CN109142420B - 基于核磁共振技术探究药物在胶束内最大增溶量的方法 - Google Patents

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Abstract

基于核磁共振技术探究药物在胶束内最大增溶量的方法，涉及一种核磁共振波谱学检测方法。制备实验待测样品；待测样品的NMR检测；实验数据预处理；实验结果分析，实现基于核磁共振技术的探究药物在表面活性剂胶束内最大增溶量。最大增溶量可以使用最大增溶浓度表征，综合分析常规一维氢谱谱峰化学位移和扩散排序谱中自扩散系数的变化规律，确定药物在表面活性剂胶束内的最大增溶浓度。NMR技术具有可重复性、非侵入性等优点。可以获取药物在某一表面活性剂浓度下胶束内的最大溶解浓度，为药物载体的选择提供了一种更为简便有效的方法。

Description

基于核磁共振技术探究药物在胶束内最大增溶量的方法
技术领域
本发明涉及一种核磁共振波谱学检测方法，尤其是涉及一种利用核磁共振的常规一维氢谱和二维扩散谱探究药物在胶束内最大增溶量的方法。
背景技术
表面活性剂是具有亲水性和疏水性且能显著降低表面张力的两亲有机化合物，可溶于有机溶剂和水，广泛应用于食品、化妆品、医药等领域[1]。少量表面活性剂的加入可使水的表面张力迅速下降，但到某一浓度后，水溶液的表面张力几乎不变，非极性部分会相互吸引，从而使得表面活性剂分子自发形成有序的聚集体，使疏水基向内，亲水基向外，导致体系能量下降，这种多分子有序聚集体称为胶束，而将这个表面张力转折点的浓度称为临界胶束浓度(Critical Micelle Concentration,CMC)[2]。胶束分为内核和外壳两部分。在水介质中胶束的内核由疏水的碳氢链构成，为胶束在水溶液中的非极性微区。外壳是胶束与水溶液之间的一层区域。在非水介质中，表面活性剂的疏水和亲水部分与水溶液中的内核和外壳相反。
表面活性剂在水中形成胶束后，胶束内部是非极性或极性很小的区域，这使得原本微溶或不溶于水的有机化合物在胶束溶液中的溶解度显著增大，这种作用称为胶束增溶[3]。胶束增溶通常通过以下四种方式实现：增溶于胶束的内核，吸附于胶束的表面，增溶于胶束的极性头之间，排列在胶束的表面活性剂分子之间[4]。胶束增溶在药物供给方面有广阔的前景[5]，很多药物微溶于水甚至难溶于水，但为了提高治疗效果，要求药物具有较高的浓度，因此探究药物在胶束内的最大增溶显得尤为重要[6]。QixinZhong做了Tween 20胶束封装乳链菌态和百里香酚这两种药物的实验，得出了胶束封装有利于发挥药物功效最终提高抗菌能力的结论[7]。Michael Gradzielshi使用普朗尼克胶束溶解不同极性的活性成分，探究增溶极性和增溶部位之间的相关性[8]。Hui Zhang曾做过百里香酚溶解在Tween 80胶束内的物理特性和活性研究，使用了滴定法获取百里香酚在Tween 80胶束内的最大增溶浓度[9]。
核磁共振(Nuclear Magnetic Resonance,NMR)是目前解析分子结构的最常用手段之一，已经在食品、医药、生物等领域得到了非常广泛的应用[10]。核磁共振的常规一维氢谱在提供化学位移信息的同时也提供了偶合裂分信息。通过分析谱峰化学位移的变化，探究物质所处化学环境的变化，新出现的谱峰可以用来判断物质的形态是否发生了变化。相比于核磁共振其它谱，常规一维氢谱的信噪比和灵敏度都得到了保障，所以对于检测样品的浓度要求低，为使用NMR技术探究药物在胶束内的最大增溶量提供了可行性[11]。
扩散排序谱(Diffusion Ordered Spectroscopy,DOSY)是一种普遍使用的核磁共振波谱学方法之一[12]，它可以得到NMR谱中的每一个共振峰的自扩散系数。DOSY主要用于分析小分子混合物和低聚状态的生物分子[13-14]，也有用于研究聚合物，包括测量聚合物的平均粒径和追踪聚合物的聚合反应速率[15]。目前DOSY在胶束中的应用主要包括测量临界胶束浓度[16-17]和胶束大小[18]。据我们所知，目前还没有报道通过NMR常规一维氢谱和DOSY探究药物在胶束内的最大增溶量。
参见文献：
[1]Nagarajan R,Ruckenstein E.Theory ofsurfactant self-assembly-apredictive molecular thermodynamic approach[J].Langmuir,1991,7(12):2934-2969.
[2]Wijmans C M,Linse P.Surfactant self-assembly at a hydrophilicsurface.A monte carlo simulation study[J].Journal of Physical Chemistry,1996,100(30):12583-12591.
[3]Weers J G.Solubilization in mixed micelles[J].Journal of theAmerican Oil Chemists Society,1990,67(5):340-345.
[4]陈玉霞,朱文娴,麻建国,高大金.胶束增溶技术研究[J].食品科学,2004(S1):267-272.
[5]Kore G,Kolate A,Nej A,et al.Polymeric micelle as multifunctionalpharmaceutical carriers[J].Journal of Nanoscience and Nanotechnology,2014,14(1):288-307.
[6]Aziz Z,Ahmad A,Mohd-Setapar S H,et al.Recent advances in drugdelivery of polymeric nano-micelles[J].Current Drug Metabolism,2017,18(1):16-29.
[7]Xiao D,Gommel C,Davidson P M,et al.Intrinsic Tween 20 improvesrelease and antilisterial properties of co-encapsulated nisin and thymol[J].JAgric Food Chem,2011,59(17):9572-80.
[8]Nguyen-Kim V,Prevost S,Seidel K,et al.Solubilization of activeingredients of different polarity in Pluronic(R)micellar solutions-Correlations between solubilizate polarity and solubilization site[J].JColloid Interface Sci,2016,477:94-102.
[9]Deng L L,Taxipalati M,Que F,et al.Physical characterization andantioxidant activity of thymol solubilized Tween 80 micelles[J].Sci Rep,2016,6:38160.
[10]Guthausen G.Analysis of food and emulsions[J].Trac trends inanalytical chemistry,2016,83:103-106.
[11]Hathout R M,Woodman T J.Applications of NMR in thecharacterization of pharmaceutical microemulsions[J].J Control Release,2012,161(1):62-72.
[12]Hoehnberlage M.Diffusion NMR[J].Nmr in biomedicine,1995,8(7-8):279-279.
[13]Coumes F,Huang C Y,Huang C H,et al.Design and development ofimmunomodulatory antigen delivery systems based on peptide/peg-pla conjugatefor tuning immunity[J].Biomacromolecules,2015,16(11):3666-3673.
[14]Viel S,Mazarin M,Giordanengo R,et al.Improved compositionalanalysis of block copolymers using diffusion ordered NMR spectroscopy[J].Analytica Chimica Acta,2009,654(1):45-48.
[15]Cherifi N,Khoukh A,Benaboura A,et al.Diffusion-orderedspectroscopy NMR DOSY:an all-in-one tool to simultaneously follow sidereactions,livingness and molar masses of polymethylmethacrylate by nitroxidemediated polymerization[J].Polymer Chemistry,2016,7(33):5249-5257.
[16]Cui X H,Mao S Z,Liu M L,et al.Mechanism of surfactant micelleformation[J].Langmuir,2008,24(19):10771-10775.
[17]Jiang Y,Chen H,Cui X H,et al.H-1 NMR study on pre-micellizationof quaternary ammonium gemini surfactants[J].Langmuir,2008,24(7):3118-3121.
[18]Soderman O,Stilbs P,Price W S.NMR studies of surfactants[J].Concepts in Magnetic Resonance Part A,2004,23A(2):121-135.
发明内容
本发明的目的是提供一种基于核磁共振技术的探究药物在表面活性剂胶束内最大增溶量的方法，该方法可以获取某一表面活性剂浓度下胶束内药物的最大增溶浓度。
本发明包括以下步骤：
1)制备实验待测样品；
在步骤1)中，所述制备实验待测样品的具体方法可为：
先配制第一母液和第二母液，所述第一母液为表面活性剂Tween 80的重水溶液，第二母液为待增溶药物百里香酚和表面活性剂Tween 80的混合重水溶液，所述第一母液的Tween 80浓度与第二母液的Tween 80浓度相同并超过Tween 80的临界胶束浓度；为了确保第一母液和第二母液的均匀，进行超声处理，然后在室温下静置，直到第一母液和第二母液中都没有气泡；然后用第一母液稀释第二母液，配制成实验所需要的不同百里香酚浓度的第二母液；最后将配制好的溶液转移至核磁管中密封。
2)待测样品的NMR检测；
在步骤2)中，所述待测样品的NMR检测的具体方法可为：将已经制备好的待测样品核磁管置于500MHz AgilentNMRSystem核磁共振谱仪中，用常规一维氢谱脉冲序列采集一张1HNMR谱，获得谱线的线宽，为谱宽参数设置提供依据；优化好参数后，为了提高低浓度样品的信噪比，可以适当增加累加次数；向核磁共振谱仪操作软件中导入事先编译好的二维扩散谱脉冲序列，除了设置好合理的常规一维氢谱所需的参数外，还需要优化扩散时间、扩散梯度作用时间和扩散梯度强度，使谱峰合理衰减；所述常规一维氢谱脉冲序列是核磁共振谱仪自带的一维脉冲序列，由一个非选择性90°射频脉冲和采样期构成，即非选择性90°射频脉冲作用后紧跟着信号采样，目的是为了检查磁场均匀性，保证实验能够获得较高质量的谱图。
3)实验数据预处理；
在步骤3)中，所述实验数据预处理的具体方法可为：将步骤2)中所得到的常规一维氢谱和二维扩散谱使用MestReNova(Version 9.0)软件进行手动相位校正，多点基线校正、定标、优化傅里叶变换点数和窗函数等预操作；提取每一个样品的常规一维氢谱谱峰化学位移并导入OriginPro(Version 2017C)，绘制化学位移变化图并进行线性拟合；二维扩散谱需要使用MestReNova的高级DOSY谱转换，得到一维是自扩散系数，另一维是化学位移的2DDOSY图。
4)实验结果分析，实现基于核磁共振技术的探究药物在表面活性剂胶束内最大增溶量。
在步骤4)中，所述实验结果分析的具体方法可为：分析所有样品的谱峰化学位移和自扩散系数的变化规律，得到百里香酚在Tween 80胶束内的最大增溶浓度；分析OriginPro中绘制的化学位移变化图，在百里香酚浓度较低时，观察到的谱峰化学位移来自Tween 80原始胶束，且在较低浓度时该化学位移值保持不变，此时观测到的化学位移等于胶束峰的化学位移，用公式表示为δobsd＝δmic，其中δobsd，δmic分别是观测到的化学位移，原始胶束的化学位移。当百里香酚的浓度升高，该谱峰化学位移逐渐降低在图中呈现拐点以及之后的直线下降趋势，表明随着百里香酚浓度升高，原胶束的形态发生变化，此时观测到的化学位移值为原始胶束和增溶后胶束化学位移的加权平均值，用公式表示为
Figure BDA0001826587900000041
其中δagg是增溶后胶束的化学位移，MSC是最大增溶浓度(Maximum Solubilization Concentration)；结合2DDOSY图每种成分自扩散系数的变化，将自扩散系数的变化和化学位移的变化进行联系和对比，进而判断百里香酚的最大增溶浓度。
最大增溶量可以使用最大增溶浓度表征，综合分析常规一维氢谱谱峰化学位移和扩散排序谱中自扩散系数的变化规律，确定药物在表面活性剂胶束内的最大增溶浓度。
本发明的有益效果如下：
1)本发明将NMR常规一维氢谱和二维扩散谱相结合，应用于药物在胶束内的增溶研究，通过获取常规一维氢谱谱峰化学位移变化规律可以初步得到药物在表面活性剂胶束内的最大增溶浓度。二维扩散谱处理后得到的2DDOSY图可以通过进一步分析自扩散系数的变化规律，辅证最大增溶浓度确定的可靠性。
2)本发明所采用的方法，对表面活性剂的临界胶束浓度没有限制，可以选择低临界胶束浓度的表面活性剂作为药物载体，在胶束内溶解度较低的药物也可以作为研究对象，而且常规一维氢谱和二维扩散谱脉冲序列简单，易于操作，常规谱仪条件即可满足实验要求。
3)NMR技术具有可重复性、非侵入性等优点。采用本方法可以获取药物在某一表面活性剂浓度下胶束内的最大溶解浓度，为药物载体的选择提供了一种更为简便有效的方法。
附图说明
图1为实验所使用的BPPLED脉冲序列。
图2为Tween 80和百里香酚的结构示意图及常规一维氢谱谱图。在图2中，最上方从左到右分别是Tween 80和百里香酚的结构式；1HNMR谱从下到上依次是百里香酚在重水中的常规一维氢谱谱图；Tween 80在重水中的常规一维氢谱谱图；百里香酚、Tween 80的混合重水溶液的常规一维氢谱谱图；图中的字母t表示百里香酚，s表示Tween 80，字母后面的数字表示该种物质的第几类氢原子。
图3为百里香酚、Tween 80混合重水溶液中Tween 80末端甲基化学位移随浓度倒数的变化图。
图4为百里香酚、Tween 80混合重水溶液的2DDOSY图。在图4中，从左到右，从上到下对应的百里香酚浓度分别为0.323、2.58、3.87、6.45、9.03、10.3g/L；图中的字母t表示百里香酚，s表示Tween 80；图中虚线经过点的自扩散系数一致。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程。
实施例1
本实施例探究百里香酚在60g/LTween 80形成的胶束内的最大增溶量，适用于获取百里香酚在60g/L Tween 80形成的胶束内的最大增溶浓度。
(1)样品配制
本实施例所用的Tween 80和百里香酚(99.8％纯度)购自当地化学产品零售商(Jilin GmbH，Xiamen，China)并直接使用而无需进一步纯化。重水(99.8％)是Norell(USA)的产品。在实验中，需要先配制60g/L(高于Tween 80的临界胶束浓度)Tween 80重水溶液和60g/LTween 80、30.96g/L百里香酚的混合重水溶液分别作为母液，具体操作是先称取249mg Tween 80加入4.15mL重水中，混合后放入超声波水浴锅中超声处理30min，以确保Tween 80完全溶于重水中；称取120mg Tween 80加入2mL重水中，然后再加入61.92mg百里香酚，混合后放入超声波水浴锅中超声处理30min，形成均匀的Tween 80、百里香酚的混合溶液，超声波处理后在室温下放置2h直到气泡完全消失。分别取不同量的Tween 80重水溶液和百里香酚、Tween 80的混合重水溶液配制成百里香酚浓度分别为0.129、0.323、0.645、0.968、1.29、1.94、2.58、3.23、3.87、4.52、5.16、6.45、7.74、9.03、10.32、12.9g/L的实验待测样品，最后使用移液枪将实验待测样品移入5mm核磁管封闭。
(2)样品检测
实验使用的仪器为500MHz Varian NMR核磁共振谱仪，脉冲序列为常规一维氢谱和双极性纵向涡流延迟(Bipolar Pulse Pairs Longitudinal Eddy Current Delay,BPPLED)脉冲序列。BPPLED脉冲序列不仅可以消除95％以上的涡流效应，获取未失真的信号，还能解决谱图相位扭曲的问题。因此选择BPPLED作为二维扩散谱脉冲序列，所有的采样温度均为298K。
图1给出实验所使用的BPPLED脉冲序列。在图1中，RF轴上较窄的矩形是非选择性90°脉冲，较宽的矩形是非选择性180°脉冲；G轴上的δ是扩散梯度作用时间；Δ是扩散时间；g是扩散梯度值；Te是涡流稳定期。
在正式实验之前，使用稳定的参考样品进行匀场以提供相对均匀的场。将已经制备好的实验待测样品核磁管置于500MHz Varian NMR核磁共振谱仪用常规一维脉冲序列采样一张一维谱，获得谱线的线宽，为谱宽参数设置提供依据，将实验参数设置为合适的数值后便开始采集常规一维氢谱。所述实验参数包括直接维谱宽sw为10kHz，累加次数nt为8，采样时间at为2s，弛豫延迟d1为10s。
打开BPPLED脉冲序列，将实验参数设置为合适的数值使谱峰正常指数衰减，然后进行数据采样。所述实验参数包括直接维谱宽sw为8kHz，累加次数nt为16，空扫次数ss为16，采样时间at为2s，弛豫延迟d1为3s，由于溶剂峰太强，在实验中，打开了BPPLED脉冲序列的压水模块，设置压水模式satmode为y，压水功率satpwr为15，扩散时间Δ为0.2s，扩散梯度作用时间δ为0.002s，涡轮稳定期Te为0.005s，扩散梯度g的值分别为2.5、5.0、7.5、10、12.5、15、17.5、20、22.5、25、27.5、30G/cm。
(3)实验数据处理
将采集到的常规一维氢谱和二维扩散谱使用MestReNova(Version 9.0)软件进行傅里叶变换点数和窗函数优化、手动相位校正、多点基线校正、以常规一维氢谱中的TSP峰定标(δ0ppm)。对于常规一维氢谱，将每一个样品的Tween 80末端甲基化学位移及对应的浓度导入OriginPro(Version 2017C)中，对浓度进行取倒数，将数据点绘制在横坐标为浓度倒数(L/g)纵坐标为化学位移(ppm)的坐标轴上，对图中左侧8个呈线程相关的点做线性拟合得到一条直线，这些浓度下的所对应的化学位移是原始胶束和增溶后胶束的化学位移加权平均值，对图中右侧化学位移最大的点作一条水平线，设置其值为该化学位移值，即原始胶束的化学位移。对于二维扩散谱，使用MestReNova的高级DOSY谱转化，优化参数，设置自扩散系数范围从10-12m2s-1到10-10m2s-1，得到横轴是化学位移，纵轴是自扩散系数的2D DOSY图。
(4)实验结果处理分析
Tween 80末端甲基，即图2中的s1，其化学位移随百里香酚浓度倒数的变化如图3所示，在图的右侧区域对应的百里香酚的浓度较低，可以看到Tween 80末端甲基化学位移是一个固定值0.925ppm，不随浓度的增加而发生变化。在图的中间区域，随着百里香酚浓度的增加，Tween 80末端甲基化学位移开始减小，但减小的幅度较小。在图的左侧部分，Tween80末端甲基化学位移随浓度的增加减小的愈加明显，大多数的点都落在拟合的直线附近，说明其化学位移随着浓度倒数增大而线性增大。图中两条直线相交点的横坐标倒数，就是百里香酚在Tween 80胶束内的最大增溶浓度。所以百里香酚在60g/LTween 80形成的胶束内的增大增溶浓度是4.0g/L。
部分具有代表性的百里香酚浓度不同的百里香酚、Tween 80的混合重水溶液的2DDOSY图如图4所示。从左到右，从上到下对应的百里香酚浓度为0.323、2.58、3.87、6.45、9.03、10.32g/L。当百里香酚浓度低于3.87g/L时，百里香酚的自扩散系数与Tween 80的自扩散系数均在一条水平直线上，表明百里香酚完全处于Tween 80胶束的内部，自扩散系数与化学位移趋势变化相同，表明增溶百里香酚后Tween 80胶束变大。当百里香酚浓度在3.87g/L及以上时，除了百里香酚和Tween 80共同的自扩散系数在继续减小之外，百里香酚出现了另一单独的自扩散系数，且数值上比Tween 80和百里香酚共有自扩散系数大。表明一部分的百里香酚依旧增溶在Tween 80胶束的内部，而另一部分则游离出Tween 80胶束的内部。上述化学位移变化图中的交点为4.0g/L，结合自自扩散系数的变化，推测此浓度为百里香酚的最大增溶浓度，出现百里香酚单体的浓度3.87g/L与最大增溶浓度4.0g/L在实验允许的误差范围内一致。此外，当百里香酚浓度继续升高至一定的浓度时，如图4右下角的2D DOSY图所示，Tween 80末端的甲基和亚甲基右侧都出现了一个新的共振峰，且其自扩散系数更小，表明Tween 80胶束已经形成了新的更大的聚集体。
综上所述，基于核磁共振技术探究药物在胶束内最大增溶量的方法为药物载体的选择提供了可靠的依据，由常规一维氢谱谱峰化学位移变化得到了最大增溶浓度，二维扩散谱结果可以对最大增溶浓度的可靠性进一步辅证。
本发明通过分析谱峰的化学位移和自扩散系数的变化规律得到了药物在表面活性剂胶束内的最大增溶浓度。所用脉冲序列为常规一维氢谱和双极性纵向涡流延迟脉冲序列，利用该方法可以得到样品的共振峰化学位移和自扩散系数。

Claims (2)

1.基于核磁共振技术探究药物在胶束内最大增溶量的方法，其特征在于包括以下步骤：
1)制备实验待测样品；
2)待测样品的NMR检测，具体方法为：将待测样品核磁管置于核磁共振谱仪中，用常规一维氢谱脉冲序列采集一张1HNMR谱，获得谱线的线宽，为谱宽参数设置提供依据；优化好参数后，为了提高低浓度样品的信噪比，增加累加次数；向核磁共振谱仪操作软件中导入事先编译好的二维扩散谱脉冲序列，除了设置常规一维氢谱所需的参数外，还需要优化扩散时间、扩散梯度作用时间和扩散梯度强度，使谱峰衰减；
3)实验数据预处理，具体方法为：将步骤2)中所得到的常规一维氢谱和二维扩散谱使用MestReNova软件进行手动相位校正，多点基线校正、定标、优化傅里叶变换点数和窗函数预操作；提取每一个样品的常规一维氢谱谱峰化学位移并导入OriginPro，绘制化学位移变化图并进行线性拟合；二维扩散谱使用MestReNova的高级DOSY谱转换，得到一维是自扩散系数，另一维是化学位移的2DDOSY图；将二维扩散脉冲序列中的扩散参数进行优化，确保NMR谱峰正常衰减，通过采样获得每个样品的二维扩散谱；
4)实验结果分析，得基于核磁共振技术探究药物在胶束内最大增溶量，具体方法为：分析所有样品的谱峰化学位移和自扩散系数的变化规律，得到百里香酚在Tween 80胶束内的最大增溶浓度；分析OriginPro中绘制的化学位移变化图，在百里香酚浓度较低观察到的谱峰化学位移来自Tween 80原始胶束，且该化学位移值保持不变时，观测到的化学位移等于胶束峰的化学位移，用公式表示为δobsd＝δmic，其中δobsd,δmic分别是观测到的化学位移，原始胶束的化学位移；当百里香酚的浓度升高，谱峰化学位移降低呈现拐点出现直线下降趋势，观测到的化学位移值为原始胶束和增溶后胶束化学位移的加权平均值时，用公式表示为
Figure FDA0002233004980000011
其中δagg是增溶后胶束的化学位移，MSC是最大增溶浓度；结合2DDOSY图每种成分自扩散系数的变化，将自扩散系数的变化和化学位移的变化进行联系和对比，进而判断百里香酚的最大增溶浓度。
2.如权利要求1所述基于核磁共振技术探究药物在胶束内最大增溶量的方法，其特征在于在步骤1)中，所述制备实验待测样品的具体方法为：
先配制第一母液和第二母液，所述第一母液为表面活性剂Tween 80的重水溶液，第二母液为待增溶药物百里香酚和表面活性剂Tween 80的混合重水溶液，所述第一母液的Tween 80浓度与第二母液的Tween 80浓度相同并超过Tween 80的临界胶束浓度；超声处理后，静置，直到第一母液和第二母液中没有气泡；然后用第一母液液稀释第二母液，配制成实验所需要的不同百里香酚浓度的第二母液；最后将配制好的溶液转移至核磁管中密封。
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