ES2212681T3 - Metodo para separar acidos nucleicos en poblaciones. - Google Patents
Metodo para separar acidos nucleicos en poblaciones.Info
- Publication number
- ES2212681T3 ES2212681T3 ES99973074T ES99973074T ES2212681T3 ES 2212681 T3 ES2212681 T3 ES 2212681T3 ES 99973074 T ES99973074 T ES 99973074T ES 99973074 T ES99973074 T ES 99973074T ES 2212681 T3 ES2212681 T3 ES 2212681T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- dna
- pcr
- primer
- nucleic acid
- molecules
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
- C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6858—Allele-specific amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Semiconductor Lasers (AREA)
Abstract
Un método para separar al menos parcialmente moléculas de ácido nucleico presentes en una muestra, en poblaciones, en el que una población está marcada con una proteína capaz de ser inmovilizada en una matriz, comprendiendo dicho método poner en contacto la muestra que contiene el ácido nucleico con una matriz a la que se unen selectivamente proteínas, por medio de lo cual dicha proteína interacciona directamente con la matriz, las moléculas marcadas son capturadas por la matriz y de ese modo se separan de las moléculas no marcadas.
Description
Método para separar ácidos nucleicos en
poblaciones.
El presente invento se refiere a un método para
separar al menos parcialmente fragmentos de ácidos nucleicos. En
particular, se refiere a un método para separar entre una población
de moléculas de ácido nucleico, aquellas moléculas que están
marcadas con una proteína capaz de ser inmovilizada en una matriz a
la que se unen selectivamente proteínas.
La manipulación y manejo de DNA es fundamental
para la mayoría de las técnicas de biotecnología. La manipulación de
DNA típicamente incluye la digestión con endonucleasas usando
enzimas de restricción específicas que cortan el DNA en fragmentos,
seguida de la purificación de los fragmentos de DNA, de la
inserción del fragmento requerido dentro de vectores de clonación y
de la transferencia de estos vectores a hospedadores no naturales
encargados de la transcripción, y opcionalmente de la traducción,
proporcionando de este modo una información biológica valiosa, y/o
la expresión del DNA insertado en forma de un producto, tal como un
producto terapéutico. Esto permite, por ejemplo, que proteínas
eucariotas sean expresadas en bacterias. La capacidad de poder
cortar y unir moléculas o fragmentos de DNA es fundamental en la
biotecnología moderna. A menudo, estos fragmentos de DNA son
generados por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), que en
la actualidad es una herramienta común tanto en investigación
científica como en biotecnología industrial. Este método permite
que moléculas de DNA específicas sean amplificadas por medio de
cebadores ácido nucleicos específicos y cortos, para producir
grandes cantidades de DNA que pueden ser luego manipuladas, por
ejemplo, utilizando las técnicas de clonación anteriormente
mencionadas.
Los métodos de manipulación de ácidos nucleicos
que incluyen el uso de moléculas de DNA generadas, por ejemplo, por
medio del corte con enzimas de restricción anteriormente mencionado,
o por PCR, suelen ser ineficaces debido, al menos en parte, a la
presencia de moléculas de DNA no deseadas. Esas moléculas "no
deseadas" incluyen, por ejemplo, el DNA del vector resultante de
la escisión, en particular de una escisión incompleta, de un
fragmento de DNA insertado en una molécula recombinante, fragmentos
de restricción parcialmente digeridos u otros productos secundarios
del corte de las moléculas de DNA con enzimas de restricción,
cebadores de PCR presentes en exceso, moléculas de ácido nucleico
ligadas de manera incorrecta y que son los productos secundarios de
la manipulación de ácidos nucleicos, y productos de PCR que son el
resultado de una reasociación errónea de un cebador de PCR con el
ácido nucleico molde. La calidad del DNA producto final principal
es crucial para el éxito de las posteriores manipulaciones aguas
abajo tales como la ligación y transformación de células
hospedadoras bacterianas o eucariotas. La posibilidad de separar
mezclas de moléculas de ácidos nucleicos, tales como mezclas de
moléculas de DNA o de fragmentos de DNA, en poblaciones diferentes,
y de este modo separar lo que se considera que es la población
"no deseada" o contaminante, de la molécula de ácido nucleico
deseada o diana, aumentaría por lo tanto la eficiencia de
procedimientos posteriores o de etapas aguas abajo en las que se
usan esas moléculas de ácido nucleico
generadas.
generadas.
En la técnica se conocen métodos para purificar
moléculas de ácidos nucleicos consideradas como una clase. Sin
embargo, se dispone de métodos limitados que sean capaces de
separar mezclas de moléculas de ácidos nucleicos, tales como
mezclas que comprenden varias moléculas de DNA diferentes, en
poblaciones diferentes. En general, estos métodos se basan en la
separación de moléculas, o fragmentos, de ácidos nucleicos,
conforme a su tamaño, por ejemplo, por medio de una electroforesis
a través de geles de agarosa o poliacrilamida, seguida de la
purificación de la molécula deseada o del fragmento deseado. Estos
métodos presentan varios inconvenientes. Uno de los factores
limitativos es la capacidad del propio gel, la cual limita la
cantidad de DNA que puede separarse. El DNA necesita ser
visualizado en el gel, generalmente por medio de una tinción con
bromuro de etidio. A parte de ser tóxico para el operario, el
bromuro de etidio puede contribuir a una disminución en la calidad
del ácido nucleico, de manera que el rendimiento en aplicaciones
aguas abajo puede ser escaso. La recuperación de las moléculas de
ácido nucleico fraccionadas por electroforesis en gel también es
ineficaz, produciéndose pérdidas significativas, con frecuencia de
al menos el 20% del DNA. Los métodos de electroforesis en gel
también requieren mucho tiempo. El DNA es una molécula frágil y es
vulnerable al ataque por acción de exonucleasas y endonucleasas. El
procedimiento comparativamente largo de separación electroforética,
durante el que el DNA es vulnerable a la degradación, puede por lo
tanto ser perjudicial para la integridad del DNA, y afectar a la
eficiencia de los procedimientos aguas abajo. Esos métodos de
separación son por lo tanto ineficaces y costosos.
El documento
EP-A-O 872 559 describe un método
para la detección simultánea de poligenes. En particular, la Figura
1 describe el uso de cebadores marcados con biotina para iniciar la
síntesis de cDNA, y la recuperación de los cDNA resultantes usando
bolitas magnéticas Dynabeads unidas a estreptavidina.
El documento US 5.741.678 describe un método
cuantitativo para la detección temprana de alelos mutantes. En
particular, la Figura 2 describe secuencias de nucleótidos que
están marcadas con biotina y que pueden unirse a una superficie de
soporte revestida con avidina o estreptavidina.
El documento US 5.602.300 describe un
procedimiento para detectar mutaciones, inter alia. Describe
el uso de partículas sólidas revestidas con la proteína represora
lacI la cual se une a moléculas de DNA que contienen una secuencia
del operador lacZ.
Existe por lo tanto la necesidad de un nuevo
método para separar, al menos parcialmente, moléculas de ácidos
nucleicos en poblaciones diferentes. El presente invento proporciona
ese método.
Según el presente invento, se proporciona un
método para separar al menos parcialmente moléculas de ácido
nucleico presentes en una muestra, en poblaciones, en el que una
población está marcada con una proteína capaz de ser inmovilizada en
una matriz, comprendiendo dicho método poner en contacto la muestra
que contiene el ácido nucleico con una matriz a la que se unen
selectivamente proteínas, por medio de lo cual dicha proteína
interacciona directamente con la matriz, las moléculas marcadas son
capturadas por la matriz y de ese modo se separan de las moléculas
no marcadas.
Este método es mucho más simple que el método de
separación electroforética anteriormente mencionado y es también más
rápido. Es por lo tanto más rentable, tiene una eficiencia completa
mayor, y no adolece de los inconvenientes de una separación
electroforética.
El método se basa en las moléculas de ácido
nucleico marcadas que son capturadas, es decir, que son
inmovilizadas o retenidas en la matriz, efectuándose de este modo
su separación de las moléculas que permanecen en disolución.
El método del invento puede utilizarse para
separar moléculas de ácido nucleico de interés y no marcadas
(moléculas diana), de moléculas o fragmentos de ácido nucleico no
deseados y marcados, y en este caso son las moléculas de ácido
nucleico no deseadas las que son capturadas por la matriz, quedando
las moléculas diana libres en disolución. Esto es ventajoso cuando
las moléculas de ácido nucleico diana deseadas se requieren para
procesamientos aguas abajo, por ejemplo, mediante técnicas de
manipulación genética posteriores, ya que permite que las etapas
posteriores sean llevadas a cabo sin necesidad de eluir o de
desunir de la matriz de alguna otra manera las moléculas de ácido
nucleico deseadas, y asimismo evita la necesidad, en caso de que la
hubiera, de retirar el marcador de las moléculas de ácido nucleico.
Esto constituye por lo tanto un aspecto preferido del invento. El
método puede sin embargo utilizarse también para separar moléculas
marcadas del ácido nucleico diana de interés, de entre fragmentos
de ácido nucleicos no deseados y no marcados, en cuyo caso son las
moléculas diana de interés las que son capturadas por la matriz,
quedando las moléculas de ácido nucleico no deseadas en disolución.
De manera adicional, el método puede utilizarse para reunir todas
las fracciones de ácido nucleico separadas para diferentes fines
aguas
abajo.
abajo.
Según aquí se utiliza, "molécula de ácido
nucleico" se refiere a cualquier molécula de ácido nucleico,
incluyendo DNA, RNA, cDNA y compuestos híbridos tales como
compuestos que comprenden ácidos nucleicos y péptidos, tales como
los ácidos peptidonucleicos (PNA); y en el caso del DNA, incluye
moléculas bicatenarias y monocatenarias, y cualquier molécula
sintética de DNA o RNA y moléculas híbridas de DNA/RNA (es decir,
moléculas en las que una cadena es DNA y la otra cadena es RNA).
DNA "diana" o "deseado" se refiere a la molécula de ácido
nucleico que se quiere aislar o separar de entre otras moléculas de
ácido nucleico. En el contexto del invento, "marcador" se
refiere a una proteína que puede estar añadida a, unida a,
incorporada en, portada por, una molécula de ácido nucleico, o que
puede ser parte de la secuencia de nucleótidos de la molécula de
ácido nucleico, o que puede estar enlazada de algún otro modo a una
molécula de ácido nucleico, y que sirve como medio para capturar la
población marcada de moléculas de ácido nucleico en una muestra que
contiene ácidos nucleicos en la que una población particular está
marcada de este modo y las otras poblaciones no están marcadas. El
marcador de ese modo permite que la mezcla de ácidos nucleicos sea
fraccionada, separándose las moléculas marcadas de las moléculas no
marcadas por medio de una etapa de retención utilizando una matriz.
El marcador puede estar incorporado dentro de la molécula del ácido
nucleico, es decir, puede ser parte de la molécula del ácido
nucleico, por ejemplo, puede ser parte de un nucleótido modificado
y puede incorporarse a la molécula de ácido nucleico durante su
síntesis, o puede ser parte de la secuencia de ácido nucleico de la
molécula, en cuyo caso a la molécula de ácido nucleico propiamente
dicha se la denomina marcada, o el marcador puede añadirse o unirse
a una molécula de ácido nucleico, por ejemplo, en etapas posteriores
a su síntesis, por ejemplo, mediante la adición de nucleótidos
terminales, o uniéndolo a una secuencia de reconocimiento contenida
en la secuencia del ácido nucleico, en cuyo caso, el ácido
nucleico, cuando no lleva el marcador añadido, se describe como
capaz de ser marcado.
El método puede utilizarse para separar o
fraccionar cualquiera de las clases de ácidos nucleicos
anteriormente mencionadas, o mezclas de las mismas. Un aspecto
preferido del invento comprende el fraccionamiento de moléculas o
fragmentos de DNA presentes en una muestra para separar al menos
parcialmente la muestra en diferentes poblaciones de moléculas de
ácidos nucleicos. Ejemplos de esos métodos incluyen la separación
de fragmentos de restricción particulares en una preparación de DNA
digerido con enzimas de restricción, por ejemplo, una molécula de
DNA generada por PCR, o una molécula de DNA recombinante, y la
"limpieza" de reacciones de PCR, es decir, la retirada de los
productos de la PCR que son resultado de una reasociación errónea
del cebador. El método tiene también otras aplicaciones, y puede
utilizarse, por ejemplo, para separar un ácido nucleico lineal o
circular, en una PCR diagnóstica y en el empaquetamiento in
vitro de un bacteriófago.
El resto utilizado para marcar las moléculas de
ácido nucleico de acuerdo con el método del invento, puede ser
cualquier proteína que es capaz de marcar una molécula de ácido
nucleico y de quedar inmovilizada en una matriz a la que se unen
selectivamente proteínas.
La naturaleza del marcador dependerá al menos en
parte de las moléculas que han de ser separadas y de la matriz
utilizada. Ejemplos de marcadores adecuados incluyen proteínas que
pueden incorporarse a una molécula de ácido nucleico, o que pueden
usarse para modificar nucleótidos individuales contenidos en una
molécula de ácido nucleico, y proteínas que presentan afinidad por
un sitio de unión particular contenido en una molécula de ácido
nucleico. El marcador puede por lo tanto ser introducido en la
molécula de ácido nucleico durante su síntesis, por ejemplo por
medio de un nucleótido marcado, o después de su síntesis por
ejemplo mediante la adición en uno de los extremos de nucleótidos
marcados, p. ej., por medio de una reacción enzimática.
En una de las realizaciones, la molécula de ácido
nucleico puede estar inmovilizada en la matriz del método del
invento, por medio de una proteína que es una pareja de unión para
una molécula ligando de pequeño tamaño, sirviendo el ligando como
grupo enlazador independiente entre la molécula de ácido nucleico y
la proteína pareja de unión.
En una de las realizaciones de este método, la
muestra de ácido nucleico se pone primero en contacto en disolución
con una proteína que es pareja de unión para el ligando, que se une
solamente a las moléculas de ácido nucleico marcadas con el
ligando, y las moléculas de ácido nucleico marcadas y unidas a la
pareja de unión se extraen luego por medio de una matriz que tiene
afinidad por proteínas.
Un ejemplo de ligando que puede utilizarse en el
invento es la biotina. En la técnica se conocen otros ejemplos.
Cuando la biotina se utiliza como ligando, la pareja de unión es
avidina o estreptavidina, y la matriz puede ser una matriz que
posea afinidad por proteínas y de este modo sea capaz de capturar
estreptavidina o avidina y todas las moléculas a las que la
(estrept)avidina esté unida. La avidina y la estreptavidina
pueden utilizarse como pareja de unión para la biotina, y cuando en
lo sucesivo se hace referencia a estreptavidina, la proteína
bacteriana, se entenderá que también podría utilizarse avidina. La
biotina puede incorporarse con facilidad al interior de nucleótidos,
y de hecho nucleótidos biotinilados se encuentran comercialmente
disponibles. También se ha encontrado que el uso de un ligando
constituido por biotina es muy eficaz en el método del invento. La
biotina por lo tanto representa un ligando preferido para el método
del invento.
En una de las realizaciones del invento en la que
como ligando se utiliza biotina, las moléculas de ácido nucleico
biotiniladas pueden incubarse primero en la disolución con
estreptavidina, por medio de lo cual la estrepatavidina,
considerada como pareja de unión, se unirá a todas las moléculas de
ácido nucleico que contengan biotina y formará un complejo de
unión. Estas moléculas marcadas y que llevan estreptavidina añadida,
son así posteriormente inmovilizadas por medio de una matriz que es
capaz de inmovilizar proteínas de manera selectiva, mientras que no
es capaz de inmovilizar moléculas de ácidos nucleicos, al menos en
las condiciones utilizadas, retirando de este modo de la muestra las
moléculas de ácido nucleico que contienen biotina.
En otra realización, el ligando puede ser
fluoresceína o digoxigenina o un antígeno. Estos ligandos pueden
ser capturados en la matriz por medio de proteínas que son parejas
de unión a estos ligandos, por ejemplo, un anticuerpo dirigido
contra el ligando, ya sea policlonal o monoclonal, o un fragmento
de dicho anticuerpo. Cuando el ligando es un esteroide, el medio de
captura puede ser un anticuerpo o uno de sus fragmentos, o un
receptor para esteroide, o uno de sus fragmentos con propiedades de
unión al esteroide. Estos medios de captura pueden utilizarse de un
modo similar al uso anteriormente mencionado de la estreptavidina,
con una matriz que tenga afinidad por proteínas.
En otra realización del invento, el marcador es
una proteína de unión a ácidos nucleicos, que tiene una secuencia
de reconocimiento específica dentro de la molécula de ácido
nucleico a la que ha de marcar. Ejemplos de esas proteínas de unión
a ácidos nucleicos incluyen el factor de transcripción
AP-1 que se une a la secuencia de reconocimiento
AP-1, la proteína myb que se une a una secuencia de
reconocimiento corta y específica, y la proteína represora lacI,
que se une a la secuencia del operador lac.
En esas realizaciones del invento, una muestra
que contiene moléculas de ácido nucleico y que incluye la secuencia
de reconocimiento de una proteína, puede en primer lugar marcarse
en la disolución mediante contacto con la proteína reconocida por
la secuencia específica, y a continuación la muestra se pone en
contacto con la matriz después de lo cual las moléculas marcadas
quedan retenidas en la matriz quedando en la disolución las
moléculas no marcadas, es decir, las moléculas sin proteína
unida.
En cada una de estas realizaciones, una proteína
está implicada en la captura de una población de moléculas de ácido
nucleico, ya sea como el marcador propiamente dicho, o ya sea como
la pareja de unión para un ligando (tal como un anticuerpo o
estreptavidina). Esto es ventajoso porque permite que como matriz
se usen materiales receptivos a proteínas, preferiblemente
materiales que tienen una unión selectiva a proteínas y, por lo
tanto, que no se unen a ácidos nucleicos, al menos en las
condiciones utilizadas, asegurando con ello que las moléculas no
marcadas no son capturadas por la membrana ni secuestradas en la
muestra. La proteína puede ser capturada por la matriz y unirse a
ella mediante diversas interacciones, que incluyen la interacción
iónica, la interacción hidrófoba y la unión por afinidad.
La matriz puede tomar cualquier forma física
conveniente, por ejemplo, láminas, geles, filtros, membranas,
fibras, tubos, placas de micro titulación, columnas, partículas, y
puede estar en forma de partículas o ser porosa. Los materiales
porosos, tales como filtros y membranas, son convenientes para los
métodos de separación según el invento, ya sea para separar por
filtración el DNA marcado no deseado como para recoger el DNA
marcado deseado. Los ejemplos incluyen muestras en las que una
población no marcada es la deseada para su procesamiento aguas
abajo y en las que la población de ácidos nucleicos marcada, que
constituye la población "no deseada", puede ser capturada en la
disolución por medio de la membrana, ya que es lo más directo para
procesar la muestra por filtración a través de la membrana,
ofreciendo un método de captura efectivo y rápido, y simultáneamente
fraccionando en forma del filtrado la población de ácidos nucleicos
no marcada, ofreciendo de este modo una ruta directa hacia la
siguiente etapa de la manipulación. Los materiales porosos tales
como las membranas constituyen por lo tanto una matriz preferida
para usar en el invento.
Las matrices porosas pueden por lo tanto usarse
convenientemente para separar por filtración moléculas de ácido
nucleico marcadas y no deseadas o para recoger moléculas de ácido
nucleico marcadas deseadas. Esas matrices pueden utilizarse como
parte de un dispositivo para una separación en una sola etapa o
para una separación en muchas etapas, o como parte de otras etapas,
tal como para detectar, evaluar o cuantificar DNA o cualquier otro
producto en una corriente de reacciones aguas abajo. Estas matrices
porosas pueden ser incorporadas a dispositivos de separación tales
como viales de centrífuga, placas de micro titulación cartuchos o
jeringas, y, dependiendo de la muestra y de los procedimientos
aguas abajo que han de ser ejecutados, uno o más de estos
dispositivos pueden proporcionarse en serie. Esos dispositivos
pueden ser manipulados manualmente, semiautomáticamente o de una
manera completamente automática.
En una de las realizaciones, puede utilizarse una
Nycocard™. Cuando el fragmento de ácido nucleico marcado es la
secuencia que ha de ser detectada, este fragmento puede, después de
unirse por ejemplo a una proteína con afinidad por el marcador, ser
atrapado directamente en una membrana de unión a proteínas,
retenida en un dispositivo NycoCard. Ese dispositivo incluiría una
membrana apropiada con una almohadilla absorbente tal como papel de
celulosa, colocado en uno de los lados para aumentar el paso de la
muestra líquida a través de la membrana. En una de las
realizaciones, una lámina impermeable puede colocarse sobre el otro
lado de la membrana y puede llevar orificios que permitan aplicar
las muestras a la membrana en el caso en el que se tengan que
analizar múltiples muestras. Cuando las secuencias marcadas son las
que han de ser eliminadas, y se han de recoger los ácidos nucleicos
no marcados, un filtro de unión a proteínas puede ser utilizado
como prefiltro, colocarse sobre un filtro de unión a ácidos
nucleicos montado en el dispositivo NycoCard de manera que las
moléculas marcadas no deseadas quedan retenidas en el prefiltro, y
las moléculas no marcadas deseadas quedan retenidas en el filtro de
unión de ácidos
nucleicos.
nucleicos.
La matriz puede componerse de diversos materiales
conocidos en la técnica para este fin, que incluyen materiales
poliméricos, por ejemplo, celulosa, poliestireno, agarosa, látex,
que pueden formar derivados o modificarse para proporcionar un
medio para capturar el marcador propiamente dicho. Así, por
ejemplo, el material puede ser tratado, p. ej., recubriéndolo con
una sustancia que tenga afinidad por proteínas. Preferiblemente, la
matriz tendrá especificidad por proteínas en comparación con ácidos
nucleicos, de manera que las moléculas no marcadas no son retenidas
por la matriz. En el invento, el procedimiento de captura incluye
una proteína, tanto cuando el marcador es una proteína, como cuando
un ligando tiene una pareja de unión que es una proteína que une el
ligando a la matriz, y la matriz tiene por lo tanto una naturaleza
receptora de proteínas. En la técnica se conocen ejemplos e
incluyen matrices conocidas de unión a proteínas, recubiertas por
ejemplo con polímeros que tienen una afinidad específica por
proteínas, al menos en las condiciones utilizadas. Son
particularmente preferidas membranas constituidas por polímeros de
unión a proteínas, tales como los descritos en los documentos
WO98/23630, EP-0524800 y EP 0580305, por ejemplo,
Centriflex^{TM} comercializada por Edge Biosystems,
EE.UU.
El método de separación del invento es
particularmente conveniente cuando una muestra ha de ser
fraccionada, y las moléculas de ácido nucleico no marcadas presentes
en la disolución han de ser recogidas para su posterior
procesamiento aguas abajo. El método puede sin embargo utilizase
también cuando son las moléculas de ácido nucleico marcadas las que
han de recogerse para su posterior procesamiento. Cuando las
moléculas marcadas son las que han de recogerse para el trabajo
aguas abajo, las moléculas necesitarán ser liberadas de la matriz,
y dependiendo del método de captura utilizado, pueden necesitar
también ser liberadas de la pareja de unión correspondiente al
ligando. El método de liberación utilizado puede depender de la
naturaleza del ligando, y de su pareja de unión, y del tipo e
intensidad de sus fuerzas de unión recíprocas.
Las condiciones de reacción elegidas para la
etapa de liberación pueden asimismo seleccionarse de manera que se
evite que el ácido nucleico marcado liberado se vuelva a unir a la
matriz o a su pareja de unión. En la técnica se conocen ejemplos de
esos métodos. Así, por ejemplo, las condiciones químicas o físicas
pueden cambiarse de manera que se ayude a la liberación de las
moléculas de ácido nucleico marcadas del complejo unido a la matriz.
Como ejemplos de métodos químicos se incluyen la alteración de la
fuerza iónica o del pH, la adición de agentes quelantes, y el uso
de moléculas marcadoras libres que compitan, o de moléculas
químicamente relacionadas con ellas, moléculas que incluyen
marcadores o restos similares a marcadores, moléculas o iones que
cambian la conformación de la pareja de unión y de ese modo
disminuyen, eliminan o modifican la interacción entre pareja de
unión-ligando, la adición de detergentes o de
agentes de disociación, o mediante tratamiento enzimático. Como
ejemplos de métodos físicos se incluyen cambios en la temperatura,
sonicación, vibración. Puede utilizarse cualquier combinación de
estos métodos físicos y químicos.
Dependiendo de la fuerza de la interacción entre
el ligando y su pareja de unión, quizá sea posible liberar el
ligando o la molécula marcada de la pareja de unión o de la matriz
añadiendo ligando en exceso, el cual compite con el DNA marcado y
unido al ligando por sitios de anexión a la pareja de unión
correspondiente al ligando, o por sitios de unión a la matriz, y el
DNA marcado liberado puede luego separarse simplemente mediante
lavado. Así, cuando el ligando es fluoresceína, y la pareja de
unión es un anticuerpo dirigido contra fluoresceína, el complejo
fluoresceína-DNA puede ser liberado de la matriz
mediante la adición de fluoresceína libre en la disolución. Cuando
sin embargo la interacción ligando-pareja de unión,
pareja de unión-matriz, o
marcador-matriz es fuerte, la adición de marcador
libre no siempre es efectiva para romper la interacción. En este
caso, pueden utilizarse otros métodos tales como degradar la pareja
de unión, por ejemplo, por medio de pH o de enzimas de manera tal
que la pareja de unión se libere de la matriz y/o del ligando. La
liberación puede también efectuarse mediante la desorganización de
la matriz en una forma a la que no puedan unirse proteínas, tal
como por medio de agentes químicos, de manera que el complejo
proteína-DNA o el complejo
proteína-ligando-DNA se libera, o
por medios químicos que rompen la interacción o afectan de alguna
otra manera a la afinidad entre proteína y matriz.
El par de unión
biotina-estreptavidina es un par en el que existe
una interacción particularmente fuerte y por ello no es susceptible
a la ruptura por medio de la adición de biotina libre. Así, cuando
el ligando es biotina, y el par ligando-DNA marcado
es capturado en la matriz por medio de avidina o estreptavidina, el
DNA biotinilado no puede ser liberado de la membrana mediante
adición de biotina libre. Este método puede utilizarse sin embargo
cuando el ligando es un derivado de biotina con una afinidad de
unión por estreptavidina menor que la de la biotina, en cuyo caso
el par ligando-DNA marcado puede ser liberado de la
matriz mediante adición de biotina libre. Esta biotina libre puede
competir con el DNA biotinilado por los sitios de unión a
estreptavidina y el DNA biotinilado liberado puede simplemente
separarse de la matriz mediante lavado.
Dependiendo del ligando utilizado, puede ser
necesario incorporar una etapa en la que el DNA marcado que se
busca para el procesamiento aguas abajo se libere de su pareja de
unión por medio del ligando que sirve para inmovilizar el par
ligando-DNA marcado sobre la matriz. Algunos
ejemplos incluyen la adición de sustancias químicas o de iones o
aplicar condiciones físicas capaces de disminuir la fuerza de unión
entre el ligando y su pareja de unión y recoger luego el DNA
liberado.
El método del invento puede usarse en varias
aplicaciones diferentes, que incluyen usos analíticos, preparativos
y diagnósticos, de los que se presentan ejemplos más adelante.
Otras aplicaciones se harán evidentes a los expertos en la
técnica.
Una aplicación importante del invento es la de
cortar y ligar moléculas de DNA, tal como sucede en la separación
de los productos particulares resultantes de la digestión con
enzimas de restricción, y en la separación de moléculas ligadas de
DNA circular de entre otros productos de reacciones de
ligación.
Así, una de las aplicaciones del invento consiste
en la manipulación de fragmentos de DNA digeridos con enzimas de
restricción, en particular cuando un fragmento específico se
requiere para su posterior manipulación, fragmento que por ello
necesita ser separado de los otros productos de la reacción
enzimática. El método de separación permite que una población de
moléculas lineales de DNA que están marcadas en uno o en ambos
extremos, se separen de las moléculas no marcadas. Las moléculas
pueden marcarse durante su síntesis, por ejemplo, usando
nucleótidos marcados tales como nucleótidos biotinilados, p. ej.,
en forma de cebadores biotinilados, o las moléculas pueden marcarse
por técnicas enzimáticas mediante métodos de marcaje de los
extremos conocidos en la técnica.
Contemplado por lo tanto desde otro aspecto, el
presente invento proporciona un método para separar al menos
parcialmente una mezcla de fragmentos de DNA digeridos con enzimas
de restricción, en el que el material de partida es una molécula de
DNA lineal que está marcada o que es capaz de estar marcada en un
extremo o cerca de un extremo o en ambos extremos, con una proteína
capaz de ser inmovilizada en una matriz, comprendiendo dicho método
someter la molécula de DNA a una digestión con enzimas de
restricción, seguido de poner la muestra en contacto con una matriz
a la que se unen selectivamente proteínas, con lo cual las
moléculas marcadas que se originan en un extremo del material de
partida son capturadas por la matriz y de este modo son separadas de
las moléculas no marcadas.
Este método es particularmente adecuado para
separar productos resultantes de la digestión de un DNA producido
por PCR debido al modo en el que la síntesis opera. En el método de
amplificación de DNA por PCR, se utilizan dos cebadores
oligonucleotídicos específicos, uno de ellos es complementario al
extremo 5' de la cadena codificadora y por lo tanto se hibrida con
dicho extremo, y el otro de ellos es complementario al extremo 5'
de la cadena no codificadora y se hibrida con dicho extremo, de
manera que en presencia de enzimas DNA-polimerasas
apropiadas, puede sintetizarse una copia de longitud completa de la
secuencia diana. Esta copia llevará el oligonucleótido cebador
incorporado en cada una de las dos cadenas del DNA sintetizado, en
el extremo 5' de cada cadena. Esos métodos de síntesis por PCR
suelen utilizarse para preparar moléculas o fragmentos de DNA
específicos para su posterior manipulación genética, cuando el
fragmento de interés específico puede obtenerse mediante corte con
una enzima de restricción de un producto de PCR más largo. Como se
ha mencionado anteriormente, estas manipulaciones posteriores con
frecuencia son ineficaces debido a la presencia en las etapas
posteriores, tales como en mezclas de ligación de otros productos
procedentes del material digerido con enzimas de restricción tales
como productos digeridos parcialmente y moléculas de DNA no
digeridas. En las circunstancias en las que existe un fragmento
interno del producto de PCR de longitud completa, que es el producto
de interés para el procesamiento aguas abajo, los productos
secundarios "no deseados" del material digerido con enzimas de
restricción incluirán al menos una terminación del producto de PCR
de longitud completa, y el método del invento puede usarse para
efectuar una separación al menos parcial del producto de interés
entre los fragmentos que contienen terminaciones, y moléculas no
digeridas, utilizando cebadores marcados, por ejemplo, cebadores
biotinilados. De este modo, las moléculas de ácido nucleico marcadas
pueden separarse de entre FROM una muestra de ácidos nucleicos,
quedando en la disolución una muestra que contiene el fragmento de
restricción interno deseado el cual, debido a que no incluye una
terminación por ejemplo que incorpora un cebador de PCR, no estará
marcado.
Un aspecto más del invento, pertinente a la
metodología de la PCR, es la denominada "limpieza" de los
productos de la reacción de PCR, es decir, la separación de los
productos no deseados que incluyen los productos que son el
resultado de una reasociación errónea de los cebadores. Cuanto más
largo es el molde de ácido nucleico, mayor puede ser el problema.
Este método tiene utilidad cuando existen sitios únicos de enzimas
de restricción u otras secuencias escindibles, en los extremos o
cerca de los extremos de la muestra de ácido nucleico que ha de ser
amplificada en la reacción de PCR.
El método implica el uso de cebadores de PCR que
están marcados, o que pueden marcarse con una proteína, y que son
complementarios a los extremos de la secuencia que ha de ser
amplificada, y que por lo tanto son capaces de hibridarse con el
ácido nucleico molde, y que también se solapan sólo parcialmente
con cada uno de los sitios de restricción únicos. Con el uso de
cebadores que son complementarios y que se hibridan con la secuencia
completa de reconocimiento de una enzima de restricción, incluida
en el ácido nucleico molde, cada molécula de ácido nucleico
producida en la reacción de PCR portará el sitio de reconocimiento
de la enzima de restricción independientemente de si el cebador se
ha reasociado o no con la secuencia deseada, o de si el producto de
PCR es el resultado de una reasociación errónea del cebador. Sin
embargo, usando cebadores que se hibridan con solamente parte de un
sitio de reconocimiento de una enzima de restricción presente en el
molde, es solamente en los productos de PCR que derivan de la
reasociación buscada, en los que el sitio de reconocimiento de la
enzima de restricción es reconstituido en el producto de PCR. Así,
usando cebadores marcados, o cebadores que pueden marcarse, es
posible realizar la limpieza de los productos de la reacción de PCR
realizando la reacción de PCR, y posteriormente escindiendo o
digiriendo los productos de la reacción de PCR con las enzimas de
restricción particulares, específicas para dichos sitios únicos de
reconocimiento de enzimas de restricción. Después de la digestión
con las enzimas de restricción, sólo los productos de PCR correctos
que son escindidos y que, debido a que la escisión da como
resultado la separación del cebador y del marcador, pueden ser
separados de los productos de extensión de PCR no deseados los
cuales, al no estar cortados por las enzimas de restricción, aún
conservan el marcador.
Contemplado así desde uno de los aspectos, el
presente invento proporciona un método para separar al menos
parcialmente los productos correctos y deseados de una
amplificación por PCR, de los productos de PCR que son el resultado
de una reasociación incorrecta de un cebador de PCR con el molde, en
el que la molécula del ácido nucleico molde comprende un sitio de
reconocimiento único de una enzima de restricción situado en un
extremo o hacia un extremo del molde, y en el que un cebador de PCR
que está marcado o que es capaz de ser marcado con una proteína, es
complementario a una secuencia presente en el molde que se extiende
parcialmente dentro del sitio de restricción único, método que
comprende amplificar el molde por medio de una PCR, digerir los
productos de la PCR con la enzima de restricción específica para
dicho sitio de reconocimiento único de una enzima de restricción, y
poner en contacto el producto resultante con una matriz capaz de
unirse a proteínas, con lo que las moléculas de ácido nucleico
marcadas son capturadas por la matriz y de este modo se separan de
las moléculas no marcadas.
En este contexto, sitio único para una enzima de
restricción de refiere a enzimas de restricción que tienen
solamente un sitio de reconocimiento único dentro de la molécula
del ácido nucleico molde, pero también incluye el caso especial en
el que el mismo sitio de restricción puede estar presente en o
hacia cada uno de los extremos del molde.
En una de las realizaciones, la molécula de ácido
nucleico molde que ha de ser amplificada por PCR incorpora
solamente un sitio de restricción único e individual situado en o
cerca de sólo uno de los extremos. Cuando los productos de la
reacción se tratan con esta enzima, se obtiene como resultado una
"limpieza" parcial de los productos de la PCR, el grado de la
cual depende, al menos en parte, de la medida en la que el cebador
que se reasocia con la región del molde que incluye este sitio
único, es responsable de una reasociación incorrecta. En esta
realización, el cebador que se extiende dentro del sitio único para
la enzima de restricción es el que estará marcado o tendrá capacidad
para marcarse. En una realización preferida, el molde que ha de ser
amplificado por PCR incorpora un sitio único para una enzima de
restricción, situado en o cerca de cada uno de los extremos. Estos
sitios pueden ser sitios para la misma enzima de restricción, es
decir, una enzima de restricción que corta el molde y las copias de
PCR dos veces, una vez en cada extremo, o pueden ser sitios para
enzimas de restricción diferentes, con la condición de que cada una
de dichas enzimas tenga solamente un sitio de reconocimiento único
dentro del molde, y que los dos sitios estén uno en cada extremo
del molde.
En este método, la localización del sitio de
restricción único, o de cada uno de los sitios de restricción
únicos, en relación con la terminación del molde de ácido nucleico,
depende, al menos en parte, de la enzima de restricción particular,
ya que las diferentes enzimas tienen distancias mínimas diferentes
desde la terminación para un corte de restricción eficiente. Estas
preferencias se conocen en la técnica y se encuentran descritas por
ejemplo en los catálogos de fabricantes de enzimas de restricción.
En general, el sitio de restricción estará situado a una distancia
de al menos a una base de la terminación. La elección de la enzima
y su localización pueden ser determinadas fácilmente por alguien
experto, basándose en el conocimiento de la técnica y conforme a la
información aportada por el fabricante. En general, el sitio de
restricción estará localizado al menos a la distancia mínima de la
terminación para obtener un corte eficiente por parte de la enzima
correspondiente, aunque el sitio puede estar situado bastante
alejado de la terminación. Ejemplos de estas distancias mínimas son
de al menos a una base de la terminación para BamHI y de al menos a
seis bases de la terminación para NdeI. Las distancias mínimas
pueden establecerse a partir de los catálogos publicados de los
suministradores de las enzimas de restricción, por ejemplo, el
catálogo de 1.999 de New Englansd Biolabs, y a partir de
Moreira y Noren, Biotechniques 19, 56-59
(1999).
Así, usando o construyendo por medio de técnicas
de DNA recombinante conocidas en la técnica, un molde que comprende
un sitio único para una enzima de restricción, situado en cada
extremo o cerca de cada extremo, es posible separar los productos
secundarios no deseados de una PCR que son el resultado de una
reasociación errónea de los cebadores de PCR en localizaciones del
molde diferentes de las pretendidas. Cuando los dos cebadores están
marcados o tienen capacidad para marcarse, todos los productos de
la PCR inicialmente estarán marcados en ambos extremos. Sometiendo
los productos de la PCR a digestión con enzimas de restricción, con
las enzimas de restricción anteriormente mencionadas que tienen
sitios de reconocimiento únicos situados cerca de cada uno de los
extremos del molde, ya sea de manera simultánea o secuencial, las
moléculas que no estén cortadas, o que estén cortadas en sólo uno
de los extremos, conservarán el marcador, al igual que lo harán las
terminaciones del producto de PCR correcto que han sido creado
mediante el corte con las enzimas de restricción; estas moléculas
pueden ser separadas del producto deseado el cual tendrá los dos
cebadores retirados y por lo tanto ya no contendrá un marcador o un
resto con capacidad para marcarse. Esto tiene la ventaja de que se
evita el gasto de grandes cantidades de tiempo y de materiales para
el ajuste fino de la reacción de PCR, como se necesita en la
electroforesis en gel o en otros métodos de separación de productos
de PCR por tamaños. Una "limpieza" al menos parcial puede
conseguirse sin embargo cuando sólo uno de los dos cebadores de PCR
está marcado o tiene capacidad para marcarse.
Convenientemente, el ligando puede ser biotina,
en cuyo caso los productos de la PCR, antes o después de la
digestión con enzimas de restricción, se ponen en contacto con
estreptavidina, y después las moléculas marcadas que llevan
estreptavidina unida, se separan de las moléculas no marcadas
mediante matrices a las que se unen proteínas.
En esta realización particular del invento, el
marcador puede estar unido a cualquier posición del cebador,
siempre y cuando el extremo 3' del cebador esté disponible para la
extensión por acción de la polimerasa de la PCR. Convenientemente,
el marcador puede estar añadido al extremo 5' del cebador, ya que
la adición de un marcador en esta posición no supone dificultades
para la síntesis. Además, sin desear estar sujeto a una teoría, se
cree que un marcador situado en el extremo 5' del cebador será
menos probable que interfiera con la actividad de la polimerasa de
la PCR, y también que puede estar mejor situado para su captura por
cualquiera de los métodos de captura que aquí se
describen.
describen.
A continuación se muestra un ejemplo:
5'-ttactggatcctag- - - - -
-ttacgtacattaatcgg-3'
3'-aaatgacctaggatc- - - - -
-aatgcatgtaattagcc-5'
Este fragmento tiene dos sitios de restricción
únicos, uno para BamHI situado a la "izquierda" (ggatcc), y
otro para AsnI situado a la "derecha" (attaat). Para
amplificar este fragmento de la manera usual, normalmente se
preparan dos marcadores, opcionalmente marcados con biotinas en sus
extremos 5', como se ilustra a continuación:
Cebador BamHI:
5'-biotina-tttactggatcctag-3'
Cebador AsnI:
5'-biotina-ccgattaatgtacgtaa-3'
Usando estos cebadores en una reacción de PCR se
producirán típicamente varios productos, principalmente debidos a
una reasociación errónea de los cebadores durante la PCR.
Los cebadores BamHI y AsnI implementan totalmente
en sus secuencias las secuencias nucleicas de reconocimiento. Esto
tiene la consecuencia de que cada fragmento de DNA producido en la
reacción de PCR por estos cebadores, tiene el sitio de
reconocimiento de las enzimas de restricción BamHI y AsnI. Todos los
fragmentos producidos en la reacción de PCR podrán ser cortados con
la enzima BamHI y con la enzima AsnI, tanto los fragmentos
correctos (es decir, los deseados) como los productos
secundarios.
Sin embargo, mediante el uso de cebadores
ligeramente más cortos en esta realización del presente invento, se
pueden separar de manera muy eficiente todos los productos
secundarios no deseados.
Ejemplos de cebadores que pueden usarse son los
siguientes:
Cebador BamHI corto:
5'-biotin-tttactgga-3'
Cebador AsnI corto:
5'-biotina-ccgatt-3'
Estos cebadores se solapan sólo parcialmente con
los sitios de reconocimiento de las enzimas de restricción. Por lo
tanto, solamente mediante la reasociación con los sitios nucleicos
pretendidos, estos cebadores formarán los sitios de reconocimiento
completos para las enzimas. Como consecuencia de ello, sólo los
fragmentos correctos o deseados, producidos en la reacción de PCR,
pueden ser cortados por ambas enzimas de restricción.
Los cuatro grupos posibles de productos de PCR
que se obtendrán como resultado del uso de esos cebadores (B =
marcador biotina) son los siguientes:
5'-Btttactggatcctag- - - -
- -ttacgtacattaatcgg-3'
3'- aaatgacctaggatc- - - - -
-aatgcatgtaattagccB-5'
(Fragmento correcto - dos sitios de
restricción)
5'-Btttactggtag- - - - -
-ttacgtacattaatcgg-3'
3'- aaatgaccatc- - - - -
-aatgcatgtaattagccB-5'
(Fragmento incorrecto-sólo un
sitio de restricción (AsnI))
\vskip1.000000\baselineskip
5'-Btttactggatcctag- - - -
- -ttacgtacaatcgg-3'
3'- aaatgacctaggatc- - - - -
-aatgcatgttagccB-5'
(Fragmento incorrecto-sólo un
sitio de restricción (BamHI))
\vskip1.000000\baselineskip
5'-Btttactggatag- - - - -
-ttacgtacaatcgg-3'
3'- aaatgacctatc- - - - -
-aatgcatgttagccB-5'
(Fragmento incorrecto - No hay sitios de
restricción)
\vskip1.000000\baselineskip
El corte con AsnI y BamHI proporciona los
siguientes fragmentos:
\vskip1.000000\baselineskip
5'-Btttactg
gatcctag- - - - - -ttacgtaca
ttaatcgg-3'
3'- aaatgacctag gatc- - - - -
-aatgcatgtaatt agccB-5'
(Fragmento correcto - dos sitios de restricción -
las dos biotinas separadas)
\vskip1.000000\baselineskip
5'-Btttactggtag- - - - -
-ttacgtaca ttaatcgg-3'
3'- aaatgaccatc- - - - -
-aatgcatgtaatt agccB-5'
(Fragmento incorrecto-sólo un
sitio de restricción (AsnI) - sólo una de las biotinas separada)
\vskip1.000000\baselineskip
5'-Btttactg
gatcctag- - - - -
-ttacgtacaatcgg-3'
3'- aaatgacctag gatc- - - - -
-aatgcatgttagccB-5'
(Fragmento incorrecto-sólo un
sitio de restricción (BamHI) - sólo una de las biotinas
separada)
\vskip1.000000\baselineskip
5'-Btttactggatag- - - - -
-ttacgtacaatcgg-3'
3'- aaatgacctatc- - - - -
-aatgcatgttagccB-5'
(Fragmento incorrecto - ningún sitio de
restricción - ninguna biotina separada debido a la ausencia de
cortes de restricción)
En una mezcla de todos los fragmentos
anteriormente mencionados, sólo uno de los fragmentos, el fragmento
correcto, estará sin llevar unida biotina. Añadiendo estreptavidina
a los fragmentos, y poniendo en contacto los productos de la
reacción con una matriz de unión a proteínas, por ejemplo mediante
un pase a través de una membrana Centriflex, sólo el fragmento
correcto no será secuestrado, y en el caso de utilizar una membrana
Centriflex, el fragmento correcto atravesará la membrana sin
obstáculos.
La diferencia entre usar los cebadores cortos (es
decir, los cebadores que no se extienden de manera completa dentro
del sitio para la enzima de restricción contenido en el molde) y
los cebadores largos (que incorporan el sitio completo para la
enzima de restricción) es evidente, ya que, en el caso de los
cebadores largos, todos los fragmentos, incluso los fragmentos
erróneos, llevarían introducidos los sitios de restricción para
AsnI y BamHI. En ese caso, no sería posible distinguir entre
productos correctos y productos erróneos de la reacción de PCR.
El método puede también utilizarse para separar
productos de la digestión con enzimas de restricción de moléculas
de DNA que o son lineares o han sido linearizadas y que están
marcadas en uno o ambos extremos por medio de métodos de marcaje de
los extremos tales como los que se conocen en la técnica, por
ejemplo, por medio de enzimas. Uno de los ejemplos lo constituye la
enzima desoxinucleotidiltransferasa terminal (TdT) que puede
utilizarse sola o junto con la DNA polimerasa I (fragmento de
Klenow) para añadir nucleótidos marcados, por ejemplo, nucleótidos
biotinilados o nucleótidos marcados con fluoresceína o digoxigenina,
a los grupos hidroxilo libres situados en los extremos 3'de una
molécula lineal de DNA, añadiendo de este modo un ligando a los
extremos 3'. En el caso en el que el DNA lineal que ha de ser
sometido a digestión con enzimas de restricción sea de extremos
romos o tenga extremos 3' protuberantes, sólo se necesita TdT para
marcar los extremos 3'. Sin embargo cuando el extremo 5' es el
protuberante, y el extremo 3' está mellado, una enzima tal como el
fragmento de Klenow se necesita de manera adicional para rellenar
el extremo mellado y para aumentar la eficiencia.
Cuando el ligando es biotina, la muestra puede
primero ponerse en contacto con estreptavidina en la disolución, y
después la muestra se hace pasar a través de una membrana de unión
a proteínas que se une a la estreptavidina y con ello retiene las
moléculas de ácido nucleico marcadas y no deseadas, dejando al
fragmento deseado en la disolución y en una forma adecuada para su
posterior manipulación.
Esto representa un avance importante sobre los
procedimientos actuales que son laboriosos y que implican la
separación de la mezcla resultante de la digestión con enzimas de
restricción en un gel de agarosa, la visualización de los
fragmentos mediante tinción con bromuro de etidio, la escisión del
fragmento de DNA de interés y su purificación a partir del gel, lo
cual es un procedimiento mucho más largo y porque esto implica un
mayor riesgo de exposición del DNA a la actividad de nucleasa.
Una aplicación adicional más de este aspecto del
invento, está en el campo de la digestión con enzimas de restricción
de productos amplificados por PCR. Así, existen circunstancias en
las que es conveniente llevar a cabo una digestión parcial con
enzimas de digestión, es decir, con cantidades limitadas de enzima.
Las preparaciones de enzimas de restricción a menudo contienen
pequeñas cantidades de endonucleasa que son capaces de degradar los
extremos del DNA recién cortado, el cual puede reducir la calidad
de los fragmentos de interés, y producir dificultades en
posteriores etapas de manipulación, tales como ligar el DNA, por
ejemplo dentro de un vector de expresión. Esos problemas causados
por nucleasas contaminantes pueden sin embargo minimizarse
utilizando cantidades límite de enzima de restricción y
disminuyendo los períodos de incubación. Un inconveniente sin
embargo es que el producto digerido resultante incluirá productos
secundarios no deseados de la digestión con una enzima de
restricción, tales como moléculas cortadas sólo parcialmente o
moléculas no cortadas. El método del presente invento permite sin
embargo aprovechar una digestión parcial, sintetizando por PCR el
sustrato de la digestión con la enzima de restricción, utilizando
un DNA cebador marcado, p. ej. biotinilado, de manera que cualquier
molécula o fragmento de DNA que incluya al menos una terminación
(tales como moléculas no digeridas, o moléculas parcialmente
digeridas) puede ser retirada o secuestrada por medio de una matriz
apropiada, quedando una disolución enriquecida en el fragmento de
restricción interno de interés.
Otra aplicación del método de separación basado
en marcadores del invento es una PCR diagnóstica. Se conoce el uso
de la PCR para detectar mutaciones que incluyen mutaciones que
difieren en incluso sólo un único nucleótido tal como sucede en la
enfermedad de las células falciformes. En algunos casos, el tamaño
de un fragmento de PCR será indicativo de la presencia o ausencia
de una mutación particular. Normalmente, sin embargo, las técnicas
diagnósticas de PCR generalmente requieren técnicas adicionales
después de la PCR inicial realizada sobre la muestra del paciente,
con el fin de diagnosticar si la mutación está o no presente en la
muestra, por ejemplo, un análisis de restricción y/o secuenciación.
Estos análisis pueden ser costosos ya que suelen requerir productos
químicos caros tales como ácidos péptidonucleicos y que también son
largos de duración, contribuyendo a un retraso en la determinación
del estado médico del paciente. Los métodos existentes se han
simplificado de manera considerable utilizando el método de captura
de marcadores del invento por medio de reacciones de PCR que usan
al menos uno de los cebadores de la PCR marcado, o que tiene
capacidad para marcarse. Utilizando cebadores marcados no se
necesitan etapas adicionales, y la presencia de una mutación puede
detectarse usando la etapa de amplificación por PCR sola.
Así, el método del invento, cuando se aplica a
una PCR diagnóstica, es capaz de reemplazar la necesidad de
secuenciar los productos de la PCR de acuerdo con los métodos
diagnósticos actuales. En esta realización, el cebador encargado de
la reasociación y extensión por el extremo 3' de la muestra está
marcado, o tiene capacidad para marcarse, de manera tal que conserva
un grupo OH en 3' y puede por ello extenderse en una reacción de
PCR, y es específico del ácido nucleico mutante; en otras palabras,
se hibrida con la secuencia del ácido nucleico que está alterada en
esa enfermedad. De manera alternativa, el cebador 3' puede
hibridarse con la secuencia normal del ácido nucleico.
En una de las realizaciones, el método puede
utilizarse para detectar mutaciones de una sola base, en cuyo caso
el extremo 3' del cebador corresponde a la base mutada. En el caso
de mutaciones en múltiples bases, el extremo 3' del cebador puede
corresponder a una cualquiera de las bases mutadas.
Así, cuando la mutación es conocida, en una de
las versiones de esta realización, en la muestra de DNA se llevan a
cabo dos reacciones de PCR, cada una de las cuales usa el mismo
cebador para el extremo 5' de la muestra, pero un cebador 3'
diferente, uno que se hibrida con el DNA "normal" y es capaz de
producir un producto de extensión que corresponde al DNA
"normal", y otro que es complementario a la secuencia de ácido
nucleico mutante y es específico para ella, y es por lo tanto capaz
de producir un producto de extensión que corresponde a la secuencia
mutante. En el caso de la PCR de una diana mutada utilizando el
cebador marcado, apropiado para el DNA mutado, los productos de la
amplificación por PCR incorporarán el marcador, mientras que en la
reacción de PCR que usa el cebador "normal" habrá una base
desapareada en el extremo 3' del cebador, la cual será separada por
la polimerasa de la PCR, tal como la Taq polimerasa, y, si la base
en 3' estuviera marcada, su separación retirará el marcador o el
resto que puede marcarse que el cebador porte. El producto de la
PCR por lo tanto no incorporará el marcador. Por ello, sólo los
productos de la reacción de PCR del ácido nucleico mutante que se
forman por extensión del cebador mutante son los que están
marcados, o los que pueden marcarse, y son los que pueden ser
detectados utilizando cualquiera de los métodos anteriormente
mencionados.
La situación contraria surge en el caso de la
extensión por PCR del DNA "normal" que no contiene la mutación
específica que ha de ser detectada. En este caso, los productos de
la PCR obtenidos usando el cebador mutante en el que el nucleótido
en 3' del cebador está desapareado y por consiguiente ha sido
retirado junto con el marcador que no puede por ello ser detectado
en el producto de reacción de longitud completa, mientras que el
producto obtenido usando el cebador "normal" incluirá el
marcador o el resto que puede marcarse, son los que serán luego
detectados.
En esta realización, el marcador o el resto que
puede marcarse se encuentra en la base en 3', o está unido en o a la
base en 3', de tal manera que el OH en 3' todavía puede ser
extendido por acción de la polimerasa de la PCR.
Contemplado así desde un aspecto más, el presente
invento proporciona un método para una PCR diagnóstica en el que
una muestra a ensayar se somete a reacciones de PCR de manera
independiente, muestra en la que la mutación, en caso de estar
presente, se encuentra en la secuencia complementaria a la del
cebador en 3', una primera reacción de PCR que usa un cebador en 3'
complementario al ácido nucleico diana normal, y una segunda
reacción de PCR que usa un cebador en 3' complementario a la diana
mutante, y en la que el nucleótido en 3' del cebador mutante
corresponde a uno de los nucleótidos que está mutado en el ácido
nucleico mutante, portando cada uno de dichos cebadores en 3' un
marcador o siendo capaces de estar marcados en el nucleótido en 3'
del cebador, y en la que se detecta la presencia o ausencia del
marcador en los productos de la reacción de PCR.
En la más sencilla de las realizaciones, los
cebadores en 3' se encuentran marcados, por ejemplo con biotina, la
cual puede ser detectada usando cualquiera de los métodos que aquí
se describen. Ejemplos de métodos para detectar productos de PCR
biotinilados incluyen la adición de estreptavidina y la filtración
a través de una membrana de unión a proteínas en la que el DNA
retenido es detectado, y un pase a través de una membrana como por
ejemplo una membrana de nitrocelulosa, por ejemplo, como en el
sistema NycoCard™ anteriormente mencionado.
En un método alternativo, a los productos de la
reacción de PCR puede añadirse estreptavidina y la mezcla se hace
pasar a través de una membrana Centriflex. Si no hay DNA detectable
en el material que pasa a través de la membrana, el DNA habrá sido
retenido en la membrana y por lo tanto habrá sido biotinilado.
En las circunstancias en las que el cebador no
está marcado de por sí, sino que tiene capacidad para marcarse, se
necesitará añadir el marcador antes de la etapa de detección.
En una realización alternativa, puede llevarse a
cabo una única reacción de PCR usando un cebador marcado,
específico o de la secuencia normal o de la secuencia mutada,
siendo la presencia del marcador en los productos de la PCR
indicativa de la presencia o ausencia de la mutación, dependiendo de
si el cebador es específico para el DNA normal o para el DNA
mutante. Así, si el cebador marcado es específico para el DNA
normal, el producto de la PCR con DNA normal estará marcado,
mientras que con el DNA mutante no lo estará, y si el cebador
marcado es específico para el DNA mutante, el producto de la PCR con
el DNA normal no estará marcado mientras que los productos de la
PCR con un DNA mutante estarán marcados y por lo tanto serán
detectables. Así pues, aunque llevar a cabo reacciones de PCR
duplicadas proporciona más seguridad, una reacción de PCR única
proporciona al menos una indicación de la presencia o ausencia de
la mutación.
Así contemplado desde un aspecto más, el presente
invento proporciona un método de PCR diagnóstica de una mutación
presente en una molécula de ácido nucleico, en el que se detecta la
presencia o ausencia de una mutación en una muestra de ácido
nucleico, en el que se utiliza un cebador en 3' específico o para
el ácido nucleico normal o para el ácido nucleico mutante, en el
que dicho cebador es complementario a una región del ácido nucleico
en la que existe una diferencia de bases entre el DNA normal y el
DNA mutado, correspondiendo la terminación 3' del cebador a la
posición en la muestra en la que existe una diferencia entre el DNA
normal y el DNA mutante, estando el cebador marcado o teniendo
capacidad para marcarse, por medio de lo cual se detecta la
presencia o ausencia del marcador en el producto de la PCR.
También es posible llevar a cabo al menos un
diagnóstico preliminar utilizando un cebador en 3' que es específico
para el DNA normal.
El presente invento por consiguiente proporciona
desde un punto de vista adicional un método para una PCR
diagnóstica, en el que una muestra a ensayar se somete a PCR con
cebadores complementarios al DNA diana normal, en el que el cebador
encargado de la extensión en el extremo 3' del DNA diana se
reasocia con una secuencia en la que el nucleótido en 3' está mutado
en el DNA mutante, portando ese cebador en 3' un marcador o
teniendo capacidad para marcarse junto a, o en, el nucleótido en
3', y en el que se detecta la presencia del marcador en el producto
de la reacción de PCR.
De este modo, la ausencia de un marcador
detectable en el producto indica que la muestra no contiene DNA
normal.
Un ejemplo de detección de una mutación de una
sola base es el siguiente:
En este caso, el extremo 3' del cebador encargado
de la extensión del extremo 3' de la muestra, se alinea con el DNA
mutado presente en el molde.
Supóngase el caso de que se tenga que determinar
si un paciente presenta una mutación genética normal o una mutación
genética anormal.
Una secuencia de DNA normal del gen en cuestión
es la siguiente:
5'-ccccatg- - - - - - - -
-atgacctaggAccaccy-3'
3'-ggggtac- - - - - - - -
-tactggatccTggtgga-5'
El DNA del paciente se asemeja a éste:
5'-ccccatg- - - - - - - -
-atgacctaggCccacct-3'
3'-ggggtac- - - - - - - -
-tactggatccGggtgga-5'
Está presente una mutación. No es necesario
conocer el DNA del paciente para realizar el ensayo. Sólo se
necesita conocer el estado normal con el fin de diagnosticar la
mutación.
Se necesitan cebadores para realizar la PCR, un
cebador que se reasocie en el área del extremo 5', y otro cebador
que se reasocie en el área del extremo 3'. El cebador del extremo
5' será idéntico en ambos pacientes, con la mutación o sin la
mutación, y será como el siguiente:
Cebador n.º 1:
5'-ccccatg-3'
En el caso del otro área en 3', se necesitaría un
cebador que se empareje con el DNA de la situación normal, y sería
como el siguiente:
Cebador n.º 2 normal:
5'-aggtggt-3'
Si se conoce la mutación, puede construirse un
cebador para ella, y será como el siguiente:
Cebador n.º 2 anormal:
5'-aggtggg-3'
Con el fin de que el método funcione, el último
nucleótido del extremo 3' está marcado con una biotina, quedándole
aún capacidad para extenderse en una reacción de PCR (teniendo un
grupo OH libre en el extremo 3').
Los cebadores del extremo 3' serán ahora como
éstos:
Cebador n.º 2 normal:
5'-aggtggtB-3'
Cebador n.º 2 anormal:
5'-aggtgggB-3'
(B = biotina)
Los productos de la PCR obtenidos como resultado
de usar estos cebadores sobre un DNA normal serán:
(Cebador n.º1 + Cebador n.º 2 anormal)
5'-ccccatg- - - - -
-atgacctaggAccacct-3'
3'-ggggtac- - - - -
-tactggatccTggtgga-5' + biotina
\vskip1.000000\baselineskip
Solamente el uso del cebador n.º 2 normal sobre
el DNA molde normal dará productos de PCR biotinilados. Las enzimas
de la PCR separarán la biotina del cebador n.º 2 anormal,
obteniéndose un producto no biotinilado.
Los productos de PCR obtenidos con el uso de
estos cebadores sobre DNA anormal serán:
(Cebador n.º1 + Cebador n.º 2 normal)
5'-ccccatg- - - - -
-atgacctaggCccacct-3'
3'-ggggtac- - - - -
-tactggatccGggtgga-5'
Como en el caso anterior, pero justo el
contrario.
La presencia de producto biotinilado mostrará si
el paciente presenta o no una mutación.
Un ejemplo específico de una PCR diagnóstica de
la anemia de células falciformes causada por una mutación de una
sola base es el siguiente: En este ejemplo, se indica que el
cebador está marcado con biotina. Éste es sólo un ejemplo de uno de
los ligandos que pueden utilizarse y no debe interpretarse que
limite este ejemplo ilustrativo; pueden utilizarse otros
ligandos.
La hemoglobina A1 humana normal tiene una
secuencia de DNA correspondiente al primer exón (parte codificadora)
del gen de la beta-globina de haplotipo A1 que
comienza como se muestra a continuación:
DNA normal:
atg gtg cac ctg act cct gag gag aag tct gcc gtt
act gcc
ctg tgg ggc aag gtg aac gtg gat gaa gtt ggt ggt
gag gcc
ctg ggc agg...
que se traduce en la
Secuencia de aminoácidos normal:
MVHLTPEEKSAVTALWGKVNVDEVGGEALG...
En el caso de la enfermedad humana de la anemia
de células falciformes, la secuencia de DNA del primer exón del gen
de la beta-globina de haplotipo S comienza como se
muestra a continuación:
DNA de la enfermedad de las células
falciformes:
atg gtg cac ctg act cct gtg gag aag tct gcc gtt
act gcc
ctg tgg ggc aag gtg aac gtg gat gaa gtt ggt ggt
gag gcc
ctg ggc agg...
que se traduce en la
Secuencia de aminoácidos de la enfermedad de las
células falciformes:
MVHLTPVEKSAVTALWGKVNVDEVGGEALG...
La comparación del DNA normal con el DNA de la
enfermedad de las células falciformes revela que una sustitución de
una sola base es suficiente para transformar el gen normal de la
hemoglobina en un gen anormal de la hemoglobina anormal, que se
sabe que es causante de la grave enfermedad de la anemia de células
falciformes. El codón gag está mutado a un codón gtg, causando una
sustitución del aminoácido ácido ácido glutámico con el aminoácido
no polar valina.
Para detectar la presencia o ausencia de esta
mutación, se aísla el DNA genómico, y en caso necesario, se
amplifica por PCR antes de la PCR diagnóstica de la manera
convencional.
Los cebadores utilizados para la amplificación de
parte del gen de la cadena beta de la hemoglobina están basados en
la secuencia de DNA proporcionada por el programa de búsqueda de
EMBEL cuando la búsqueda se hace en el identificador único
EMBL-ID: HSBETGLOB'.
El gen de la cadena beta de la hemoglobina (que
se muestra más adelante en forma de tripletes separados) está
precedido por la secuencia de un intrón (intrón 1) y va seguido por
otra secuencia (intrón 2) y ambos intrones aparecen indicados más
adelante en letra itálica.
Una parte de los intrones (la parte
subrayada) se utiliza para la construcción de cebadores
(véase más adelante).
Los intrones no codificadores están flanqueando
la porción codificadora del gen; el segundo intrón está separando
la secuencia codificadora de la siguiente parte de la secuencia
codificadora más en dirección aguas abajo.
Para amplificar la primera parte codificadora del
gen para la PCR diagnóstica posterior, pueden utilizarse dos
cebadores, por ejemplo, que se reasocien a los intrones 1 y 2
respectivamente. Las secuencias de reasociación de los cebadores
están indicadas en letras itálicas subrayadas.
Cebador 1:
5'-ctagcaacctcaaacagacacc-3'
Cebador 2:
5'-gtaaccttgataccaacctgcc-3'
Estos cebadores se utilizan sólo en la PCR de
amplificación para obtener más DNA molde para el procedimiento de
la PCR diagnóstica, y por ello no necesitan estar biotinilados ni
modificados en modo alguno.
Para la PCR diagnóstica, ya que se conoce la
naturaleza de la mutación, una mutación de una sola base en el
codón 6 del exón, se diseñan tres cebadores, que corresponden al
DNA normal y al DNA anormal (de la anemia de células
falciformes):
Cebador correspondiente a la hemoglobina
normal:
Cebador N: 5'-atg gtg cac
ctg act cct ga-biotina-OH
Cebador correspondiente a la hemoglobina de la
enfermedad de las células falciformes:
Cebador S: 5'-atg gtg cac
ctg act cct gt-biotina-OH
Cebador correspondiente al otro extremo del
gen:
Cebador 2:
5'-gtaaccttgataccaacctgcc-3'
(Este puede ser el mismo cebador utilizado en la
etapa de amplificación: no está marcado ni modificado)
A continuación se realiza el ensayo diagnóstico
con los cebadores de la etapa 1 y la muestra o la muestra
amplificada por PCR.
Se realizan dos reacciones de PCR:
a) una PCR que utiliza el Cebador N + Cebador
2;
b) una PCR que utiliza el Cebador S + Cebador
2;
Los productos de PCR resultantes de las
reacciones de PCR a) y b) se estudian luego con respecto a la
presencia de biotina de la manera previamente descrita.
Los resultados obtenidos del estudio de las dos
reacciones de PCR a) y b) pueden presentar una de cuatro posibles
consecuencias que se ilustran a continuación.
El método puede también utilizarse para el
diagnóstico de mutaciones de múltiples bases, como se ilustra más
adelante, también en el caso de la anemia de células
falciformes.
Una mutación de múltiples bases (letras en
negrilla y subrayadas) en el primer exón del gen de la
beta-globina, aparece en la secuencia de DNA de la
siguiente manera:
atg gtg cac ctg act cct aac gag aag tct
gcc gtt act gcc
ctg tgg ggc aag gtg aac gtg gat gaa gtt ggt ggt
gag gcc
ctg ggc agg...
secuencia que se traduce en la secuencia de
aminoácidos:
MVHLTPNEKSAVTALWGKVNDEVGGEALG...
Un cebador, tal como el Cebador N
anteriormente mencionado, puede utilizarse para revelar si el gen
está presente. El diagnóstico de la presencia potencial de una
mutación requiere un cebador capaz de detectar la mutación.
Uno cebador que puede utilizarse se corresponde
con la hemoglobina mutada de la siguiente manera:
5'-atggtgcacctgactcctaac-biotina-OH.
Este cebador identificaría de manera exacta la
mutación "acc" en el codón 6.
Otro cebador que puede utilizarse es:
5'-atggtgcacctgactccta-biotina-OH
Este cebador puede utilizarse para identificar
todas las mutaciones en el codón 6 que comienzan con una base
"a".
Las reacciones de PCR se realizan con el Cebador
N normal, y con uno o más cebadores que se corresponden con la
secuencia mutada (es decir, son complementarios a ella).
Este método puede utilizarse para cualquier
mutación presente en una secuencia conocida del gen normal y la
mutación en la hemoglobina de las células falciformes se aporta
como uno de los ejemplos. Cuando se conocen las mutaciones comunes
observadas en la población, pueden utilizarse varios cebadores para
localizar de manera exacta la mutación que está presente.
Otra utilidad del método del invento reside en
cortar y separar fragmentos de DNA de interés procedentes de una
molécula recombinante para su posterior manipulación. Un aspecto
relacionado reside en cortar y separar un DNA vector para usarlo en
posteriores manipulaciones de clonación. Se necesitan métodos
eficientes para obtener fragmentos linearizados de un DNA vector,
que tengan una elevada calidad para utilizarlos en procedimientos
de clonación o en otros procedimientos biotecnológicos. Como ya se
conoce en la técnica, los vectores tales como plásmidos y virus
comprenden, además de los elementos apropiados para controlar la
replicación y la transcripción, uno o más sitios de clonación para
la incorporación de un DNA heterólogo para su propagación o
expresión. De la misma manera que las enzimas de restricción se
utilizan para insertar un fragmento heterólogo en un vector de
clonación para preparar un vector recombinante, las enzimas de
restricción también se utilizan para cortar el fragmento heterólogo
para su posterior manipulación genética, o para cortar el elemento
vector para su posterior manipulación. Esos vectores comprenden
moléculas circulares de DNA. Éstas moléculas incluyen un fragmento
de relleno, con frecuencia un adaptador de policlonación, y un
fragmento que incluye las secuencias de control anteriormente
mencionadas. En uno de los métodos, un vector recombinante que
lleva un fragmento de DNA heterólogo insertado, se digiere con una
enzima de restricción con el fin de cortar el fragmento de DNA
insertado, lo que produce una mezcla de moléculas lineales de DNA,
que incluyen el fragmento de relleno del propio vector, el inserto,
y también moléculas de DNA recombinante parcialmente cortadas. El
método del invento puede utilizarse cuando el elemento de relleno
(o el vector) contenido en la molécula de DNA recombinante de la
que el elemento heterólogo ha de ser cortado incluye una secuencia
específica de reconocimiento de proteínas, tal como la secuencia de
reconocimiento de AP-1. En el método del invento,
los productos de la reacción de digestión con enzimas de restricción
se ponen en contacto en la disolución con la proteína para la que
es específica el ácido nucleico, AP-1 en este caso,
y a continuación se hace pasar a través de una membrana selectiva
para proteínas que secuestrará aquellas moléculas de ácido nucleico
a las que se ha unido AP-1, quedando en la
disolución sólo aquellas moléculas de DNA que incluyen el DNA
heterólogo insertado, y por no contienen una secuencia de
reconocimiento de AP-1.
En otra realización del invento, el método puede
utilizarse para separar la forma linearizada del vector propiamente
dicho para su posterior manipulación, es decir, de un vector que ha
sido linearizado mediante digestión con una enzima de restricción y
en el que se ha cortado el fragmento de relleno. Ese fragmento del
vector puede luego utilizarse para insertar y ligar un DNA
heterólogo, el cual, después de la circularización, puede utilizarse
para posteriores aplicaciones aguas abajo, tales como la
transformación de células hospedadoras.
En uno de los ejemplos, el fragmento de relleno
es, o incluye, un adaptador de policlonación constituido por sitios
únicos de reconocimiento para enzimas de restricción. El vector se
corta con una de estas enzimas lo que hará que la molécula se
linearice. La molécula lineal puede luego marcarse en los extremos
utilizando las técnicas enzimáticas anteriormente mencionadas.
Preferiblemente, para facilidad de una posterior manipulación, la
enzima de corte única es una enzima que crea un extremo
protuberante en 3'. En este caso, la molécula lineal del vector
puede marcarse en los extremos mediante la adición de nucleótidos
marcados tales como, nucleótidos biotinilados por medio de TdT. Si
la enzima crea un extremo protuberante en 5', el fragmento de Klenow
se necesitará de manera adicional para extender las terminaciones
en 3'. Se ha encontrado que este método es eficiente, en particular
cuando están implicadas grandes cantidades de DNA, mayores que 10
\mug. Teniendo marcado el vector linearizado, éste se somete
luego a una nueva digestión con enzimas de restricción, con una o
más enzimas de restricción, preferiblemente con enzimas que tienen
sitios únicos dentro del fragmento de relleno, uno a cada lado del
sitio de corte original. De este modo, los fragmentos de los
extremos quedan marcados, y el fragmento deseado que está sin
marcar puede ser separado del fragmento de relleno por medio del
método del invento. Así, cuando la muestra se hace pasar a través
del filtro, el vector cortado en su totalidad pasará a través de la
membrana.
En otra aplicación, el método del invento puede
utilizarse para separar productos de ligación no productivos en una
mezcla de ligación. La unión covalente de dos fragmentos de DNA
utilizando la enzima DNA-ligasa es fundamental en
biotecnología. En general, las reacciones de ligación implican la
inserción de fragmentos o insertos pequeños de DNA dentro de un DNA
vector de mayor tamaño. Es importante que el producto final de la
ligación esté circularizado correctamente para evitar la
degradación en las células hospedadoras transformadas, tales como
células hospedadoras bacterianas. Así, los productos de ligación
lineales no son de utilidad y no sobrevivirán en la bacteria
hospedadora. Por desgracia, las reacciones con ligasas no son
eficientes, produciendo típicamente más del 80% de productos
lineales. Esto disminuye la eficiencia de la incorporación de
productos de ligación circularizados y productivos en E.
coli. Desde este punto de vista, los productos lineales pueden
por ello considerarse contaminantes o productos secundarios de la
reacción de ligación. La eficiencia de la transformación con
productos ligados podría por lo tanto aumentarse si fuera posible,
para retirar de la mezcla de reacción los productos de ligación
lineales no deseados, antes de la transformación. Actualmente no
existe ningún método disponible. Debido a la naturaleza polimórfica
de los productos de ligación circulares productivos, no pueden
recuperarse cortándolos de los geles. El presente invento
proporciona ese método.
Por lo tanto, conforme a un aspecto más, este
invento proporciona un método para separar moléculas de ácido
nucleico lineales de moléculas de ácido nucleico circulares en una
muestra, comprendiendo dicho método introducir un marcador en un
extremo de una molécula de ácido nucleico lineal, siendo dicho
marcador una proteína que puede ser inmovilizada en una matriz, por
interacción directa con la matriz, y poner en contacto la muestra
con una matriz a la que se unen selectivamente proteínas, mediante
lo cual dichas moléculas de ácido nucleico marcadas quedan
inmovilizadas en la matriz.
El método del invento es aplicable en este caso
porque todas las moléculas de DNA presentes en la mezcla de ligación
y distintas de las moléculas circulares deseadas, tienen extremos
libres con grupos fosfato e hidroxilo expuestos y reactivos. Estos
grupos pueden estar marcados en los extremos, mediante los métodos
enzimáticos anteriormente mencionados, con nucleótidos marcados
tales como nucleótidos biotinilados. Las moléculas circulares no
pueden marcarse porque no tienen grupos hidroxilo reactivos en 3' a
los que pueda unirse un marcador. De este modo, las moléculas
marcadas y lineales pueden ser capturadas por la matriz y con ello
separadas de las moléculas ligadas circularizadas que quedan en
disolución y que pueden utilizarse para posteriores procedimientos
aguas abajo, tales como la transformación de células
hospedadoras.
En otra realización del invento, el método puede
utilizarse en el empaquetamiento in vitro de partículas de
bacteriófagos, tales como el fago lambda, por ejemplo en la
construcción de bibliotecas génicas y bibliotecas de presentación
de fagos. El bacteriófago puede empaquetarse o bien in vitro,
en cuyo caso el DNA vírico se mezcla in vitro junto con los
diferentes componentes proteicos de la cubierta del virus, después
de lo cual tiene lugar el ensamblaje del virus, o bien en
bacterias, en cuyo caso el DNA vírico se introduce en bacterias
apropiadas que proporcionan los componentes proteicos necesarios
que se necesitan para el ensamblaje del virus. El empaquetamiento
in vitro es más rápido que el método de transformación
bacteriana, porque el empaquetamiento puede conseguirse en cuestión
de minutos, en contraposición a una duración de 1-2
días. Sin embargo es un método menos eficiente que el método de la
transformación bacteriana, en particular en el caso del
empaquetamiento de un DNA fágico que ha sido manipulado, por
ejemplo el DNA de un fago \lambda en el que se ha insertado un
DNA heterólogo, cuando existen indicaciones experimentales de que
la eficiencia del empaquetamiento puede disminuirse en un máximo de
10^{3}/\mug de DNA, cuando se compara con la del DNA lineal
resultante de manipulaciones moleculares con el virus lambda lineal
no modificado. Esta eficiencia disminuida proviene, al menos en
parte, de la presencia de productos secundarios de las reacciones
de manipulación del DNA. Sería por lo tanto ventajoso si estos
productos secundarios pudieran retirarse antes del empaquetamiento,
aumentándose de este modo la eficiencia del empaquetamiento in
vitro y posibilitando que este método se utilice en lugar del
método de transformación bacteriana, lo que permite una mayor
velocidad y por ello un procedimiento global más eficiente. El
método del invento hace posible, usando el sistema de marcadores,
marcar los fragmentos no deseados, haciendo que éstos puedan
separarse de los productos de ligación deseados.
El método aprovecha la ventaja de la presencia de
sitios cos en el genoma del fago. Estos sitios son regiones de DNA
monocatenarias y complementarias, una en cada extremo del genoma
del fago lambda, las cuales, después del la inserción del DNA
lineal de \lambda en las células bacterianas, se reasocian entre
sí para crear un genoma circular que puede replicarse y que no es
susceptible de degradación por acción de exonucleasas bacterianas
como lo sería un DNA lineal.
En esta realización, antes de clonar un DNA
heterólogo en un vector, los extremos 3' del vector se bloquean,
por ejemplo, añadiendo un didesoxinucleótido junto con una DNA
polimerasa apropiada, por ejemplo, el fragmento de Klenow, que
retira de manera efectiva los grupos OH reactivos de los sitios cos
en 3', dejando solamente un hidrógeno no reactivo, que no puede ser
extendido ni marcado. Así, después de que la reacción de clonación
se haya llevado a cabo, las moléculas de DNA se someten a la
adición de un marcador, capaz de ser añadido solamente en los
grupos OH en 3'. De este modo, sólo los productos correctamente
ligados, que no incluyen un grupo OH reactivo en 3', serán los que
no estarán marcados; todas las demás moléculas de DNA, incluyendo
los fragmentos del vector sometidos a restricción y el fragmento que
ha de ser clonado, llevarán un grupo OH reactivo en 3' que puede
ser marcado. Debido a que solamente las moléculas de DNA
correctamente ligadas son las que no pueden estar marcadas, estas
moléculas pueden separarse con facilidad de los productos
secundarios no deseados usando cualquiera de los métodos que aquí se
describen.
Contemplado así desde un aspecto más, el presente
invento proporciona un método de empaquetamiento in vitro de
fagos, para fagos recombinantes en los que el DNA del vector está
cortado con una o más enzimas de restricción, los grupos OH en 3'
del DNA del vector están bloqueados, el vector y el DNA que ha de
ser insertado se ponen en contacto en condiciones apropiadas para
la ligación de los fragmentos de DNA, y los productos de la ligación
se marcan con un resto capaz de unirse a los grupos OH reactivos en
3', seguido de la separación de las moléculas marcadas y no
marcadas.
En este contexto, el bloqueo de los grupos OH en
3' significa que el grupo OH en 3' está ausente, o se encuentra
protegido o modificado de alguna manera que no puede ser extendido
más.
En una realización conveniente, el marcador es
biotina la cual se añade a los grupos OH reactivos en 3' en forma
de un nucleótido biotinilado por medios enzimáticos, por ejemplo,
por medio del fragmento de Klenow.
En una de las realizaciones, los extremos 3' del
vector primero se bloquean, por ejemplo, con un didesoxinucleótido,
y el vector se corta luego con una enzima que tiene un sitio de
reconocimiento único dentro del vector, estando el sitio de
reconocimiento localizado entre los dos sitios de restricción que
van a ser usados para la clonación. Un ejemplo de esa enzima de
restricción es EcoRI. El propósito de este corte inicial con una
enzima de restricción es hacer posible que todas las moléculas del
DNA del vector que no se van a cortar posteriormente sean retiradas
por medio del marcaje. El vector se corta luego en dos posiciones,
con dos enzimas que tienen sitios de corte únicos dentro del
vector, que constituirán el sitio de clonación. Además de generar
los fragmentos del vector encargados de la clonación, pueden
obtenerse varios productos de restricción parcialmente cortados, los
cuales pueden ser retirados por medio del marcador, por ejemplo,
cuando el marcador es biotina, por medio de la unión a
estreptavidina, según se ha descrito anteriormente. El
fragmento(s) de DNA encargado de la clonación se liga luego
en el interior del DNA del vector lambda. Para retirar todos los
productos de reacción no deseados, todos los extremos 3' expuestos
se encuentran marcados, por ejemplo, por medio de biotina. Los
productos de ligación correctos no tienen grupos OH reactivos en 3'
y no pueden marcarse, y pueden por ello separarse de todas las
moléculas marcadas mediante los métodos que aquí se describen.
El invento será ahora descrito con más detalle
con referencia a los Ejemplos no limitativos que vienen a
continuación.
5 \mug de DNA del fago lambda sometido a
restricción con HindIII (Gibco 15612-13)
40 unidades de DNA-polimerasa I.
Fragmento de Klenow mayor (New England Biolabs n.º 210S)
10 \mul de tampón para la
DNA-polimerasa I (Fragmento de Klenow mayor (New
England Biolabs)
5 nmoles de
biotina-14-dCTP (Gibco
19518-018)
5 nmoles de dATP (Gibco
10216-018)
5 nmoles de dTTP (Gibco
10219-012)
5 nmoles de dGTP (Gibco
10218-014)
Agua destilada ad 100 \mul
La mezcla de reacción se incubó a 25ºC durante 45
minutos.
La mezcla de reacción se hizo pasar a través de
una columna MicroSpin S400 HR (Pharmacia-Amersham
275140-01), se añadieron 10 \mug de
estreptavidina (Promega n.º 7041) y se incubaron 5 minutos a
25ºC.
La mezcla de reacción se añadió a una columna
Centriflex (Edge Biosystems n.º 73883) y se dejó difundir a
través de la membrana de la manera descrita por el fabricante, antes
de una centrifugación a 10.000xg durante 30 segundos. Se añadieron
10 \mul de agua destilada a la membrana que se giró 180º a
posición horizontal y se centrifugó de nuevo a 10.000xg.
El eluido se analizó en una electroforesis en un
gel de agarosa al 1% (FMC n.º 50080), y se tiñó con bromuro de
etidio según se describe en Maniatis, Molecular Cloning: a
laboratory manual, segunda edición, 1989.
No pudieron observarse trazas del DNA del fago
lambda en el gel, lo que indicaba que las moléculas lineales y
marcadas en un extremo que llevaban estreptavidina unida estaban
retenidas en la membrana.
2 \mug de Low DNA Mass™ Ladder (Gibco
10068-013)
40 unidades de Terminal Deoxynucleotidyl
Transferasa, Recombinant (Gibco 10533-016)
20 \mul de tampón para la Terminal
Deoxynucleotidyl Transferasa, Recombinant (Gibco)
5 nmoles de
biotina-14-dCTP (Gibco
19518-018)
Agua destilada ad 100 \mul
La mezcla de reacción se incubó a 37ºC durante 45
minutos.
La mezcla de reacción se hizo pasar a través de
una columna MicroSpin S200 HR (Pharmacia-Amersham
275120-01) y se añadieron 10 \mug de
estreptavidina (Promega n.º 7041). La mezcla se incubó 5 minutos a
25ºC.
La mezcla de reacción se añadió a una columna
Centriflex (Edge Biosystems n.º 73883) y se dejó difundir a
través de la membrana de la manera descrita por el fabricante, antes
de la centrifugación a 10.000xg durante 30 segundos. Se añadieron
10 \mul de agua destilada a la membrana que se giró 180º a
posición horizontal y se centrifugó de nuevo a 10.000xg.
Para su inspección, el eluido se hizo correr en
gel de agarosa al 2% (FMC n.º 50080), que se tiñó con bromuro de
etidio según se describe en Maniatis, Molecular Cloning: a
laboratory manual, segunda edición, 1989.
No pudieron observarse trazas del DNA del fago
lambda en el gel, lo que indicaba que las moléculas lineales y
marcadas en un extremo que llevaban estreptavidina unida estaban
retenidas en la membrana.
El vector Cantab 5E que contiene un inserto a
ensayar (Pharmacia-Amersham
279401-01) se preparó usando Qiagen maxiprep
(Qiagen n.º 12166).
El vector Cantab 5E contiene sitios de
restricción únicos para las enzimas SfiI, NotI y BsmI, estando los
sitios SfiI y BamHI localizados a cada uno de los lados del sitio
NotI.
25 \mug del vector Cantab 5E anteriormente
descrito
40 unidades de endonucleasa NotI
(Boehringer-Mannheim 1014714)
5 \mul de tampón para la endonucleasa NotI
(Boehringer-Mannheim 1014714)
agua ad 50 \mul
La mezcla se incubó 1 hora a 37ºC.
La mezcla de reacción se hizo pasar a través de
una columna MicroSpin S400 HR (Pharmacia-Amersham
275140-01) después de lo cual se añadió lo
siguiente:
40 unidades de la DNA-polimerasa
I, fragmento de Klenow mayor (New England Biolabs n.º
210S)
10 \mul de tampón para la
DNA-polimerasa I, fragmento de Klenow mayor (New
England Biolabs)
5 nmoles de
biotina-14-dCTP (Gibco
19518-018)
5 nmoles de dGTP (Gibco
10218-014)
Agua destilada ad 100 \mul
La mezcla se incubó a 25ºC durante 45
minutos.
La mezcla de reacción se hizo pasar a través de
una columna MicroSpin S400 HR (Pharmacia-Amersham
275140-01).
Una muestra de la mezcla de reacción (5 \mug)
se diluyó hasta un volumen de 50 \mul y se añadió a una columna
Centriflex (Edge Biosystems n.º 73883) y se dejó difundir a
través de la membrana de la manera descrita por el fabricante,
antes de una centrifugación a 10.000xg durante 30 segundos. Se
añadieron 10 \mul de agua destilada a la membrana que se giró 180º
a posición horizontal y se centrifugó de nuevo a 10.000xg.
\newpage
Para su inspección, el eluido se hizo correr en
un gel de agarosa al 2% (FMC n.º 50080), que se tiñó con bromuro de
etidio según se describe en Maniatis, Molecular Cloning: a
laboratory manual, segunda edición, 1989.
No se observaron trazas de DNA vector en el gel,
lo que indica que todo el DNA había quedado retenido en la
membrana.
La mezcla de reacción se hizo pasar a través de
una columna MicroSpin S400 HR (Pharmacia-Amersham
275140-01), y partes alícuotas individuales se
trataron de la siguiente manera:
(1)
33 \mul de la mezcla de reacción se pusieron en
un tubo diferente (1) al que se añadieron:
20 unidades de BsmI
(Boehringer-Mannheim 1292315)
5 \mul de tampón para BsmI
(Boehringer-Mannheim 1292315)
agua destilada ad 50 \mul
La mezcla se incubó 1 hora a 65ºC.
(2)
una porción de 33 \mul de la mezcla de reacción
se pusieron en un tubo diferente (2) al que se añadieron:
20 unidades de SfiI
(Boehringer-Mannheim 1288032)
5 \mul de tampón para SfiI
(Boehringer-Mannheim 1288032)
agua destilada ad 50 \mul
La mezcla se incubó 1 hora a 50ºC.
(3)
una porción de 33 \mul de la mezcla de reacción
se pusieron en un tubo diferente (3) al que se añadieron:
20 unidades de SfiI
(Boehringer-Mannheim 1288032)
5 \mul de tampón para SfiI
(Boehringer-Mannheim 1288032)
agua destilada ad 50 \mul
La mezcla se incubó 1 hora a 50ºC. A continuación
la mezcla de reacción se hizo pasar a través de una columna
MicroSpin S400 y a la mezcla de reacción se añadió lo siguiente:
20 unidades de BsmI
(Boehringer-Mannheim 1292315)
5 \mul de tampón para BsmI
(Boehringer-Mannheim 1292315)
agua destilada ad 50 \mul
La mezcla se incubó 1 hora a 65ºC.
Cada una de las tres mezclas de reacción se
purificó en columnas MicroSpin S400 distintas, y se añadieron 10
\mug de estreptavidina (Promega n.º 7041) a cada una de las
mezclas y se incubaron durante 5 minutos a 25ºC.
Cada una de las mezclas de reacción se añadió a
una columna Centriflex (Edge Biosystems n.º 73883) y se dejó
difundir a través de la membrana de la manera descrita por el
fabricante, antes de la centrifugación a 10.000xg durante 30
segundos. A cada una de las membranas se añadieron 10 \mul de
agua destilada, y las membranas se giraron 180º a posición
horizontal y se centrifugaron de nuevo a 10.000xg.
Las tres mezclas de reacción se hicieron correr
en un gel de agarosa al 1% (FMC n.º 50080), y se tiñeron con
bromuro de etidio.
Sólo en la tercera muestra de reacción pudo
observarse en el gel el DNA vector purificado, y las muestras 1 y 2
no proporcionaron trazas de DNA detectables. Esto indica que sólo
el vector correcto cortado por restricción es el que atraviesa la
membrana.
Se produjo un producto de PCR amplificando una
construcción scFV usando cebadores para PCR de alta calidad y
biotinilados.
La construcción scFV es un fragmento de 800 pares
de bases, que contiene sitios únicos para SfiI y NotI, situados en
la posición de las bases 40 y 760 respectivamente.
Se mezclaron 1 \mug de producto de PCR con 2
\mug de estreptavidina (Promega n.º 7041) y se incubaron a 25ºC
durante 5 minutos.
La mezcla de reacción se añadió a una columna
Centriflex (Edge Biosystems n.º 73883) y se dejó difundir a
través de la membrana de la manera descrita por el fabricante, antes
de una centrifugación a 10.000xg durante 30 segundos. Se añadieron
10 \mul de agua destilada a la membrana que se giró 180º a
posición horizontal y se centrifugó de nuevo a 10.000xg.
Para su inspección, la mezcla de reacción se hizo
correr en gel de agarosa al 2% (FMC n.º 50080), y se tiñó con
bromuro de etidio.
No se detectaron trazas del producto de PCR, lo
que indicaba que éste había sido retenido en la membrana.
Partes alícuotas distintas se trataron de la
siguiente manera:
(1)
3 \mug del producto de PCR se añadieron en un
tubo diferente (1) a:
20 unidades de la endonucleasa NotI
(Boehringer-Mannheim 1014714)
5 \mul de tampón para NotI y
agua destilada ad 50 \mul
y se incubaron 1 hora a 37ºC.
(2)
Otros 3 \mug del producto de PCR se añadieron
en un tubo diferente (2) a:
20 unidades de SfiI
(Boehringer-Mannheim 1288032)
5 \mul de tampón para SfiI
(Boehringer-Mannheim 1288032)
agua destilada ad 50 \mul
y se incubaron 1 hora a 50ºC.
(3)
Otros 3 \mug del producto de PCR se añadieron
en un tubo diferente (3) a:
20 unidades de SfiI
(Boehringer-Mannheim 1288032)
5 \mul de tampón para SfiI
(Boehringer-Mannheim 1288032)
agua destilada ad 50 \mul
y se incubaron 1 hora a 50ºC.
A continuación la mezcla de reacción se hizo
pasar a través de una columna MicroSpin S400 y a la mezcla de
reacción se añadió lo siguiente:
20 unidades de la endonucleasa NotI
(Boehringer-Mannheim 1014714)
5 \mul de tampón para la endonucleasa NotI
(Boehringer-Mannheim 1014714)
agua destilada ad 50 \mul
y se incubaron 1 hora a 37ºC.
Cada una de las tres mezclas de reacción se
purificó en columnas distintas MicroSpin S400, y a continuación se
añadieron 10 \mug de estreptavidina (Promega n.º 7041) a cada una
de las mezclas y se incubaron durante 5 minutos a 25ºC.
Cada una de las mezclas de reacción se añadió a
una columna Centriflex (Edge Biosystems n.º 73883) y se dejó
difundir a través de la membrana de la manera descrita por el
fabricante, antes de una centrifugación a 10.000xg durante 30
segundos. A cada una de las membranas se añadieron 10 \mul de
agua destilada, y las membranas se giraron 180º a posición
horizontal y se centrifugaron de nuevo a 10.000xg.
Para su inspección, las tres mezclas de reacción
se sometieron a electroforesis en un gel de agarosa al 1% (FMC n.º
50080), y se tiñeron con bromuro de etidio.
Sólo en la muestra de reacción del tubo 3 pudo
observarse en el gel el producto purificado por PCR, y los tubos 1
y 2 no proporcionaron trazas detectables de DNA, lo que indica que
los fragmentos que contienen los extremos habían sido retenidos en
la membrana, y que el fragmento interno había atravesado la
membrana.
Se produjo un producto de PCR amplificando una
construcción scFV usando cebadores para PCR de alta calidad y
biotinilados.
Se mezcló 1 \mug de producto de PCR con 2
\mug de estreptavidina (Promega n.º 7041) y se incubaron a 25ºC
durante 5 minutos, igual que en el Ejemplo 4.
La mezcla de reacción se añadió a una columna
Centriflex (Edge Biosystems n.º 73883) y se dejó difundir a
través de la membrana de la manera descrita por el fabricante, antes
de una centrifugación a 10.000xg durante 30 segundos. Se añadieron
10 \mul de agua destilada a la membrana que se giró 180º a
posición horizontal y se centrifugó de nuevo a 10.000xg.
Para su inspección, la mezcla de reacción se hizo
correr en gel de agarosa al 2% (FMC n.º 50080), y se tiñó con
bromuro de etidio.
El producto de PCR se detectó en el gel, lo que
indica que éste no había sido retenido en la membrana.
A 3 \mug de producto de PCR se le añadió lo
siguiente:
40 unidades de Terminal Deoxynucleotidyl
Transferasa, Recombinant (Gibco 10533-016)
20 \mul de tampón para la Terminal
Deoxynucleotidyl Transferasa, Recombinant (Gibco)
5 nmoles de
biotina-14-dCTP (Gibco
19518-018)
Agua destilada ad 100 \mul
y se incubaron a 37ºC durante 45 minutos.
La mezcla de reacción se hizo pasar a través de
una columna MicroSpin S200 HR (Pharmacia-Amersham
275120-01), se añadieron 10 \mug de
estreptavidina (Promega n.º 7041) y se incubaron 5 minutos a
25ºC.
La mezcla de reacción se añadió a una columna
Centriflex (Edge Biosystems n.º 73883) y se dejó difundir a
través de la membrana de la manera descrita por el fabricante, antes
de la centrifugación a 10.000xg durante 30 segundos. Se añadieron
10 \mul de agua destilada y la columna se giró 180º a posición
horizontal y se centrifugó de nuevo a
10.000xg.
10.000xg.
Para su inspección, la mezcla de reacción se hizo
correr en un gel de agarosa al 2% (FMC n.º 50080), que se tiñó con
bromuro de etidio.
No pudo detectarse ningún producto de PCR en el
gel, lo que indicaba que éste había sido retenido en la
membrana.
Tres partes alícuotas diferentes se trataron de
la siguiente manera:
\newpage
(1)
En un tubo distinto (1) se añadieron 3 \mug del
producto de la PCR a:
20 unidades de endonucleasa NotI
(Boehringer-Mannheim 1014714)
5 \mul de tampón para NotI y
agua destilada ad 50 \mul
y se incubaron 1 hora a 37ºC.
(2)
En un tubo distinto (2) se añadieron otros 3
\mug del producto de PCR a:
20 unidades de SfiI
(Boehringer-Mannheim 1288032)
5 \mul de tampón para SfiI
(Boehringer-Mannheim 1288032)
agua destilada ad 50 \mul
y se incubaron 1 hora a 50ºC.
(3)
En un tubo distinto (3) se añadieron otros 3
\mug del producto de PCR a:
20 unidades de SfiI
(Boehringer-Mannheim 1288032)
5 \mul de tampón para SfiI
(Boehringer-Mannheim 1288032)
agua destilada ad 50 \mul
y se incubaron 1 hora a 50ºC.
A continuación la mezcla de reacción se hizo
pasar a través de una columna MicroSpin S400 y a la mezcla de
reacción se añadió lo siguiente:
20 unidades de la endonucleasa NotI
(Boehringer-Mannheim 1014714)
5 \mul de tampón para la endonucleasa NotI
(Boehringer-Mannheim 1014714)
agua destilada ad 50 \mul
y se incubaron 1 hora a 37ºC.
Cada una de las tres mezclas de reacción se
purificó en columnas MicroSpin S400 diferentes, y después se
añadieron 10 \mug de estreptavidina (Promega n.º 7041) y se
incubaron durante 5 minutos a 25ºC.
Cada una de las mezclas de reacción se añadió a
una columna Centriflex (Edge Biosystems n.º 73883) y se
dejaron difundir a través de la membrana de la manera descrita por
el fabricante, antes de la centrifugación a 10.000xg durante 30
segundos. A cada una de las membranas se añadieron 10 \mul de
agua destilada, y las membranas se giraron 180º a posición
horizontal y se centrifugaron de nuevo a 10.000xg.
Para su inspección, las tres mezclas de reacción
se hicieron correr en un gel de agarosa al 1% (FMC n.º 50080), y se
tiñeron con bromuro de etidio.
Sólo en el grupo 3 de las mezclas de reacción
pudo observarse en el gel el producto de PCR purificado, y los
tubos 1 y 2 no proporcionaron trazas detectables de DNA, lo que
indica que los fragmentos que contenían los extremos habían sido
retenidos en la membrana, y que solamente el fragmento interno había
atravesado la membrana.
El material de partida de DNA circular es el
vector de clonación pUC19 que lleva un sitio HindIII único en el
sitio del adaptador de policlonación.
Se añadieron 5 \mug del DNA vector pUC19
(New England Biolabs nº. 301-1S) a:
40 unidades de la enzima de restricción HindIII
(New England Biolabs nº. 104S)
5 \mul de tampón para la enzima de restricción
HindIII (New England Biolabs)
agua destilada ad 50 \mul
Se incubaron 1 hora a 37ºC.
La reacción se hizo pasar a través de una columna
MicroSpin S400 HR y la mezcla de reacción se añadió a:
5 \mul del DNA vector pUC19 (New England
Biolabs n.º 301-1S)
40 unidades de la DNA-polimerasa
I, fragmento de Klenow mayor (New England Biolabs)
10 \mul de tampón para la
DNA-polimerasa I, fragmento de Klenow mayor (New
England Biolabs)
5 nmoles de
biotina-14-dCTP (Gibco
19518-018)
5 nmoles de dATP (Gibco
10216-014)
5 nmoles de dTTP (Gibco
10219-012)
5 nmoles de dGTP (Gibco
10218-014)
Agua destilada ad 100 \mul
La mezcla de reacción se incubó a 25ºC durante 45
minutos.
La mezcla de reacción se hizo pasar a través de
una columna MicroSpin S400 HR (Pharmacia-Amersham
275140-01), se añadieron 10 \mug de
estreptavidina (Promega n.º7041) y se incubaron 5 minutos a
25ºC.
La mezcla de reacción se añadió a una columna
Centriflex (Edge Biosystems n.º 73883) y se dejó difundir a
través de la membrana de la manera descrita por el fabricante,
antes de la centrifugación a 10.000xg durante 30 segundos. Se
añadieron 10 \mul de agua destilada, la columna se giró 180º a
posición horizontal y se centrifugó de nuevo a 10.000xg.
Para su inspección, el eluido se analizó en una
electroforesis en gel de agarosa al 1% (FMC n.º 50080), se tiñó con
bromuro de etidio según se describe en Maniatis, Molecular
Cloning: a laboratory manual, segunda edición, 1989.
Sólo se detectó DNA circular en el gel de agarosa
(FMC n.º 50080), lo que indica que este DNA había atravesado la
membrana, quedando retenido el DNA lineal.
Se utiliza el vector lambda
Uni-ZAP® XR (Stratagene, n.º de catálogo 236612)
precortado.
10 \mug de vector lambda precortado
trifosfato de didesoxiguanosina (concentración
final 200 \muM)
trifosfato de didesoxiadenosina (concentración
final de 200 \muM)
fragmento de Klenow (10 unidades)
tampón NEB EcoPol
en un volumen total de 30 \mul
La mezcla de reacción se incuba a 24ºC durante 20
minutos.
La mezcla de reacción se hace pasar a través de
una columna MicroSpin S400 HR para separar las proteínas y
nucleótidos y a la mezcla de reacción purificada se añade:
200 ng del inserto de DNA
pre-preparado
DNA-ligasa de T4
tampón NEB para la ligasa de T4
en un volumen de 40 \mul
La mezcla de reacción se incuba a 16ºC durante 48
horas.
La mezcla de reacción se hace pasar a través de
una columna MicroSpin S400 HR y a la mezcla de reacción purificada
se añade:
dCTP biotinilado (5 nmoles)
dATP biotinilado (5 nmoles)
dTTP (concentración final 200 \muM)
dGTP (concentración final 200 \muM)
fragmento de Klenow (10 unidades)
tampón NEB
en un volumen de 50 \mul
La mezcla de reacción se incuba a 24ºC durante 20
minutos.
La mezcla de reacción se hace pasar a través de
una columna MicroSpin S400 HR y a la mezcla de reacción purificada
se añade Estreptavidina y la mezcla de reacción se añade a una
columna Centriflex igual que en el Ejemplo 2.
El procedimiento posterior sigue las
instrucciones del prospecto del envase de Stratagene. La ligación
proporciona un número más alto de bacteriófagos viables que el
encontrado con el método estándar, como se observa por el recuento
de calvas sobre el cultivo de bacterias.
Se utiliza el vector lambda
Uni-ZAP® XR (Stratagene) no cortado que contiene un
inserto a ensayar.
5 \mug de vector lambda no cortado
trifosfato de didesoxiguanosina (concentración
final 200 \muM)
trifosfato de didesoxiadenosina (concentración
final de 200 \muM)
fragmento de Klenow (10 unidades)
tampón NEB
en un volumen total de 20 \mul
La mezcla de reacción se incuba a 24ºC durante 20
minutos. Esto bloquea los extremos 3' del vector.
La mezcla de reacción se hace pasar a través de
una columna MicroSpin S400 HR y a la mezcla de reacción purificada
se añade:
enzima de restricción EcoRI (20 unidades)
tampón NEB para EcoRI
en un volumen de 30 \mul
La mezcla de reacción se incuba a 37ºC durante
120 minutos. Esto digiere el vector en trozos aproximadamente
iguales.
La mezcla de reacción se hace pasar a través de
una columna MicroSpin S400 HR y a la mezcla de reacción purificada
se añade:
dATP biotinilado (5 nmoles)
dTTP (concentración final 200 \muM)
dCTP (concentración final 200 \muM)
dGTP (concentración final 200 \muM)
fragmento de Klenow (10 unidades)
tampón NEB
en un volumen de 40 \mul
La mezcla de reacción se incuba a 24ºC durante 30
minutos. En esta reacción, la biotina marcará el DNA lambda digerido
con EcoRI.
A la mezcla de reacción se añaden:
las enzimas de restricción XbaI y XhoI (20
unidades de cada una) en tampón NEB 2 en un volumen de 50 \mul.
Esta reacción crea el sitio de clonación.
La mezcla de reacción se incuba a 37ºC durante 60
minutos.
La mezcla de reacción se hace pasar a través de
una columna MicroSpin S400 HR y a la mezcla de reacción purificada
se añade Estreptavidina y la mezcla de reacción se añade a una
columna Centriflex igual que en el Ejemplo 2. En esta etapa, la
Estreptavidina se une al vector no cortado.
La mezcla de reacción se hace pasar a través de
una columna MicroSpin S400 HR para separar las proteínas y
nucleótidos y a la mezcla de reacción purificada se añade:
200 ng del inserto de DNA
pre-preparado
DNA-ligasa de T4
tampón NEB para la DNA-ligasa de
T4
en un volumen de 60 \mul
La mezcla de reacción se incuba a 16ºC durante 48
horas.
La mezcla de reacción se hace pasar a través de
una columna MicroSpin S400 HR y a la mezcla de reacción purificada
se añade:
dCTP biotinilado (5 nmoles)
dATP biotinilado (5 nmoles)
dTTP (concentración final 200 \muM)
dGTP (concentración final 200 \muM)
fragmento de Klenow (10 unidades)
tampón NEB
en un volumen de 70 \mul
La mezcla de reacción se incuba a 24ºC durante 20
minutos. En esta reacción, se marcan todos los extremos OH en 3'
expuestos que no estaban previamente bloqueados.
La mezcla de reacción se hace pasar a través de
una columna MicroSpin S400 HR y a la mezcla de reacción purificada
se añade Estreptavidina y la mezcla de reacción se añade a una
columna Centriflex igual que en el Ejemplo 2. Esto separa las
moléculas marcadas de las moléculas no marcadas.
El procedimiento posterior sigue las
instrucciones del prospecto del envase de Stratagene. La ligación
produce un número más alto de bacteriófagos viables que el
encontrado con el método estándar, como se observa por el recuento
de calvas sobre el cultivo de bacterias.
a) Modificación del vector Cantab5E (Pharmacia)
para obtener Cantab5E^{BamHI(1)}
El vector Cantab5E (1 \mug) se corta añadiendo
10 unidades de BamHI y 10 \mul de tampón NEB para BamHI en un
volumen total de reacción de 100 \mul y se incuba 1 hora a 37ºC.
La mezcla de reacción se separa en un gel de agarosa al 1% y el
fragmento de peso molecular más alto se aísla mediante un método
común de extracción en gel. A 500 ng del fragmento mayor aislado se
añade 1 unidad Weiss de la DNA-ligasa de T4 y 5
\mul de tampón para la ligasa en un volumen de reacción total de
50 \mul y la mezcla se incuba 1 hora a 24ºC. La mezcla de
ligación se utiliza para transformar células TGI usando
electroporación y las células bacterianas se incuban durante la
noche en agar que contiene ampicilina (100 \mug/ml). El DNA
procedente de las bacterias formadoras de colonias se aísla y se
comprueba mediante determinación por tamaño y tratamiento con
enzimas de restricción que contiene solamente un sitio de
restricción BamHI. Este DNA se denomina
Cantab5E^{BamHI(1)}.
b) Uso del vector Cantab5E^{BamHI(1)}
modificado como molde en PCR
10 \mug del vector
Cantab5E^{BamHI(1)}
mezcla de dNTP (suministrada por Finnzyme;
concentración final 200 \muM)
10 \mul de tampón para la enzima Expand High
Fidelity (Boehringer-Mannheim AG)
30 pmoles del cebador 1 que se solapa
parcialmente con un sitio de restricción único AflIII
30 pmoles del cebador 2 que se solapa
parcialmente con un sitio de restricción único BamHI
agua ad 100 \mul
La reacción de PCR se calentó a 96ºC durante 2
minutos antes de añadir 1 \mul de la enzima Expand High
Fidelity (Boehringer-Mannheim AG).
La mezcla de reacción se cicla en un
termociclador durante 20 rondas, en las siguientes condiciones:
- Los primeros 2 minutos a 96ºC, y a continuación
20 rondas de la siguiente manera:
- 30 segundos a 55ºC,
- 80 segundos a 72ºC,
- 30 segundos a 96ºC.
El producto de PCR se identifica mediante tinción
con bromuro de etidio después de una electroforesis en agarosa.
Típicamente se observan productos secundarios no deseados.
La mezcla de reacción del termociclador se hace
pasar a través de una columna MicroSpin S400 HR.
El producto de PCR purificado se corta utilizando
las enzimas de restricción AflIII y BamHI en un procedimiento
normal, seguido de la adición de estreptavidina, y la mezcla de
reacción se añade a una columna Centriflex (igual que en el ejemplo
2). Solamente se observa el producto de PCR correctamente cortado,
después de la electroforesis en agarosa, ya que las impurezas no
deseadas quedan retenidas por la matriz de unión a proteínas.
La hemoglobina A1 humana normal tiene una
secuencia de DNA del primer exón (parte codificadora) del gen de la
beta-globina de haplotipo A1, que comienza como se
muestra a continuación:
DNA normal:
atg gtg cac ctg act cct gag gag aag tct gcc gtt
act gcc
ctg tgg ggc aag gtg aac gtg gat gaa gtt ggt ggt
gag gcc
ctg ggc agg...
que traduce la
Secuencia de aminoácidos normal:
MVHLTPEEKSAVTALWGKVNVDEVGGEALG...
En la enfermedad humana de la anemia de células
falciformes, la secuencia de DNA del primer exón del gen de la
beta-globina de haplotipo S, comienza como se
muestra a continuación:
DNA de la enfermedad de las células
falciformes:
atg gtg cac ctg act cct gtg gag aag tct gcc gtt
act gcc
ctg tgg ggc aag gtg aac gtg gat gaa gtt ggt ggt
gag gcc
ctg ggc agg...
que traduce la
Secuencia de aminoácidos de la enfermedad de las
células falciformes:
MVHLTPVEKSAVTALWGKVNVDEVGGEALG...
La comparación del DNA normal y del DNA de la
enfermedad de las células falciformes revela que una sustitución de
una sola base es suficiente para transformar el gen normal de la
hemoglobina en un gen anormal de la hemoglobina, que se sabe que es
causante de la grave enfermedad de la anemia de células
falciformes. El codón gag está mutado a un gtg codón, produciendo
una sustitución del aminoácido de carácter ácido ácido glutámico
con el aminoácido no polar valina.
Para detectar la presencia o ausencia de esta
mutación, el DNA genómico se aísla, y, si fuera necesario, se
amplifica por PCR antes de la PCR diagnóstica, de la manera
convencional.
Un kit comercial (GFX Genomic Blood DNA
Purification kit; Pharmacia-Amersham n.º
27-9603-01) se usa conforme a las
recomendaciones del fabricante para aislar DNA genómico de una
muestra de sangre de un paciente.
Si se obtienen DNA suficiente, se procede
directamente a ejecutar el Ejemplo 10c. Si no fuera así, se lleva a
cabo una etapa de amplificación por PCR de una parte del gen de la
cadena beta de la hemoglobina (Ejemplo 10b).
El DNA aislado del Ejemplo 10a se amplifica para
aumentar la cantidad de DNA para su procesamiento posterior, como
se muestra a continuación.
Una mezcla de
250 ng de DNA genómico
10 \mul de tampón para la enzima Expand High
Fidelity
20 nmoles de dNTP
20 pmoles de cada cebador de la amplificación
(Cebador 1 y Cebador 2; véanse más adelante)
Agua hasta completar 100 \mul
3 unidades de la enzima para PCR Expand High
Fidelity
se utiliza para una PCR durante 30 rondas en las
siguientes condiciones estándar:
arranque en caliente a 96ºC
reasociación a 56ºC durante 30 segundos
polimerización a 72ºC durante 1 minuto
desnaturalización a 96ºC durante 30 segundos
Los cebadores usados para la amplificación de
parte del gen de la cadena beta de la hemoglobina están basados en
la secuencia de DNA proporcionada por el programa de búsqueda EMBEL
cuando la búsqueda se realiza en el identificador único
EMBL-ID:HSBETGLOB'.
El gen de la cadena beta de la hemoglobina (que
se muestra más adelante en forma de tripletes independientes) va
precedido por la secuencia de un intrón (intrón 1) y va seguido por
otra secuencia (intrón 2), intrones ambos que aparecen indicados
más adelante en letra itálica.
Parte de los intrones (la parte subrayada)
se usa para la construcción de los cebadores (véase más
adelante).
Los intrones no codificadores flanquean la
porción codificadora del gen; el segundo intrón separa la secuencia
codificadora de la parte siguiente de la secuencia codificadora
situada más aguas abajo.
Para amplificar la primera parte codificadora del
gen para una posterior PCR diagnóstica, pueden usarse dos
cebadores, por ejemplo, que se reasocien a los intrones 1 y 2
respectivamente. Las secuencias que se reasocian correspondientes
con los cebadores se encuentran indicadas en lo que antecede en
letra itálica subrayada.
Cebador 1:
5'-ctagcaacctcaaacagacacc-3'
Cebador 2:
3'-gtaaccttgataccaacctgcc-3'
Estos cebadores se utilizan solamente en la PCR
de amplificación para conseguir más DNA molde para el procedimiento
de la PCR diagnóstica, y por ello no necesitan estar biotinilados
ni modificados en modo alguno.
Etapa
1
Para la PCR diagnóstica, debido a que la
naturaleza de la mutación se conoce, una mutación de una sola base
en el codón 6 del exón, se diseñan tres cebadores, que corresponden
al DNA normal y al DNA anormal (anemia de células perniciosas).
Cebador que corresponde a la hemoglobina
normal:
Cebador N: 5'-atg gtg cac
ctg act cct ga-biotina-OH
Cebador que corresponde a la hemoglobina de la
enfermedad de las células falciformes:
Cebador S: 5'-atg gtg cac
ctg act cct gt-biotina-OH
Cebador que corresponde al otro extremo del
gen:
Cebador 2:
5'-gtaaccttgataccaacctgcc-3'
(Este cebador puede ser el mismo que el utilizado
en la etapa de amplificación del Ejemplo 10b; no está marcado ni
modificado).
Etapa
2
Se realizan dos reacciones de PCR, usando las
mismas condiciones que en el Ejemplo 10b.
a) PCR usando el Cebador N + Cebador 2:
100 ng del DNA producto de la PCR del Ejemplo
10b
10 \mul de tampón para la enzima Expand High
Fidelity
20 nmoles de dNTP
20 pmoles de cada cebador de la amplificación
(Cebador N y Cebador 2)
3 Unidades de la enzima para PCR Expand High
Fidelity
Agua hasta completar 100 \mul
b) PCR usando el Cebador S + Cebador 2:
Igual que en la reacción de PCR (a) pero con el
cebador AB que reemplaza al cebador N para la amplificación.
Los productos de PCR resultantes de las
reacciones de PCR a) y b) se purifican mediante el uso de columnas
MicroSpin S400 HR como se describe en el Ejemplo 1. Todos los
productos se examinan luego con respecto a la presencia de biotina
por medio de una membrana Centriflex, como se describe en el Ejemplo
1. La mezcla de reacción se divide en 2 partes. Se añade
estreptavidina en exceso (5 \mug) a 9 de 10 mezclas de reacción,
y se incuban a 25ºC durante 5 minutos como en el Ejemplo 1, y a
continuación se añaden a una membrana Centriflex igual que en el
Ejemplo 1. El eluido recogido se analiza en un gel de agarosa, igual
que en el Ejemplo 1, con respecto a la presencia de un DNA
producto. La 1/10 mezcla de reacción restante, que no se ha puesto
en contacto con estreptavidina, se hace correr en paralelo en el
gel de agarosa como muestra de control.
Los resultados del examen de las dos reacciones
de PCR a) y b) pueden tener una de cuatro posibles consecuencias
que se ilustran a continuación:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
El método puede también utilizarse para el
diagnóstico de mutaciones de múltiples bases, como se ilustra más
adelante, también esta vez en el caso de anemia de células
falciformes.
Una mutación en múltiples bases (subrayada y
en negrilla) en el primer exón del gen de la
beta-globina se presenta en la siguiente secuencia
de DNA:
atg gtg cac ctg act cct aac gag aag
tct gcc gtt act gcc
ctg tgg ggc aag gtg aac gtg gat gaa gtt ggt ggt
gag gcc
ctg ggc agg...
que se traduce en la secuencia de
aminoácidos:
MVHLTP N EKSAVTALWGKVNVDEVGGEALG...
Aunque han cambiado tres bases, para detectar la
mutación puede usarse un método similar al del Ejemplo 10.
Al igual que en el Ejemplo 10, se utiliza un
Cebador N para revelar si el gen normal está presente. Se
construyen dos cebadores para diagnosticar la presencia potencial
de una mutación.
Un cebador que corresponde a la hemoglobina
mutada, como el siguiente:
Cebador AB2a
5'-atggtgcacctgactcctaac-biotina-OH
Este cebador identifica de manera exacta la
mutación "acc" en el codón 6.
El segundo cebador es:
Cebador AB2b
5'-atggtgcacctgactccta-biotina-OH
Este cebador puede identificar todas las
mutaciones presentes en el codón 6 que comiencen con una base
"a".
Las reacciones de PCR se llevan a cabo con el
Cebador N normal, y con uno o más cebadores que corresponden a la
secuencia mutada (es decir, que son complementarios a ella) usando
las condiciones del Ejemplo 10.
Este método puede utilizarse para cualquier
mutación presente en una secuencia conocida del gen normal y la
mutación de la hemoglobina de las células falciformes se
proporciona como ejemplo. Cuando se conocen las mutaciones comunes
observadas en la población, pueden usarse varios cebadores para
localizar de manera exacta la mutación que está presente.
Ejemplos
12-22
Los Ejemplos 1-11 se repiten con
una NycoCard que porta una membrana de unión a proteínas que
reemplaza a la columna Centriflex para la separación o el
aislamiento de las moléculas de DNA marcadas con biotina y que
están formando un complejo con estreptavidina.
Claims (20)
1. Un método para separar al menos parcialmente
moléculas de ácido nucleico presentes en una muestra, en
poblaciones, en el que una población está marcada con una proteína
capaz de ser inmovilizada en una matriz, comprendiendo dicho método
poner en contacto la muestra que contiene el ácido nucleico con una
matriz a la que se unen selectivamente proteínas, por medio de lo
cual dicha proteína interacciona directamente con la matriz, las
moléculas marcadas son capturadas por la matriz y de ese modo se
separan de las moléculas no marcadas.
2. Un método según la reivindicación 1, en el
que el marcador es una proteína que puede incorporarse a una
molécula de ácido nucleico, o una proteína que tiene afinidad por
una molécula de ácido nucleico.
3. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones de 1 a 2, en el que el marcador es un
antígeno.
4. Un método según la reivindicación 1 o la
reivindicación 2, en el que la proteína es una proteína de unión a
ácidos nucleicos.
5. Un método según la reivindicación 1, en el
que las proteínas se encuentran enlazadas o unidas a las moléculas
de ácido nucleico.
6. Un método según la reivindicación 5, en el
que la proteína está enlazada vía biotina al ácido nucleico, y la
proteína es estreptavidina o avidina.
7. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que la matriz está en forma de
láminas, geles, filtros, membranas, fibras, tubos, placas de
microtitulación, columnas, partículas.
8. Un método según la reivindicación 7, en el
que la matriz es un material poroso.
9. Un método según la reivindicación 8, en el
que la matriz está incorporada en un dispositivo de separación
seleccionado entre viales de centrífuga, placas de microtitulación,
cartuchos y jeringas.
10. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones de 7 a 9, en el que una almohadilla absorbente se
coloca sobre dicho material poroso, una lámina líquida impermeable
se coloca sobre la cara de dicha almohadilla absorbente alejada de
dicho material poroso, y una lámina líquida impermeable que
contiene uno o más agujeros se coloca sobre la cara de dicho
material poroso alejada de dicha almohadilla absorbente, por medio
de lo cual la muestra a ensayar se aplica en uno de dichos agujeros
y se hace que difunda transversalmente a través de dicho material
poroso mediante absorción en dicha almohadilla absorbente.
11. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, para la separación al menos parcial
de un producto de la digestión con enzimas de restricción, o para
purificar los productos de la reacción de PCR.
12. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, para separar al menos parcialmente
una mezcla de fragmentos de DNA digeridos con enzimas de
restricción, en el que el material de partida es una molécula lineal
de DNA que está marcada o que puede marcarse en o cerca de uno o
ambos extremos con una proteína capaz de ser inmovilizada en una
matriz, comprendiendo dicho método someter la molécula de DNA a
digestión con enzimas de restricción, seguido de poner en contacto
la muestra con una matriz a la que se unen selectivamente
proteínas, por medio de lo cual las moléculas marcadas que se han
originado a partir de un extremo del material de partida son
capturadas por la matriz y de ese modo se separan de las moléculas
no marcadas.
13. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, para separar al menos parcialmente
los productos correctos y deseados resultantes de una amplificación
por PCR, de los productos de PCR resultantes de una reasociación
incorrecta de un cebador de PCR a un molde, en el que la molécula
de ácido nucleico molde comprende un sitio de reconocimiento único
para una enzima de restricción en, o cerca de, un extremo del molde,
y un cebador de PCR que está marcado, o que puede marcarse con una
proteína, es complementario a una secuencia contenida en el molde y
que se extiende parcialmente dentro del sitio de restricción único,
método que comprende amplificar el molde por medio de una PCR,
digerir los productos de la PCR con la enzima de restricción
específica para el sitio de reconocimiento único de la enzima de
restricción, y poner en contacto el producto resultante con una
matriz a la que se unen selectivamente proteínas, por medio de lo
cual las moléculas de ácido nucleico marcadas son capturadas por la
matriz y de ese modo se separan de las moléculas no marcadas.
14. Un método según la reivindicación 13, en el
que el marcador está unido al extremo 5' del cebador.
15. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones de 1 a 10, para una PCR diagnóstica.
16. Un método según la reivindicación 15, para
una PCR diagnóstica, en el que la muestra a ensayar se somete por
separado a reacciones de PCR, en el que la mutación, en caso de
estar presente, está en la secuencia a la que el cebador 3' es
complementaria, una primera reacción de PCR que usa un cebador 3'
complementario al ácido nucleico diana normal, y una segunda
reacción de PCR que usa un cebador 3' complementario al ácido
nucleico diana mutante, en el que el nucleótido 3' del cebador
mutante se corresponde con uno de Los nucleótidos que está mutado
en el ácido nucleico mutante, portando cada uno de dichos cebadores
3' un marcador o pudiendo cada uno de dichos cebadores marcarse en
el nucleótido 3' del cebador, y en el que se detecta la presencia o
ausencia del marcador en los productos de la reacción de PCR.
17. Un método según la reivindicación 15, para
una PCR diagnóstica de mutaciones en una molécula de ácido
nucleico, en el que se detecta la presencia o ausencia de una
mutación en una muestra de ácido nucleico, en el que se usa un
cebador 3' específico o para el ácido nucleico normal o para el
ácido nucleico mutante, en el que dicho cebador es complementario a
una región del ácido nucleico en la que existe una diferencia de
bases entre el DNA normal y el DNA mutado, correspondiendo la
terminación 3' del cebador con la posición en la muestra en la que
existe una diferencia entre el DNA normal y el DNA mutante, estando
el cebador marcado o pudiendo el cebador marcarse, por medio de lo
cual se detecta la presencia o ausencia del marcador en el producto
de PCR.
18. Un método según la reivindicación 15, para
una PCR diagnóstica, en el que la muestra a ensayar se somete a una
PCR con cebadores complementarios al DNA diana normal, en el que el
cebador encargado de la extensión en el extremo 3' del DNA diana se
reasocia con una secuencia cuyo nucleótido en 3' está mutado en el
DNA mutante, en el que el cebador 3' porta un marcador o puede
marcarse en el nucleótido 3' o cerca del mismo, y en el que se
detecta la presencia del marcador en el producto de la reacción de
PCR.
19. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones de 1 a 10, para separar moléculas de ácido
nucleico lineales de moléculas de ácido nucleico circulares
presentes en una muestra, comprendiendo dicho método introducir un
marcador en un extremo de las moléculas de ácido nucleico lineales,
en el que dicho marcador es una proteína que puede ser inmovilizada
en una matriz mediante interacción directa con la matriz, y poner
en contacto la muestra con una matriz a la que se unen
selectivamente proteínas, por medio de lo cual dichas moléculas de
ácido nucleico lineales y marcadas quedan inmovilizadas en la
matriz.
20. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones de 1 a 10, para el empaquetamiento fágico in
vitro de un fago recombinante, en el que el DNA vector se corta
con una o más enzimas de restricción, los grupos OH en 3' del
vector se bloquean, el vector y el DNA que ha de ser insertado se
ponen en contacto en condiciones apropiadas para la ligación de los
fragmentos de DNA, y los productos de la ligación se marcan con un
resto capaz de unirse a grupos OH reactivos situados en 3', seguido
de la separación de las moléculas marcadas y no marcadas.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GBGB9826247.0A GB9826247D0 (en) | 1998-11-30 | 1998-11-30 | Method |
GB9826247 | 1998-11-30 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
ES2212681T3 true ES2212681T3 (es) | 2004-07-16 |
Family
ID=10843337
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES99973074T Expired - Lifetime ES2212681T3 (es) | 1998-11-30 | 1999-11-30 | Metodo para separar acidos nucleicos en poblaciones. |
Country Status (15)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20040253584A1 (es) |
EP (1) | EP1144692B1 (es) |
JP (1) | JP2002531099A (es) |
CN (1) | CN1344331A (es) |
AT (1) | ATE259426T1 (es) |
AU (1) | AU771985B2 (es) |
BR (1) | BR9915809A (es) |
CA (1) | CA2353103A1 (es) |
CZ (1) | CZ20011905A3 (es) |
DE (1) | DE69914804T2 (es) |
DK (1) | DK1144692T3 (es) |
ES (1) | ES2212681T3 (es) |
GB (1) | GB9826247D0 (es) |
NO (1) | NO20012630L (es) |
WO (1) | WO2000032812A1 (es) |
Families Citing this family (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP1559790A1 (de) * | 2004-02-02 | 2005-08-03 | International University Bremen Gmbh | Vesikel zum Abtrennen von Substanzen aus flüssigen Medien |
JP2007222160A (ja) * | 2006-01-26 | 2007-09-06 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | 生体由来試料中の蛋白質の解析方法 |
US20080124777A1 (en) * | 2006-11-29 | 2008-05-29 | Canon U.S. Life Sciences, Inc. | Method for releasing genetic material from solid phase |
EP2167519A4 (en) * | 2007-06-16 | 2011-04-13 | Scarab Genomics Llc | NUCLEIC ACID ENCAPSIDATION SYSTEM |
WO2009045344A2 (en) * | 2007-09-28 | 2009-04-09 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Error-free amplification of dna for clonal sequencing |
US9090948B2 (en) | 2008-09-30 | 2015-07-28 | Abbott Molecular Inc. | Primers and probes for detecting human papillomavirus and human beta globin sequences in test samples |
GB201208726D0 (en) * | 2012-05-17 | 2012-07-04 | Oxford Gene Tech Ip Ltd | Methods and materials |
EP3354750A1 (en) | 2012-07-18 | 2018-08-01 | Siemens Healthcare Diagnostics Inc. | Kit of normalizing biological samples |
Family Cites Families (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS61501746A (ja) * | 1984-04-05 | 1986-08-21 | ライフ テクノロジ−ズ,インコ−ポレイテツド | 核酸の固定化法 |
AU5640090A (en) * | 1989-03-21 | 1990-11-05 | Collaborative Research Inc. | A dna diagnostic test using an exonuclease activity |
GB8921227D0 (en) * | 1989-09-20 | 1989-11-08 | Wellcome Found | Antibodies and proteins |
US5427908A (en) * | 1990-05-01 | 1995-06-27 | Affymax Technologies N.V. | Recombinant library screening methods |
NL9100567A (nl) * | 1991-04-02 | 1992-11-02 | Ingeny Bv | Werkwijze voor het detecteren van mutaties, transgeen zoogdier, transgene zoogdiercel, en werkwijze voor het onderzoeken van stoffen of omstandigheden op mutagene eigenschappen. |
FR2678639B1 (fr) * | 1991-07-03 | 1993-09-17 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Procede de clonage d'acides nucleiques. |
US5665539A (en) * | 1991-07-12 | 1997-09-09 | The Regents Of The University Of California | Immuno-polymerase chain reaction system for antigen detection |
US5710028A (en) * | 1992-07-02 | 1998-01-20 | Eyal; Nurit | Method of quick screening and identification of specific DNA sequences by single nucleotide primer extension and kits therefor |
US5591841A (en) * | 1993-01-14 | 1997-01-07 | Ji; Huamin | Rapid purification of circular DNA by triplex-mediated affinity capture |
US6120992A (en) * | 1993-11-04 | 2000-09-19 | Valigene Corporation | Use of immobilized mismatch binding protein for detection of mutations and polymorphisms, and allele identification in a diseased human |
DE69531612D1 (de) * | 1994-04-25 | 2003-10-02 | Avitech Diagnostics Inc | Die bestimmung von mutationen durch spaltung mit resolvase |
US5512441A (en) * | 1994-11-15 | 1996-04-30 | American Health Foundation | Quantative method for early detection of mutant alleles and diagnostic kits for carrying out the method |
AU7506896A (en) * | 1995-11-09 | 1997-05-29 | Shionogi & Co., Ltd. | Method for the simultaneous detection of polygenes |
US6261797B1 (en) * | 1996-01-29 | 2001-07-17 | Stratagene | Primer-mediated polynucleotide synthesis and manipulation techniques |
-
1998
- 1998-11-30 GB GBGB9826247.0A patent/GB9826247D0/en not_active Ceased
-
1999
- 1999-11-30 DE DE69914804T patent/DE69914804T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1999-11-30 CA CA002353103A patent/CA2353103A1/en not_active Abandoned
- 1999-11-30 AT AT99973074T patent/ATE259426T1/de not_active IP Right Cessation
- 1999-11-30 DK DK99973074T patent/DK1144692T3/da active
- 1999-11-30 EP EP99973074A patent/EP1144692B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-11-30 ES ES99973074T patent/ES2212681T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-11-30 JP JP2000585443A patent/JP2002531099A/ja not_active Withdrawn
- 1999-11-30 AU AU13980/00A patent/AU771985B2/en not_active Ceased
- 1999-11-30 CN CN99815765A patent/CN1344331A/zh active Pending
- 1999-11-30 BR BR9915809-4A patent/BR9915809A/pt not_active IP Right Cessation
- 1999-11-30 WO PCT/GB1999/003995 patent/WO2000032812A1/en active IP Right Grant
- 1999-11-30 CZ CZ20011905A patent/CZ20011905A3/cs unknown
-
2001
- 2001-05-29 NO NO20012630A patent/NO20012630L/no not_active Application Discontinuation
- 2001-05-30 US US09/870,128 patent/US20040253584A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
NO20012630L (no) | 2001-06-27 |
CN1344331A (zh) | 2002-04-10 |
NO20012630D0 (no) | 2001-05-29 |
ATE259426T1 (de) | 2004-02-15 |
DE69914804T2 (de) | 2004-07-15 |
CZ20011905A3 (cs) | 2002-03-13 |
EP1144692A1 (en) | 2001-10-17 |
GB9826247D0 (en) | 1999-01-20 |
CA2353103A1 (en) | 2000-06-08 |
BR9915809A (pt) | 2001-08-21 |
WO2000032812A1 (en) | 2000-06-08 |
US20040253584A1 (en) | 2004-12-16 |
EP1144692B1 (en) | 2004-02-11 |
DE69914804D1 (de) | 2004-03-18 |
DK1144692T3 (da) | 2004-06-14 |
AU771985B2 (en) | 2004-04-08 |
AU1398000A (en) | 2000-06-19 |
JP2002531099A (ja) | 2002-09-24 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US11768200B2 (en) | Methods for maintaining the integrity and identification of a nucleic acid template in a multiplex sequencing reaction | |
KR101815695B1 (ko) | 표적 특이적 뉴클레아제를 이용한 표적 dna의 민감한 검출 방법 | |
FI86436B (fi) | Foerfarande foer framstaellning av faktor viii:c och daertill hoerande vektorer och saollningsmedel. | |
AU3274500A (en) | Detection of mutations in genes by specific lna primers | |
JPH04502862A (ja) | 核酸配列上の一個の塩基を迅速に検出および/または同定する方法とその応用 | |
PT92420B (pt) | Metodo e combinacao de reagentes para a determinacao de sequencias de nucleotidos | |
ES2212681T3 (es) | Metodo para separar acidos nucleicos en poblaciones. | |
EP0530998B1 (en) | Detection of complementary nucleotide sequences | |
US6528256B1 (en) | Methods for identification and isolation of specific nucleotide sequences in cDNA and genomic DNA | |
WO1994001447A1 (en) | Methods of single nucleotide primer extension to detect specific alleles and kits therefor | |
JPS62282599A (ja) | ポリヌクレオチド配列の検出のための溶液相単一交雑アツセイ | |
CN107683335A (zh) | 用于核酸分离的自动化方法 | |
US5741638A (en) | Microtiter well for detecting nucleic acid | |
US20220403368A1 (en) | Methods and systems for preparing a nucleic acid construct for single molecule characterisation | |
HU229967B1 (hu) | Eljárás töredezett nukleinsavak szekvenciájának meghatározására | |
JPH1080279A (ja) | 核酸合成法 | |
Wychowski et al. | Construction of recombinant DNA molecules by the use of a single stranded DNA generated by the polymerase chain reaction: its application to chimeric hepatitis A virus/poliovirus subgenomic cDNA | |
EP0294595B1 (en) | Polynucleotide composition and method for its production | |
JPH08173195A (ja) | エンテロウイルス71型及びコクサッキーa群ウイルス16型の型鑑別方法並びにそれに用いるdnaプローブ及びdna断片 | |
JP2002525076A (ja) | モジュラーオリゴヌクレオチドによるプライマーエクステンション産物の単離方法 | |
JP2001522588A (ja) | 特異的ヌクレオチド配列を検出するための方法および組成物 | |
JPH05260999A (ja) | 単純ヘルペスウイルス2型の特異的検出方法 | |
Skern et al. | Polymerase Chain-Reaction (PCR) Detection of Rhinoviruses | |
Crouse | Characterization of the mouse strain carbon (3) hafnium/selenium germinally-transmitted mtv proviruses: Analysis of the transcriptional regulatory region and identification of mtv-1 as the specific provirus template of mammary tissue mtv RNA transcripts | |
JPH01124387A (ja) | 非a非b型肝炎特異抗原をコードするdnaを有する発現ベクター、形質転換体および該抗原の産生方法 |