencia.

El "reactivo indicador" comprende un "compuesto generador de señal" (marcador) que es capaz de generar una señal detectable mensurable por medios externos conjugado (unido) a un miembro de unión específica de HBV mutante. "Miembro de unión específica" como se usa en la presente invención significa un miembro de un para de unión específico. Esto es, dos moléculas diferentes en donde una de las moléculas a través de medios físicos o químicos específicamente se une a la segunda molécula. Además de ser un anticuerpo miembro de un par de unión específico para el HBV mutante, el reactivo indicador también puede ser un miembro de cualquier par de unión específico, incluyen sistemas hapteno-antihapteno tales como biotina o antibiotina, avidina o biotina, un carbohidrato o una lectina, una secuencia de nucleótidos complementaria, un efector o una molécula receptora, un cofactor enzimático y un enzima, un inhibidor enzimático o un enzima, y similar. Un miembro de unión específico inmunoreactivo puede ser un anticuerpo, un antígeno o un complejo anticuerpo/antígeno que es capaz de unirse a HBV mutante como en un ensayo de tipo sándwich, para la captura del reactivo como en un ensayo competitivo o el miembro de unión específico auxiliar como en un ensayo indirecto.

Los varios "compuestos de generación de señal" (marcador) contemplados incluyen cromógenos, catalíticos tales como enzimas, compuestos luminiscentes tales como fluoresceína y rodamina, compuestos quimioluminiscentes, elementos radiactivos, y marcadores de visualización directa. Ejemplos de los enzimas incluyen la fosfatasa alcalina, la peroxidasa de rábano picante, beta-galactosidasa y similares. La selección de un marcador no es crítica, pero será capaz de producir una señal por sí mismo o junto con una o más sustancias adicionales.

Otras realizaciones que utilizan otras varias fases sólidas también se contemplar y están en el ámbito de esta invención. Por ejemplo, procedimientos de captura iónica por inmovilización de un complejo de reacción inmovilizable en un polímero cargado negativamente, descrito en la solicitud de patente de Estados Unidos copendiente con Nº de serie 150,278 correspondiente con la publicación de Patente Europea 0326100 y la solicitud de patente de Estados Unidos con Nº de serie 375,029 (publicación EP Nº 0406473), cada una de las cuales se incorpora en la presente invención como referencia, puede emplearse de acuerdo con la presente invención para efectuar una reacción inmunoquímica rápida de fase en solución. Un complejo inmune inmovilizable se separa del resto de la mezcla de reacción por interacciones entre el complejo inmune/polianión cargado negativamente y la matriz porosa cargada positivamente tratada previamente, y se detecta usando varios sistemas generadores de señal previamente descritos, incluyendo aquellos descritos en mediciones de señales quimioluminiscentes como se describe en la solicitud de patente de Estados Unidos con Nº de serie 921,979 correspondiente con la publicación EPO Nº. 0 273,115, que se incorpora en la presente invención como referencia.

También, los métodos de la presente invención puede adaptarse al uso en sistemas que utilizan tecnología de micropartículas incluyendo sistemas automáticos y semiautomáticos en donde la fase sólida comprende una micropartícula. Tales sistemas incluyen los descritos en las solicitudes de patente de Estados Unidos 425,651 y 425,643, que corresponden con las solicitudes publicadas de patente europea Nº EP 0 425 633 y EP 0424 634, respectivamente, que se incorporan en la presente invención como referencias.

El uso de microscopía de barrido por sonda (SPM) para inmunoensayos también es una tecnología a la que los anticuerpos monoclonales de la presente invención se adaptan fácilmente. En la microscopía de barrido por sonda, en particular en la microscopia de fuerza atómica, en la fase de captura, por ejemplo, al menos uno de los anticuerpos monoclonales de la invención se adhiere a una fase sólida y se utiliza un microscopio de barrido por sonda para detectar los complejos antígeno/anticuerpo que puede estar presentes en la superficie de la fase sólida. El uso de microscopía de efecto túnel de barrido elimina la necesidad de marcadores que normalmente han de utilizarse en muchos sistemas de inmunoensayo para detectar los complejos antígeno /anticuerpo. Tal sistema se describe en la solicitud de patente de Estados Unidos con Nº de serie 662,147, la cual se incorpora en la presente solicitud como referencia.

El uso de SPM para monitorizar las reacciones de unión específica puede darse de muchas formas. En una realización, un miembro de una pareja de unión específica (sustancia específica analito que es el anticuerpo monoclonal de la invención) se une a una superficie adecuada para el barrido. La unión de la sustancia específica analito puede ser por adsorción a una pieza de prueba que comprende una fase sólida de una superficie de plástico o metal, continuando con métodos conocidos por los especialistas en la técnica. O puede utilizarse una unión covalente de una pareja de unión específica (sustancia específica analito) a una pieza de prueba cuya pieza de prueba comprende una fase sólida de plástico derivado, metal, silicona o vidrio. Los métodos de unión covalente son conocidos por los especialistas en la técnica e incluyen varias formas de unir las parejas de unión específica de forma irreversible a la pieza de muestra. Si la pieza de muestra es silicona o vidrio, la superficie puede activarse antes de unir la pareja de unión específica. Pueden usarse compuestos de silano activado como el trietoxi-aminopropil-silano (disponible en Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), trietoxi-vinil-silano (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI), y ( 3-mercapto-propil-trimetoxi silano (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) para introducir grupos reactivos tales como amino, vinilo y tiol, respectivamente. Tales superficies activadas pueden usarse para unir directamente la pareja de unión (en los casos de amino o tiol) y la superficie pues además reaccionar con enlazadores tales como glutaraldehido, bis-(succinimidil)-suberato, SPPD (succinimidil3-[2-piridilditio] propionato), SMCC (succinimidil-4-[N-maleimidometil] ciclohexano-1-carboxilato), SIAB (succinimidil [4-yodoacetil] aminobenzoato) y SMPB (succinimidil 4-[1-maleimidofenil] butirato) para separar la pareja de unión de la superficie. El grupo vinilo puede oxidarse para proporcionar un medio de enlace covalente. También puede usarse como anclaje para la polimerización de varios polímeros tales como ácido acrílico, el cual puede proporcionar puntos múltiples de unión para pajeras de unión específicas. La superficie amino puede reaccionar con dextranos oxidados de varios pesos moleculares para proporcionar enlazadores hidrófilos de diferente tamaño y capacidad. Ejemplo de dextranos oxidables incluyen Dextrano T-40 (peso molecular de 40.000 daltons), Dextrano T-110 (peso molecular de 110.000 daltons), Dextrano T-500 (peso molecular de 500.000 daltons), Dextrano T-2M (peso molecular de 2.000.000 daltons) (todos ellos disponibles en Pharmacia), o Ficoll (peso molecular de 70.000 daltons (disponible de Sigma Chemical Co., St. Louis. MO). También pueden usarse interacciones polielectrolíticas para inmovilizar una pareja de unión específica en una superficie de una pieza de muestra usando técnicas y métodos químicos descritos en las solicitudes de patente pendientes de Estados Unidos Nº de serie 150,278, clasificada el 29 de enero de 1988 y Nº de serie 375,029, clasificada el 7 de julio de 1989. El método de unión preferido es por medios covalentes. Tras la unión de un miembro de unión específico, la superficie puede tratarse además con materiales tales como suero, proteínas u otros agentes de bloqueo para minimizar la unión no específica. La superficie también puede ser barrido en el sitio de fabricación o en el punto de uso para verificar su adecuación para los fines del ensayo. No se espera que el proceso de barrido altere la propiedades específicas de unión de la pieza de prueba.

Pueden usarse otros varios formatos de ensayo, incluyendo inmunoensayos tipo "sándwich" y ensayo de sonda competitivo. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales de la presente invención puede emplearse en varios sistemas de ensayo para determinar la presencia, si la hay, de proteínas de HBV mutante en una muestra de ensayo. También puede usarse los fragmentos de estos anticuerpos monoclonales proporcionado. Por ejemplo, en un primer formato de ensayo, un anticuerpo policlonal o monoclonal anti-HBV mutante o fragmento de éste, o una combinación de estos anticuerpos, que están cubriendo una fase sólida, se pone en contacto con una muestra de ensayo que puede contener las proteínas de HBV mutantes, para formar una mezcla. Esta mezcla se incuba durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para formar complejos antígeno/anticuerpo. Entonces, un reactivo indicador que comprende un anticuerpo monoclonal o policlonal o un fragmento de éstos, que específicamente se une a una región de un HBV mutante, o una combinación de estos anticuerpos, al que se ha unido un componente que genera una señal, se pone en contacto con los complejos antígeno/anticuerpo para formar una segunda mezcla. Entonces, esta segunda mezcla se incuba durante un tiempo y bajo las condiciones suficientes para formar complejos anticuerpo/antígeno/anticuerpo. La presencia de antígeno de HBV mutante presente en la muestra de ensayo y capturado en la fase sólido, si lo hay, se determina por detección de la señal mensurable generada por el compuesto que genera la señal. La cantidad de antígeno de HBV mutante presente en la muestra de ensayo es proporcional a la señal generada.

Alternativamente, un anticuerpo policlonal o monoclonal anti-HBV mutante, un fragmento de éste o una combinación de estos anticuerpos que se unen a un soporte sólido, la muestra de ensayo y un reactivo indicador que comprende un anticuerpo monoclonal o policlonal, o fragmentos de éste, que especialmente se unen al antígeno de HBV mutante, o una combinación de estos anticuerpos a los que se une un compuesto que genera la señal, se ponen en contacto para formar una mezcla. Esta mezcla se incuba durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para formar complejos anticuerpo/antígeno/anticuerpo. La presencia, si la hay, de proteínas de HBV mutante presentes en la muestra de ensayo y capturada en la fase sólida se determina por detección de la señal mensurable generada por el compuesto que genera la señal. La cantidad de proteínas de HBV mutante presentes en la muestra de ensayo es proporcional a la señal generada.

En otro formato de ensayo alternativo, uno o una combinación de uno o más anticuerpos monoclonales de la invención puede emplearse como sonda competitiva para la detección de anticuerpo contra proteínas de HBV mutante. Por ejemplo, las proteínas de HBV mutante, solas o en combinación con otras proteínas de HBV mutante o proteínas de HBV no mutantes, pueden cubrir una fase sólida. Una muestra de ensayo de la que se sospecha contiene anticuerpos contra antígeno de HBV mutante y/o no mutante se incuba entonces con un reactivo indicador que comprende un compuesto que genera una señal y al menos un anticuerpo monoclonal de la invención durante un tiempo y bajo condiciones suficiente para formar complejos antígeno/anticuerpo de la muestra de ensayo y el reactivo indicador con la fase sólida o el reactivo indicador a la fase sólida. La reducción en la unión del anticuerpo monoclonal a la fase sólida puede medirse cuantitativamente. Una reducción mensurable en la señal comparada con la señal generada a partir de una muestra de ensayo de HBV negativa confirmada indica la presencia de anticuerpo anti HBV en la muestra de ensayo.

Aún en otro método de detección, cada uno de los anticuerpos monoclonales de la presente invención pueden emplearse en la detección de antígenos HBV mutantes en cortes de tejido fijados, así como en células fijadas, por análisis inmunohistoquímico.

Además, estos anticuerpos monoclonales pueden unirse a matrices similares a Sefarora activada con CNBr y se usa para la purificación por afinidad de proteínas específicas de HBV mutante a partir de cultivos celulares, o de tejidos biológicos tales como la sangre y el hígado.

Los anticuerpos monoclonales de la invención puede también usarse para la generación de anticuerpos quiméricos para uso terapéutico u otras aplicaciones similares.

Los anticuerpos monoclonales o fragmentos de éstos puede proporcionarse individualmente para detectar antígenos de HBV mutante. Las combinaciones de los anticuerpos monoclonales (y fragmentos de éstos) proporcionados en la presente invención también puede usarse juntos como componentes de una mezcla o "cocktail" de al menos un anticuerpo anti-HBV mutante de la invención con anticuerpos contra otras regiones de HBV (mutante o no mutante, cada uno con diferentes especificidades de unión). De ese modo, este cocktail puede incluir los anticuerpos monoclonales de la invención que están dirigidos contra las proteínas de HBV mutantes y otros anticuerpos monoclonales contra otros determinantes antigénicos del genoma de HBV.

El anticuerpo policlonal o fragmento de éste que puede usarse en los formatos de ensayo debería unirse específicamente a una región específica de un HBV mutante o a otras proteínas de HBV mutante usadas en el ensayo. El anticuerpo policlonal preferiblemente usado es de origen mamífero; pueden usarse anticuerpos policlonales de humano, cabra, conejo o carnero anti-HCV. Más preferiblemente, el anticuerpo policlonal es un anticuerpo policlonal de conejo anti-HBV mutante. El anticuerpo policlonal usado en los ensayos puede usarse sólo o como un cocktail de anticuerpos policlonales. Puesto que los cocktails usados en los formatos de ensayos están compuestos por anticuerpos monoclonales o anticuerpos policlonales que tienen especificidad diferente por HBV, serían útiles para diagnóstico, evaluación y pronóstico de infección por HBV, así como para estudiar la diferenciación de proteínas y la especificidad de HBV.

En otro formato de ensayo, puede detectarse la presencia de anticuerpo y/o antígeno contra HBV mutante en un ensayo simultáneo como sigue. Una muestra de ensayo se pone simultáneamente en contacto con un reactivo de captura de un primer analito, en donde dicho reactivo de captura contiene un primer miembro de unión específico para un primer analito unido a una fase sólida, y un reactivo de captura para un segundo analito, en donde dicho reactivo de captura contiene un primer miembro de unión para un segundo analito unido a la segunda fase sólida, para formar de este modo, una mezcla. Esta mezcla se incuba durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para formar complejos reactivo de captura/primer analito y reactivo de captura/segundo analito. Entonces, estos complejos así formados se ponen en contacto con un reactivo indicador que contiene un miembro de un par de unión específico para el primer analito unido con un compuesto que genera una señal y un reactivo indicador que contiene un miembro de un par de unión específico para el segundo analito marcado con un compuesto que genera una señal para formar una segunda mezcla. Esta segunda mezcla se incuba durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para formar complejos reactivo de captura/primer analito/reactivo indicador y complejos reactivo de captura/segundo analito/reactivo indicador. La presencia de uno o más analitos se determina detectando una señal generada en conexión con los complejos formados sobre ambas fases sólidas con una indicación de la presencia de uno o más analitos en la muestra de ensayo. En este formato de ensayo, puede utilizarse proteínas derivadas de los sistemas de expresión humanos, así como anticuerpos monoclonales producidos a partir de proteínas derivadas de los sistemas de expresión de mamíferos como se describe en la presente invención. Tales sistemas de ensayo se describen con gran detalle en la solicitud de patente pendiente de Estados Unidos Nº de serie 07/574,821 titulada. Ensayo simultáneo para la detección de uno o más analitos, que se corresponde con la publicación de Patente Europea Nº 0473064, que se incorpora a la presente invención como referencia.

Aún en otros formatos de ensayo, pueden utilizarse proteínas recombinantes para detectar la presencia de anti-HBV mutante en las muestras problema. Por ejemplo, una muestra de ensayo se incuba con una fase sólida en la cual al menos se ha unido una proteína recombinante. Estas reaccionan durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para formar complejos antígeno/anticuerpo. Tras la incubación, se detecta el complejo antígeno/anticuerpo. Se pueden usar reactivos indicadores para facilitar la detección, dependiendo del sistema de ensayo escogido. En otro formato de ensayo, una muestra de ensayo se pone en contacto con una fase sólida a la que se ha unido una proteína recombinante producida como se describe en la presente invención y también se pone en contacto con un anticuerpo monoclonal o policlonal específico para la proteína, que preferiblemente se ha marcado con un reactivo indicador. Después de la incubación durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para que se formen complejos anticuerpo/antígeno, la fase sólida se separa de la fase libre, y se detecta el marcaje en la fase sólida o en la libre como una indicación de la presencia de anticuerpo HBV. Se contemplan otros formatos de ensayo utilizando las proteínas de la presente invención. Estos incluye poner en contacto una muestra de ensayo con una fase sólida a la que se ha unido al menos una proteína recombinante producida en el sistema de expresión de mamíferos, incubar la fase sólida y la muestra de ensayo durante un tiempo y bajo unas condiciones suficientes como para que se formen los complejos antígeno/anticuerpo, y entonces poner en contacto la fase sólida con un antígeno recombinante marcado. Ensayos tales como este y otros se describen en la solicitud de patente pendiente de Estados Unidos Nº de serie 07/787,710, la cual se incorpora en la presente invención como referencia.

Mientras que la presente invención describe la preferencia del uso de fases sólidas, se contempla que las proteínas de la presente invención puedan utilizarse en sistemas de ensayo en fase no sólida. Estos sistemas de ensayo son conocidos por los especialistas en la técnica y se considera que están dentro del alcance de la presente invención.

Mientras que la presente invención describe la preferencia del uso de fases sólidas, se contempla que los péptidos de la presente invención puedan utilizarse en sistemas de ensayo en fase no sólida. Estos sistemas de ensayo son conocidos por los especialistas en la técnica y se considera que están dentro del alcance de la presente invención.

Materiales y métodos Técnicas generales

Las técnicas y métodos convencionales y bien conocidos en los campos de la biología molecular, microbiología, ADN recombinante e inmunología se emplean en la práctica de la invención excepto que se especifique lo contrario. Tales técnicas están explicadas y detalladas en la literatura. Véase, por ejemplo, T. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2º edition, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1989; D. N. Glover, ed., DNA Cloning, Volumes I and II (1985); M. J. Gait ed., Oligonucleotide Synthesis, (1984); B. D. Hames et al., eds., Nucleic Acid Hybridization (1984); B. D. Hames et al., eds., Transcription and Translation, (1984); R. I. Freshney ed., Animal Cell Culture, (1986); Immobilized Cells and Enzymes, IRL Press (1986); B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984), la serie Methods in Enzymology, Adacemic Press, Inc., Orlando, Florida; J. H. Miller et al., eds., Gene Transfer Vector For Mammalian Cells, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1987); Wu et al., eds., Methods in Enzymology, Vol. 154 y 155; Mayer et al., eds., Immunological Methods In Cell and Molecular Biology, Academic Press, Londres (1987); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, 2º ed., Springer-Verlag, NY; y D. Weir et al., ed., Handbook Of Experimental Immunology, volúmenes I a IV (1986).

Los reactivos y los métodos de la presente invención son posibles por la provisión de una familia de secuencias de nucleótidos estrechamente homólogas aisladas a partir de una librería genómica derivada de las secuencias de ácidos nucleicos presentes en el plasma, suero u homogenizado de hígado de un individuo infectado por el HBV mutante. Los sueros, plasmas u homogenizados de hígado de humanos infectados por HBV mutante contienen anticuerpos que se unen a este polipéptido mientras que sueros, plasmas u homogenizados de hígado de humanos no infectados no contiene anticuerpo contra este polipéptido. Finalmente, mientras que los sueros de individuos no infectados no contienen anticuerpos contra este polipéptido, los anticuerpos se inducen en individuos tras la infección aguda con HBV.

La disponibilidad de las secuencias de ácidos nucleicos permite la construcción de sondas de ADN y polipéptidos útiles en el diagnóstico de la hepatitis debida a infecciones por HBV mutante y en la selección de donantes de sangre, sangre donada, productos de sangre e individuos para infección. Por ejemplo, a partir de la secuencia es posible sintetizar oligómeros de ADN de aproximadamente ocho a diez nucleótidos, o mayores, que son útiles como sondas de hibridación para detectar la presencia del genoma viral en, por ejemplo, sueros de sujetos sospechosos de portar el virus, o para la selección de donantes de sangre por la presencia del virus. La familia de secuencias de ácidos nucleicos también permite el diseño y la producción de polipéptidos específicos de HBV mutante que son útiles como reactivos de diagnóstico para la presencia de anticuerpos aparecidos durante la infección con el HBV mutante. Los anticuerpos contra los polipéptidos purificados derivados a partir de las secuencias de ácidos nucleicos también pueden usarse para detectar antígenos virales en individuos infectados y en sangre. Estas secuencias de ácidos nucleicos también permiten el diseño y la producción de polipéptidos que puede ser útiles como vacunas contra HBV mutante, y también para la producción de anticuerpos, que posteriormente pueden usarse para la protección contra la enfermedad, y/o para terapia de los individuos infectados de HBV mutante.

Las secuencias y los polipéptidos derivados de estas secuencias, así como los anticuerpos dirigidos contra estos polipéptidos, también son útiles para el aislamiento y la identificación del agente o agentes etiológicos del HBV mutante. Por ejemplo, los anticuerpos dirigidos contra un epítopo de HBV mutante contenido en los polipéptidos derivados de las secuencias de ácidos nucleicos pueden usarse en métodos para aislar virus basado en cromatografía de afinidad. Alternativamente, los anticuerpos puede usarse para identificar partículas virales aislada por otras técnicas. Los antígenos virales y el material genómico dentro de las partícula virales aisladas puede caracterizarse más detalla-
damente.

La información obtenida a partir de la secuenciación más detallado del genoma(s) de HBV mutante, así como a partir de la caracterización más detallado del antígeno de HBV mutante y la caracterización del genoma permiten el diseño y la síntesis de sondas adicionales y polipéptidos y anticuerpo que puede usarse para diagnóstico, prevención y terapia de hepatitis inducidas por HBV mutante, y para la selección de sangre y productos relacionados con la sangre infectados.

La disponibilidad de sondas para HBV mutante, incluyendo antígenos, anticuerpos y polinocleótidos derivados del genoma a partir del cual se derivan las secuencias de nucleótidos, también permite el desarrollo de sistemas de cultivo celular que serán de principal uso para elucidar la biología del HBV mutante. Una vez que esto es conoce, se contempla que pueden desarrollarse nuevos regímenes de tratamiento basado en compuestos antivirales que inhibe de forma preferente la replicación de o la infección por HBV mutante.

En el método usado para identificar y aislar el agente etiológico de HBV, se crea una librería genómica a partir de los ácidos nucleicos presentes en suero, plasma u homogeneizado de hígado infectados de un individuo infectado, preferiblemente un chimpancé o un humano. La librería se crea en un vector que permite la expresión de polipéptidos codificados en las secuencias de ácido nucleico. Los clones de las células hospedadoras que contienen el vector, que ha expresado un fragmento inmunológicamente reactivo de un polipéptido del agente etiológico (HBV mutante) se seleccionan por una selección inmunológica de los productos de expresión de la librería con un componente corporal que contiene un anticuerpo a partir de otro individuo previamente infectado con el agente putativo. Las etapas de la técnica de selección inmunológica incluye la interacción de los productos de expresión de los vectores que contienen las secuencias de ácidos nucleicos clonadas con el componente del cuerpo que contiene el anticuerpo de un segundo individuo infectado, y detectar la formación de los complejos antígeno-anticuerpo entre el producto(s) de expresión y los anticuerpos del segundo individuo infectado. Los clones aislados se seleccionan inmunológicamente de forma más detallada por interacción de sus productos de expresión con el componente corporal que contiene el anticuerpo de otros individuos infectados con el agente putativo y detectando la formación de los complejos antígeno-anticuerpo con anticuerpos de los individuos infectados, y se aíslan los vectores que contienen la secuencias de ácidos nucleicos que codifican para los polipéptidos que reaccionan inmunológicamente con los anticuerpos de individuos infectados y con individuos de los que se sospecha están infectados con el agente, pero no con individuos controles. Los individuos infectados usados para la construcción de la librería de secuencias de ácidos nucleicos, y para la selección inmunológica, no necesitan ser de la misma especie. Las secuencias de ácido nucleico aisladas como resultado de este método, y sus productos de expresión, y los anticuerpos dirigidos contra los productos de expresión, son útiles para caracterizar y/o capturar el agente etiológico. Este método se muestra en la publicación de solicitud de patente EP Nº 0 318 216, la cual se incorpora a la presente invención como referencia.

Preparación de las secuencias de ácido nucleico

Suero, plasma u homogeneizados de hígado mezclados o individuales a partir de un individuo que cumple los criterios y dentro de los parámetros expuestos a continuación con infección agua o crónica por HBV mutante se usan para aislar partículas virales. Los ácidos nucleicos aislados a partir de estas partículas se usan cómo molde para la construcción de una librería genómica del genoma viral. Los procedimientos usados para el aislamiento de las partículas de HBV mutante y para la construcción de la librería genómica en lambda-gt11 o sistemas similares conocidos en la técnica se discuten a partir de aquí. Lambda-gt11 es un vector que se ha desarrollado específicamente para expresar ADNc insertados como polipéptidos de fusión con beta-galactosidasa y para seleccionar grandes cantidades de fagos recombinantes con antisueros específicos obtenidos contra un antígeno definido. La librería de ADNc de lambda-gt11 generada de un ADNc que contiene una mezcla de ADNc se selecciona para epítopos codificados que puede unirse específicamente con los sueros derivados de los individuos que previamente han experimentado una hepatitis debida al HBV mutante. Véase V. Hunyh et al., en D. Glover, ed., DNA Cloning Techniques: A Practical Approach, IRL Press, Oxford, England, pp 49-78 (1985). Se analizaron aproximadamente 10^{6}-10^{7}fagos, de los cuales los fagos positivos se identificaron, purificaron y luego se testaron para la especificidad de unión con sueros de diferentes individuos previamente infectados con el agente HBV mutante. Se prefieren, para estudio más detallado, los fagos que selectivamente unen los sueros o plasma de los pacientes que cumplen los criterios descritos a continuación y no los de los pacientes que no cumplen dichos criterios descritos.

Utilizando la técnica de aislamiento de secuencias de ácidos nucleicos solapados, se obtienen los clones que contienen secuencias adicionales de HBV mutantes secuencia arriba o secuencia abajo. El aislamiento de estos clones se describe a continuación.

El análisis de las secuencias nucleotídicas de las secuencias de ácido nucleico codificadas del HBV mutante entre los clones aislados se lleva a cabo para determina si la secuencia compuesta contiene un ORF largo continuo. Las secuencias (y sus complementos) recuperada a partir de la librería de secuencias del HBV mutante se proporcionan en la presente invención, y las secuencias o cualquier porción de éstas, pueden prepararse usando métodos sintéticos y por una combinación de método sintéticos con recuperación de secuencias parciales usando métodos similares a los descritos en la presente invención. De este modo, esta descripción proporciona un método por el cual pueden aislarse secuencias genómicas correspondientes al genoma completo de HBV mutante. Otros métodos de aislamiento de estas secuencias, sin embargo, serán obvios para los especialistas en la técnica y se considera que están dentro del ámbito de la presente invención.

Las cepas replicadas a partir de la librería de la secuencia de ácido nucleico de HBV mutante se depositarán en la American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, bajo los términos del Tratado de Budapest y se mantendrán durante un período de treinta (30) años a partir de la fecha de depósito, o durante cinco (5) años tras la última solicitud del depósito, o por el periodo impuesto por la patente de Estados Unidos, el que sea más largo. Los depósitos y cualquier otro material depositado descrito en la presente invención se proporciona sólo por conveniencia, y no se requiere practicar las enseñanzas proporcionadas en la presente invención.

Preparación de polipéptidos y fragmentos virales

La disponibilidad de secuencias de ácidos nucleicos permite la construcción de vectores de expresión que codifican para una región antigénicamente activa del polipéptido codificado en cualquier hebra. La región antigénicamente activa deriva del antígeno de la envoltura (cubierta). Los fragmentos que codifican para los polipéptidos deseados se derivan a partir de los clones genómicos usando digestión por restricción convencional o métodos sintéticos, y se ligan en vectores que puede, por ejemplo, contener porciones de secuencias de fusión tales como la beta-galactosidasa (B-gal), la superoxido dismutasa (SOD) o la CMP-KDO sintetasa (CKS). Los métodos y vectores que son útiles para la producción de polipéptidos que contienen secuencias de fusión de SOD se describen en el documento EPO 0196056, publicado el 1 de octubre de 1986, y los de CKS se describen en la publicación EPO Nº. 0331961, publicado el 13 de septiembre de 1989, los cuales se incorporan en la presente invención como referencias. Cualquier porción deseada de la secuencia de ácido nucleico que contiene un marco abierto de lectura, en cualquier sentido de la hebra, puede obtenerse como una proteína recombinante, tales como una proteína madura o de fusión; alternativamente, un polipéptido codificado en el genoma de HBV mutante puede obtener por síntesis química.

La secuencia de ácido nucleico que codifica para el polipéptido deseado, en forma fusionada o madura, o conteniendo o no una secuencia señal que permita la secreción, puede ligarse en vectores de expresión adecuados para cualquier hospedador conveniente. En la técnica se usan sistemas de hospedadores eucarióticos y procarióticos para obtener proteínas recombinantes, y algunas de éstas se enumeran en la presente invención. Entonces, el polipéptido se aisla a partir de las células lisadas o a partir del medio de cultivo y se purifican hasta el punto que se necesite para su uso deseado. La purificación puede llevarse a cabo por técnicas conocidas en la técnica, e incluyen fraccionamiento con sales, cromatografía en resinas de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, centrifugación, entre otros. Tales polipéptidos puede usarse como reactivos de diagnóstico o para inmunoterapia pasiva. Además, los anticuerpos contra estos polipéptidos son útiles para el aislamiento y la identificación de partículas de HBV mutante. Los antígenos de HBV mutante también puede aislarse a partir de los viriones de HBV mutante. Estos viriones pueden crecerse en células en cultivos tisulares infectadas con HBV mutante, o en un individuo infectado.

Preparación de polipéptidos antigénicos y conjugación con fase sólida

Una región antigénica o fragmento de un polipéptido en general es relativamente pequeña, normalmente aproximadamente de 8 a 10 aminoácidos de longitud o menos. Fragmentos de tan sólo 2 a 5 aminoácidos pueden caracterizar una región antigénica. Estos segmentos pueden corresponder con regiones del antígeno de HBV mutante. Usando las secuencias genómicas de HBV mutante como base, las secuencias de ácidos nucleicos que codifican para segmentos cortos de polipéptidos de HBV mutante pueden expresarse de forma recombinante como proteínas de fusión o como polipéptidos aislados. Estas cortas secuencias de aminoácidos también pueden unirse a una molécula transportadora adecuada cuando el polipéptido sintético proporcionado se configura correctamente para proporcionar el epítopo correcto pero demasiado pequeño para ser inmunogénico. Los métodos de unión son conocidos en la técnica e incluyen, pero no de forma limitante, el uso de N-succinimidil-3(2-piridiltio) propionato (SPDP) y succinimidil 4-(N-maleimidometil) cilohexano-1-carboxilato (SMCC). Los polipéptidos que carecen de grupos sulfidrilo pueden modificarse añadiendo un resto de cisteina. Estos reactivos crean un puente disulfuro entre ellos mismos y restos de cisteina del péptido en una proteína y un enlace amida a través del épsilon-amino de una lisina, u otro grupo amino libre en el otro. Varios de tales agentes que forman disulfuro/amido son conocidos. Otros agentes de enlace bifuncionales forman un triéster en lugar de un puente disulfuro. Muchos de estos agentes que forman tioéter están disponibles comercialmente y son conocidos por los especialistas en la técnica. Los grupos carboxilo pueden activarse combinándolos con succiminida o la sal sódico de ácido 1-hidroxil-2-nitro-4-sulfónico. Puede usarse cualquier vehículo que no induzca por sí mismo la producción de anticuerpos perjudiciales para el hospedador. Vehículos adecuados incluyen proteínas, polisacáridos tales como sefarosa que funciona como látex, agarosa, celulosa, bolitas de celulosa, aminoácidos poliméricos tales como ácido poliglutámico, polilisina, copolímeros de aminoácidos y partículas virales inactivas. Ejemplos de los sustratos proteicos incluyen albúminas séricas, hemocianica de la concha de molusco (babosa), moléculas de inmunoglobulina, tiroglobulina, ovoalbúmina, toxoide del tétano y aún otras proteínas conocidas por los especialistas en la técnica.

Preparación de inmunógenos particulados híbridos que contienen epítopos de HBV

La inmunogenicidad del epítopo(s) de HBV mutante también puede aumentarse preparándolos en sistemas de mamíferos o levaduras fusionados con o unido con proteínas formadoras de partículas tales como las asociadas con antígenos de superficie de HBV. Las construcciones en donde el epítopo de HBV mutante se une directamente a las secuencias que codifican para la proteína formadora de partícula producen híbridos que son inmunogénicos con respecto al epítopo de HBV mutante. Además, todos los vectores preparados incluyen epítopos específico de HBV mutante, que tienen grado de inmunogenicidad variable. Las partículas construidas a partir de las proteínas formadoras de partículas que incluyen secuencias de HBV mutante son inmunogénicas con respecto al mutante HBV.

Se ha determinado que el antígeno de la superficie de la hepatitis B se forma y ensambla en partículas en S. cerevisiae y en células de mamífero; se ha publicado que la formación de estas partículas aumenta la inmunogenicidad de la unidad monomérica. P. Valenzuela et al., Nature 298:334 (1982); P. Valenzuela et al., en I. Millman et al., eds., Hepatitis B, Plenum Press, pp. 225-236 (1984). La construcción puede incluir epítopos dominantes de HBsAg. Se ha publicado que tales construcciones son expresables en levaduras, y se han descrito híbridos que incluyen secuencias virales heterólogas para la expresión en levaduras. Véase, por ejemplo, los documentos EPO 174,444 y EPO 174,261. También se ha publicado que estas construcciones son capaces de expresarse en células de mamíferos como células de ovario de hámster chino (CHO). Michelle et al., International Symposium on Viral Hepatitis, 1984. En HBV, las porciones de secuencia que codifican para la proteína formadora de partículas puede reemplazarse con codones que codifican para un epítopo de HBV. En esta sustitución, las regiones que no se requieren para mediar en la agregación de las unidades para formar partículas inmunogénicas en levaduras o mamíferos pueden delecionarse, eliminando de este modo sitios antigénicos de HBV adicionales de competición con el epítopo de HBV.

Preparación de vacuna

Las vacunas pueden prepararse a partir de uno o más polipéptidos inmunogénicos derivados de secuencias de ácidos nucleicos de HBV mutante o a partir del genoma de HBV mutante con las que corresponden. Las vacunas pueden contener polipéptidos recombinantes que contienen un epítopo(s) de HBV mutante. Estos polipéptidos puede expresarse en bacterias, levaduras o células de mamíferos, o alternativamente puede aislar a partir de preparaciones virales. También se anticipa que varias proteínas estructurales pueden contener epítopos de HBV mutante que dan lugar a anticuerpos protectores anti-HBV mutante. De este modo, pueden usarse los polipéptidos que contiene al menos un epítopo de HBV mutante, por separado o en combinaciones, en vacunas de HBV mutante. También se contempla que las proteínas no estructurales así como las proteínas estructurales pueden proporcionar protección contra patogenicidad viral, incluso si no causan la producción de anticuerpo neutralizantes.

Considerando lo anterior, las vacunas multivalentes contra la HBV mutante pueden contener proteínas que incluyen la inserción de dos aminoácidos (N-T) en la posición 122. Estas vacunas pueden contener, por ejemplo, polipéptidos recombinantes de HBV mutante y/o polipéptidos aislados a partir de viriones. Adicionalmente, puede ser posible usar HBV mutante inactivado en vacunas. Tal inactivación puede ser la preparación de lisados virales, o por otros medios conocidos en la técnica para causar la inactivación de los virus similares a los de la hepatitis, por ejemplo, tratamiento con solventes orgánicos o detergentes, o tratamiento con formalina. La preparación de una cepa de HBV mutante atenuada también se describe en la presente invención. Se contempla que algunas de las proteínas del HBV mutante pueden reaccionar de forma cruzada con otros virus conocidos y, de ese modo, que pueden existir epítopos compartidos entre HBV mutante y otros virus que entonces podrían dar lugar a anticuerpos protectores contra uno o más de los desórdenes causados por estos agentes patogénicos. Se contempla que podría ser posible diseñar una vacuna con múltiple propósito basado en esta opinión.

La preparación de vacunas que contiene al menos un péptido inmunogénico como un ingrediente activo es conocido por un especialista en la técnica. Generalmente, dichas vacunas se preparan como inyectables como soluciones líquidas o suspensiones; también pueden prepararse formas sólidas adecuadas para solución o suspensión en un líquido antes de la inyección. La preparación puede emulsionarse, o la proteína puede encapsularse en liposomas. Los ingredientes inmunogénicamente activos se mezclan con excipientes farmacológicamente aceptables que son compatibles con el ingrediente activo. Excipientes adecuados incluyen, pero no de forma limitante, agua, solución salina, dextrosa, gicerol, etanol y similares; también pueden usarse combinaciones de estos excipientes en varias cantidades. La vacuna también puede contener pequeñas cantidades de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes de tamponamiento del pH, y/o adyuvantes que aumentan la eficacia de la vacuna. Por ejemplo, tales adyuvantes pueden incluir hidróxido de aluminio, N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-DMP), N-acetil-nomuramil-L-alanil-D isoglutamina (CGP 11687, también denominado como nor-MDP), N-acetil-muramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2- (1'2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina (CGP 19835A, también denominado como MTP-PE) y RIBI (MPL + TDM + CWS) en una emulsión de escualeno/Tween-80® al 2%. La eficacia de un adyuvante puede determinarse midiendo la cantidad de anticuerpos dirigidos contra un polipéptido inmunogénico que contiene una secuencia antigénica de HBV resultante de la administración de este polipéptidos en vacunas que también contienen los distintos adyuvantes.

Las vacunas normalmente se administran por inyección intravenosa o intramuscular. Formulaciones adicionales que son adecuadas para otros modos de administración incluyen supositorios y, en algunos casos, formulaciones orales. Para los supositorios, pueden incluirse conectores y vehículos tradicionales pero no de forma limitante, como polialquileno glicoles o triglicéridos. Tales supositorios pueden formarse a partir de mezclas que contengan el ingrediente activo en el intervalo de aproximadamente 0,5% a aproximadamente 10%, preferiblemente, aproximadamente 1% a aproximadamente 2%. La formulación oral incluye excipientes empleados normalmente tales como, por ejemplo, grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio y similares. Estas composiciones pueden tomar la forma de soluciones, suspensiones, comprimidos, píldoras, cápsulas, formulaciones de liberación controlada o polvos y contener desde aproximadamente 10% a aproximadamente 95% de ingrediente activo, preferiblemente de aproximadamente 25% a aproximadamente 70%.

Las proteínas usadas en la vacuna puede formularse dentro de la vacuna en formas neutras o sales. Las sales farmacéuticamente aceptables tales como sales de adición de ácido (formadas con grupos aminos del péptido) y que se forman con ácidos inorgánicos tales como ácido clorhídrico o fosfórico, y ácidos orgánicos tales como acético, oxálico, tartárico, maleico y otros conocidos por los especialistas en la materia. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también pueden derivar de bases inorgánicas tales como hidróxido sódico, potásico, amónico, cálcico o férrico y similares, y bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, 2-etilamino etanol, histidina procaína y otras conocidas por los especialistas en la materia.

Las vacunas se administran de forma compatible con la formulación de dosificación, y en tal cantidad que será profiláctica y/o terapéuticamente eficaz. La cantidad que se administra generalmente está en el intervalo de aproximadamente 5 microgramos a aproximadamente 250 microgramos de antígeno por dosis, y depende del sujeto al que se proporciona la dosis, la capacidad del sistema inmune del sujeto para sintetizar anticuerpos, y el grado de protección buscado. Las cantidades precisas de ingrediente activo que es necesario administra también pueden depender del criterio del médico y puede ser única para cada sujeto. La vacuna puede darse en una dosis única o múltiple programada. Una dosis múltiple es aquella en la cual un tratamiento primer de vacunación puede ser con una a diez dosis separadas, seguida de otras dosis dadas a intervalos de tiempo posteriores requeridos para mantener y/o reforzar la respuesta inmune, por ejemplo, de uno a cuatro meses para una segunda dosis, y si el individuo lo requiere, una o más dosis posteriores después de varios meses. El régimen de dosificación también se determinará, al menos en parte, por la necesidad del individuo y dependerá del criterio del médico. Se contempla que la vacuna que contiene el antígeno(s) inmunogénicos de HBV mutante puede administrarse junto con otros agentes inmunoreguladores, por ejemplo, con inmunoglobulinas.

Preparación de anticuerpos contra epítopos de HBV mutante

Los péptidos inmunogénicos preparados como se describe en la presente invención se usan para producir anticuerpos, policlonales o monoclonales. Cuando se preparan anticuerpo policlonales, se inmuniza a un mamífero (por ejemplo, un ratón, conejo, cabra, caballo y similar) con un polipéptido inmunogénico que porta al menos un epítopo de HBV mutante. Se recoge el suero de los animales inmunizados tras un periodo de incubación apropiado y se tratan según procedimientos conocidos. Si el suero que contiene anticuerpos policlonales contra un epítopo de HBV mutante, contiene anticuerpos contra otros antígenos, los anticuerpos policlonales pueden purificarse, por ejemplo, por cromatografía de inmunoafinidad. Las técnicas para producir y procesar anticuerpos policlonales son conocidas en la técnica y se describen en, entre otros, Mayer y Walker, eds., Immunochemical Methods In Cell and Molecular Biology, Academic Press, Londres (1987). Los anticuerpos policlonales también pueden aislarse. Los anticuerpos policlonales puede obtenerse a partir de un mamífero previamente infectado con HBV. En la presente invención se proporciona un ejemplo de un método para purificar anticuerpos contra epítopos de HBV mutante a partir del suero de un individuo infectado con HBV mutante usando cromatografía de afinidad.

Los anticuerpos monoclonales dirigidos contra epítopos de HBV mutante también puede producirse por un especialista en la técnica. La metodología general para producir tales anticuerpos es bien conocida y ha sido descrita en, por ejemplo, Kohler y Milstein, Nature 256:494 (1975) y revisada en J.G.R. Hurrel, ed. Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications, CRC Press Inc., Boco Ratan, FL (1982) así como aquel mostrado por L. T. Mimms et al., Virology 176:604-619 (1990). Las líneas celulares inmortales productoras de anticuerpos pueden obtenerse por fusión celular, y también por otras técnicas tales como la transformación directa de linfocitos B con ADN oncogénico, y transfección con el virus de Epstein-Barr. Véase también, M. Schreier et al., Hibridoma Techniques, Scopes (1980) Protein Purification, Principles and Practice, 2º Edition, Springer-Verlag, New York (1984); Hammerling et al., Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas (1981); Kennet et al., Monoclonal Antibodies (1980). Ejemplo de usos y técnicas de anticuerpos monoclonales para HCV se describen en las solicitudes de patente de Estados Unidos Nº de serie 748,292; 748,563; 610,175; 610,473; 648,477 y 648,475.

De este modo, los anticuerpos monoclonales y policlonales desarrollados, dirigidos contra epítopos de HBV mutante, son útiles en aplicaciones de diagnóstico y pronóstico, y también, aquellos que son neutralizantes son útiles en inmunoterapia pasiva. Los anticuerpos monoclonales pueden usarse especialmente para producir anticuerpos anti-idiotipo. Estos anticuerpos anti-idiotipo son inmunoglobulinas que portan una "imagen interna" del antígeno del agente infeccioso contra el cual se desea protección. Véase, por ejemplo, A. Nisonoff et al., Clin. Immunol. Immunopath. 21:397-406 (1981) y Dreesman et al., J. Infect. Dis. 151:761 (1985). Las técnicas para obtener tales anticuerpos idiotipo son conocidas en la técnica y se ilustran, por ejemplo, en Grych et al., Nature 316:74 (1985); MacNamara et al., Science 226:1325 (1984); y Uytdehaag et al., J. Immunol. 134:1225 (1985). Estos anticuerpos anti-idiotipo también pueden ser útiles para el tratamiento de infección por HBV, así como para la elucidación de la regiones inmunogénicas de los antígenos de HBV.

Sondas oligonucleotídicas de diagnóstico y kits

Usando determinadas porciones de las secuencias de ácidos nucleicos aisladas de HBV mutante como base, pueden prepararse oligómeros de aproximadamente 8 nucleótidos o más, por escisión o sintéticamente, que hibridan con el genoma de HBV mutante y es útil para la identificación del agente o agentes virales, caracterización más detallada del genoma viral así como en la detección del o los virus en individuos enfermos. Las sondas naturales o derivadas de los polinucleótidos de HBV mutante tienen una longitud que permite la detección de secuencias virales únicas para hibridación. Mientras que de 6 a 8 nucleótidos puede ser una longitud práctica, se prefieren las secuencias de 10 a 12 nucleótidos, y aquellas de aproximadamente 20 nucleótidos pueden ser más preferidas. Estas secuencias preferiblemente derivarán de regiones a las que falta heterogeneidad. Estas sondas pueden prepararse usando métodos de rutina estándar incluyendo métodos de síntesis automática de oligonucleótidos. Un complemento para cualquier porción única del genoma de HBV mutante será satisfactorio. Es conveniente la complementariedad completa para su uso como sonda, aunque puede no ser necesaria cuando se incrementa la longitud del fragmento.

Cuando se usa como reactivo diagnóstico, la muestra de ensayo biológica para analizar, tal como sangre o suero, puede tratarse para extraer los ácidos nucleicos contenidos en la misma. Los ácidos nucleicos resultantes a partir de la muestra puede someterse a electroforesis en gel o a otras técnicas de separación por tamaño; o la muestra de ácido nucleico puede transferirse de forma puntual sin separación por tamaño. Entonces las sondas se marcaron. Se conocen en la técnica métodos de marcajes adecuados para unir marcadores a las sondas, e incluyen, pero no de forma limitante incorporación de marcaje radiactivo por translación de mellas o por quinasas, biotina, sondas fluorescentes o quimioluminiscentes. Ejemplos de mucho de estos marcajes se describen en la presente invención. Entonces, los ácidos nucleicos extraídos a partir de la muestra se tratan con la sonda marcada bajo condiciones de hibridación de rigor apropiado.

Las sondas pueden hacerse completamente complementarias al genoma de HBV mutante. Por tanto, son deseables normalmente altas condiciones de rigor para prevenir falsos positivos. Sin embargo, deberían usarse condiciones de alto rigor sólo si las sondas son complementarias con regiones del genoma de HBV mutante en la que falta heterogeneidad. El rigor de la hibridación se determina por un número de factores durante el procedimiento de lavado, incluyendo temperatura, fuerza iónico, duración y concentración de formamida. Véase, por ejemplo, T. Maniatis (supra). La hibridación puede llevarse a cabo por varias técnicas incluyendo, por ejemplo, reacción en cadena de la ligasa (LCR), reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Estas técnicas están descritas en la presente invención.

Se contempla que las secuencias del genoma de HBV mutante pueden estar presente en el suero de individuos infectados a niveles relativamente bajos, por ejemplo, aproximadamente de 10^{2} a 10^{3} secuencias por ml. Este nivel puede requerir técnicas de amplificación que se usen en los ensayos de hibridación, tales como la reacción en cadena de la ligasa o la reacción en cadena de la polimerasa. Tales técnicas son conocidas en la técnica. Por ejemplo, el sistema de "Bio-Bridge" usa la transferasa deoxinucleótido terminal para añadir una cola 3' poli-dT no modificada a una sonda de ácido nucleico (Enzo Biochem. Corp.). La sonda con la cola dT se hibrida con la secuencia de nucleótidos diana, y entonces, a un poli-A modificado con biotina. También, en el documento EP 124221 se describe un ensayo de hibridación de ADN en donde el analito hibrida con una sonda de ADN de hebra sencilla que es complementario con un oligonucleótido marcado con un enzima y la doble hélice con cola resultante se hibrida con un oligonucleótido marcado con un enzima. El documento EP 204510 describe un ensayo de hibridación de ADN en el que el ADN analito se pone en contacto con una sonda que tiene una cola, tal como una cola de poli-dT, una hebra amplificadora que tiene una secuencia que hibrida por la cola de la sonda, tal como una secuencia poli-A, y que es capaz de unir varias hebras marcadas. La primera técnica puede implicar la amplificación de las secuencias diana de HBV en el suero a aproximadamente 10^{6} secuencias/ml. Esto puede lograrse siguiendo los métodos descritos por Saiki et al., Nature 324:163 (1986). Entonces, la secuencia(s) amplificadas pueden detectarse usando un ensayo de hibridación tale como los conocidos en la técnica. Las sondas pueden empaquetarse en kits de diagnóstico que incluyen la secuencia de ácido nucleico sonda cuya secuencia puede estar marcada; alternativamente, la sonda puede no estar marcada y podrían incluirse en el kit los ingredientes para el marcaje. El kit también puede contener otros reactivos adecuados empaquetados y materiales necesarios o deseables para el protocolo particular de hibridación, por ejemplo, estándar así como instrucciones para llevar a cabo el ensayo.

Kits de inmunoensayo y diagnóstico

Los polipéptidos que reaccionan inmunológicamente con los anticuerpos contra HBV mutante contenidos en el suero y compuestos de éstos, y los anticuerpos producidos contra los epítopos específicos de HBV mutante en estos polipéptidos, son útiles en inmunoensayo para detectar la presencia de anticuerpo contra HBV mutante, o la presencia del virus y/o antígenos virales en muestras problema biológicas. El diseño de estos inmunoensayos está sujeto a variación, y se conocen en la técnicas varios de éstos; varios de estos se describen en la presente invención. El inmunoensayo puede utilizar un antígeno viral, tal como un polipéptido derivado de cualquier secuencia de ácido nucleico de HBV mutante contenida en un clon, o a partir de secuencias de ácido nucleico compuesto derivado de las secuencias de ácido nucleico de HBV mutante en estos clones, a partir del genoma de HBV mutante a partir del cual se derivan las secuencias de ácidos nucleicos en estos clones. O el inmunoensayo puede usar una combinación de antígenos virales derivados de estas fuentes. Puede usarse, por ejemplo, una anticuerpo monoclonal dirigido contra el mismo antígeno viral, o anticuerpos policlonales dirigidos contra diferentes antígenos virales. Los ensayos pueden incluir, pero no de forma limitante aquellos ensayos basados en competición, reacción directa o tipo sándwich. Los ensayos pueden usar fases sólidas, o puede llevarse a cabo por inmunoprecipitación y cualquier otro método que puede no utilizar fases sólidas. Ejemplo de ensayos que utilizan marcadores como componente generador de señal y los marcadores se describen en la presente invención. Las señales también pueden amplificarse usando biotina y avidina, marcadores enzimáticos o sistemas biotina anti-biotina, tales como los que se describen en las solicitudes de patente pendientes de Estados Unidos Nº de serie 608,849; 070,647; 418,981 y 687,785. Los polipéptidos recombinantes que incluyen epítopos a partir de regiones inmunodominantes de HBV mutante pueden ser útiles para la detección de anticuerpos virales en muestras problema biológicas de individuos infectados. También se contempla que los anticuerpos pueden ser útiles para discriminar infecciones agudas y no agudas. Se construyen kits adecuados para inmunodiagnóstico y que contienen los reactivos empaquetando los materiales apropiados, incluyendo los polipéptidos de la invención que contiene epítopos de HBV mutante o anticuerpos dirigidos contra los epítopos de HBV mutante en recipientes adecuados, junto con los demás reactivos y materiales requeridos para llevar acabo el ensayo, así como instrucciones del ensayo adecuadas.

Caracterización más detallada del genoma de HBV, viriones y antígenos virales usando sondas

Las secuencias de ácido nucleico de HBV mutante pueden usarse para obtener información más detallada de la secuencia del genoma de HBV mutante, y para la identificación y aislamiento de HBV mutante. Esta información, sucesivamente, puede llevar a sondas polinucleotídicas adicionales, polipéptidos derivados del genoma de HBV y anticuerpos dirigidos contra epítopos de HBV mutante que podrían ser útiles para el diagnóstico y/o el tratamiento de la hepatitis por HBV mutante.

La información de la secuencia de ácido nucleico es útil para el diseño de sondas para el aislamiento de secuencias de ácido nucleico que derivan de la región de envuelta del genoma de HBV mutante. Por ejemplo, sondas marcadas que contienen una secuencias de 8 o más nucleótidos, y preferiblemente de 20 o más nucleótidos, que deriva de regiones próximas al extremo 5' o al extremo 3' de las secuencias de ácido nucleico de HBV mutante pueden usarse para aislar secuencias de ácido nucleico solapadas a partir de librerías genómicas de HBV mutante. Estas secuencias que solapan con las secuencias de ácido nucleico de HBV mutante, pero que también contienen secuencias derivadas de las regiones del genoma a partir de las cuales no deriva la secuencia de ácido nucleico de HBV mutante mencionada anteriormente, pueden usarse entonces para la síntesis de sondas para la identificación de otros fragmentos solapados que no necesariamente solapan con las secuencias de ácido nucleico de los clones. A menos que el genoma de HBV mutante esté segmentado y los segmentos carezcan de secuencias comunes, es posible secuenciar el o los genomas virales completos utilizando la técnica de aislamiento de secuencias de ácido nucleico solapantes derivadas del genoma(s) virales. Aunque esto es poco probable, si el genoma es un genoma fragmentado que carece de secuencias comunes, la secuencia del genoma puede determinarse serológicamente por selección de las librerías genómicas lambda-gt11 de HBV mutante, secuenciando los aislados genómicos de HBV mutante, y usando las secuencias de ácido nucleico aisladas de HBV mutante para aislar fragmentos solapantes, usando las técnicas descritas para el aislamiento y la secuenciación de clones. La caracterización de los segmentos genómicos alternativamente podría ser a partir del genoma(s) virales aislados a partir de partículas virales mutantes. Se describe en la presente invención los métodos de purificación de partículas de HBV mutante y para detectarlos durante los procesos de purificación. Los procedimientos para el aislamiento de los genomas polinucleotídicos a partir de las partículas virales son bien conocidos en la técnica. Entonces, pueden clonarse y secuenciarse los segmentos genómicos aislados. De ese modo, es posible clonar y secuenciar el genoma o genomas de HBV mutante sin tomar en cuenta su naturaleza.

Los métodos para la construcción de librerías genómicas de HBV mutante son conocidos en la técnica, y los vectores útiles para este fin son conocidos en la técnica. Estos vectores incluyen lambda-gt11, lambda-gt10, y otros. La secuencia de ácido nucleico derivada de HBV mutante detectada por las sondas derivadas de las librerías genómicas de HBV mutante, pueden aislarse a partir del clon por digestión de polinucleotido aislado con el enzima o enzimas de restricción apropiados, y secuenciado.

La información de la secuencia derivada de estas secuencias solapadas de ácido nucleico de HBV mutante es útil para determinar áreas de homología y heterogeneidad entre el genoma(s) virales, que podría indicar la presencia de diferentes cepas del genoma y/o de poblaciones de partículas deficazs. También se usa para el diseño de sondas de hibridación para detectar antígenos de HBV o de HBV mutante o ácidos nucleicos de HBV en muestras biológicas, y durante el aislamiento de HBV mutante, utilizando las técnicas descritas en la presente invención. Las secuencias de ácido nucleico solapantes puede usarse en la creación de vectores de expresión para los polipéptidos derivados del genoma(s) de HBV mutante. Codificados dentro de la familia de secuencias de ácido nucleico están el antígeno(s) que contienen epítopos contemplados como únicos de HBV mutante, es decir, los anticuerpos dirigidos contra estos antígenos están ausentes en individuos infectados con HAV, HCV y HEV, y con las secuencias genómica en Genebank, se contemplan para indicar que existe una homología mínima entre estas secuencias de ácido nucleico y las secuencias de polinucleótidos de aquellas fuentes. Así, los anticuerpos dirigidos contra los antígenos codificados por las secuencias de ácido nucleico de HBV mutante pueden usarse para identificar las partículas de HBV mutante a partir de individuos infectados. Además, también son útiles para el aislamiento del agente(s) HBV mutante.

Las partículas mutantes pueden aislarse a partir del suero de individuos infectados o de cultivos celulares por cualquier método conocido en la técnica, incluyendo por ejemplo, técnicas basadas en la discriminación por tamaño tales como métodos de sedimentación o exclusión, o técnicas basadas en densidad tales como ultracentrifugación en gradientes de densidad, o precipitación con agentes como el polietilen glicol (PEG), o cromatografía en varios materiales tales como materiales de intercambio aniónico o catiónico, y materiales que se unen debido a interacciones hidrófobas, así como columnas de afinidad. Durante el procedimiento de aislamiento puede detectarse la presencia de HBV mutante mediante análisis de hibridación del genoma extraído, usando sondas derivadas de las secuencias de ácido nucleico de HBV mutante o por inmunoensayo que utiliza como sondas anticuerpos dirigidos contra antígenos de HBV mutante codificados dentro de la familia de las secuencias de ácido nucleico de HBV mutante. Los anticuerpos pueden ser policlonales o monoclonales, y puede ser conveniente purificar los anticuerpos antes de su uso en inmunoensayo. Tales anticuerpos dirigidos contra antígenos de HBV mutante que están pegados a fases sólidas son útiles para el aislamiento de HBV mutante por cromatografía de inmunoafinidad. Los métodos de cromatografía de inmunoafinidad son bien conocidos en la materia, e incluyen métodos para pegar anticuerpos a fases sólidas reteniendo su actividad inmunoselectiva. Estos métodos incluyen adsorción y unión covalente. Pueden incluirse grupos espaciadores en los agentes de enlace bifuncionales siempre que el sitio de unión al antígeno con el anticuerpo permanezca accesible.

Durante el procedimiento de purificación, la presencia de HBV mutante puede detectarse y/o verificarse por hibridación del ácido nucleico, utilizando como sondas polinucleótidos derivados de una familia de secuencias genómicas, así como a partir de secuencias de ácido nucleico de HBV mutante solapantes. Las fracciones se tratan bajo condiciones que causaría la interrupción de partículas virales, tales como el uso de detergentes en presencia de agentes quelantes y la presencia de ácido nucleico viral determinado por técnicas de hibridación. Puede obtenerse confirmación adicional de que las partículas aisladas son los agentes que inducen la infección de HBV mutante infectando un individuo, que es preferiblemente un chimpancé, con las partículas aisladas del virus, seguido de una determinación de qué síntomas de hepatitis por HBV mutante, como se describe en la presente invención, resultan de la infección.

La determinación de las secuencias que contienen polipéptidos conservados puede ser útil para la selección de sondas que se unan al genoma de HBV mutante, permitiendo de ese modo su aislamiento. Además, las secuencias conservadas junto con las derivadas de las secuencias de ácido nucleico de HBV mutante, puede usarse para diseñar cebadores para usar en sistemas en los que se amplifican las secuencias génicas. Además, también puede determinarse la estructura de HBV mutante y de sus componentes aislados. La morfología y el tamaño pueden determinarse por microscopía electrónica, por ejemplo. La identificación y localización de antígenos polipeptídicos virales específicos como los antígenos de la envoltura (cubierta), o antígenos internos como las proteínas de unión con ácido nucleico o antígenos del núcleo, y polinucleotido polimerasa(s) también pueden determinarse estableciendo si los antígenos están presentes en componentes virales principales o menores, así como utilizando como sondas anticuerpos dirigidos contra los antígenos específicos en las secuencias de ácido nucleico aisladas. Esta información puede ser útil para las aplicaciones diagnósticas y terapéuticas. Por ejemplo, pude ser preferible incluir un antígeno exterior en una preparación para vacuna, o quizás las vacunas multivalentes pueden comprende un polipéptido derivado del genoma que codifica para una proteína estructural así como para otro polipéptido de otra porción del genoma tal como un polipéptido no estructural.

Sistemas de cultivo celular y sistemas de modelo animal para la replicación de HBV

Generalmente, células o líneas celulares adecuadas para el cultivo de HBV mutante pueden incluir las siguientes: células de riñón de mono tales como MK2 y VERO, líneas celulares de riñón porcino tales como PS, líneas celulares de riñón de cría de hámster tales como BHK, líneas celulares de macrófagos murinos tales como P388D1, MK1 y Mm1, líneas celulares de macrófagos humanos tales como U-937, leucocitos de sangre periférica humana, monocitos adherentes humanos, hepatocitos o líneas celulares hepatocíticas tales como HUH7 y HepG2, embriones o células embrionarias como fibroblastos de embrión de pollo o líneas celulares derivadas de invertebrados, preferiblemente de insectos tales como líneas celulares de Drosophila o más preferiblemente a partir de artrópodos tales como líneas celulares de mosquito y líneas celulares de garrapata. También es posible que se puedan cultivar hepatocitos primarios y luego infectarlos con HBV mutante. Alternativamente, los cultivos de hepatocitos pueden derivar de los hígados de individuos infectados (humano o chimpancé). Este último caso es un ejemplo de una línea celular que es infectada in vivo se pasa a in vitro. Además, pueden usarse varios métodos de inmortalización para obtener líneas celulares derivadas de los cultivos de hepatocitos. Por ejemplo, los cultivos primarios de hígado (antes y después del enriquecimiento de la población de hepatocitos) pueden fusionarse con varias líneas celulares para mantener su estabilidad. También, los cultivos pueden infectarse con virus transformantes, o transfectarse con genes transformantes para crear líneas celulares permanentes o semipermanentes. Además, las células en cultivos de hígado puede fusionarse para establecer líneas celulares tales como PehG2. Los métodos de fusión celular son bien conocidos por los especialistas, e incluyen el uso de agentes de fusión tales como PEG, el virus Sendai y virus de Epstein-Barr, entre
otros.

Se contempla que la infección por HBV mutante de líneas celulares puede realizarse mediante técnicas tal como incubación de las células con preparaciones virales bajo condiciones que permitan la entrada viral en la célula. También puede ser posible obtener producción viral por transfección de células con polinucleótidos virales aislados. Métodos para transfectar células de cultivos tisulares son conocidos en la técnica e incluyen, pero sin ser limitantes, técnicas que usan electroporación y precipitación con DEAE-Dextrano o fosfato cálcico. La transfección con ADN genómico de HBV mutante clonado debería tener como resultado la replicación viral y la propagación in vitro del virus. Además de células cultivadas, se pueden usar sistemas de modelos animales para la replicación viral.

Selección de agentes antivirales para HBV mutante

La capacidad de cultivos celulares y sistemas de modelos animales para HBV mutante también proporciona la selección de agentes antivirales que inhiben la posible replicación de HBV mutante, y particularmente para los agentes que preferentemente permiten el crecimiento y multiplicación celular, mientras que inhiben la replicación viral. Estos métodos de selección son conocidos en la técnica. Generalmente, se testa a varias concentraciones el efecto de los agentes antivirales en la prevención de la replicación viral en sistemas de cultivos celulares que mantienen la replicación, y luego una inhibición de la infectividad o patogenicidad viral, y un bajo nivel de toxicidad, en un sistema de modelo animal. Los métodos y composición proporcionados en la presente invención para detectar antígenos de HBV mutantes y polinucleótidos de HBV mutante son útiles para la selección de agentes antivirales puesto que proporcionan una alternativa, y quizás un medio más sensible, para detectar el efecto de los agentes sobre la replicación viral que el ensayo de placa celular o el ensayo de ID_{50}. Por ejemplo, las sondas de polinucleótidos de HBV mutante descritos en la presente invención pueden ser útiles para cuantificar la cantidad de ácido nucleico viral producido en un cultivo celular. Esto podría realizarse por hibridación o hibridación competitiva de los ácidos nucleicos de las células infectadas con una sonda marcada de polinucleotido de HBV mutante. También se pueden usar anticuerpos anti-HBV mutante para identificar y cuantificar antígeno(s) de HBV mutante en el cultivo celular utilizando los inmunoensayos descritos en la presente invención. También, ya que puede ser deseable cuantificar antígenos de HBV mutante en un cultivo celular infectado por un ensayo competitivo, los polipéptidos codificados en las secuencias de ácido nucleico de HBV mutante descritas en la presente invención son útiles para estos ensayos. Generalmente, un polipéptido recombinante de HBV mutante derivado del ADN genómico de HBV mutante se marcaría, y la inhibición de la unión de este polipéptido marcado a un polipéptido de HBV mutante debido al antígeno producido en el sistema de cultivo celular, sería monitorizado. Estos métodos son especialmente útiles en casos donde el HBV mutante puede ser capaz de replicarse en una línea celular sin causar la muerte celular.

Preparación de cepas atenuadas de HBV mutante

Quizás es posible aislar cepas atenuadas de HBV mutante utilizando sistemas de cultivo tisular y/o sistemas de modelos animales proporcionados en la presente invención. Estas cepas atenuadas serían útiles para vacunas o para el aislamiento de antígenos virales. Las cepas atenuadas son aislables después de múltiples pases en cultivo celular y/o modelo animal. La detección de una cepa atenuada en una célula o individuo infectado es posible mediante los siguientes métodos conocidos en la técnica y podría incluir el uso de anticuerpos contra uno o más epítopos codificados en el HBV mutante como sonda o el uso de un polinucleotido que contenga una secuencia de HBV mutante de al menos aproximadamente 8 nucleótidos de longitud como sonda. También o alternativamente, se puede construir una cepa atenuada utilizando la información genómica de HBV mutantes proporcionados en la presente invención, y utilizando técnicas recombinantes. Normalmente se hace un intento para delecionar la región del genoma que codifica para un polipéptido relacionado con la patogenicidad, pero no con la replicación viral. La construcción genómica permitiría la expresión de un epítopo que da lugar a anticuerpos neutralizantes para HBV mutante. El genoma alterado podría usarse entonces para transformar células que permiten la replicación de HBV mutante y el crecimiento celular bajo condiciones que permiten la replicación viral. Las cepas atenuadas de HBV mutantes son útiles, no sólo para los propósitos de vacunas, sino también como fuente para la producción comercial de antígenos virales, puesto que el procesamiento de estos virus requeriría unas medidas de protección menos rigurosas para los empleados implicados en la producción viral y/o la producción de productos virales.

Hospedadores y secuencias control de la expresión

Aunque las siguientes son conocidas en la técnica, las incluidas en la presente invención son generalmente técnicas usadas en la extracción de un virus, preparación y análisis de una librería genómica, secuenciación de clones, construcción de vectores de expresión, transformación de células, realización de ensayos inmunológicos y para el crecimiento de células en cultivo.

Ambas células hospedadoras, procariotas y eucariotas, pueden usarse para la expresión de secuencias codificadoras deseadas cuando se usan las apropiadas secuencias control compatibles con el hospedador designado. Entre los hospedadores procariotas, E. coli es el más frecuentemente usado. Las secuencias control de la expresión para procariotas incluyen promotores, conteniendo opcionalmente porciones de operador, y sitios de unión a ribosomas. Los vectores de transferencia compatibles con hospedadores procariotas derivan frecuentemente del plásmido pBR322 que contienen operones que confieren resistencia a la ampicilina y tetraciclina, y varios vectores pUC, que también contienen secuencias que confieren marcadores de resistencia a antibióticos. Estos marcadores pueden usarse para obtener transformantes eficaces para la selección. Frecuentemente, las secuencias control de procariotas usadas incluyen la beta-lactamasa (penicilinasa), el sistema promotor de lactosa (Chang et al., Nature, 198:1056 [1977]), el sistema promotor de triptófano (publicado por Goeddel et al., Nucleic Acid Res., 8:4057 [1980]) y el promotor P1 derivado de lambda y el sitio de unión a ribosomas del gen N (Shimatake et al., Nature 292:128 [1981]) y el promotor Tac híbrido (De Boer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21 [1983]) derivado de secuencias de los promotores de UV5 de trp y lac. Los sistemas anteriores son particularmente compatibles con E. coli; sin embargo, los hospedadores procariotas como cepas de Bacillus o Pseudomonas pueden usarse si se desea, con las correspondientes secuencias
control.

Los hospedadores eucariotas incluyen sistemas de células de levadura y de mamífero en cultivo. Saccharomyces cerevisiae y Saccharomyces carlsbergensis son los hospedadores de levadura más frecuentemente usados y son hospedadores fúngicos convenientes. Los vectores compatibles de levadura llevan marcadores que permiten la selección de transformantes eficaces confiriendo protrofia a mutantes auxotróficos o resistencia a metales pesados en cepas de tipo salvaje. Los vectores compatibles de levadura pueden emplear el origen de replicación de 2 micras (como describe Broach et al., Meth. Enz. 101:307 [1983]), la combinación de CEN3 y ARS1 u otros medios para asegurar la replicación, tales como secuencias que tendrán como resultado la incorporación de un fragmento apropiado en el genoma de la célula hospedadora. Las secuencias control para los vectores de levadura son conocidas en la técnica e incluyen promotores para la síntesis de enzimas glicolíticos, incluyendo el promotor de la 3-fosfoglicerato quinasa. Véase, por ejemplo, Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7:149 (1968), Holland et al., Biochemistry 17:4900 (1978) y Hitzeman, J. Biol. Chem. 255:2073 (1980). También se pueden incluir terminadores, tales como los derivados del gen de enolasa como publicó Holland et al., J. Biol. Chem. 256:1385 (1981). Se contempla que sistemas control particularmente útiles son aquellos que comprenden el promotor de la gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) o el promotor regulable de la alcohol deshidrogenasa (ADH), los terminadores también derivan de GAPDH, y si se desea la secreción, secuencias líder del factor alfa de levadura. Además, la región reguladora transcripcional y la región iniciadora transcripcional que están operativamente ligadas pueden ser tales que no estén asociadas de forma natural en el organismo de tipo salvaje.

Líneas celulares de mamíferos disponibles como hospedadores para la expresión son conocidas en la técnica e incluyen muchas líneas celulares inmortalizadas que están disponibles en la American Type Culture Collection. Estas incluyen, células HeLa, células de ovario de hámster chino (CHO), células de riñón de cría de hámster (BHK) y otras. Los promotores adecuados para células de mamífero también son conocidos en la técnica e incluyen promotores virales como el del virus 40 de mono (SV40), virus del sarcoma de Rous (RSV), adenovirus (ADV), virus del papiloma bovino (BPV), citomegalovirus (CMV). Las células de mamífero también pueden necesitar secuencias terminadoras y secuencias de adición de poli A; también se pueden incluir secuencias potenciadoras que incrementan la expresión, y también pueden ser deseables las secuencias que causan la amplificación del gen. Estas secuencias son conocidas en la técnica. Los vectores virales adecuados para la replicación en células de mamífero pueden incluir replicones virales o secuencias que aseguren la integración de las secuencias apropiadas que codifican para epítopos no A, no B, no C y no E en el genoma de hospedador. Un ejemplo de un sistema de expresión mamífero para HCV se describe en la Solicitud de Patente de los Estados Unidos Nº de Serie 07/830,024, presentada el 31 de enero de 1992.

Transformaciones

La transformación puede realizarse por cualquier método conocido para la introducción de polinucleótidos en una célula hospedadora, incluyendo el empaquetamiento del polinucleotido en un virus y la transducción de una célula hospedadora con el virus, y mediante captación directa del polinucleotido. Los procedimientos de transformación seleccionados dependen del hospedador que ha de ser transformado. La transformación bacteriana por captación directa generalmente emplea tratamiento con cloruro de calcio o de rubidio. Cohen, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:2110 (1972). La transformación en levadura por captación directa se puede llevar a cabo usando el método de precipitación con fosfato cálcico de Graham et al., Virology 52:526 (1978), o modificaciones de éste.

Construcción de vectores

La construcción de vectores emplea métodos conocidos en la técnica. Generalmente, se realiza la escisión de ADN específica de sitio mediante el tratamiento con enzimas de restricción adecuadas bajo condiciones que generalmente específica el fabricante de estos enzimas disponibles comercialmente. Normalmente, se escinde aproximadamente 1 microgramo (\mug) de plásmido o de secuencia de ADN por 1 unidad de enzima en aproximadamente 20 \mul de solución tampón mediante la incubación a 37ºC durante 1 a 2 horas. Tras la incubación con el enzima de restricción, la proteína es eliminada por extracciones con fenol/cloroformo y el ADN recuperado por precipitación con etanol. Los fragmentos escindidos pueden separarse usando métodos de electroforesis en geles de poliacrilamida o agarosa, según los métodos conocidos por el especialista.

Los extremos cohesivos de fragmentos escindidos pueden hacerse extremos romos usando la ADN polimerasa I (Klenow) de E. coli en presencia de los apropiados desoxinucleótidos trifosfato (dNTP) presentes en la mezcla. También se puede usar el tratamiento con nucleasa SI, que tiene como resultado la hidrólisis de cualquier porción de ADN de hebra sencilla.

Los ligamientos se realizan usando tampones y condiciones de temperatura estándar usando la ADN ligasa de T4 y ATP. Los ligamientos de extremos cohesivos requieren menos ATP y menos ligasa que los ligamientos de extremos romos. Cuando se usan fragmentos de vector como parte de una mezcla de ligamiento, el fragmento de vector a menudo se trata con fosfatasa alcalina bacteriana (BAP) o fosfatasa alcalina intestinal de ternero para eliminar el 5'-fosfato y así prevenir el religamiento del vector. O se puede usar la digestión con enzimas de restricción de fragmentos indeseados para prevenir el ligamiento. Las mezclas de ligamiento se transforman en hospedadores de clonación adecuados como E. coli y transformantes eficaces seleccionados por métodos que incluyen resistencia a antibióticos, y luego seleccionados para la construcción correcta.

Construcción de secuencias de ADN deseadas

Se pueden preparar oligonucleótidos sintéticos usando un sintetizador de oligonucleótidos automático como el descrito por Warner, DNA 3:401 (1984). Si se desea, la hebra sintética se puede marcar con ^{32}P mediante el tratamiento con polinucleotido quinasa en presencia de ^{32}P-ATP, usando condiciones estándar para la reacción. Las secuencias de ADN que incluyen las aisladas de librerías genómicas o de ADNc, pueden modificarse por métodos conocidos que incluye la mutagénesis dirigida a sitio como describe Zoller, Nucleic Acids Res. 10:6487 (1982). Brevemente, el ADN que ha de ser modificado se empaqueta en un fago como una secuencia de hebra sencilla, y se convierte en ADN de doble hebra con ADN polimerasa usando, como cebador, un oligonucleótido sintético complementario a la porción de ADN que ha de ser modificado, y teniendo la modificación deseada incluida en su propia secuencia. El cultivo de las bacterias transformadas, que contienen replicaciones de cada hebra del fago se pone en placas de agar para obtener placas. Teóricamente, el 50% de las placas nuevas contienen fagos que portan la secuencia mutada, y el 50% restante tienen la secuencia original. Se hibridan réplicas de las placas con la sonda sintética marcada a temperatura y condiciones adecuadas para hibridar con la banda correcta, pero no con la secuencia sin modificar. Las secuencias que han sido identificadas por hibridación se recuperan y se clonan.

Hibridación con sonda

Las librerías genómicas o de ADN de HBV pueden ser analizadas usando el procedimiento descrito por Grunstein y Hogness, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73:3961 (1975). Brevemente, el ADN a analizar es inmovilizado en filtros de nitrocelulosa, desnaturalizado y prehibridado con un tampón que contiene de 0 a 50% de formamida, NaCl 0,75 M, citrato sódico 0,75 mM, albúmina sérica bovina (BSA), polivinil pirrolidona y Ficoll al 0,02% (p/v) cada uno, fosfato sódico 50 mM (pH 6,5), SDS al 0,1% y 100 \mug/ml de ADN desnaturalizado vehículo. El porcentaje de formamida en el tampón, así como las condiciones de tiempo y temperatura de las etapas de prehibridación y posterior hibridación dependen del rigor requerido. Las sondas oligoméricas que requieren condiciones de rigor más bajas se usan generalmente con porcentajes bajos de formamida, temperaturas más bajas y tiempos de hibridación más largos. Las sondas que contienen más de 30 ó 40 nucleótidos como los derivados de secuencias genómicas generalmente emplean temperaturas más altas, por ejemplo, aproximadamente 40 a 42ºC, y un alto porcentaje, por ejemplo, 50% de formamida. Después de la prehibridación, se añade una sonda de oligonucleótido marcada con ^{32}P al tampón y los filtros se incuban en esta mezcla bajo las condiciones de hibridación. Después de lavar, los filtros tratados son sometidos a autorradiografía para mostrar la localización de la sonda hibridada. El ADN en las localizaciones correspondientes sobre la placa de agar original se usa como fuente del ADN deseado.

Verificación de la construcción y secuenciación

Para la construcción de vectores estándares, las mezclas de ligamiento se transforman en la cepa HB101 de E. coli u otro hospedador adecuado, y se seleccionan los transformantes eficaces por la resistencia a antibióticos u otros marcadores. Los plásmidos de los transformantes seleccionados se preparan entonces según el método de Clewell et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 62:1159 (1969) normalmente tras la amplificación con cloranfenicol como publica Clewell et al., J. Bacteriol. 110:667 (1972). El ADN se aisla y analiza normalmente mediante el análisis por enzimas de restricción y/o secuenciación. La secuenciación puede realizarse por el bien conocido método dideoxi de Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463 (1977) como describen más detalladamente Messing et al., Nucleic Acid Res. 9:309 (1981), o por el método publicado por Maxam et al., Methods in Enzymology 65:499 (1980). Los problemas con la compresión de bandas, que se observan a veces en regiones ricas en CG, se solucionan por el uso de T-deazoguanosina según el método publicado por Barr et al., Biotechniques 4:428 (1986).

Ensayo de inmunoabsorción enzimática

Se puede usar el ensayo de inmunoabsorción enzimática (ELISA) para medir las concentraciones de antígeno o anticuerpo. Este método depende de la conjugación de un marcador enzimático a un antígeno o anticuerpo, y usa la actividad del enzima unido (señal generada) como un marcaje cuantitativo (señal generada mensurable). Los métodos que utilizan enzimas como marcajes se describen en la presente invención, como son ejemplos de tales marcadores enzimáticos.

Preparación de secuencias de ácido nucleico de HVB mutante

La fuente del agente de HBV mutante es un plasma, suero u homogeneizado de hígado individual o mezcla de un humano o chimpancé infectado con el virus HBV mutante que reúna los criterios clínicos y de laboratorio descritos en la presente invención. Alternativamente, se puede infectar experimentalmente un chimpancé con sangre de otro individuo con hepatitis HBV mutante que reúna los criterios descritos posteriormente. Se puede hacer una mezcla combinando muchas muestras de plasmas, sueros u homogeneizados de hígado individuales que contengan altos niveles de actividad alanina transferasa; esta actividad resulta de la lesión hepática debida a la infección por HBV mutante.

Por ejemplo, una librería de plasma, suero u homogeneizado de hígado, preferiblemente, pero no necesariamente, con alto título, se genera como sigue. Primero, se aíslan las partículas virales del plasma, suero u homogeneizado de hígado; luego se diluye una alícuota en una solución tamponada, como una que contenga Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM, NaCl 100 mM. Los restos se eliminan por centrifugación, por ejemplo, durante 20 minutos a 15.000 x g a 20ºC. Las partículas virales en el sobrenadante se sedimentan entonces por centrifugación bajo las condiciones apropiadas, que pueden ser determinas de forma rutinaria por un especialista en la técnica. Para liberar el genoma viral, las partículas se rompen resuspendiendo los sedimentos en una alícuota de una suspensión de SDS, por ejemplo, una que contenga SDS al 1%, EDTA 120 mM, Tris-HCl 10 mM, pH 7,5, que también contenga 2 mg/ml de proteinasa K, seguido por una incubación en condiciones adecuadas, por ejemplo, 45ºC durante 90 minutos. Los ácidos nucleicos se aíslan añadiendo, por ejemplo, 0,8 \mug de ARN de bacteriófago MS2 como vehículo, y extrayendo la mezcla cuatro veces con una mezcla 1:1 de fenol:cloroformo (fenol saturado con Tris-HCl 0,5 M, pH 7,5, beta-mercaptoetanol al 0,1% (v/v), hidroxiquinolona al 0,1% (p/v)), seguido de la extracción dos veces con cloroformo. La fase acuosa se concentra con, por ejemplo, 1-butanol previo a la precipitación con 2,5 volúmenes de etanol absoluto durante toda la noche a -20ºC. Los ácidos nucleicos se recuperan por centrifugación en, por ejemplo, un rotor Beckman SW41 a 40.000 rpm durante 90 min a 4ºC, y se disuelven en agua tratada con dietilpirocarbonato al 0,05% (v/v) y autoclavada.

Los ácidos nucleicos obtenidos por el procedimiento anterior se desnaturalizan con, por ejemplo, CH_{3}HgOH 17,5 mM; se sintetiza entonces el ADNc usando este ácido nucleico desnaturalizado como molde, y se clona en un sitio EcoRI del fago lambda-gt11, por ejemplo, usando métodos descritos por Huynh (1985), supra, excepto en que los cebadores aleatorios reemplazan al oligo(dT) 12-18 durante la síntesis de la primera hebra de ácido nucleico mediante transcriptasa inversa (véase Taylor et al., [1976]).

La librería genómica de lambda-gt11 generada así se selecciona para epítopos que se pueden unir específicamente con suero, plasma u homogeneizado de hígado de un individuo que ha experimentado previamente hepatitis debida al virus de la hepatitis B mutante (uno que reúna los criterios como se explican posteriormente). Se analizan aproximadamente 10^{4} a 10^{7} fagos con sueros, plasmas u homogeneizados de hígado usando el método de Huynh et al. (supra). El anticuerpo humano unido se puede detectar con un antisuero de carnero anti-Ig humana que esté radiomarcada con ^{125}I u otras moléculas indicadoras apropiadas incluyendo HRPO, fosfatasa alcalina y otras. Se identifican y purifican los fagos positivos. Se testa, entonces, la especificidad de estos fagos para unirse a sueros de un número predeterminado de humanos diferentes previamente infectados con el agente HBV mutante, usando el mismo método. Idealmente, el fago codificará para un polipéptido que reacciona con todos o la mayoría de los sueros, plasmas u homogeneizados de hígado que se testan, y no reaccionará con sueros, plasmas u homogenizados de hígado de individuos que se determinan son "negativos" según los criterios explicados en la presente invención para el agente HBV mutante, así como hepatitis A, B no mutante, C y E. Siguiendo estos procedimientos, un clon que codifica para un polipéptido que es reconocido de forma específica inmunológicamente por sueros, plasmas u homogeneizados de hígado de pacientes identificados como no A, no B mutante, no C, no E.

La presente invención será ahora descrita por media de ejemplos.

Ejemplos Ejemplo 1 Identificación de las muestras de suero Determinaciones iniciales de laboratorio

Se usaron inmunoensayos disponibles comercialmente (AUSZYME® y AUSRIA®II, Abbott Laboratorios, Abbott Park, IL) para la determinación de anticuerpos contra HBsAg. Siguiendo las instrucciones del fabricante, una muestra de ensayo de suero de un paciente se testó tres veces por el ensayo AUSZYME® para anticuerpos contra HBsAg. El kit AUSZYME® contiene una fase sólida (partículas) sobre la que se ha cubierto con los anticuerpos contra HBsAg. La muestra de ensayo del paciente dio negativa cada una de las tres veces para anticuerpos contra HBsAg usando este kit. La muestra de ensayo del paciente se volvió a testar usando el kit AUSRIA®, que contiene un anticuerpo policlonal contra el antígeno de superficie de la hepatitis B. El resultado de la prueba AUSRIA® indicaba que el paciente era positivo para el anticuerpo contra HBsAg.

Pruebas de laboratorio más detalladas

Una muestra de ensayo de suero del paciente que se testó como negativo en la prueba de anticuerpo monoclonal AUSZYME® para el anticuerpo contra HBsAg y positivo en la prueba de anticuerpo policlonal AUSRIA® para el anticuerpo contra HBsAg, se diluyó 1:20. Se realizó un intercambio de reactivos de AUSRIA® y reactivos monoclonales de AUSZYME® (es decir, partículas de AUSRIA® con el anticuerpo monoclonal marcador de AUSZYME®, y viceversa). Las condiciones preferidas de la prueba para evaluación fueron la incubación durante toda la noche de las muestras problema a temperatura ambiente para la primera incubación y cuatro horas a temperatura ambiente para la segunda incubación. También se hizo una dilución seriada de la muestra de ensayo, y se testaron y compararon las diluciones con diluciones similares (5 veces) del control positivo. Los datos de estas pruebas se representan a continuación en la tabla 1.

TABLA 1

1

Los datos previamente indicaban que la muestra de ensayo era reactiva con AUSRIA®II y no con el monoclonal AUSZYME®. Los datos de la tabla 1 muestran que cuando se usaban los reactivos de intercambio cruzado para testar la muestra de ensayo, la muestra de ensayo era débilmente reactiva con ambas combinaciones, pero era algo más reactiva con las partículas de AUSZYME® y con el ^{125}I-anticuerpo que con las partículas de AUSRIA® y el anticuerpo AUSZYME®-HRP. Investigaciones más detalladas de las diferencias entre los anticuerpos de cada sistema de ensayo indican que el principal reactivo en el AUSZYME® es un anticuerpo anti-a, como es el HRP-anticuerpo. En AUSRIA®II, la partícula está cubierta con un anticuerpo policlonal anti-HB que es un fuerte anti-a, pero con capacidades anti-d y anti-y. Además, el ^{125}-I-anticuerpo de AUSRIA®II es un policlonal que es predominantemente anti-a, pero se considera que partícula y anticuerpos sonda tienen un amplio espectro. El anticuerpo monoclonal que centra su especificidad en anti-a no reaccionó con la muestra de ensayo. Aunque la muestra de ensayo reaccionó con el anticuerpo policlonal, se pensó que la reactividad del anticuerpo policlonal podría estar alterada puesto que anti-a se detectada demasiado predominantemente. Una curva de dilución con el anticuerpo de AUSRIA®II (no mostrado) reveló que de hecho estaba alterado, aunque el amplio espectro del reactivo policlonal era adecuado para detectar los anti-HB presentes en la muestra de ensayo.

Ejemplo 2 Determinación de secuencia

Puesto que se creía que la muestra era una forma de HBV mutante, la secuenciación se llevó a cabo para determinar si se presentaban algunas variables en el nucleótido y la secuencia de aminoácidos del antígeno de la superficie de HBV. Se llevó a cabo la reacción de secuenciación del dideoxi de Sanger, como se describe en T. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y., Libro 2, Capítulo 13, 13.1-13.77 (1989). Los resultados de las determinaciones de secuencia muestran una inserción de dos aminoácidos en la secuencia del HBsAg en la posición 122. La secuencia de nucleótidos y de aminoácidos de HBV se presentan en la SECUENCIA ID. Nº 1 y en la SECUENCIA ID. Nº 2. La repetición del método revela pequeños cambios de aminoácidos, y se presentan en la SECUENCIA ID. Nº 3 y SECUENCIA ID. Nº 4. Lo que cada secuencia de aminoácidos tiene en común es la inserción de dos aminoácidos (N-T) en la posición 122 de HBsAg. Así, en la secuencia de HBsAg está presente una modificación en la cual hay una inserción de dos aminoácidos en la posición 122 (N-T), con la correspondiente modificación de inserción de seis nucleótidos en la posición 366 en el genoma de HBsAg.

De este modo, la presente invención proporciona reactivos y métodos para determinar la presencia de HBsAg mutantes en una muestra de ensayo. Parece que ensayando con una prueba de anticuerpo monoclonal que predominantemente utiliza anticuerpos anti-a no se detectará este mutante especial. Además, basado en los datos presentados es previsible que las vacunas no protegerán contra esta cepa mutante de HBV. Así, los reactivos de tal HBV mutante son útiles para la detección de HBV en las muestras problema, y también para la producción de vacunas. Se contempla y dentro del alcance de la presente invención que un polinucleotido o polipéptido específico de HBV mutante descrito en la presente invención, o los anticuerpos producidos a partir de estos polipéptidos y polinucleótidos, pueden combinarse con reactivos del presente ensayo e incorporarse en procedimiento de ensayo actuales para la detección de anticuerpos contra HBsAg. Alternativamente, estos polinucleótidos o polipéptidos específicos para el HBV mutante descritos en la presente invención, o los anticuerpos producidos a partir de estos polipéptidos y polinucleótidos, pueden usarse separadamente para la detección de la cepa de HBV mutante en la cual el determinante "a" tiene una inserción de dos aminoácidos en la posición 122 de la secuencias de HBsAg.

Otros usos o variaciones de la presente invención estarán claros para los especialistas en la técnica cuando consideren esta descripción. Por tanto, se desea que la presente invención se limite sólo por las reivindicaciones adjuntas.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i): SOLICITANTE: CARMAN, WILLIAM

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DECKER, RICHARD H

\hskip3,3cm

WALLIS, LESLEY

\hskip3,3cm

MIMMS, LARRY T

\hskip3,3cm

SOLOMON, LARRY R

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(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: MUTANTES DEL VIRUS DE LA HEPATITIS B, REACTIVOS Y MÉTODOS PARA LA DETECCIÓN

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(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 4

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(iv): DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:

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(A): DESTINATARIO: ABBOTT LABORATORIES D377/AP 6D

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(B): CALLE: ONE ABBOTT PARK ROAD

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(C): CIUDAD: ABBOTT PARK

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(D): ESTADO: IL

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(E): PAÍS: ESTADOS UNIDOS

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(F): CÓDIGO POSTAL: 60064-3500

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(v): FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

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(A): TIPO DE MEDIO: Disco flexible

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(B): ORDENADOR: PC IBM compatible

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(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

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(D): SOFTWARE: PatentIn Release No. 1.0, Versión No. 1.25

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(vi): DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

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(A): NÚMERO DE SOLICITUD:

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(B): FECHA DE PRESENTACIÓN:

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(C): CLASIFICACIÓN:

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(viii): INFORMACIÓN DEL MANDATARIO/AGENTE:

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(A): NOMBRE: POREMBSKI, PRISCILLA E.

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(B): NÚMERO DE REGISTRO: 33.207

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(C): NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 5347. US. 01

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(ix): INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:

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(A): TELÉFONO: 708-937-6365

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(B): TELEFAX: 708-938-2623

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 1:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 684 pares de bases

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(B): TIPO: ácido nucleico

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(C): CADENA: sencilla

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

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(ix): CARACTERÍSTICAS:

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(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

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(B): LOCALIZACIÓN: 1..684

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 1:

2

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 2:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 684 aminoácidos

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(B): TIPO: aminoácido

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(C): CADENA: sencilla

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:2:

3

4

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 3:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 228 aminoácidos

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(B): TIPO: aminoácido

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(C): CADENA: sencilla

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:3:

5

6

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 4:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 228 aminoácidos

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(B): TIPO: aminoácido

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(C): CADENA: sencilla

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:4:

7

Claims

1. Un polinucleotido purificado de HBV mutante que comprende un determinante "a" modificado en el que hay una inserción de seis nucleótidos en la posición 366 del genoma de HBsAg, en el que dichos seis nucleótidos son -A-A-C-A-C-A-.

2. Un polipéptido recombinante de HBV mutante que comprende un determinante "a" modificado en el que hay una inserción de dos aminoácidos en la posición 122 de la secuencia de HBsAg, en el que dichos dos aminoácidos insertados en la posición 122 son N y T.

3. El polinucleotido de la reivindicación 2, en el que dicho polinucleotido está contenido en un vector recombinante que se utiliza para transformar una célula huésped.

4. Un sistema de expresión recombinante que comprende un marco abierto de lectura de ADN derivado a partir del genoma de HBV mutante, en el que dicho genoma comprende un determinante "a" modificado que tiene una inserción de seis nucleótidos en la posición 366 del genoma de HBsAg, en el que el marco abierto de lectura está unido de forma operativa con una secuencia control compatible con un hospedador deseado, y en el que dichos seis nucleótidos son -A-A-C-A-C-A-.

5. Un polipéptido recombinante que comprende una secuencia derivada de un genoma de HBV mutante que comprende un determinante "a" modificado que tiene una inserción de seis nucleótidos en la posición 366 del genoma de HBsAg, en el que dichos seis nucleótidos son -A-A-C-A-C-A-.

6. Un anticuerpo monoclonal que específicamente detecta el antígeno del determinante "a" de HBV mutante y no presenta reacción cruzada con el antígeno del determinante "a" de HBV nativo, en cuyo determinante "a" modificado hay una inserción de dos aminoácidos en la posición 122 de la secuencia de HBs Ag, en el que dichos dos aminoácidos insertados en la posición 122 son N y T.

7. Un polipéptido de fusión que comprende un polipéptido de HBV mutante, en el que dicho polipéptido de fusión además comprende un determinante "a" modificado y en el que hay una inserción de dos aminoácidos en la posición 122 de la secuencia de HBsAg, en el que dichos dos aminoácidos insertados en la posición 122 son N y T.

8. Una partícula que es inmunogénica contra la infección de HBV mutante, que comprende un polipéptido no de HBV que tiene una secuencia de aminoácidos capaz de formar una partícula cuando dicha secuencia se produce en hospedadores eucarióticos o procarióticos, y un epítopo de HBV mutante, en el que dicho epítopo de dicho HBV mutante además comprende un determinante "a" modificado en el cual hay una inserción de dos aminoácidos en la posición 122 de la secuencia de HBsAg, en el que dichos dos aminoácidos insertados en la posición 122 son N y T.

9. Una sonda polinucleotídica para HBV mutante que comprende un determinante "a" modificado en el cual hay una inserción de seis nucleótidos en la posición 366 del genoma de HBsAg en el que dichos seis nucleótidos son -A-A-C-A-C-A-.

10. Un kit para determinar la presencia de un antígeno de HBV mutante o anticuerpo en una muestra de ensayo que comprende un recipiente que contiene un polipéptido que posee un epítopo de HBV presente en el antígeno HBV, en el que dicho epítopo comprende un determinante "a" modificado en el que hay una inserción de dos aminoácidos en la posición 122 de la secuencia de HBsAg, en el que los dos aminoácidos son N y T.

11. Un kit para determinar la presencia de un antígeno de HBV mutante o anticuerpo en una muestra de ensayo que comprende un recipiente que contiene un anticuerpo el cual está dirigido contra un antígeno que ha de ser detectado de HBV mutante y en el que dicho antígeno comprende un determinante "a" modificado en el cual hay una inserción de dos aminoácidos en la posición 122 de la secuencia de HBsAg, en el que los dos aminoácidos son N y T.

12. Un kit para determinar la presencia de polinucleótidos de HBV mutante en una muestra de ensayo sospechosa de contener dichos polinucleótidos, que comprende un recipiente que contiene una sonda polinucleotídica que contiene una secuencia de nucleótidos a partir de HBV mutante, en el que dicha secuencia de aminoácidos comprende una inserción de seis nucleótidos en la posición 366 del genoma HBsAg en el que los seis nucleótidos son -A-A-C-A-C-A-.

13. Un método para determinar ácidos nucleicos de HBV mutante en una muestra de ensayo sospechosa de contener HBV que comprende:

a. hacer reaccionar la muestra de ensayo con una sonda para un polinucleotido de HBV en el que dicho polinucleotido comprende una secuencia de nucleótidos a partir de HBV mutante de una inserción de seis nucleótidos en la posición 366 del genoma de HBsAg, bajo condiciones y por un tiempo que permitan la formación de un complejo entre la sonda y el ácido nucleico de HBV mutante en la muestra de ensayo; y

b. detectar el complejo que contiene la sonda, en el que dichos seis nucleótidos son -A-A-C-A-C-A-.

14. Un método para detectar un antígeno de HBV mutante en una muestra de ensayo sospechosa de contener HBV que comprende:

a. poner en contacto una muestra de ensayo con un anticuerpo dirigido contra un antígeno que ha de ser detectado de HBV mutante, en el que dicho antígeno de HBV mutante comprende un determinante "a" modificado en el cual hay una inserción de dos aminoácidos en la posición 122 de la secuencia de HBsAg, en el que los dos aminoácidos son N y T, por un tiempo y bajo condiciones suficientes para permitir la formación de complejos antígeno/anticuerpo; y

b. detectar dichos complejos que contienen el anticuerpo.

15. Un método para detectar anticuerpos contra HBV en una muestra de ensayo sospechosa de contener dichos anticuerpos, que comprende:

a. poner en contacto la muestra de ensayo con una sonda polipeptídica en la que dicho polipéptido contiene un epítopo de HBV mutante y en el que dicho antígeno HBV comprende un determinante "a" modificado en el cual hay una inserción de dos aminoácidos en la posición 122 de la secuencia de HBsAg, durante un tiempo y bajo condiciones que permitan la formación de complejos antígeno/anticuerpo; y

b. detectar dichos complejos que contiene la sonda polipeptídica, en el que dichos dos aminoácidos de la posición 122 son N y T.

16. Una vacuna para el tratamiento de la infección por HBV mutante que comprende una dosis farmacológicamente eficaz de un polipéptido inmunogénico de HBV mutante que contiene un epítopo de HBV y en el cual dicho epítopo de BHV mutante comprende un determinante "a" modificado en el que hay una inserción de dos aminoácidos en la posición 122 de la secuencia HBsAg en un excipiente farmacéuticamente aceptable, y en el que dichos dos aminoácidos insertados en la posición 122 son N y T.

17. Una vacuna para el tratamiento de la infección por HBV mutante que comprende una inactivación o atenuación de HBV mutante en una dosis farmacológicamente eficaz en un excipiente farmacológicamente aceptable, y en el que dicho HBV mutante comprende un determinante "a" modificado en el cual hay una inserción de dos aminoácidos en la posición 122 de la secuencia HBsAg, en el que los dos aminoácidos son N y T.

18. Células desarrolladas en un cultivo tisular infectadas con HBV mutante, en el que dicho HBV mutante comprende un determinante "a" modificado en el cual hay una inserción de dos aminoácidos en la posición 122 de la secuencia HBsAg, en el cual los dos aminoácidos son N y T.

19. El uso de un polipéptido inmunogénico aislado que contiene un epítopo que comprende un determinante "a" modificado en el cual hay una inserción de dos aminoácidos en la posición 122 de la secuencia de HBsAg, en el que dichos dos aminoácidos insertados en la posición 122 son N y T, para la fabricación de una vacuna para prevenir la infección por HBV mutante.