ES2212145T3 - Administracion de sustancias por la mucosa a mamiferos. - Google Patents

Abstract

NUEVO PROCEDIMIENTO DE ADMINISTRACION A UN MAMIFERO DE UNA SUSTANCIA. ESTE PROCEDIMIENTO COMPRENDE EL CONTACTO DE LA SUPERFICIE MUCOSA DEL MAMIFERO CON LA SUSTANCIA EN COMBINACION CON UN BIOVECTOR. ESTE BIOVECTOR TIENE UN NUCLEO QUE COMPRENDE UN POLIMERO NATURAL, UN DERIVADO O UN HIDROLIZADO DE UN POLIMERO NATURAL, O SU MEZCLA. EL POLIMERO NATURAL PREFERIDO ES UN POLISACARIDO O UN OLIGOSACARIDO. EL NUCLEO ESTA OCASIONALMENTE REVESTIDO DE UN COMPUESTO ANFIFILICO, COMO POR EJEMPLO UN LIPIDO.

Description

Administración de sustancias por la mucosa a mamíferos.

Se han desarrollado un gran número de sustancias farmacéuticas con diversos propósitos para la introducción en animales, con inclusión de humanos. Las sustancias incluyen agentes terapéuticos, tales como fármacos; agentes profilácticos, tales como antígenos para uso en vacunas; y agentes diagnósticos, tales como agentes de formación de imágenes marcados. Las sustancias pueden introducirse por una diversidad de modos de administración enterales y parenterales.

Recientemente se ha registrado una proliferación de compuestos farmacéuticos potenciales y reales que son macromoléculas, tales como proteínas y moléculas de ácido nucleico. Estos compuestos macromoleculares presentan problemas particulares para el suministro del fármaco, dado que tienden a ser inestables, absorberse deficientemente, y metabolizarse fácilmente.

Se ha registrado también un interés renovado en la administración mucosal de sustancias farmacéuticas. La mucosa hace referencia al tejido epitelial que reviste las cavidades internas del cuerpo, tales como el tracto gastrointestinal, el tracto respiratorio, los pulmones y los órganos genitales. Para el propósito de esta administración, la mucosa incluirá también la superficie externa del ojo, es decir, la córnea.

Algunos modos comunes de administración mucosal incluyen las administraciones oral y nasal. Los métodos de administración ocular conocidos corrientemente están sometidos a diversas limitaciones que ponen en compromiso su eficacia. Estos problemas incluyen el drenaje nasolacrimal rápido, la penetración deficiente en la córnea, la pérdida conjuntiva no productiva, y exposición sistémica indeseable.

Almeida et al., han revisado la administración mucosal de las vacunas en general, y la administración nasal de las vacunas en particular en la publicación Journal of Drug Targeting 3, 456-467 (1996). La inmunidad mucosal está basada en la existencia en la mucosa de tejido linfoide mucoso-asociado (MALT). Éstos incluyen tejido linfoide asociado al intestino (GALT), tejido linfoide asociado a los bronquios (BALT), y tejido linfoide asociado al órgano nasal (NALT). La inmunización mucosal es susceptible de inducir una respuesta inmune tanto local (IgA) como sistémica (IgG). Adicionalmente, existe un sistema inmune mucosal común, por el cual un antígeno entra en el MALT en un punto local y es transportando a través de los ganglios linfáticos regionales a otras superficies mucosas, en las cuales se induce también una respuesta inmune.

Las sustancias farmacéuticas pueden administrarse sea en ausencia o en presencia de un vehículo. Tales vehículos pueden atender a diversos propósitos, tales como la liberación controlada de moléculas biológicamente activas, y el direccionamiento de las moléculas biológicamente activas a tejidos específicos.

Illum et al. investigaron tres microesferas como sistemas potenciales de suministro nasal de fármacos. Las microesferas eran albúmina, almidón, y DEAE-Sephadex. Aunque estas microesferas se mostraron prometedoras en cierto grado, precisan ser resueltos todavía ciertos problemas.

Por ejemplo, Illum et al. consignaron que el tamaño de las microesferas tiene que ser mayor que 10 \mum. Sin embargo, tales partículas grandes presentan ciertas desventajas. Por ejemplo, las mismas no pueden esterilizarse por ultrafiltración, requiriendo otros métodos, tales como el uso de conservantes.

Adicionalmente, Illum et al. registraron la dificultad en la liberación de fármacos a partir de microesferas que tengan una carga catiónica. Existen ventajas en las microesferas cargadas positivamente, debiendo resolverse los problemas consignados por Illum et al.

A menudo se utilizan liposomas como vehículos para sustancias. Los liposomas han demostrado potencial como sistemas de suministro de liberación controlada de fármacos y como adyuvantes inmunológicos. El uso de liposomas como vehículos para vacunas se expone en el artículo publicado por Almeida et al. arriba mencionado. De un modo más específico, el uso de liposomas como vehículos para vacunas contra la gripe ha sido expuesto por El Guink et al., Vaccine 7, 147-151 (1989), y en la Patente U.S. 4.196.191 de la Burroughs Wellcome Company y la Solicitud de Patente Internacional PCT WO 92/03162 de la Fundación Wellcome.

Existen, sin embargo, desventajas en el uso de liposomas como vehículo para compuestos activos. Por ejemplo, únicamente pueden incorporarse por regla general pequeñas cantidades de un compuesto en un liposoma, y la relación de compuesto activo a lípido es baja. Además, el compuesto activo se libera a menudo demasiado pronto.

Los liposomas presentan también ciertas desventajas de fabricación. Por ejemplo, se utilizan detergentes y disolventes para aumentar la solubilidad durante una fase del proceso de fabricación. Estos detergentes y disolventes tienen que eliminarse del fármaco en una etapa posterior.

Otras dificultades en el uso de liposomas como sistemas de suministro de fármacos han sido consignadas por Meisner en el Capítulo 3, página 31 de Pharmaceutical Particulate Carriers-Therapeutic Applications, A. Roland, compilador, Marcel Dekker, 1993. Existe, por esta razón, la necesidad de un vehículo más flexible para las sustancias.

Otros vehículos para sustancias han sido descritos en la Patente U.S. 4.921.757 y 4.900.556 del Instituto de Tecnología de Massachussets; la Patente U.S 5.354.853 de Genzyme Corporation; y la Patente Europea 352295 de Access Pharmaceuticals, Inc. Por ejemplo, la Patente de Access describe un vehículo para fármacos y agentes de diagnóstico que tiene un agente aglomerante multivalente, tal como heparina. El agente aglomerante multivalente es específico para determinantes de la superficie endotelial, y puede ser tan grande como tres micrómetros.

Los vehículos descritos en la Patente de Access tienen, sin embargo, ciertas desventajas. En primer lugar, los vehículos de Access se fijan específicamente a las células endoteliales. Asimismo, la Patente de Access describe únicamente vehículos pre-cargados con el fármaco o agente de diagnóstico antes de la administración. Dichos métodos pueden conducir a inestabilidad. Así, los Ejemplos X y XII en la página 19 de la Patente de Access miden la estabilidad en horas. Asimismo, los vehículos descritos en la Patente de Access son generalmente demasiado grandes para poder someterse a microfiltración.

Además de las arriba mencionadas, se conocen numerosas otras microesferas y nanoesferas. Estas incluyen polímeros de poliacrilato, látex, y polilactida. Björk y Edman, International Journal of Pharmaceuticals 47, 233 (1988) han consignado que microesferas de almidón, celulosa y dextranos pueden actuar como mejoradores de la absorción si satisfacen ciertos criterios, a saber, que tienen que ser absorbentes de agua, insolubles en agua, y administradas a la nariz en forma de polvo.

Un nuevo tipo de vehículo mejorado ha sido descrito por el Centro Nacional de la Investigación Científica (CNRS) en el documento EP 0 344 040 y por Biovector Therapeutics, S.A. en la Solicitud Internacional PCT WO 94/20078. Estos vehículos, denominados Biovectores Supramoleculares (SMBVs) actúan como suspensiones solvatadas en agua, manteniendo al mismo tiempo su integridad como partículas encapsuladoras de sustancias. Estos SMBVs comprenden un núcleo hidrófilo no líquido, tal como un polisacárido reticulado o un oligosacárido reticulado y, opcionalmente, una capa externa que comprende un compuesto anfifílico, tal como un fosfolípido. El Biovector tiene opcionalmente ligandos catiónicos o aniónicos injertados en el núcleo de polisacárido u oligosacárido. El Biovector contiene además opcionalmente una capa de compuestos lipídicos injertada en el núcleo por enlaces covalentes. Véase la Solicitud Internacional PCT WO 94/23701. Estos Biovectores se han descrito por ser útiles en vacunas, por ejemplo en vacunas contra CMV. Véase la Solicitud Internacional PCT WO 96/06638.

Existe necesidad de un vehículo que sea capaz de suministrar eficientemente sustancias a animales, con inclusión de humanos, y que evite las desventajas de los vehículos de la técnica anterior. Un objeto de la presente invención es proporcionar un método para la administración de moléculas biológicamente activas y otras sustancias a mamíferos de una forma que evita las desventajas expuestas anteriormente. De modo más específico, un objeto de la presente invención es proporcionar un método para administrar sustancias a mamíferos por medio de un vehículo que dirige la sustancia a la mucosa de una manera inespecífica, que puede ser cargado con la sustancia inmediatamente antes de su administración, que tiene un tamaño susceptible de microfiltración, y que es estable durante al menos 12 meses e incluso uno o más años.

Sumario de la invención

Estos y otros objetivos, como será apreciado por quienes poseen una experiencia ordinaria en la técnica, se han alcanzado proporcionando un nuevo método para la administración mucosal de una sustancia a un mamífero. El método comprende poner en contacto una superficie de la mucosa del mamífero con la sustancia en combinación con un Biovector. El Biovector tiene un núcleo que comprende un polisacárido reticulado o un oligosacárido reticulado, o un derivado o hidrolizado de un polisacárido reticulado o de un oligosacárido reticulado, o una mezcla de los mismos con 0,2 a 3 miliequivalentes de carga iónica positiva por gramo de núcleo injertado al núcleo.

La invención se refiere adicionalmente al uso de Biovectores asociados con uno o más compuestos biológicamente activos para preparar una composición para propósitos terapéuticos o preventivos, especialmente contra agentes infecciosos, por la vía de administración mucosal a un mamífero.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra la tasa de aclaramiento de Biovectores radiomarcados con ^{14}C de la mucosa nasal después de administración de Biovectores marcados con ^{14}C a ratas. El porcentaje del radiomarcador ^{14}C remanente en el cornete (cavidad) nasal se representa en función del número de horas subsiguientes a la administración. El protocolo se describe en el Ejemplo II. Los cuadrados representan Biovectores catiónicos, los diamantes representan Biovectores aniónicos, y los triángulos representan ^{14}C libre (control).

La Figura 2 muestra la concentración en ng/ml del radiomarcador encontrada en el plasma tres, seis, y doce horas después de la administración de Biovectores radiomarcados con ^{14}C a ratas de acuerdo con el protocolo descrito en el Ejemplo II. Los triángulos llenos representan SMBV-P1, los círculos llenos representan SMBV-P2, los cuadrados llenos representan SMBV-P3, los triángulos vacíos representan SMBV-Q1, los círculos vacíos representan SMBV-Q2 y los cuadrados vacíos representan SMBV-Q3.

La Figura 3 muestra las concentraciones medias de radiactividad como porcentaje de la dosis administrada en la cavidad nasal de individuos humanos voluntarios.

La Figura 4 muestra las concentraciones medias de radiactividad en las cavidades del estómago y del intestino como porcentaje de la dosis administrada en función del tiempo.

La Figura 5 muestra el análisis en gradiente de sacarosa (0 a 20%) de fracciones recogidas para la formulación SMBV/HA y HA exclusivamente, en la cual la proteína se rastreó utilizando fluorescencia intrínseca de proteínas a 280 nm o un ensayo de proteínas (técnica microBSA).

La Figura 6 muestra los recuentos normalizados por minuto/mililitro (cpm/ml) en función del tiempo para ^{111}In-DPTA+SMBV y ^{111}In-DPTA administrados por vía nasal.

La Figura 7 muestra los recuentos normalizados por minuto/mililitro (cpm/ml) en función del tiempo para ^{111}In-DPTA+SMBV y ^{111}In-DPTA administrados por vía vaginal.

La Figura 8 muestra los recuentos normalizados por minuto/mililitro (cpm/ml) en función del tiempo para ^{111}In-DPTA+SMBV y ^{111}In-DPTA administrados por vía sublingual.

La Figura 9 es un gráfico de barras que compara el AUC (área bajo la curva) plasmática para las rutas de administración siguientes: intravenosa, nasal, vaginal y sublingual.

La Figura 10 muestra el análisis en gradiente de sacarosa (0 a 20%) de fracciones recogidas para una formulación de SMV/antígeno de la gripe, el núcleo de polisacárido (PSC) y la membrana lipídica, analizadas por fluorescencia intrínseca de proteínas a 280 nm y la técnica microBSA.

La Figura 11 muestra el análisis en gradiente de sacarosa (0 a 20%) de fracciones recogidas para SMBV-Q2 con cuatro componentes de capa externa diferentes (DPPC, DPPC/colesterol, PC de huevo/colesterol y PC de huevo) y HA exclusivamente, analizadas por fluorescencia intrínseca de proteínas a 280 nm y por la técnica microBSA.

Descripción detallada de la invención

En la descripción de la invención que sigue, se aplicarán las interpretaciones siguientes. El término "comprenden" seguido por un elemento de la invención utilizado en la descripción de una realización de la invención significa que la realización incluye dicho elemento, pero sin carácter necesariamente limitante. La realización puede incluir también otros miembros del mismo elemento u otros elementos. Un elemento descrito en singular, es decir "sustancia", no excluye la presencia de más de un elemento, es decir "sustancias". Todos los números son aproximados, a no ser que el lenguaje de la memoria descriptiva o su contexto indique otra cosa.

Inesperadamente, se ha descubierto que los Biovectores, como se describen en la Solicitud Internacional PCT WO 94/23701, WO 94/20078, y WO 96/06638, son particularmente adecuados para la administración mucosal de sustancias a mamíferos, con inclusión de animales de granja, animales de compañía, animales de laboratorio, y humanos. La mucosa hace referencia al tejido epitelial que reviste las cavidades internas del cuerpo. Por ejemplo, la mucosa comprende el canal alimentario, con inclusión de la boca, el esófago, el estómago, los intestinos, y el ano; el tracto respiratorio, con inclusión de los conductos nasales, la tráquea, los bronquios y los pulmones; y los órganos genitales. Para el propósito de esta memoria descriptiva, la mucosa incluirá también la superficie externa del ojo, es decir la córnea.

La sustancia en combinación con el Biovector puede añadirse a cualquier superficie de la mucosa. Algunas superficies mucosas particularmente adecuadas incluyen, por ejemplo, las superficies nasal, bucal, oral, vaginal, ocular, auditiva, del tracto pulmonar, uretral, del tracto digestivo, o rectal.

El polisacárido u oligosacárido reticulado se fija preferiblemente de modo inespecífico a la superficie de la mucosa. Los solicitantes han descubierto inesperadamente que los polisacáridos y oligosacáridos que se fijan inespecíficamente de acuerdo con la invención constituyen vehículos excelentes para el suministro de sustancias a las superficies mucosas. Este descubrimiento es sorprendente, dado que, como se ha mencionado arriba, la Patente Europea 352 296 de Access Pharmaceuticals consignaba el requerimiento de un agente de fijación multivalente específico para determinantes de la superficie endotelial en los vehículos para fármacos y agentes de diagnóstico.

Propiedades de los Biovectores

El Biovector comprende un núcleo de un polisacárido reticulado o un oligosacárido reticulado, o un derivado o hidrolizado de un polisacárido reticulado o un oligosacárido reticulado, o una mezcla de los mismos. El polisacárido u oligosacárido puede estar reticulado naturalmente o puede reticularse por vía química por métodos conocidos en la técnica. Algunos métodos de reticulación químicos adecuados incluyen, por ejemplo, poner en contacto el polisacárido u oligosacárido con un agente multifuncional, tal como epiclorhidrina u oxicloruro fosforoso. La relación molar mínima de agente de reticulación a residuo de glucosa puede ser, por ejemplo, 1:15, 1:12, ó 1:10 en el caso del oxicloruro fosforoso y 1:50, 1:40 ó 1:30 en el caso de la epiclorhidrina. La relación molar máxima de agente de reticulación a residuo de glucosa puede ser, por ejemplo, 1:0,5, 1:07, ó 1:1 en el caso del oxicloruro fosforoso y 1:2, 1:3, ó 1:5 en el caso de la epiclorhidrina. Para la epiclorhidrina, un intervalo preferido de las relaciones de agente de reticulación a residuo de glucosa es 1:15 a 1:7. Para el oxicloruro fosforoso, un intervalo preferido de relaciones de agente de reticulación a residuo de glucosa es 1:7 a 1:2. Cuando se utiliza oxicloruro fosforoso como el agente multifuncional, el producto reticulado comprende preferiblemente de modo aproximado 0,1 a 3,0 mmoles de fosfato/gramo, preferiblemente 0,4 a 1,0 mmoles de fosfato/gramo, de producto final.

Algunos ejemplos adecuados de polisacáridos reticulados naturalmente incluyen, por ejemplo, celulosa y sus derivados. Algunos ejemplos adecuados de polisacáridos reticulados por vía química incluyen, por ejemplo, almidón reticulado con epiclorhidrina, es decir microesferas de almidón degradables (DSM), y dextrano reticulado con epiclorhidrina, es decir Sephadex.

Los polisacáridos u oligosacáridos útiles en la presente invención pueden derivarse de cualquier monómero de sacárido. La glucosa es el monosacárido preferido. Los polímeros u oligómeros pueden formarse a partir de los monómeros en la orientación \alpha o \beta, y pueden estar enlazados en las posiciones 1-4 ó 1-6 de cada unidad de sacárido. Los polisacáridos u oligosacáridos tienen preferiblemente un peso molecular comprendido entre 1.000 y 2.000.000 de daltons, preferiblemente 2.000 a 100.000 daltons, y muy preferiblemente 3.000 a 10.000 daltons.

Los polisacáridos preferidos son almidón (polímeros 1-4 de \alpha-glucosa) y dextrano (polímeros 1-6 de \alpha-glucosa derivados de bacterias). Se prefiere especialmente el almidón. Es adecuado almidón procedente de cualquiera de las fuentes bien conocidas de almidón. Algunas fuentes adecuadas de almidón incluyen, por ejemplo, patata, trigo, maíz, etc. Otros polisacáridos adecuados incluyen, por ejemplo, pectinas, amilopectinas, quitosano, y glucosaminoglucano.

Los polisacáridos u oligosacáridos reticulados pueden ser también derivados de hidrolizados de los polisacáridos u oligosacáridos reticulados arriba mencionados. Algunos hidrolizados de almidón preferidos incluyen, por ejemplo, almidón hidrolizado con ácidos, tal como dextrinas, o almidón hidrolizado con enzimas, tal como maltodextrinas. El grado de hidrólisis del polisacárido u oligosacárido está determinado por el poder reductor del hidrolizado, expresado comúnmente como el Equivalente de Dextrosa (DE). El intervalo de DE varía preferiblemente entre 2 y 20, preferiblemente entre 2 y 12.

Un grupo iónico (0,2 a 3 miliequivalentes, preferiblemente 0,2 a 2 miliequivalentes, de carga iónica por gramo) se injerta opcionalmente en el polisacárido u oligosacárido reticulado. El grupo iónico puede ser un grupo aniónico o un grupo catiónico. Los Biovectores tienen preferiblemente un mínimo de 0,2, 0,4, 0,6, ó 0,8 miliequivalentes de carga iónica por gramo de núcleo de polisacárido, y un máximo de 1,2, 1,4, 1,6, ó 1,8 miliequivalentes de carga iónica por gramo de núcleo de polisacárido. Se conocen en la técnica métodos para injertar grupos iónicos a polisacáridos y oligosacáridos.

El polisacárido u oligosacárido reticulado puede hacerse aniónico por injerto de un grupo cargado negativamente o grupo ácido. Algunos grupos aniónicos adecuados injertados al polisacárido u oligosacárido incluyen, por ejemplo, fosfato, sulfato o carboxilato. El grupo aniónico puede injertarse por tratamiento del polisacárido u oligosacárido con un derivado activado de un ácido polivalente, tal como ácido fosfórico, ácido sulfúrico, ácido succínico, o ácido cítrico. Derivados activados de ácidos polivalentes incluyen, por ejemplo, haluros de acilo, anhídridos, y ésteres activados. El grupo aniónico preferido es fosfato injertado por la vía de tratamiento con oxicloruro fosforoso. Un Biovector al cual está injertado un grupo fosfato se conoce como SMBV-P.

El polisacárido u oligosacárido puede hacerse catiónico por injerto de un ligando que comprende un grupo cargado positivamente o grupo básico. Algunos grupos catiónicos adecuados injertados al polisacárido u oligosacárido incluyen, por ejemplo, iones amonio cuaternario, y aminas primarias, secundarias, o terciarias. Algunos ligandos adecuados que pueden injertarse al polisacárido u oligosacárido incluyen, por ejemplo, colina, 2-hidroxipropiltrimetilamonio, 2-dimetilaminoetanol, 2-dietilaminoetanol, 2-dimetilamino-etilamina, y 2-dietilaminoetilamina. Estos ligandos pueden injertarse convenientemente al polisacárido u oligosacárido por métodos conocidos en la técnica, tales como, por ejemplo, por contacto del polisacárido u oligosacárido con un derivado adecuado del grupo alquilo respectivo, tal como un cloruro, bromuro, yoduro, o epóxido.

Otro método adecuado para injertar grupos catiónicos al polisacárido u oligosacárido incluye injertar un ácido polivalente, como se ha descrito arriba, y utilizar luego un grupo ácido libre, tal como un grupo carboxilato libre, para injertar el ligando básico por la vía, por ejemplo, de un enlace de amida o éster. Los aminoácidos se injertan convenientemente de este modo. Algunos ejemplos adecuados de aminoácidos incluyen, por ejemplo, glicina, alanina, ácido glutámico o ácido aspártico.

El grupo catiónico preferido es amonio cuaternario. Un Biovector al cual está injertado un grupo amonio cuaternario se conoce como SMBV-Q.

Debe observarse que Illum et al., International Journal of Pharmaceutics 39, 189-199 (1987), han consignado el hecho de que no se encuentra cantidad detectable alguna de los fármacos modelo liberados de un microesfera catiónica de dextrano, DEAE-Sephadex. Illum et al. atribuyen esta falta de liberación a la fijación del fármaco modelo a los sitios catiónicos de fijación en la matriz de la microesfera. Sin embargo, los solicitantes han encontrado inesperadamente una liberación eficiente de sustancias a partir de polisacáridos, a los cuales se han injertado grupos catiónicos.

Opcionalmente, el núcleo de polisacárido u oligosacárido del Biovector está unido covalentemente a una capa de compuestos lipídicos. La capa de compuestos lipídicos puede recubrir el núcleo del polisacárido u oligosacárido parcialmente o por completo. La capa lipídica comprende preferiblemente ácidos grasos naturales, como se describe en la Solicitud Internacional PCT WO 94/23701.

El polisacárido u oligosacárido reticulado, sea con o sin una capa lipídica, puede estar recubierto también opcionalmente en parte o por completo con una capa externa de uno o más compuestos anfifílicos. Tales Biovectores se conocen como Biovectores ligeros o L-SMBV. Los Biovectores constituidos exclusivamente por un núcleo de polisacárido u oligosacárido reticulado se conocen como Biovectores de núcleo.

El recubrimiento anfifílico se adhiere preferiblemente al polisacárido u oligosacárido reticulado, o a la capa lipídica opcional, por medio de enlaces no covalentes, por ejemplo por medio de enlaces iónicos o enlaces de hidrógeno. Los compuestos anfifílicos adecuados para el recubrimiento se seleccionan de modo que confieran un entorno físico-químico apropiado a la sustancia, el modo de administración mucosal, y el efecto deseado.

El recubrimiento anfifílico puede comprender cualquier compuesto anfifílico que pueda absorberse en la superficie del núcleo del Biovector. De modo preferible, el recubrimiento anfifílico comprende principalmente un fosfolípido o ceramida natural o sintético(a), o una mezcla de los mismos.

El grupo fosfato del fosfolípido puede estar injertado opcionalmente a grupos iónicos o neutros. Algunos fosfolípidos adecuados incluyen, por ejemplo, fosfatidil-colina, fosfatidil-hidroxicolina, fosfatidil-etanolamina, fosfatidil-serina, y fosfatidil-glicerol. Un fosfolípido preferido es dipalmitoil-fosfatidilcolina (DPPC).

El recubrimiento anfifílico puede comprender también un derivado de un fosfolípido o ceramida. Algunos derivados adecuados de fosfolípidos incluyen PEG-fosfolípidos, y fosfolípidos injertados a otras moléculas o polímeros.

El recubrimiento anfifílico puede comprender también otros compuestos anfifílicos, sea por sí mismos o en combinación con los fosfolípidos, ceramidas, o derivados arriba descritos. Algunos ejemplos adecuados de dichos otros compuestos anfifílicos incluyen poloxámeros, polioxietileno modificado, y otros detergentes y compuestos tensioactivos.

Pueden añadirse compuestos adicionales y mezclas de los mismos a los fosfolípidos o ceramidas en el recubrimiento anfifílico. Algunos ejemplos de tales compuestos adicionales incluyen ácidos grasos, esteroides (tales como colesterol), triglicéridos, lipoproteínas, glicolípidos, vitaminas, detergentes, y agentes tensioactivos.

La preparación de Biovectores puede llevarse a cabo normalmente de modo conveniente, sea como un proceso simple de un solo paso (en el caso de un Biovector de núcleo) o como un proceso de dos pasos: se prepara primeramente el núcleo y se recubre luego con un compuesto anfifílico para crear un Biovector ligero.

El tamaño del Biovector es un elemento importante de la presente invención. Por ejemplo, Illum et al. han subrayado la importancia de microesferas que tengan un tamaño mayor que 10 \mum para suministro nasal. Véase Illum et al., International Journal of Pharmaceutics 39, 189-199 (1987).

Sin embargo, los solicitantes han encontrado de modo inesperado que Biovectores mucho menores que 10 \mum son vehículos altamente eficientes para la administración de sustancias a la mucosa nasal, así como a otras mucosas. Los Biovectores de la presente invención tienen preferiblemente un diámetro mínimo de aproximadamente 20 nm, de modo más preferible aproximadamente 30 nm, y de modo muy preferible aproximadamente 40 nm. El tamaño máximo de los Biovectores es aproximadamente 200 nm, de modo más preferiblemente aproximadamente 150 mm, y de modo muy preferible aproximadamente 100 nm. El tamaño óptimo del Biovector está comprendido entre 80 y 90 nm, y es muy óptimamente del orden de 80 nm.

El tamaño relativamente pequeño de los Biovectores confiere diversas ventajas, que hacen los Biovectores aún más adecuados para la administración a las mucosas. Por ejemplo, los Biovectores tienen superficies y volúmenes relativos mayores que las nanoesferas y microesferas de mayor tamaño. Adicionalmente, el pequeño tamaño de los Biovectores permite su esterilización cómoda por microfiltración, evitándose de este modo la necesidad de conservantes.

Los Biovectores se pueden administrar en diversas formas. Por ejemplo, los Biovectores pueden administrarse en forma dispersada, tal como suspensiones o geles. Los Biovectores pueden producirse también en forma seca por métodos conocidos en la técnica, y administrarse en un dispositivo de dosificación medida adecuado.

Por ejemplo, una suspensión o gel de Biovectores dispersados puede secarse por liofilización o secado por pulverización. Todos los Biovectores ligeros, tales como Biovectores ligeros aniónicos y catiónicos, así como todos los Biovectores de núcleo, tales como Biovectores de núcleo aniónicos y catiónicos, pueden secarse. Los Biovectores se pueden administrar en forma seca, o pueden resuspenderse (es decir, rehidratarse) en un medio adecuado, preferiblemente un líquido o gel acuoso farmacéuticamente aceptable, y administrarse. Para los propósitos de esta administración, la expresión Biovectores resuspendidos significa Biovectores que se han secado y resuspendido en un medio acuoso.

Sustancias para administración mucosal

La sustancia administrada a un mamífero en combinación con un Biovector de acuerdo con la presente invención puede ser cualquier sustancia que se administre a un mamífero. Algunas sustancias adecuadas incluyen, por ejemplo, agentes terapéuticos, agentes profilácticos y agentes de diagnóstico. Una sustancia puede introducirse para más de un propósito, tal como, por ejemplo, como agentes terapéuticos y profilácticos en combinación, agentes profilácticos y de diagnóstico, y agentes terapéuticos y de diagnóstico.

El agente terapéutico puede ser cualquier composición de materia utilizada en el tratamiento de enfermedades y afecciones que afligen a los mamíferos. Algunos ejemplos adecuados de agentes terapéuticos incluyen un producto radiofarmacéutico, un fármaco analgésico, un agente anestésico, un agente anoréxico, un agente anti-anemia, un agente anti-asma, un agente anti-diabético, una anti-histamina, un fármaco anti-inflamatorio, un fármaco antibiótico, un fármaco antimuscarínico, un fármaco anti-neoplástico, un fármaco antivírico, un fármaco cardiovascular, un estimulador del sistema nervioso central, un depresor del sistema nervioso central, un anti-depresivo, un anti-epiléptico, un agente ansiolítico, un agente hipnótico, un sedante, un fármaco anti-psicótico, un beta-bloqueante, un agente hemostático, una hormona, un vasodilatador, un vasoconstrictor, una vitamina, etc.

El agente profiláctico que se administra a un mamífero en combinación con un Biovector de acuerdo con la invención puede ser cualquier agente profiláctico utilizado para prevenir o reducir el efecto de cualquier enfermedad o afección que aflija a los mamíferos por cualquier mecanismo. Por ejemplo, el agente profiláctico puede ser un antígeno utilizado en una vacuna contra un patógeno. El patógeno puede, por ejemplo, ser un virus o un microorganismo, tal como una bacteria, una levadura, o un hongo. El virus puede ser, por ejemplo, un virus de la gripe, tal como Haemo-philus influenzae; un citomegalovirus; HIV; un papilomavirus; un virus respiratorio sincitial; un virus de la poliomielitis; un poxvirus, tal como el virus de la varicela (es decir el virus varicela-zóster); un virus del sarampión, un arbovirus; un virus de Coxsackie; un herpesvirus, tal como un virus de herpes símplex; un hantavirus; un virus de la hepatitis, tal como virus de la hepatitis A, B, C, D, E, o G; un virus de la enfermedad de Lyme, tal como Borrelia burgdorferi; un virus de las paperas, tal como Paramixovirus; o un rotavirus, tal como los rotavirus A, B, o C. Se han obtenido resultados particularmente satisfactorios con vacunas contra el virus de la gripe e HIV.

Una bacteria contra la cual es eficaz una vacuna de acuerdo con la presente invención puede ser cualquier bacteria susceptible de causar enfermedad en los mamíferos. Por ejemplo, la bacteria puede ser un miembro del género Neisseria, tal como N. gonorrhoeae y N. meningitidis; Aerobactor, Pseudomonas; Porfiromonas, tal como P. gingivalis; Salmonella, Escherichia, tal como E. coli; Pasteurella; Shigella; Bacillus; Helibacter, tal como H. pylori; Corynebacterium, tal como C. diphteriae; Clostridium, tal como C. tetanii; Mycobacterium, tal como M. tuberculosis y M. leprae; Yersinia, tal como Y. pestis; Staphylococcus; Bordetella, tal como B. pertussis; Brucella, tal como B. abortus; Vibrio, tal como V. cholerae; y Streptococcus, tales como Streptococci mutantes.

Otros patógenos contra los cuales es eficaz una vacuna de acuerdo con la presente invención incluyen, por ejemplo, un miembro del género Plasmodium, tal como la especie que causa la malaria; un miembro del género Schistosoma, tal como la especie que causa la esquistosomiasis o Bilharzia; y un miembro del género Candida, tal como C. albicans.

La sustancia que puede combinarse con un Biovector puede ser un agente de diagnóstico. El agente de diagnóstico puede ser cualquier composición de materia que se introduce en un mamífero con el propósito de detectar cualquier enfermedad o afección, o para detectar la concentración de una sustancia diferente añadida al mamífero, tal como un fármaco o una vacuna. Por ejemplo, el agente de diagnóstico puede ser un agente de contraste o un agente de formación de imágenes, con inclusión de un agente de formación de imágenes magnético, que es capaz de detectar un órgano u otra parte interna del cuerpo del mamífero. Alternativamente, el agente de diagnóstico puede ser capaz de detectar irregularidades dentro del mamífero, tales como irregularidades de la córnea, el tracto respiratorio, el tracto digestivo, el canal auditivo, la uretra, el recto, o cualquier otra parte de un mamífero que contenga una membrana mucosa.

Para los propósitos arriba indicados, el agente de diagnóstico se marca ventajosamente con un grupo detectable. El grupo detectable puede ser, por ejemplo, un grupo radiactivo; un grupo fluorescente, tal como, por ejemplo, fluoresceno; un grupo visible, tal como, por ejemplo, un colorante marcador; o un grupo magnético, preferiblemente adecuado para formación de imágenes por resonancia magnética.

La sustancia a suministrar en combinación con un Biovector puede ser, por ejemplo, una molécula química pequeña o una molécula biológica. Una molécula química pequeña es usualmente una molécula no polímera que puede existir o no naturalmente en el mamífero al que se administra. La molécula química pequeña puede ser, por ejemplo, una molécula orgánica, una molécula inorgánica, o una molécula organo-metálica. Algunos ejemplos de moléculas químicas pequeñas incluyen esteroides, porfirinas, nucleótidos, nucleósidos, etc., así como mezclas y derivados de los mismos.

Los Biovectores son particularmente eficaces en el suministro de moléculas biológicas a las mucosas. Para los propósitos de esta memoria descriptiva, una molécula biológica es un polímero de un tipo que existe en la naturaleza, o un monómero o resto del mismo. Tales polímeros comprenden típicamente monómeros tales como aminoácidos, nucleósidos, nucleótidos, y sacáridos, así como sus mezclas. Algunas clases estructurales de moléculas biológicas incluyen, por ejemplo, aminoácidos, péptidos, proteínas, glicoproteínas, y lipoproteínas; proteoglucanos; monosacáridos, oligosacáridos, polisacáridos, y lipopolisacáridos; ácidos grasos, con inclusión de eicosanoides; lípidos, con inclusión de triglicéridos, fosfolípidos, y glicolipídos.

Moléculas biológicas adicionales que pueden suministrarse a las mucosas por medio de Biovectores incluyen nucleótidos, nucleósidos y moléculas de ácido nucleico, con inclusión de polímeros y oligómeros de DNA y RNA. Los ácidos nucleicos pueden ser, por ejemplo, ribozimas y oligonucleótidos antisentido. Los ácidos nucleicos pueden administrarse por su propio potencial diagnóstico o terapéutico, o por su capacidad para expresarse en conexión con terapia génica.

Algunas clases funcionales de moléculas biológicas incluyen, por ejemplo, citoquinas, factores de crecimiento, enzimas, antígenos (con inclusión de epítopes de antígenos y haptenos), anticuerpos, hormonas (con inclusión de hormonas tanto naturales como sintéticas y sus derivados), co-factores, receptores, encefalinas, endorfinas, neurotransmisores y nutrientes. Algunos ejemplos específicos de moléculas biológicas incluyen, por ejemplo, insulina, un interferón, tal como un \alpha-, \beta- o \gamma-interferón; una interleuquina, tal como cualquiera de IL-1 a IL-15; cualquiera de los receptores de interleuquinas, tales como el receptor de IL-1; calcitonina; factores de crecimiento, tales como eritropoyetina, trombopoyetina, factor de crecimiento epidérmico, y factor 1 del crecimiento semejante a la insulina.

La administración de las sustancias de acuerdo con la presente invención puede ir acompañada por uno o más compuestos suplementarios para mejorar la actividad, propiedades, o comerciabilidad de la sustancia. Por ejemplo, se conocen en la técnica adyuvantes que mejoran la eficiencia de absorción de la mucosa. Algunos ejemplos de tales mejoradores de la absorción de las mucosas incluyen, por ejemplo, sales biliares, tales como glicocolato de sodio, y agentes tensioactivos, tales como polioxietileno-9-lauril-éter. Se conocen también adyuvantes para mejora de la inmunogenicidad de los antígenos. Algunos ejemplos de mejoradores de la inmunogenicidad incluyen, por ejemplo, MPL, Quil A, QS21, LPS, endotoxinas, CTB, y BCG. Algunos compuestos suplementarios adicionales incluyen, por ejemplo, desinfectantes, conservantes, agentes tensioactivos, agentes estabilizadores, agentes quelantes, y agentes colorantes.

Otra característica importante de la presente invención es la flexibilidad en la administración de sustancias a la mucosa. Por ejemplo, al contrario que la mayoría de los restantes vehículos farmacéuticos, la presente invención proporciona el suministro de más de una sustancia por Biovector a suministrar a una superficie de la mucosa.

Existe también flexibilidad en el caso en que una, o más de una sustancia, está localizada en el vector. Por ejemplo, la una, o más de una sustancia puede estar localizada en el núcleo interior del polisacárido u oligosacárido reticulado. Alternativamente, la una, o más de una, sustancia puede estar localizada en la superficie externa del polisacárido u oligosacárido reticulado.

Si el polisacárido u oligosacárido reticulado está recubierto con una capa anfifílica, la una, o más de una, sustancia puede estar localizada en el núcleo interno de la capa del compuesto anfifílico. Alternativamente, la una, o más de una, sustancia puede estar localizada en la superficie externa de la capa del compuesto anfifílico.

Si se administra a un mamífero más de una sustancia por Biovector, alguna o la totalidad de las sustancias pueden estar localizadas en la misma parte del Biovector. Alternativamente, alguna o la totalidad de las sustancias pueden estar localizadas en las diferentes partes del Biovector.

Se conocen métodos para dirigir sustancias a diversas partes de los Biovectores. Véase la Solicitud Internacional PCT WO 94/20078.

Como en el caso de otros vehículos, la sustancia puede pre-cargarse en un biovector, y el Biovector cargado puede almacenarse antes de la administración al mamífero. Preferiblemente, sin embargo, la sustancia se somete a post-carga en un Biovector vacío inmediatamente antes de su envasado o, v.g. en el caso de sustancias lábiles, por ejemplo, el Biovector puede utilizarse como el medio de dilución para retener la sustancia inmediatamente antes de la administración al mamífero. Se conocen métodos para pre-cargar y post-cargar Biovectores. Véanse, por ejemplo, las solicitudes internaciones PCT WO 94/20078, WO 94/23071, y WO 96/06638 de Biovector Therapeutics S.A.

Ventajas de la administración mucosal con Biovectores

Algunas de las ventajas de la administración mucosal de sustancias a mamíferos pueden verse tomando como referencia a los ejemplos que siguen. Estas ventajas se describen únicamente por razones ilustrativas.

Como se muestra en el experimento descrito en el Ejemplo II, verbigracia, los grupos iónicos de ("sic") permiten modificar el modo de administración de los Biovectores se de acuerdo con los requerimientos de un caso particular. El protocolo se describe en detalle en el Ejemplo II. Resumidamente, se administraron tres formulaciones catiónicas y tres formulaciones aniónicas de Biovectores marcados con ^{14}C por vía intranasal a ratas. En diversos momentos, se sacrificaron las ratas, y se determinó el porcentaje del marcador remanente en la cavidad nasal y en el plasma.

Los resultados de este experimento, que se muestran en la Figura 1, demostraron que aproximadamente el 30% de la dosis de tres Biovectores catiónicos administrados por vía intranasal a ratas permanecía en la cavidad nasal cinco minutos después de la administración, y estaba todavía presente después de doce horas.

La satisfactoria mucoadhesión de los Biovectores catiónicos aumentaba el tiempo de residencia del Biovector en la mucosa diana. El tiempo de residencia incrementado es importante cuando se desea una biodisponibilidad incrementada o un efecto local de la sustancia administrada. Un efecto local de la sustancia administrada se desea en una diversidad de circunstancias.

Por ejemplo, se desea un efecto local cuando se administra un fármaco antibiótico o antivírico para tratar una infección bacteriana o vírica local. Alternativamente, se desea un efecto local cuando se administra una vacuna para proteger un mamífero contra una infección de las mucosas por un microorganismo o virus. Un tercer ejemplo de una situación en la que se desea el efecto local es la administración de un agente de diagnóstico para producir una imagen de un órgano que contiene una membrana mucosa.

En contraste, los Biovectores aniónicos (SMBV-P1, SMBV-P2, y SMBV-P3) que exhiben mucoadhesión inicial comparable (cinco minutos), tienen un aclaramiento más rápido de la mucosa nasal que los Biovectores catiónicos. Con los Biovectores aniónicos, se encontró en las cavidades nasales menos del 10% de la dosis remanente 5 minutos después de la administración tres horas después de la administración. No había variación significativa alguna para las tres formulaciones aniónicas ensayadas.

Sin embargo, se encontró en el plasma una cantidad significativa de Biovectores aniónicos marcados tres horas y, en menor grado, seis horas después de la administración nasal de SMBV-P1, SMBV-P2, y SMBV-P3, respectivamente. Véanse el Ejemplo II y la Figura 2. Por consiguiente, los Biovectores aniónicos son de utilización particular cuando se desea una respuesta sistémica.

En general, existen ventajas en la utilización de Biovectores cargados positivamente para la administración de Biovectores que tengan tiempos de residencia incrementados en las mucosas. Existen ventajas en la administración de Biovectores cargados negativamente que tengan una susceptibilidad incrementada de pasar a través de la mucosa al torrente sanguíneo. Las ventajas de ambos tipos de carga de los Biovectores pueden combinarse por administración de una mezcla de un Biovector cargado positivamente y un Biovector cargado negativamente.

Los resultados del Ejemplo III confirman que el comportamiento in vivo de los Biovectores aniónicos (SMBV-P1, SMBV-P2, y SMBV-P3) es diferente del de los Biovectores catiónicos (SMBV-Q1, SMBV-Q2, y SMBV-Q3). En este experimento, ratas tratadas de acuerdo con el protocolo del Ejemplo 2 se sacrificaron después de 12 horas, y se midió el ^{14}C remanente en diversos órganos.

Como era de esperar, las cantidades relativamente grandes de ^{14}C procedente de Biovectores catiónicos encontradas en las cavidades nasales, los lavados de la cavidad nasal, y los bronquios indican un tiempo de residencia incrementado de Biovectores catiónicos en la mucosa en la cual, o cerca de la cual, se administran los Biovectores. Para los Biovectores aniónicos, la cantidad significativa de ^{14}C encontrada en el hígado y el riñón demuestra el paso trans-mucosal incrementado de los Biovectores al torrente sanguíneo.

La gran cantidad de ^{14}C procedente tanto de los Biovectores catiónicos como aniónicos encontrada en el intestino delgado y grueso indica que la eliminación de los Biovectores después de la administración nasal ocurría a través del tracto digestivo. El aumento en el tiempo de residencia de los Biovectores en el tracto digestivo es especialmente significativo para la administración oral de antígenos asociados con Biovectores en el caso de la vacunación oral.

Se demuestra una evidencia adicional de la satisfactoria mucoadhesión de los Biovectores catiónicos por los resultados presentados en el Ejemplo IV. En este experimento, Biovectores ligeros catiónicos marcados con fluoresceína en forma de suspensiones dispersadas o resuspendidas se administraron por vía intranasal a ratas. Aproximadamente el 20% de los Biovectores resuspendidos se adhieren a la mucosa después de su administración, y la misma cantidad permanece durante al menos 12 horas. Los Biovectores dispersados no se adhieren a la mucosa nasal después de tres horas, excepto a niveles bajos. Aproximadamente un tercio de los Biovectores fluorescentes administrados se encuentran todavía en suspensión en el lavado nasal cinco minutos después de la administración, pero no se encuentra cantidad alguna seis horas más tarde.

El Ejemplo V proporciona una evidencia importante de la superioridad de los Biovectores en la administración mucosal de vacunas. En este experimento, se realizó una comparación entre la administración intranasal (i.n.) de un antígeno dividido monovalente de hemaglutinina (HA) y neuraminidasa (N) preparado a partir de membranas víricas en Biovectores ligeros catiónicos con la administración intranasal y subcutánea (s.c.) de antígeno solo. El experimento demuestra que el antígeno administrado por vía i.n. en un Biovector es capaz de suscitar una respuesta mucosal y sérica superior.

Así pues, la IgG total, IgG específica y hemaglutinación inhibidora eran del mismo orden de magnitud cuando el antígeno se administró por vía i.n. en un Biovector en comparación con el antígeno administrado por vía s.c. solo. Sin embargo, la formulación antígeno/Biovector induce la producción de IgA circulante y secretora, en tanto que el antígeno solo administrado por vías s.c. o i.n., para propósitos prácticos, no lo hacía.

Además, la relación de IgG específica a IgG total en el lavado nasal era dos veces mayor en el caso en que el antígeno se administró por vía i.n. en un Biovector que en el caso en que el antígeno se administró solo por vía s.c. Una relación mayor significa que puede esperarse que la respuesta inmune sea más específica y más protectora. Si bien no se desea quedar ligados a teoría alguna, los solicitantes creen que los antígenos de membrana tales como los utilizados en este experimento son presentados por la capa externa del biovector, creando un entorno lipídico favorable para la presentación del antígeno al sistema inmune.

El experimento descrito en el Ejemplo VI compara el efecto de formulaciones diferentes de la proteína gp180 de HIV sobre la respuesta inmune mucosal de los conejos. La proteína se administró con dos formulaciones de un Biovector ligero cargado positivamente, una formulación dispersada y una formulación resuspendida. Como control, la proteína se administró en combinación con un adyuvante mucosal potente, la subunidad B de la toxina del cólera (CTB). En cada uno de los tres casos, se realizaron una serie de inmunizaciones a intervalos de treinta días. Las dos primeras inmunizaciones fueron vaginales, las dos segundas inmunizaciones fueron orales, y la inmunización final fue intramuscular.

Los resultados demostraron que los Biovectores eran al menos tan eficientes como CTB en la inducción de secreciones específicas de IgA en la vagina y en la saliva diez días después de la segunda administración vaginal, (D_{40}). Los SMBVs resuspendidos inducían un aumento del 50% de las IgAs cuando se compararon con formulaciones del antígeno con CTB o en SMBV dispersados.

Debe indicarse que la administración vaginal del antígeno inducía la secreción de IgAs específicas en la salida y en la vagina. Así pues, el antígeno, que entraba en el MALT (tejido linfoide asociado a la mucosa) al nivel vaginal, inducía la secreción de IgAs in situ. Adicionalmente, las formulaciones de Biovector eran capaces de estimular una respuesta fuerte de IgA en la saliva por entrar en el denominado "sistema inmuno-mucosal común".

El experimento descrito en el Ejemplo VII compara la inmunización intranasal de ratones con hemaglutinina de la gripe en una formulación de control con la de cuatro formulaciones de Biovectores ligeros: dispersados y cargados positivamente, dispersados y cargados negativamente, resuspendidos y cargados positivamente, y resuspendidos y cargados negativamente. Se midió el efecto de la pre-carga y la post-carga de cada formulación de Biovector sobre el título relativo de IgG en suero después de 28 días. Adicionalmente, se realizó una comparación del título relativo obtenido por administración de los Biovectores pre-cargados a animales que estaban conscientes con el obtenido por administración de los Biovectores pre-cargados a animales que estaban anestesiados.

Como era de esperar, el antígeno de la subunidad de control sin vehículo o adyuvante alguno no es muy inmunógeno cuando se administra por vía intranasal a los ratones, estén anestesiados o conscientes. De los subgrupos SMBV, los Biovectores cargados positivamente y dispersados exhibían una mejora significativa (en más de un orden de magnitud) del título con respecto a los obtenidos con el antígeno solo u otras formulaciones de Biovectores. Tanto los Biovectores pre-cargados como post-cargados tienen efectos generalmente comparables. Esta versatilidad del Biovector puede ser particularmente interesante, permitiendo o bien una mezcla de la sustancia activa con el Biovector en el momento de la administración, o la integración de la sustancia activa con el Biovector antes de su utilización.

Sorprendentemente, los animales anestesiados no exhibían un aumento significativo en títulos de anticuerpos, lo que sugería que la deposición, en su caso, del antígeno en el tracto respiratorio inferior o el pulmón tenía poco efecto biológico.

Ejemplos Ejemplo 1 Preparación de Biovectores

En los ejemplos que siguen, los Biovectores, en caso de estar marcados, se marcan antes del proceso de fosfolipidación. Cuando están cargados con un compuesto biológicamente activo(o más de uno), la carga tiene lugar después del proceso de fabricación del Biovector vacío.

I(a). Preparación del Biovector de núcleo aniónico (SMBV-P1)

Se vierten 500 g de maltodextrina (Glucidex, Roquette, Lestrem, Francia) en un reactor de 10 litros (TRIMIX) junto con 2 litros de agua desmineralizada. Después de solubilización a 4ºC, se añaden 500 ml de hidróxido de sodio (NaOH) 10 M con agitación mecánica. Cuando la temperatura de la solución se ha estabilizado a 4ºC, se añaden 1700 ml de NaOH 10 M y 283,3 ml de POCl_{3} en condiciones de flujo controladas. La reacción de reticulación tiene lugar con agitación mecánica durante un periodo de 20 horas. Al final del periodo de 20 horas, la mezcla de reacción se agita durante 15 minutos más. Se añade un volumen de 5 litros de agua desmineralizada y se ajusta el pH a 7,0 por neutralización con ácido acético glacial. El hidrogel obtenido se tritura bajo alta presión. Al final de este paso, el diámetro medio de las partículas es aproximadamente 60 nm. La purificación adicional transcurre como sigue: (1) microfiltración a 0,45 \mum para eliminar las partículas de mayor tamaño; (ii) (sic) diafiltración a volumen constante para eliminar las moléculas más pequeñas (sales, fragmentos de polisacáridos, etc). Los núcleos de polisacáridos aniónicos (PSC) se concentran luego, se añaden a matraces estériles, y se guardan a \sim20ºC.

I(b). Preparación del Biovector ligero aniónico dispersado (SMBV-P2)

Se preparan Biovectores de núcleo aniónico como se describe en el Ejemplo I(a) y se marcan como se describe en caso necesario. Los núcleos descongelados se diluyen en agua sometida a ósmosis en un matraz de vidrio a una concentración de 1 mg por mililitro (v.g. 250 mg de PSC/250 ml de agua). La dispersión se agita 5 a 10 minutos y se homogeneíza en un homogeneizador de alta presión (RANNIE Lab) a 400 bares durante 3 minutos. La suspensión se calienta a 80ºC en un baño termostático. Se añaden los lípidos de la futura membrana externa (v.g. DPPC, DPPC/colesterol, etc), en forma de polvo, en una relación de 0,3:1 (p/p) de la masa de PSC (v.g. 75 mg de lípidos para 250 mg de PSC). Los lípidos se mezclan y se solubilizan en 2,5 ml de etanol de 95% (v/v). El homogeneizador se calienta a 60ºC por circulación cerrada de agua. La solución etanólica de lípidos se inyecta en la suspensión de PSC a 80ºC y se homogeneíza luego a 450 bares durante 25 minutos a 60ºC. Al final de este paso, la preparación se introduce en un recipiente de vidrio y se elimina el etanol libre de la preparación de Biovector ligero a presión reducida. Los Biovectores ligeros aniónicos resultantes se filtran (0,2 \mum) y se guardan.

I(c). Preparación del Biovector ligero aniónico resuspendido (SMBV-P3)

Los Biovectores de núcleo aniónico y ligeros se suspenden en agua a una concentración de 1,2 mg/ml, y se distribuyen luego en dosis de 1 ml en crioviales diseñados específicamente para liofilización. Los crioviales se ponen en un liofilizador (Dura seco, FT Systems), se congelan a -30ºC, y se liofilizan por etapas, primeramente a -10ºC, luego a 0ºC, y finalmente a 10ºC durante el secado primario, y 30ºC durante el paso siguiente. El secado se completa usualmente en 24 horas. Los Biovectores liofilizados en cada criovial se rehidratan en 200 \mul de PBS.

I(d). Preparación del Biovector de núcleo catiónico (SMBV-Q1)

Se solubilizan 500 mg de maltodextrina (Glucidex, Roquette, Lestrem, Francia) con 0,880 litros de agua a 20ºC, con agitación, en un reactor termorregulado. Se añaden 7 gramos de NaBH_{4} y se mezclan durante 1 hora. Se añaden 220 ml de NaOH 10 M, seguidos por 30,25 ml de epiclorhidrina (Fulka). Después de 12 horas de reacción, se introducen 382,3 g de cloruro de glicidiltrimetilamonio (Fulka) y la mezcla se agita durante 10 minutos. El gel resultante se diluye con 8 litros de agua desmineralizada y el pH se ajusta a 7,0 por neutralización con ácido acético glacial. El hidrogel obtenido se tritura bajo alta presión. La presión utilizada es 400 bares. Al final de este paso, el diámetro medio de las partículas es aproximadamente 60 nm. La purificación ulterior transcurre como sigue: (i) microfiltración a 0,45 \mum para eliminar las partículas mayores, (ii) diafiltración a volumen constante para eliminar las moléculas más pequeñas (sales, fragmentos de polisacáridos). Los PSC catiónicos se concentran luego, se muestrean en matraces estériles y se guardan a \sim20ºC.

I(e). Preparación de Biovector ligero catiónico dispersado (SMBV-Q2)

Se preparan Biovectores de núcleo catiónico como se describe en el Ejemplo I(d), y se marcan como se describe en caso necesario. Los núcleos descongelados se diluyen en agua sometida a ósmosis en un matraz de vidrio a una concentración de 1 mg por mililitro (v.g. 250 mg de PSC/250 ml de agua). La dispersión se agita 5 a 10 minutos y se homogeneíza (RANNIE Lab) a 400 bares durante 3 minutos. La suspensión se calienta a 80ºC en un baño termostático. Se añaden los lípidos de la futura membrana externa (v.g. DPPC, DPPC/colesterol, etc), en forma de polvo, en una relación de 0,3:1 (p/p) de la masa de PSC (v.g. 75 mg de lípidos para 250 mg de PSC). Los lípidos se mezclan y se solubilizan en 2,5 ml de etanol de 95% (v/v). Se calienta un homogeneizador a 60ºC por circulación cerrada de agua. La solución etanólica de lípidos se inyecta en la suspensión de PSC a 80ºC y se homogeneíza luego a 450 bares durante 25 minutos a 60ºC. Al final de este paso, la preparación se pone en un recipiente de vidrio y el etanol libre se elimina de la preparación del Biovector ligero a presión reducida. Los Biovectores catiónicos ligeros se filtran (0,2 \mum) y se guardan.

I(f). Preparación del Biovector ligero catiónico resuspendido (SMBV-Q3)

Los Biovectores de núcleo catiónico y ligeros se suspenden en agua a una concentración de 1,2 mg/ml, y se distribuyen luego en dosis de 1 ml en crioviales diseñados especialmente para liofilización. Los crioviales se ponen en un liofilizador (DURA seco, FT Systems), se congelan a -30ºC y se liofilizan por etapas, primeramente a -10ºC, luego a 0ºC, y finalmente a 10ºC durante el secado primario, y 30ºC durante el paso siguiente. El secado se completa usualmente en 24 horas. Los Biovectores liofilizados en cada criovial se rehidratan en 200 \mul de PBS.

I(g). Marcación de los Biovectores con cloruro cianúrico ^{14}C

Los núcleos de polisacárido se marcan con triazina radiactiva ^{14}C utilizando la capacidad del cloruro cianúrico para reaccionar con los grupos hidroxilo libres del polisacárido. La reacción se lleva a cabo sobre los núcleos de polisacárido acabados preparados como se ha descrito arriba. El protocolo siguiente es representativo de cualquier núcleo de polisacárido (aniónico o catiónico).

El cloruro cianúrico ^{14}C a 47 mCi/mmol se obtiene siguiendo la síntesis habitual de Dupont NEN Product (Boston, MA). El cloruro cianúrico se suspende antes de su utilización en acetonitrilo puro a 100 g/l. Los núcleos de polisacárido se suspenden en agua a 40 g/l, y el pH se ajusta a 10 con carbonato de sodio. La suspensión se calienta y se mantiene a 50ºC. Se añade la cantidad deseada de cloruro cianúrico (normalmente entre 1 y 5% p/p referida a los núcleos de polisacárido) y se observa el pH con un medidor de pH. El pH se mantiene durante la reacción por adición de pequeñas porciones de carbonato de sodio sólido, y la reacción se lleva a cabo durante un periodo de cinco horas. Una vez completada la reacción, la suspensión de núcleos de polisacárido marcados se pone en una celda de ultrafiltración agitada equipada con una membrana de 10 Kilodalton (Amicon, Francia) y la solución se somete a diafiltración contra solución tampón de fosfato 1 mM de pH 7,4 hasta que no se encuentra radiactividad alguna en el filtrado. La suspensión resultante de núcleos de polisacárido marcados se esteriliza luego por filtración a través de filtros de 0,2 \mum y se guarda en recipientes estériles. El contenido de radiactividad se determina por medidas en un Contador Beta Beckman (Alemania) y se expresa en \muCi por mg de núcleos de polisacárido. Los núcleos de polisacárido marcados resultantes pueden utilizarse como se ha descrito arriba para preparar Biovectores marcados.

I(h). Marcación de los Biovectores con diclorotriazinil-fluoresceína

Los núcleos de polisacárido se marcan con diclorotri-azinil-fluoresceína utilizando la capacidad del resto diclorotriazina para reaccionar con los grupos hidroxilo libres del polisacárido. Esta reacción se lleva a cabo sobre los núcleos de polisacárido acabados preparados como se ha descrito arriba. El protocolo es representativo de cualquier núcleo de polisacárido (aniónico o catiónico con cualquier carga). La diclorotriazinil-fluoresceína se obtiene de Sigma Chemical (St. Louis, EE.UU.). La diclorotriazinil-fluoresceína se suspende antes de su utilización en dimetil-formamida pura a 100 g/litro. Los núcleos de polisacárido se suspenden en una solución tampón (NaCl 150 mM e hidrogenocarbonato de sodio 140 mM) a 50 gramos/litro y el pH se ajusta a 10 sin hidróxido de sodio. Se añade la cantidad deseada de dicloro-triazinilfluoresceína (normalmente entre 1 y 5% p/p referida a núcleos de polisacárido) y la mezcla de reacción se deja durante 5 horas a la temperatura ambiente con agitación suave. Una vez terminada la reacción, la suspensión de núcleos de polisacárido marcados se pone en una celda de ultrafiltración provista de agitación con una membrana de 30 kd (Amicon, Francia), y la solución se somete a diafiltración contra agua hasta que no se encuentra fluorescencia alguna en el filtrado. La suspensión de núcleos de polisacárido marcados resultante se esteriliza luego por filtración en filtros de 0,2 \mum y se acondiciona en recipientes estériles. El contenido de fluorescencia se determina por medidas en un Espectrofotómetro de Luminiscencia Perkin Elmer LS 50B. Los núcleos de polisacárido resultantes pueden utilizarse normalmente después de la marcación para preparar suspensiones de SMBV como se ha descrito arriba.

I(i). Preparación de la formulación de SMBV-Q2 con ^{111}Indio

Una solución de ^{111}InCl_{3} (Cisbio) (370 MBq/ml) se mezcló con una solución de InCl_{3} (Fluka) (InCl_{3} 15 mM, citrato de sodio 2 mM, pH 6,0). Se añadió esta solución a una suspensión de SMBV-Q2. La suspensión final tenía las características siguientes: SMBV-Q2 15 mg/ml, InCl_{3} 0,3 mM, citrato de sodio 1 mM, pH 6,0.

Se midió la concentración de indio libre con un contador gamma después de dilución 1/10 en un tampón de citrato (1 mM, pH 6,0) y se sometió a ultrafiltración sobre Microcon de 100 kd (Amicon). La suspensión resultante se esterilizó por filtración (0,2 \mum), y se mantuvo a 4ºC, hasta su administración. Para la administración de la suspensión al individuo, se introdujeron 120 \mul de la suspensión en un dispositivo de monopulverización (Pfeiffer, Reino Unido), permitiendo con ello la administración de 100 \mul/pulverización.

La Tabla I-1, que se muestra a continuación, resume los resultados de un estudio de farmacocinética en humanos que utilizó los lotes preparados. En estas condiciones, la marcación de SMBV por InCl_{3} era extremadamente cuantitativa con relaciones de asociación de 87,5 \pm 9,8%. Adicionalmente, se encontró que las dosis de radiactividad (0,39 \pm 0,03 MBq/dosis) eran perfectamente compatibles con una gráfica de centelleo obtenida después de la administración nasal de SMBV a humanos.

TABLA I-1

1

I(j). Preparación en gran escala de Biovectores ligeros dispersados

Pueden hacerse modificaciones en los procedimientos descritos en los Ejemplos I(b) y I(e) para favorecer la escalación de los procedimientos. Los tiempos de duración de los pasos de homogeneización a alta presión se modifican sobre la base del volumen y la concentración de Biovectores ligeros a preparar. El segundo paso de homogeneización a alta presión puede eliminarse, y reemplazarse por incubación de los Biovectores ligeros a 80ºC con agitación. La eliminación del etanol puede realizarse por medio de diafiltración contra agua en lugar de hacerlo a presión reducida.

Ejemplo II Adhesión del Biovector marcado con ^{14}C a la mucosa nasal de las ratas

Ratas macho Sprague Dawley de aproximadamente 200 g cada una se dividieron en seis grupos de acuerdo con el tipo de Biovector marcado administrado. Los 6 tipos de Biovector se resumen a continuación en la Tabla II-1:

TABLA II-1

2

Cada rata de los grupos SMBV-P1 y SMBV-Q1 recibió una dosis de 100 \mug de su respectiva formulación de Biovector marcado con ^{14}C administrada por vía intranasal sin anestésico en un volumen de 50 \mul de suspensión (25 \mul en cada orificio nasal).

Cada rata de los grupos SMBV-P2, SMBV-P3, SMBV-Q2, y SMBV-Q3 recibió una dosis de 150 \mug de su respectiva formulación de Biovector marcado con ^{13}C administrada sin anestésico por vía intranasal en un volumen de 50 \mul de suspensión (25 \mul en cada orificio nasal).

Las dosis anteriores representan aproximadamente 200 \mul de suspensión de Biovectores por kg de rata. Este volumen de suspensión es equivalente a aproximadamente 400 \mug de polisacárido y aproximadamente 200 \mug de lípido por kg de rata.

Al cabo de 0,083 horas (5 minutos), tres horas, seis horas, doce horas, y veinticuatro horas, se sacrificaron tres ratas de cada grupo. Se aislaron ambas cavidades nasales; se abrió el tracto nasal y se lavó con 5 ml de solución salina fisiológica; se extrajo sangre y se centrifugó. Se midió el ^{14}C remanente en el lavado nasal, la cavidad nasal, y el plasma. Los resultados se muestran en las Figuras 1 y 2.

Ejemplo III Biodistribución del Biovector marcado con ^{14}C después de administración nasal

Ratas macho Sprague Dawley de aproximadamente 200 g cada una se trataron como se describe en el Ejemplo II. Doce horas después de la administración nasal, se sacrificaron tres ratas por muestra, y se midió el ^{14}C remanente en hígado, bazo, riñón, sangre, bronquios, pulmón, esófago, estómago, intestino delgado y grueso, músculo esquelético, ganglio linfático sub-maxilar, cerebro, y cornete nasal.

La Tabla III-1 siguiente resume la biodistribución doce horas después de la administración nasal de las formulaciones de Biovector descritas en la Tabla II-1.

TABLA III-1

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Ejemplo IV Adhesión de los Biovectores fluorescentes a la mucosa nasal de las ratas

Tres grupos de ratas macho Wistar anestesiadas (doce ratas en cada grupo) recibieron una sola gota en los orificios nasales de 50 \mul de una suspensión PBS/glicerol (control); una suspensión de 0,93 mg/ml de Biovectores ligeros catiónicos marcados con fluoresceína (Ejemplo I(h)) suspendidos en PBS/glicerol (L-SMBV dispersado); o una suspensión de 0,93 mg/ml de Biovectores ligeros catiónicos liofilizados marcados con fluoresceína, resuspendidos en PBS/glicerol (L-SMBV resuspendido). Los SMBV dispersados tienen diámetros de aproximadamente 80 nm, y núcleos de polisacárido injertados con iones amonio cuaternario.

En los tiempos cero, cinco minutos, tres horas, seis horas, y doce horas, se sacrificaron dos ratas de cada grupo. Se midió la fluorescencia tanto de los lavados nasales (tres lavados con NaCl) como de la mucosa nasal (rascado). Los resultados se muestran en las Tablas IV-1 y IV-2 a continuación.

TABLA IV-1

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TABLA IV-2

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Estudios histológicos realizados en paralelo demostraron que la fluorescencia observada no es granular, y es generalmente visible en el polo apical de las células.

Ejemplo V Comparación de la administración intranasal de una división monovalente de un antígeno del virus de la gripe en Biovectores con las administraciones intranasal (i.n.) y subcutánea (s.c.) de HA exclusivamente

El antígeno utilizado en este estudio fue una división monovalente disponible comercialmente de hemaglutinina (HA) y neuraminidasa (N) preparada a partir de membranas víricas. El estudio se realizó por administración de 5 \mug del antígeno a tres grupos de seis ratones BALB/c por grupo. Dos grupos recibieron antígeno solo, un grupo i.n. y el otro grupo s.c. El tercer grupo recibió antígeno en un Biovector dispersado, cargado positivamente (SMBV-Q), que tenía una capa anfifílica (DPPC/colesterol en una relación de 70:30) preparada de acuerdo con el Ejemplo I(e). El antígeno se inyectó por vía subcutánea (s.c.) o se administró por vía intranasal (i.n.) el día cero y el día veintiuno. La respuesta de anticuerpos se analizó el día 35 por ELISA y por hemaglutinación inhibidora contra Nlb 16. Los resultados se muestran en la Tabla V-1:

TABLA V-1

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Ejemplo VI Comparación de las rutas de administración de gp160 de HIV con Biovectores

Se hicieron varias inmunizaciones sucesivas a intervalos de un mes en conejos contra la proteína gp160 de HIV: dos aplicaciones vaginales, dos administraciones orales y una inyección intramuscular. Cuatro conejos hembra recibieron cinco dosis de 10 \mug de gp160 de HIV, formuladas en cualquiera de:

(a)

Una solución que contenía la subunidad B de la toxina del cólera (CTB), la exotoxina de Vibrio cholerae, que es un adyuvante mucosal potente.

(b)

Una solución de Biovectores ligeros dispersados cargados positivamente (SMBV-Q2 disp.). La solución contenía 1,95 mg/ml de Biovector (1,5 mg/ml de núcleo de polisacárido y 0,45 mg/ml de lípido, v.g., DPPC/colesterol) por 100 \mug/ml de gp160;

(c)

Una solución de Biovectores ligeros cargados positivamente y liofilizados resuspendidos en PBS (Biovectores ligeros resuspendidos-SMBV-Q3 res.). La solución contenía 1,95 mg/ml de Biovector (1,5 mg/ml de núcleo de polisacárido y 0,45 mg/ml de lípido, v.g., DPPC/colesterol) por 100 \mug/ml de gp160.

Las inmunizaciones se realizaron como sigue: vaginal el día D_{0} y D_{30}, oral el día D_{60} y D_{90}, e intramuscular el día D_{120}.

Diez días después de cada inmunización (días D_{40}, D_{70}, D_{100} y D_{130}), se midieron las IgAs específicas en la mucosa vaginal y en la saliva por ELISA. Los resultados se muestran a continuación en la Tabla siguiente.

TABLA VI-1

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TABLA VI-2

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La Tabla VI-2 muestra que, después de la última administración vaginal, la administración oral mantiene la inmunidad mucosal al mismo nivel.

Nuevamente, los Biovectores son al menos tan eficientes como CTB en el mantenimiento de la secreción específica de IgA por la vagina y la saliva.

TABLA VI-3

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La Tabla VI-3 muestra que, el día D_{130}, no persiste la inmunización mucosal. La inyección intramuscular no es capaz de reforzarla.

Por consiguiente, el Biovector parece inducir inmunidad mucosal cuando se utiliza para suministrar antígenos al nivel de las mucosas. Se trata de un vector de compuestos activos adaptado particularmente para administración a las mucosas.

Ejemplo VII Hemaglutinina de la gripe suministrada intranasalmente por Biovectores

Muestras de cuatro ratones hembra se inmunizaron el día D_{0} y se reforzaron en D_{14} con 5 \mug de hemaglutinina (HA) aplicados por vía intranasal en 20 \mul o 50 \mul de una solución o suspensión en PBS, sola o en una formulación de Biovector. Un grupo de animales se sometió a anestesia ligera con éter (*), mientras que los otros se mantenían conscientes. La administración de 20 \mul en los orificios nasales externos de los animales conscientes restringe el antígeno al tracto respiratorio superior. Un volumen de 50 \mul directamente en los orificios nasales de los animales anestesiados da como resultado la deposición de al menos parte del antígeno en el tracto respiratorio inferior y el pulmón, además de la deposición en la cavidad nasal.

Se utilizaron cuatro Biovectores diferentes: Biovectores ligeros cargados positivamente (SMBV-Q) y negativamente (SMBV-P), resuspendidos (res) o dispersados (disp).

El antígeno de la subunidad del virus de la gripe se pre-cargó en los Biovectores (HA en SMBV) o se post-cargó simplemente (HA+SMBV), es decir, mezclado con ellos inmediatamente antes de la administración a los animales. El antígeno solo se utilizó como control. La calidad del material utilizado en el presente estudio era equivalente a la empleada para propósitos de vacunación a humanos.

El día D_{28} se sacrificaron los ratones. Se tomaron muestras de suero de la vena porta y se midieron los anticuerpos específicos del antígeno en un ensayo directo de inmunosorbente unido a enzima (ELISA). Los resultados se muestran en la Tabla VII-1.

TABLA VII-1

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Ejemplo VIII Administración intranasal de Biovectores™ en humanos VIII(a). Tiempo de residencia de los Biovectores™ en la cavidad nasal humana

Diez individuos varones, sanos, mantenidos en ayunas y no fumadores, que tenían edades comprendidas entre 18 y 35 años recibieron la administración de 1,5 mg de una formulación radiomarcada con ^{111}In de SMBV-Q2 en cada orificio nasal (100 \mul/orificio nasal). Esta dosis era equivalente a aproximadamente 0,05 mg/kg en un cuerpo de 60 kg. El estudio fue un estudio cruzado de tres vías no aleatorizado.

Después de la administración intranasal, se recogieron imágenes escintigráficas con una cámara \gamma para comprobar la retención de la radiactividad administrada por la mucosa nasal. Se obtuvo una serie continua de imágenes laterales de la cabeza. La concentración de radiactividad en la cavidad nasal mostró una disminución constante a lo largo de la evolución del estudio. Se detectó todavía veintisiete por ciento de la dosis al cabo de 12 y 24 horas, respectivamente, lo cual es un período de retención prolongado para una solución, en comparación con la técnica anterior. El tiempo de aclaramiento de la mitad de la dosis procedente la cavidad nasal era aproximadamente 2 horas, con un modelo de dos compartimientos. Estos resultados, que se muestran en la Figura 3, confirman el potencial de los Biovectores™ para suministro prolongado de materiales a la cavidad nasal.

VIII(b). Biodistribución del Biovector™ radiomarcado con ^{111}Indio después de la administración a humanos

Después de la administración de las formulaciones radiomarcadas de Biovectores™ en la nariz de los individuos voluntarios, además de los recuentos \gamma detectados en la región nasal (como se ha descrito arriba), se detectaron también recuentos en otras regiones de interés (v.g., pulmones, estómago, intestino delgado/colon), que se expresan como porcentaje del número máximo de recuentos detectado. Esto permitió cuantificar el movimiento observado de la radiactividad a lo largo del cuerpo. Se determinaron también valores para la radiactividad urinaria y fecal en muestras de orina total y fecales recogidas a lo largo de 24 horas.

Las dosis nasales aclaradas de la cavidad nasal eran tragadas usualmente, y subsiguientemente excretadas por la vía del tracto gastrointestinal. Esta eliminación de las dosis nasales se veía soportada por el hecho de que se detectaron cantidades considerables de radioactividad en el estómago en los momentos iniciales, y posteriormente en el intestino delgado/colon. Pudo establecerse una correlación inversa satisfactoria entre la cantidad de radiactividad remanente en el intestino delgado/colon y la cantidad de radiactividad excretada en las heces. En las regiones de interés examinadas, no se detectó radiactividad significativa alguna que pudiera asociarse con cualquier otro tejido u órgano identificable. Se detectó muy poca radiactividad en la orina, lo que indicaba que sólo cantidades pequeñas de la dosis se habían absorbido sistémicamente. Por el contrario, en muchos de los individuos voluntarios, se detectó una gran cantidad de radiactividad en el intestino delgado/colon a las 24 horas después de la dosificación (valor medio 1/3 de la dosis inicial) lo que indicaba que este material no se había excretado todavía. Estos resultados se muestran en la Figura 4. Así pues, los resultados anteriores ilustran que la formulación de SMBV-Q2 es mucoadhesiva y tiene un potencial significativo para propósitos de diagnóstico, v.g. de la región del tracto gastrointestinal (GI).

Ejemplo IX Evacuación de la administración nasal de las formulaciones de hemaglutinina (HA)/Biovector purificadas

La solución de proteínas de la gripe está basada en la vacuna de la gripe dividida, que es una mezcla de diferentes proteínas de la gripe: hemaglutinina (HA); neuraminidasa (NA) y otras proteínas víricas tales como proteína de la matriz, nucleoproteína y tres polimerasas. La hemaglutinina está considerada como el antígeno principal de esta división. Con objeto de caracterizar la fijación de HA a SMBV, los autores de la invención analizaron la fijación de la HA purificada a SMBV. Se obtuvo HA purificada del virus de la gripe (cepa B/Harbin), utilizando el método clásico de la bromelina descrito por Wiley et al., Ann. res. Biochem. 56:365-394 (1987).

IX(a). Estudio de la fijación de HA a SMBV

El rendimiento de la fijación de HA a SMBV se analizó después de separación de las formulaciones en gradiente de sacarosa (0 a 20%). El gradiente de sacarosa se utilizó para separar la HA libre de la HA fijada a SMBV. La HA libre se aisló hasta la última fracción del gradiente. Además, dado que HA estaba formulada con SMBV, se observó un cambio en la densidad de la proteína debido a su fijación a SMBV. Se observó una fijación prácticamente cuantitativa de HA a SMBV. Se ensayó el contenido de proteína utilizando la técnica microBCA o fluorescencia intrínseca de antígenos después de irradiación a 280 nm (no se encontró diferencia alguna utilizando estas dos técnicas). Los resultados de este experimento se muestran en la Figura 5.

IX(b). Respuesta de los ratones a la administración i.n. de HA en Biovectores™

Se inmunizaron cuatro ratones hembra el día D_{0} y se reforzaron el día D_{14} con 5 \mug de hemaglutinina (HA) aplicada por vía intranasal en 20 \mul o 50 \mul de una solución o suspensión en PBS, sola o en una formulación con Biovector. Para 5 \mug de HA, la relación HA/lípido era 1/10, siendo la cantidad de SMBV introducida aproximadamente 220 \mug. Un grupo de animales se sometió a anestesia ligera con éter. La administración de 20 \mul en los orificios nasales externos de los animales conscientes restringió el antígeno al tracto respiratorio superior. Se administró directamente un volumen de 50 \mul en los orificios nasales de los animales anestesiados dando como resultado la deposición de al menos una parte del antígeno en el tracto respiratorio inferior y el pulmón.

Se utilizaron cuatro Biovectores diferentes: Biovectores ligeros cargados positivamente (SMBV-Q2, Q3) y negativamente (SMBV-P2, P3), resuspendidos (res.) o dispersados (disp.). La HA se pre-cargó en los Biovectores (HA en SMBV) o se post-cargó simplemente (HA+SMBV), es decir, se mezcló antes de la administración a los animales. La HA sola se utilizó como control. El día D_{28} se sacrificaron los ratones. Se tomaron muestras de suero y se midieron los anticuerpos específicos del antígeno (ELISA). Los resultados se muestran a continuación en la Tabla IX-1.

TABLA IX-1

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Ejemplo X Administración nasal, vaginal y sublingual de ácido dietilenotriaminapentaacético (DTPA)

Se utilizó DTPA como herramienta de diagnóstico, que permite la administración de compuestos tales como indio y gadolinio. El DTPA es hidrófilo y está considerado como un marcador eficiente del agua extracelular, que se aclara rápidamente del plasma (H.J. Weinmenn, RC et al., Characteristic of Gd-DTPA- a potential NMR contrast agent, A.J.R. 142: 619 (1984); Brasch R.C. et al., Contrast enhanced NMR imaging. Animal study using gadolinium DTPA complex., A.J.R. 142:625 (1984); Doucet et al. en Enhanced Resonance Imaging, p. 87-92. Compiladores val M. Runge y C.V. Mosby. Company edition (St Louis, Missouri) (1989)).

El SMBV catiónico se cargó con ^{111}In-DTPA. Para este propósito, un volumen de solución de DTPA (Fluka) (12 mM en agua) se marcó con un volumen de ^{111}InCl_{3} (10 mCi/ml Cisbio). Un volumen de SMBV catiónico, como el preparado en el Ejemplo I(e) (SMBV-Q2), con densidad de carga de 2 mEq/g a 20 mg/ml en agua se mezcló con un volumen de solución ^{111}In-DTPA (6 mM). Se preparó también una preparación de control siguiendo el mismo procedimiento pero sin SMBV catiónico.

Ambas preparaciones se administraron a ratas hembra por tres rutas mucosales diferentes: nasal, vaginal o sublingual. Después de la administración, a D+2 min, D+5 min, D+15 min, D+30 min, D+1 h, D+2 h y D+4 h (siendo D el tiempo cero), se extrajo una pequeña cantidad de sangre de cada animal y se midió la radiactividad con un contador gamma.

Adicionalmente, se realizaron también dos controles. El primer control consistió en la administración de la preparación por ruta intravenosa. En este caso, se diluyó ^{111}In-DTPA-SMBV-Q2 en tampón de citrato/NaCl (citrato de sodio 1 mM, NaCl 150 mM) a fin de compensar la baja osmolaridad de la preparación y debido a que el tampón de citrato puede inhibir la interacción molecular entre compuestos policarboxílicos tales como DTPA y el SMBV catiónico. El segundo control se realizó por administración intranasal de la preparación diluida en un tampón de citrato (1 mM, pH 6).

Los resultados obtenidos después de la administración mucosal de ^{111}In-DTPA-SMBV se muestran en las Figuras 6, 7 y 8. Estos estudios farmacocinéticos comparativos muestran que las rutas de administración nasal y vaginal son comparables a sus cinéticas de absorción de ^{111}In-DTPA. El ^{111}In-DTPA asociado con el SMBV catiónico administrado por vía intranasal o intravaginal se absorbía rápidamente, con una semi-vida de absorción de 7 min y 27 min, respectivamente. La alta tasa de absorción se refleja por el tiempo necesario para alcanzar la concentración pico en plasma (T_{max}). El valor T_{max} era 30 min para la ruta intranasal y 60 min para la ruta vaginal. Después de las administraciones intranasal y vaginal de ^{111}In-DTPA-SMBV, la semi-vida de eliminación de ^{111}In-DTPA era 2,0 horas y 2,3 horas, respectivamente (comparadas con una semi-vida de eliminación de 13 min después de la administración intravenosa de ^{111}In-DTPA-SMBV). Este valor puede compararse también con el tiempo de semi-vida del SMBV catiónico después de administración nasal en humanos (2,3 horas, véase Ejemplo VIII).

Aunque el resultado de la administración sublingual de ^{111}In-DTPA-SMBV parecía menor, se obtuvo también una absorción clara de ^{111}In-DTPA por esta ruta de administración. Además, cuando se administró ^{111}In-DTPA-SMBV intranasalmente en tampón de citrato no se obtuvo prácticamente absorción alguna. Este resultado ilustraba que la asociación entre ^{111}In-DTPA y SMBV catiónico es necesaria para obtener la absorción mucosal de ^{111}In-DTPA.

En comparación con la administración intravenosa (I.V.), todas las rutas mucosales facilitaban un aumento del valor AUC (área bajo la curva) plasmático, que es representativo del tiempo de residencia de ^{111}In-DTPA en el plasma (véase la Figura 8). De hecho, la administración intranasal o vaginal exhibía un aumento de 300% sobre la administración intravenosa, en tanto que la administración sublingual exhibía un aumento de 150%.

Ejemplo XI Comparación de la administración intranasal de una división monovalente de un antígeno del virus de la gripe en Biovectores con la administración intranasal y subcutánea del antígeno del virus de la gripe sin Biovector XI(a). Estudio de la fijación del antígeno a SMBV

Se preparó una vacuna dividida de la gripe a partir de una mezcla de diferentes proteínas de la gripe: hemaglutinina (HA), neuraminidasa (NA) y otras proteínas víricas tales como proteína de la matriz, nucleoproteína y tres polimerasas. La hemaglutinina está considerada como el antígeno principal de esta división. Se analizó La fijación de las proteínas totales de la división a SMBV utilizando la misma técnica descrita en el Ejemplo IX.

Con objeto de averiguar si la estructura supramolecular de SMBV (fijación de los lípidos al núcleo de polisacárido) se mantenía inalterada o no, se marcaron diferentes partes de SMBV. La parte interior de SMBV-Q2 (PSC) se marcó con fluoresceína fijada covalentemente y la membrana con difenilhexatrieno (DPH). Se rastrearon las proteínas totales en un gradiente de sacarosa (0 a 20%) utilizando o bien un ensayo de proteínas (técnica microBCA) o fluorescencia a 280 nm. El análisis de las fracciones recogidas se muestra en la Figura 10.

En la Figura 10, puede observarse que los antígenos se encontraban en las mismas fracciones que SMBV-Q2 (PSC + lípidos), en las cuales la mayor parte de HA está fijada a SMBV. Además, la estructura supramolecular de SMBV (fijación de PSC + lípidos) se mantenía inalterada cuando estaba asociada con antígenos en la formulación.

Con objeto de optimizar la fijación de las proteínas de la gripe divididas a SMBV-Q2, se investigaron diferentes componentes de la capa exterior (a saber DPPC, DPPC/colesterol, PC de huevo y PC de huevo/colesterol). Los controles fueron el núcleo interno de PSC solo (SMBV-Q1) y el componente de la capa externa solo (a saber, como la membrana de un liposoma), en los cuales ni el componente de la capa externa ni el PSC estaban marcados con un agente fluorescente para evitar cualquier interferencia. Los resultados se muestran en la Figura 11, registrándose el análisis de cuantificación en la Tabla XI-1.

TABLA XI-1

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Como se registra en la Tabla XI-1, se encontró que la fijación de los antígenos de la gripe a liposomas, y al núcleo de polisacárido de SMBV-Q1 (PSC) está comprendida entre 11 y 37%. En cambio, se encontró que la fijación de los antígenos a SMBV-Q2 (complejo PSC/lípido) es significativamente mayor, desde 52% a 90%, dependiendo de la composición de la membrana. Este resultado puede explicarse por la estructura supramolecular de SMBV, con sus propiedades duales. Los antígenos en esta estructura están fijados a la capa exterior y estabilizados también por el núcleo de polisacárido catiónico subyacente, siendo la combinación óptima de la capa externa DPPC/colesterol.

XI(b). Respuesta de los ratones a la administración intranasal del antígeno del virus de la gripe en Biovectores en comparación con la administración intranasal y subcutánea del antígeno solo

Se realizó un estudio para averiguar las dosis inmunobioequivalentes de antígenos de la gripe combinados con Biovectores administrados por vía nasal (Flu/BV) y la administración subcutánea de antígenos de la gripe libres (Flu/Ag). La respuesta antigénica inducida por Flu/BV administrado intranasalmente se comparó con la respuesta antigénica inducida por la administración subcutánea de Flu/Ag libre.

Se prepararon formulaciones nasales por mezcla de soluciones de proteínas de la gripe, virus dividido de la gripe (cepa A/Singapur NIB16 111NI), con una suspensión catiónica de SMBV. Se evaluaron ratones vacunados con diferentes formulaciones de Flu/BV preparadas a partir del antígeno del virus dividido de la gripe (Flu/Ag) asociado con SMBV-Q2.

Quince ratones hembra BALB/cJ/Rj (de diez semanas) se dividieron en tres grupos (5 ratones/grupo) y recibieron o bien Flu/Ag libre (grupos de control) o Flu/BV. La administración se realizó sobre animales sin anestesiar. Un resumen del protocolo de dosificación se registra en la Tabla XI-2.

TABLA XI-2

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Los ratones se sensibilizaron a D_{0} y se reforzaron a D_{21}, y el análisis de la respuesta inmune se realizó a D_{35}. Se muestrearon los sueros y se analizaron los títulos de anticuerpos y los ensayos de hemaglutinación inhibidora (IHA). Se obtuvieron también secreciones nasales por lavado de las cavidades nasales con 500 \mul de Solución Salina Tamponada con Fosfato, después de lo cual se determinaron el nivel de IgG nasal y los títulos de sigA. Los resultados de este análisis se registran en la Tabla XI-3.

TABLA XI-3

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La formulación Flu/Ag libre administrada por vía subcutánea indujo una respuesta sérica fuerte de IgG asociada con títulos altos de IHA. Cuando se comparó con el control subcutáneo, el antígeno libre administrado intranasalmente no consiguió inducir respuesta sérica específica alguna. En contraste, la formulación nasal de Flu/BV inducía una respuesta sérica fuerte similar a la obtenida con el antígeno libre administrado subcutáneamente. Adicionalmente, la administración nasal de la formulación Flu/BV suscitaba sigA específica en los lavados nasales. En contraste, la formulación Flu/Ag libre administrada por vía intranasal o subcutánea no conseguía inducir respuesta mucosal alguna.

Como resulta evidentemente por los resultados anteriores, el antígeno intranasal de la gripe asociado con SMBV catiónico (formulación Flu/BV) era capaz de inducir a la vez títulos de IgG e IHA equivalentes a la administración subcutánea de Flu/Ag libre. Además, únicamente la formulación Flu/BV administrada por vía intranasal inducía títulos altos de IgA en suero y respuestas nasales importantes de anticuerpos sigA.

Claims (45)

1. Uso de un Biovector que tiene 0,2 a 3 miliequivalentes de carga iónica positiva por gramo de núcleo injertados al núcleo para la fabricación de un medicamento para aumentar el tiempo de residencia en las mucosas en la administración mucosal de una sustancia a un mamífero, en el cual el Biovector comprende un núcleo de un polisacárido reticulado o un oligosacárido reticulado, o un derivado o hidrolizado de un polisacárido reticulado o un oligosacárido reticulado, o una mezcla de los mismos, y en el cual el núcleo carece de recubrimiento o en el cual el núcleo está recubierto parcial o completamente con una capa de compuestos lipídicos enlazados covalentemente al núcleo, o en el cual el núcleo, con o sin una capa lipídica, está recubierto parcial o completamente con una capa externa de uno o más compuestos anfifílicos.

2. Uso de un Biovector que tiene 0,2 a 3 miliequivalentes de carga iónica negativa por gramo de núcleo injertados al núcleo para la fabricación de un medicamento para mejorar en la administración mucosal de una sustancia a un mamífero la capacidad de la sustancia para pasar a través de la mucosa al torrente sanguíneo, en el cual el Biovector comprende un grupo de un polisacárido reticulado o un oligosacárido reticulado, o un derivado o hidrolizado de un polisacárido reticulado o un oligosacárido reticulado, o una mezcla de los mismos, y en el cual el núcleo carece de recubrimiento o en el cual el núcleo está recubierto parcial o completamente con una capa de compuestos lipídicos enlazados covalentemente al núcleo, o en el cual el núcleo, con o sin una capa lipídica, está recubierto parcial o completamente con una capa externa de uno o más compuestos anfifílicos.

3. Uso de un Biovector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en el cual el polisacárido reticulado u oligosacárido reticulado se selecciona de almidón, dextrano, dextrina, y maltodextrina.

4. Uso de un Biovector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 3, en el cual dicha carga iónica positiva se debe a la presencia de un grupo catiónico o básico seleccionado de grupo amonio cuaternario, una amina primaria, una amina secundaria o una amina terciaria.

5. Uso de un Biovector de acuerdo con la reivindicación 4, en el cual dicha carga positiva se debe a la presencia de un grupo amonio cuaternario.

6. Uso de un Biovector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 3, en el cual dicha carga positiva se debe a la presencia de un ligando seleccionado de colina, 2-hidroxipropiltrimetilamonio, 2-dimetilaminoetanol, 2-dietilaminoetanol, 2-dimetilaminoetilamina y 2-dietilamino-etilamina o un aminoácido.

7. Uso de un Biovector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 ó 3, en el cual dicha carga iónica negativa se debe a la presencia de un grupo aniónico o ácido seleccionado de fosfato, sulfato o carboxilato.

8. Uso de un Biovector de acuerdo con la reivindicación 7, en el cual dicha carga negativa se debe a la presencia de un grupo fosfato.

9. Uso de un Biovector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el cual el núcleo carece de recubrimiento.

10. Uso de un Biovector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el cual el núcleo está recubierto parcial o completamente con una capa de compuestos lipídicos enlazados covalentemente al núcleo.

11. Uso de un Biovector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el cual el núcleo, sin una capa lipídica, está recubierto con una capa externa de uno o más compuestos anfifílicos.

12. Uso de un Biovector de acuerdo con la reivindicación 11, en el cual dicho compuesto anfifílico es un fosfolípido o una ceramida.

13. Uso de un Biovector de acuerdo con la reivindicación 12, en el cual el fosfolípido es fosfatidil-colina, fosfatidil-hidroxicolina, fosfatidil-etanolamina, fosfatidil-serina, y fosfatidil-glicerol.

14. Uso de un Biovector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el cual el diámetro del Biovector es 20-200 nm.

15. Uso de un Biovector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el cual el diámetro del Biovector es 20-100 nm.

16. Uso de un Biovector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el cual el polisacárido reticulado u oligosacárido reticulado se fija inespecíficamente a la superficie de la mucosa.

17. Uso de un Biovector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en el cual el Biovector está dispersado.

18. Uso de un Biovector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en el cual el Biovector está secado.

19. Uso de un Biovector de acuerdo con la reivindicación 18, en el cual el Biovector secado está resuspendido.

20. Uso de un Biovector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, en el cual la sustancia es un agente terapéutico, un agente profiláctico o un agente de diagnóstico.

21. Uso de un Biovector de acuerdo con la reivindicación 20, en el cual dicho agente terapéutico es un producto radiofarmacéutico, un fármaco analgésico, un agente anestésico, un agente anoréxico, un agente anti-anemia, un agente anti-asma, un agente anti-diabético, una antihistamina, un fármaco anti-inflamatorio, un fármaco antibiótico, un agente antimuscarínico, un fármaco anti-neoplástico, un fármaco antivírico, un fármaco cardiovascular, un estimulador del sistema nervioso central, un depresor del sistema nervioso central, un anti-depresivo, un anti-epiléptico, un agente ansiolítico, un agente hipnótico, un sedante, un fármaco anti-psicótico, un beta-bloqueante, un agente hemostático, una hormona, un vasodilatador, un vasoconstrictor o una vitamina.

22. Uso de un Biovector de acuerdo con la reivindicación 20, en el cual dicho agente profiláctico es una vacuna contra un patógeno.

23. Uso de un Biovector de acuerdo con la reivindicación 22, en el cual el patógeno es un virus, una bacteria, una levadura o un hongo.

24. Uso de un Biovector de acuerdo con la reivindicación 23, en el cual el virus es un virus de la gripe, un citomegalovirus, HIV, un papilomavirus, un virus respiratorio sincitial, un virus de la poliomielitis, un poxvirus, un virus del sarampión, un arbovirus, un virus de Coxsackie, un herpesvirus, un hantavirus, un virus de la hepatitis, un virus de la enfermedad de Lyme, un virus de las paperas o un rotavirus.

25. Uso de un Biovector de acuerdo con la reivindicación 23, en el cual el virus es un virus de la gripe.

26. Uso de un Biovector de acuerdo con la reivindicación 23, en el cual el virus es HIV.

27. Uso de un Biovector de acuerdo con la reivindicación 23, en el cual la bacteria es un miembro del género Neisseria, Aerobacter, Pseudomonas, Porphyromonas, Salmonella, Escherichia, Pasteurella, Shigella, Bacillus, Helibacter, Corynebacteriun, Clostridium, Mycobacterium, Yersinia, Staphylococcus, Bordetella, Brucella, Vibrio o Streptococcus.

28. Uso de un Biovector de acuerdo con la reivindicación 23, en el cual el patógeno es un miembro del género Plasmodium, Schistosoma, o Candida.

29. Uso de un Biovector de acuerdo con la reivindicación 20, en el cual el agente de diagnóstico es un agente de contraste o un agente de formación de imágenes.

30. Uso de un Biovector de acuerdo con la reivindicación 20, en el cual el agente de diagnóstico es capaz de detectar irregularidades en la córnea.

31. Uso de un Biovector de acuerdo con la reivindicación 20, en el cual el agente de diagnóstico está marcado con un grupo detectable.

32. Uso de un Biovector de acuerdo con la reivindicación 31, en el cual dicho grupo detectable es un grupo radiactivo, un grupo magnético, o un grupo fluorescente.

33. Uso de un Biovector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, en el cual dicha sustancia es una molécula química pequeña.

34. Uso de un Biovector de acuerdo con la reivindicación 33, en el cual dicha molécula química pequeña es una molécula orgánica, una molécula inorgánica, o una molécula organometálica.

35. Uso de un Biovector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, en el cual dicha sustancia es una molécula biológica.

36. Uso de un Biovector de acuerdo con la reivindicación 35, en el cual dicha molécula biológica es un amino-ácido, un oligopéptido, un péptido, una proteína, una glicoproteína, una lipoproteína, un proteoglucano, un monosacárido, un oligosacárido, un polisacárido, un lipopolisacárido, un ácido graso, un eicosanoide, un lípido, un triglicérido, un fosfolípido, un glicolípido, un nucleósido, un nucleótido, un ácido nucleico, una molécula de DNA o una molécula de RNA.

37. Uso de un Biovector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 36, en el cual se administra más de una sustancia en combinación con el Biovector.

38. Uso de un Biovector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 37, en el cual la sustancia está localizada en el núcleo interno del polisacárido reticulado u oligosacárido reticulado.

39. Uso de un Biovector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 37, en el cual la sustancia está localizada en la superficie externa del polisacárido reticulado u oligosacárido reticulado.

40. Uso de un Biovector de acuerdo con la reivindicación 11, en el cual la sustancia está localizada en el núcleo interno de la capa del compuesto anfifílico.

41. Uso de un Biovector de acuerdo con la reivindicación 11, en el cual la sustancia está localizada en la superficie externa de la capa del compuesto anfifílico.

42. Uso de un Biovector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 41, en el cual la sustancia se añade al Biovector antes de la administración al mamífero.

43. Uso de un Biovector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 41, en el cual la sustancia y el Biovector se mezclan juntos en el momento de la administración al mamífero.

44. Uso de un Biovector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 43, en el cual la superficie de la mucosa es una superficie nasal, bucal, oral, vaginal, ocular, auditiva, del tracto pulmonar, uretral, del tracto digestivo, o rectal.

45. Uso de un Biovector de acuerdo con la reivindicación 44, en el cual la superficie de la mucosa es una superficie nasal, vaginal u ocular.