ES2200394T3 - Composicion para el tratamiento de estados alergicos con inhibidores de la proteinasa de la cisteina y serina. - Google Patents
Composicion para el tratamiento de estados alergicos con inhibidores de la proteinasa de la cisteina y serina.Info
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Abstract
El uso de un inhibidor de la actividad de la proteinasa de la cisteína conjuntamente con un inhibidor de la actividad de la proteinasa de la serina para la fabricación de un medicamento para la prevención o el tratamiento de un estado en el que un alergeno atraviesa una barrera epitelial.
Description
Composición para el tratamiento de estados
alérgicos con inhibidores de la proteinasa de la cisteina y
serina.
La presente invención hace referencia a los
medios para la prevención y/o tratamiento de las condiciones
alérgicas y más particularmente las condiciones en las que un
potencial alergeno (agente que produce la alergia) debe atravesar la
barrera epitelial. La invención tiene la aplicación particular,
pero no la única, de la prevención y/o tratamiento del asma.
El asma es la enfermedad crónica más común de la
infancia y la que produce un mayor debilitamiento y estado de
amenaza de la vida. Se caracteriza por una hipersensibilidad aguda,
reactividad bronquial crónica y daño y rotura del tejido
epitelial.
Un factor de riesgo primario para el asma es la
sensibilización del pulmón a los agentes alergenos en suspensión en
el aire tales como las proteínas excretadas en los pellets
(gránulos) fecales de los ácaros del polvo de la casa (house dust
mites = HDM) que pertenecen al género de los Dermatofagoides (por
ej. D pteronyssinus, D. Farinae). Cuando se inhalan, los
pellets fecales de los HDM impactan en el fluido que cubre la
superficie epitelial de las vías aéreas de gran diámetro. La
resultante hidratación de los pellets fecales de los HDM activará
una rápida y total descarga de las proteínas alérgicas principales
activando de este modo una alta concentración local de proteínas de
los HDM en el revestimiento de las líneas aéreas. La
sensibilización implica la detección del alergeno por las células
que presentan el antígeno que normalmente están protegidas del
entorno por el epitelio del pulmón. El mecanismo por el que los
alergenos son capaces de atravesar la barrera epitelial no es
totalmente conocido.
Ahora hay un cuerpo de evidencia creciente por el
que varios de los principales alergenos de los HDMs muestran una
competencia catalítica como enzimas y esto ha favorecido las
sugerencias de que estas acciones enzimáticas pueden ser importantes
en la sensibilización alérgica y para la perpetuación de las
reacciones inflamatorias alérgicas establecidas.
La mayoría de los datos referentes a la actividad
de la proteinasa en los alergenos de los ácaros están actualmente
relacionados con los de los grupos 1, 3, 6 y 9 para los ácaros del
género Dermatofagoides. Los alergenos del grupo 1 son las
proteinasas de la cisteína y han sido sujeto de mayor escrutinio
mientras que existe una menor cantidad de información referente a
los efectos enzimáticos de los alergenos del grupo 3, del grupo 6 y
del grupo 9 que comparten una idéntica secuencia con las
proteinasas del arquetipo de la serina y que son por sí mismas
catalíticamente competentes.
Se ha propuesto que la actividad de la proteinasa
de la cisteína es importante en la exacerbación de la respuesta
alérgica en el asma debido a que segmenta el CD23, un receptor IgE
de baja afinidad, en la superficie de las células que producen el
anticuerpo. La división da lugar a una retroacción positiva que
provoca un incremento de la secreción de IgE, aumentando de este
modo la respuesta alérgica. Sobre esta base, la patente WO-
A-97/04004 (Peptide Therapeutics) propone que los
inhibidores de las proteinasas de la cisteína pueden ser utilizadas
inter alia para la profilaxis del asma. Sin embargo no
creemos que sea probable que el mecanismo propuesto en la patente
WO-A-97/04004 vaya a funcionar in
vivo. El motivo para esto es que todos los experimentos de
división del CD23 han sido llevados a cabo en células en cultivo y
las concentraciones de Der p 1 requeridas para producir la división
fueron en nuestra opinión elevadas de forma no realista. Las
células afectadas estarían localizadas, in vivo, en los
tejidos o en la sangre. Es, en nuestra opinión, extremadamente
improbable que las concentraciones de alergeno alcancen los niveles
requeridos para producir la división del CD23 en estas situaciones.
No hay evidencia de que lo hagan, ni que la división del CD23 tenga
lugar in vivo.
Kalsheker N. y col. (1996) Biochem.
Biophys. Res. Comms. (USA) 221/1 páginas 59- 61 describen que el
inhibidor de la proteinasa de la serina \boxempty_{1}-
antitripsina protege el aparato respiratorio inferior del daño de
las proteinasas liberadas en el pulmón durante la inflamación. La
proteinasa de la cisteína Der p1 ha demostrado que divide el ciclo
reactivo propuesto del inhibidor de la proteinasa de la serina
\boxempty_{1} antitripsina y se propone que este mecanismo es
importante en la patogénesis del asma. También se ha descrito que la
deficiencia de \boxempty_{1}-antitripsina está
relacionada con la incidencia del asma en la infancia. Sin embargo
no hay ninguna descripción de cómo deben ser tratadas o prevenidas
las condiciones alérgicas (tales como el asma) en las que el
alergeno debe atravesar la barrera epitelial.
Stewart G. y col. (1991) Int. Arch. Allergy Appl.
Inmunol. 95/2-3 páginas 248- 256 describen que las
heces de los ácaros del polvo contienen tres proteinasas de la
serina y una proteinasa de la cisteína junto con otras varias
enzimas. También se describe que la proteinasa de la cisteína y al
menos una de las proteinasas de la serina producen alergia. Sin
embargo, no se describe cómo pueden ser tratadas o prevenidas las
condiciones alérgicas tales como el asma en que un alergeno debe
atravesar una barrera epitelial.
A pesar de que se ha tenido lugar un considerable
esfuerzo en el campo de la investigación del asma, queda todavía
una necesidad para métodos mejorados para la prevención y/o
tratamiento del asma (y otras condiciones alérgicas en las que un
alergeno potencial atraviese una barrera epitelial).
\newpage
De acuerdo con la presente invención se
proporciona el uso de un inhibidor de la actividad de la proteinasa
de la cisteína conjuntamente con un inhibidor de la actividad de la
proteinasa de la serina para la fabricación de un medicamento para
la prevención o tratamiento de un estado en el que el alergeno
atraviese una barrera epitelial.
La invención es particularmente aplicable (pero
no exclusivamente) al tratamiento del asma para el que la actividad
de la proteinasa de la cisteína a inhibir es preferiblemente la del
Der p 1 mientras que la actividad de la proteinasa de la cisteína a
inhibir puede ser la de cualquier proteinasa de la serina distinta
de la tripsina, preferiblemente un alergeno proteinasa de la serina
y más preferiblemente al Der p 3, al Der p 6 y/o al Der p 9.
La invención se ha basado en nuestros estudios
experimentales (que se fijan en mayor detalle a continuación) que
han demostrado que la etapa inicial clave en la sensibilización
alérgica a los alergenos de los ácaros del polvo de la casa está
mediada tanto por la actividad de la proteinasa de la cisteína como
de la serina. Hemos encontrado que esta actividad provoca la rotura
de las conexiones rígidas entre las células del epitelio
incrementando de este modo la permeabilidad epitelial y permitiendo
al alergeno atravesar el epitelio. Por estos medios, los alergenos
pueden ganar exceso a, e interaccionar con, las células que
presentan antígeno dendrítico para producir una respuesta alérgica.
Los inhibidores de la proteinasa de la cisteína inhiben los
alergenos de la proteinasa de la cisteína pero no los alergenos de
la proteinasa de la serina y de este modo no bloquean completamente
la rotura de las conexiones rígidas. De forma similar, los
inhibidores de la proteinasa de la serina bloquean los efectos de
los alergenos de la proteinasa de la serina pero no los alergenos
de la proteinasa de la cisteína y de este modo no bloquean
completamente la rotura de la conexión rígida. La inhibición parcial
permitiría todavía el que se produjera una respuesta alérgica. La
inhibición tanto de la actividad de la proteinasa de la cisteína
como de la serina de los alergenos es necesaria para inhibir
completamente la rotura de las conexiones rígidas y de este modo la
generación de una respuesta alérgica.
Aunque la invención es aplicable de forma
particular a la prevención y/o tratamiento del asma, puede ser
aplicada a un intervalo de otras condiciones alérgicas incluyendo la
rinitis, la conjuntivitis alérgica, la dermatitis atópica y las
alergias a la comida.
El tratamiento y/o la prevención del estado
alérgico puede ser efectuado por medio de
- (i) una formulación que tenga actividad inhibitoria de la proteinasa de la cisteína y la serina; o
- (ii) un kit (equipo) que comprende un inhibidor de la actividad de la proteinasa de la cisteína y un inhibidor de la actividad de la proteinasa de la serina.
En la formulación, un único compuesto inhibidor
puede proporcionar la inhibición requerida de la actividad de la
proteasa de la serina y cisteína. Sin embargo, de forma más usual,
la inhibición de la actividad de la proteinasa de la cisteína y de
la actividad de la proteinasa de la serina será proporcionada por
compuestos inhibidores separados.
Cuando se utilicen compuestos inhibidores
separados, como en el kit, estos pueden ser utilizados de forma
simultánea con otros o de forma secuencial.
En el caso en que sea necesario puede utilizarse
más de un tipo de actividad de proteinasa de la cisteína y/o más de
un tipo de actividad de la proteasa de la serina para proporcionar
el espectro de actividad requerido.
La invención es aplicable de forma particular al
tratamiento del asma incluyendo el tratamiento profiláctico del
mismo. Por el término tratamiento profiláctico se incluye cualquier
tratamiento aplicado para prevenir, o mitigar el efecto de, un
ataque asmático subsiguiente. El tratamiento profiláctico puede ser
dado, por ejemplo, periódicamente a una persona de la que se
conozca que sufre de ataques asmáticos con vistas a prevenir, o
reducir la frecuencia de, dichos ataques. De forma alternativa el
tratamiento profiláctico puede ser dado bajo una base ad hoc
a una persona que sufra de asma y que esté sometida a un entorno
(por ej. un entorno infectado con alergeno) que puede hacer más
probable el comienzo de un ataque asmático. Una posibilidad
adicional es para el tratamiento profiláctico a administrar a una
persona que no haya desarrollado asma pero que, por un motivo u
otro, se crea que tenga un riesgo de padecerlo.
Para el objetivo de administración terapéutica,
el compuesto(s) inhibitorio será formulado en un excipiente
farmacéuticamente aceptable para la liberación al epitelio del
pulmón. Más preferiblemente el compuesto(s) inhibitorio será
liberado por medio de un aerosol tal como los tratamientos para
anti-asmáticos convencionales. Sin embargo, no se
pueden excluir otras rutas de liberación.
La cantidad del compuesto(s) inhibitorio a
administrar será, naturalmente, una dosis terapéuticamente
efectiva. La proporción de la dosis dependerá de factores tales
como el peso del paciente a tratar, la severidad de la condición
asmática a tratar y la actividad de los inhibidores. Sin embargo,
se encontrarán dosis típicas en el intervalo comprendido entre 1 y
1000 microgramos por día.
Ejemplos de inhibidores de la actividad de la
proteinasa de la cisteína que pueden ser utilizados para cualquier
aspecto de la invención incluyen
L-tran-epoxisuccinil-
leucilamido-(4-guanidino)-butano
(E-64) así como los inhibidores de la proteinasa de
la cisteína descritos en la patente
WO-A-97/04004.
\newpage
Ejemplos de inhibidores de la actividad de la
proteinasa de la serina que pueden ser utilizados para cualquier
aspecto de la invención incluyen el clorhidrato del fluoruro de
4-(2-aminoetil)-bencenosulfonilo
(AEBSF).
La invención se ilustrará por los siguientes
Ejemplos no limitativos (y las Figuras que los acompañan) que dan
resultados al Ejemplo.
Utilizando los métodos descritos en mayor detalle
a continuación, el Ejemplo demuestra el efecto sobre la
permeabilidad epitelial de
- (i) las fracciones de proteinasa de la cisteína y serina separadas a partir de los ácaros del polvo de la casa, y
- (ii) las fracciones especificadas bajo (i) en combinación con inhibidores de la actividad de la proteinasa de la cisteína y la serina.
Se utilizaron células Calu-3 y
MDCK como paradigmas para examinar las uniones intercelulares del
epitelio y su susceptibilidad a las proteinasas de los HDM y a los
potenciales inhibidores. Ambas líneas celulares expresan uniones
rígidas, adhesivos por zonas y desmosomas y son modelos aceptables
de mecanismos de adhesión de células presentes en las vías aéreas.
El Calu-3 es una línea celular de adenocarcinoma
derivado de un varón caucasiano de 25 años de edad. Ha sido el
sujeto de relativamente pocas investigaciones, pero es conocido por
expresas propiedades de barrera precisas sobre la base de estudios
electrofisiológicos (Shen y col., 1994; Haws y col.,
1994) y nuestra propia caracterización inmunocitoquímica (no
conocida). Las células fueron propagadas en un medio esencial mínimo
Eagle con sales Earle (EMEM) suplementadas con un 10 % de suero de
vaca fetal inactivado caliente al 10% v/v (FCS), 2mM de
L-glutamina, amino ácidos no esenciales, 10\muM de
piruvato sódico y conteniendo 50U/ml de penicilina y 50\mug/ml de
estreptomicina.
Se cultivaron células epiteliales (MDCK) de riñón
de canino Madin-Darby en EMEM conteniendo 50U
ml^{-1} de penicilina, 50\mug ml^{-1} de estreptomicina, 2mM
de L-glutamina, amino ácidos no esenciales y un 10%
v/v de FCS inactivados por calor. Para el subcultivo de ambos tipos
de células, las células fueron enjuagadas en solución salina
tamponada con fosfato (PBS) sin calcio ni magnesio y a continuación
fueron digeridas parcialmente utilizando tripsina al 0,05 %
(peso/v) y una solución de EDTA al 0,02 % (peso/v).
Todos los cultivos fueron propagados a 37ºC en
una atmósfera humidificada de dióxido de carbono al 5 % en
aire.
Se llevaron a cabo determinaciones de la
eliminación de manitol en monocapas de células confluentes que
habían sido propagadas en insertos Costar Transwell® de 0,4 \mum
de diámetro de poro recubiertos con una imprimación de Matrigel
ultrafino no gelificado. Se consiguió el recubrimiento por adición
de alícuotas de 250\mul de Matrigel (diluidas 1:500 v/v en EMEM)
al interior del inserto seguido por incubación ambiente durante 60
minutos bajo condiciones asépticas. A continuación se aspiró la
solución y los insertos fueron bien lavados con medio antes de la
adición de una densidad confluente de suspensión de células.
Se colocaron en placas células
(2-5 x 10^{5} por cm^{2} de área de
crecimiento) sobre insertos recubiertos con Matrigel. Se utiliza el
término 'inserto' como significado de la unidad del filtro que
contiene las células y el término 'pocillo' como referencia a las
cavidades de la placa de cultivo de tejido. Para registrar el
crecimiento y la integridad, se tomaron los insertos al azar, se
lavaron bien en PBS y se tiñeron bajo eliminación difusa con naranja
de acridina y bromuro de etidio (l mg ml^{-1} cada uno en PBS).
Los insertos fueron examinados por microscopía de fluorescencia y
se utilizaron sólo cuando se se alcanzó la confluencia con alta
viabilidad.
En concurrencia, el medio fue aspirado de los
pocillos y sustituido con EMEM libre de suero y de bicarbonato
tamponado con 20 mM de HEPES y conteniendo 2 mM de
L-glutamina. A continuación se eliminó ligeramente
el medio de los insertos y se sustituyó con 300\mul de EMEM libre
de suero conteniendo manitol marcado con [^{14}C] (1\muCi
ml^{-1} y l mg ml^{-1} de manitol no marcado en un medio
tamponado con HEPES). A continuación se equilibraron las placas
Transwell® durante 30 min a 37ºC en un agitador orbital Luckham
R100. Se tomaron muestras por triplicado de alícuotas de 100\mul
de la solución de manitol marcado no utilizado y se determinó su
contenido en radioactividad por espectrometría de centelleo líquido
(Beckman LS6000IC) seguido por la adición de 5ml de
Opti-Fluor.
Después del periodo de equilibrio, se situaron
los insertos en pocillos frescos conteniendo 1 ml de EMEM tamponado
con HEPES libre de suero y se incubaron a 37ºC con ligera agitación
continua. Se retuvo el medio de los pocillos originales y se
determinó su contenido de radioactividad después de la adición de
10ml de Opti-Fluor. Estos resultados se utilizaron
para determinar la concentración de trazador a tiempo cero. Se
eliminaron, a intervalos de tiempo, alícuotas de 20\mul del
fluido de baño basolateral y se cuantificó el manitol marcado con
^{14}C tal como se ha descrito anteriormente para el cálculo del
volumen de eliminación.
Se determinó la permeabilidad paracelular del
manitol de acuerdo con el procedimiento descrito en nuestra
solicitud de patente U.K. pendiente de concesión No. 9715058 y se
calculó a partir de mediciones del volumen de eliminación a puntos
de tiempo definidos. Las estimaciones de eliminación se hicieron
durante 3-5 h y se calcularon de acuerdo con la
relación:
(1)V_{probe_{t}}=\sum\limits^{1}_{i=1}
\frac{VA_{i}\Delta
[A]_{i}}{[L]_{i}}
en
donde:
V_{probe_{t}} es el volumen de eliminación para
cada punto de tiempo
VA_{i} es el volumen abluminal para cada punto
de tiempo
\Delta [A]i es el incremento en la
concentración de trazador entre puntos de tiempo
[L]_{i} es la concentración de trazador
luminal a cada punto de tiempo
Bajo condiciones en que la difusión es el único
medio de movimiento transepitelial del soluto, el dV_{probe} /dt
se aproxima de forma muy cercana al producto permeabilidad- área de
la superficie permitiendo así la estimación de la permeabilidad del
manitol en el sistema compuesto de células, filtro, capas no
agitadas y recubrimiento de la proteína (P_{t} ). La
permeabilidad epitelial puede ser calculada a partir de la variable
medida considerando el filtro recubierto con Matrigel y las capas
no agitadas como un sistema de series de permeabilidades. De este
modo:
(2)\frac{1}{P_{1}}=\frac{1}{P_{1}}+\frac{1}{P_{2}}+\frac{1}{P_{3}}
y
(3)\frac{1}{P_{4}}=\frac{1}{P_{2}}+\frac{1}{P_{3}}
en
donde
P_{t} es la permeabilidad compuesta del
sistema
P_{1} es el componente debido solo a las
células epiteliales
P_{2} es el componente debido al filtro sin
Matrigel
P_{3} es el componente de la capa no
agitada
P_{4} es la permeabilidad del filtro con el
recubrimiento de Matrigel
En sistemas de difusión puros
(4)P_{3}=\frac{D}{\delta}
en
donde
D es el coeficiente de difusión libre del
manitol
\delta es el espesor sumado de las capas no
agitadas
\newpage
El espesor de la capa no agitada es independiente
de la permeabilidad de la membrana bajo condiciones ideales, con lo
que P3 en las ecuaciones (3) y (4) es idéntico. Las ecuaciones de
resta (2) y (3) permiten de este modo el cálculo de la permeabilidad
de la monocapa epitelial (5).
(5)\frac{1}{P_{1}}=\frac{1}{P_{t}}-\frac{1}{P_{4}}
Se llevó a cabo el análisis de varianza después
de la transformación logarítmica de los datos de permeabilidad y
los valores de probabilidad para los diferentes tratamientos
asignados utilizando el ensayo de diferencia menos significativa.
Los datos se presentan como los valores promedio geométricos con
errores estándar indicados de n observaciones
experimentales. Los niveles de probabilidad de P<0,05 fueron
considerados estadísticamente significativos.
Los alergenos de la proteinasa de los HDM todavía
no han sido preparados en una forma catalíticamente competente por
expresión celular recombinante de la proteína de la enzima madura.
Por conveniencia, y para permitir la futura selección a gran escala
de inhibidores potenciales en ausencia de proteínas recombinantes
catalíticamente activas, es deseable separar la actividad de la
proteinasa de la cisteína y de la serina por simple fraccionamiento
bioquímico del medio gastado en el que se ha producido el
crecimiento del HDM. Durante el cultivo los HDM liberan alergenos
en el medio resultante en la acumulación de proteínas adecuadas
para la purificación. Se disolvió el medio gastado de los cultivos
de D. pteronyssinus (Commonwealth Serum Laboratory,
Parkville, Australia) en 5 volúmenes de solución salina tamponada
con fosfato y a continuación se centrifugó a 48.400 x g y a 4ºC
durante 20 min. Se añadió de forma gradual sulfato amónico sobre el
sobrenadante agitado a 4ºC para conseguir una solución saturada al
50 %. Después de la centrifugación (48.400 x g, 20 min, 4ºC) se
redisolvió el pellet, del que se encontró por ensayo enzimático que
estaba enriquecido en la actividad de la proteinasa de la cisteína,
en un volumen mínimo de agua destilada. Se añadió sulfato amónico
al sobrenadante del primer corte para conseguir una saturación del
80 %. El pellet resultante de la centrifugación adicional, del que
se encontró que estaba enriquecido en la actividad de la proteinasa
de la serina, fue resuspendido en un volumen mínimo de agua
destilada. Las fracciones de proteinasa de la cisteína (50 % del
precipitado) y de proteinasa de la serina (50-80 %
del precipitado) fueron dializadas de forma separada contra agua
destilada toda la noche y a continuación fueron liofilizadas antes
de la reconstitución en EMEM. El contenido de proteína de los
extractos fue medido utilizando la técnica azul de Coomassie con
albúmina de suero como estándar (Smithy col., 1985). Se
determinó la actividad de la proteinasa utilizando el ensayo de
degradación Azocoll tal como se ha descrito en otra parte (Herbert
y col., 1995; Chavira y col., 1984). También se
ensayaron los extractos para determinar la presencia de endotoxina
utilizando el ensayo de rotura (lisis) de amebocito Limulus
(Endotect®, ICN Biomedicals, Thame, Oxfordshire). En todos los
casos los niveles de endotoxina estuvieron por debajo del límite de
la detección del ensayo (<0,06ng ml^{-1}).
Las fracciones de proteinasa fueron separadas por
SDS-PAGE y transferidas electroforéticalmente a
membranas de nitrocelulosa. Se bloqueó la unión de proteína no
específica con un 5 % peso/v de leche no grasa y un 0,1 % v/v de
Tween-20 en solución salina tamponada con Tris
(TBS) seguido por incubación con mAb 5H8 (anti-Der p
1) diluida en TBS conteniendo un 2 % peso/v de albúmina de suero de
bovino y un 0,1 % v/v de Tween-20. La detección se
llevó a cabo por una técnica de quimioluminiscencia incrementada
(Amersham International, Buckinghamshire).
Las células se colocaron en capas en cápsulas de
petri de 60 x 15 mm y se dejaron crecer durante 2-4
días en EMEM conteniendo suero bajo condiciones de cultivo de
tejidos en una atmósfera al 5 % en CO_{2}. A continuación se
expusieron las células a tratamientos en EMEM libre de suero
conteniendo 20mM de HEPES mientras se mantenía bajo incubación
aeróbica a 37ºC. A puntos de tiempo definidos, las células se
recogieron con un raspador y se juntaron con las células separadas
en el sobrenadante. Las células fueron centrifugadas a 550 x g
durante 5 min y se extrajo su ADN (Nucleon II, Scotlab, Coatbridge,
Stratchclyde). Se suspendió de nuevo el ADN extraído en 100\mul
de tampón de TE (10 mM de Tris-HCL y 1 mM de
Na_{2} EDTA) toda la noche a temperatura ambiente, y su pureza se
determinó espectroscópicamente. Se aplicaron cantidades iguales de
ADN en relación 4:1 con un tampón muestra (0,25 % de azul de
bromofenol y un 40 % peso/v de sacarosa en agua) a cada banda de
geles de agarosa al 2 % (peso/v) y se llevó a cabo la
electroforesis a 50V durante 2-3h en un tampón TAE
(0,04M de Tris-acetato y 0,001M de EDTA). Las bandas
de ADN en los geles (que tuvieron bromuro de etidio incorporado a
los mismos) fueron visualizadas por luz
ultra-violeta.
La redistribución de la fosfatidilserina en la
capa externa de las membranas de las células que se produjo durante
la iniciación de la apoptosis fue estudiada utilizando la tinción
con anexina V. Esto se llevó a cabo en cápsulas petri de 60 x 15 mm
que habían sido modificadas por perforación de un agujero de 1 cm
de diámetro en la base de cada cápsula y cubriendo la cara externa
de ésta con una cobertura de vidrio asegurada en su sitio con
Sylgard (Dow Coming, Midland, MI, USA). Se montó un anillo de
poliamida por medio de un adhesivo de cianoacrilato sobre la capa
interior de la cápsula para crear un pocillo con fondo de vidrio
que a continuación fue recubierto con una capa ultrafina de
Matrigel. Las células fueron colocadas en capas (3 x 10^{4}) en
cada pocillo y se dejaron crecer durante 2-3 días,
después de lo cual fueron expuestas al tratamiento experimental
deseado. Siguiendo esto, las células fueron enjuagadas en PBS y a
continuación en 200 ml de tampón de unión antes de la adición de
anexina V-FITC (AV) y de yoduro de propidio (PI)
bajo condiciones de iluminación difusa. Después de la incubación
durante 15 min las células fueron enjuagadas con tampón de unión y
se examinaron por microscopía de fluorescencia utilizando un
conjunto de filtros de excitación azul y verde (Zeiss Axiovert 10
con objetivos Fluar de inmersión en aceite). Utilizando esta
técnica, la células en apoptosis inicial se tiñen en verde debido a
que la anexina V conjugada con el FITC se une a la fosfatidilserina
que se ha reorientado en la cara externa de la membrana de la
célula (Fadok y col., 1992; Koopman y col., 1994;
Vermes y col., 1995; Homburgy col., 1995). Las
células muertas también muestran tinción roja con PI debido a que la
permeabilidad creciente de la membrana nuclear les permiten unirse
a los ácidos nucleicos. Se preparó la documentación fotográfica
utilizando una cámara Contax 167MT y película Kodak TMAX 400 film
para impresión en blanco y negro o Ektachrome 160T para reversión de
las imágenes en color.
Se midió la actividad del LDH utilizando ácido
pirúvico como substrato y monitorizando de forma
espectrofotométrica la formación de un derivado de fenilhidrazona a
partir de ácido láctico. Se sembraron células MDCK o
Calu-3 en placas de 12 pocillos y y crecieron hasta
confluencia. Se expusieron las monocapas de células a tratamientos
control o de 18 horas (EMEM libre de suero y rojo de fenol, con 0,6
mM de ditiotreitol en el caso del control para la fracción de
proteinasa de la cisteína) o las fracciones de proteinasa del HDM
diluidas en el mismo medio (con 0,6 mM de ditiotreitol presente en
la fracción de proteinasa de la cisteína). Al final del
experimento, se recogió el medio de incubación y se centrifugó a
temperatura ambiente para sedimentar cualquier célula que se hubiera
separado de los pocillos durante el tratamiento. Se ensayó la
primera fracción de sobrenadante directamente para determinar la
actividad LDH, mientras que el pellet formado por cualquiera de las
células separadas fue sometido a lisis hipotónica con agua
destilada (5 min a temperatura ambiente) antes de una breve
centrifugación para eliminar residuos celulares. A continuación se
ensayó el segundo sobrenadante resultante para determinar la
actividad LDH. Las células que habían permanecido adheridas a los
pocillos durante el tratamiento fueron lisiadas (rotas) tal como se
ha descrito anteriormente y se determinó la actividad LDH. Debido a
que no se produjo una disgregación significativa durante el
tratamiento con medio control, se definió la actividad LDH celular
total como la presente en el lisato de las células adherentes
tratadas con sólo EMEM libre de suero y de rojo de fenol.
Para estudiar los efectos de las proteinasas y de
los inhibidores de las conexiones intercelulares, se cultivaron
células MDCK en cubreobjetos y se trataron con la proteinasa y/o el
inhibidor apropiado para el periodo de tiempo deseado. Las células
se fijaron en metanol enfriado con hielo antes de la unión del
anti-ZO-1 de rata (mAb R40.76)
(Stevenson y col., 1986; Anderson y col., 1988) y la
anti-desmoplakin de ratón (mAb
11-5F) (Parrish y col., 1987). Se realizó
la tinción del anticuerpo por fluorescencia indirecta utilizando los
segundos anticuerpos conjugados con FITC y TRITC. Se realizó la
microscopía utilizando un microscopio Zeiss Axiovert con un
objetivo Fluar de inmersión en aceite de x 40 aumentos. Los
especímenes fueron iluminados utilizando conjuntos de filtros de
excitación y emisión para FITC y TRITC. Las células fueron
fotografiadas tal como se ha descrito anteriormente.
Todos los reactivos para los medios y los
cultivos celulares fueron obtenidos de ICN Biomedicals Ltd (Thame,
Oxfordshire), excepto cuando se establece algo diferente. El HBSS
se obtuvo de GibcoBRL, Life Technologies Ltd (Paisley). El manitol y
el Triton X- 100 se obtuvieron de Sigma-Aldrich Ltd
(Poole, Dorset) y el suero de vaca fetal inactivado por calor se
obtuvo de Labtech International Ltd (Uckfield, East Sussex). El
matrigel se obtuvo de Universal Biologicals, London. Las
determinaciones de la eliminación de manitol se hicieron en
Transwells de 12 mm de diámetro con uma membrana de tamaño de poro
de 0,4\mum y un espesor de membrana de 10\mum (Costar UK Ltd,
High Wycombe, Buckinghamshire). El
D-[^{14}C]-maitol se obtuvo de NEN Du Pont
Research Products (Stevenage, Hertfordshire), y el
Opti-Fluor de centelleo y los viales de centelleo
fueron de Canberra Packard Ltd (Pangbourne, Berkshire). Las células
MDCK se hicieron crecer de la reserva en nuestro laboratorio. Las
células Calu-3 fueron originalmente obtenidas de la
American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA) y expandidas
por paso en serie para crear un banco local de células
criopreservadas. Las células se cultivaron en frascos de cultivo de
células Falcon de 75 cm^{2} (Marathon Laboratory Supplies,
London,), placas de cultivo de tejidos multipocillos Costar o
insertos Transwell de acuerdo con la naturaleza del experimento. La
agarosa (grado molecular) se obtuvo de Promega (Southampton,
Hampshire). Los equipos de ensayo para la determinación del LDH se
obtuvieron de Sigma; los equipos de Apoalert se obtuvieron de
Cambridge Bioscience. El naranja de acridina, el bromuro de etidio y
todos los demás reactivos de laboratorio generales se obtuvieron de
BDH (Poole, Dorset). El compuesto E-64
(L-trans-epoxisuccinil-leucilamida-(4-guanidino)-butano,
un inhibidor de las proteinasas de la cisteína, se obtuvo de Sigma.
Las soluciones de almacenaje acuosas concentradas se almacenaron
congeladas hasta que se precisaron. El inhibidor de la proteinasa
serina clorhidrato del fluoruro de
4-(2-aminoetil)-bencenosulfonilo
(AEBSF) se obtuvo de Pentapharm, Basilea, Suiza. El inhibidor
BB-250 de la metaloproteinasa matriz (MMP)
([4-(N-hidroxiamino)-
2R-isobutil-3S-(tiofen-2-il-sulfonilometil)succinil]-L-fenilalanina-N-
metilamida) se obtuvo de British Biotech Pharmaceuticals Ltd. Todos
los inhibidores se prepararon como soluciones de reserva
concentradas en Me_{2}SO seco y se diluyeron según requerimientos
con medio para uso en los experimentos. Los controles apropiados
para el vehículo Me_{2}SO se incorporaron en los experimentos en
cuento se requirieron. El reactivo anticuerpo monoclonal R40.76
frente al ZO-1 fue generosamente proporcionado por
el Dr Bruce Stevenson, Universidad de Alberta. El anticuerpo 5H8
monoclonal Der p 1 fue un obsequio del Dr Martin Chapman,
Universidad de Virginia, USA.
Se separó el medio de consumo de ácaros en dos
fracciones por precipitación con sulfato amónico. La fracción
obtenida por precipitación con sulfato amónico al 50 % consistió en
las principales bandas de proteínas a \sim22kDa y 38kDa (Figura
1a, banda2). Los ensayos de degradación de enzima utilizando
substratos cromogénicos mostraron que la actividad catalítica del
50 % de precipitado era inhibida por el E-64 (no se
muestra). El análisis de la manchas de inmunotransferencia del 50 %
de precipitado utilizando mAb 5H8 aumentado frente al Der p 1
revelaron la presencia de una banda principal con una masa aparente
de \sim22kDa y una banda menor a 38kDa (Figura 1b, banda2). En
el análisis SDS-PAGE y de manchas de
inmunotransferencia la fracción de proteinasa de la cisteína se
comportó de forma idéntica al Der p 1 purificado por una
combinación de cromatografía de inmunoafinidad, filtración sobre
gel y focalización isoeléctrica (comparación de las bandas 1 y 2 en
los paneles a, b de la Figura 1). La comparación de las bandas 2 y
3 de la mancha por inmunotransferencia mostrada en la Figura 1b
demuestra que el 5H8 mAb también reacciona con un intervalo
adicional de proteínas presente en el precipitado del
50-80 % de sulfato amónico. En ausencia del agente
de reducción la fracción precipitada del 50-80 % de
sulfato amónico mostró una elevada actividad catalítica que fue
atenuada por inhibidores de las proteinasas de la serina arquetipal
(no mostrado). Por conveniencia, en este manuscrito el 50 % de
precipitado es referido de forma subsecuente como la fracción de
proteinasa de la cisteína y el precipitado del
50-80 % como la fracción de proteinasa de la
serina.
Bajo las condiciones de control utilizadas en
estos experimentos tanto las líneas celulares epiteliales MDCK y
como las Calu-3 forman monocapas compactas con
permeabilidades de manitol en el intervalo 0,7-1,2 x
10^{-6} cm s^{-1}. La exposición tanto de las monocapas de
células MDCK como Calu-3 a la fracción de proteinasa
de la serina produjo un cambio relacionado con la concentración en
la permeabilidad (Figura 2). La dependencia de la concentración de
la fracción de la proteinasa de la cisteína no fue valorada en estas
series particulares de experimentos, pero los efectos del alergeno
de la proteinasa de la cisteína pura Der p 1 ha sido previamente
demostrada por nosotros en modelos similares in vitro
(Herbert y col., 1990; 1995).
Los efectos de la fracción de la proteinasa de la
cisteína en las monocapas de las células MDCK fueron atenuadas por
el inhibidor de la proteinasa de la cisteína E-64
(Figura 3a). El E-64 no tuvo un efecto observable en
las propiedades de permeabilidad intrínseca de la monocapa de
células (Figura 3a). Los inhibidores de la proteinasa de la serina
AEBSF y, menos efectivamente, SBTI inhibieron ambos la acción de la
fracción de la proteinasa de la serina en células MDCK (Figura 3b).
Ningún inhibidor per se ejerció ningún efecto observable en la
permeabilidad epitelial (Figura 3b). Los inhibidores también fueron
efectivos cuando se ensayaron a la misma concentración en monocapas
de células Calu-3. Las monocapas de células
Calu-3 tratadas con la fracción de la proteinasa de
la cisteína tuvieron una permeabilidad al manitol de (8,44 \pm
0,43) x 10^{-6} cm s^{-1} que se redujo a (4,84 \pm 0,32) x
10^{-6} cm s^{-1} por el E-64 (P<0,05, n =
5). Las monocapas de células Calu-3 tratadas con
la fracción de la proteinasa de la serina tuvieron una permeabilidad
al manitol de (18, 1 \pm 0,02) x 10^{-6} cm s^{-1} que se
redujo a (10,20 \pm 0,01) 10^{-6} cm s^{-1}por AEBSF (p <
0,05, n = 5).
Los inhibidores de la proteinasa específicos de
clase sólo fueron efectivos frente a las fracciones de enzimas
análogas derivadas de los cultivos de HDM La Figura 4 muestra que
el AEBSF, a una concentración que anula los efectos de la fracción
de la proteinasa de la serina, fracasó en inhibir la acción de la
fracción de la proteinasa de la cisteína sobre las monocapas de las
células Calu-3. A la inversa, el
E-64 no inhibió el cambio de permeabilidad causado
por la fracción de la proteinasa de la serina (Figura 4).
La Figura 5 muestra que el tratamiento de las
monocapas de las células MDCK tanto con las fracciones de
proteinasa de la cisteína como de la serina produjeron una ruptura
del modelo de tinción periférica normalmente contigua de la
ZO-1 de la proteína TJ y de la tinción punteada de
desmoplaquina. La adición de E-64 ala fracción de
proteinasa de la cisteína o de AEBSF a la fracción de proteinasa de
la serina inhibió los cambios dependientes de la proteinasa (Figura
5).
La incubación control de las monocapas de células
MDCK o Calu-3 durante 18 h en EMEM libre de suero
produjo una liberación insignificante del LDH hasta que fueron
sometidas a lisis hipotónica al final del experimento (Figura 6). El
tratamiento de las monocapas de cualquier tipo de células con las
fracciones de proteinasa de la cisteína y la serina también fracasó
en liberar cantidades significativas de LDH en el medio de
incubación (Figura 6), a pesar del hecho de que algunas células se
separaron del substrato de la matriz durante el experimento. La
lisis de las células separadas y las células adherentes resultó en
la recuperación del equivalente del LDH en la cantidad que se
encontró en los lisatos de células no tratados (Figura 6).
También se estudió la muerte celular por examen
de la fragmentación de ADN y estudio del teñido de las células con
AV y PI. La Figura 7a,b muestra evidencia de la fragmentación del
ADN en células MDCK y Calu-3 después del tratamiento
con proteinasas de HDM bajo condiciones que dieron lugar a un
incremento de la permeabilidad de las monocapas epiteliales. Los
efectos de ambas fracciones de proteinasa del HDM fueron atenuadas
por la matriz del inhibidor de la metaloproteinasa
BB-250 (Figura 7b). El E-64 inhibió
los efectos de la fracción de la proteinasa de la cisteína, pero no
de la fracción de la proteinasa de la serina (Figura 7b). La Figura
7 también muestra el tratamiento de las células de MDCK o de
Calu-3 con la fracción de proteinasa de la serina
dio lugar a algunas células en las monocapas que se unen sólo a la
anexina V (AV^{+}PI^{-}), indicativo de apoptosis temprana en
estas células, y otras que se tiñieron con ambas anexinas V y PI
(AV^{+}PI^{+}) indicando muerte celular (ver Figura 7d,f,h,j).
La distribución espacial de las células tempranamente apoptóticas
AV^{+}PI^{-} y de las células muertas AV^{+}PI^{+} fue
agrupada alrededor de las regiones en las que se produjo una clara
rotura de la adhesión de células (eg ver Figura 7d,f).
Las proteínas del pellet fecal del HDM son una
causa principal de asma alérgica (Tovey y col., 1981) y en
gran parte refuerzan la prevalencia incrementada de la enfermedad
(Dowse y col., 1985). En este estudio hemos mostrado que las
proteinasas de los pellets fecales de D. pteronyssinus
ejercen efectos biológicos potentes en las células epiteliales.
Las proteinasas del HDM fueron fraccionadas por precipitación con
sulfato amónico en las clases de cisteína y serina. Ambos
precipitados tuvieron efectos similares en los sistemas
experimentales investigados. Produjeron un incremento en la
permeabilidad de las monocapas epiteliales, causaron rotura de la
adhesión celular lateral, y separaron células del substrato de la
biomatriz. La rotura y la separación de las células no estuvo
asociada con la gran liberación de LDH, pero se encontró evidencia
de apoptosis temprana y muerte celular directa con ruptura nuclear.
La inspección de las células teñidas con AV y PI reveló que la
tinción se localizó en áreas de rotura/separación de células.
Demostramos además que la muerte celular puede ser atenuada por los
inhibidores de la proteinasa.
La precipitación con sulfato amónico demostró ser
un medio efectivo de separar las clases principales de actividad de
la proteinasa en el consumo de los HDM del medio de cultivo. La
fracción precipitada por el sulfato amónico del 50 % tuvo actividad
de la proteinasa de la cisteína y su efecto de favorecer la
permeabilidad en las monocapas de células epiteliales fue inhibida
por el E-64 pero no por el inhibidor de la
proteinasa de la serina AEBSF. El análisis SDS-PAGE
y de inmunotransferencia de manchas con mAb 5H8 aumentado frente al
alergeno Der p 1 del HDM (una proteinasa de la cisteína) reveló la
presencia de bandas con masas moleculares aparentes de \sim22kDa
y \sim38kDa en esta fracción. En contraste, la fracción
precipitada por el sulfato amónico saturado del
50-80 % tuvo una actividad de la proteinasa de la
serina y sus efectos sobre las células epiteliales fueron inhibidos
por el AEBSF, y hasta un menor grado el SBTI, pero de ningún modo
por el E-64. Se concluye de los estudios con
inhibidores que hubo un arrastre del alergeno de la proteinasa de la
cisteína en esta fracción. El análisis de SDS-PAGE
y de inmunotransferencia por mancha reveló la presencia de varias
bandas de proteína en la fracción de proteinasa de la serina,
algunas de las cuales fueron reconocidas por el mAb 5H8 (ej
masas aparentes aproximadas 22, 26, 28, 29 y 38kDa). El mAb 5H8 es
ampliamente utilizado para purificar y cuantificar la Der p 1, pero
su especificidad ha sido recientemente puesta en cuestión (Cambra
& Berrens, 1996). De este modo, una observación incidental a
partir de nuestro estudio es causa para una adicional preocupación
respecto a la especificidad de este anticuerpo. Las bandas de
proteína detectadas en el precipitado de sulfato amónico del
50-80 % son consistentes con la presencia de los
alergenos de la proteinasa de la serina Der p 3, Der p 6 y Der p 9.
Sobre la base de estas observaciones sugerimos que el
fraccionamiento por sulfato amónico de los extractos del cultivo de
los HDM proporciona un medio simple y efectivo de estudiar los
efectos biológicos de los alergenos de la proteinasa de los HDM y
también para identificar nuevos inhibidores de sus efectos.
Hemos mostrado previamente que el alergeno Der p
1 altamente purificado induce un incremento en el flujo
transepitelial de albúmina en suero en la mucosa de las vías
aéreas, causa rotura de la arquitectura epitelial y separa las
células MDCK de los substratos de biopolímero natural (Herbert y
col., 1990; 1995). También demostramos que estos efectos del
Der p 1 fueron un resultado de su actividad de la proteinasa de la
cisteína debido a que fueron sensibles a la inhibición por
E-64, un inhibidor relativamente específico de la
mayor parte de las proteinasas de la cisteína (Barrett y
col., 1982; Shaw, 1994; Herbert y col., 1995).
Aunque las comparaciones de la secuencia de amino ácidos predice que
el Der p 1 es una proteinasa de la cisteína putativa (Chua y
col., 1988; 1993; Stewart, 1994; Topham y col., 1994;
Robinson y col., 1997), otros han sugerido que puede actuar
como una proteinasa bifuncional de la
cisteína-serina debido a que su actividad también ha
sido descrita por ser inhibida por el APMSF, un inhibidor de las
proteinasas de la serina (Hewitt y col., 1995, 1997). Si
fuera correcta, esta bifuncionalidad propuesta tendría
potencialmente implicaciones importantes para el diseño de
inhibidores específicos del Der p 1. Sin embargo, en el presente
estudio argumentamos contra la significación funcional de la
bifuncionalidad reivindicada mostrando que (i) la fracción de la
proteinasa de la cisteína derivada de los cultivos de HDM pueden no
ser inhibidos por las concentraciones de AEBSF que inhiben de forma
significativa la actividad de la fracción de la proteinasa de la
serina, y (ii) la fracción de la proteinasa de la serina que es
resistente a la inhibición por E-64 a
concentraciones a las que este inhibidor bloquea la actividad de la
proteinasa de la cisteína. Recientemente también ha sido presentada
otra evidencia contra el que el Der p I sea una proteinasa de la
serina-cisteína mezclada. (Chambers y col.,
1997).
La permselectividad del epitelio bronquial a los
solutos hidrofílicos está gobernada por TJs que son expresados de
forma circunferencial en el polo apical de cada célula
(Schneeberger & Lynch, 1992). La expresión contigua de las
proteínas TJ de una célula y de su oposición cercana con proteínas
TJ en células adyacentes se piensa que hace que el epitelio sea
capaz de desarrollar sus propiedades de rigidez (Anderson & Van
Itallie, 1995; Robinson, 1995). La rotura de la interacción de las
proteínas TJ entre células, por ejemplo por la formación de
discontinuidades en su localización periconexional, está asociada
con el fallo de las barreras epiteliales (Howarth y col.,
1994; Zhong y col., 1994; Stuart y col., 1994 Stuart
& Nigam, 1995). Ambas fracciones de proteinasa del HDM
utilizadas en este estudio causaron la rotura de los TJs tal como
se valoró por la pérdida de tinción periconexional del
ZO-1. También se observó rotura de las desmosomas.
La rotura de los TJs dio lugar a una permeabilidad incrementada de
las monocapas epiteliales, y eventualmente a que se produjera la
separación de las células del substrato. La pérdida de
ZO-1 del TJ y de la desmoplakin a partir de los
desmosomas fue dependiente de la actividad de la proteinasa exógena
debido a que el procedimiento fue atenuado por el
E-64 (en el caso de la fracción de la proteinasa de
la cisteína) y por el AEBSF (en el caso de la fracción de la
proteinasa de la serina). Aunque el ZO-1 y la
desmoplakin son proteínas intracelulares, y de este modo no es
probable que se degraden por las proteinasas exógenas, su rotura es
explicable como una consecuencia de la rotura del otro, expuesta a
la membrana, componente del TJ y de los desmosomas.. Se ha invocado
un mecanismo similar para conseguir cambios en otra proteínas
intracelulares siguiendo la rotura de los contactos intercelulares
(Volk y col., 1990).
Los efectos de las proteinasas no resultaron en
una liberación significativa del LDH por las células. Sin embargo,
el tratamiento con cualquiera de las fracciones de proteinasa dio
lugar a que algunas células mostraran signos de apoptosis temprana
(AV^{+}PI^{-}) o muerte celular directa (AV^{+}PI^{+}).
Las células pueden entrar apoptosis por mecanismos múltiples
(revisados en Hale y col., 1996) incluyendo cambios en la
adhesión de células homotípicas y heterotípicas y la unión a la
matriz de las células (Boudreau y col., 1995,1996; Mahida y
col., 1996; Frisch & Francis, 1994). Un suceso
señaladamente temprano en la muerte celular programada es la rotura
de las proteínas citoesqueléticas unidas a fosfolípidos que
conducen a la redistribución de la transmembrana de la
fosfatidilserina (Martin y col., 1995a,b). La estructura de
las proteínas citoesqueléticas es normalmente estabilizada y
restringida por la interacción directa con los componentes de
proteína de las conexiones intercelulares (Furuse y col.,
1994; Anderson & Van Itallie, 1995) que sugieren que la
proteolisis de las adhesiones intercelulares, especialmente el TJ,
pueden ser críticas incluso en orquestar la respuesta celular a los
alergenos de la proteinasa. La facilidad del E-64
para inhibir la acción de la fracción de la proteinasa de la
cisteína pero no de la serina sugiere que el E-64
actúa en una etapa próxima en el procedimiento conduciendo a
cambios de permeabilidad y apoptosis, más que por inhibición de una
etapa proteolítica distal en un mecanismo de transducción. Además,
las proteinasas señaladamente intracelulares de la familia de la
caspasa ICE/ced-3 que son activadas inter
alia por la unión Fas/APO-1 en la apoptosis (Los
y col., 1995; Mariani y col., 1995; Kayagaki y
col., 1995; Tanaka y col., 1996) tienen un perfil
inhibidor inususal por ser insensibles al E-64. Por
el contrario, la acción inhibitoria del BB- 250 puede tener lugar
mediante la prevención de la liberación del ligando Fas (Mariani y
col., 1995; Kayagaki y col., 1995).
La sensibilización del pulmón a los alergenos en
suspensión en el aire tales como el HDM es central a la patogénesis
del asma alérgico. El epitelio del pulmón forma una barrera que la
proteínas extrañas deben cruzar antes de que puedan causar
sensibilización alérgica, pero el mecanismo por el que los
alergenos cruzan la barrera epitelial es escasamente comprendido
(Robinson y col., 1997). La naturaleza enzimática de las
proteínas derivadas de los pellets fecales de los HDM proporciona
una explicación del mecanismo por el que los alergenos colisionan
con el sistema inmune. Debido a que causan rotura focal de las
conexiones rígidas, y finalmente la pérdida de una célula moribunda,
las proteinasas del HDM serían capaces de incrementar la permeación
paracelular de los alergenos a células que presentan antígenos. Es
de hacer notar que el trauma localizado y la muerte celular
producida por la rotura proteolítica de las conexiones
intercelulares también puede cumplir algunas condiciones del
"modelo de peligro" de la respuesta inmunológica adaptiva y
explicar de este modo por que se evocan las respuestas dirigidas al
anticuerpo (Matzinger, 1994; Ridge y col., 1996). Como
soporte adicional a este punto de vista, una evidencia reciente ha
sugerido que cuando se produce apoptosis (a menudo considerada como
una forma "silenciosa" inmunológicamente de la muerte celular)
en presencia de daño en el tejido, el estímulo combinado resultante
es realmente amenazante para las células que presentan antígeno
(Boockvar y col., 1994; Casciola-Rosen y
col., 1994; Ibrahim y col., 1996).
En resumen, estos resultados muestran que las
proteinasas de los HDM tienen efectos en las células epiteliales
los cuales probablemente favorecen la sensibilización alérgica. La
facilidad de los inhibidores específicos para interferir con las
respuestas celulares epiteliales a los alergenos de la proteinasa
proporcionan un racional para la prevención y/o tratamiento de las
condiciones alérgicas.
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\newpage
Fracciones del análisis SDS-PAGE
(panel a) y de inmunotransferencia de manchas (panel b) de las
fracciones de la proteinasa de los HDM. La equivalencia de las
bandas en el panel a es: Der p 1 purificado por inmunoafinidad (1);
fracción de la proteinasa de la cisteína de HDM (2) y fracción de
la proteinasa de la serina de los HDM (3). Las proteínas fueron
visualizadas por teñido con azul coomassie. El panel b muestra la
inmunotransferencia preparada a partir del gel en el panel a. Las
proteínas fueron detectadas utilizando mAb 5H8
(anti-Der p 1) y se visualizaron por la técnica
ECL. Es de señalar la detección de las proteínas inmunoreactivas
por mAb 5H8 en la fracción de proteinasa de la serina además de la
inmunoreactividad esperada de la fracción de proteinasa de la
cisteína. Los círculos llenos indican los estándares de calibración
de masa y las flechas indican masas moleculares aparentes de bandas
calculadas a partir de la movilidades de los estándares marcados con
tinte.
Las gráficas dilución-respuesta
muestran los efectos de 18 h de exposición de monocapas de células
a la fracción de proteinasa de la serina preparada a partir de
cultivos de los HDM. El panel (a) muestra la permeabilidad del
manitol de las células epiteliales MDCK bajo condiciones control
(EMEM solo, libre de suero) y después del tratamiento (fracción de
la proteinasa diluida en EMEM libre de suero). El panel (b)
representa estudios similares llevados a cabo en células
epiteliales bronquiales Calu-3. Los datos son
promedio \pm s.e. promedio en 4-6 experimentos.
La actividad del alergeno de la proteinasa (expresada en unidades
azocoll ml^{-1}) se indica por los números bajo las barras
rellenas. Los asteriscos indican las diferencias estadísticamente
significativas con respecto a la respuesta del control no tratado
(medio EMEM libre de suero) para cada célula tipo.
Inhibición de los efectos de las fracciones de la
proteinasa de los HDM sobre la permeabilidad del manitol en
monocapas de células MDCK. El panel (a) muestra los efectos del
E-64 (10\muM) sobre el efecto producido por la
fracción de proteinasa de la cisteína (80 unidades de azocoll
ml^{-1}). Las células control fueron expuestas a EMEM libre de
suero conteniendo 0,5 mM de glutationa reducida. El panel (b)
representa los efectos del AEBSF (100 \muM) sobre los efectos de
la fracción de proteinasa de la serina (127 unidades de azocoll
ml^{-1}). Los datos son el promedio \pm s.e. promedio en
3-5 experimentos. El tiempo de contacto fue de 18 h
en todos los casos. En ambos paneles (a) y (b) existen diferencias
estadísticamente significativas entre las permeabilidades de las
monocapas tratadas con proteínas y las del control y también entre
las monocapas tratadas con las proteinasas en presencia y ausencia
de inhibidores. Las comparaciones significativas se muestran en la
Figura por las líneas rotas e indican valores probables.
El panel (a) ilustra los efectos de 100 \muM de
AEBSF en los cambios en la permeabilidad del manitol evocados en
las monocapas de las células Calu-3 después de 18 h
de exposición a la fracción de proteinasa de la cisteína (80
unidades de azocoll ml^{-1}). Los datos son el promedio \pm
s.e. promedio in 3 experimentos. El panel (b) ilustra los efectos de
10 \muM de E-64 en los cambios en la
permeabilidad del manitol evocado en monocapas de células
Calu-3 después de 18 h de exposición a la fracción
de proteinasa de la serina (94 unidades de azocoll ml^{-1}). Los
datos son el promedio \pm s.e. promedio en 3 experimentos. En
ambos ejemplos, se trataron las células control con medio EMEM
solo, libre de suero (con 0,5 mM de glutationa reducida en el caso
de la fracción de proteinasa de la cisteína).
Inmunoteñido de la proteína ZO-1
del TJ (paneles a-e) y de la desmopakin proteína de
la placa desmosomal (paneles f-j) en monocapas de
células MDCK. Los paneles a,f muestran el inmunoteñido de las
células expuestas al EMEM libre de suero como control. El modelo de
inmunoteñido después del tratamiento con la fracción de la
proteinasa de la cisteína (80 unidades de azocoll ml^{-1}) se
muestra en los paneles b,g y la modificación de esta respuesta por
el E-64 (10\muM) en los paneles c,h. El modelo de
inmunoteñido después del tratamiento con la fracción de proteinasa
de la serina (94 unidades de azocoll ml^{-1}) se muestra en los
paneles d,i y la modificación de esta respuesta por el AEBSF
(100\muM) en los paneles e,j.
Determinación de la liberación de LDH después del
tratamiento de las células MDCK o Calu-3 con las
fracciones de proteinasa del HDM durante 18 h. El panel a muestra la
falta de liberación del LDH a partir de las células bajo
condiciones de control hasta que se sometió la monocapa a lisis
hipotónica. El panel a también muestra que el tratamiento con la
fracción de proteinasa de la cisteína (80 unidades de azocoll
ml^{-1} después de la activación con 0,5 mM de glutationa
reducida) no produjo ninguna liberación de LDH en el medio durante
el periodo de tratamiento. Es de señalar que todas las células
fueron separadas de los pocillos durante el tratamiento y que la
lisis hipotónica de las células separadas dio lugar a la
recuperación de la misma cantidad de actividad de LDH medida en las
células control. El panel b ilustra un experimento similar
utilizando la fracción de proteinasa de la serina (114 unidades de
azocoll ml^{-1}). Es de señalar que no todas las células fueron
eliminadas durante el periodo de tratamiento, pero que la suma de
la actividad del LDH en células adherentes lisiadas y células
separadas lisiadas corresponde a la cantidad detectada en células
control. Los paneles c y d muestran experimentos similares
realizados en células Calu-3. Es de señalar que
hubo una liberación de fondo pequeña de LDH desde estas células
(<10 % del LDH total celular) bajo condiciones de control y que
esto no se alteró de forma significativa por el tratamiento con
proteinasa. Los datos que se muestran son el promedio + s.e.
promedio en 4 experimentos.
Electroforesis del ADN en gel de agarosa (paneles
a,b) y tinción celular con AV y PI (paneles c-j)
después del tratamiento de las células MDCK y Calu-3
con fracciones de la proteinasa del HDM. El panel a muestra la
fragmentación del ADN inducida por proteinasa en las células MDCK.
Los significados para las bandas son: marcadores de ADN (1,10);
células no tratadas (2,3); células tratadas durante 18 h con
camfotecina 10\muM (control positivo) (4,5); células tratadas
durante 18 h con la fracción de proteinasa de la cisteína (114
unidades de azocoll ml^{-1}) (6,7) y células tratadas con la
fracción de proteinasa de la cisteína (80 unidades de azocoll
ml^{-1} después de la activación) durante 18 h (8,9). El panel b
muestra la fragmentación del ADN en células Calu-3.
El significado para las bandas es: marcadores de ADN (1,11);
células no tratadas (2); células tratadas para Xh con la fracción de
proteinasa de la serina (94 unidades de azocoll ml^{-1}) (3);
células tratadas con la fracción de proteinasa de la cisteína (80
unidades de azocoll ml^{-1} después de la activación) durante 18h
(4); células no tratadas en presencia de BB-250
(5\muM) (5); como banda 3, pero células tratadas en presencia de
5 \muM de BB-250 (6); como banda 4, pero células
tratadas en presencia de 5\muM de BB-250 (7);
células no tratadas en presencia de 10M de E- 64 (8); como la banda
3, pero células tratadas en presencia de 10\muM de
E-64 (9); como la banda 4, pero células tratadas en
presencia de 10\muM de E-64 (10). Los paneles
c-f muestran la microscopía de fluorescencia de AV y
PI (e,f) tiñiendo las monocapas de las células
Calu-3 bajo condiciones control (c,e) y siguiendo el
tratamiento durante 18h con la fracción de proteinasa de la serina
(135 unidades de azocoll ml^{-1}) (d,f). Los paneles c,d muestran
el modelo de tinción bajo excitación por luz azul y los e,f lo
muestran bajo excitación de luz verde. Los paneles
g-j muestran ejemplos a partir de monocapas de
células MDCK con la misma disposición que los paneles
c-f. En ambos tipos de células, es de señalar la
ausencia virtual de tinción del AV y PI en células no tratadas. En
los paneles d,f el modelo de tinción circumscribe de forma parcial
un área de separación de células en la monocapa y señala que
algunas células muestran tanto la tinción AV como la PI. En los
paneles h,j la mayoría de las células teñidas es positiva tanto para
el AV como para el PI y se fue evidente la separación de células
del substrato.
Claims (6)
1. El uso de un inhibidor de la actividad de la
proteinasa de la cisteína conjuntamente con un inhibidor de la
actividad de la proteinasa de la serina para la fabricación de un
medicamento para la prevención o el tratamiento de un estado en el
que un alergeno atraviesa una barrera epitelial.
2. El uso, de acuerdo con la reivindicación 1, en
el que el estado alérgico es asma.
3. El uso, de acuerdo con la reivindicación 1, en
el que el estado alérgico es un estado alérgico seleccionado entre
rinitis, conjuntivitis alérgica, dermatitis atópica o alergias de
la comida.
4. El uso, de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que el inhibidor de la proteinasa de
la serina inhibe la actividad de cualquier proteinasa de la serina
diferente de la tripsina.
5. El uso, de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que el inhibidor de la actividad de
la proteinasa de la serina es un inhibidor de la actividad del
alergeno de la proteinasa de la serina.
6. El uso, de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que el inhibidor de la actividad de
la proteinasa de la serina es un inhibidor de la actividad de la
proteinasa de la serina Der p3, Der p6 or Der p9.
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