KR100462805B1

KR100462805B1 - 세리신의 효소가수분해방법 및 그에 사용되는 반응기

Info

Publication number: KR100462805B1
Application number: KR10-2002-0011883A
Authority: KR
Inventors: 남중희; 권영기; 강경돈; 이기훈
Original assignee: 재단법인서울대학교산학협력재단
Priority date: 2002-03-06
Filing date: 2002-03-06
Publication date: 2004-12-29
Also published as: KR20020026507A

Abstract

본 발명은 고분자량의 단백질인 세리신을 효소가수분해방법에 의하여 분해함에 있어서, 그에 사용된 효소를 효율적으로 회수 및 재활용할 수 있도록 하는 세리신의 효소가수분해방법에 관한 것으로, 섬유를 가수분해하여 그 표면에 하이드록실기(-OH)와 카르복실기(-COOH)가 도출되도록 하는 단계; 전기 단계에서 처리된 섬유의 표면을 가교제인 글루타알데히드를 이용하여 활성화시키는 단계; 전기 단계에서 활성화된 섬유의 표면에 효소를 고정시키는 단계; 전기 단계에서 효소가 고정된 섬유를 효소 반응기에 장착시키는 단계; 및 전기 단계의 반응기에 세리신 수용액을 순환시켜 세리신이 효소 가수분해되도록 하는 단계를 포함하는 세리신의 효소가수분해방법이다.

Description

세리신의 효소가수분해방법 및 그에 사용되는 반응기 {Method of enzyme hydrolysis for sericin and the reaction device to be used therefor}

본 발명은 세리신의 효소가수분해방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 고분자량인 세리신을 효소가수분해방법에 의하여 분해함에 있어서, 그에 사용된 효소를 효율적으로 회수 및 재활용할 수 있도록 하는 세리신의 효소가수분해방법 및 그에 사용되는 반응기에 관한 것이다.

누에고치에 생산되는 실크는 고순도의 천연단백질원으로 섬유를 이루는 피브로인과 그를 감싸며 접착시키는 아교질의 세리신으로 구성된다. 이 중에서 세리신은 누에고치를 뜨거운 물에 담그면 녹아 나오는 것으로, 대체로 피브로인과 비슷한 아미노산의 조성을 가지나, 글리신, 알리닌 및 티로신의 함유량이 적고 세린과 산성아미노산의 함유량이 많다. 고압정련방법에 의하여 얻어지는 세리신의 분자량은 대체로 30,000-100,000으로 그 분자량의 분포가 매우 넓다.

세리신은 티로시나제의 활성억제, 지질의 과산화방지 등의 효능을 있는 것으로 알려져 있으나, 그 분자량이 매우 높기 때문에 수용액의 상태에서는 겔화가 쉽게 일어나고, 또한 동결 건조시키는 경우에는 용해도가 현저히 감소하는 현상을 보이므로, 이러한 이유로 지금까지 그 산업적인 이용이 활성화되지 못하고 있다.

따라서, 이러한 문제점을 해소하기 위해서는 무엇보다도 세리신의 저분자화가 필수적이다. 최근까지 효소가수분해방법이 세리신의 저분자화에 가장 효율적인 방법으로 알려지고 있는데, 이 방법은 실크 단백질 용액에 효소를 직접 첨가하여 세리신의 고분자량을 저분자량으로 분해하는 방법이다. 일반적으로 효소가수분해방법은 효소의 반응특이성에 의하여 특정부위에서만 절단이 일어난다는 점과 환경친화적이라는 점에서 다른 방법에 비하여 그 우수성이 인정되고 있다.

그러나, 종래의 효소가수분해방법은 첨가된 효소를 회수하는 것이 어렵고, 한편으로 효소가 첨가되지 않은 순수한 세리신을 얻지 못한다는 점과, 다른 한편으로 고가(高價)의 효소를 재활용할 수 없음으로 인하여 경제적인 부담이 크다는 점이 문제로 지적되고 있다. 특히, 세리신의 티로시나제의 활성억제효과를 이용하여 피부미백제로 사용하는 경우에는 그 순도가 매우 높아야 하는데, 종래의 효소가수분해방법은 효소의 완벽한 회수가 어려워 화장품에 사용할 수 있는 정도의 순도를 보장할 수가 없었다.

한편, 종래의 효소의 고정화 기술은 셀룰로오스, 데스트란, 녹말, 아가로스 등의 폴리사카라이드류의 고분자에 효소를 고정시키는 것으로, 그 지지체의 형태로는 다공성 비드(bead) 또는 겔 등이 많이 사용되었다. 그러나, 이러한 종래 기술은, 기질 확산속도의 저하, 효소의 반응부위로의 접근 곤란, 유속의 감소 등의 문제가 있기 때문에 주로 저분자량의 물질에 적합한 것으로, 수만 단위의 분자량을 갖는 세리신에는 적용될 수가 없는 것이다.

본 발명은 위와 같은 종래 방법의 문제점을 해소하기 위하여 창안된 것으로, 본 발명의 목적은 세리신을 효소가수분해에 의하여 저분자화함에 있어서 효소의 회수 및 재활용을 가능하게 하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 효소가수분해방법을 이용하여 세리신의 저분자화함에 있어서, 효소가 첨가되지 않도록 하여 세리신의 순도를 높이는 것이다.

도1은 본 발명을 적용한 일 실시예

도2는 본 발명을 적용한 다른 실시예

도3은 본 발명을 적용한 반응기의 일 실시예

도4 (a)는 효소가 고정되기 전의 폴리에스테르 섬유의 조직 사진

도4 (b)는 효소가 고정된 후의 폴리에스테르 섬유의 조직 사진

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 방법은, 섬유를 가수분해하여 그 표면에 하이드록실기(-OH)와 카르복실기(-COOH)가 도출되도록 하는 단계; 전기 단계에서 처리된 섬유의 표면을 가교제인 글루타알데히드를 이용하여 활성화시키는 단계; 전기 단계에서 활성화된 섬유의 표면에 효소를 고정시키는 단계; 전기 단계에서 효소가 고정된 섬유를 효소 반응기에 장착시키는 단계; 및 전기 단계의 반응기에 세리신 수용액을 순환시켜 세리신이 효소 가수분해되도록 하는 단계를 포함하는 것이다.

또한, 본 발명의 반응기는, 일측에 입구와 타측에 출구를 갖는 관상의 통체와 섬유의 표면을 부분 가수분해하여 하이드록실기(-OH)와 카르복실기(-COOH)를 도출시켜 활성화되고 이에 효소가 고정된 섬유가 장착되어 있는 구성으로 된 것이다.

이하 본 발명에 대하여 구체적으로 설명한다.

본 발명의 방법을 각 단계별로 설명하면 아래와 같다.

첫째 단계 : 폴리에스테르 또는 나일론 섬유를 가수분해하여 그 표면에 하이드록실기(-OH)나 카르복실기(-COOH)가 도출되도록 하는 단계.

전술하였듯이, 종래 기술에 있어서 효소의 고정화 기술은 그 지지체의 형태로 다공성 비드(bead) 또는 겔, 막 등을 사용하는 것이기 때문에 기질확산의 속도에 따라 유속의 저항이 심하게 발생하여, 저분자 기질에는 사용될 수 있으나, 고분자 기질에는 사용될 수가 없었다. 본 발명은 이러한 종래 기술과는 달리, 섬유에 단백질을 결합시키는 방법을 이용하는 것으로, 단면적이 넓어 기질확산의 속도유속에 대한 저항성이 현저히 감소하는 장점이 있다.

본 발명에서 사용되는 섬유로는 작용기를 갖는 섬유가 적합하다. 면, 레이온, 아세테이트와 같은 셀룰로오스계 섬유처럼 히드록시기(-OH)를 갖는 경우 보다 쉽게 효소를 고정시킬 수 있기 때문에 본 발명이 적용될 수 있으나, 이러한 종류의 섬유는 그 표면에 효소를 고정시키는 공정이 복잡하기 때문에 막상 본 발명을 적용시킴에 있어서 그다지 바람직한 것은 아니다. 그리고, 올레핀계 섬유는 작용기가 없기 때문에 효소고정에 부적합하다.

폴리에스터 또는 나일론의 경우 작용기 측쇄가 존재하지는 않지만 표면의 가수분해를 통하여 고분자 말단의 아미드기(-NH2), 히드록시기(-OH) 또는 카르복실기(-COOH)를 도출시킬 수 있으므로 사용이 가능하다. 뿐만 아니라, 폴리에스터 또는 나일론을 사용하는 경우에는 효소의 고정이 용이하기 때문에 본 발명에 사용되기에 가장 적합하다.

폴리에스터 또는 나일론의 표면을 가수분해함에 있어서는 2-8%의 수산화나트륨 수용액에 폴리에스터나 나일론을 실온에서 약 0.5-2시간 담가두면 된다. 수산화나트륨 수용액의 온도를 상승시키면 가수분해에 소요되는 시간을 단축킬 수 있으나, 섬유의 표면이 많이 손상될 수 있으므로, 실온(약 15-35℃ 정도)에서 반응시키는 것이 바람직하다.

둘째 단계 : 가교제를 이용하여 가수분해된 섬유의 표면을 활성화시키는 단계.

섬유의 표면에 효소를 보다 견고하게 고정시키기 위해서는 섬유 표면의 작용기에 효소를 직접 고정시키기보다는 섬유 표면에 가교제를 첨가하여 효소가 섬유 표면에서 공유결합을 하도록 하는 것이 필요하다. 즉, 간단한 가교제를 사용하여 섬유의 표면을 활성화시키는 것이다.

일반적으로, 효소는 일종의 단백질로서, 라이신 또는 알기닌의 아미드기, 아스파틱산 또는 글루타민산의 카르복실기, 세린, 트레오닌 또는 티로신의 히드록시기, 시스틴의 황화수소기 등이 작용기로서 존재하므로, 가교제는 이러한 작용기와 용이하게 결합할 수 있는 것이면 어느 것이나 사용이 가능하다. 그러나, 사용의 편이성 및 효율성 등을 고려하면, 본 발명에 있어서는 글루타알데히드를 가교제로 사용하는 것이 바람직하다. 가교제를 이용하여 섬유의 표면을 활성화시키면, 지지체인 섬유 표면이 친전자성이 되어 친핵성인 효소의 작용기와 용이하게 반응을 일으키게 된다.

글루타알데히드를 가교제로 사용하는 경우에는 5-15%의 글루타알데히드용액에 섬유를 10-60분간 담가두면 된다. 다만, 글루타알데히드 용액에 담가두기 전에 충분히 수세하여 전 단계에서의 수산화나트륨이 과잉으로 섬유에 묻어있지 않도록 하여야 한다.

셋째 단계 : 전기 단계에서 활성화된 섬유의 표면에 효소를 고정시키는 단계.

전 단계에서의 글루타알데히드가 섬유의 표면에 과잉으로 묻어있지 않도록 충분히 수세한 후, 그 섬유를 0.5-2%의 효소액에 약 10시간 이상 담가두어 섬유의 표면의 작용기에 효소를 고정시킨다. 이때 사용되는 효소로는 트립신 또는 α-키모트립신이 바람직하다.

넷째 단계 : 전기 단계에서 효소가 고정된 섬유를 효소 반응기에 장착시키는 단계.

전기 단계에서 효소가 고정된 섬유를 반응기에 장착시킴에 있어서, 반응기는 유체의 흐름이 원만히 이루어질 수 있는 (입구와 출구가 별도로 형성되어 있는) 관형의 통체를 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 관형의 반응기에 섬유를 고정시킴에 있어서는, 반응기 입구측 단부에 섬유를 고정시켜 둘 수도 있고, 또는 반응기 내부에 섬유를 (고정됨이 없이) 충전시켜 둘 수도 있다. 반응기 내부에 섬유를 충전시키는 경우에는, 유체의 흐름을 둔화시키지 않도록 충전되는 섬유의 양을 조절하여야 하고, 또한 반응기 양단부의 입출구의 크기는 섬유는 빠져나가지 못하고, 유체만 흘러나갈 수 있는 정도이어야 한다.

본 발명에 있어서, 상기한 단계를 거쳐 효소가 고정된 섬유를 최종적으로 반응기에 장착시킬 수도 있으나, 필요에 따라서는, 섬유를 반응기에 미리 장착시킨 후, 수산화나트륨에 의한 가수분해과정, 글루타알데히드에 의한 섬유표면의 활성화과정, 효소의 고정화 과정을 거칠 수도 있다. 즉, 본 발명에 있어서, 효소가 고정된 섬유를 반응기에 장착시키든지, 아니면, 섬유를 반응기에 장착시킨 후 그 섬유에 효소를 고정시키든지, 그 어느 것도 가능하다. 즉, 그 순서를 어떻게 하는지는 문제가 되지 않는다. 다만, 여러가지 화학약품이 사용되므로, 반응기의 재질은 내화학성을 가지는 것이어야 하며, 기질의 흡착이 잘 일어나지 않는 것일수록 좋다.

다섯째 단계 : 전기 단계의 반응기에 세리신 수용액을 순환시켜 세리신이 효소 가수분해되도록 하는 단계.

누에고치를 뜨거운 물에 담구면 세리신이 녹아 나오는데, 본 발명에서는 이와 같이하여 얻어진 세리신 수용액을 그 농도를 1-3%로 하여 본 발명의 반응기를 반복 통과시키게 하는 것이다.

도1은 반응기를 한개 설치한 경우를 도시한 것이고, 도2는 반응기 두개를 설치한 경우를 도시한 것이다. 반응기를 두개 설치하는 경우에는 효소의 종류를 달리하여 제1반응기에는 트립신을 고정시키고, 제2반응기에는 α-키모트립신을 고정시키는 것이 바람직하다. 트립신은 티로신 잔기의 펩타이드 결합을 절단하고, α-키모트립신은 세린 잔기의 펩타이드 결합을 절단하므로, 절단부분을 달리하는 장점이 있다.

반응기에 세리신 수용액을 통과시킴에 있어서는, 수용액의 온도를 30-45℃로 하고, 유속을 1-30㎖/min하여 반복 순환시킨다. 순환의 반복횟수는 반응기의 크기, 반응기에 충전된 (효소가 고정된) 섬유의 양, 유속 등에 따라 달라질 수 있다. 반응기의 크기가 크고, 섬유의 양이 많고, 유속이 느릴 수록 반복횟수가 적어지고, 그 반대인 경우에는 반복횟수가 많아져야 한다. 이러한 과정을 거치면, 세리신은 효소에 의하여 가수분해되어 저분자화된다.

이하 본 발명을 실시예에 의거 설명한다.

(실시예)

뜨거운 물에 누에고치를 담가 세리신이 녹아나오게 한 후, 이 세리신 용액을 본 발명의 반응기를 반복하여 순환하게 하고, 그 결과물로서 채취된 세리신의 특성을 측정하였다. 본 실시예에서 행해진 공정은 아래와 같다.

제1공정 : 폴리에스터 섬유(120데니아)를 150회 권취한 후, 유리관(길이 90㎝, 직경 1.5㎝)내에 실다발의 양끝을 도3과 같이 고정, 장착시켰다. 이와 같이 하여 두개의 유리관(제1반응기와 제2반응기)을 제조하였다.

제2공정 : 상기 폴리에스터 섬유가 장착된 유리관을 실온에서 5%의 수산화나트륨 용액에 1시간 동안 침지시켜 폴리에스터의 표면에 하이드록실기(-OH)와 카르복실기(-COOH)가 도출되도록 전처리 하였다.

제3공정 : 상기 수산화나트륨에 의하여 전처리된 폴리에스터를 3회 이상 수세하여 과잉의 폴리에스터 표면에 부착되어 있는 과잉의 수산화나트륨을 제거하고,이를 실온에서 10% 글루타알데히드 용액에 30분간 침지시켜, 폴리에스터 섬유의 표면을 가교제로서 활성화시켰다.

제4공정 : 상기 활성화된 폴리에스터를 3회 이상 수세하여 표면에 부착된 과잉의 글루타알데히드를 제거하고, 이를 실온에서 1%의 효소액에 12시간 침지시켰다. 이때, 반응기1에는 트립신을 고정시켰고, 반응기2에는 α-키모트립신을 고정시켰다. 그 후, 이를 3회 이상 수세하여 과잉의 효소를 제거하였다. 도4의 (a) 및 (b)는 효소 고정 전과 효소 공정 후의 폴리에스터의 조직을 전자현미경으로 확대 촬영한 것으로, 이에서 보듯이, 본 발명의 방법에 의하여 폴리에스터의 표면에 효소가 견고히 고정되어 있다.

제5공정 : 누에고치 40g을 120℃의 물 1,000㎖에 1시간 침지시켜 세리신을 추출하고 그 농도를 1%로 조절하여, 상기 공정에서 제조된 반응기1와 반응기2 각각, 그리고 반응기1 과 반응기2를 동시에, 반복 순환시킨 후, 최종적으로 효소가수분해된 세리신을 추출하였다.

본 실시예에서 추출한 세리신 각각의 성질을 측정하여, 열수 추출 및 일반적인 효소분해의 결과물과 비교하였는바, 그 결과는 하기 표1과 같다.

이때, 실험예1은 상기 세리신 용액을 트립신을 고정시킨 반응기1을 35℃의 온도조건에서 20㎖/min의 유속으로 6시간 순환시킨 것이고, 실험예2는 α-키모트립신을 고정시킨 반응기2를 35℃의 온도조건에서 20㎖/min의 유속으로 6시간 순환시킨 것이며, 실험예3은 상기 제1반응기와 제2반응기를 모두 통과시킨 것으로 수용액의 온도는 40℃이고, 5㎖/min 유속으로 1회 순환시킨 것이다.

표1

처리방법	분자량	겔화시간 (농도)	용해도(%)
열수추출	30,000-100,000	1시간 (3%)	63.29
일반적인 효소분해	10,000-30,000	8시간 (3%)	73.45
제1반응기를 사용한 경우	10,000 이하	겔화가 일어나지 않음 (10%)	95.65
제2반응기를 사용한 경우	10,000 이하	겔화가 일어나지 않음 (10%)	96.12
제1반응기 및 제2반응기를 모두 사용한 경우	10,000 이하	겔화가 일어나지 않음 (10%)	95.41

상기 표1에서 보듯이, 종래의 방법에 의한 경우에는 분자량을 10,000이하로 낮출 수 없었으나, 본 발명의 방법을 적용한 경우에는 세리신의 분자량이 모두 10,000 이하이었다.

그리고, 겔화를 측정함에 있어서는 세리신 수용액내의 염농도를 변화시키기 위하여 NaCl. KCl, CaCl₂등을 첨가하여 겔화를 관찰하였으며, 세리신 수용액의 농도가 1%인 경우에는 겔화시간이 너무 많이 걸리기 때문에 세리신 수용액의 농도를 3%로 농축하여 겔화를 관찰하였다. 겔화 여부는 수용액이 담긴 용기를 90°로 기우렸을 때 수면이 변화되지 않으면 겔화가 발생한 것으로 판정하였다.

열수추출이나 종래의 효소분해의 경우에는 3%의 농도에서도 겔화가 일어났음에 불구하고, 본 발명의 경우에는 농도를 10%로 하여도 겔화가 일어나지 않았고, 두 달이 지나도 약간의 침전만 발생하였을 뿐 겔화 현상은 발견되지 않았다. 따라서, 본 발명에 의하면 농도가 10%인 세리신 수용액도 제조할 수 있다고 하겠다.

또한, 종래 기술의 경우에는 용해도가 60-70% 정도에 불과하나, 본 발명의 경우에는 용해도가 모두 95%이상이었다. 이러한 결과는 모두 세리신이 충분히 저분자화됨으로 인하여 이루어질 수 있는 것이다.

상기에서 설명한 바와 같이, 본 발명은 세리신의 저분자화를 효과적으로 달성할 수 있는 효소가수분해방법 및 그에 사용되는 반응기로서, 본 발명은 효소를 완전 회수함으로써 세리신에 효소가 잔존하지 않아 순도를 높일 수 있으며, 또한 고가의 효소를 재활용할 수 있도록 함으로써 경제성을 향상시키는 것이다. 따라서, 본 발명은 세리신의 다양한 산업적 이용을 활성화시키는 매우 유용한 것이라 하겠다.

Claims

섬유를 부분 가수분해하여 그 표면에 하이드록실기(-OH)와 카르복실기(-COOH)가 도출되도록 하는 단계; 상기 섬유의 표면을 가교제인 글루타알데히드를 이용하여 활성화시키는 단계; 상기 섬유의 표면에 효소를 고정시키는 단계; 상기 섬유를 효소 반응기에 장착시키는 단계; 및 상기 반응기에 세리신 수용액을 순환시켜 세리신이 저분자화되도록 하는 단계를 포함하는 세리신의 효소가수분해방법.
제1항에 있어서, 상기 섬유는 폴리에스테르 또는 나일론이며 가수분해를 위하여 수산화나트륨용액을 사용하는 것을 특징으로 하는 세리신의 효소가수분해방법.
삭제
제1항에 있어서, 상기 효소는 트립신 또는 α-키모트립신인 것을 특징으로 하는 세리신의 효소가수분해방법.
제1항에 있어서, 상기 반응기는 2개로서 제1반응기에는 트립신이 고정되고, 제2반응기에는 α-키모트립신이 고정된 것을 특징으로 하는 세리신의 효소가수분해방법.
제1항에 있어서, 상기 반응기는 관(管)형상의 통체로서 일측에 출구가 형성되고, 타측에 출구가 형성되며, 내화학성의 재질로 된 것을 특징으로 하는 세리신의 효소가수분해방법.
섬유를 효소 반응기에 장착시키는 단계; 상기 섬유를 가수분해하여 그 표면에 하이드록실기(-OH)와 카르복실기(-COOH)가 도출되도록 하는 단계; 상기 섬유의 표면을 가교제인 글루타알데히드를 이용하여 활성화시키는 단계; 상기 섬유의 표면에 효소를 고정시키는 단계; 상기 반응기에 세리신 수용액을 순환시켜 세리신이 저분자화되도록 하는 단계를 포함하는 세리신의 효소가수분해방법.
제7항에 있어서, 상기 섬유는 폴리에스테르 또는 나일론이고, 상기 섬유의 가수분해제는 수산화나트륨용액이고, 상기 효소는 트립신 또는 α-키모트립신인 것을 특징으로 하는 세리신의 효소가수분해방법.
일측에 입구가 형성되고 타측에는 출구가 형성되며 내화학성 재질로 된 관(管)형상의 통체를 이루고, 그 내부에는 수산화나트륨용액에 의해 가수분해되어 표면에 하이드록실기(-OH)와 카르복실기(-COOH)가 도출된 폴리에스테르 또는 나일론인 섬유가 장착되고, 상기 섬유의 표면은 가교제인 글루타알데히드에 의하여 활성화되고, 이에 효소인 트립신 또는 α-키모트립신이 고정된 것을 특징으로 하는 효소가수분해 반응기.
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