ES2201249T3 - Uso de sericina como antioxidante e inhibidor de tirosina. - Google Patents
Uso de sericina como antioxidante e inhibidor de tirosina.Info
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Abstract
ESTA INVENCION SE REFIERE A UNA COMPOSICION UTIL COMO ANTIOXIDANTE O UN INHIBIDOR DE LA ACTIVIDAD TIROSINASA QUE COMPRENDE COMO INGREDIENTE ACTIVO UNA CANTIDAD SUFICIENTE DE SERICINA PARA EJERCER UNA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE O UNA ACCION INHIBIDORA DE LA ACTIVIDAD TIROSINASA, Y ESTA COMPOSICION ES APLICABLE COMO ANTIOXIDANTE O UN INHIBIDOR DE LA ACTIVIDAD TIROSINASA EN EL CAMPO DE MEDICAMENTOS, CUASI-FARMACOS PARA USO EXTERNO, COSMETICOS, ALIMENTOS, ADITIVOS ALIMENTARIOS Y SIMILARES.
Description
Uso de sericina como antioxidante e inhibidor de
tirosina.
Esta invención se refiere al uso de un nuevo
antioxidante o inhibidor de tirosinasa que puede emplearse en los
diversos campos de, por ejemplo, los alimentos, los cosméticos,
las medicinas y otros. Más específicamente, esta invención se
refiere al uso de un nuevo antioxidante o inhibidor de tirosinasa
que contiene como ingrediente activo sericina, una proteína
obtenible del capullo del gusano de seda o de la seda en bruto.
Recientemente se ha sugerido, a partir de las
investigaciones realizadas en los campos de la medicina, la
bioquímica y otros, que las enfermedades que se producen en el
curso de la vida cotidiana, tales como el infarto de miocardio, la
arterioesclerosis, la diabetes mellitus, el cáncer, la apoplejía
cerebral y similares, o los trastornos cutáneos tales como manchas
cutáneas, pecas, granos, eczema y similares podrían estar causados,
al menos en parte, por los peróxidos de lípidos producidos y
acumulados in vivo.
Para resolver estos problemas, se han sugerido
hasta ahora antioxidantes, que se pueden obtener por extracción de
productos naturales tales como plantas, productos marinos,
microorganismos y similares, o antioxidantes sintetizados
químicamente. Por ejemplo, se han utilizado como antioxidantes
naturales vitamina E (tocoferol), vitamina C (ácido
L-ascórbico), o una sustancia parecida a la SOD
(superóxido dismutasa, una de las enzimas in vivo). También
se han sugerido como antioxidantes sintéticos derivados fenólicos
tales como BHA (hidroxianisol butirato), BHT (hidroxitolueno
butirato) y similares.
Sin embargo, en el caso de antioxidantes
naturales, por ejemplo, la SOD tiene los inconvenientes de ser
muy cara debido a la dificultad en la purificación y de que podría
desactivarse al calentarla, debido a una proteína enzimática. Aunque
se han encontrado también otras proteínas antioxidantes, todas
ellas tienen inconvenientes similares a los de la SOD. Se ha
sugerido que los antioxidantes sintéticos presentan problemas con
respecto a la seguridad. En particular, se ha sugerido que el BHA es
cancerígeno. Además, cuando se usan para los alimentos, en muchos
de ellos se ha restringido la cantidad a utilizar o su grado de
utilización.
Muchos de los antioxidantes naturales y
sintéticos son normalmente liposolubles y, en el caso de los
antioxidantes naturales, vitamina E o
\beta-caroteno, por ejemplo, poseen un potente
efecto inhibidor in vivo sobre los peróxidos de lípidos, pero
esto tiene el problema de un grado restringido de utilización a
causa de la escasa solubilidad en agua. Los antioxidantes naturales
hidrosolubles son de tipo restringido y solamente podrían
mencionarse, por ejemplo, la vitamina C, el glutation, el ácido
úrico, la SOD, etc.
Sin embargo, la vitamina C y el glutation pueden
actuar como un pro-oxidante, es decir un promotor
de la oxidación, en presencia de un ion metálico, y tienen el
inconveniente de que tienden a fomentar la peroxidación de lípidos
bajo determinadas condiciones. El ácido úrico es hidrosoluble,
pero escasamente soluble en agua y, cuando se acumula in
vivo, podría ser el responsable de gota o de cálculos
renales.
Además, se ha presentado el problema de que se
han encontrado pocos antioxidantes naturales hidrosolubles que
tengan un alto efecto inhibidor de peróxidos de lípidos comparable
al de la vitamina C.
La tirosinasa es una clase de enzima que tiene
actividad de monofenol-monooxigenasa EC 1. 14. 18.
1. Este tipo de enzima está ampliamente distribuido en animales,
plantas y microorganismos, típicamente, en melanocitos, mosca
doméstica, hongos, patatas, manzanas, Neurospora, etc.
Recientemente, se ha purificado en alto grado este tipo de enzima
a partir de diversos materiales y, por ejemplo, se ha purificado a
partir del cuerpo fructífero de hongos por tratamiento con
acetona, fraccionamiento con sulfato amónico, intercambio iónico o
filtración a través de gel. Su peso molecular es 119.000 en la
enzima derivada de hongos, 144.000 en la enzima derivada de plantas
superiores o 33.000 en la enzima derivada de Neurospora, y su peso
molecular puede variar considerablemente dependiendo de su origen.
Todas estas enzimas son enzimas con cobre, pero sus contenidos
encobre pueden ser diferentes. Son específicas para sustratos tales
como monofenol u o-difenol y, en particular, la
enzima derivada de animales muestra una alta actividad frente a la
DOPA y participa profundamente en la primera etapa de la
biosíntesis de melanina. Esto puede expresarse de acuerdo con el
esquema de reacción siguiente:
L-tirosina +
dihidroxi-L-fenilalanina(DOPA)
+ O_{2}
\rightarrow
DOPA +
DOPA-quinona +
H_{2}O
La melanina es un pigmento que está distribuido
en el cabello o en la piel, en el caso de los seres humanos, y que
es el responsable de la determinación de su color. La formación de
melanina en la piel es una de las funciones protectoras en seres
humanos. La biosíntesis de melanina en animales puede producirse del
modo siguiente: primero, cuando se expone a los rayos
ultravioleta, la tirosinasa del melanosoma que se encuentra en el
melanocito se activa y a su vez se biosintetizan DOPA y
DOPA-quinona como se muestra en el esquema de
reacción anterior. Después de esto, la DOPA-quinona
se policondensa a su vez por oxidación no enzimática,
descarboxilación y reacción de acoplamiento para formar melanina.
Cuando se libera a partir de la irradiación con luz ultravioleta,
la melanina se separa de la capa córnea por metabolismo en la piel
para recobrar la coloración de la piel. Por otra parte, cuando se
estimula, por ejemplo, por exposición a alta irradiación de luz
ultravioleta, la función de formación de melanina se mantiene
localmente y la región correspondiente de la piel queda oscurecida
causando pigmentación o manchas.
En el campo de los alimentos, por ejemplo, cuando
los crustáceos capturados están muertos, su caparazón se decolora
en un corto periodo de tiempo. Cuando se pelan o se cortan frutas
y hortalizas tales como manzanas, batatas o lechuga, se altera el
color de su parte interior en un corto periodo de tiempo. Este
fenómeno es causado por la activación de la tirosinasa, que se
encuentra en dichos crustáceos o frutas y hortalizas, y la
formación subsiguiente de melanina como producto de reacción.
Para evitar esta pigmentación o mancha en la piel
causada por la formación de melanina, para promover el efecto
cosmético de aclaramiento o para evitar la decoloración de los
alimentos se ha aplicado hasta ahora un agente inhibidor de la
actividad de tirosinasa para evitar la biosíntesis de melanina. Por
ejemplo, se han sugerido diversos sulfitos como inhibidores
sintéticos de tirosinasa, y como inhibidores naturales de
tirosinasa, ácido cójico, extracto de placenta, vitamina C,
cisteína o extractos que tengan una función inhibidora sobre la
actividad de la tirosinasa y que se derivan de plantas y
similares.
Sin embargo, se han planteado algunos problemas
de seguridad para el cuerpo humano. Existe el peligro, por ejemplo,
de que pueda observarse una respuesta alérgica a los sulfitos en
el cuerpo humano o, cuando se utilizan los sulfitos para
crustáceos, se puede formar formaldehído durante el almacenamiento.
Aunque el sulfito sódico o el hidrógenosulfito sódico están
designados como aditivos alimentarios, está especificado el
criterio para su uso y también están reglamentados sus residuos en
alimentos.
En el caso de los inhibidores naturales de
tirosinasa, por ejemplo el ácido cójico es difícil de producir o
de purificar y, en consecuencia, es caro. Más específicamente, se
cultiva una cepa capaz de producir ácido cójico y este ácido se
extrae del caldo de cultivo que lo contiene como componente
principal y después se cristaliza. Por otra parte, se ha observado
que algunas cepas capaces de producir ácido cójico también podrían
producir aflatoxinas que tienen una potente actividad cancerígena y
dan lugar, por lo tanto, a problemas de seguridad. El extracto de
placenta también es difícil de producir o de purificar y por ello
también es caro.
En el caso de la vitamina C, la reacción de
oxidación enzimática por la tirosinasa (como muestra el esquema de
reacción anterior) está controlada por el poder reductor de dicha
vitamina. De acuerdo con ello, el ácido ascórbico se convierte en
ácido deshidroascórbico y el ácido ascórbico decrece a lo largo
del tiempo, de modo que no podría mantenerse su actividad
inhibidora. En el caso de la cisteína, no podría mantenerse una
actividad inhibidora debido a que la propia cisteína se oxida de un
modo similar al de la vitamina C y tiene el inconveniente de que
podría alterar su color a negro cuando se oxida. Los extractos
derivados de plantas y de otros por extracción y que tienen una
función inhibidora de la actividad de tirosinasa son difíciles de
identificar por su composición química con una pureza baja.
Además, existe la posibilidad de que la calidad del extracto pueda
variar entre los lotes.
Además, la mayoría de los inhibidores de la
actividad de tirosinasa de técnicas anteriores son liposolubles y
los inhibidores hidrosolubles de la actividad de tirosinasa son de
disponibilidad limitada.
El objeto de esta invención es proporcionar el
uso de una composición que tenga una alta actividad antioxidante y
una alta acción inhibidora de la actividad de tirosinasa, que
tiene una alta seguridad debido a que procede de productos
naturales, no se desactiva por calentamiento, puede producirse o
purificarse de forma fácil y barata y es soluble en agua con una
alta pureza única.
De acuerdo con esta invención, se proporciona el
uso de una composición como antioxidante e inhibidor de la
actividad de tirosinasa, que comprende, como ingrediente activo,
una cantidad suficiente de sericina para ejercer una capacidad
antioxidante y una acción inhibidora de la actividad de
tirosinasa.
Esta invención proporciona también el uso de
sericina para la fabricación de un medicamento para ejercer un
efecto inhibidor de peróxidos de lípidos en el tratamiento del
infarto de miocardio, arterioesclerosis, diabetes mellitus, cáncer o
apoplejía cerebral.
Como sericina que puede emplearse en esta
invención, sería preferible usar sericina que tenga un alto grado
de pureza y que se derive habitualmente del capullo del gusano de
seda o de la seda bruta y que incluya su hidrolizado.
La sericina que puede emplearse en esta invención
puede obtenerse del capullo del gusano de seda o de la seda bruta
de acuerdo con un método convencional de extracción. Por ejemplo,
se puede extraer en la forma de una proteína sencilla con una
pureza del 90% o superior, de acuerdo con el procedimiento
siguiente.
Es decir, la sericina que contiene el capullo del
gusano de seda o la seda bruta se extrae con agua y después se
somete, por ejemplo, al procedimiento (1), (2) o (3) que se
detalla más adelante, para dar sericina.
De forma alternativa, el hidrolizado de sericina
que puede emplearse en esta invención puede obtenerse del capullo
del gusano de seda o de la seda bruta de acuerdo con un método
convencional de extracción. Por ejemplo, puede extraerse en forma de
una proteína sencilla (un péptido) con una pureza del 90% o
superior de acuerdo con el procedimiento siguiente.
Es decir, la sericina que contiene el capullo del
gusano de seda o la seda bruta se extrae y se hidroliza
parcialmente con un ácido, un álcali o una enzima y después se
somete, por ejemplo, al siguiente procedimiento (1), (2) o (3) para
dar un hidrolizado de sericina.
(1) Una solución acuosa de sericina se ajusta a
un pH 3 \sim 5 con un ácido orgánico o un ácido inorgánico, un
agente coagulante orgánico o un agente coagulante inorgánico para
separar la sericina, que después se filtra y se seca para dar una
sericina sólida.
(2) Una solución acuosa de sericina se mezcla
con un disolvente miscible con agua, tal como metanol, etanol o
dioxano, para separar la sericina que después se filtra y se seca
para dar una sericina sólida.
(3) Una solución acuosa de sericina se hace pasar
a través de una membrana de diálisis para separar la sustancia que
pasa a través de la membrana y después se seca la sustancia que ha
quedado en la membrana para dar una sericina sólida.
La base de sericina libre o el hidrolizado de
sericina obtenidos tal como se ha descrito anteriormente pueden
usarse en cualquier forma adecuada, por ejemplo, en su forma
sólida tal como se presenta o en la forma de una solución disuelta
en un disolvente, preferiblemente una solución acuosa disuelta en
un volumen apropiado de agua, de acuerdo con el uso que se pretende
como antioxidante o como inhibidor de la actividad de
tirosinasa.
La sericina o su hidrolizado puede utilizarse
para cosméticos, alimentos, aditivos alimentarios, medicinas para
uso externo, productos de para-farmacia, medicinas,
etc., de modo similar al de los antioxidantes o inhibidores de la
actividad de tirosinasa de la técnica anterior.
Una cantidad de sericina para mezclar es
comúnmente de alrededor de 0,1 \sim 50% en peso,
preferiblemente de alrededor de 0,5 \sim 5% en peso, por
ejemplo, en cosméticos, aditivos alimentarios, medicinas para uso
externo, productos de para-farmacia y similares.
Una cantidad de sericina para mezclar es comúnmente de alrededor de
0,1 \sim 100% en peso, preferiblemente de alrededor de 0,5
\sim 50% en peso en alimentos. La sericina no tiene toxicidad y
tiene una solubilidad excelente en agua, lo que no presentaría
ningún problema específico aunque se mezclara o se tomara una gran
cantidad de ella.
Las formas de dosificación de cosméticos o de
medicinas para uso externo podrían incluir, por ejemplo, cremas,
emulsiones, bases, packs, lociones, dosificaciones en forma de
gel, de solución o de lápiz, y similares. Estas formas de
dosificación pueden mezclarse opcionalmente con cualesquiera
componentes adecuados usados convencionalmente en los campos
correspondientes, tales como lubricantes, humectantes, espesantes,
conservantes, emulsionantes, pigmentos, ajustadores del pH, otros
componentes activos, absorbentes de rayos ultravioleta, perfumes,
etc.
La sericina o su hidrolizado pueden administrarse
oralmente como medicinas. En este caso, no hay una dosis
particularmente crítica y puede administrarse, por ejemplo, en
dosis de alrededor de 10 mg \sim 100 g/día.
Como una realización alternativa de esta
invención, se pueden utilizar de forma concomitante con la
sericina o su hidrolizado en la composición de esta invención
cualesquiera otros componentes activos o componentes aditivos que se
añaden convencionalmente a los antioxidantes o inhibidores de la
actividad de tirosinasa de la técnica anterior. Estos componentes
no son particularmente decisivos y pueden incorporarse
opcionalmente, adicionalmente al principal ingrediente activo, es
decir la sericina o su hidrolizado.
A continuación se citarán aquí ejemplos
representativos de estos componentes que se pueden emplear de
forma concomitante en el campo de los alimentos por sus resultados
favorables.
Inhibidores de la alteración del color: ácido
polifosfórico o sus sales, ácido metafosfórico o sus sales, ácido
pirofosfórico o sus sales, ácido cítrico o sus sales, sulfato de
aluminio y potasio, ácido eritórbico o sus sales y similares.
Agentes antimicrobianos y conservantes: ácido
benzoico o sus sales, ortofenilfenol o sus sales, difenilo, ácido
sórbico o sus sales, tiabendazol, ácido deshidroacético o sus
sales, ésteres alquílicos del ácido paraoxibenzoico, ácido
propiónico o sus sales, polvos blanqueadores, ácido hipocloroso o
sus sales, ácido fumárico,
\varepsilon-polilisina, glicina, lisozima,
extracto de anís y similares.
A continuación se citaran aquí en lo que sigue
ejemplos representativos de estos componentes que se pueden
emplear de forma concomitante en el campo de los cosméticos por sus
resultados favorables.
Astringentes: ácido cítrico o sus sales, ácido
tartárico o sus sales, ácido láctico o sus sales, cloruro de
aluminio, sulfato de potasio y aluminio y similares.
Agentes antimicrobianos y conservantes: ácido
benzoico, benzoato sódico, ésteres del ácido paraoxibenzoico,
cloruro de diestearilmetilamonio, cloruro de bencetonio, soluciones
de cloruro de alquildiaminoetilglicina, dihidrocloruro de
clorohexidina, ortofenilfenol, colorante sensibilizador Nº 101,
colorante sensibilizador Nº 201, ácido salicílico, salicilato
sódico, ácido sórbico, halocarban, resorcina, paraclorofenol,
fenoxietanol y similares.
Agentes aclarantes cosméticos: ácido ascórbico y
sus derivados, azufre, extracto de placenta, ácido cójico y sus
derivados, glucosamina y sus derivados, ácido azelaico y sus
derivados, arbutina y sus derivados, ácido hidroxicinámico y sus
derivados, glutation y similares.
Absorbentes de rayos ultravioleta: derivados de
\beta-isopropilfuranona, ácido urocánico,
urocanato de etilo, oxibenzona, ácido oxibenzonsulfónico,
tetrahidrobenzofenona, dihidroxidimetoxibenzofenona y
similares.
Humectantes: glicina, treonina, alanina,
colágeno, colágeno hidrolizado, vitronectina, fibronectina,
queratina, elastina, jalea real, condroitina heparina y
similares.
Activadores celulares: riboflavina o sus
derivados, piridoxina o sus derivados, ácido nicotínico o sus
derivados, ácido pantoténico o sus derivados.
Agentes antiinflamatorios y antialérgicos:
azuleno, alantoína, ácido aminocaproico, indometacina,
hidrocloruro de lisozima, ácido
\varepsilon-aminocaproico y similares.
Grasas y aceites: aceite de soja, aceite de
linaza, aceite de tung, aceite de sésamo y similares.
Hidrocarburos: parafina líquida, vaselina, cera
microcristalina y similares.
Ácidos alifáticos: ácido esteárico, ácido
linoleico, ácido láurico, ácido mirístico, ácido palmítico y
similares.
Alcoholes: alcohol láurico, alcohol cetílico,
alcohol estearílico, alcohol de lanolina, alcohol oleico y
similares.
Ésteres: oleato de decilo, estearato de butilo,
miristato de miristilo, laurato de hexilo, palmitato de isopropilo
y similares.
Tensioactivos: tensioactivos aniónicos,
tensioactivos catiónicos, tensioactivos anfóteros, tensioactivos
no iónicos.
Perfumes: mentol, carvona, eugenol, anetol,
aceite de menta, aceite de hierbabuena y similares.
La invención se describirá ahora con referencia a
los ejemplos siguientes.
1 kg de tela de seda compuesta por seda cruda se
trató en 50L de agua a 95ºC durante 2 horas para extraer la
sericina. El extracto resultante se filtró a través de un filtro
con un diámetro medio de poros de 0,2 \mum, se separó el agregado
y el filtrado se desalinizó a través de una membrana de ósmosis
inversa para conseguir una solución transparente e incolora de
sericina en agua con una concentración de 0,2%. Esta solución
acuosa se concentró mediante un evaporador hasta una concentración
de sericina de aproximadamente 2% y después se liofilizó para
conseguir 100 g de una sericina en polvo (a la que se aludirá a
partir de aquí como sericina H) con una pureza del 95% o superior
y un peso molecular medio de 100.000.
1 kg de tela de seda compuesta por seda bruta se
trató en 50L de una solución acuosa de carbonato sódico al 0,2%
(pH 11 \sim 12) a 95ºC durante 2 horas para extraer un
hidrolizado de sericina. El extracto resultante se filtró a través
de un filtro con un diámetro medio de poro de 0,2 \mum, se
separó el agregado y el filtrado se desalinizó a través de una
membrana de ósmosis inversa para conseguir una solución transparente
e incolora de un hidrolizado de sericina en agua con una
concentración del 0,2%. Este extracto se concentró con un
evaporador hasta una concentración de sericina de alrededor del 2%
y después se liofilizó para conseguir 100 g de un hidrolizado de
sericina en polvo (al que se aludirá a partir de aquí como
sericina L) con una pureza del 90% o superior y un peso molecular
medio de 20.000.
\newpage
Ejemplo de ensayo
1
A 1 g de cerebro de rata almacenado bajo
refrigeración se le añadieron 9 ml de tampón fosfato 0,075M (pH
7,5) y la mezcla se homogeneizó (a la que se referirá a partir de
aquí como homogeneizado) bajo enfriamiento con hielo.
A 0,5 ml del homogeneizado obtenido anteriormente
se le añadieron 3,5 ml de cada uno de los tampones fosfato 0,075M
que contenían respectivamente sericina L y sericina H (pH 7,5). Se
continuó la incubación a 37ºC durante 2 horas. Al final de este
tiempo, las concentraciones finales respectivas de sericina se
hicieron de 0,02 \sim 0,5%. Inmediatamente antes y después de la
incubación durante 2 horas se recuperaron 0,5 ml de cada una de
las muestras y se determinó la SRATB (sustancia reactiva de ácido
tiobarbitúrico), un indicador del nivel de peróxidos de acuerdo con
el método del ATB (ácido tiobarbitúrico). La capacidad
antioxidante de la sericina se calculó a partir de la cantidad de
SRATB obtenida cuando no se había añadido sericina y la cantidad de
SRATB obtenida cuando se había añadido sericina de acuerdo con la
siguiente ecuación 1 y expresada en términos de una tasa de
inhibición sobre un aumento en peróxidos de lípidos por
incubación. En todos los casos de este Ejemplo de Ensayo y en los
siguientes ejemplos de ensayo 2 \sim 5, los ensayos se repitieron
tres veces y los resultados se indicaron con un valor medio de los
valores numéricos así obtenidos.
Ecuación
1
Tasa de inhibición (%) =
(1 -- A/B ) x
100
- A:
- cantidad incrementada de SRATB obtenida cuando se había añadido un agente inhibidor de peróxidos de lípidos (un antioxidante)
- B:
- cantidad incrementada de SRATB obtenida cuando no había añadido un agente inhibidor de peróxidos de lípidos (un antioxidante)
Método del
ATB
A 0,5 ml de una muestra se le añadieron 2,5 ml de
solución de ácido tricloroacético al 8% y 2,0 ml de una solución
de ácido tiobarbitúrico al 0,67% y la mezcla resultante se mezcló
a fondo y después se calentó al baño maría durante 15 minutos.
Después se centrifugó la mezcla a 2000 X g durante 10 minutos y se
midió la absorbancia del sobrenadante a 535 nm para determinar la
cantidad de SRATB. Como patrón se utilizó
1,1,3,3-tetraetoxipropano.
| Tasa de inhibición (%) | ||
| Concentración (%) | Sericina L | Sericina H |
| 0,02 | 9 | 12 |
| 0,05 | 18 | 27 |
| 0,1 | 55 | 20 |
| 0,3 | 100 | 54 |
| 0,5 | 95 | 95 |
Como muestra la Tabla 1, se ha establecido que
tanto la sericina L como la sericina H poseen una capacidad
antioxidante. Se ha establecido que una sericina con cualquier
peso molecular puede poseer una capacidad antioxidante.
Ejemplo de ensayo
2
La preparación se llevó a cabo del mismo modo al
descrito en el Ejemplo de Ensayo 1.
A 0,5ml del homogeneizado obtenido anteriormente
se le añadieron 3,5 ml de cada uno de los tampones fosfato 0,075M
(pH 7,5) que contenían respectivamente sericina L, ácido ascórbico
(vitamina C) y seroalbúmina bovina. La incubación se continuó a 37ºC
durante 2 horas. Las concentraciones finales de sericina L, ácido
ascórbico y albúmina se hicieron de 0,01% \sim 1,0%. Después de
la incubación se determinó la cantidad de SRATB de acuerdo con el
método del ATB, de modo similar al del Ejemplo de Ensayo 1 y se
determinaron las tasas de inhibición sobre un aumento en peróxidos
de lípidos, respectivamente.
| Concentración (%) | Sericina L | Ácido ascórbico | Albúmina |
| 0,01 | 3 | -39 | -6 |
| 0,05 | 13 | 39 | -4 |
| 0,1 | 86 | 87 | -12 |
| 0,5 | 96 | 97 | 20 |
| 1,0 | 97 | 96 | 30 |
Como muestra la Tabla 2, se ha confirmado que el
nivel de capacidad antioxidante de la sericina es comparable con
el de la vitamina C del que se ha dicho que tiene una potente
capacidad antioxidante, Además, en el caso de la vitamina C se ha
encontrado el inconveniente de que la oxidación puede acelerarse en
una gama baja de concentraciones de 0,01%, mientras que no se ha
observado este fenómeno en el caso de la sericina.
Ejemplo de ensayo
3
La preparación se llevó a cabo del mismo modo
descrito en el Ejemplo de Ensayo 1.
A 0,5 ml del homogeneizado obtenido anteriormente
se añadieron cada uno de los tampones fosfato 0,075M que contenían
respectivamente sericina L y sericina H (pH 7,5). Se continuó la
incubación a 37ºC durante 2 horas. Separadamente, a 0,5 ml del
homogeneizado obtenido anteriormente se le añadieron 3,5 ml de los
tampones fosfato 0,075M que contenían sericina L y sericina H (pH
7,5) que habían sido calentados previamente al baño maría durante 2
horas, y se continuó la incubación a 37ºC durante 2 horas. Al
término de este tiempo, la concentración final de sericina se hizo
de 0,5%. Se determinó la cantidad de SRATB de acuerdo con el método
del ATB, de modo similar al del Ejemplo de Ensayo 1 y se determinó
la tasa de inhibición sobre un aumento de peróxidos de
lípidos.
| Tasa de inhibición (%) | |
| 0,5% de sericina L no calentada | 99 |
| 0,5% de sericina L calentada | 99 |
| 0,5% de sericina H no calentada | 85 |
| 0,5% de sericina H calentada | 78 |
Incluso cuando se calentó durante 2 horas al baño
maría sericina L o sericina H y se determinó una capacidad
antioxidante, apenas se observó un cambio entre dicha capacidad
antioxidante y la capacidad antioxidante antes del calentamiento. A
partir de los resultados se ha demostrado que la capacidad
antioxidante no puede ser inactivada por calentamiento.
Ejemplo de ensayo
4
La preparación se llevó a cabo del mismo modo al
descrito en el Ejemplo de Ensayo 1.
A 0,5 ml del homogeneizado obtenido anteriormente
se añadieron 3,5 ml de tampones fosfato 0,075M (pH 7,5) que
contenían sericina L y se continuó la incubación a 37ºC durante 2
horas. La concentración final de sericina L se hizo de 0,1% o de
0,25%. Después de la incubación, se recuperaron 0,5 ml de muestra y
se añadieron 2,5 ml de éter etílico/etanol (1:3,v/v), y la mezcla
resultante se agitó vigorosamente durante un minuto. Después, la
mezcla se centrifugó a 1000 X g durante 5 minutos y se midió la
absorbancia de la capa superior a 234 nm para dar un indicador de la
cantidad de antioxidación (un dieno conjugado). En este Ejemplo de
Ensayo, la capacidad antioxidante de la sericina se expresó en
términos de una tasa de inhibición (%) sobre un aumento de
peróxidos de lípidos.
| Tasa de inhibición (%) | |
| 0,1% de sericina L | 80 |
| 0,25% de sericina L | 86 |
En los Ejemplos de Ensayo 1 \sim 3, las SRATB
se utilizaron como indicador de la cantidad de peróxidos de
lípidos, mientras que en el Ejemplo de Ensayo 4 se utilizó como
indicador un dieno conjugado. A partir de estos dos indicadores
diferentes también se ha confirmado que la sericina puede poseer
una potente capacidad antioxidante.
Ejemplo de ensayo
5
1 ml de tampón carbonato 100 mM (pH 7,4) que
contenía 160 \muM de ácido araquidónico, 150 \muM de
FeCl_{3}, 1,0 mM de ascorbato sódico y 0,3% de sericina se
incubó a 37ºC durante una hora. Después de la incubación se
añadieron 2 ml de una mezcla de ácido tricloroacético y ácido
tiobarbitúrico (que contenían ácido tricloroacético al 15%, ácido
tiobarbitúrico al 0,375% y ácido clorhídrico 0,25N) mezclando todo
muy bien. Después se añadió 1 ml de seroalbúmina bovina al 0,1% y
la mezcla se calentó al baño maría durante 15 minutos. Después de
centrifugar se midió la absorbancia del sobrenadante a 535 nm para
determinar la cantidad de SRATB. Como patrón se utilizó
1,1,3,3-tetraetoxipropano. En este Ejemplo de Ensayo
la capacidad antioxidante de la sericina se expresó de un modo
similar en comparación con el del caso en el que no se añadió
sericina.
| Tasa de inhibición (%) | |
| 0,3% de sericina L | 93 |
| 0,3% de sericina H | 95 |
Los Ejemplos de Ensayo 1 \sim 4 ilustran los
ejemplos que utilizan un sistema de constituyentes in vivo,
mientras que el Ejemplo de Ensayo 5 ilustra el ejemplo en el que
se utilizó como sistema experimental un sistema compuesto por un
componente químico puro. Se ha confirmado que la sericina puede
poseer una capacidad antioxidante, incluso cuando se emplean
sistemas experimentales tan diferentes.
A partir de los resultados de los Ejemplos de
Ensayo 4 y 5 se ha sugerido que la presencia de una capacidad
antioxidante de la sericina es mucho más segura, lo que no se
corresponde con el fenómeno observado solamente en el sistema
experimental específico.
Ejemplo de ensayo
6
A un tampón fosfato 1/15M (pH 6,8) que contenía
sericina H o sericina L se añadieron 0,1 ml de una solución de
tirosinasa (derivada de hongos, fabricada por Sigma Chemical Co.)
de 0,5 mg/ml (tampón fosfato 1/15M, pH 6,8) y 0,9 ml de tampón
fosfato 1/15M (pH 6,8) y la mezcla se incubó a 25ºC durante 10
minutos. Después se añadió 1 ml de DOPA de 0,3 mg/ml (tampón
fosfato 1/15M, pH 6,8), la incubación se realizó a 25ºC durante 5
minutos y luego se midió la absorbancia a 475 nm (D1).
Separadamente, se llevó a cabo un procedimiento similar utilizando
la enzima inactivada por calentamiento (D2) para determinar una
cantidad de cromo DOPA exenta de sericina (D3), y después se
calculó la tasa de inhibición de acuerdo con la ecuación
siguiente:
Tasa de inhibición (%) = ((D3
- D1)/(D3 -D2)) x
100
Como muestra la Tabla 6, se ha confirmado que
tanto la sericina H como la sericina L poseen una capacidad de
inhibición de la actividad de la tirosinasa. En particular, se
aseguró que poseían una capacidad de inhibición de la actividad de
tirosinasa a la concentración final de 0,5% o más.
Ejemplo de ensayo
7
Se repitió el mismo experimento al descrito en el
Eemplo de Ensayo 6, salvo que se aplicó la concentración final de
0,5% de sericina H y de sericina L, y este mismo experimento se
repitió también, como comparación, salvo que se utilizó
seroalbúmina bovina (concentración final 0,5%). Además, se hirvió
durante 2 horas una solución de sericina o de hidrolizado de
sericina disueltas en un tampón fosfato y después se determinó
también la capacidad de inhibición de la actividad de la tirosinasa
después del calentamiento.
\newpage
Al comparar entre las tasas de inhibición de la
actividad de tirosinasa de la sericina H o de la sericina L y
otras proteínas comunes (seroalbúmina bovina), se ha confirmado que
la seroalbúmina bovina apenas posee capacidad de inhibición de la
actividad de la tirosinasa y que la sericina y el hidrolizado de
sericina son superiores a la albúmina.
Por otra parte, la capacidad de inhibición de la
actividad de tirosinasa de la sericina H o de la sericina L se
mantiene sustancialmente sin cambios incluso si hay calentamiento.
De acuerdo con ello, se ha confirmado que la capacidad de inhibición
de la actividad de la tirosinasa de la sericina o del hidrolizado
de sericina es considerablemente estable frente al
calentamiento.
| Concentración final (%) | Tasa de inhibición de la actividad | |
| de tirosinasa (%) | ||
| Sericina H | Sericina L | |
| 0,25 | 6,0 | 5,3 |
| 0,5 | 35,5 | 20,0 |
| 1,0 | 50,1 | 29,1 |
| Concentración final (%) | Tasa de inhibición de la actividad | |
| de tirosinasa (%) | ||
| Seroalbúmina bovina | 0,5 | 5,8 |
| Sericina H (no calentada) | 0,5 | 37,5 |
| Sericina H (calentada) | 0,5 | 35,0 |
| Sericina L (no calentada) | 0,5 | 27,3 |
| Sericina L (calentada) | 0,5 | 22,6 |
La sericina es soluble en agua y, por lo tanto,
podría emplearse también como un antioxidante o como un inhibidor
de la actividad de tirosinasa en los productos con bajo contenido
en aceites o grasas. Además, no tiene efecto promotor de peróxidos
de lípidos en un intervalo bajo de concentracionesón como se ha
observado en la vitamina C.
Además, la sericina tiene las características que
se han observado en las proteínas o péptidos derivados de
productos naturales, muestra una buena afinidad con la piel, no
tiene propiedades acumulativas debido a que se hidroliza fácilmente
por una proteasa y tiene una alta seguridad, de modo que puede
utilizarse en un campo muy extenso que incluye medicinas,
productos de para-farmacia, cosméticos, alimentos,
etc. Además, tiene la característica de que su actividad no se
inactiva ni siquiera por calentamiento y que mantiene, al mismo
tiempo que la seguridad, una actividad prolongada de
inhibición.
Y además, la sericina puede extraerse fácilmente
como proteína o péptido sencillo con un alto grado de pureza, a
partir de un extracto de capullo de gusano de seda o de seda bruta
con un disolvente y, por lo tanto, se pone a disposición de forma
barata, al tiempo que su solución acuosa es incolora y
transparente, de modo que no es necesaria la decoloración ni
tampoco etapas complicadas de tratamiento, lo que da lugar a
grandes ventajas.
Claims (10)
1. Utilización de sericina como antioxidante, con
la condición de que la utilización no sea un tratamiento de
terapia del cuerpo humano o animal.
2. Utilización de sericina como antioxidante en
un cosmético.
3. Utilización de sericina según la
reivindicación 2, en la que el cosmético es un cosmético
aclarante.
4. Utilización de sericina según la
reivindicación 1, para evitar la alteración de color de un sistema
al que se ha añadido.
5. Utilización de sericina según las
reivindicaciones 1 o 4, como antioxidante en alimentos y aditivos
de alimentos.
6. Utilización de sericina según la
reivindicación 1 como inhibidor de peróxidos de lípidos.
7. Utilización de sericina según la
reivindicación 1, como inhibidor de la actividad de
tirosinasa.
8. Utilización de sericina para la fabricación de
un medicamento para ejercer un efecto de inhibición de peróxidos
de lípidos en el tratamiento del infarto de miocardio,
arterioesclerosis, diabetes mellitus, cáncer o apoplejía
cerebral.
9. Utilización de sericina según la
reivindicación 8, en la que el medicamento se formula para uso
externo.
10. Utilización de sericina según la
reivindicación 8 en la que el medicamento se formula para
administración oral.
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