ES2212681T3 - Metodo para separar acidos nucleicos en poblaciones. - Google Patents

Metodo para separar acidos nucleicos en poblaciones.

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ES2212681T3 ES99973074T ES99973074T ES2212681T3 ES 2212681 T3 ES2212681 T3 ES 2212681T3 ES 99973074 T ES99973074 T ES 99973074T ES 99973074 T ES99973074 T ES 99973074T ES 2212681 T3 ES2212681 T3 ES 2212681T3
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Abstract

Un método para separar al menos parcialmente moléculas de ácido nucleico presentes en una muestra, en poblaciones, en el que una población está marcada con una proteína capaz de ser inmovilizada en una matriz, comprendiendo dicho método poner en contacto la muestra que contiene el ácido nucleico con una matriz a la que se unen selectivamente proteínas, por medio de lo cual dicha proteína interacciona directamente con la matriz, las moléculas marcadas son capturadas por la matriz y de ese modo se separan de las moléculas no marcadas.

Description

Método para separar ácidos nucleicos en poblaciones.
El presente invento se refiere a un método para separar al menos parcialmente fragmentos de ácidos nucleicos. En particular, se refiere a un método para separar entre una población de moléculas de ácido nucleico, aquellas moléculas que están marcadas con una proteína capaz de ser inmovilizada en una matriz a la que se unen selectivamente proteínas.
La manipulación y manejo de DNA es fundamental para la mayoría de las técnicas de biotecnología. La manipulación de DNA típicamente incluye la digestión con endonucleasas usando enzimas de restricción específicas que cortan el DNA en fragmentos, seguida de la purificación de los fragmentos de DNA, de la inserción del fragmento requerido dentro de vectores de clonación y de la transferencia de estos vectores a hospedadores no naturales encargados de la transcripción, y opcionalmente de la traducción, proporcionando de este modo una información biológica valiosa, y/o la expresión del DNA insertado en forma de un producto, tal como un producto terapéutico. Esto permite, por ejemplo, que proteínas eucariotas sean expresadas en bacterias. La capacidad de poder cortar y unir moléculas o fragmentos de DNA es fundamental en la biotecnología moderna. A menudo, estos fragmentos de DNA son generados por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), que en la actualidad es una herramienta común tanto en investigación científica como en biotecnología industrial. Este método permite que moléculas de DNA específicas sean amplificadas por medio de cebadores ácido nucleicos específicos y cortos, para producir grandes cantidades de DNA que pueden ser luego manipuladas, por ejemplo, utilizando las técnicas de clonación anteriormente mencionadas.
Los métodos de manipulación de ácidos nucleicos que incluyen el uso de moléculas de DNA generadas, por ejemplo, por medio del corte con enzimas de restricción anteriormente mencionado, o por PCR, suelen ser ineficaces debido, al menos en parte, a la presencia de moléculas de DNA no deseadas. Esas moléculas "no deseadas" incluyen, por ejemplo, el DNA del vector resultante de la escisión, en particular de una escisión incompleta, de un fragmento de DNA insertado en una molécula recombinante, fragmentos de restricción parcialmente digeridos u otros productos secundarios del corte de las moléculas de DNA con enzimas de restricción, cebadores de PCR presentes en exceso, moléculas de ácido nucleico ligadas de manera incorrecta y que son los productos secundarios de la manipulación de ácidos nucleicos, y productos de PCR que son el resultado de una reasociación errónea de un cebador de PCR con el ácido nucleico molde. La calidad del DNA producto final principal es crucial para el éxito de las posteriores manipulaciones aguas abajo tales como la ligación y transformación de células hospedadoras bacterianas o eucariotas. La posibilidad de separar mezclas de moléculas de ácidos nucleicos, tales como mezclas de moléculas de DNA o de fragmentos de DNA, en poblaciones diferentes, y de este modo separar lo que se considera que es la población "no deseada" o contaminante, de la molécula de ácido nucleico deseada o diana, aumentaría por lo tanto la eficiencia de procedimientos posteriores o de etapas aguas abajo en las que se usan esas moléculas de ácido nucleico
generadas.
En la técnica se conocen métodos para purificar moléculas de ácidos nucleicos consideradas como una clase. Sin embargo, se dispone de métodos limitados que sean capaces de separar mezclas de moléculas de ácidos nucleicos, tales como mezclas que comprenden varias moléculas de DNA diferentes, en poblaciones diferentes. En general, estos métodos se basan en la separación de moléculas, o fragmentos, de ácidos nucleicos, conforme a su tamaño, por ejemplo, por medio de una electroforesis a través de geles de agarosa o poliacrilamida, seguida de la purificación de la molécula deseada o del fragmento deseado. Estos métodos presentan varios inconvenientes. Uno de los factores limitativos es la capacidad del propio gel, la cual limita la cantidad de DNA que puede separarse. El DNA necesita ser visualizado en el gel, generalmente por medio de una tinción con bromuro de etidio. A parte de ser tóxico para el operario, el bromuro de etidio puede contribuir a una disminución en la calidad del ácido nucleico, de manera que el rendimiento en aplicaciones aguas abajo puede ser escaso. La recuperación de las moléculas de ácido nucleico fraccionadas por electroforesis en gel también es ineficaz, produciéndose pérdidas significativas, con frecuencia de al menos el 20% del DNA. Los métodos de electroforesis en gel también requieren mucho tiempo. El DNA es una molécula frágil y es vulnerable al ataque por acción de exonucleasas y endonucleasas. El procedimiento comparativamente largo de separación electroforética, durante el que el DNA es vulnerable a la degradación, puede por lo tanto ser perjudicial para la integridad del DNA, y afectar a la eficiencia de los procedimientos aguas abajo. Esos métodos de separación son por lo tanto ineficaces y costosos.
El documento EP-A-O 872 559 describe un método para la detección simultánea de poligenes. En particular, la Figura 1 describe el uso de cebadores marcados con biotina para iniciar la síntesis de cDNA, y la recuperación de los cDNA resultantes usando bolitas magnéticas Dynabeads unidas a estreptavidina.
El documento US 5.741.678 describe un método cuantitativo para la detección temprana de alelos mutantes. En particular, la Figura 2 describe secuencias de nucleótidos que están marcadas con biotina y que pueden unirse a una superficie de soporte revestida con avidina o estreptavidina.
El documento US 5.602.300 describe un procedimiento para detectar mutaciones, inter alia. Describe el uso de partículas sólidas revestidas con la proteína represora lacI la cual se une a moléculas de DNA que contienen una secuencia del operador lacZ.
Existe por lo tanto la necesidad de un nuevo método para separar, al menos parcialmente, moléculas de ácidos nucleicos en poblaciones diferentes. El presente invento proporciona ese método.
Según el presente invento, se proporciona un método para separar al menos parcialmente moléculas de ácido nucleico presentes en una muestra, en poblaciones, en el que una población está marcada con una proteína capaz de ser inmovilizada en una matriz, comprendiendo dicho método poner en contacto la muestra que contiene el ácido nucleico con una matriz a la que se unen selectivamente proteínas, por medio de lo cual dicha proteína interacciona directamente con la matriz, las moléculas marcadas son capturadas por la matriz y de ese modo se separan de las moléculas no marcadas.
Este método es mucho más simple que el método de separación electroforética anteriormente mencionado y es también más rápido. Es por lo tanto más rentable, tiene una eficiencia completa mayor, y no adolece de los inconvenientes de una separación electroforética.
El método se basa en las moléculas de ácido nucleico marcadas que son capturadas, es decir, que son inmovilizadas o retenidas en la matriz, efectuándose de este modo su separación de las moléculas que permanecen en disolución.
El método del invento puede utilizarse para separar moléculas de ácido nucleico de interés y no marcadas (moléculas diana), de moléculas o fragmentos de ácido nucleico no deseados y marcados, y en este caso son las moléculas de ácido nucleico no deseadas las que son capturadas por la matriz, quedando las moléculas diana libres en disolución. Esto es ventajoso cuando las moléculas de ácido nucleico diana deseadas se requieren para procesamientos aguas abajo, por ejemplo, mediante técnicas de manipulación genética posteriores, ya que permite que las etapas posteriores sean llevadas a cabo sin necesidad de eluir o de desunir de la matriz de alguna otra manera las moléculas de ácido nucleico deseadas, y asimismo evita la necesidad, en caso de que la hubiera, de retirar el marcador de las moléculas de ácido nucleico. Esto constituye por lo tanto un aspecto preferido del invento. El método puede sin embargo utilizarse también para separar moléculas marcadas del ácido nucleico diana de interés, de entre fragmentos de ácido nucleicos no deseados y no marcados, en cuyo caso son las moléculas diana de interés las que son capturadas por la matriz, quedando las moléculas de ácido nucleico no deseadas en disolución. De manera adicional, el método puede utilizarse para reunir todas las fracciones de ácido nucleico separadas para diferentes fines aguas
abajo.
Según aquí se utiliza, "molécula de ácido nucleico" se refiere a cualquier molécula de ácido nucleico, incluyendo DNA, RNA, cDNA y compuestos híbridos tales como compuestos que comprenden ácidos nucleicos y péptidos, tales como los ácidos peptidonucleicos (PNA); y en el caso del DNA, incluye moléculas bicatenarias y monocatenarias, y cualquier molécula sintética de DNA o RNA y moléculas híbridas de DNA/RNA (es decir, moléculas en las que una cadena es DNA y la otra cadena es RNA). DNA "diana" o "deseado" se refiere a la molécula de ácido nucleico que se quiere aislar o separar de entre otras moléculas de ácido nucleico. En el contexto del invento, "marcador" se refiere a una proteína que puede estar añadida a, unida a, incorporada en, portada por, una molécula de ácido nucleico, o que puede ser parte de la secuencia de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico, o que puede estar enlazada de algún otro modo a una molécula de ácido nucleico, y que sirve como medio para capturar la población marcada de moléculas de ácido nucleico en una muestra que contiene ácidos nucleicos en la que una población particular está marcada de este modo y las otras poblaciones no están marcadas. El marcador de ese modo permite que la mezcla de ácidos nucleicos sea fraccionada, separándose las moléculas marcadas de las moléculas no marcadas por medio de una etapa de retención utilizando una matriz. El marcador puede estar incorporado dentro de la molécula del ácido nucleico, es decir, puede ser parte de la molécula del ácido nucleico, por ejemplo, puede ser parte de un nucleótido modificado y puede incorporarse a la molécula de ácido nucleico durante su síntesis, o puede ser parte de la secuencia de ácido nucleico de la molécula, en cuyo caso a la molécula de ácido nucleico propiamente dicha se la denomina marcada, o el marcador puede añadirse o unirse a una molécula de ácido nucleico, por ejemplo, en etapas posteriores a su síntesis, por ejemplo, mediante la adición de nucleótidos terminales, o uniéndolo a una secuencia de reconocimiento contenida en la secuencia del ácido nucleico, en cuyo caso, el ácido nucleico, cuando no lleva el marcador añadido, se describe como capaz de ser marcado.
El método puede utilizarse para separar o fraccionar cualquiera de las clases de ácidos nucleicos anteriormente mencionadas, o mezclas de las mismas. Un aspecto preferido del invento comprende el fraccionamiento de moléculas o fragmentos de DNA presentes en una muestra para separar al menos parcialmente la muestra en diferentes poblaciones de moléculas de ácidos nucleicos. Ejemplos de esos métodos incluyen la separación de fragmentos de restricción particulares en una preparación de DNA digerido con enzimas de restricción, por ejemplo, una molécula de DNA generada por PCR, o una molécula de DNA recombinante, y la "limpieza" de reacciones de PCR, es decir, la retirada de los productos de la PCR que son resultado de una reasociación errónea del cebador. El método tiene también otras aplicaciones, y puede utilizarse, por ejemplo, para separar un ácido nucleico lineal o circular, en una PCR diagnóstica y en el empaquetamiento in vitro de un bacteriófago.
El resto utilizado para marcar las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con el método del invento, puede ser cualquier proteína que es capaz de marcar una molécula de ácido nucleico y de quedar inmovilizada en una matriz a la que se unen selectivamente proteínas.
La naturaleza del marcador dependerá al menos en parte de las moléculas que han de ser separadas y de la matriz utilizada. Ejemplos de marcadores adecuados incluyen proteínas que pueden incorporarse a una molécula de ácido nucleico, o que pueden usarse para modificar nucleótidos individuales contenidos en una molécula de ácido nucleico, y proteínas que presentan afinidad por un sitio de unión particular contenido en una molécula de ácido nucleico. El marcador puede por lo tanto ser introducido en la molécula de ácido nucleico durante su síntesis, por ejemplo por medio de un nucleótido marcado, o después de su síntesis por ejemplo mediante la adición en uno de los extremos de nucleótidos marcados, p. ej., por medio de una reacción enzimática.
En una de las realizaciones, la molécula de ácido nucleico puede estar inmovilizada en la matriz del método del invento, por medio de una proteína que es una pareja de unión para una molécula ligando de pequeño tamaño, sirviendo el ligando como grupo enlazador independiente entre la molécula de ácido nucleico y la proteína pareja de unión.
En una de las realizaciones de este método, la muestra de ácido nucleico se pone primero en contacto en disolución con una proteína que es pareja de unión para el ligando, que se une solamente a las moléculas de ácido nucleico marcadas con el ligando, y las moléculas de ácido nucleico marcadas y unidas a la pareja de unión se extraen luego por medio de una matriz que tiene afinidad por proteínas.
Un ejemplo de ligando que puede utilizarse en el invento es la biotina. En la técnica se conocen otros ejemplos. Cuando la biotina se utiliza como ligando, la pareja de unión es avidina o estreptavidina, y la matriz puede ser una matriz que posea afinidad por proteínas y de este modo sea capaz de capturar estreptavidina o avidina y todas las moléculas a las que la (estrept)avidina esté unida. La avidina y la estreptavidina pueden utilizarse como pareja de unión para la biotina, y cuando en lo sucesivo se hace referencia a estreptavidina, la proteína bacteriana, se entenderá que también podría utilizarse avidina. La biotina puede incorporarse con facilidad al interior de nucleótidos, y de hecho nucleótidos biotinilados se encuentran comercialmente disponibles. También se ha encontrado que el uso de un ligando constituido por biotina es muy eficaz en el método del invento. La biotina por lo tanto representa un ligando preferido para el método del invento.
En una de las realizaciones del invento en la que como ligando se utiliza biotina, las moléculas de ácido nucleico biotiniladas pueden incubarse primero en la disolución con estreptavidina, por medio de lo cual la estrepatavidina, considerada como pareja de unión, se unirá a todas las moléculas de ácido nucleico que contengan biotina y formará un complejo de unión. Estas moléculas marcadas y que llevan estreptavidina añadida, son así posteriormente inmovilizadas por medio de una matriz que es capaz de inmovilizar proteínas de manera selectiva, mientras que no es capaz de inmovilizar moléculas de ácidos nucleicos, al menos en las condiciones utilizadas, retirando de este modo de la muestra las moléculas de ácido nucleico que contienen biotina.
En otra realización, el ligando puede ser fluoresceína o digoxigenina o un antígeno. Estos ligandos pueden ser capturados en la matriz por medio de proteínas que son parejas de unión a estos ligandos, por ejemplo, un anticuerpo dirigido contra el ligando, ya sea policlonal o monoclonal, o un fragmento de dicho anticuerpo. Cuando el ligando es un esteroide, el medio de captura puede ser un anticuerpo o uno de sus fragmentos, o un receptor para esteroide, o uno de sus fragmentos con propiedades de unión al esteroide. Estos medios de captura pueden utilizarse de un modo similar al uso anteriormente mencionado de la estreptavidina, con una matriz que tenga afinidad por proteínas.
En otra realización del invento, el marcador es una proteína de unión a ácidos nucleicos, que tiene una secuencia de reconocimiento específica dentro de la molécula de ácido nucleico a la que ha de marcar. Ejemplos de esas proteínas de unión a ácidos nucleicos incluyen el factor de transcripción AP-1 que se une a la secuencia de reconocimiento AP-1, la proteína myb que se une a una secuencia de reconocimiento corta y específica, y la proteína represora lacI, que se une a la secuencia del operador lac.
En esas realizaciones del invento, una muestra que contiene moléculas de ácido nucleico y que incluye la secuencia de reconocimiento de una proteína, puede en primer lugar marcarse en la disolución mediante contacto con la proteína reconocida por la secuencia específica, y a continuación la muestra se pone en contacto con la matriz después de lo cual las moléculas marcadas quedan retenidas en la matriz quedando en la disolución las moléculas no marcadas, es decir, las moléculas sin proteína unida.
En cada una de estas realizaciones, una proteína está implicada en la captura de una población de moléculas de ácido nucleico, ya sea como el marcador propiamente dicho, o ya sea como la pareja de unión para un ligando (tal como un anticuerpo o estreptavidina). Esto es ventajoso porque permite que como matriz se usen materiales receptivos a proteínas, preferiblemente materiales que tienen una unión selectiva a proteínas y, por lo tanto, que no se unen a ácidos nucleicos, al menos en las condiciones utilizadas, asegurando con ello que las moléculas no marcadas no son capturadas por la membrana ni secuestradas en la muestra. La proteína puede ser capturada por la matriz y unirse a ella mediante diversas interacciones, que incluyen la interacción iónica, la interacción hidrófoba y la unión por afinidad.
La matriz puede tomar cualquier forma física conveniente, por ejemplo, láminas, geles, filtros, membranas, fibras, tubos, placas de micro titulación, columnas, partículas, y puede estar en forma de partículas o ser porosa. Los materiales porosos, tales como filtros y membranas, son convenientes para los métodos de separación según el invento, ya sea para separar por filtración el DNA marcado no deseado como para recoger el DNA marcado deseado. Los ejemplos incluyen muestras en las que una población no marcada es la deseada para su procesamiento aguas abajo y en las que la población de ácidos nucleicos marcada, que constituye la población "no deseada", puede ser capturada en la disolución por medio de la membrana, ya que es lo más directo para procesar la muestra por filtración a través de la membrana, ofreciendo un método de captura efectivo y rápido, y simultáneamente fraccionando en forma del filtrado la población de ácidos nucleicos no marcada, ofreciendo de este modo una ruta directa hacia la siguiente etapa de la manipulación. Los materiales porosos tales como las membranas constituyen por lo tanto una matriz preferida para usar en el invento.
Las matrices porosas pueden por lo tanto usarse convenientemente para separar por filtración moléculas de ácido nucleico marcadas y no deseadas o para recoger moléculas de ácido nucleico marcadas deseadas. Esas matrices pueden utilizarse como parte de un dispositivo para una separación en una sola etapa o para una separación en muchas etapas, o como parte de otras etapas, tal como para detectar, evaluar o cuantificar DNA o cualquier otro producto en una corriente de reacciones aguas abajo. Estas matrices porosas pueden ser incorporadas a dispositivos de separación tales como viales de centrífuga, placas de micro titulación cartuchos o jeringas, y, dependiendo de la muestra y de los procedimientos aguas abajo que han de ser ejecutados, uno o más de estos dispositivos pueden proporcionarse en serie. Esos dispositivos pueden ser manipulados manualmente, semiautomáticamente o de una manera completamente automática.
En una de las realizaciones, puede utilizarse una Nycocard™. Cuando el fragmento de ácido nucleico marcado es la secuencia que ha de ser detectada, este fragmento puede, después de unirse por ejemplo a una proteína con afinidad por el marcador, ser atrapado directamente en una membrana de unión a proteínas, retenida en un dispositivo NycoCard. Ese dispositivo incluiría una membrana apropiada con una almohadilla absorbente tal como papel de celulosa, colocado en uno de los lados para aumentar el paso de la muestra líquida a través de la membrana. En una de las realizaciones, una lámina impermeable puede colocarse sobre el otro lado de la membrana y puede llevar orificios que permitan aplicar las muestras a la membrana en el caso en el que se tengan que analizar múltiples muestras. Cuando las secuencias marcadas son las que han de ser eliminadas, y se han de recoger los ácidos nucleicos no marcados, un filtro de unión a proteínas puede ser utilizado como prefiltro, colocarse sobre un filtro de unión a ácidos nucleicos montado en el dispositivo NycoCard de manera que las moléculas marcadas no deseadas quedan retenidas en el prefiltro, y las moléculas no marcadas deseadas quedan retenidas en el filtro de unión de ácidos
nucleicos.
La matriz puede componerse de diversos materiales conocidos en la técnica para este fin, que incluyen materiales poliméricos, por ejemplo, celulosa, poliestireno, agarosa, látex, que pueden formar derivados o modificarse para proporcionar un medio para capturar el marcador propiamente dicho. Así, por ejemplo, el material puede ser tratado, p. ej., recubriéndolo con una sustancia que tenga afinidad por proteínas. Preferiblemente, la matriz tendrá especificidad por proteínas en comparación con ácidos nucleicos, de manera que las moléculas no marcadas no son retenidas por la matriz. En el invento, el procedimiento de captura incluye una proteína, tanto cuando el marcador es una proteína, como cuando un ligando tiene una pareja de unión que es una proteína que une el ligando a la matriz, y la matriz tiene por lo tanto una naturaleza receptora de proteínas. En la técnica se conocen ejemplos e incluyen matrices conocidas de unión a proteínas, recubiertas por ejemplo con polímeros que tienen una afinidad específica por proteínas, al menos en las condiciones utilizadas. Son particularmente preferidas membranas constituidas por polímeros de unión a proteínas, tales como los descritos en los documentos WO98/23630, EP-0524800 y EP 0580305, por ejemplo, Centriflex^{TM} comercializada por Edge Biosystems, EE.UU.
El método de separación del invento es particularmente conveniente cuando una muestra ha de ser fraccionada, y las moléculas de ácido nucleico no marcadas presentes en la disolución han de ser recogidas para su posterior procesamiento aguas abajo. El método puede sin embargo utilizase también cuando son las moléculas de ácido nucleico marcadas las que han de recogerse para su posterior procesamiento. Cuando las moléculas marcadas son las que han de recogerse para el trabajo aguas abajo, las moléculas necesitarán ser liberadas de la matriz, y dependiendo del método de captura utilizado, pueden necesitar también ser liberadas de la pareja de unión correspondiente al ligando. El método de liberación utilizado puede depender de la naturaleza del ligando, y de su pareja de unión, y del tipo e intensidad de sus fuerzas de unión recíprocas.
Las condiciones de reacción elegidas para la etapa de liberación pueden asimismo seleccionarse de manera que se evite que el ácido nucleico marcado liberado se vuelva a unir a la matriz o a su pareja de unión. En la técnica se conocen ejemplos de esos métodos. Así, por ejemplo, las condiciones químicas o físicas pueden cambiarse de manera que se ayude a la liberación de las moléculas de ácido nucleico marcadas del complejo unido a la matriz. Como ejemplos de métodos químicos se incluyen la alteración de la fuerza iónica o del pH, la adición de agentes quelantes, y el uso de moléculas marcadoras libres que compitan, o de moléculas químicamente relacionadas con ellas, moléculas que incluyen marcadores o restos similares a marcadores, moléculas o iones que cambian la conformación de la pareja de unión y de ese modo disminuyen, eliminan o modifican la interacción entre pareja de unión-ligando, la adición de detergentes o de agentes de disociación, o mediante tratamiento enzimático. Como ejemplos de métodos físicos se incluyen cambios en la temperatura, sonicación, vibración. Puede utilizarse cualquier combinación de estos métodos físicos y químicos.
Dependiendo de la fuerza de la interacción entre el ligando y su pareja de unión, quizá sea posible liberar el ligando o la molécula marcada de la pareja de unión o de la matriz añadiendo ligando en exceso, el cual compite con el DNA marcado y unido al ligando por sitios de anexión a la pareja de unión correspondiente al ligando, o por sitios de unión a la matriz, y el DNA marcado liberado puede luego separarse simplemente mediante lavado. Así, cuando el ligando es fluoresceína, y la pareja de unión es un anticuerpo dirigido contra fluoresceína, el complejo fluoresceína-DNA puede ser liberado de la matriz mediante la adición de fluoresceína libre en la disolución. Cuando sin embargo la interacción ligando-pareja de unión, pareja de unión-matriz, o marcador-matriz es fuerte, la adición de marcador libre no siempre es efectiva para romper la interacción. En este caso, pueden utilizarse otros métodos tales como degradar la pareja de unión, por ejemplo, por medio de pH o de enzimas de manera tal que la pareja de unión se libere de la matriz y/o del ligando. La liberación puede también efectuarse mediante la desorganización de la matriz en una forma a la que no puedan unirse proteínas, tal como por medio de agentes químicos, de manera que el complejo proteína-DNA o el complejo proteína-ligando-DNA se libera, o por medios químicos que rompen la interacción o afectan de alguna otra manera a la afinidad entre proteína y matriz.
El par de unión biotina-estreptavidina es un par en el que existe una interacción particularmente fuerte y por ello no es susceptible a la ruptura por medio de la adición de biotina libre. Así, cuando el ligando es biotina, y el par ligando-DNA marcado es capturado en la matriz por medio de avidina o estreptavidina, el DNA biotinilado no puede ser liberado de la membrana mediante adición de biotina libre. Este método puede utilizarse sin embargo cuando el ligando es un derivado de biotina con una afinidad de unión por estreptavidina menor que la de la biotina, en cuyo caso el par ligando-DNA marcado puede ser liberado de la matriz mediante adición de biotina libre. Esta biotina libre puede competir con el DNA biotinilado por los sitios de unión a estreptavidina y el DNA biotinilado liberado puede simplemente separarse de la matriz mediante lavado.
Dependiendo del ligando utilizado, puede ser necesario incorporar una etapa en la que el DNA marcado que se busca para el procesamiento aguas abajo se libere de su pareja de unión por medio del ligando que sirve para inmovilizar el par ligando-DNA marcado sobre la matriz. Algunos ejemplos incluyen la adición de sustancias químicas o de iones o aplicar condiciones físicas capaces de disminuir la fuerza de unión entre el ligando y su pareja de unión y recoger luego el DNA liberado.
El método del invento puede usarse en varias aplicaciones diferentes, que incluyen usos analíticos, preparativos y diagnósticos, de los que se presentan ejemplos más adelante. Otras aplicaciones se harán evidentes a los expertos en la técnica.
Una aplicación importante del invento es la de cortar y ligar moléculas de DNA, tal como sucede en la separación de los productos particulares resultantes de la digestión con enzimas de restricción, y en la separación de moléculas ligadas de DNA circular de entre otros productos de reacciones de ligación.
Así, una de las aplicaciones del invento consiste en la manipulación de fragmentos de DNA digeridos con enzimas de restricción, en particular cuando un fragmento específico se requiere para su posterior manipulación, fragmento que por ello necesita ser separado de los otros productos de la reacción enzimática. El método de separación permite que una población de moléculas lineales de DNA que están marcadas en uno o en ambos extremos, se separen de las moléculas no marcadas. Las moléculas pueden marcarse durante su síntesis, por ejemplo, usando nucleótidos marcados tales como nucleótidos biotinilados, p. ej., en forma de cebadores biotinilados, o las moléculas pueden marcarse por técnicas enzimáticas mediante métodos de marcaje de los extremos conocidos en la técnica.
Contemplado por lo tanto desde otro aspecto, el presente invento proporciona un método para separar al menos parcialmente una mezcla de fragmentos de DNA digeridos con enzimas de restricción, en el que el material de partida es una molécula de DNA lineal que está marcada o que es capaz de estar marcada en un extremo o cerca de un extremo o en ambos extremos, con una proteína capaz de ser inmovilizada en una matriz, comprendiendo dicho método someter la molécula de DNA a una digestión con enzimas de restricción, seguido de poner la muestra en contacto con una matriz a la que se unen selectivamente proteínas, con lo cual las moléculas marcadas que se originan en un extremo del material de partida son capturadas por la matriz y de este modo son separadas de las moléculas no marcadas.
Este método es particularmente adecuado para separar productos resultantes de la digestión de un DNA producido por PCR debido al modo en el que la síntesis opera. En el método de amplificación de DNA por PCR, se utilizan dos cebadores oligonucleotídicos específicos, uno de ellos es complementario al extremo 5' de la cadena codificadora y por lo tanto se hibrida con dicho extremo, y el otro de ellos es complementario al extremo 5' de la cadena no codificadora y se hibrida con dicho extremo, de manera que en presencia de enzimas DNA-polimerasas apropiadas, puede sintetizarse una copia de longitud completa de la secuencia diana. Esta copia llevará el oligonucleótido cebador incorporado en cada una de las dos cadenas del DNA sintetizado, en el extremo 5' de cada cadena. Esos métodos de síntesis por PCR suelen utilizarse para preparar moléculas o fragmentos de DNA específicos para su posterior manipulación genética, cuando el fragmento de interés específico puede obtenerse mediante corte con una enzima de restricción de un producto de PCR más largo. Como se ha mencionado anteriormente, estas manipulaciones posteriores con frecuencia son ineficaces debido a la presencia en las etapas posteriores, tales como en mezclas de ligación de otros productos procedentes del material digerido con enzimas de restricción tales como productos digeridos parcialmente y moléculas de DNA no digeridas. En las circunstancias en las que existe un fragmento interno del producto de PCR de longitud completa, que es el producto de interés para el procesamiento aguas abajo, los productos secundarios "no deseados" del material digerido con enzimas de restricción incluirán al menos una terminación del producto de PCR de longitud completa, y el método del invento puede usarse para efectuar una separación al menos parcial del producto de interés entre los fragmentos que contienen terminaciones, y moléculas no digeridas, utilizando cebadores marcados, por ejemplo, cebadores biotinilados. De este modo, las moléculas de ácido nucleico marcadas pueden separarse de entre FROM una muestra de ácidos nucleicos, quedando en la disolución una muestra que contiene el fragmento de restricción interno deseado el cual, debido a que no incluye una terminación por ejemplo que incorpora un cebador de PCR, no estará marcado.
Un aspecto más del invento, pertinente a la metodología de la PCR, es la denominada "limpieza" de los productos de la reacción de PCR, es decir, la separación de los productos no deseados que incluyen los productos que son el resultado de una reasociación errónea de los cebadores. Cuanto más largo es el molde de ácido nucleico, mayor puede ser el problema. Este método tiene utilidad cuando existen sitios únicos de enzimas de restricción u otras secuencias escindibles, en los extremos o cerca de los extremos de la muestra de ácido nucleico que ha de ser amplificada en la reacción de PCR.
El método implica el uso de cebadores de PCR que están marcados, o que pueden marcarse con una proteína, y que son complementarios a los extremos de la secuencia que ha de ser amplificada, y que por lo tanto son capaces de hibridarse con el ácido nucleico molde, y que también se solapan sólo parcialmente con cada uno de los sitios de restricción únicos. Con el uso de cebadores que son complementarios y que se hibridan con la secuencia completa de reconocimiento de una enzima de restricción, incluida en el ácido nucleico molde, cada molécula de ácido nucleico producida en la reacción de PCR portará el sitio de reconocimiento de la enzima de restricción independientemente de si el cebador se ha reasociado o no con la secuencia deseada, o de si el producto de PCR es el resultado de una reasociación errónea del cebador. Sin embargo, usando cebadores que se hibridan con solamente parte de un sitio de reconocimiento de una enzima de restricción presente en el molde, es solamente en los productos de PCR que derivan de la reasociación buscada, en los que el sitio de reconocimiento de la enzima de restricción es reconstituido en el producto de PCR. Así, usando cebadores marcados, o cebadores que pueden marcarse, es posible realizar la limpieza de los productos de la reacción de PCR realizando la reacción de PCR, y posteriormente escindiendo o digiriendo los productos de la reacción de PCR con las enzimas de restricción particulares, específicas para dichos sitios únicos de reconocimiento de enzimas de restricción. Después de la digestión con las enzimas de restricción, sólo los productos de PCR correctos que son escindidos y que, debido a que la escisión da como resultado la separación del cebador y del marcador, pueden ser separados de los productos de extensión de PCR no deseados los cuales, al no estar cortados por las enzimas de restricción, aún conservan el marcador.
Contemplado así desde uno de los aspectos, el presente invento proporciona un método para separar al menos parcialmente los productos correctos y deseados de una amplificación por PCR, de los productos de PCR que son el resultado de una reasociación incorrecta de un cebador de PCR con el molde, en el que la molécula del ácido nucleico molde comprende un sitio de reconocimiento único de una enzima de restricción situado en un extremo o hacia un extremo del molde, y en el que un cebador de PCR que está marcado o que es capaz de ser marcado con una proteína, es complementario a una secuencia presente en el molde que se extiende parcialmente dentro del sitio de restricción único, método que comprende amplificar el molde por medio de una PCR, digerir los productos de la PCR con la enzima de restricción específica para dicho sitio de reconocimiento único de una enzima de restricción, y poner en contacto el producto resultante con una matriz capaz de unirse a proteínas, con lo que las moléculas de ácido nucleico marcadas son capturadas por la matriz y de este modo se separan de las moléculas no marcadas.
En este contexto, sitio único para una enzima de restricción de refiere a enzimas de restricción que tienen solamente un sitio de reconocimiento único dentro de la molécula del ácido nucleico molde, pero también incluye el caso especial en el que el mismo sitio de restricción puede estar presente en o hacia cada uno de los extremos del molde.
En una de las realizaciones, la molécula de ácido nucleico molde que ha de ser amplificada por PCR incorpora solamente un sitio de restricción único e individual situado en o cerca de sólo uno de los extremos. Cuando los productos de la reacción se tratan con esta enzima, se obtiene como resultado una "limpieza" parcial de los productos de la PCR, el grado de la cual depende, al menos en parte, de la medida en la que el cebador que se reasocia con la región del molde que incluye este sitio único, es responsable de una reasociación incorrecta. En esta realización, el cebador que se extiende dentro del sitio único para la enzima de restricción es el que estará marcado o tendrá capacidad para marcarse. En una realización preferida, el molde que ha de ser amplificado por PCR incorpora un sitio único para una enzima de restricción, situado en o cerca de cada uno de los extremos. Estos sitios pueden ser sitios para la misma enzima de restricción, es decir, una enzima de restricción que corta el molde y las copias de PCR dos veces, una vez en cada extremo, o pueden ser sitios para enzimas de restricción diferentes, con la condición de que cada una de dichas enzimas tenga solamente un sitio de reconocimiento único dentro del molde, y que los dos sitios estén uno en cada extremo del molde.
En este método, la localización del sitio de restricción único, o de cada uno de los sitios de restricción únicos, en relación con la terminación del molde de ácido nucleico, depende, al menos en parte, de la enzima de restricción particular, ya que las diferentes enzimas tienen distancias mínimas diferentes desde la terminación para un corte de restricción eficiente. Estas preferencias se conocen en la técnica y se encuentran descritas por ejemplo en los catálogos de fabricantes de enzimas de restricción. En general, el sitio de restricción estará situado a una distancia de al menos a una base de la terminación. La elección de la enzima y su localización pueden ser determinadas fácilmente por alguien experto, basándose en el conocimiento de la técnica y conforme a la información aportada por el fabricante. En general, el sitio de restricción estará localizado al menos a la distancia mínima de la terminación para obtener un corte eficiente por parte de la enzima correspondiente, aunque el sitio puede estar situado bastante alejado de la terminación. Ejemplos de estas distancias mínimas son de al menos a una base de la terminación para BamHI y de al menos a seis bases de la terminación para NdeI. Las distancias mínimas pueden establecerse a partir de los catálogos publicados de los suministradores de las enzimas de restricción, por ejemplo, el catálogo de 1.999 de New Englansd Biolabs, y a partir de Moreira y Noren, Biotechniques 19, 56-59 (1999).
Así, usando o construyendo por medio de técnicas de DNA recombinante conocidas en la técnica, un molde que comprende un sitio único para una enzima de restricción, situado en cada extremo o cerca de cada extremo, es posible separar los productos secundarios no deseados de una PCR que son el resultado de una reasociación errónea de los cebadores de PCR en localizaciones del molde diferentes de las pretendidas. Cuando los dos cebadores están marcados o tienen capacidad para marcarse, todos los productos de la PCR inicialmente estarán marcados en ambos extremos. Sometiendo los productos de la PCR a digestión con enzimas de restricción, con las enzimas de restricción anteriormente mencionadas que tienen sitios de reconocimiento únicos situados cerca de cada uno de los extremos del molde, ya sea de manera simultánea o secuencial, las moléculas que no estén cortadas, o que estén cortadas en sólo uno de los extremos, conservarán el marcador, al igual que lo harán las terminaciones del producto de PCR correcto que han sido creado mediante el corte con las enzimas de restricción; estas moléculas pueden ser separadas del producto deseado el cual tendrá los dos cebadores retirados y por lo tanto ya no contendrá un marcador o un resto con capacidad para marcarse. Esto tiene la ventaja de que se evita el gasto de grandes cantidades de tiempo y de materiales para el ajuste fino de la reacción de PCR, como se necesita en la electroforesis en gel o en otros métodos de separación de productos de PCR por tamaños. Una "limpieza" al menos parcial puede conseguirse sin embargo cuando sólo uno de los dos cebadores de PCR está marcado o tiene capacidad para marcarse.
Convenientemente, el ligando puede ser biotina, en cuyo caso los productos de la PCR, antes o después de la digestión con enzimas de restricción, se ponen en contacto con estreptavidina, y después las moléculas marcadas que llevan estreptavidina unida, se separan de las moléculas no marcadas mediante matrices a las que se unen proteínas.
En esta realización particular del invento, el marcador puede estar unido a cualquier posición del cebador, siempre y cuando el extremo 3' del cebador esté disponible para la extensión por acción de la polimerasa de la PCR. Convenientemente, el marcador puede estar añadido al extremo 5' del cebador, ya que la adición de un marcador en esta posición no supone dificultades para la síntesis. Además, sin desear estar sujeto a una teoría, se cree que un marcador situado en el extremo 5' del cebador será menos probable que interfiera con la actividad de la polimerasa de la PCR, y también que puede estar mejor situado para su captura por cualquiera de los métodos de captura que aquí se
describen.
A continuación se muestra un ejemplo:
5'-ttactggatcctag- - - - - -ttacgtacattaatcgg-3'
3'-aaatgacctaggatc- - - - - -aatgcatgtaattagcc-5'
Este fragmento tiene dos sitios de restricción únicos, uno para BamHI situado a la "izquierda" (ggatcc), y otro para AsnI situado a la "derecha" (attaat). Para amplificar este fragmento de la manera usual, normalmente se preparan dos marcadores, opcionalmente marcados con biotinas en sus extremos 5', como se ilustra a continuación:
Cebador BamHI: 5'-biotina-tttactggatcctag-3'
Cebador AsnI: 5'-biotina-ccgattaatgtacgtaa-3'
Usando estos cebadores en una reacción de PCR se producirán típicamente varios productos, principalmente debidos a una reasociación errónea de los cebadores durante la PCR.
Los cebadores BamHI y AsnI implementan totalmente en sus secuencias las secuencias nucleicas de reconocimiento. Esto tiene la consecuencia de que cada fragmento de DNA producido en la reacción de PCR por estos cebadores, tiene el sitio de reconocimiento de las enzimas de restricción BamHI y AsnI. Todos los fragmentos producidos en la reacción de PCR podrán ser cortados con la enzima BamHI y con la enzima AsnI, tanto los fragmentos correctos (es decir, los deseados) como los productos secundarios.
Sin embargo, mediante el uso de cebadores ligeramente más cortos en esta realización del presente invento, se pueden separar de manera muy eficiente todos los productos secundarios no deseados.
Ejemplos de cebadores que pueden usarse son los siguientes:
Cebador BamHI corto: 5'-biotin-tttactgga-3'
Cebador AsnI corto: 5'-biotina-ccgatt-3'
Estos cebadores se solapan sólo parcialmente con los sitios de reconocimiento de las enzimas de restricción. Por lo tanto, solamente mediante la reasociación con los sitios nucleicos pretendidos, estos cebadores formarán los sitios de reconocimiento completos para las enzimas. Como consecuencia de ello, sólo los fragmentos correctos o deseados, producidos en la reacción de PCR, pueden ser cortados por ambas enzimas de restricción.
Los cuatro grupos posibles de productos de PCR que se obtendrán como resultado del uso de esos cebadores (B = marcador biotina) son los siguientes:
5'-Btttactggatcctag- - - - - -ttacgtacattaatcgg-3'
3'- aaatgacctaggatc- - - - - -aatgcatgtaattagccB-5'
(Fragmento correcto - dos sitios de restricción)
5'-Btttactggtag- - - - - -ttacgtacattaatcgg-3'
3'- aaatgaccatc- - - - - -aatgcatgtaattagccB-5'
(Fragmento incorrecto-sólo un sitio de restricción (AsnI))
\vskip1.000000\baselineskip
5'-Btttactggatcctag- - - - - -ttacgtacaatcgg-3'
3'- aaatgacctaggatc- - - - - -aatgcatgttagccB-5'
(Fragmento incorrecto-sólo un sitio de restricción (BamHI))
\vskip1.000000\baselineskip
5'-Btttactggatag- - - - - -ttacgtacaatcgg-3'
3'- aaatgacctatc- - - - - -aatgcatgttagccB-5'
(Fragmento incorrecto - No hay sitios de restricción)
\vskip1.000000\baselineskip
El corte con AsnI y BamHI proporciona los siguientes fragmentos:
\vskip1.000000\baselineskip
5'-Btttactg gatcctag- - - - - -ttacgtaca ttaatcgg-3'
3'- aaatgacctag gatc- - - - - -aatgcatgtaatt agccB-5'
(Fragmento correcto - dos sitios de restricción - las dos biotinas separadas)
\vskip1.000000\baselineskip
5'-Btttactggtag- - - - - -ttacgtaca ttaatcgg-3'
3'- aaatgaccatc- - - - - -aatgcatgtaatt agccB-5'
(Fragmento incorrecto-sólo un sitio de restricción (AsnI) - sólo una de las biotinas separada)
\vskip1.000000\baselineskip
5'-Btttactg gatcctag- - - - - -ttacgtacaatcgg-3'
3'- aaatgacctag gatc- - - - - -aatgcatgttagccB-5'
(Fragmento incorrecto-sólo un sitio de restricción (BamHI) - sólo una de las biotinas separada)
\vskip1.000000\baselineskip
5'-Btttactggatag- - - - - -ttacgtacaatcgg-3'
3'- aaatgacctatc- - - - - -aatgcatgttagccB-5'
(Fragmento incorrecto - ningún sitio de restricción - ninguna biotina separada debido a la ausencia de cortes de restricción)
En una mezcla de todos los fragmentos anteriormente mencionados, sólo uno de los fragmentos, el fragmento correcto, estará sin llevar unida biotina. Añadiendo estreptavidina a los fragmentos, y poniendo en contacto los productos de la reacción con una matriz de unión a proteínas, por ejemplo mediante un pase a través de una membrana Centriflex, sólo el fragmento correcto no será secuestrado, y en el caso de utilizar una membrana Centriflex, el fragmento correcto atravesará la membrana sin obstáculos.
La diferencia entre usar los cebadores cortos (es decir, los cebadores que no se extienden de manera completa dentro del sitio para la enzima de restricción contenido en el molde) y los cebadores largos (que incorporan el sitio completo para la enzima de restricción) es evidente, ya que, en el caso de los cebadores largos, todos los fragmentos, incluso los fragmentos erróneos, llevarían introducidos los sitios de restricción para AsnI y BamHI. En ese caso, no sería posible distinguir entre productos correctos y productos erróneos de la reacción de PCR.
El método puede también utilizarse para separar productos de la digestión con enzimas de restricción de moléculas de DNA que o son lineares o han sido linearizadas y que están marcadas en uno o ambos extremos por medio de métodos de marcaje de los extremos tales como los que se conocen en la técnica, por ejemplo, por medio de enzimas. Uno de los ejemplos lo constituye la enzima desoxinucleotidiltransferasa terminal (TdT) que puede utilizarse sola o junto con la DNA polimerasa I (fragmento de Klenow) para añadir nucleótidos marcados, por ejemplo, nucleótidos biotinilados o nucleótidos marcados con fluoresceína o digoxigenina, a los grupos hidroxilo libres situados en los extremos 3'de una molécula lineal de DNA, añadiendo de este modo un ligando a los extremos 3'. En el caso en el que el DNA lineal que ha de ser sometido a digestión con enzimas de restricción sea de extremos romos o tenga extremos 3' protuberantes, sólo se necesita TdT para marcar los extremos 3'. Sin embargo cuando el extremo 5' es el protuberante, y el extremo 3' está mellado, una enzima tal como el fragmento de Klenow se necesita de manera adicional para rellenar el extremo mellado y para aumentar la eficiencia.
Cuando el ligando es biotina, la muestra puede primero ponerse en contacto con estreptavidina en la disolución, y después la muestra se hace pasar a través de una membrana de unión a proteínas que se une a la estreptavidina y con ello retiene las moléculas de ácido nucleico marcadas y no deseadas, dejando al fragmento deseado en la disolución y en una forma adecuada para su posterior manipulación.
Esto representa un avance importante sobre los procedimientos actuales que son laboriosos y que implican la separación de la mezcla resultante de la digestión con enzimas de restricción en un gel de agarosa, la visualización de los fragmentos mediante tinción con bromuro de etidio, la escisión del fragmento de DNA de interés y su purificación a partir del gel, lo cual es un procedimiento mucho más largo y porque esto implica un mayor riesgo de exposición del DNA a la actividad de nucleasa.
Una aplicación adicional más de este aspecto del invento, está en el campo de la digestión con enzimas de restricción de productos amplificados por PCR. Así, existen circunstancias en las que es conveniente llevar a cabo una digestión parcial con enzimas de digestión, es decir, con cantidades limitadas de enzima. Las preparaciones de enzimas de restricción a menudo contienen pequeñas cantidades de endonucleasa que son capaces de degradar los extremos del DNA recién cortado, el cual puede reducir la calidad de los fragmentos de interés, y producir dificultades en posteriores etapas de manipulación, tales como ligar el DNA, por ejemplo dentro de un vector de expresión. Esos problemas causados por nucleasas contaminantes pueden sin embargo minimizarse utilizando cantidades límite de enzima de restricción y disminuyendo los períodos de incubación. Un inconveniente sin embargo es que el producto digerido resultante incluirá productos secundarios no deseados de la digestión con una enzima de restricción, tales como moléculas cortadas sólo parcialmente o moléculas no cortadas. El método del presente invento permite sin embargo aprovechar una digestión parcial, sintetizando por PCR el sustrato de la digestión con la enzima de restricción, utilizando un DNA cebador marcado, p. ej. biotinilado, de manera que cualquier molécula o fragmento de DNA que incluya al menos una terminación (tales como moléculas no digeridas, o moléculas parcialmente digeridas) puede ser retirada o secuestrada por medio de una matriz apropiada, quedando una disolución enriquecida en el fragmento de restricción interno de interés.
Otra aplicación del método de separación basado en marcadores del invento es una PCR diagnóstica. Se conoce el uso de la PCR para detectar mutaciones que incluyen mutaciones que difieren en incluso sólo un único nucleótido tal como sucede en la enfermedad de las células falciformes. En algunos casos, el tamaño de un fragmento de PCR será indicativo de la presencia o ausencia de una mutación particular. Normalmente, sin embargo, las técnicas diagnósticas de PCR generalmente requieren técnicas adicionales después de la PCR inicial realizada sobre la muestra del paciente, con el fin de diagnosticar si la mutación está o no presente en la muestra, por ejemplo, un análisis de restricción y/o secuenciación. Estos análisis pueden ser costosos ya que suelen requerir productos químicos caros tales como ácidos péptidonucleicos y que también son largos de duración, contribuyendo a un retraso en la determinación del estado médico del paciente. Los métodos existentes se han simplificado de manera considerable utilizando el método de captura de marcadores del invento por medio de reacciones de PCR que usan al menos uno de los cebadores de la PCR marcado, o que tiene capacidad para marcarse. Utilizando cebadores marcados no se necesitan etapas adicionales, y la presencia de una mutación puede detectarse usando la etapa de amplificación por PCR sola.
Así, el método del invento, cuando se aplica a una PCR diagnóstica, es capaz de reemplazar la necesidad de secuenciar los productos de la PCR de acuerdo con los métodos diagnósticos actuales. En esta realización, el cebador encargado de la reasociación y extensión por el extremo 3' de la muestra está marcado, o tiene capacidad para marcarse, de manera tal que conserva un grupo OH en 3' y puede por ello extenderse en una reacción de PCR, y es específico del ácido nucleico mutante; en otras palabras, se hibrida con la secuencia del ácido nucleico que está alterada en esa enfermedad. De manera alternativa, el cebador 3' puede hibridarse con la secuencia normal del ácido nucleico.
En una de las realizaciones, el método puede utilizarse para detectar mutaciones de una sola base, en cuyo caso el extremo 3' del cebador corresponde a la base mutada. En el caso de mutaciones en múltiples bases, el extremo 3' del cebador puede corresponder a una cualquiera de las bases mutadas.
Así, cuando la mutación es conocida, en una de las versiones de esta realización, en la muestra de DNA se llevan a cabo dos reacciones de PCR, cada una de las cuales usa el mismo cebador para el extremo 5' de la muestra, pero un cebador 3' diferente, uno que se hibrida con el DNA "normal" y es capaz de producir un producto de extensión que corresponde al DNA "normal", y otro que es complementario a la secuencia de ácido nucleico mutante y es específico para ella, y es por lo tanto capaz de producir un producto de extensión que corresponde a la secuencia mutante. En el caso de la PCR de una diana mutada utilizando el cebador marcado, apropiado para el DNA mutado, los productos de la amplificación por PCR incorporarán el marcador, mientras que en la reacción de PCR que usa el cebador "normal" habrá una base desapareada en el extremo 3' del cebador, la cual será separada por la polimerasa de la PCR, tal como la Taq polimerasa, y, si la base en 3' estuviera marcada, su separación retirará el marcador o el resto que puede marcarse que el cebador porte. El producto de la PCR por lo tanto no incorporará el marcador. Por ello, sólo los productos de la reacción de PCR del ácido nucleico mutante que se forman por extensión del cebador mutante son los que están marcados, o los que pueden marcarse, y son los que pueden ser detectados utilizando cualquiera de los métodos anteriormente mencionados.
La situación contraria surge en el caso de la extensión por PCR del DNA "normal" que no contiene la mutación específica que ha de ser detectada. En este caso, los productos de la PCR obtenidos usando el cebador mutante en el que el nucleótido en 3' del cebador está desapareado y por consiguiente ha sido retirado junto con el marcador que no puede por ello ser detectado en el producto de reacción de longitud completa, mientras que el producto obtenido usando el cebador "normal" incluirá el marcador o el resto que puede marcarse, son los que serán luego detectados.
En esta realización, el marcador o el resto que puede marcarse se encuentra en la base en 3', o está unido en o a la base en 3', de tal manera que el OH en 3' todavía puede ser extendido por acción de la polimerasa de la PCR.
Contemplado así desde un aspecto más, el presente invento proporciona un método para una PCR diagnóstica en el que una muestra a ensayar se somete a reacciones de PCR de manera independiente, muestra en la que la mutación, en caso de estar presente, se encuentra en la secuencia complementaria a la del cebador en 3', una primera reacción de PCR que usa un cebador en 3' complementario al ácido nucleico diana normal, y una segunda reacción de PCR que usa un cebador en 3' complementario a la diana mutante, y en la que el nucleótido en 3' del cebador mutante corresponde a uno de los nucleótidos que está mutado en el ácido nucleico mutante, portando cada uno de dichos cebadores en 3' un marcador o siendo capaces de estar marcados en el nucleótido en 3' del cebador, y en la que se detecta la presencia o ausencia del marcador en los productos de la reacción de PCR.
En la más sencilla de las realizaciones, los cebadores en 3' se encuentran marcados, por ejemplo con biotina, la cual puede ser detectada usando cualquiera de los métodos que aquí se describen. Ejemplos de métodos para detectar productos de PCR biotinilados incluyen la adición de estreptavidina y la filtración a través de una membrana de unión a proteínas en la que el DNA retenido es detectado, y un pase a través de una membrana como por ejemplo una membrana de nitrocelulosa, por ejemplo, como en el sistema NycoCard™ anteriormente mencionado.
En un método alternativo, a los productos de la reacción de PCR puede añadirse estreptavidina y la mezcla se hace pasar a través de una membrana Centriflex. Si no hay DNA detectable en el material que pasa a través de la membrana, el DNA habrá sido retenido en la membrana y por lo tanto habrá sido biotinilado.
En las circunstancias en las que el cebador no está marcado de por sí, sino que tiene capacidad para marcarse, se necesitará añadir el marcador antes de la etapa de detección.
En una realización alternativa, puede llevarse a cabo una única reacción de PCR usando un cebador marcado, específico o de la secuencia normal o de la secuencia mutada, siendo la presencia del marcador en los productos de la PCR indicativa de la presencia o ausencia de la mutación, dependiendo de si el cebador es específico para el DNA normal o para el DNA mutante. Así, si el cebador marcado es específico para el DNA normal, el producto de la PCR con DNA normal estará marcado, mientras que con el DNA mutante no lo estará, y si el cebador marcado es específico para el DNA mutante, el producto de la PCR con el DNA normal no estará marcado mientras que los productos de la PCR con un DNA mutante estarán marcados y por lo tanto serán detectables. Así pues, aunque llevar a cabo reacciones de PCR duplicadas proporciona más seguridad, una reacción de PCR única proporciona al menos una indicación de la presencia o ausencia de la mutación.
Así contemplado desde un aspecto más, el presente invento proporciona un método de PCR diagnóstica de una mutación presente en una molécula de ácido nucleico, en el que se detecta la presencia o ausencia de una mutación en una muestra de ácido nucleico, en el que se utiliza un cebador en 3' específico o para el ácido nucleico normal o para el ácido nucleico mutante, en el que dicho cebador es complementario a una región del ácido nucleico en la que existe una diferencia de bases entre el DNA normal y el DNA mutado, correspondiendo la terminación 3' del cebador a la posición en la muestra en la que existe una diferencia entre el DNA normal y el DNA mutante, estando el cebador marcado o teniendo capacidad para marcarse, por medio de lo cual se detecta la presencia o ausencia del marcador en el producto de la PCR.
También es posible llevar a cabo al menos un diagnóstico preliminar utilizando un cebador en 3' que es específico para el DNA normal.
El presente invento por consiguiente proporciona desde un punto de vista adicional un método para una PCR diagnóstica, en el que una muestra a ensayar se somete a PCR con cebadores complementarios al DNA diana normal, en el que el cebador encargado de la extensión en el extremo 3' del DNA diana se reasocia con una secuencia en la que el nucleótido en 3' está mutado en el DNA mutante, portando ese cebador en 3' un marcador o teniendo capacidad para marcarse junto a, o en, el nucleótido en 3', y en el que se detecta la presencia del marcador en el producto de la reacción de PCR.
De este modo, la ausencia de un marcador detectable en el producto indica que la muestra no contiene DNA normal.
Un ejemplo de detección de una mutación de una sola base es el siguiente:
En este caso, el extremo 3' del cebador encargado de la extensión del extremo 3' de la muestra, se alinea con el DNA mutado presente en el molde.
Supóngase el caso de que se tenga que determinar si un paciente presenta una mutación genética normal o una mutación genética anormal.
Una secuencia de DNA normal del gen en cuestión es la siguiente:
5'-ccccatg- - - - - - - - -atgacctaggAccaccy-3'
3'-ggggtac- - - - - - - - -tactggatccTggtgga-5'
El DNA del paciente se asemeja a éste:
5'-ccccatg- - - - - - - - -atgacctaggCccacct-3'
3'-ggggtac- - - - - - - - -tactggatccGggtgga-5'
Está presente una mutación. No es necesario conocer el DNA del paciente para realizar el ensayo. Sólo se necesita conocer el estado normal con el fin de diagnosticar la mutación.
Se necesitan cebadores para realizar la PCR, un cebador que se reasocie en el área del extremo 5', y otro cebador que se reasocie en el área del extremo 3'. El cebador del extremo 5' será idéntico en ambos pacientes, con la mutación o sin la mutación, y será como el siguiente:
Cebador n.º 1: 5'-ccccatg-3'
En el caso del otro área en 3', se necesitaría un cebador que se empareje con el DNA de la situación normal, y sería como el siguiente:
Cebador n.º 2 normal: 5'-aggtggt-3'
Si se conoce la mutación, puede construirse un cebador para ella, y será como el siguiente:
Cebador n.º 2 anormal: 5'-aggtggg-3'
Con el fin de que el método funcione, el último nucleótido del extremo 3' está marcado con una biotina, quedándole aún capacidad para extenderse en una reacción de PCR (teniendo un grupo OH libre en el extremo 3').
Los cebadores del extremo 3' serán ahora como éstos:
Cebador n.º 2 normal: 5'-aggtggtB-3'
Cebador n.º 2 anormal: 5'-aggtgggB-3'
(B = biotina)
Los productos de la PCR obtenidos como resultado de usar estos cebadores sobre un DNA normal serán:
1
(Cebador n.º1 + Cebador n.º 2 anormal)
5'-ccccatg- - - - - -atgacctaggAccacct-3'
3'-ggggtac- - - - - -tactggatccTggtgga-5' + biotina
\vskip1.000000\baselineskip
Solamente el uso del cebador n.º 2 normal sobre el DNA molde normal dará productos de PCR biotinilados. Las enzimas de la PCR separarán la biotina del cebador n.º 2 anormal, obteniéndose un producto no biotinilado.
Los productos de PCR obtenidos con el uso de estos cebadores sobre DNA anormal serán:
2
(Cebador n.º1 + Cebador n.º 2 normal)
5'-ccccatg- - - - - -atgacctaggCccacct-3'
3'-ggggtac- - - - - -tactggatccGggtgga-5'
Como en el caso anterior, pero justo el contrario.
La presencia de producto biotinilado mostrará si el paciente presenta o no una mutación.
Un ejemplo específico de una PCR diagnóstica de la anemia de células falciformes causada por una mutación de una sola base es el siguiente: En este ejemplo, se indica que el cebador está marcado con biotina. Éste es sólo un ejemplo de uno de los ligandos que pueden utilizarse y no debe interpretarse que limite este ejemplo ilustrativo; pueden utilizarse otros ligandos.
La hemoglobina A1 humana normal tiene una secuencia de DNA correspondiente al primer exón (parte codificadora) del gen de la beta-globina de haplotipo A1 que comienza como se muestra a continuación:
DNA normal:
atg gtg cac ctg act cct gag gag aag tct gcc gtt act gcc
ctg tgg ggc aag gtg aac gtg gat gaa gtt ggt ggt gag gcc
ctg ggc agg...
que se traduce en la
Secuencia de aminoácidos normal:
MVHLTPEEKSAVTALWGKVNVDEVGGEALG...
En el caso de la enfermedad humana de la anemia de células falciformes, la secuencia de DNA del primer exón del gen de la beta-globina de haplotipo S comienza como se muestra a continuación:
DNA de la enfermedad de las células falciformes:
atg gtg cac ctg act cct gtg gag aag tct gcc gtt act gcc
ctg tgg ggc aag gtg aac gtg gat gaa gtt ggt ggt gag gcc
ctg ggc agg...
que se traduce en la
Secuencia de aminoácidos de la enfermedad de las células falciformes:
MVHLTPVEKSAVTALWGKVNVDEVGGEALG...
La comparación del DNA normal con el DNA de la enfermedad de las células falciformes revela que una sustitución de una sola base es suficiente para transformar el gen normal de la hemoglobina en un gen anormal de la hemoglobina anormal, que se sabe que es causante de la grave enfermedad de la anemia de células falciformes. El codón gag está mutado a un codón gtg, causando una sustitución del aminoácido ácido ácido glutámico con el aminoácido no polar valina.
Para detectar la presencia o ausencia de esta mutación, se aísla el DNA genómico, y en caso necesario, se amplifica por PCR antes de la PCR diagnóstica de la manera convencional.
Los cebadores utilizados para la amplificación de parte del gen de la cadena beta de la hemoglobina están basados en la secuencia de DNA proporcionada por el programa de búsqueda de EMBEL cuando la búsqueda se hace en el identificador único EMBL-ID: HSBETGLOB'.
El gen de la cadena beta de la hemoglobina (que se muestra más adelante en forma de tripletes separados) está precedido por la secuencia de un intrón (intrón 1) y va seguido por otra secuencia (intrón 2) y ambos intrones aparecen indicados más adelante en letra itálica.
Una parte de los intrones (la parte subrayada) se utiliza para la construcción de cebadores (véase más adelante).
3
Los intrones no codificadores están flanqueando la porción codificadora del gen; el segundo intrón está separando la secuencia codificadora de la siguiente parte de la secuencia codificadora más en dirección aguas abajo.
Para amplificar la primera parte codificadora del gen para la PCR diagnóstica posterior, pueden utilizarse dos cebadores, por ejemplo, que se reasocien a los intrones 1 y 2 respectivamente. Las secuencias de reasociación de los cebadores están indicadas en letras itálicas subrayadas.
Cebador 1: 5'-ctagcaacctcaaacagacacc-3'
Cebador 2: 5'-gtaaccttgataccaacctgcc-3'
Estos cebadores se utilizan sólo en la PCR de amplificación para obtener más DNA molde para el procedimiento de la PCR diagnóstica, y por ello no necesitan estar biotinilados ni modificados en modo alguno.
Para la PCR diagnóstica, ya que se conoce la naturaleza de la mutación, una mutación de una sola base en el codón 6 del exón, se diseñan tres cebadores, que corresponden al DNA normal y al DNA anormal (de la anemia de células falciformes):
Cebador correspondiente a la hemoglobina normal:
Cebador N: 5'-atg gtg cac ctg act cct ga-biotina-OH
Cebador correspondiente a la hemoglobina de la enfermedad de las células falciformes:
Cebador S: 5'-atg gtg cac ctg act cct gt-biotina-OH
Cebador correspondiente al otro extremo del gen:
Cebador 2: 5'-gtaaccttgataccaacctgcc-3'
(Este puede ser el mismo cebador utilizado en la etapa de amplificación: no está marcado ni modificado)
A continuación se realiza el ensayo diagnóstico con los cebadores de la etapa 1 y la muestra o la muestra amplificada por PCR.
Se realizan dos reacciones de PCR:
a) una PCR que utiliza el Cebador N + Cebador 2;
b) una PCR que utiliza el Cebador S + Cebador 2;
Los productos de PCR resultantes de las reacciones de PCR a) y b) se estudian luego con respecto a la presencia de biotina de la manera previamente descrita.
Los resultados obtenidos del estudio de las dos reacciones de PCR a) y b) pueden presentar una de cuatro posibles consecuencias que se ilustran a continuación.
4
El método puede también utilizarse para el diagnóstico de mutaciones de múltiples bases, como se ilustra más adelante, también en el caso de la anemia de células falciformes.
Una mutación de múltiples bases (letras en negrilla y subrayadas) en el primer exón del gen de la beta-globina, aparece en la secuencia de DNA de la siguiente manera:
atg gtg cac ctg act cct aac gag aag tct gcc gtt act gcc
ctg tgg ggc aag gtg aac gtg gat gaa gtt ggt ggt gag gcc
ctg ggc agg...
secuencia que se traduce en la secuencia de aminoácidos:
MVHLTPNEKSAVTALWGKVNDEVGGEALG...
Un cebador, tal como el Cebador N anteriormente mencionado, puede utilizarse para revelar si el gen está presente. El diagnóstico de la presencia potencial de una mutación requiere un cebador capaz de detectar la mutación.
Uno cebador que puede utilizarse se corresponde con la hemoglobina mutada de la siguiente manera:
5'-atggtgcacctgactcctaac-biotina-OH.
Este cebador identificaría de manera exacta la mutación "acc" en el codón 6.
Otro cebador que puede utilizarse es:
5'-atggtgcacctgactccta-biotina-OH
Este cebador puede utilizarse para identificar todas las mutaciones en el codón 6 que comienzan con una base "a".
Las reacciones de PCR se realizan con el Cebador N normal, y con uno o más cebadores que se corresponden con la secuencia mutada (es decir, son complementarios a ella).
Este método puede utilizarse para cualquier mutación presente en una secuencia conocida del gen normal y la mutación en la hemoglobina de las células falciformes se aporta como uno de los ejemplos. Cuando se conocen las mutaciones comunes observadas en la población, pueden utilizarse varios cebadores para localizar de manera exacta la mutación que está presente.
Otra utilidad del método del invento reside en cortar y separar fragmentos de DNA de interés procedentes de una molécula recombinante para su posterior manipulación. Un aspecto relacionado reside en cortar y separar un DNA vector para usarlo en posteriores manipulaciones de clonación. Se necesitan métodos eficientes para obtener fragmentos linearizados de un DNA vector, que tengan una elevada calidad para utilizarlos en procedimientos de clonación o en otros procedimientos biotecnológicos. Como ya se conoce en la técnica, los vectores tales como plásmidos y virus comprenden, además de los elementos apropiados para controlar la replicación y la transcripción, uno o más sitios de clonación para la incorporación de un DNA heterólogo para su propagación o expresión. De la misma manera que las enzimas de restricción se utilizan para insertar un fragmento heterólogo en un vector de clonación para preparar un vector recombinante, las enzimas de restricción también se utilizan para cortar el fragmento heterólogo para su posterior manipulación genética, o para cortar el elemento vector para su posterior manipulación. Esos vectores comprenden moléculas circulares de DNA. Éstas moléculas incluyen un fragmento de relleno, con frecuencia un adaptador de policlonación, y un fragmento que incluye las secuencias de control anteriormente mencionadas. En uno de los métodos, un vector recombinante que lleva un fragmento de DNA heterólogo insertado, se digiere con una enzima de restricción con el fin de cortar el fragmento de DNA insertado, lo que produce una mezcla de moléculas lineales de DNA, que incluyen el fragmento de relleno del propio vector, el inserto, y también moléculas de DNA recombinante parcialmente cortadas. El método del invento puede utilizarse cuando el elemento de relleno (o el vector) contenido en la molécula de DNA recombinante de la que el elemento heterólogo ha de ser cortado incluye una secuencia específica de reconocimiento de proteínas, tal como la secuencia de reconocimiento de AP-1. En el método del invento, los productos de la reacción de digestión con enzimas de restricción se ponen en contacto en la disolución con la proteína para la que es específica el ácido nucleico, AP-1 en este caso, y a continuación se hace pasar a través de una membrana selectiva para proteínas que secuestrará aquellas moléculas de ácido nucleico a las que se ha unido AP-1, quedando en la disolución sólo aquellas moléculas de DNA que incluyen el DNA heterólogo insertado, y por no contienen una secuencia de reconocimiento de AP-1.
En otra realización del invento, el método puede utilizarse para separar la forma linearizada del vector propiamente dicho para su posterior manipulación, es decir, de un vector que ha sido linearizado mediante digestión con una enzima de restricción y en el que se ha cortado el fragmento de relleno. Ese fragmento del vector puede luego utilizarse para insertar y ligar un DNA heterólogo, el cual, después de la circularización, puede utilizarse para posteriores aplicaciones aguas abajo, tales como la transformación de células hospedadoras.
En uno de los ejemplos, el fragmento de relleno es, o incluye, un adaptador de policlonación constituido por sitios únicos de reconocimiento para enzimas de restricción. El vector se corta con una de estas enzimas lo que hará que la molécula se linearice. La molécula lineal puede luego marcarse en los extremos utilizando las técnicas enzimáticas anteriormente mencionadas. Preferiblemente, para facilidad de una posterior manipulación, la enzima de corte única es una enzima que crea un extremo protuberante en 3'. En este caso, la molécula lineal del vector puede marcarse en los extremos mediante la adición de nucleótidos marcados tales como, nucleótidos biotinilados por medio de TdT. Si la enzima crea un extremo protuberante en 5', el fragmento de Klenow se necesitará de manera adicional para extender las terminaciones en 3'. Se ha encontrado que este método es eficiente, en particular cuando están implicadas grandes cantidades de DNA, mayores que 10 \mug. Teniendo marcado el vector linearizado, éste se somete luego a una nueva digestión con enzimas de restricción, con una o más enzimas de restricción, preferiblemente con enzimas que tienen sitios únicos dentro del fragmento de relleno, uno a cada lado del sitio de corte original. De este modo, los fragmentos de los extremos quedan marcados, y el fragmento deseado que está sin marcar puede ser separado del fragmento de relleno por medio del método del invento. Así, cuando la muestra se hace pasar a través del filtro, el vector cortado en su totalidad pasará a través de la membrana.
En otra aplicación, el método del invento puede utilizarse para separar productos de ligación no productivos en una mezcla de ligación. La unión covalente de dos fragmentos de DNA utilizando la enzima DNA-ligasa es fundamental en biotecnología. En general, las reacciones de ligación implican la inserción de fragmentos o insertos pequeños de DNA dentro de un DNA vector de mayor tamaño. Es importante que el producto final de la ligación esté circularizado correctamente para evitar la degradación en las células hospedadoras transformadas, tales como células hospedadoras bacterianas. Así, los productos de ligación lineales no son de utilidad y no sobrevivirán en la bacteria hospedadora. Por desgracia, las reacciones con ligasas no son eficientes, produciendo típicamente más del 80% de productos lineales. Esto disminuye la eficiencia de la incorporación de productos de ligación circularizados y productivos en E. coli. Desde este punto de vista, los productos lineales pueden por ello considerarse contaminantes o productos secundarios de la reacción de ligación. La eficiencia de la transformación con productos ligados podría por lo tanto aumentarse si fuera posible, para retirar de la mezcla de reacción los productos de ligación lineales no deseados, antes de la transformación. Actualmente no existe ningún método disponible. Debido a la naturaleza polimórfica de los productos de ligación circulares productivos, no pueden recuperarse cortándolos de los geles. El presente invento proporciona ese método.
Por lo tanto, conforme a un aspecto más, este invento proporciona un método para separar moléculas de ácido nucleico lineales de moléculas de ácido nucleico circulares en una muestra, comprendiendo dicho método introducir un marcador en un extremo de una molécula de ácido nucleico lineal, siendo dicho marcador una proteína que puede ser inmovilizada en una matriz, por interacción directa con la matriz, y poner en contacto la muestra con una matriz a la que se unen selectivamente proteínas, mediante lo cual dichas moléculas de ácido nucleico marcadas quedan inmovilizadas en la matriz.
El método del invento es aplicable en este caso porque todas las moléculas de DNA presentes en la mezcla de ligación y distintas de las moléculas circulares deseadas, tienen extremos libres con grupos fosfato e hidroxilo expuestos y reactivos. Estos grupos pueden estar marcados en los extremos, mediante los métodos enzimáticos anteriormente mencionados, con nucleótidos marcados tales como nucleótidos biotinilados. Las moléculas circulares no pueden marcarse porque no tienen grupos hidroxilo reactivos en 3' a los que pueda unirse un marcador. De este modo, las moléculas marcadas y lineales pueden ser capturadas por la matriz y con ello separadas de las moléculas ligadas circularizadas que quedan en disolución y que pueden utilizarse para posteriores procedimientos aguas abajo, tales como la transformación de células hospedadoras.
En otra realización del invento, el método puede utilizarse en el empaquetamiento in vitro de partículas de bacteriófagos, tales como el fago lambda, por ejemplo en la construcción de bibliotecas génicas y bibliotecas de presentación de fagos. El bacteriófago puede empaquetarse o bien in vitro, en cuyo caso el DNA vírico se mezcla in vitro junto con los diferentes componentes proteicos de la cubierta del virus, después de lo cual tiene lugar el ensamblaje del virus, o bien en bacterias, en cuyo caso el DNA vírico se introduce en bacterias apropiadas que proporcionan los componentes proteicos necesarios que se necesitan para el ensamblaje del virus. El empaquetamiento in vitro es más rápido que el método de transformación bacteriana, porque el empaquetamiento puede conseguirse en cuestión de minutos, en contraposición a una duración de 1-2 días. Sin embargo es un método menos eficiente que el método de la transformación bacteriana, en particular en el caso del empaquetamiento de un DNA fágico que ha sido manipulado, por ejemplo el DNA de un fago \lambda en el que se ha insertado un DNA heterólogo, cuando existen indicaciones experimentales de que la eficiencia del empaquetamiento puede disminuirse en un máximo de 10^{3}/\mug de DNA, cuando se compara con la del DNA lineal resultante de manipulaciones moleculares con el virus lambda lineal no modificado. Esta eficiencia disminuida proviene, al menos en parte, de la presencia de productos secundarios de las reacciones de manipulación del DNA. Sería por lo tanto ventajoso si estos productos secundarios pudieran retirarse antes del empaquetamiento, aumentándose de este modo la eficiencia del empaquetamiento in vitro y posibilitando que este método se utilice en lugar del método de transformación bacteriana, lo que permite una mayor velocidad y por ello un procedimiento global más eficiente. El método del invento hace posible, usando el sistema de marcadores, marcar los fragmentos no deseados, haciendo que éstos puedan separarse de los productos de ligación deseados.
El método aprovecha la ventaja de la presencia de sitios cos en el genoma del fago. Estos sitios son regiones de DNA monocatenarias y complementarias, una en cada extremo del genoma del fago lambda, las cuales, después del la inserción del DNA lineal de \lambda en las células bacterianas, se reasocian entre sí para crear un genoma circular que puede replicarse y que no es susceptible de degradación por acción de exonucleasas bacterianas como lo sería un DNA lineal.
En esta realización, antes de clonar un DNA heterólogo en un vector, los extremos 3' del vector se bloquean, por ejemplo, añadiendo un didesoxinucleótido junto con una DNA polimerasa apropiada, por ejemplo, el fragmento de Klenow, que retira de manera efectiva los grupos OH reactivos de los sitios cos en 3', dejando solamente un hidrógeno no reactivo, que no puede ser extendido ni marcado. Así, después de que la reacción de clonación se haya llevado a cabo, las moléculas de DNA se someten a la adición de un marcador, capaz de ser añadido solamente en los grupos OH en 3'. De este modo, sólo los productos correctamente ligados, que no incluyen un grupo OH reactivo en 3', serán los que no estarán marcados; todas las demás moléculas de DNA, incluyendo los fragmentos del vector sometidos a restricción y el fragmento que ha de ser clonado, llevarán un grupo OH reactivo en 3' que puede ser marcado. Debido a que solamente las moléculas de DNA correctamente ligadas son las que no pueden estar marcadas, estas moléculas pueden separarse con facilidad de los productos secundarios no deseados usando cualquiera de los métodos que aquí se describen.
Contemplado así desde un aspecto más, el presente invento proporciona un método de empaquetamiento in vitro de fagos, para fagos recombinantes en los que el DNA del vector está cortado con una o más enzimas de restricción, los grupos OH en 3' del DNA del vector están bloqueados, el vector y el DNA que ha de ser insertado se ponen en contacto en condiciones apropiadas para la ligación de los fragmentos de DNA, y los productos de la ligación se marcan con un resto capaz de unirse a los grupos OH reactivos en 3', seguido de la separación de las moléculas marcadas y no marcadas.
En este contexto, el bloqueo de los grupos OH en 3' significa que el grupo OH en 3' está ausente, o se encuentra protegido o modificado de alguna manera que no puede ser extendido más.
En una realización conveniente, el marcador es biotina la cual se añade a los grupos OH reactivos en 3' en forma de un nucleótido biotinilado por medios enzimáticos, por ejemplo, por medio del fragmento de Klenow.
En una de las realizaciones, los extremos 3' del vector primero se bloquean, por ejemplo, con un didesoxinucleótido, y el vector se corta luego con una enzima que tiene un sitio de reconocimiento único dentro del vector, estando el sitio de reconocimiento localizado entre los dos sitios de restricción que van a ser usados para la clonación. Un ejemplo de esa enzima de restricción es EcoRI. El propósito de este corte inicial con una enzima de restricción es hacer posible que todas las moléculas del DNA del vector que no se van a cortar posteriormente sean retiradas por medio del marcaje. El vector se corta luego en dos posiciones, con dos enzimas que tienen sitios de corte únicos dentro del vector, que constituirán el sitio de clonación. Además de generar los fragmentos del vector encargados de la clonación, pueden obtenerse varios productos de restricción parcialmente cortados, los cuales pueden ser retirados por medio del marcador, por ejemplo, cuando el marcador es biotina, por medio de la unión a estreptavidina, según se ha descrito anteriormente. El fragmento(s) de DNA encargado de la clonación se liga luego en el interior del DNA del vector lambda. Para retirar todos los productos de reacción no deseados, todos los extremos 3' expuestos se encuentran marcados, por ejemplo, por medio de biotina. Los productos de ligación correctos no tienen grupos OH reactivos en 3' y no pueden marcarse, y pueden por ello separarse de todas las moléculas marcadas mediante los métodos que aquí se describen.
El invento será ahora descrito con más detalle con referencia a los Ejemplos no limitativos que vienen a continuación.
Ejemplos Ejemplo 1 Marcaje en los extremos de fragmentos de DNA sometidos a restricción que tienen un extremo de DNA protuberante en 5' Reactivos
5 \mug de DNA del fago lambda sometido a restricción con HindIII (Gibco 15612-13)
40 unidades de DNA-polimerasa I. Fragmento de Klenow mayor (New England Biolabs n.º 210S)
10 \mul de tampón para la DNA-polimerasa I (Fragmento de Klenow mayor (New England Biolabs)
5 nmoles de biotina-14-dCTP (Gibco 19518-018)
5 nmoles de dATP (Gibco 10216-018)
5 nmoles de dTTP (Gibco 10219-012)
5 nmoles de dGTP (Gibco 10218-014)
Agua destilada ad 100 \mul
La mezcla de reacción se incubó a 25ºC durante 45 minutos.
La mezcla de reacción se hizo pasar a través de una columna MicroSpin S400 HR (Pharmacia-Amersham 275140-01), se añadieron 10 \mug de estreptavidina (Promega n.º 7041) y se incubaron 5 minutos a 25ºC.
La mezcla de reacción se añadió a una columna Centriflex (Edge Biosystems n.º 73883) y se dejó difundir a través de la membrana de la manera descrita por el fabricante, antes de una centrifugación a 10.000xg durante 30 segundos. Se añadieron 10 \mul de agua destilada a la membrana que se giró 180º a posición horizontal y se centrifugó de nuevo a 10.000xg.
El eluido se analizó en una electroforesis en un gel de agarosa al 1% (FMC n.º 50080), y se tiñó con bromuro de etidio según se describe en Maniatis, Molecular Cloning: a laboratory manual, segunda edición, 1989.
No pudieron observarse trazas del DNA del fago lambda en el gel, lo que indicaba que las moléculas lineales y marcadas en un extremo que llevaban estreptavidina unida estaban retenidas en la membrana.
Ejemplo 2 Marcaje de fragmentos de DNA con extremos romos y con extremos protuberantes en 3' Reactivos
2 \mug de Low DNA Mass™ Ladder (Gibco 10068-013)
40 unidades de Terminal Deoxynucleotidyl Transferasa, Recombinant (Gibco 10533-016)
20 \mul de tampón para la Terminal Deoxynucleotidyl Transferasa, Recombinant (Gibco)
5 nmoles de biotina-14-dCTP (Gibco 19518-018)
Agua destilada ad 100 \mul
La mezcla de reacción se incubó a 37ºC durante 45 minutos.
La mezcla de reacción se hizo pasar a través de una columna MicroSpin S200 HR (Pharmacia-Amersham 275120-01) y se añadieron 10 \mug de estreptavidina (Promega n.º 7041). La mezcla se incubó 5 minutos a 25ºC.
La mezcla de reacción se añadió a una columna Centriflex (Edge Biosystems n.º 73883) y se dejó difundir a través de la membrana de la manera descrita por el fabricante, antes de la centrifugación a 10.000xg durante 30 segundos. Se añadieron 10 \mul de agua destilada a la membrana que se giró 180º a posición horizontal y se centrifugó de nuevo a 10.000xg.
Para su inspección, el eluido se hizo correr en gel de agarosa al 2% (FMC n.º 50080), que se tiñó con bromuro de etidio según se describe en Maniatis, Molecular Cloning: a laboratory manual, segunda edición, 1989.
No pudieron observarse trazas del DNA del fago lambda en el gel, lo que indicaba que las moléculas lineales y marcadas en un extremo que llevaban estreptavidina unida estaban retenidas en la membrana.
Ejemplo 3 Preparación de un DNA vector mediante la retirada del fragmento de relleno
El vector Cantab 5E que contiene un inserto a ensayar (Pharmacia-Amersham 279401-01) se preparó usando Qiagen maxiprep (Qiagen n.º 12166).
El vector Cantab 5E contiene sitios de restricción únicos para las enzimas SfiI, NotI y BsmI, estando los sitios SfiI y BamHI localizados a cada uno de los lados del sitio NotI.
Reactivos
25 \mug del vector Cantab 5E anteriormente descrito
40 unidades de endonucleasa NotI (Boehringer-Mannheim 1014714)
5 \mul de tampón para la endonucleasa NotI (Boehringer-Mannheim 1014714)
agua ad 50 \mul
La mezcla se incubó 1 hora a 37ºC.
La mezcla de reacción se hizo pasar a través de una columna MicroSpin S400 HR (Pharmacia-Amersham 275140-01) después de lo cual se añadió lo siguiente:
40 unidades de la DNA-polimerasa I, fragmento de Klenow mayor (New England Biolabs n.º 210S)
10 \mul de tampón para la DNA-polimerasa I, fragmento de Klenow mayor (New England Biolabs)
5 nmoles de biotina-14-dCTP (Gibco 19518-018)
5 nmoles de dGTP (Gibco 10218-014)
Agua destilada ad 100 \mul
La mezcla se incubó a 25ºC durante 45 minutos.
La mezcla de reacción se hizo pasar a través de una columna MicroSpin S400 HR (Pharmacia-Amersham 275140-01).
Una muestra de la mezcla de reacción (5 \mug) se diluyó hasta un volumen de 50 \mul y se añadió a una columna Centriflex (Edge Biosystems n.º 73883) y se dejó difundir a través de la membrana de la manera descrita por el fabricante, antes de una centrifugación a 10.000xg durante 30 segundos. Se añadieron 10 \mul de agua destilada a la membrana que se giró 180º a posición horizontal y se centrifugó de nuevo a 10.000xg.
\newpage
Para su inspección, el eluido se hizo correr en un gel de agarosa al 2% (FMC n.º 50080), que se tiñó con bromuro de etidio según se describe en Maniatis, Molecular Cloning: a laboratory manual, segunda edición, 1989.
No se observaron trazas de DNA vector en el gel, lo que indica que todo el DNA había quedado retenido en la membrana.
La mezcla de reacción se hizo pasar a través de una columna MicroSpin S400 HR (Pharmacia-Amersham 275140-01), y partes alícuotas individuales se trataron de la siguiente manera:
(1)
33 \mul de la mezcla de reacción se pusieron en un tubo diferente (1) al que se añadieron:
20 unidades de BsmI (Boehringer-Mannheim 1292315)
5 \mul de tampón para BsmI (Boehringer-Mannheim 1292315)
agua destilada ad 50 \mul
La mezcla se incubó 1 hora a 65ºC.
(2)
una porción de 33 \mul de la mezcla de reacción se pusieron en un tubo diferente (2) al que se añadieron:
20 unidades de SfiI (Boehringer-Mannheim 1288032)
5 \mul de tampón para SfiI (Boehringer-Mannheim 1288032)
agua destilada ad 50 \mul
La mezcla se incubó 1 hora a 50ºC.
(3)
una porción de 33 \mul de la mezcla de reacción se pusieron en un tubo diferente (3) al que se añadieron:
20 unidades de SfiI (Boehringer-Mannheim 1288032)
5 \mul de tampón para SfiI (Boehringer-Mannheim 1288032)
agua destilada ad 50 \mul
La mezcla se incubó 1 hora a 50ºC. A continuación la mezcla de reacción se hizo pasar a través de una columna MicroSpin S400 y a la mezcla de reacción se añadió lo siguiente:
20 unidades de BsmI (Boehringer-Mannheim 1292315)
5 \mul de tampón para BsmI (Boehringer-Mannheim 1292315)
agua destilada ad 50 \mul
La mezcla se incubó 1 hora a 65ºC.
Cada una de las tres mezclas de reacción se purificó en columnas MicroSpin S400 distintas, y se añadieron 10 \mug de estreptavidina (Promega n.º 7041) a cada una de las mezclas y se incubaron durante 5 minutos a 25ºC.
Cada una de las mezclas de reacción se añadió a una columna Centriflex (Edge Biosystems n.º 73883) y se dejó difundir a través de la membrana de la manera descrita por el fabricante, antes de la centrifugación a 10.000xg durante 30 segundos. A cada una de las membranas se añadieron 10 \mul de agua destilada, y las membranas se giraron 180º a posición horizontal y se centrifugaron de nuevo a 10.000xg.
Las tres mezclas de reacción se hicieron correr en un gel de agarosa al 1% (FMC n.º 50080), y se tiñeron con bromuro de etidio.
Sólo en la tercera muestra de reacción pudo observarse en el gel el DNA vector purificado, y las muestras 1 y 2 no proporcionaron trazas de DNA detectables. Esto indica que sólo el vector correcto cortado por restricción es el que atraviesa la membrana.
Ejemplo 4 Restricción de un fragmento de PCR biotinilado
Se produjo un producto de PCR amplificando una construcción scFV usando cebadores para PCR de alta calidad y biotinilados.
La construcción scFV es un fragmento de 800 pares de bases, que contiene sitios únicos para SfiI y NotI, situados en la posición de las bases 40 y 760 respectivamente.
Se mezclaron 1 \mug de producto de PCR con 2 \mug de estreptavidina (Promega n.º 7041) y se incubaron a 25ºC durante 5 minutos.
La mezcla de reacción se añadió a una columna Centriflex (Edge Biosystems n.º 73883) y se dejó difundir a través de la membrana de la manera descrita por el fabricante, antes de una centrifugación a 10.000xg durante 30 segundos. Se añadieron 10 \mul de agua destilada a la membrana que se giró 180º a posición horizontal y se centrifugó de nuevo a 10.000xg.
Para su inspección, la mezcla de reacción se hizo correr en gel de agarosa al 2% (FMC n.º 50080), y se tiñó con bromuro de etidio.
No se detectaron trazas del producto de PCR, lo que indicaba que éste había sido retenido en la membrana.
Partes alícuotas distintas se trataron de la siguiente manera:
(1)
3 \mug del producto de PCR se añadieron en un tubo diferente (1) a:
20 unidades de la endonucleasa NotI (Boehringer-Mannheim 1014714)
5 \mul de tampón para NotI y
agua destilada ad 50 \mul
y se incubaron 1 hora a 37ºC.
(2)
Otros 3 \mug del producto de PCR se añadieron en un tubo diferente (2) a:
20 unidades de SfiI (Boehringer-Mannheim 1288032)
5 \mul de tampón para SfiI (Boehringer-Mannheim 1288032)
agua destilada ad 50 \mul
y se incubaron 1 hora a 50ºC.
(3)
Otros 3 \mug del producto de PCR se añadieron en un tubo diferente (3) a:
20 unidades de SfiI (Boehringer-Mannheim 1288032)
5 \mul de tampón para SfiI (Boehringer-Mannheim 1288032)
agua destilada ad 50 \mul
y se incubaron 1 hora a 50ºC.
A continuación la mezcla de reacción se hizo pasar a través de una columna MicroSpin S400 y a la mezcla de reacción se añadió lo siguiente:
20 unidades de la endonucleasa NotI (Boehringer-Mannheim 1014714)
5 \mul de tampón para la endonucleasa NotI (Boehringer-Mannheim 1014714)
agua destilada ad 50 \mul
y se incubaron 1 hora a 37ºC.
Cada una de las tres mezclas de reacción se purificó en columnas distintas MicroSpin S400, y a continuación se añadieron 10 \mug de estreptavidina (Promega n.º 7041) a cada una de las mezclas y se incubaron durante 5 minutos a 25ºC.
Cada una de las mezclas de reacción se añadió a una columna Centriflex (Edge Biosystems n.º 73883) y se dejó difundir a través de la membrana de la manera descrita por el fabricante, antes de una centrifugación a 10.000xg durante 30 segundos. A cada una de las membranas se añadieron 10 \mul de agua destilada, y las membranas se giraron 180º a posición horizontal y se centrifugaron de nuevo a 10.000xg.
Para su inspección, las tres mezclas de reacción se sometieron a electroforesis en un gel de agarosa al 1% (FMC n.º 50080), y se tiñeron con bromuro de etidio.
Sólo en la muestra de reacción del tubo 3 pudo observarse en el gel el producto purificado por PCR, y los tubos 1 y 2 no proporcionaron trazas detectables de DNA, lo que indica que los fragmentos que contienen los extremos habían sido retenidos en la membrana, y que el fragmento interno había atravesado la membrana.
Ejemplo 5 Restricción de fragmentos de PCR no biotinilados
Se produjo un producto de PCR amplificando una construcción scFV usando cebadores para PCR de alta calidad y biotinilados.
Se mezcló 1 \mug de producto de PCR con 2 \mug de estreptavidina (Promega n.º 7041) y se incubaron a 25ºC durante 5 minutos, igual que en el Ejemplo 4.
La mezcla de reacción se añadió a una columna Centriflex (Edge Biosystems n.º 73883) y se dejó difundir a través de la membrana de la manera descrita por el fabricante, antes de una centrifugación a 10.000xg durante 30 segundos. Se añadieron 10 \mul de agua destilada a la membrana que se giró 180º a posición horizontal y se centrifugó de nuevo a 10.000xg.
Para su inspección, la mezcla de reacción se hizo correr en gel de agarosa al 2% (FMC n.º 50080), y se tiñó con bromuro de etidio.
El producto de PCR se detectó en el gel, lo que indica que éste no había sido retenido en la membrana.
A 3 \mug de producto de PCR se le añadió lo siguiente:
40 unidades de Terminal Deoxynucleotidyl Transferasa, Recombinant (Gibco 10533-016)
20 \mul de tampón para la Terminal Deoxynucleotidyl Transferasa, Recombinant (Gibco)
5 nmoles de biotina-14-dCTP (Gibco 19518-018)
Agua destilada ad 100 \mul
y se incubaron a 37ºC durante 45 minutos.
La mezcla de reacción se hizo pasar a través de una columna MicroSpin S200 HR (Pharmacia-Amersham 275120-01), se añadieron 10 \mug de estreptavidina (Promega n.º 7041) y se incubaron 5 minutos a 25ºC.
La mezcla de reacción se añadió a una columna Centriflex (Edge Biosystems n.º 73883) y se dejó difundir a través de la membrana de la manera descrita por el fabricante, antes de la centrifugación a 10.000xg durante 30 segundos. Se añadieron 10 \mul de agua destilada y la columna se giró 180º a posición horizontal y se centrifugó de nuevo a
10.000xg.
Para su inspección, la mezcla de reacción se hizo correr en un gel de agarosa al 2% (FMC n.º 50080), que se tiñó con bromuro de etidio.
No pudo detectarse ningún producto de PCR en el gel, lo que indicaba que éste había sido retenido en la membrana.
Tres partes alícuotas diferentes se trataron de la siguiente manera:
\newpage
(1)
En un tubo distinto (1) se añadieron 3 \mug del producto de la PCR a:
20 unidades de endonucleasa NotI (Boehringer-Mannheim 1014714)
5 \mul de tampón para NotI y
agua destilada ad 50 \mul
y se incubaron 1 hora a 37ºC.
(2)
En un tubo distinto (2) se añadieron otros 3 \mug del producto de PCR a:
20 unidades de SfiI (Boehringer-Mannheim 1288032)
5 \mul de tampón para SfiI (Boehringer-Mannheim 1288032)
agua destilada ad 50 \mul
y se incubaron 1 hora a 50ºC.
(3)
En un tubo distinto (3) se añadieron otros 3 \mug del producto de PCR a:
20 unidades de SfiI (Boehringer-Mannheim 1288032)
5 \mul de tampón para SfiI (Boehringer-Mannheim 1288032)
agua destilada ad 50 \mul
y se incubaron 1 hora a 50ºC.
A continuación la mezcla de reacción se hizo pasar a través de una columna MicroSpin S400 y a la mezcla de reacción se añadió lo siguiente:
20 unidades de la endonucleasa NotI (Boehringer-Mannheim 1014714)
5 \mul de tampón para la endonucleasa NotI (Boehringer-Mannheim 1014714)
agua destilada ad 50 \mul
y se incubaron 1 hora a 37ºC.
Cada una de las tres mezclas de reacción se purificó en columnas MicroSpin S400 diferentes, y después se añadieron 10 \mug de estreptavidina (Promega n.º 7041) y se incubaron durante 5 minutos a 25ºC.
Cada una de las mezclas de reacción se añadió a una columna Centriflex (Edge Biosystems n.º 73883) y se dejaron difundir a través de la membrana de la manera descrita por el fabricante, antes de la centrifugación a 10.000xg durante 30 segundos. A cada una de las membranas se añadieron 10 \mul de agua destilada, y las membranas se giraron 180º a posición horizontal y se centrifugaron de nuevo a 10.000xg.
Para su inspección, las tres mezclas de reacción se hicieron correr en un gel de agarosa al 1% (FMC n.º 50080), y se tiñeron con bromuro de etidio.
Sólo en el grupo 3 de las mezclas de reacción pudo observarse en el gel el producto de PCR purificado, y los tubos 1 y 2 no proporcionaron trazas detectables de DNA, lo que indica que los fragmentos que contenían los extremos habían sido retenidos en la membrana, y que solamente el fragmento interno había atravesado la membrana.
Ejemplo 6 Separación de DNA lineal en una población de moléculas de DNA lineales y circulares
El material de partida de DNA circular es el vector de clonación pUC19 que lleva un sitio HindIII único en el sitio del adaptador de policlonación.
Se añadieron 5 \mug del DNA vector pUC19 (New England Biolabs nº. 301-1S) a:
40 unidades de la enzima de restricción HindIII (New England Biolabs nº. 104S)
5 \mul de tampón para la enzima de restricción HindIII (New England Biolabs)
agua destilada ad 50 \mul
Se incubaron 1 hora a 37ºC.
La reacción se hizo pasar a través de una columna MicroSpin S400 HR y la mezcla de reacción se añadió a:
5 \mul del DNA vector pUC19 (New England Biolabs n.º 301-1S)
40 unidades de la DNA-polimerasa I, fragmento de Klenow mayor (New England Biolabs)
10 \mul de tampón para la DNA-polimerasa I, fragmento de Klenow mayor (New England Biolabs)
5 nmoles de biotina-14-dCTP (Gibco 19518-018)
5 nmoles de dATP (Gibco 10216-014)
5 nmoles de dTTP (Gibco 10219-012)
5 nmoles de dGTP (Gibco 10218-014)
Agua destilada ad 100 \mul
La mezcla de reacción se incubó a 25ºC durante 45 minutos.
La mezcla de reacción se hizo pasar a través de una columna MicroSpin S400 HR (Pharmacia-Amersham 275140-01), se añadieron 10 \mug de estreptavidina (Promega n.º7041) y se incubaron 5 minutos a 25ºC.
La mezcla de reacción se añadió a una columna Centriflex (Edge Biosystems n.º 73883) y se dejó difundir a través de la membrana de la manera descrita por el fabricante, antes de la centrifugación a 10.000xg durante 30 segundos. Se añadieron 10 \mul de agua destilada, la columna se giró 180º a posición horizontal y se centrifugó de nuevo a 10.000xg.
Para su inspección, el eluido se analizó en una electroforesis en gel de agarosa al 1% (FMC n.º 50080), se tiñó con bromuro de etidio según se describe en Maniatis, Molecular Cloning: a laboratory manual, segunda edición, 1989.
Sólo se detectó DNA circular en el gel de agarosa (FMC n.º 50080), lo que indica que este DNA había atravesado la membrana, quedando retenido el DNA lineal.
Ejemplo 7 Empaquetamiento in vitro del fago lambda, usando un vector lambda precortado
Se utiliza el vector lambda Uni-ZAP® XR (Stratagene, n.º de catálogo 236612) precortado.
Reactivos
10 \mug de vector lambda precortado
trifosfato de didesoxiguanosina (concentración final 200 \muM)
trifosfato de didesoxiadenosina (concentración final de 200 \muM)
fragmento de Klenow (10 unidades)
tampón NEB EcoPol
en un volumen total de 30 \mul
La mezcla de reacción se incuba a 24ºC durante 20 minutos.
La mezcla de reacción se hace pasar a través de una columna MicroSpin S400 HR para separar las proteínas y nucleótidos y a la mezcla de reacción purificada se añade:
200 ng del inserto de DNA pre-preparado
DNA-ligasa de T4
tampón NEB para la ligasa de T4
en un volumen de 40 \mul
La mezcla de reacción se incuba a 16ºC durante 48 horas.
La mezcla de reacción se hace pasar a través de una columna MicroSpin S400 HR y a la mezcla de reacción purificada se añade:
dCTP biotinilado (5 nmoles)
dATP biotinilado (5 nmoles)
dTTP (concentración final 200 \muM)
dGTP (concentración final 200 \muM)
fragmento de Klenow (10 unidades)
tampón NEB
en un volumen de 50 \mul
La mezcla de reacción se incuba a 24ºC durante 20 minutos.
La mezcla de reacción se hace pasar a través de una columna MicroSpin S400 HR y a la mezcla de reacción purificada se añade Estreptavidina y la mezcla de reacción se añade a una columna Centriflex igual que en el Ejemplo 2.
El procedimiento posterior sigue las instrucciones del prospecto del envase de Stratagene. La ligación proporciona un número más alto de bacteriófagos viables que el encontrado con el método estándar, como se observa por el recuento de calvas sobre el cultivo de bacterias.
Ejemplo 8 Empaquetamiento in vitro del fago lambda utilizando un vector lambda no cortado
Se utiliza el vector lambda Uni-ZAP® XR (Stratagene) no cortado que contiene un inserto a ensayar.
Reactivos
5 \mug de vector lambda no cortado
trifosfato de didesoxiguanosina (concentración final 200 \muM)
trifosfato de didesoxiadenosina (concentración final de 200 \muM)
fragmento de Klenow (10 unidades)
tampón NEB
en un volumen total de 20 \mul
La mezcla de reacción se incuba a 24ºC durante 20 minutos. Esto bloquea los extremos 3' del vector.
La mezcla de reacción se hace pasar a través de una columna MicroSpin S400 HR y a la mezcla de reacción purificada se añade:
enzima de restricción EcoRI (20 unidades)
tampón NEB para EcoRI
en un volumen de 30 \mul
La mezcla de reacción se incuba a 37ºC durante 120 minutos. Esto digiere el vector en trozos aproximadamente iguales.
La mezcla de reacción se hace pasar a través de una columna MicroSpin S400 HR y a la mezcla de reacción purificada se añade:
dATP biotinilado (5 nmoles)
dTTP (concentración final 200 \muM)
dCTP (concentración final 200 \muM)
dGTP (concentración final 200 \muM)
fragmento de Klenow (10 unidades)
tampón NEB
en un volumen de 40 \mul
La mezcla de reacción se incuba a 24ºC durante 30 minutos. En esta reacción, la biotina marcará el DNA lambda digerido con EcoRI.
A la mezcla de reacción se añaden:
las enzimas de restricción XbaI y XhoI (20 unidades de cada una) en tampón NEB 2 en un volumen de 50 \mul. Esta reacción crea el sitio de clonación.
La mezcla de reacción se incuba a 37ºC durante 60 minutos.
La mezcla de reacción se hace pasar a través de una columna MicroSpin S400 HR y a la mezcla de reacción purificada se añade Estreptavidina y la mezcla de reacción se añade a una columna Centriflex igual que en el Ejemplo 2. En esta etapa, la Estreptavidina se une al vector no cortado.
La mezcla de reacción se hace pasar a través de una columna MicroSpin S400 HR para separar las proteínas y nucleótidos y a la mezcla de reacción purificada se añade:
200 ng del inserto de DNA pre-preparado
DNA-ligasa de T4
tampón NEB para la DNA-ligasa de T4
en un volumen de 60 \mul
La mezcla de reacción se incuba a 16ºC durante 48 horas.
La mezcla de reacción se hace pasar a través de una columna MicroSpin S400 HR y a la mezcla de reacción purificada se añade:
dCTP biotinilado (5 nmoles)
dATP biotinilado (5 nmoles)
dTTP (concentración final 200 \muM)
dGTP (concentración final 200 \muM)
fragmento de Klenow (10 unidades)
tampón NEB
en un volumen de 70 \mul
La mezcla de reacción se incuba a 24ºC durante 20 minutos. En esta reacción, se marcan todos los extremos OH en 3' expuestos que no estaban previamente bloqueados.
La mezcla de reacción se hace pasar a través de una columna MicroSpin S400 HR y a la mezcla de reacción purificada se añade Estreptavidina y la mezcla de reacción se añade a una columna Centriflex igual que en el Ejemplo 2. Esto separa las moléculas marcadas de las moléculas no marcadas.
El procedimiento posterior sigue las instrucciones del prospecto del envase de Stratagene. La ligación produce un número más alto de bacteriófagos viables que el encontrado con el método estándar, como se observa por el recuento de calvas sobre el cultivo de bacterias.
Ejemplo 9 Limpieza de la reacción de reamplificación por PCR
a) Modificación del vector Cantab5E (Pharmacia) para obtener Cantab5E^{BamHI(1)}
El vector Cantab5E (1 \mug) se corta añadiendo 10 unidades de BamHI y 10 \mul de tampón NEB para BamHI en un volumen total de reacción de 100 \mul y se incuba 1 hora a 37ºC. La mezcla de reacción se separa en un gel de agarosa al 1% y el fragmento de peso molecular más alto se aísla mediante un método común de extracción en gel. A 500 ng del fragmento mayor aislado se añade 1 unidad Weiss de la DNA-ligasa de T4 y 5 \mul de tampón para la ligasa en un volumen de reacción total de 50 \mul y la mezcla se incuba 1 hora a 24ºC. La mezcla de ligación se utiliza para transformar células TGI usando electroporación y las células bacterianas se incuban durante la noche en agar que contiene ampicilina (100 \mug/ml). El DNA procedente de las bacterias formadoras de colonias se aísla y se comprueba mediante determinación por tamaño y tratamiento con enzimas de restricción que contiene solamente un sitio de restricción BamHI. Este DNA se denomina Cantab5E^{BamHI(1)}.
b) Uso del vector Cantab5E^{BamHI(1)} modificado como molde en PCR
Reactivos
10 \mug del vector Cantab5E^{BamHI(1)}
mezcla de dNTP (suministrada por Finnzyme; concentración final 200 \muM)
10 \mul de tampón para la enzima Expand High Fidelity (Boehringer-Mannheim AG)
30 pmoles del cebador 1 que se solapa parcialmente con un sitio de restricción único AflIII
30 pmoles del cebador 2 que se solapa parcialmente con un sitio de restricción único BamHI
agua ad 100 \mul
La reacción de PCR se calentó a 96ºC durante 2 minutos antes de añadir 1 \mul de la enzima Expand High Fidelity (Boehringer-Mannheim AG).
La mezcla de reacción se cicla en un termociclador durante 20 rondas, en las siguientes condiciones:
- Los primeros 2 minutos a 96ºC, y a continuación 20 rondas de la siguiente manera:
- 30 segundos a 55ºC,
- 80 segundos a 72ºC,
- 30 segundos a 96ºC.
El producto de PCR se identifica mediante tinción con bromuro de etidio después de una electroforesis en agarosa. Típicamente se observan productos secundarios no deseados.
La mezcla de reacción del termociclador se hace pasar a través de una columna MicroSpin S400 HR.
El producto de PCR purificado se corta utilizando las enzimas de restricción AflIII y BamHI en un procedimiento normal, seguido de la adición de estreptavidina, y la mezcla de reacción se añade a una columna Centriflex (igual que en el ejemplo 2). Solamente se observa el producto de PCR correctamente cortado, después de la electroforesis en agarosa, ya que las impurezas no deseadas quedan retenidas por la matriz de unión a proteínas.
Ejemplo 10 Uso de un DNA que contiene biotina en una PCR diagnóstica de la anemia de células falciformes
La hemoglobina A1 humana normal tiene una secuencia de DNA del primer exón (parte codificadora) del gen de la beta-globina de haplotipo A1, que comienza como se muestra a continuación:
DNA normal:
atg gtg cac ctg act cct gag gag aag tct gcc gtt act gcc
ctg tgg ggc aag gtg aac gtg gat gaa gtt ggt ggt gag gcc
ctg ggc agg...
que traduce la
Secuencia de aminoácidos normal:
MVHLTPEEKSAVTALWGKVNVDEVGGEALG...
En la enfermedad humana de la anemia de células falciformes, la secuencia de DNA del primer exón del gen de la beta-globina de haplotipo S, comienza como se muestra a continuación:
DNA de la enfermedad de las células falciformes:
atg gtg cac ctg act cct gtg gag aag tct gcc gtt act gcc
ctg tgg ggc aag gtg aac gtg gat gaa gtt ggt ggt gag gcc
ctg ggc agg...
que traduce la
Secuencia de aminoácidos de la enfermedad de las células falciformes:
MVHLTPVEKSAVTALWGKVNVDEVGGEALG...
La comparación del DNA normal y del DNA de la enfermedad de las células falciformes revela que una sustitución de una sola base es suficiente para transformar el gen normal de la hemoglobina en un gen anormal de la hemoglobina, que se sabe que es causante de la grave enfermedad de la anemia de células falciformes. El codón gag está mutado a un gtg codón, produciendo una sustitución del aminoácido de carácter ácido ácido glutámico con el aminoácido no polar valina.
Para detectar la presencia o ausencia de esta mutación, el DNA genómico se aísla, y, si fuera necesario, se amplifica por PCR antes de la PCR diagnóstica, de la manera convencional.
Ejemplo 10 (a) Aislamiento del DNA de un paciente
Un kit comercial (GFX Genomic Blood DNA Purification kit; Pharmacia-Amersham n.º 27-9603-01) se usa conforme a las recomendaciones del fabricante para aislar DNA genómico de una muestra de sangre de un paciente.
Si se obtienen DNA suficiente, se procede directamente a ejecutar el Ejemplo 10c. Si no fuera así, se lleva a cabo una etapa de amplificación por PCR de una parte del gen de la cadena beta de la hemoglobina (Ejemplo 10b).
Ejemplo 10 (b) Etapa de amplificación (opcional, si fuera necesaria por falta de material)
El DNA aislado del Ejemplo 10a se amplifica para aumentar la cantidad de DNA para su procesamiento posterior, como se muestra a continuación.
Una mezcla de
250 ng de DNA genómico
10 \mul de tampón para la enzima Expand High Fidelity
20 nmoles de dNTP
20 pmoles de cada cebador de la amplificación (Cebador 1 y Cebador 2; véanse más adelante)
Agua hasta completar 100 \mul
3 unidades de la enzima para PCR Expand High Fidelity
se utiliza para una PCR durante 30 rondas en las siguientes condiciones estándar:
arranque en caliente a 96ºC
reasociación a 56ºC durante 30 segundos
polimerización a 72ºC durante 1 minuto
desnaturalización a 96ºC durante 30 segundos
Los cebadores usados para la amplificación de parte del gen de la cadena beta de la hemoglobina están basados en la secuencia de DNA proporcionada por el programa de búsqueda EMBEL cuando la búsqueda se realiza en el identificador único EMBL-ID:HSBETGLOB'.
El gen de la cadena beta de la hemoglobina (que se muestra más adelante en forma de tripletes independientes) va precedido por la secuencia de un intrón (intrón 1) y va seguido por otra secuencia (intrón 2), intrones ambos que aparecen indicados más adelante en letra itálica.
Parte de los intrones (la parte subrayada) se usa para la construcción de los cebadores (véase más adelante).
5
Los intrones no codificadores flanquean la porción codificadora del gen; el segundo intrón separa la secuencia codificadora de la parte siguiente de la secuencia codificadora situada más aguas abajo.
Para amplificar la primera parte codificadora del gen para una posterior PCR diagnóstica, pueden usarse dos cebadores, por ejemplo, que se reasocien a los intrones 1 y 2 respectivamente. Las secuencias que se reasocian correspondientes con los cebadores se encuentran indicadas en lo que antecede en letra itálica subrayada.
Cebador 1: 5'-ctagcaacctcaaacagacacc-3'
Cebador 2: 3'-gtaaccttgataccaacctgcc-3'
Estos cebadores se utilizan solamente en la PCR de amplificación para conseguir más DNA molde para el procedimiento de la PCR diagnóstica, y por ello no necesitan estar biotinilados ni modificados en modo alguno.
Ejemplo 10c PCR diagnóstica
Etapa 1
Construcción de los cebadores
Para la PCR diagnóstica, debido a que la naturaleza de la mutación se conoce, una mutación de una sola base en el codón 6 del exón, se diseñan tres cebadores, que corresponden al DNA normal y al DNA anormal (anemia de células perniciosas).
Cebador que corresponde a la hemoglobina normal:
Cebador N: 5'-atg gtg cac ctg act cct ga-biotina-OH
Cebador que corresponde a la hemoglobina de la enfermedad de las células falciformes:
Cebador S: 5'-atg gtg cac ctg act cct gt-biotina-OH
Cebador que corresponde al otro extremo del gen:
Cebador 2: 5'-gtaaccttgataccaacctgcc-3'
(Este cebador puede ser el mismo que el utilizado en la etapa de amplificación del Ejemplo 10b; no está marcado ni modificado).
Etapa 2
Ensayo diagnóstico con los cebadores de la etapa 1 y con el producto de la PCR del Ejemplo 10b
Se realizan dos reacciones de PCR, usando las mismas condiciones que en el Ejemplo 10b.
a) PCR usando el Cebador N + Cebador 2:
100 ng del DNA producto de la PCR del Ejemplo 10b
10 \mul de tampón para la enzima Expand High Fidelity
20 nmoles de dNTP
20 pmoles de cada cebador de la amplificación (Cebador N y Cebador 2)
3 Unidades de la enzima para PCR Expand High Fidelity
Agua hasta completar 100 \mul
b) PCR usando el Cebador S + Cebador 2:
Igual que en la reacción de PCR (a) pero con el cebador AB que reemplaza al cebador N para la amplificación.
Los productos de PCR resultantes de las reacciones de PCR a) y b) se purifican mediante el uso de columnas MicroSpin S400 HR como se describe en el Ejemplo 1. Todos los productos se examinan luego con respecto a la presencia de biotina por medio de una membrana Centriflex, como se describe en el Ejemplo 1. La mezcla de reacción se divide en 2 partes. Se añade estreptavidina en exceso (5 \mug) a 9 de 10 mezclas de reacción, y se incuban a 25ºC durante 5 minutos como en el Ejemplo 1, y a continuación se añaden a una membrana Centriflex igual que en el Ejemplo 1. El eluido recogido se analiza en un gel de agarosa, igual que en el Ejemplo 1, con respecto a la presencia de un DNA producto. La 1/10 mezcla de reacción restante, que no se ha puesto en contacto con estreptavidina, se hace correr en paralelo en el gel de agarosa como muestra de control.
Los resultados del examen de las dos reacciones de PCR a) y b) pueden tener una de cuatro posibles consecuencias que se ilustran a continuación:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página siguiente)
6
El método puede también utilizarse para el diagnóstico de mutaciones de múltiples bases, como se ilustra más adelante, también esta vez en el caso de anemia de células falciformes.
Ejemplo 11 PCR diagnóstica de la anemia de células falciformes (mutación en múltiples bases)
Una mutación en múltiples bases (subrayada y en negrilla) en el primer exón del gen de la beta-globina se presenta en la siguiente secuencia de DNA:
atg gtg cac ctg act cct aac gag aag tct gcc gtt act gcc
ctg tgg ggc aag gtg aac gtg gat gaa gtt ggt ggt gag gcc
ctg ggc agg...
que se traduce en la secuencia de aminoácidos:
MVHLTP N EKSAVTALWGKVNVDEVGGEALG...
Aunque han cambiado tres bases, para detectar la mutación puede usarse un método similar al del Ejemplo 10.
Al igual que en el Ejemplo 10, se utiliza un Cebador N para revelar si el gen normal está presente. Se construyen dos cebadores para diagnosticar la presencia potencial de una mutación.
Un cebador que corresponde a la hemoglobina mutada, como el siguiente:
Cebador AB2a
5'-atggtgcacctgactcctaac-biotina-OH
Este cebador identifica de manera exacta la mutación "acc" en el codón 6.
El segundo cebador es:
Cebador AB2b
5'-atggtgcacctgactccta-biotina-OH
Este cebador puede identificar todas las mutaciones presentes en el codón 6 que comiencen con una base "a".
Las reacciones de PCR se llevan a cabo con el Cebador N normal, y con uno o más cebadores que corresponden a la secuencia mutada (es decir, que son complementarios a ella) usando las condiciones del Ejemplo 10.
Este método puede utilizarse para cualquier mutación presente en una secuencia conocida del gen normal y la mutación de la hemoglobina de las células falciformes se proporciona como ejemplo. Cuando se conocen las mutaciones comunes observadas en la población, pueden usarse varios cebadores para localizar de manera exacta la mutación que está presente.
Ejemplos 12-22
Los Ejemplos 1-11 se repiten con una NycoCard que porta una membrana de unión a proteínas que reemplaza a la columna Centriflex para la separación o el aislamiento de las moléculas de DNA marcadas con biotina y que están formando un complejo con estreptavidina.

Claims (20)

1. Un método para separar al menos parcialmente moléculas de ácido nucleico presentes en una muestra, en poblaciones, en el que una población está marcada con una proteína capaz de ser inmovilizada en una matriz, comprendiendo dicho método poner en contacto la muestra que contiene el ácido nucleico con una matriz a la que se unen selectivamente proteínas, por medio de lo cual dicha proteína interacciona directamente con la matriz, las moléculas marcadas son capturadas por la matriz y de ese modo se separan de las moléculas no marcadas.
2. Un método según la reivindicación 1, en el que el marcador es una proteína que puede incorporarse a una molécula de ácido nucleico, o una proteína que tiene afinidad por una molécula de ácido nucleico.
3. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 2, en el que el marcador es un antígeno.
4. Un método según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que la proteína es una proteína de unión a ácidos nucleicos.
5. Un método según la reivindicación 1, en el que las proteínas se encuentran enlazadas o unidas a las moléculas de ácido nucleico.
6. Un método según la reivindicación 5, en el que la proteína está enlazada vía biotina al ácido nucleico, y la proteína es estreptavidina o avidina.
7. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la matriz está en forma de láminas, geles, filtros, membranas, fibras, tubos, placas de microtitulación, columnas, partículas.
8. Un método según la reivindicación 7, en el que la matriz es un material poroso.
9. Un método según la reivindicación 8, en el que la matriz está incorporada en un dispositivo de separación seleccionado entre viales de centrífuga, placas de microtitulación, cartuchos y jeringas.
10. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones de 7 a 9, en el que una almohadilla absorbente se coloca sobre dicho material poroso, una lámina líquida impermeable se coloca sobre la cara de dicha almohadilla absorbente alejada de dicho material poroso, y una lámina líquida impermeable que contiene uno o más agujeros se coloca sobre la cara de dicho material poroso alejada de dicha almohadilla absorbente, por medio de lo cual la muestra a ensayar se aplica en uno de dichos agujeros y se hace que difunda transversalmente a través de dicho material poroso mediante absorción en dicha almohadilla absorbente.
11. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, para la separación al menos parcial de un producto de la digestión con enzimas de restricción, o para purificar los productos de la reacción de PCR.
12. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, para separar al menos parcialmente una mezcla de fragmentos de DNA digeridos con enzimas de restricción, en el que el material de partida es una molécula lineal de DNA que está marcada o que puede marcarse en o cerca de uno o ambos extremos con una proteína capaz de ser inmovilizada en una matriz, comprendiendo dicho método someter la molécula de DNA a digestión con enzimas de restricción, seguido de poner en contacto la muestra con una matriz a la que se unen selectivamente proteínas, por medio de lo cual las moléculas marcadas que se han originado a partir de un extremo del material de partida son capturadas por la matriz y de ese modo se separan de las moléculas no marcadas.
13. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, para separar al menos parcialmente los productos correctos y deseados resultantes de una amplificación por PCR, de los productos de PCR resultantes de una reasociación incorrecta de un cebador de PCR a un molde, en el que la molécula de ácido nucleico molde comprende un sitio de reconocimiento único para una enzima de restricción en, o cerca de, un extremo del molde, y un cebador de PCR que está marcado, o que puede marcarse con una proteína, es complementario a una secuencia contenida en el molde y que se extiende parcialmente dentro del sitio de restricción único, método que comprende amplificar el molde por medio de una PCR, digerir los productos de la PCR con la enzima de restricción específica para el sitio de reconocimiento único de la enzima de restricción, y poner en contacto el producto resultante con una matriz a la que se unen selectivamente proteínas, por medio de lo cual las moléculas de ácido nucleico marcadas son capturadas por la matriz y de ese modo se separan de las moléculas no marcadas.
14. Un método según la reivindicación 13, en el que el marcador está unido al extremo 5' del cebador.
15. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 10, para una PCR diagnóstica.
16. Un método según la reivindicación 15, para una PCR diagnóstica, en el que la muestra a ensayar se somete por separado a reacciones de PCR, en el que la mutación, en caso de estar presente, está en la secuencia a la que el cebador 3' es complementaria, una primera reacción de PCR que usa un cebador 3' complementario al ácido nucleico diana normal, y una segunda reacción de PCR que usa un cebador 3' complementario al ácido nucleico diana mutante, en el que el nucleótido 3' del cebador mutante se corresponde con uno de Los nucleótidos que está mutado en el ácido nucleico mutante, portando cada uno de dichos cebadores 3' un marcador o pudiendo cada uno de dichos cebadores marcarse en el nucleótido 3' del cebador, y en el que se detecta la presencia o ausencia del marcador en los productos de la reacción de PCR.
17. Un método según la reivindicación 15, para una PCR diagnóstica de mutaciones en una molécula de ácido nucleico, en el que se detecta la presencia o ausencia de una mutación en una muestra de ácido nucleico, en el que se usa un cebador 3' específico o para el ácido nucleico normal o para el ácido nucleico mutante, en el que dicho cebador es complementario a una región del ácido nucleico en la que existe una diferencia de bases entre el DNA normal y el DNA mutado, correspondiendo la terminación 3' del cebador con la posición en la muestra en la que existe una diferencia entre el DNA normal y el DNA mutante, estando el cebador marcado o pudiendo el cebador marcarse, por medio de lo cual se detecta la presencia o ausencia del marcador en el producto de PCR.
18. Un método según la reivindicación 15, para una PCR diagnóstica, en el que la muestra a ensayar se somete a una PCR con cebadores complementarios al DNA diana normal, en el que el cebador encargado de la extensión en el extremo 3' del DNA diana se reasocia con una secuencia cuyo nucleótido en 3' está mutado en el DNA mutante, en el que el cebador 3' porta un marcador o puede marcarse en el nucleótido 3' o cerca del mismo, y en el que se detecta la presencia del marcador en el producto de la reacción de PCR.
19. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 10, para separar moléculas de ácido nucleico lineales de moléculas de ácido nucleico circulares presentes en una muestra, comprendiendo dicho método introducir un marcador en un extremo de las moléculas de ácido nucleico lineales, en el que dicho marcador es una proteína que puede ser inmovilizada en una matriz mediante interacción directa con la matriz, y poner en contacto la muestra con una matriz a la que se unen selectivamente proteínas, por medio de lo cual dichas moléculas de ácido nucleico lineales y marcadas quedan inmovilizadas en la matriz.
20. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 10, para el empaquetamiento fágico in vitro de un fago recombinante, en el que el DNA vector se corta con una o más enzimas de restricción, los grupos OH en 3' del vector se bloquean, el vector y el DNA que ha de ser insertado se ponen en contacto en condiciones apropiadas para la ligación de los fragmentos de DNA, y los productos de la ligación se marcan con un resto capaz de unirse a grupos OH reactivos situados en 3', seguido de la separación de las moléculas marcadas y no marcadas.
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Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1559790A1 (de) * 2004-02-02 2005-08-03 International University Bremen Gmbh Vesikel zum Abtrennen von Substanzen aus flüssigen Medien
JP2007222160A (ja) * 2006-01-26 2007-09-06 National Institute Of Advanced Industrial & Technology 生体由来試料中の蛋白質の解析方法
US20080124777A1 (en) * 2006-11-29 2008-05-29 Canon U.S. Life Sciences, Inc. Method for releasing genetic material from solid phase
EP2167519A4 (en) * 2007-06-16 2011-04-13 Scarab Genomics Llc NUCLEIC ACID ENCAPSIDATION SYSTEM
WO2009045344A2 (en) * 2007-09-28 2009-04-09 Pacific Biosciences Of California, Inc. Error-free amplification of dna for clonal sequencing
US9090948B2 (en) 2008-09-30 2015-07-28 Abbott Molecular Inc. Primers and probes for detecting human papillomavirus and human beta globin sequences in test samples
GB201208726D0 (en) * 2012-05-17 2012-07-04 Oxford Gene Tech Ip Ltd Methods and materials
EP3354750A1 (en) 2012-07-18 2018-08-01 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Kit of normalizing biological samples

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS61501746A (ja) * 1984-04-05 1986-08-21 ライフ テクノロジ−ズ,インコ−ポレイテツド 核酸の固定化法
AU5640090A (en) * 1989-03-21 1990-11-05 Collaborative Research Inc. A dna diagnostic test using an exonuclease activity
GB8921227D0 (en) * 1989-09-20 1989-11-08 Wellcome Found Antibodies and proteins
US5427908A (en) * 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
NL9100567A (nl) * 1991-04-02 1992-11-02 Ingeny Bv Werkwijze voor het detecteren van mutaties, transgeen zoogdier, transgene zoogdiercel, en werkwijze voor het onderzoeken van stoffen of omstandigheden op mutagene eigenschappen.
FR2678639B1 (fr) * 1991-07-03 1993-09-17 Rhone Poulenc Rorer Sa Procede de clonage d'acides nucleiques.
US5665539A (en) * 1991-07-12 1997-09-09 The Regents Of The University Of California Immuno-polymerase chain reaction system for antigen detection
US5710028A (en) * 1992-07-02 1998-01-20 Eyal; Nurit Method of quick screening and identification of specific DNA sequences by single nucleotide primer extension and kits therefor
US5591841A (en) * 1993-01-14 1997-01-07 Ji; Huamin Rapid purification of circular DNA by triplex-mediated affinity capture
US6120992A (en) * 1993-11-04 2000-09-19 Valigene Corporation Use of immobilized mismatch binding protein for detection of mutations and polymorphisms, and allele identification in a diseased human
DE69531612D1 (de) * 1994-04-25 2003-10-02 Avitech Diagnostics Inc Die bestimmung von mutationen durch spaltung mit resolvase
US5512441A (en) * 1994-11-15 1996-04-30 American Health Foundation Quantative method for early detection of mutant alleles and diagnostic kits for carrying out the method
AU7506896A (en) * 1995-11-09 1997-05-29 Shionogi & Co., Ltd. Method for the simultaneous detection of polygenes
US6261797B1 (en) * 1996-01-29 2001-07-17 Stratagene Primer-mediated polynucleotide synthesis and manipulation techniques

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