WO2022107054A1 - Inhibidores de la enzima adam17 y composiciones que los comprenden para el tratamiento efectivo de la covid-19 - Google Patents

Inhibidores de la enzima adam17 y composiciones que los comprenden para el tratamiento efectivo de la covid-19 Download PDF

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WO2022107054A1
WO2022107054A1 PCT/IB2021/060729 IB2021060729W WO2022107054A1 WO 2022107054 A1 WO2022107054 A1 WO 2022107054A1 IB 2021060729 W IB2021060729 W IB 2021060729W WO 2022107054 A1 WO2022107054 A1 WO 2022107054A1
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compound
formula
enzyme inhibitor
adam17
inhibitor compound
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PCT/IB2021/060729
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Inventor
Michael Schnoor
Juan Salvador VALLE REYES
Nathaniel LARTEY LARTEY
Hilda VARGAS ROBLES
Eduardo Manuel VADILLO ROSADO
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Centro De Investigación Y De Estudios Avanzados Del Instituto Politécnico Nacional
Instituto Mexicano Del Seguro Social
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/54—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one sulfur as the ring hetero atoms, e.g. sulthiame
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses

Definitions

  • the invention relates to compounds for the treatment of lung diseases, particularly to compounds that inhibit the ADAM17 enzyme, which make it possible to treat COVID-19 (Corona Virus Disease-19) and severe acute respiratory syndrome (SARS) that occurs in diseases caused by viruses of the SARS-CoV family, particularly the severe acute respiratory syndrome caused by the SARS-CoV-2 virus, which causes COVID-19.
  • COVID-19 Corona Virus Disease-19
  • SARS severe acute respiratory syndrome
  • COVID-19 is an emerging disease caused by the coronavirus SARS-CoV-2 that is characterized in its severe form by developing symptoms of an acute respiratory disease that rapidly leads to severe acute respiratory syndrome (SARS, for its acronym in English, Severe Acute Respiratory Syndrome), acute respiratory failure, pulmonary edema, sepsis, and multiorgan failure, which can lead to death (Chen, et.al., 2020).
  • the SARS-CoV-2 virus belongs to the coronaviridae family, which are single-stranded RNA (ssRNA) enveloped viruses (Jin, et.al., 2020). Although the mechanism by which the SARS-CoV-2 viral RNA is recognized by the human immune system has not yet been demonstrated, it is already known that some of the viral components are highly immunogenic when recognized by receptors that recognize patterns. (PRRs) among which are the toll-like receptors (TLRs) (Vadillo, et.al., 2012).
  • PRRs single-stranded RNA
  • TLRs toll-like receptors
  • the viral ssRNA can be recognized in endosomes by the toll-like receptor 7 (TLR-7), while the double-stranded RNA (dsRNA), which is an intermediate that the virus generates during its replication, it can also be recognized in endosomes by the toll-like receptor 3 (TLR3) (Deng, et.al., 2017).
  • TLR-7 toll-like receptor 7
  • dsRNA double-stranded RNA
  • TLR3 toll-like receptor 3
  • S protein Spike protein of some coronaviruses is recognized by TLR4.
  • cytokines such as interleukins (IL) IL-ip, IL-6, IL-8, IL-12, TNFa, in addition to the different types of interferon (IFNa/0 and IFNy) (Vadillo, et al., 2012).
  • IL interleukins
  • IFNa/0 and IFNy interferon
  • the high production of all these proinflammatory cytokines can generate a hyperinflammatory state that is characteristic of viral infections that can cause acute lung damage and its complications.
  • Rajagopal (Rajagopal, 2020) describes substituted 9-anilinoacridine chalcone compounds (la-z) determined by docking and that show affinity to different protein residues of constitutive molecules of the virus, which could be potential inhibitors of COVID-19.
  • Siddhartha (Siddhartha, 2020) describes the use of Camellia sinensis infusions, (L.) O. Kuntze for the treatment of COVID-19.
  • Ramu et al. (Ramu, et.al., 2020) describe the use of small molecules with antiviral activity for the treatment of COVID-19.
  • Baker et al. (Baker, et.al., 2020) describe antiseptic quaternary ammonium compounds such as ammonium chloride, ceti I pyridinium, and miramistin as therapeutic agents for SARS-CoV-2.
  • Shaker et al. (Shaker, et.al., 2020) describe potential inhibitory molecules of SARS-CoV-2 related to the main protease Mpro of the virus.
  • Gupta et al. (Gupta, et.al., 2020) describe the use of the main protease Mpro of the SARS-CoV-2 virus as a therapeutic target to detect promising compounds that show affinity to it, among which dihydroergotamine, midostaurin, ziprasidone are mentioned , etoposide, apixaban, fluorescein, tadalafil, rolapitant and pa I bocicl i b.
  • Mahmoud et al. (Mahmoud, et.al., 2020) describe formazan nanoanalogues, which show affinity with the 3CLpro protease of SARS-CoV-2, which show promise for the treatment of COVID-19.
  • Ghosh et al. (Ghosh, et.al., 2020) describe Justicia adhatoda alkaloids as potent inhibitors of the main protease of SARS-CoV-2, of which only anisotine had an interaction with the His41 and Cysl45 catalytic sites of Mpro.
  • Ghahremanpour et al. (Ghahremanpour, et.al, 2020) describe compounds with different affinities to the main protease Mpro of SARS-CoV-2 as potential therapeutic agents for COVID-19 since they reduce the enzymatic activity of said protease, such as manidipine, boceprevir, lercanidipine, bedaquiline and efonidipine.
  • Ebada et al. (Ebada, et.al., 2020) describe the potential use of chrisosplenetin as an inhibitor of the SARS-CoV-2 protease Mpro for the treatment of COVID-19.
  • the above compounds are directed at structural components of the virus, which does not in itself constitute an effective treatment against SARS, a pathological condition that has already been caused by viral infection, being that this condition is one of the most common causes. important causes of death in patients with a severe state of the disease.
  • FIG. 1 The appearance of new daily confirmed cases of COVID-19 (average of 7 days) is shown, showing A) the evolution of the outbreak in the 10 most affected countries today, and B) the evolution of the outbreak in Mexico. Retrieved from public data from Johns Hopkins University, Coronavirus Resource Center, https://coronavirus.jhu.edu/data/new-cases.
  • ADAM17 inhibition reduces ICAM-1 mRNA levels in lung tissue affected by Polil:C /RBD-spike SARS-CoV-2.
  • the present invention provides an effective solution for COVID-19 and severe acute respiratory syndrome (SARS) that occurs as a consequence of the infection caused by the SARS-CoV-2 virus, which has become the main cause of death. by COVID-19.
  • SARS severe acute respiratory syndrome
  • the present invention provides the novel use of ADAM17 enzyme inhibitor compounds and compositions comprising them, as compounds with therapeutic effect for the effective treatment of COVID-19 and severe acute respiratory syndrome (SARS), exerting their therapeutic action by reducing and/or significantly eliminate the symptoms and pathological condition associated with said syndrome, thus allowing the restoration of the patient's normal condition.
  • SARS severe acute respiratory syndrome
  • the present invention constitutes an effective solution for the treatment of COVID-19, even in its most serious stages, since it allows stopping the process that leads to the appearance of SARS as a consequence of infection by the SARS-CoV virus. -2, thereby preventing COVID-19 from progressing to severe disease states, constituting the present invention so far as an effective measure for the treatment of the disease, regardless of whether the virus is still present in the patient at the same time .
  • SARS is characterized by the high vascular permeability that occurs in said pathology, which results in pulmonary edema, severe arterial hypoxia, and hypercapnia (increase in the partial pressure of CO2).
  • the chances of survival to this syndrome depend on the severity of lung damage, the extent of damage to other organs, the comorbidities that the patient presents and the quality of medical care (Matthay, et.al., 2012).
  • the central axes in the pathogenesis of SARS are excessive inflammation, accumulation of leukocytes and thrombocytes in the lungs, activation of the coagulation cascade, and increased permeability of the endothelial and epithelial barrier.
  • the increase in vascular permeability is due to the increase in the production of proinflammatory cytokines and this occurs due to the disturbance of the adherens junctions between endothelial cells in the lung.
  • the increased permeability of the endothelial and epithelial barriers in the lung also induces the migration of neutrophils and platelets that are responsible for the innate immune response and healing of damaged tissue, respectively. Excessive recruitment of neutrophils to this organ can be counterproductive due to than activated neutrophils, can also damage inflamed tissues during the course of acute infection (Matthay, et.al., 2012).
  • ACE-2 angiotensin-converting enzyme 2
  • This enzyme cleaves angiotensin into Ang(l-9) and Ang(l-7), which are known to protect against increased permeability and excessive inflammation in the lung (Gheblawi, et.al., 2020).
  • ACE-2 angiotensin-converting enzyme 2
  • Ang(l-7) angiotensin-converting enzyme 2
  • this enzyme is essential for the prevention of acute lung damage in response to SARS-CoV-2.
  • coronavirus infection causes a decrease in the expression of ACE2 (Kuba, et.al., 2005), a mechanism that triggers SARS;
  • ACE2 Kuba, et.al., 2005
  • ADAM17 metalloprotease disintegrase 17
  • ADAM17 metalloprotease disintegrase 17
  • the main complication during viral infection is precisely pulmonary involvement in 88% of cases, where the complications associated with this state are pneumonia (78% of cases) and respiratory failure (54% of cases). There are other causes of death such as shock, respiratory distress and pulmonary edema, as well as cardiac complications that are less frequent in older age groups. Likewise, 72% of patients who have died from COVID-19 had comorbidities such as hypertension, diabetes, obesity, and neoplasms (Grippo, et.al., 2020; Huang, et.al., 2020).
  • the acute lung damage caused by the infection is the main complication that leads the seriously ill patient to be hospitalized with unfavorable outcomes (Pi ⁇ a-Sanchez, et.al., 2020).
  • the treatment and/or prevention of acute lung damage is critical in patients with the severe form of COVID-19.
  • the present invention proposes evaluating the ADAM17 enzyme as a therapeutic target for the treatment of COVID-19, since this enzyme is found in the membrane of most of the cells that make up the pulmonary epithelium and has been shown to cleave to ACE2, the receptor that SARS-CoV-2 uses to internalize itself. However, not only does it have this function, but it also has a fundamental role in maintaining the lung barrier and preventing acute lung disease. Although the cleavage of ACE-2 by the enzyme ADAM17 in SARS-CoV-1 coronavirus infection has been described (Heurich, et.al., 2014), the role of ADAM17 has not been studied in the context of lung inflammation caused by SARS-CoV-1 or SARS-CoV-2.
  • SARS-CoV-2 is capable of promoting the cleavage of ACE-2 due to the activation of the enzyme ADAM17; this could lead to the loss of the anti-inflammatory effect of the signaling that ACE-2 induces in COVID-19. Furthermore, it is not known whether such a mechanism contributes in high-risk subjects to developing more severe states of COVID-19.
  • the present invention proposes that the cleavage of ACE2 and the consequent loss of signaling due to the effect of the ADAM17 enzyme during SARS-CoV-2 infection is responsible for the loss of lung function observed in the COVID-19.
  • the present invention provides compounds that inhibit the ADAM17 enzyme, which are very effective in inhibiting the function of said enzyme, which is apparently activated by infection with the SARS-CoV-2 virus, so that the ACE-2 protein is not is affected, thus preserving its function in contributing to the integrity and protection of the pulmonary epithelium, which is obviously affected by the disease.
  • any compound that has the ability to inhibit ADAM17 enzyme activity is useful to provide the therapeutic effect described in the present invention, such as the pyridone derivative compounds described by Hirata et al. (Hirata, et.al., 2016), the compounds described by Fukui et al. (Fukui, et.al., 2008), the compound GW280264X
  • the SARS-CoV-2 virus that causes the COVID-19 pandemic uses the ACE2 enzyme to internalize itself, however, this enzyme is more than a receptor for the virus.
  • ACE2 degrades angiotensinogen into Ang (1-7) and Ang (1-9), thus promoting vasodilation, vascular protection and thus limiting the formation of edema and fibrosis (Clarke, et.al., 2012).
  • ACE2 In the process of viral invasion by SARS-CoV-2, ACE2 is internalized together with the virus and is degraded, which decreases its anti-inflammatory activity, in addition, the presence of ACE2 in the membrane depends on the activity of ADAM17 (Gheblawi M, Wang K, Viveiros A., et.al, 2020; Zipeto, et.al., 2020).
  • ADAM17 During infection by the SARS-Cov2 virus, ADAM17 is activated to increase the production of TNF-a and as a side effect it cleaves ACE2, culminating in SARS, which represents the main cause of death of infected patients (Xu, et al. .al., 2020).
  • lymphopenia accompanied by neutrophilia, typical characteristics described during SARS-Cov-2 infection in patients (Henry, et.al., 2020).
  • ADAM17 inhibitors described in the present invention we found that in peripheral blood, the number of neutrophils tended to decrease significantly, while the number of lymphocytes tended to increase (Figure 5).
  • the ADAM17 inhibitors were administered intraperitoneally, generating a systemic effect of said inhibitors.
  • the observed effects of the present invention are very important for its clinical application, since for the treatment of COVID-19 an immediate local effect is sought by non-invasive route, such as the intranasal route, which also improves the bioavailability of inhibitors at the affected site.
  • apratastat it was decided to carry out an intranasal administration of apratastat, where we found a behavior very similar to the intraperitoneal route, observing the decrease in the recruitment of neutrophils and lymphocytes in the lungs ( Figure 6A and 6B) and in the BAL ( Figure 6). ).
  • intranasal administration of apratastat tends to decrease ICAM-1 expression (FIG. 7B), contributing to a decrease in leukocyte recruitment.
  • the present invention shows the enzyme ADAM17 as a very attractive therapeutic target for the treatment of severe acute respiratory syndrome (SARS) that occurs in patients with COVID-19, since it partly limits the production of TNF-a and contributes to the permanence of ACE2 in the membrane, having a dual effect to limit pulmonary inflammation.
  • SARS severe acute respiratory syndrome
  • the pharmaceutically acceptable salts of the compounds mentioned above can also be used to produce the same effects described here, thus falling within the scope of the present invention.
  • mixtures of the above compounds and their pharmaceutically acceptable salts are included for the purpose of enhancing their effect or making them more compatible for administration.
  • the object of the invention is to provide pharmaceutical compositions comprising ADAM17 inhibitors together with pharmaceutically acceptable excipients and suitable for administration to the patient who requires it.
  • An embodiment of the invention is the adaptation of the active ingredients to be used in pharmaceutical compositions for enteral, parenteral administration and topical use, including inhalation. The effective doses for the patient of the active ingredient will also be adjusted in accordance with preclinical and clinical studies, but based on the findings of the present invention.
  • Examples of pharmaceutically acceptable excipients that accompany the active ingredient of the invention are, for example, for oral administration as tablets, agents that include, for example, diluents, binders, stabilizers, bulking agents, thickening agents, such as povidone, cellulose microcrystalline, lactose, etc., disintegrating agents such as cross-linked carboxymethylcellulose, surfactants such as sodium lauryl sulfate, lubricating or slip agents such as magnesium stearate, colloidal silicon dioxide, etc., where said excipients can be formulated for preferably slow or prolonged release for a systemic effect.
  • Solutions for intravenous or intraperitoneal administration of the active ingredient can be prepared first dissolved in an organic solvent such as DMSO, ethanol, or dimethylformamide and subsequently in aqueous buffers, such as PBS.
  • organic solvent such as DMSO, ethanol, or dimethylformamide
  • compositions designed for localized administration to the place where the most severe form of the disease occurs, such as SARS, for example, where liquid or solid compositions can be formulated, suitable for local administration, for example, and whose excipients can be selected, for example, from components compatible with said pharmaceutical form, for example of a lipid or peptidic nature, or peptidomimetics, known in the state of the art as non-immunogenic, and which can preferably be bound to the active ingredients of the invention to improve its bioavailability; blowing agents such as propane, butane, or permissible chlorofluorocarbons; pH regulators such as sulfuric acid; chelating agents such as EDTA.
  • the active ingredients can also be formed into micronized particles contained in gelatin capsules or in other systems known in the technical field, which help to release the active ingredient to its target site of action, for example, through solid pharmaceutical forms such as tablets or dragees. , including those formulated for sustained release.
  • compositions described herein may be obtained by combining ADAM17 inhibitors with pharmaceutically compatible carriers known in the art, in the corresponding amounts and/or concentrations as described herein, and may include compounds known in the art. art to obtain said compositions.
  • administration of such compositions may be done depending on the patient's conditions, which will determine the doses and frequency of administration necessary to achieve an effective treatment of the condition in each particular case.
  • the invention provides pharmaceutical compositions comprising ADAM17 inhibitors suitable for nasal administration.
  • compositions suitable for nasal administration include, but are not limited to, aqueous solutions, ointments, and gels.
  • a composition suitable for topical nasal administration can be in the form of an ointment or gel, in the form of a nasal spray to be potentially administered by means of an aerosol administration mechanism, for example, through through inhaler devices known in the art, or in the form of aqueous solutions to be administered by drops.
  • an aerosol administration mechanism for example, through through inhaler devices known in the art, or in the form of aqueous solutions to be administered by drops.
  • ADAM17 inhibitors and compositions comprising them are administered to the nasal mucous membrane of the patient. affected by COVID-19.
  • any method known in the art can be used for the administration of said active ingredients to the nasal mucous membrane, where said active ingredients are preferably administered via the nasal route through drops or aerosols, which allows them to reach their site. action quickly and efficiently.
  • aqueous solutions comprising inhibitors of ADAM17 can be administered to the patient affected by COVID-19 by applying drops to the nasal cavity through the nostrils.
  • said aqueous solutions can be administered to the patient affected by COVID-19 through nasal application aerosols or by an aerosol administration mechanism through devices known in the art for this purpose, so that the aqueous solution comprising inhibitors of ADAM17 is sprayed into the respiratory tissue in a single or multiple ways, as needed by the patient.
  • the pharmaceutical compositions described herein in gel or ointment form can be administered nasally by topical application to one or more mucous membranes of the nasal cavity, as well as upper and lower respiratory tissues, including lung tissue.
  • the present invention comprises the nasal or intranasal administration of the compositions described herein.
  • the benefits of said administration include the precise delivery of the active ingredients to the target site of action, in this case the respiratory and lung tissue, a substantial increase in covering a greater surface of superficial tissue in the application, shorter nebulization times, reduction of systemic toxicity and accumulation of a higher concentration of drugs at the target site.
  • Therapeutic amounts of ADAM17 inhibitors can be rapidly delivered to respiratory tissue using nebulizers of various types, such as ultrasonic.
  • a greater portion of the dose administered by this route can be deposited very efficiently in the lung if necessary.
  • ADAM17 inhibitors are one of the modalities of the present invention, where said route of administration provides obvious benefits in that a greater load of said active ingredients can be administered if necessary, avoiding with this, the use of excipients and solvents that could hinder said administration by this route (for example, co-solvents and/or high-density solubilizers, extreme pH's, etc.), and using liquid and/or aqueous formulations that facilitate its administration.
  • excipients and solvents for example, co-solvents and/or high-density solubilizers, extreme pH's, etc.
  • liquid and/or aqueous formulations that facilitate its administration.
  • conventional devices known in the art such as hypodermic needles that allow intravenous, intramuscular and/or subcutaneous administration.
  • the present invention also includes methods of treating COVID-19 and severe acute respiratory syndrome (SARS) that comprise administering to the patient in need, ADAM17 inhibitors or compositions that comprise them in adequate concentrations that provide the desired therapeutic effect as required. described herein and with the corresponding dosage frequency and therapeutic regimen, either orally, parenterally, nasally and/or topically, although parenteral and nasal administration are preferred.
  • said inhibitors and the compositions that comprise them can be administered to the patient who requires it for the time and frequency that is necessary until the disappearance of the typical symptoms of the disease or pathological condition, which may imply the recovery of the patient's normal condition.
  • an effective treatment and dosage regimen applied to a patient may also depend on the patient's age, gender, height, weight, previous health status, etc., therefore, considering said factors as well as the practices known in the art for this, the adequate dosage regimen for each case will be easily determined, as well as the amount for the administration of the ADAM17 inhibitors and the compositions that comprise them, with in order to achieve the desired therapeutic result for the patient in need of treatment.
  • the described ADAM17 inhibitors can be administered in doses that are adequate to exert their therapeutic effects in patients affected by COVID-19, where the concentration in which they are administered comprises a range of 1 to 20 mg/Kg of weight, preferably 10 to 20 mg/Kg of weight, which can be administered peritoneally and nasally.
  • the peritoneal administration of ADAM17 inhibitors in patients affected by COVID-19 could also have a beneficial protective effect in those organs that have been affected by the infection, both in active infection and in patients with have recovered from said infection and who report damage to said organs, such as the heart, esophagus, gastrointestinal tract, central and peripheral nervous system, liver, kidney, bladder, microvascular system (Dariya, et.al., 2020; Iwasaki, et.al., 2020), in which the ACE2 protein also exists and where it is highly feasible that the effect caused by viral infection by enhancing the activity of ADAM17 to cleave ACE2 that occurs in respiratory tissue and lung tissue, is very similar in the organs that are affected.
  • organs such as the heart, esophagus, gastrointestinal tract, central and peripheral nervous system, liver, kidney, bladder, microvascular system (Dariya, et.al., 2020; Iwasaki, et.al., 2020)
  • ADAM17 inhibitors in patients affected by COVID-19 could supplement the treatment initially administered nasally and/or intranasally, providing protection in the aforementioned organs that could be at risk. by viral infection.
  • an animal model is provided in mice that reproduces the pathology caused by the SARS-CoV-2 virus at levels of severe evolution of the disease when SARS appears and develops, which then allows counting with an animal model that does not represent a potential danger of contagion by the SARS-CoV-2 virus since the complete virus is not used to obtain it, so said model can be used under normal laboratory conditions without the need for systems and/or biosafety levels.
  • effects of affectation very similar to those observed in patients with COVID-19 are observed, for example, neutrophilia and leukopenia, high concentrations of ICAM-1, both in peripheral blood and in lung tissue, as well as progressive destruction of lung tissue due to infection.
  • the animal model for COVID-19 in its SARS development phase can be obtained by administering to the animal intratracheally a composition comprising Poly l:C and the RBD fragment of the Spike protein of the SARS-virus. CoV2 (RBD-spike) with SEQ.ID.No. 1, where said components are added in a proportion of 10 mg/kg of Poly l:C and 15 pg of the RBD fragment of the Spike protein of the SARS-CoV2 virus (RBD-spike), where with said treatment the animals develop SARS in the same way as it is observed in patients with COVID-19.
  • a composition comprising Poly l:C and the RBD fragment of the Spike protein of the SARS-virus. CoV2 (RBD-spike) with SEQ.ID.No. 1, where said components are added in a proportion of 10 mg/kg of Poly l:C and 15 pg of the RBD fragment of the Spike protein of the SARS-CoV2 virus (RBD-spike), where with said treatment the animals
  • this animal model allows studying the effects of various drugs for the treatment of COVID-19, which represents an important advance in the study of this disease and its treatment.
  • this animal model allowed us to evaluate the potential of ADAM17 inhibitors as effective therapeutic active ingredients for the treatment of COVID-19 and SARS.
  • the animal model developed in the present invention uses only a fragment of 22 amino acids (RBD domain) of the Spike protein of the SARS-CoV-2 virus (EGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGY; SEQ.ID.No.l), which turns out to be sufficient to generate SARS in animals, with which, by means of the present invention, it is verified that said protein fragment is directly responsible for the effects caused by the SARS-CoV2 virus during the development of COVID-19, as well as in the evolution and development of severe acute respiratory syndrome (SARS).
  • RBD domain 22 amino acids
  • SARS-CoV-2 virus EGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGY
  • SEQ.ID.No.l SEQ.ID.No.l
  • One of the direct and obvious benefits that the present invention provides to the health system, apart from providing an effective treatment for COVID-19, is related to reducing the time spent in hospitals to the minimum essential, which has been observed so far as a result of the COVID-19 pandemic.
  • SARS-CoV-2 virus in stages where there is a high transmission of the SARS-CoV-2 virus, there is also a significant increase in the number of patients admitted to the hospital in a serious condition due to SARS caused by COVID-19 and who need a respirator, which has caused saturation on many occasions of the health care system in various countries.
  • respirators as a treatment for patients affected by COVID-19 unfortunately does not guarantee the restoration of their health status, which places these patients in a situation of high risk of losing their lives.
  • the treatment of patients with COVID-19 who may even progress to more severe states of the disease such as SARS would have a more effective possibility of treatment, since ADAM17 inhibitors act in such a way that they can reverse the effect caused by the SARS-CoV2 virus in these stages.
  • the present invention acquires great relevance, since it is configured as a viable option for the treatment of patients affected by COVID-19 in whom the survival expectancy is low due to the lack of effective treatments to combat the disease. disease in any of its stages, including those that evolve to more serious states such as SARS.
  • ACE-2 protein is a highly expressed enzyme on the apical side of alveolar epithelial cells and pulmonary endothelial cells, which is responsible for cleaving the hormone angiotensin into Ang(1-9) and Ang(1-7), hormones that protect epithelial and endothelial cells from hyperpermeability and excessive inflammation in the lung (Gheblawi, et.al., 2020). Therefore, the presence of ACE-2 is essential for the prevention of lung damage in response to coronavirus infection. However, such infection causes a downregulation of ACE2 (Kuba, et.al., 2005), a mechanism that triggers SARS.
  • ADAM17 disintegrin and metalloprotease 17
  • the inhibition of the ADAM17 enzyme by inhibitors such as apratastat or TMI-1 prevents the elimination of ACE2, thus preserving the anti-inflammatory signaling characteristic of the ACE2 protein in COVID-19.
  • Various compounds that inhibit ADAM proteins are described in the state of the art, such as, for example, TMI-1, TMI-2, TMI-005 (apratastat), GM6001, GW9471 and TAPI-2 (Moss, et.al., 2007 ; Mezil, et.al., 2012; Zhang, Hegen, et.al., 2004; Gijbels, et.al., 1994; Moss, et.al., 1997; Black, et.al., 1997), where The compounds of the TMI family are described as blockers of ADAM17, however some of them have certain non-specificity, so their use is still being studied.
  • TMI-1 and TMI-005 have shown therapeutic potential as inhibitors of ADAM17 (Zhang, et.al., 2004), with much lower adverse effects compared to non-selective ones, and these compounds still continue to be proven as therapeutic active ingredients for the treatment of cancer, arthritis or dermatitis (Moss, et.al., 2007; Zhang, et.al., 2004); In this sense and in one of the modalities of the invention, although for purposes of the present invention compounds that inhibit the activity of the ADAM17 enzyme can be used, those compounds with greater specificity and selectivity for the ADAM17 enzyme and that show inhibitory activity are preferred. for the same, such as for example aprastatat (TMI-005) and TMI-1.
  • the present invention comprises compositions that contain ADAM17 enzyme inhibitors for use in the treatment of COVID-19, including situations where COVID-19 evolves to more serious stages, such as SARS, for example.
  • said compositions may comprise substances capable of inhibiting the enzymatic activity of ADAM17, it is preferred to use specific inhibitors for said enzyme, such as, for example, aprastatat (TMI-005), TMI-1, and combinations thereof.
  • compositions described are available in such a way that they can be administered parenterally or intranasally, for example through the use of aerosols, in the same way as other active ingredients directed at the respiratory tissue, which they exert their activity directly on their site of action in an almost direct way.
  • the invention comprises the administration of the compositions described through the intranasal route, which allows their active ingredients to arrive more efficiently and in much less time than with parenteral administration, which is also possible.
  • the intranasal application of the ADAM17 inhibitors described here generates protective effects that are very similar to when they are applied parenterally, generating an efficient local effect in the affected lung tissue and an applicable route that turns out to be highly effective in patients affected by COVID-19, where said intranasal administration can be carried out, for example, through inhaler devices known in the art and already available on the market.
  • the present invention provides strong evidence that the ADAM17 inhibitors described here work efficiently for the treatment of COVID-19 by different routes of application, where, as well as the administration of these by parenteral route, its intranasal administration generates a normalizing effect on the number of neutrophils in the blood of the treated animals, this being clear evidence that the ADAM17 inhibitors described here provide a positive systemic protective effect on lung tissue in patients affected by COVID -19.
  • mice were anesthetized by administering intraperitoneally 200 mg/kg of ketamine (Anesket, PISA, Mexico) and 10 mg/kg of xylazine (Procin, PISA, Mex); the tracheas were surgically exposed by making a 1 cm incision in the animal's skin. Subsequently, a sterile 31G needle was carefully inserted for the administration of a solution of 10 mg/kg of Poly l:C (Invivogen, San Diego)/15 pg of the RBD fragment of the Spike protein of the SARS-CoV2 virus (RBD-spike).
  • mice were treated with endotoxin-free physiological saline solution, followed by 100 pL of air, for the distribution of said solution in the lungs.
  • the control was carried out in mice managed in the same way, but administering only physiological saline solution. Subsequently, the wounds were sutured and the mice were allowed to recover in cages. The lungs of the mice under test were harvested after 24 h to analyze the inflammation caused by the Poly l:C solution / RBD-spike fragment SARS-CoV-2.
  • ADAM17 inhibitors The ADAM17 inhibitors, Apratastat and TMI-1 (Sigma Aldrich/Merck, Missouri), were administered intraperitoneally 4 hours after surgery, where a concentration of 10 mg/kg was used in both cases (Ford, et. al., 2013; Zhang, et.al., 2004).
  • Apratastat was administered at 4 h and 18 h after surgery, while TMI-1 was administered only once after 4 h. After 24 h of the induction of pulmonary inflammation, blood, bronchoalveolar lavage, and lung samples were collected.
  • the amino acid sequence of the RBD region of the Spike protein of the SARS-CoV-2 virus used in the present invention was EGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGY (SEQ.ID.No.l) (Othman et al., 2020).
  • our experimental model for the induction of pulmonary inflammation is based on that described by Gu et al. (Gu, et.al., 2020) and Gan et al. (Gan, et.al., 2020), who describe that the intratracheal application of polyl:C induces pulmonary inflammation, while the combination polyl:C / SARS-CoV-2 Spike Protein aggravates this inflammation with clinical signs similar to Acute lung damage observed in patients with COVID-19.
  • PolykC is a double-stranded RNA rich in uracils which is capable of activating the TLR3 receptor, thus triggering an inflammatory response similar to a viral infection.
  • this compound was administered intratracheally to simulate an influenza A model in C57BL/6 mice (Stowell, et.al., 2009), while later studies showed that its intratracheal administration induces the expression of cytokines (IL-6 , IL-12, and INF-a) accompanied by an increase in neutrophils and macrophages in the affected area, an effect very similar to that reported for the infection caused by the SARS-CoV virus (Lu, et.al., 2011; Harris , et al., 2013). Therefore, we opted for this model to simulate the infection caused by the SARS-CoV-2 virus.
  • cytokines IL-6 , IL-12, and INF-a
  • Bronchoalveolar lavage was obtained according to the standard procedure (Sun, et.al., 2017). The rib cage was carefully removed and a plastic cannula was inserted into the trachea and 0.8 ml of PBS was used to wash the bronchoalveolar area 3 times, repeating this wash 4 times. The recovered BAL was used for subsequent cytokine detection and flow cytometry assays.
  • the left lung was collected in a 1.5 ml microtube, to which 200 units of collagenase (Sigma Aldrich, Missouri), 0.9 mM of calcium and magnesium were added in a final volume of 1 mL of previously heated PBS.
  • the tissue was sectioned into pieces with sharp sterile scissors. A small hole was made in the lid of the microtubes to prevent hypoxia and they were incubated at 37°C in a water bath. The samples were vortexed every 20 minutes, where after 40 minutes the tissue was homogenized by pipetting. 1 h later, the cell suspension was filtered using a 40 pm strainer (Corning, New York) and washed with 5 mL PBS at 4°C. Cells were then centrifuged at 180 g for 5 min and resuspended in 1 mL PBS at 4°C for later use.
  • RNA isolation was isolated and purified from the lung tissue of mice under test using the Trizol technique (Invitrogen, California), following the manufacturer's specifications.
  • the cDNA encoding ICAM 1 was obtained by reverse transcription of purified RNA using the First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermofisher, Massachusetts) and using the following oligonucleotides:
  • Example 2 Inhibition of ADAM 17 reduces lung injury caused by intratracheal instillation of Polyl:C/ RBD-spike SARS-CoV-2.
  • the lung tissues of mice that received treatment with the ADAM17 inhibitors suffered only mild damage with better preserved lung architecture ( Figure 2).
  • Example 3 Neutrophil infiltration into the lung caused by PolikC/RBD-spike SARS-CoV-2 is attenuated by ADAM17 inhibitors.
  • neutrophils are the first to be recruited, which was determined by flow cytometry.
  • Mice treated with vehicle alone had increased lung neutrophil infiltration compared to the control group and the apratastat and TMI-1 treated groups (Figure 3A). This shows that blocking the activity of ADAM17 limits the inflammatory process.
  • FIG. 3B In the case of T lymphocytes, we clearly observed a reduction in all groups compared to the control group ( Figure 3C).
  • Example 4 ICAM-1 gene expression in PolikC/RBD-spike SARS-CoV-2 affected lung tissue is decreased by ADAM17 inhibition.
  • the recruitment and transmigration of leukocytes across the vascular endothelium is linked to the expression of adhesion molecules (Schnoor, et.al., 2015).
  • the activated endothelium expresses high levels of these proteins on its apical surface, promoting the attachment and transmigration of leukocytes.
  • the ICAM-1 protein is a ligand for integrin (32) which is found on the surface of the endothelium and mediates leukocyte adhesion and transmigration.
  • ADAM17 inhibitors reverse neutrophilia caused by PolikC/RBD-spike SARS-CoV-2-induced lung inflammation. Pulmonary inflammation induced by PolikC/RBD-spike SARS-CoV-2 caused neutrophilia and marked peripheral blood lymphopenia (Figure 5A and 5B), coinciding with the same condition reported in patients diagnosed with COVID-19. As can be seen in Figure 5, these effects were significantly reduced after inhibition of ADAM17 with apratastat and TMI-1.
  • Example 6 Intranasal administration of the inhibitor ADAM17 also prevents severe pulmonary inflammation induced by Polil:C /RBD-spike SARS-CoV-2.
  • mice treated with apratastat were reduced in mice treated with apratastat compared to vehicle ( Figure 6C, 6D and 6F).
  • No difference in BAL neutrophil count was observed in the vehicle compared to the apratastat group ( Figure 6E), while blood neutrophils (%) rose to a similar level above control in both groups ( Figure 6G). ).
  • the percentage of T lymphocytes was also reduced in the groups treated with the vehicle as in those treated with apratastat (FIG. 6H).
  • Example 7 Intranasal administration of apratastat reduces ICAM-1 expression in pulmonary endothelial cells induced by administration of Polil:C/RBD-spike SARS-CoV-2.
  • the surface expression of ICAM-1 on pulmonary endothelial cells is increased, allowing leukocyte infiltration.
  • the expression of ICAM-1 protein in endothelial cells was reduced to almost normal levels ( Figure 7A, 7B and 7C), a situation that is reflected in the decreased infiltration of neutrophils in lungs.
  • the present invention represents an efficient therapeutic alternative for the treatment of COVID-19 and severe acute respiratory syndrome (SARS).
  • SARS severe acute respiratory syndrome

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Abstract

La invención describe compuestos inhibidores de la enzima ADAM17 y composiciones que los comprenden para el tratamiento efectivo de la COVID-19. La administración de los inhibidores descritos permite revertir de forma eficiente el síndrome respiratorio agudo severo (SARS) causado por la infección del virus SARS-CoV-2, impidiendo así la destrucción del tejido pulmonar que se observa en pacientes afectados por la COVID-19 y restableciendo la condición normal de salud del paciente. Los inhibidores y sus composiciones descritas, se administraron vía parenteral e intranasal, observándose los mismos efectos benéficos del tratamiento, y revirtiendo la neutrofilia y leucopenia observada típicamente en pacientes afectados por la COVID-19. Así mismo, se describe la generación de un modelo animal que permite reproducir el síndrome respiratorio agudo severo (SARS) de forma muy similar al observado en los pacientes afectados por la COVID-19, lo que permite evaluar de manera segura diversas sustancias con posible actividad farmacológica para el tratamiento de la COVID-19.

Description

Inhibidores de la enzima ADAM17 y composiciones que los comprenden para el tratamiento efectivo de la COVID-19
Campo de la invención.
La invención se relaciona con compuestos para el tratamiento de enfermedades pulmonares, particularmente a compuestos inhibidores de la enzima ADAM17 los cuales permiten tratar la COVID- 19 (Corona Virus Disease-19) y el síndrome respiratorio agudo severo (SARS) que se presenta en enfermedades causadas por los virus de la familia SARS-CoV, particularmente el síndrome respiratorio agudo severo causado por el virus SARS-CoV-2, causante de la COVID-19.
Antecedentes de la invención.
La COVID-19 es una enfermedad emergente causada por el coronavirus SARS-CoV-2 que se caracteriza en su forma grave por desarrollar síntomas de una enfermedad respiratoria aguda que deriva rápidamente al síndrome respiratorio agudo severo (SARS, por sus siglas en inglés, Severe Acute Respiratory Syndrome), falla respiratoria aguda, edema pulmonar, sepsis y falla multiorgánica, lo que puede llevar a la muerte (Chen, et.al., 2020). Desde su detección en diciembre del 2019 en China, el virus se ha dispersado alrededor del mundo infectando en la actualidad a más de 50 millones de personas con una tasa de mortalidad que oscila actualmente alrededor del 4% a nivel mundial, donde en México dicha tasa alcanza un valor del 9.8% al 9 de noviembre del 2020 y observándose un incremento importante en la aparición de nuevos casos a partir del mes de Octubre del 2020 (Figura 1), destacándose países Europeos y Estados Unidos principalmente, donde el incremento de dichos casos ha sido muy significativo (Universidad Johns Hopkins (Coronavirus Resorce Center, https://coronavirus.jhu.edu/map.html).
A la fecha, el virus se sigue propagando, lo que supone un gran reto para los sistemas de salud a nivel mundial. Debido a que no existe un tratamiento antiviral específico para la COVID-19, la urgencia de un tratamiento que proporcione algún beneficio a estos pacientes es imperante (Jin, et.al., 2020).
El virus SARS-CoV-2 pertenece a la familia de los coronaviridae, que son virus envueltos de RNA de cadena sencilla (ssRNA) (Jin, et.al., 2020). Aunque aún no ha sido demostrado el mecanismo por el cual el RNA viral del SARS-CoV-2 es reconocido por el sistema inmune del humano, ya es conocido que algunos de los componentes virales son altamente inmunogénicos al ser reconocidos por los receptores que reconocen patrones (PRRs) entre los que se encuentran los receptores tipo toll (TLRs) (Vadillo, et.al., 2012). De esta manera, es conocido que el ssRNA viral puede ser reconocido en endosomas por el receptor tipo toll 7 (TLR-7), mientras que el RNA de doble cadena (dsRNA), que es un intermediario que el virus genera durante su replicación, puede ser reconocido también en endosomas por el receptor tipo-toll 3 (TLR3) (Deng, et.al., 2017). Así mismo, la proteína Spike (proteína S) de algunos coronavirus es reconocida por el TLR4. De manera general, el reconocimiento de estas moléculas induce la producción de citocinas proinflamatorias como las interleucinas (IL) IL- ip, IL-6, IL-8, IL-12, TNFa además de los distintos tipos de interferon (IFNa/0 e IFNy) (Vadillo, et.al., 2012). La alta producción de todas estas citocinas proinflamatorias puede generar un estado hiperinflamatorio que es característico de las infecciones virales que pueden causar el daño pulmonar agudo y sus complicaciones.
En un intento por proporcionar un tratamiento efectivo de para la COVID-19, se ha reportado el uso de diversos compuestos, los cuales se mencionan a continuación:
Rajagopal (Rajagopal, 2020) describe compuestos chalcona 9-anilinoacridinas sustituidos (la-z) determinados por docking y que muestran afinidad a diferentes residuos proteicos de moléculas constitutivas del virus, los cuales podrían ser potenciales inhibidores de la COVID-19.
Siddhartha (Siddhartha, 2020) describe el uso de infusiones de Camellia sinensis, (L.) O. Kuntze para el tratamiento de la COVID-19.
Ramu y col. (Ramu, et.al., 2020) describen el uso de moléculas pequeñas con actividad antiviral para el tratamiento de la COVID-19. Baker y col. (Baker, et.al., 2020) describen compuestos de amonio cuaternarios antisépticos tales como cloruro de amonio, ceti I piridiniu m y miramistina como agentes terapéuticos para SARS-CoV-2. Shaker y col. (Shaker, et.al., 2020) describen moléculas potenciales inhibidoras de SARS-CoV-2 afines a la proteasa principal Mpro del virus.
Gupta y col. (Gupta, et.al., 2020) describen el uso de la proteasa principal Mpro del virus SARS-CoV- 2 como blanco terapéutico para detectar compuestos prometedores que muestren afinidad a la misma, dentro de los cuales se mencionan dihidroergotamina, midostaurina, ziprasidona, etoposido, apixaban, fluoresceina, tadalafil, rolapitant y pa I bocicl i b.
Mahmoud y col. (Mahmoud, et.al., 2020) describen nanoanálogos de formazán, los cuales muestran afinidad con la proteasa 3CLpro de SARS-CoV-2, los cuales resultan promisorios para el tratamiento de la COVID-19.
Ghosh y col. (Ghosh, et.al., 2020) describen alcaloides de Justicia adhatoda como potentes inhibidores de la proteasa principal de SARS-CoV-2, de los cuales solo anisotina tuvo una interacción con los sitios catalíticos His41 y Cysl45 de Mpro.
Ghahremanpour y col. (Ghahremanpour, et.al, 2020) describen compuestos con diferentes afinidades a la proteasa principal Mpro de SARS-CoV-2 como potenciales agentes terapéuticos para la COVID-19 ya que reducen la actividad enzimática de dicha proteasa, tales como manidipina, boceprevir, lercanidipina, bedaquilina y efonidipina.
Finalmente, Ebada y col. (Ebada, et.al., 2020) describen el uso potencial de chrisosplenetina como inhibidor de la proteasa Mpro de SARS-CoV-2 para el tratamiento de la COVID-19.
Sin embargo, los compuestos anteriores están dirigidos a componentes estructurales del virus, lo que no constituye en sí mismo un tratamiento efectivo contra el SARS, condición patológica que ya ha sido causada por la infección viral, siendo que dicha condición es una de las causas más importantes de muerte en pacientes que cursan con un estado grave de la enfermedad.
Debido a lo anterior, resulta necesario contar con soluciones efectivas para el tratamiento de la COVID-19 así como del síndrome agudo respiratorio severo (SARS) causado por el virus SARS-CoV-2, permitiendo proporcionar así a los pacientes que ya estén cursando con dicho SARS una alternativa efectiva de tratamiento que permita una mayor probabilidad de sobrevivencia a dicha condición.
Breve descripción de las figuras.
Figura 1. Se muestra la aparición de nuevos casos diarios confirmados de la COVID-19 (media de 7 días), observándose A) la evolución del brote en los 10 países más afectados actuales, y B) la evolución del brote en México. Tomado de los datos públicos de la Universidad Johns Hopkins, Coronavirus Resorce Center, https://coronavirus.jhu.edu/data/new-cases.
Figura 2. La inflamación pulmonar aguda se redujo tras la inhibición de ADAM17 inducida por Polil:C /RBD-spike SARS-CoV-2. Se muestran imágenes representativas de cortes transversales de tejido pulmonar teñidos con hematoxilina-eosina. n = 2-3. PS: solución salina fisiológica.
Figura 3. El reclutamiento de neutrófilos en los pulmones afectados por Polil:C /RBD-spike SARS- CoV-2, se reduce por los inhibidores de ADAM17. Se muestra (A) el porcentaje de neutrófilos (células Ly6G+CD45+), (B) frecuencia de monocitos (células F4/80+CD45+), (C) frecuencia de linfocitosT (células CD3+CD45+) en los pulmones determinada por citometría de flujo, (D) células totales obtenidas del lavado broncoalveolar (LBA) 24 h después de la cirugía, (E) número total de leucocitos CD45+ infiltrados en las áreas broncoalveolares y (F) recuentos diferenciales de células Ly6G+, F4/80+ y CD3+ en el LBA 24 h después de la cirugía. El conteo celular se realizó empleando una cámara de Neubauer. Los datos se muestran como media ± SEM de n = 6-8. * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001, **** p <0.001.
Figura 4. La inhibición de ADAM17 reduce los niveles de ARNm de ICAM-1 en tejido pulmonar afectado por Polil:C /RBD-spike SARS-CoV-2. Se observan los niveles de ARNm de ICAM-1 presente en muestras control, vehículo (sin inhibidores de ADAM17), y tratadas con apratastat y TMI-1, las cuales fueron tratadas previamente con PolikC /RBD-spike SARS-CoV-2. Los niveles de ARNm de la molécula de adhesión ICAM-1 se determinaron mediante PCR cuantitativa en tiempo real. La expresión génica se analizó utilizando el método AACt con 0-actina como gen de referencia. Los resultados se representan como media ± SEM de n = 2-3. * p <0.05, ** p <0.01.
Figura 5. La neutrofilia inducida por Polil :C /RBD-spike SARS-CoV-2 disminuye con la inhibición de ADAM17. Se muestra la (A) frecuencia de células Ly6G+CD45+ en sangre periférica 24 h después de la cirugía, y (B) porcentaje de células CD3+CD45+ en sangre. Los resultados se representan como media ± SEM de n = 6-8. * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001.
Figura 6. La administración intranasal de apratastat reduce la inflamación pulmonar inducida por Polil:C/RBD-spike SARS-CoV-2. Se muestra el (A) porcentaje de células Ly6G+/CD45+ y (B) CD3+/CD45+ en el tejido pulmonar, (C) células BALF totales, (D) leucocitos en el LBA, (E) neutrófilos y (F) células T determinadas por citometría de flujo 24 h después de la cirugía, (G) recuento de neutrófilos y (H) células T en la sangre. Los resultados se representan como media ± SEM de n = 3. LBA: lavado broncoalveolar. #: Significancia estadística con respecto al grupo control #p < 0.05, ##p < 0.01, ###p < 0.001, ####p < 0.0001. *: Diferencias estadísticas entre vehículo vs apratastat *p < 0.05, **p < 0.01. Figura 7. La expresión de ICAM-1 en células endoteliales de pulmón se redujo en ratones tratados con inhibidores de ADAM17 administrados vía intranasal. Se muestran (A) dot plots originales de ICAM1/CD31 de células pulmonares derivadas de la población CD45‘ (no leucocitaria), (B) porcentaje de células CD45‘ CD31+ ICAM1+ y (C) UF de ICAM-1 en células CD31+ CD45‘. Los resultados se presentan como media ± SEM de n = 3. i.n: intranasal. IMF: Intensidad Media de Fluorescencia. *p < 0.05, **p < 0.01.
Descripción detallada de la invención.
La presente invención proporciona una solución efectiva para la COVID-19 y el síndrome respiratorio agudo severo (SARS) que se presenta como consecuencia de la infección causada por el virus SARS- CoV-2, el cual se ha convertido en la principal causa de muerte por la COVID-19.
La presente invención proporciona el uso novedoso de compuestos inhibidores de la enzima ADAM17 y composiciones que los comprende, como compuestos con efecto terapéutico para el tratamiento efectivo de la COVID-19 y del síndrome respiratorio agudo severo (SARS), ejerciendo su acción terapéutica al reducir y/o eliminar de forma significativa los síntomas y condición patológica asociados a dicho síndrome, permitiendo así el restablecimiento de la condición normal del paciente. Como puede observarse, la presente invención constituye una solución efectiva al tratamiento de la COVID-19, incluso en sus etapas más graves, ya que permite detener el proceso que conlleva a la aparición de SARS como consecuencia de la infección por el virus SARS-CoV-2, evitándose con ello que la COVID-19 evolucione a estados graves de la enfermedad, constituyéndose la presente invención hasta el momento como una medida efectiva para el tratamiento de la enfermedad, independientemente de que al mismo tiempo el virus siga presente en el paciente.
Fisiológicamente, el SARS se caracteriza por la alta permeabilidad vascular que se presenta en dicha patología, lo que resulta en edema pulmonar, hipoxia arterial severa e hipercapnia (aumento en la presión parcial de CO2). Las posibilidades de supervivencia a éste síndrome dependen de la severidad del daño pulmonar, la extensión del daño a otros órganos, las comorbilidades que presente el paciente y la calidad de los cuidados médicos (Matthay, et.al., 2012). Los ejes centrales en la patogénesis del SARS son la inflamación en exceso, la acumulación de leucocitos y trombocitos en los pulmones, la activación de la cascada de coagulación y el incremento en la permeabilidad de la barrera endotelial y epitelial. El aumento en la permeabilidad vascular está dado por el incremento en la producción de citocinas proinflamatorias y esto sucede debido a la perturbación de las uniones adherentes entre las células endoteliales en el pulmón. El aumento de la permeabilidad de las barreras endotelial y epitelial en el pulmón, induce también la migración de neutrófilos y plaquetas que se encargan de la respuesta inmune innata y la cicatrización del tejido dañado, respectivamente. El reclutamiento excesivo de neutrófilos a este órgano puede resultar contraproducente debido a que los neutrófilos activados, pueden también dañar los tejidos inflamados durante el curso de la infección aguda (Matthay, et.al., 2012).
El mantenimiento de la permeabilidad vascular y epitelial pulmonar está gobernada en parte por la expresión de la enzima convertidora de angiotensina 2 (ACE-2) en las células que conforman este tejido; esta enzima escinde a la angiotensina en Ang(l-9) y Ang(l-7) que se sabe, fungen como protectoras ante el aumento de la permeabilidad y la excesiva inflamación en el pulmón (Gheblawi, et.al., 2020). Además de esto, la ausencia de ACE-2 exacerba la inflamación pulmonar en condiciones experimentales mientras que la administración de Ang(l-7) mejora esta condición (Cao, et.al, 2019). Así, esta enzima resulta fundamental para la prevención del daño pulmonar agudo en respuesta a SARS-CoV-2. Cabe destacar que la infección por coronavirus causa una baja en la expresión de ACE2 (Kuba, et.al., 2005) un mecanismo que detona al SARS; en paralelo, una de las enzimas que se sabe es capaz de escindir a ACE-2 de las células endoteliales y epiteliales pulmonares es la desintegrasa y metaloproteasa 17 (ADAM17) que también puede ser activada por ciertos virus para ejercer esta función (Zunke, et.al., 2017; Patel, et.al., 2014).
Desde su transmisión al humano y hasta el 9 de noviembre del 2020, la COVID-19 ha provocado más de 1,260,000 fallecimientos en todo el mundo (Universidad Johns Hopkins (Coronavirus Resorce Center, https://coronavirus.ihu.edu/) y ha llevado al límite a los nosocomios, hospitales y centros de salud de atención hospitalaria alrededor del planeta.
La principal complicación durante la infección viral son precisamente las afectaciones pulmonares en el 88% de los casos, donde las complicaciones asociadas a este estado son la neumonía (78% de los casos) y la falla respiratoria (54% de los casos). Existen otras causas de muerte como son el shock, el distres respiratorio y el edema pulmonar, así como las complicaciones cardiacas que son menos frecuentes en los grupos de edad avanzada. Así mismo, el 72% de los pacientes que han muerto por la COVID-19 presentaban comorbilidades como hipertensión, diabetes, obesidad y neoplasias (Grippo, et.al., 2020; Huang, et.al., 2020).
Debido a que no existe un tratamiento específico para esta enfermedad ni siquiera en su forma grave, la urgencia de un tratamiento que suponga algún beneficio a estos pacientes, resulta fundamental.
Durante la COVID-19, el daño pulmonar agudo generado por la infección es la principal complicación que lleva al paciente grave a ser hospitalizado con desenlaces desfavorables (Piña-Sanchez, et.al., 2020). De ahí que el tratamiento y/o prevención del daño pulmonar agudo resulte crítico en los pacientes que cursan con la forma grave de la COVID-19.
Hasta antes de la presente invención, la mayoría de los tratamientos dirigidos a combatir la COVID- 19, estaban enfocados en inhibir la replicación viral o en dirigir sus esfuerzos directamente al agente causal, es decir, el virus SARS-CoV-2, sin embargo no se ha observado que tengan algún efecto terapéutico efectivo en contra de la forma grave de la enfermedad (SARS). En este sentido, el desarrollo de tratamientos conocidos a la fecha para tratar las complicaciones de la infección como lo es el SARS ha sido prácticamente ignorado, a pesar de que esta complicación es la que remite a los pacientes con la forma grave de la COVID-19 a las unidades de cuidados intensivos (Matheson, et.al., 2020).
El paciente que cursa con la COVID-19, requiere desde luego, resolver la infección viral, pero también el pronto restablecimiento de la función pulmonar, ya que, de lo contrario, sus posibilidades de sobrevivirá la infección se reducen drásticamente conforme el SARS evoluciona a estados más graves. El empleo de agentes que mejoren o protejan la barrera pulmonar y por consiguiente su función, supone un beneficio directo al paciente, ya que se evitaría su complicación a estadios críticos como la sepsis, la falla multiorgánica o incluso la muerte; también, el mejorar o prevenir el SARS en los nosocomios que tratan la COVID-19 supone la aceleración de la recuperación del paciente, lo que ayudaría a mitigar la saturación hospitalaria y los costos de hospitalización. Como puede visualizarse de lo anterior, el reducir la mortalidad y acortar tiempos de hospitalización representa uno de los ejes de acción que pueden impactar de manera muy importante en el control de la enfermedad y para resolver de manera efectiva la contingencia actual. Para resolver Io anterior, la presente invención plantea evaluar a la enzima ADAM17 como blanco terapéutico para el tratamiento de la COVID-19, ya que esta enzima se encuentra en la membrana de la mayoría de las células que conforman el epitelio pulmonar y ha demostrado escindir a ACE2, el receptor que el SARS-CoV-2 utiliza para internalizarse. Sin embargo, no solamente tiene esta función, sino que también tiene un papel fundamental en el mantenimiento de la barrera pulmonar y la prevención de la enfermedad pulmonar aguda. Aunque la escisión de ACE-2 por acción de la enzima ADAM17 en la infección por el coronavirus SARS-CoV-1 ha sido descrita (Heurich, et.al., 2014), el papel de ADAM17 no ha sido estudiado en el contexto de la inflamación pulmonar producida por SARS-CoV-1 o SARS-CoV-2. También, aún no es conocido si el SARS-CoV-2 es capaz de promover la escisión de ACE-2 por efecto de la activación de la enzima ADAM17; esto podría derivar en la pérdida del efecto antiinflamatorio de la señalización que induce ACE-2 en la COVID-19. Más aún, no es conocido si tal mecanismo contribuye en sujetos de alto riesgo a desarrollar estados más severos de la COVID-19.
Por lo anterior, la presente invención plantea que la escisión de ACE2 y la consecuente pérdida de la señalización por efecto de la enzima ADAM17 durante la infección por SARS-CoV-2, es la responsable de la pérdida de la función pulmonar que se observa en la COVID-19.
La presente invención proporciona compuestos inhibidores de la enzima ADAM17, los cuales resultan muy efectivos en inhibir la función de dicha enzima que aparentemente se ve activada por la infección con el virus SARS-CoV-2, con lo que la proteína ACE-2 no se ve afectada, conservándose así su función en contribuir a la integridad y protección del epitelio pulmonar que evidentemente resulta afectado por la enfermedad.
Conforme a lo descrito aquí, cualquier compuesto que tenga la capacidad de inhibir la actividad de la enzima ADAM17 resulta útil para proporcionar el efecto terapéutico descrito en la presente invención, como por ejemplo los compuestos derivados de piridona descritos por Hirata y col. (Hirata, et.al., 2016), los compuestos descritos por Fukui y col. (Fukui, et.al., 2008), el compuesto GW280264X
(((2R,3S)-3-(Formil-hidroxiamino)-2-(2-metil-l-propil) ácido hexanoico [(lS)-5- benziloxicarbamoilamino-l-(l,3-tiazol-2-ilcarbamoil)-l-pentil] amida) que inhibe ADAM17 de manera más específica descrito por Ludwig y col. (Ludwig, et.al., 2005), el compuesto hidroxamato GM6001 descrito por Gijbels y col. (Gijbels, et.al., 1994), el compuesto GW9471 descrito por Moss y col. (Moss, et.al., 1997), así como el compuesto (2/?,35)-2-({[4-(2-butin¡lox¡)fen¡l]su IfoniIJa mino)-/V,3- dihidroxibutanamida (TMI-2) descrito por Zhang y col. (Zhang, Hegen, et.al., 2004) los cuales están comprendidos en el alcance de la presente invención; principalmente se prefieren usar inhibidores con una mayor especificidad y selectividad para ADAM17 los cuales resultan particularmente útiles para el tratamiento de la COVID-19, y que se seleccionan del grupo que comprende:
- El compuesto de fórmula I: N-
Figure imgf000007_0001
- El compuesto de fórmula II:
Figure imgf000007_0002
287405-51-0;
- El compuesto de fórmula III:
Figure imgf000008_0001
- ,
- El compuesto de fórmula IV:
Figure imgf000008_0002
- El compuesto de fórmula V:
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- Sus sales farmacéuticamente aceptables, y
- Mezclas de los mismos, donde se prefieren utilizar los compuestos de fórmula I y II, sus sales farmacéuticamente aceptables y mezclas de los mismos.
El virus SARS-CoV-2 causante de la pandemia COVID-19, emplea la enzima ACE2 para internalizarse, sin embargo, esta enzima es más que un receptor para el virus. En condiciones fisiológicas la ACE2 degrada el angiotensinógeno en Ang (1-7) y Ang (1-9), promoviendo así la vasodilatación, la protección vascular y limitando de esta manera la formación de edema y fibrosis (Clarke, et.al., 2012). En el proceso de invasión viral por SARS-CoV-2, ACE2 se internaliza junto con el virus y es degradado, por lo que disminuye su actividad anti-inflamatoria, además, la presencia de ACE2 en membrana depende de la actividad de ADAM17 (Gheblawi M, Wang K, Viveiros A., et.al, 2020; Zipeto, et.al., 2020). Durante la infección por el virus SARS-Cov2, ADAM17 se activa para incrementar la producción de TNF-a y como efecto colateral escinde a ACE2, culminando en el SARS, lo que representa la principal causa de muerte de los pacientes infectados (Xu, et.al., 2020).
Nuestros datos representan la primera evidencia en el mundo de que en un modelo murino, la inhibición de ADAM17 por ejemplo con apratastat y TMI-1, disminuye la formación de edema y la fibrosis atenuando el daño pulmonar causado por la administración de Polil :C/RBD-spike SARS-CoV- 2 (Figura 2). Ensayos de citometría de flujo demostraron claramente que los ratones tratados con inhibidores de ADAM17 disminuyen el reclutamiento de neutrófilos (Figura 3), evento claramente asociado a la aparición y desarrollo del SARS, sin cambios significativos en los macrófagos.
Así mismo, en el fluido del lavado bronquioalveolar (LBA), encontramos que el grupo tratado con Polil:C/RBD-spike SARS-CoV-2 muestra un incremento significativo en los números totales para neutrófilos, macrófagos y linfocitos, condición que regresa a niveles básales al administrar inhibidores de ADAM17 como por ejemplo apratastat o TMI-1 (Figura 3F). Este elevado número de leucocitos encontrados en el LBA está relacionado con la alta expresión de ICAM-1 en las células endoteliales que permite la adhesión de las células del sistema inmune, permitiendo su reclutamiento hacia tejidos inflamados. Determinamos también que la sobre expresión de ICAM-1 que observamos se ve clara y significativamente disminuida después del tratamiento con inhibidores de ADAM-17 (Figura 4), siendo probablemente éste el mecanismo que causa la disminución en el reclutamiento de leucocitos a los pulmones.
Por otro lado, en sangre periférica encontramos linfopenia acompañada de neutrofilia, características típicas descritas durante la infección por SARS-Cov-2 en pacientes (Henry, et.al., 2020). En contraste, al administrar los inhibidores de ADAM17 descritos en la presente invención, encontramos que en sangre periférica, la cantidad de neutrófilos tendió a disminuir de manera significativa, mientras que la cantidad de linfocitos tendió a incrementarse (Figura 5).
En todos los casos anteriores se realizó la administración de los inhibidores de ADAM17 por vía intraperitoneal, generando un efecto sistémico de dichos inhibidores. En este sentido, los efectos observados de la presente invención resultan muy importantes para su aplicación clínica, ya que para el tratamiento de la COVID-19 se busca un efecto local inmediato por vía no-invasiva, como por ejemplo la vía intranasal, que también mejora la biodisponibilidad de los inhibidores en el sitio afectado. Para ello, se decidió realizar una administración intranasal de apratastat, en donde encontramos un comportamiento muy similar a la vía intraperitoneal, observándose la disminución en el reclutamiento de neutrófilos y linfocitos en los pulmones (Figura 6A y 6B) y en el LBA (Figura 6). Además, la administración intranasal de apratastat tiende a disminuir la expresión de ICAM-1 (Figura 7B), contribuyendo a una disminución en el reclutamiento de leucocitos.
Conforme a la presente invención y a los ensayos realizados hasta el momento, no encontramos diferencias significativas en los efectos protectores de los inhibidores de ADAM17 observados por su administración parenteral o nasal, sin embargo, la vía intranasal comprende ventajas adicionales en el tratamiento de la COVID-19, ya que proporciona un efecto local y directo en el tejido respiratorio y/o pulmonar afectados, limitando posibles efectos adversos de los inhibidores de ADAM17 al aplicarlos de manera sistémica en pacientes en futuros estudios clínicos.
La presente invención evidencia a la enzima ADAM17 como un blanco terapéutico muy atractivo para el tratamiento del síndrome respiratorio agudo severo (SARS) que se presenta en pacientes con la COVID-19, ya que en parte limita la producción de TNF-a y contribuye a la permanencia de ACE2 en membrana, teniendo un efecto dual para limitar la inflamación pulmonar.
Cabe destacar que en la presente invención empleamos obtuvimos y generamos un modelo murino no humanizado que simula y reproduce las condiciones patológicas observadas en infección por SARS-CoV-2, lo que facilita el estudio de la enfermedad, así como el uso de inhibidores de ADAM17 in vivo, mostrando una clara ventaja en el estudio de posibles alternativas farmacológicas futuras para el tratamiento de la COVID-19, aunado al hecho de no tener que utilizar directamente muestras o pacientes afectados por la enfermedad, lo que ha representado una gran limitante al no contar fácilmente con condiciones de bioseguridad suficientes para su manejo, por lo que el modelo animal de la COVID-19 descrito aquí permite que se maneje fácilmente en laboratorios que no cuentan con dichos niveles de bioseguridad.
En una de las modalidades de la invención, las sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos mencionados anteriormente también pueden utilizarse para producir los mismos efectos descritos aquí, por lo que quedan comprendidas en el alcance de la presente invención.
En otra de las modalidades de la invención, quedan comprendidas las mezclas de los compuestos anteriores y sus sales farmacéuticamente aceptables con la finalidad de potenciar el efecto de los mismos o de hacerlos más compatibles para su administración.
Los resultados de la presente invención muestran que las composiciones que comprenden los inhibidores de ADAM17 descritos aquí son útiles como una nueva alternativa terapéutica para pacientes con la COVID-19, por lo que es parte de las modalidades de la invención el uso de inhibidores de ADAM17 como tal o sus sales farmacéuticamente aceptables de los mismos para la obtención de las composiciones mencionadas con el fin de usarse para el tratamiento efectivo de la COVID-19. Por lo tanto, es objeto de la invención proveer de composiciones farmacéuticas que comprendan inhibidores de ADAM17 junto con excipientes farmacéuticamente aceptables y adecuados para ser administrados al paciente que lo requiera. Es modalidad de la invención la adaptación de los principios activos para utilizarse en composiciones farmacéuticas para administración enteral, parenteral y uso tópico, incluyendo la inhalación. Las dosis efectivas para el paciente del principio activo serán también ajustadas de conformidad con estudios preclínicos y clínicos procedentes, pero tomando como base los hallazgos de la presente invención.
Ejemplos de excipientes farmacéuticamente aceptables que acompañen al principio activo de la invención son por ejemplo, para la administración oral como tabletas o comprimidos, agentes que comprenden por ejemplo, diluyentes, aglutinantes, estabilizantes, agentes de carga, agentes espesantes, tales como povidona, celulosa microcristalina, lactosa, etc., agentes desintegrantes tales como por ejemplo carboximetilcelulosa entrecruzada, surfactantes como por ejemplo, laurilsulfato de sodio, agentes lubricantes o deslizantes como por ejemplo estearato de magnesio, dióxido de silicio coloidal, etc., donde dichos excipientes pueden ser formulados para liberación preferentemente lenta o prolongada para un efecto sistémico.
Se pueden preparar soluciones para administración intravenosa o intraperitoneal del principio activo disueltos primero en un solvente orgánico como DMSO, etanol, o dimetilformamida y subsecuentemente en buffers acuosos, como PBS.
Se tiene especial preferencia por las formas farmacéuticas diseñadas para la administración localizada al lugar donde se presenta la forma más grave de la enfermedad, como por ejemplo SARS, donde se pueden formular composiciones líquidas o sólidas, adecuadas para su administración local por ejemplo, y cuyos excipientes pueden seleccionarse por ejemplo, de componentes compatibles con dicha forma farmacéutica, por ejemplo de naturaleza lipídica o peptídica, o peptidomiméticos, conocidos en el estado de la técnica como no inmunogénicos, y que de preferencia puedan quedar unidos a los principios activos de la invención para mejorar su biodispon i bi I ¡dad; agentes propulsores como por ejemplo, propano, butano, o clorofluorocarbonos permisibles; reguladores de pH como por ejemplo, ácido sulfúrico; agentes quelantes como por ejemplo, EDTA. También se pueden conformar los principios activos en partículas micronizadas contenidas en cápsulas de gelatina o en otros sistemas conocidos en el campo técnico, que ayuden a liberar el principio activo a su sitio blanco de acción, por ejemplo, mediante formas farmacéuticas sólidas como tabletas o grageas, incluyendo aquellas formuladas para su liberación prolongada.
Conforme a la presente invención, pueden obtenerse las composiciones aquí descritas mediante la combinación de inhibidores de ADAM17 con vehículos farmacéuticamente compatibles conocidos en el arte, en las cantidades y/o concentraciones que correspondan conforme a lo descrito aquí, y pueden incluirse compuestos conocidos en el arte para la obtención de dichas composiciones. Así mismo, la administración de tales composiciones, podrá hacerse dependiendo de las condiciones del paciente, lo que determinará las dosis y frecuencia de administración necesarias para lograr un tratamiento efectivo del padecimiento en cada caso en particular.
En una de sus modalidades, la invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden inhibidores de ADAM17 adecuadas para su administración nasal. Ejemplos de composiciones adecuadas para la administración nasal incluyen, pero no se limitan a, soluciones acuosas, pomadas y geles. En este sentido y conforme a la presente invención, una composición adecuada para la administración nasal por vía tópica puede encontrarse en forma de pomada o gel, en forma de aerosol nasal para ser potencialmente administrada mediante un mecanismo de administración por aerosoles, por ejemplo, a través de dispositivos inhaladores conocidos en el arte, o bien en forma de soluciones acuosas para ser administradas mediante gotas. Así miso, una persona con conocimientos medios en el campo técnico de la presente invención, sabría cómo preparar tales composiciones utilizando técnicas convencionales en el arte.
Acorde con una de las modalidades de la presente invención, los inhibidores de ADAM17 y las composiciones que los comprenden se administran a la membrana mucosa nasal del paciente afectado por la COVID-19. Conforme a la presente invención, cualquier método conocido en el arte se puede utilizar para la administración de dichos principios activos a la membrana mucosa nasal, donde preferentemente dichos principios activos se administran vía nasal mediante gotas o aerosoles, lo que les permite llegar a su sitio de acción de manera rápida y eficiente.
Particularmente, soluciones acuosas que comprendan inhibidores de ADAM17 puede administrarse al paciente afectado por la COVID-19 mediante la aplicación de gotas a la cavidad nasal a través de las fosas nasales. Alternativamente, dichas soluciones acuosas se pueden administrar al paciente afectado por la COVID-19 mediante aerosoles de aplicación nasal o bien mediante mecanismo de administración de aerosoles a través de dispositivos conocidos en el arte para tal fin, de modo que la solución acuosa que comprende inhibidores de ADAM17 se rocía al tejido respiratorio de una manera única o bien múltiple, conforme el paciente lo necesite. En otra modalidad, las composiciones farmacéuticas descritas aquí en forma de gel o ungüento, se pueden administrar vía nasal mediante aplicación tópica a una o más membranas mucosas de la cavidad nasal, así como en los tejidos respiratorios superiores e inferiores, incluyendo el tejido pulmonar.
En una de sus modalidades, la presente invención comprende la administración nasal o intranasal de las composiciones descritas aquí. Los beneficios de dicha administración comprenden la entrega precisa de los principios activos al sitio blanco de acción, en este caso el tejido respiratorio y pulmonar, un incremento sustantivo en cubrir mayor superficie de tejido superficial en la aplicación, tiempos de nebulización más cortos, reducción de toxicidad sistémica y de acumulación de una mayor concentración de fármacos en el sitio objetivo. Cantidades terapéuticas de los inhibidores de ADAM17 se pueden entregar rápidamente en el tejido respiratorio utilizando nebulizadores de diversos tipos, como por ejemplo ultrasónicos. Además, una porción mayor de la dosis administrada por ésta vía se puede depositar de manera muy eficiente en el pulmón en caso necesario.
Como ya se ha mencionado anteriormente, la aplicación parenteral de los inhibidores de ADAM17 es una de las modalidades de la presente invención, donde dicha vía de administración proporciona beneficios evidentes en cuanto a que puede administrase una mayor carga de dichos principios activos en caso necesario evitando con ello el uso de excipientes y solventes que podrían dificultar dicha administración por ésta vía (por ejemplo, co-solventes y/o solubilizadores de alta densidad, pH's extremos, etc.), y utilizando formulaciones líquidas y/o acuosas que facilitan su administración mediante dispositivos convencionales conocidos en el arte, tales como agujas hipodérmicas que permiten la administración intravenosa, intramuscular y/o subcutánea.
La presente invención comprende también métodos de tratamiento de la COVID-19 y del síndrome respiratorio agudo severo (SARS) que comprenden administrar al paciente que lo necesite, inhibidores de ADAM17 o composiciones que los comprendan en concentraciones adecuadas que proporcionen el efecto terapéutico deseado conforme lo descrito aquí y con la frecuencia de dosificación y régimen terapéutico que corresponda, ya sea por vía oral, parenteral, nasal y/o tópica, aunque la administración parenteral y nasal son preferidas. Conforme a la presente invención, dichos inhibidores y las composiciones que los comprenden, pueden administrarse al paciente que lo requiera durante el tiempo y frecuencia que sea necesarias hasta la desaparición de los síntomas típicos de la enfermedad o condición patológica, lo que puede implicar el restablecimiento de la condición normal del paciente.
Conforme a la presente invención, además de los protocolos de tratamiento descritos anteriormente, un tratamiento y un régimen de dosificación eficaces aplicados a un paciente también pueden depender de la edad del paciente, sexo, altura, peso, estado de salud previo, etc., por lo que considerando dichos factores así como las prácticas conocidas en el arte para ello, será fácilmente determinado el régimen de dosificación adecuado para cada caso, así como la cantidad para la administración de los inhibidores de ADAM17 y de las composiciones que los comprenden, con el fin de lograr el resultado terapéutico deseado para el paciente en necesidad de tratamiento.
Conforme a lo anterior, los inhibidores de ADAM17 descritos pueden administrarse en dosis que resulten adecuadas para ejercer sus efectos terapéuticos en los pacientes afectados por la COVID-19, donde la concentración en la que se administran comprende un rango de 1 a 20 mg/Kg de peso, preferentemente 10 a 20 mg/Kg de peso, la cual puede administrarse vía peritoneal y nasal.
Conforme a la presente invención, la administración peritoneal de los inhibidores de ADAM17 en pacientes afectados por la COVID-19, podría también tener efecto benéfico protector en aquellos órganos que se han visto afectados por la infección, tanto en la infección activa como en pacientes que se han recuperado de dicha infección y que reportan afectaciones en dichos órganos, como por ejemplo corazón, esófago, tracto gastrointestinal, sistema nervioso central y periférico, hígado, riñón, vejiga, sistema microvascular (Dariya, et.al., 2020; Iwasaki, et.al., 2020), en los cuales también existe la proteína ACE2 y en donde es altamente factible que el efecto que provoca la infección viral al potenciar la actividad de ADAM17 para escindir ACE2 que se presenta en tejido respiratorio y tejido pulmonar, sea muy semejante en los órganos que resultan afectados. Por lo anterior, la administración peritoneal y/o sistémica de los inhibidores de ADAM17 en pacientes afectados por la COVID-19 podría suplementar el tratamiento hecho inicialmente por vía nasal y/o intranasal, proporcionando protección en los órganos mencionados y que podrían estar en riesgo por la infección viral.
En una modalidad adicional de la presente invención, se proporciona un modelo animal en ratones que reproduce la patología causada por el virus SARS-CoV-2 en niveles de evolución grave de la enfermedad cuando aparece y se desarrolla el SARS, lo que permite entonces contar con un modelo animal que no representa un peligro potencial de contagio por el virus SARS-CoV-2 ya que no se utiliza el virus completo para su obtención, con lo que dicho modelo puede utilizarse en condiciones normales de laboratorio sin necesidad de contar con sistemas y/o niveles de bioseguridad. En dicho modelo animal, se observan efectos de afectación muy similares a los observados en los pacientes con la COVID-19, por ejemplo, neutrofilia y leucopenia, altas concentraciones de ICAM-1, ambas tanto en sangre periférica como en tejido pulmonar, así como una destrucción progresiva del tejido pulmonar debido a la infección.
Para efectos de la invención, el modelo animal para la COVID-19 en su fase de desarrollo de SARS, puede obtenerse administrando al animal por vía intratraqueal una composición que comprende Poli l:C y el fragmento RBD de la proteína Spike del virus SARS-CoV2 (RBD-spike) con la SEQ.ID.No. 1, donde dichos componentes se adicionan en una proporción de 10 mg/kg de Poli l:C y 15 pg del fragmento RBD de la proteína Spike del virus SARS-CoV2 (RBD-spike), donde con dicho tratamiento los animales desarrollan el SARS de la misma manera como se observa en los pacientes con la COVID- 19. Una vez obtenida dicha condición, dicho modelo animal permite estudiar los efectos de diversos fármacos para el tratamiento de la COVID-19, lo que representa un avance importante en el estudio de esta enfermedad y su tratamiento. Como puede observarse más adelante, dicho modelo animal nos permitió evaluar el potencial de los inhibidores de ADAM17 como principios activos terapéuticos efectivos para el tratamiento de la COVID-19 y SARS.
A diferencia del modelo animal para el estudio de SARS como el descrito por Gu y col. (Gu, et.al., 2020) donde se induce el SARS causado por el virus SARS-CoV2 en los animales administrándoles una combinación de PolikC con la proteína Spike de 135 KDal que contiene los dominios SI, S2 y RBD y una bandera de histidinas (His-tag flag), el modelo animal desarrollado en la presente invención utiliza únicamente un fragmento de 22 aminoácidos (dominio RBD) de la proteína Spike del virus SARS-CoV-2 (EGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGY; SEQ.ID.No.l), el cual resulta ser suficiente para generar SARS en los animales, con lo cual, mediante la presente invención se comprueba que dicho fragmento proteico es directamente responsable de los efectos que causa el virus SARS-CoV2 durante el desarrollo de COVID-19, así como en la evolución y desarrollo del síndrome respiratorio agudo severo (SARS).
Uno de los beneficios directos y evidentes que proporciona la presente invención al sistema de salud aparte de proporcionar un tratamiento efectivo para la COVID-19, se relaciona con reducir al mínimo indispensable el tiempo de residencia en hospitales que se ha observa hasta el momento como resultado de la pandemia COVID-19. Como es conocido, en etapas en donde existe una alta transmisión del virus SARS-CoV-2, se incrementa también de manera importante el número de pacientes que ingresan al hospital en estado grave por SARS causado por la COVID-19 y que necesitan un respirador, lo que ha provocado saturación en no pocas ocasiones del sistema de atención en salud de diversos países. A pesar de ello, el uso de respiradores como tratamiento de los pacientes afectados por la COVID-19, desgraciadamente no garantiza el restablecimiento de su estado de salud, lo que coloca a dichos pacientes en una situación de alto riesgo de perder la vida. En contraste, mediante la presente invención y con base en los resultados descritos aquí, el tratamiento de pacientes con la COVID-19 que incluso puedan llegar a evolucionar a estados más graves de la enfermedad como lo es el SARS, tendrían una posibilidad más efectiva de tratamiento, ya que los inhibidores de ADAM17 actúan de tal forma que pueden revertir el efecto causado por el virus SARS- CoV2 en dichas etapas. Como puede observarse, la presente invención adquiere una relevancia mayúscula, ya que se configura como una opción viable para el tratamiento de pacientes afectados por la COVID-19 en los que la expectativa de supervivencia es baja debido a la carencia de tratamientos efectivos para combatir la enfermedad en cualquiera de sus etapas, incluyendo aquellas que evolucionan a estados más graves como el SARS.
La proteína ACE-2 es una enzima altamente expresada en el lado apical de las células epiteliales alveolares y las células endoteliales pulmonares, la cual se encarga de escindir la hormona angiotensina en Ang (1-9) y Ang (1-7), hormonas que protegen a las células epiteliales y endoteliales de la hiperpermeabilidad e inflamación excesiva en el pulmón (Gheblawi, et.al., 2020). Por tanto, la presencia de ACE-2 es fundamental para la prevención del daño pulmonar en respuesta a la infección por coronavirus. Sin embargo, dicha infección provoca una regulación a la baja de ACE2 (Kuba, et.al., 2005), un mecanismo que desencadena el SARS. En este proceso provocado por la infección viral por SARS-CoV-1, se conoce que las enzimas que escinden la ACE2 y la eliminan de la superficie de las células epiteliales pulmonares podrían ser activadas por el virus para desencadenar la pérdida de la proteína ACE2, sin embargo, hasta antes de la presente invención, aún no existía confirmación de dicho mecanismo. Una de estas enzimas que es activada por la infección viral es una desintegrina y metaloproteasa 17 (ADAM17) (Zunke, et.al., 2017; Pate, et.al., 2014) que modula la señalización dependiente de ACE2, controlando la respuesta inmune del huésped y la función pulmonar. Aunque se ha descrito la escisión de ACE2 por ADAM17 en SARS-CoVl (Heurich, et.al., 2014), hasta antes de la presente invención el papel de ADAM17 no se había estudiado en el contexto de la inflamación pulmonar inducida por el SARS-CoV-2.
Conforme a nuestros resultados, la inhibición de la enzima ADAM17 por inhibidores tales como por ejemplo apratastat o TMI-1 evita la eliminación de ACE2, conservándose en consecuencia de esta manera la señalización anti-inflamatoria propia de la proteína ACE2 en la COVID-19. En el estado del arte se describen diversos compuestos inhibidores de las proteínas ADAM, tales como por ejemplo TMI-1, TMI-2, TMI-005 (apratastat), GM6001, GW9471 y TAPI-2 (Moss, et.al., 2007; Mezil, et.al., 2012; Zhang, Hegen, et.al., 2004; Gijbels, et.al., 1994; Moss, et.al., 1997; Black, et.al., 1997), donde los compuestos de la familia TMI se describen como bloqueadores de ADAM17, sin embargo algunos de ellos tienen cierta ¡nespecificidad, por lo que su uso sigue siendo estudiado. En contraste, TMI-1 y TMI-005 han mostrado un potencial terapéutico como inhibidores de ADAM17 (Zhang, et.al., 2004), siendo sus efectos adversos mucho menores en comparación con los no selectivos, siendo que dichos compuestos aún continúan siendo probados como activos terapéuticos para el tratamiento de cáncer, artritis o dermatitis (Moss, et.al., 2007; Zhang, et.al., 2004); en este sentido y en una de las modalidades de la invención, aunque para afectos de la presente invención pueden utilizarse compuestos que inhiban la actividad de la enzima ADAM17, se prefieren aquellos compuestos con mayor especificidad y selectividad para la enzima ADAM17 y que muestren actividad inhibidora para la misma, tales como por ejemplo aprastatat (TMI-005) y TMI-1.
En una de sus modalidades, la presente invención comprende composiciones que contienen inhibidores de la enzima ADAM17 para usarse en el tratamiento de la COVID-19, incluyendo situaciones donde la COVID-19 evoluciona a etapas más graves, tales como por ejemplo a el SARS. Aunque dichas composiciones pueden comprender sustancias capaces de inhibir la actividad enzimática de ADAM17, se prefiere utilizar inhibidores específicos para dicha enzima tales como por ejemplo aprastatat (TMI-005), TMI-1 y combinaciones de los mismos.
Dentro del alcance de la invención, las composiciones descritas se encuentran disponibles en forma tal que pueden administrarse en forma parenteral o intranasal, por ejemplo mediante el uso de aerosoles, de la misma manera que se administran otros principios activos dirigidos al tejido respiratorio, los cuales ejercen su actividad directamente en su sitio de acción de manera casi directa. Adicionalmente, la invención comprende la administración de las composiciones descritas a través de la vía intranasal, lo que permite que sus principios activos lleguen de manera más eficiente y en mucho menor tiempo que con la administración parenteral que también es posible.
Como puede observarse más adelante, la aplicación intranasal de los inhibidores de ADAM17 descritos aquí, genera efectos protectores muy similares a cuando se aplican de manera parenteral, generando un efecto local eficiente en el tejido pulmonar afectado y una vía aplicable que resulta ser altamente efectiva en pacientes afectados por la COVID-19, donde dicha administración intranasal se puede realizar por ejemplo, a través de dispositivos inhaladores conocidos en el arte y que ya se encuentran disponibles en el mercado.
Como puede observarse más adelante, la presente invención proporciona evidencia contundente de que los inhibidores de ADAM17 descritos aquí funcionan de manera eficiente para el tratamiento de la COVID-19 por diferentes vías de aplicación, donde al igual que la administración de estos por vía parenteral, su administración por vía intranasal genera un efecto de normalización de la cantidad de neutrófilos en sangre de los animales tratados, siendo esto una clara evidencia de que los inhibidores de ADAM17 descritos aquí proporcionan un efecto protector sistémico positivo del tejido pulmonar en pacientes afectados por la COVID-19.
A continuación, se incluyen los siguientes ejemplos con la única finalidad de ¡lustrar la presente invención, sin que ello implique limitaciones a su alcance.
Ejemplo 1. Metodología.
- Animales de experimentación. Se emplearon ratones macho libres de patógenos de la cepa C57BL/6 de entre 6 a 8 semanas, los cuales fueron obtenidos de las instalaciones del Cinvestav donde todos los protocolos correspondientes de cuidado y manejo de animales de experimentación fueron aprobados por el comité correspondiente.
- Inducción de la inflamación pulmonar y administración de inhibidores de ADAM17. Los ratones fueron anestesiados administrando por vía intraperitoneal 200 mg/kg de ketamina (Anesket, PISA, México) y 10 mg/kg de xilazina (Procin, PISA, Mex); las tráqueas se expusieron quirúrgicamente haciendo una incisión de 1 cm en la piel del animal. Posteriormente se insertó cuidadosamente una aguja 31G estéril para la administración de una solución de 10 mg/kg de Poli l:C (Invivogen, San Diego) /15 pg del fragmento RBD de la proteína Spike del virus SARS-CoV2 (RBD-spike) en un volumen final de 60 pL de solución salina fisiológica libre de endotoxinas, seguido de 100 pL de aire, para la distribución de dicha solución en los pulmones. El control se realizó en ratones manejados de la misma manera, pero administrando únicamente solución salina fisiológica. Posteriormente, se suturaron las heridas y se dejó que los ratones se recuperaran en jaulas. Los pulmones de los ratones bajo ensayo se recolectaron después de 24 h para analizar la inflamación causada por la solución Poli l:C / fragmento RBD-spike SARS-CoV-2. Los inhibidores de ADAM17, Apratastat y TMI-1 (Sigma Aldrich/Merck, Missouri), se administraron por vía intraperitoneal a las 4h después de la cirugía, donde en ambos casos se empleó una concentración de 10 mg/kg (Ford, et.al., 2013; Zhang, et.al., 2004). Apratastat fue administrado a las 4 h y 18 h después de la cirugía, mientras que TMI-1 se administró solo una vez después de las 4 h. Después de 24 h de la inducción de la inflamación pulmonar, se recolectaron muestras de sangre, lavado broncoalveolar y pulmón.
La secuencia de aminoácidos de la región RBD de la proteína Spike del virus SARS-CoV-2 empleada en la presente invención fue EGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGY (SEQ.ID.No.l) (Othman y col., 2020). Conforme a la presente invención, nuestro modelo experimental de inducción de inflamación pulmonar está basado en lo descrito por Gu y col. (Gu, et.al., 2020) y Gan y col. (Gan, et.al., 2020), quienes describen que la aplicación intratraqueal de polyl:C induce inflamación pulmonar, mientras que la combinación polyl:C / Proteína Spike de SARS-CoV-2, agrava esta inflamación con signos clínicos similares al daño pulmonar agudo observado en pacientes con la COVID-19. PolykC es un ARN de doble cadena rico en uracilos el cual es capaz de activar el receptorTLR3, desencadenando así una respuesta inflamatoria similar a una infección viral.
Previamente, este compuesto se administró por vía intratraqueal para simular un modelo de influenza A en ratones C57BL/6 (Stowell, et.al., 2009), mientras que estudios posteriores demostraron que su administración intratraqueal induce la expresión de citocinas (IL-6, IL-12, and INF-a) acompañadas de un incremento de neutrófilos y macrófagos en la zona afectada, efecto muy similar a lo reportado para la infección causada por el virus SARS-CoV (Lu, et.al., 2011; Harris, et.al., 2013). Por lo anterior, optamos por este modelo para simular la infección causada por el virus SARS- CoV-2.
- Histología. Después de obtener la sangre por punción cardíaca de los ratones bajo ensayo, se realizó una perfusión transcardiaca con 20 ml de PBS o con la cantidad necesaria hasta que los pulmones se volvieran blancos (libre de sangre). Se cortó el pulmón derecho y se fijó en formalina al 4%. A continuación, las muestras de pulmón obtenidas se deshidrataron y se incluyeron en parafina, las cuales se cortaron en láminas de 4 pm utilizando Microtome y posteriormente se tiñeron con hematoxilina y eosina. Finalmente, un patólogo capacitado realizó el análisis de las muestras para determinar el grado de inflamación y el daño pulmonar generado. El estudio se efectuó de manera ciega.
- Lavado broncoalveolar. La obtención del lavado broncoalveolar (LBA) se realizó de acuerdo con el procedimiento estándar (Sun, et.al., 2017). Cuidadosamente se retiró la caja torácica y se insertó una cánula de plástico en la tráquea y se utilizaron 0.8 mi de PBS para lavar el área broncoalveolar 3 veces, repitiéndose dicho lavado 4 veces. El LBA recuperado se empleó para ensayos posteriores de detección de citocinas y citometría de flujo.
- Digestión del tejido pulmonar. El pulmón izquierdo fue recolectado en microtubo de 1.5 mi, al cual se añadieron 200 unidades de colagenasa (Sigma Aldrich, Missouri), 0.9 mM de calcio y magnesio en un volumen final de 1 mL de PBS previamente calentado. El tejido se seccionó en pedazos con tijeras estériles afiladas. Se hizo un pequeño orificio en la tapa de los microtubos para prevenir la hipoxia y se incubó a 37°C en un baño de agua. Las muestras se agitaron con vórtex cada 20 minutos, donde al paso de 40 minutos se realizó una homogenización del tejido por pipeteo. 1 h después, la suspensión celular se filtró usando un strainer de 40 pm (Corning, New York) y se lavó con 5 ml de PBS a 4°C. A continuación, las células se centrifugaron a 180 g durante 5 min y se resuspendieron en 1 mi de PBS a 4°C para su uso posterior.
- Citometría de flujo. Las células de sangre y pulmón fueron teñidas empleando anticuerpos específicos para neutrófilos, macrófagos y linfocitos Brevemente, las células se bloquearon con TruStain FcX (Biolegend, California) anti-ratón por 15 min. Posteriormente, se tiñeron con anti-CD45 de ratón acoplado a Pacific Blue (leucocitos totales), Ly6G-APCCy7 anti-ratón (neutrófilos), FITC antiratón F4/80 (macrófagos) y CD3-PE anti-ratón (linfocitos T) durante 15 min. Las muestras se leyeron en un equipo FASCCanto II (BD, East Rutherford, Nueva Jersey), mientras que los datos obtenidos fueron analizados en el software FlowJo VIO (BD, Nueva Jersey).
- Aislamiento de ARN, síntesis de ADNc y RT-PCR tiempo real. El ARN total se aisló y se purificó del tejido pulmonar de los ratones bajo ensayo utilizando la técnica del Trizol (Invitrogen, California), siguiendo las especificaciones del fabricante. El ADNc codificante para ICAM 1 se obtuvo mediante transcripción reversa del ARN purificado usando el kit de síntesis de cDNA First Strand (Thermofisher, Massachusetts) y utilizando los siguientes oligonucleótidos:
Delantero 5'-CAATTTCTCATGCCGCACAG -3' (SEQ.ID.No.2) Reverso 5'-GCCTGAAAGCTAGAAGGTCAG-3’ (SEQ.ID.No.3) - Análisis estadístico. Los datos mostrados corresponden a la media ± el error estándar (n = número de ratones). Se realizaron pruebas paramétricas de ANOVA seguido de un post hoc de Dunnett para la comparación de los grupos. Las pruebas estadísticas se realizaron utilizando el programa GraphPad Prism versión 6 (San Diego, California). Se consideró estadísticamente significativa una p < 0.05.
Ejemplo 2. La inhibición de ADAM 17 reduce la lesión pulmonar causada por la instilación intratraqueal de Polyl:C/ RBD-spike SARS-CoV-2. Para inducir una inflamación pulmonar aguda similar a lo observado en los pacientes con la COVID-19, administramos por vía intratraqueal una combinación de PolykC/ RBD-spike SARS-CoV-2 en ratones jóvenes C57BL/6, lo que provocó una inflamación pulmonar masiva caracterizada por infiltración de leucocitos que condujo a un engrosamiento intersticial, cierre de espacios alveolares y fibrosis (Figura 2). En gran contraste, los tejidos pulmonares de los ratones que recibieron tratamiento con los inhibidores de ADAM17 (apratastat y TMI-1) sufrieron solo daños leves con una arquitectura pulmonar mejor conservada (Figura 2).
Ejemplo 3. La infiltración de neutrófilos en el pulmón causados por PolikC /RBD-spike SARS-CoV-2 se atenúa con los inhibidores de ADAM17. En los pulmones durante una inflamación pulmonar aguda, los neutrófilos son los primeros en reclutarse, los cuales fueron determinados mediante citometría de flujo. Los ratones tratados únicamente con el vehículo tenían una mayor infiltración de neutrófilos en el pulmón en comparación al grupo control y a los grupos tratados con apratastat y TMI-1 (Figura 3A). Esto evidencia que el bloqueo de la actividad de ADAM17 limita el proceso inflamatorio. También determinamos los niveles de macrófagos en dichas muestras, donde observamos un ligero aumento en sus niveles en los ratones con el vehículo, sin embargo, no fue una diferencia considerada como significativa (Figura 3B). En el caso de los linfocitos T, claramente observamos una reducción en todos los grupos comparado con el grupo control (Figura 3C).
Por su parte, las áreas broncoalveolares de los pulmones de los ratones tratados con PolikC /RBD- spike SARS-CoV-2 se infiltraron masivamente con leucocitos (Figura 3D y 3E); de manera similar en el lavado bloncoalveolar (LBA) se encontró un incremento tanto de macrófagos como de neutrófilos en el grupo tratado con el vehículo (Figura 3F). Finalmente, se encontraron niveles más altos de linfocitos T en el LBA de los ratones tratados con vehículo, pero estos disminuyeron con la administración de apratastat y TMI-1.
Ejemplo 4. La expresión génica de ICAM-1 en el tejido pulmonar afectado por PolikC /RBD-spike SARS-CoV-2 disminuye por la inhibición de ADAM17. El reclutamiento y la transmigración de los leucocitos a través del endotelio vascular está vinculada a la expresión de las moléculas de adhesión (Schnoor, et.al., 2015). El endotelio activado expresa altos niveles de estas proteínas en su superficie apical promoviendo la unión y transmigración de los leucocitos. La proteína ICAM-1 es un ligando para la integrina (32 que se encuentra en la superficie del endotelio y media la adhesión y transmigración de los leucocitos. De acuerdo con nuestros hallazgos en ratones administrados con PolikC /RBD-spike SARS-CoV-2 que demuestran un incremento en el reclutamiento de los neutrófilos en los pulmones, observamos una mayor expresión génica del ARNm de ICAM-1 en dichas muestras, sin embargo, esta expresión disminuyó de manera significativa en presencia de los inhibidores de ADAM17 (Figura 4).
Ejemplo 5. Los inhibidores de ADAM17 revierten la neutrofilia causada por la inflamación pulmonar inducida por PolikC /RBD-spike SARS-CoV-2. La inflamación pulmonar inducida por PolikC /RBD- spike SARS-CoV-2 provocó neutrofilia y una marcada linfopenia en sangre periférica (Figura 5A y 5B), coincidiendo con la misma condición reportada en pacientes diagnosticados con la COVID-19. Como puede observarse en la figura 5, estos efectos se redujeron significativamente tras la inhibición de ADAM17 con apratastat y TMI-1. Ejemplo 6. La administración intranasal del inhibidor ADAM17 también previene la inflamación pulmonar severa inducida por Polil:C /RBD-spike SARS-CoV-2. La administración intranasal de los inhibidores de ADAM17 mediante aerosoles permitirían una disponibilidad y rápida acción en la zona afectada, además de evitar un efecto generalizado. Considerando que es más clínicamente relevante esta vía de administración, decidimos evaluarla en el laboratorio. Como puede observarse en la figura 6, la administración de apratastat vía intranasal redujo el reclutamiento de neutrófilos pulmonares a niveles cercanos a los ratones control (Figura 6A), mientras que la linfopenia en el caso del grupo de apratastat tiende a recuperarse, efecto similar a lo observado en los ratones tratados con la vía intraperitoneal (Figura 6B). Por su parte, las células totales del LBA, así como los leucocitos y linfocitos T se redujeron en los ratones tratados con apratastat en comparación con el vehículo (Figura 6C, 6D y 6F). No se observaron diferencias en el recuento de neutrófilos en el LBA del vehículo comparado con el grupo de apratastat (Figura 6E), mientras que los neutrófilos en sangre (%) se elevaron a un nivel similar por encima del control en ambos grupos (Figura 6G). Finalmente, el porcentaje de linfocitos T también se redujo en los grupos tratados con el vehículo como en los tratados con apratastat (Figura 6H).
Ejemplo 7. La administración intranasal de apratastat reduce la expresión de ICAM-1 en células endoteliales pulmonares inducidas por la administración de Polil:C/RBD-spike SARS-CoV-2. En nuestro modelo murino de inflamación pulmonar inducida por Polil:C/RBD-spike SARS-CoV-2, se incrementa la expresión superficial de ICAM-1 en las células endoteliales pulmonares, permitiendo la infiltración de leucocitos. Sin embargo, tras la administración de apratastat, la expresión de la proteína ICAM-1 en las células endoteliales se redujo a niveles casi normales (Figura 7A, 7B y 7C), situación que se ve reflejada en la disminución de la infiltración de neutrófilos en los pulmones.
Como puede observarse de lo anterior, la presente invención representa una alternativa terapéutica eficiente para el tratamiento de la COVID-19 y del síndrome respiratorio agudo severo (SARS).
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Claims

Reivindicaciones.
1. Un compuesto inhibidor de la enzima ADAM17, para usarse en el tratamiento efectivo de la COVID-19.
2. El compuesto para usarse de conformidad con la reivindicación 1, donde dicho compuesto inhibidor de la enzima ADAM17 se selecciona del grupo que comprende:
- El compuesto de fórmula I:
Figure imgf000019_0001
- El compuesto de fórmula II:
Figure imgf000019_0002
- El compuesto de fórmula III:
Figure imgf000019_0003
- El compuesto de fórmula IV:
Figure imgf000019_0004
- El compuesto de fórmula V:
Figure imgf000019_0005
sus sales farmacéuticamente aceptables, y mezclas de los mismos.
3. El compuesto para usarse de conformidad con la reivindicación 2, donde dicho compuesto inhibidor de la enzima ADAM17 es:
- El compuesto de fórmula I:
Figure imgf000020_0001
- El compuesto de fórmula II:
Figure imgf000020_0002
sus sales farmacéuticamente aceptables, y mezclas de los mismos.
4. El compuesto inhibidor de la enzima ADAM17 para usarse de conformidad con la reivindicación 1 a 3, donde dicho compuesto es administradle a una concentración de 1 a 20 mg/Kg de peso.
5. El compuesto inhibidor de la enzima ADAM17 para usarse de conformidad con la reivindicación 4, donde dicho compuesto es administradle a una concentración de 10 a 20 mg/Kg de peso.
6. El compuesto inhibidor de la enzima ADAM17 para usarse de conformidad con la reivindicación 1 a 5, donde dicho compuesto es administradle vía parenteral o vía nasal.
7. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto inhibidor de la enzima ADAM17 y un vehículo farmacéuticamente aceptable, para usarse en el tratamiento efectivo de la COVID- 19.
8. La composición farmacéutica que comprende un compuesto inhibidor de la enzima ADAM17 para usarse de conformidad con la reivindicación 7, donde dicho compuesto inhibidor de ADAM17 se selecciona del grupo que comprende:
- El compuesto de fórmula I:
Figure imgf000020_0003
- El compuesto de fórmula II:
Figure imgf000020_0004
- El compuesto de fórmula III:
Figure imgf000020_0005
- El compuesto de fórmula IV:
Figure imgf000021_0001
- El compuesto de fórmula V:
Figure imgf000021_0002
sus sales farmacéuticamente aceptables, y mezclas de los mismos.
9. La composición farmacéutica que comprende un compuesto inhibidor de la enzima ADAM17 para usarse de conformidad con la reivindicación 8, donde dicho compuesto es:
- El compuesto de fórmula I:
Figure imgf000021_0003
- El compuesto de fórmula II:
Figure imgf000021_0004
sus sales farmacéuticamente aceptables, y mezclas de los mismos.
10. La composición farmacéutica que comprende un compuesto inhibidor de la enzima ADAM17 para usarse de conformidad con la reivindicación 7 a 9, donde mediante dicha composición es administradle dicho compuesto inhibidor de la enzima ADAM17 a una concentración de 1 a 20 mg/Kg de peso.
11. La composición farmacéutica que comprende un compuesto inhibidor de la enzima ADAM17 para usarse de conformidad con la reivindicación 10, donde mediante dicha composición es administradle dicho compuesto inhibidor de la enzima ADAM17 a una concentración de 10 a 20 mg/Kg de peso.
12. La composición farmacéutica que comprende un compuesto inhibidor de la enzima ADAM17 para usarse de conformidad con la reivindicación 7 a 12, donde dicha composición es administradle vía parenteral o vía nasal.
13. Una composición farmacéutica de administración nasal que comprende un compuesto inhibidor de la enzima ADAM17 y un vehículo farmacéuticamente aceptable, para usarse en el tratamiento efectivo de la COVID-19.
14. La composición farmacéutica de administración nasal que comprende un compuesto inhibidor de la enzima ADAM17 para usarse de conformidad con la reivindicación 13, donde dicho compuesto inhibidor de ADAM17 se selecciona del grupo que comprende:
- El compuesto de fórmula I:
Figure imgf000022_0001
- El compuesto de fórmula II:
Figure imgf000022_0002
- El compuesto de fórmula III:
Figure imgf000022_0003
- El compuesto de fórmula IV:
Figure imgf000022_0004
- El compuesto de fórmula V:
Figure imgf000022_0005
sus sales farmacéuticamente aceptables, y mezclas de los mismos. La composición farmacéutica de administración nasal que comprende un compuesto inhibidor de la enzima ADAM17 para usarse de conformidad con la reivindicación 14, donde dicho compuesto es:
- El compuesto de fórmula I:
Figure imgf000022_0006
- El compuesto de fórmula II:
Figure imgf000023_0001
sus sales farmacéuticamente aceptables, y mezclas de los mismos. La composición farmacéutica de administración nasal que comprende un compuesto inhibidor de la enzima ADAM17 para usarse de conformidad con la reivindicación 13 a 15, donde mediante dicha composición es administradle vía nasal dicho compuesto inhibidor de la enzima ADAM17 a una concentración de 1 a 20 mg/Kg de peso. La composición farmacéutica de administración nasal que comprende un compuesto inhibidor de la enzima ADAM17 para usarse de conformidad con la reivindicación 16, donde mediante dicha composición es administradle vía nasal dicho compuesto inhibidor de la enzima ADAM17 a una concentración de 10 a 20 mg/Kg de peso. Un compuesto inhibidor de la enzima ADAM17, para usarse en el tratamiento efectivo del síndrome respiratorio agudo severo (SARS). El compuesto para usarse de conformidad con la reivindicación 18, donde dicho compuesto inhibidor de la enzima ADAM17 se selecciona del grupo que comprende:
- El compuesto de fórmula I:
Figure imgf000023_0002
- El compuesto de fórmula II:
Figure imgf000023_0003
- El compuesto de fórmula III:
Figure imgf000023_0004
- El compuesto de fórmula V: 22
Figure imgf000024_0001
sus sales farmacéuticamente aceptables, y mezclas de los mismos.
20. El compuesto para usarse de conformidad con la reivindicación 19, donde dicho compuesto inhibidor de la enzima ADAM17 es:
- El compuesto de fórmula I:
Figure imgf000024_0002
- El compuesto de fórmula II:
Figure imgf000024_0003
sus sales farmacéuticamente aceptables, y mezclas de los mismos.
21. El compuesto inhibidor de la enzima ADAM17 para usarse de conformidad con la reivindicación 18 a 20, donde dicho compuesto es administradle a una concentración de 1 a 20 mg/Kg de peso.
22. El compuesto inhibidor de la enzima ADAM17 para usarse de conformidad con la reivindicación 21, donde dicho compuesto es administradle a una concentración de 10 a 20 mg/Kg de peso.
23. El compuesto inhibidor de la enzima ADAM17 para usarse de conformidad con la reivindicación 18 a 22, donde dicho compuesto es administradle vía parenteral o vía nasal.
24. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto inhibidor de la enzima ADAM17 y un vehículo farmacéuticamente aceptable, para usarse en el tratamiento efectivo del síndrome respiratorio agudo severo (SARS).
25. La composición farmacéutica que comprende un compuesto inhibidor de la enzima ADAM17 para usarse de conformidad con la reivindicación 24, donde dicho compuesto inhibidor de ADAM17 se selecciona del grupo que comprende:
- El compuesto de fórmula I:
Figure imgf000024_0004
- El compuesto de fórmula II:
Figure imgf000024_0005
23
El compuesto de fórmula III:
Figure imgf000025_0001
El compuesto de fórmula IV:
Figure imgf000025_0002
- El compuesto de fórmula V:
Figure imgf000025_0003
sus sales farmacéuticamente aceptables, y mezclas de los mismos.
26. La composición farmacéutica que comprende un compuesto inhibidor de la enzima ADAM17 para usarse de conformidad con la reivindicación 25, donde dicho compuesto es:
- El compuesto de fórmula I:
Figure imgf000025_0004
- El compuesto de fórmula II:
Figure imgf000025_0005
sus sales farmacéuticamente aceptables, y mezclas de los mismos.
27. La composición farmacéutica que comprende un compuesto inhibidor de la enzima ADAM17 para usarse de conformidad con la reivindicación 24 a 26, donde mediante dicha composición es administradle dicho compuesto inhibidor de la enzima ADAM17 a una concentración de 1 a 20 mg/Kg de peso.
28. La composición farmacéutica que comprende un compuesto inhibidor de la enzima ADAM17 para usarse de conformidad con la reivindicación 27, donde mediante dicha composición es administradle dicho compuesto inhibidor de la enzima ADAM17 a una concentración de 10 a 20 mg/Kg de peso. La composición farmacéutica que comprende un compuesto inhibidor de la enzima ADAM17 para usarse de conformidad con la reivindicación 24 a 28, donde dicha composición es administradle vía parenteral o vía nasal. Una composición farmacéutica de administración nasal que comprende un compuesto inhibidor de la enzima ADAM17 y un vehículo farmacéuticamente aceptable, para usarse en el tratamiento efectivo del síndrome respiratorio agudo severo (SARS). La composición farmacéutica de administración nasal que comprende un compuesto inhibidor de la enzima ADAM17 para usarse de conformidad con la reivindicación 30, donde dicho compuesto inhibidor de ADAM17 se selecciona del grupo que comprende:
- El compuesto de fórmula I:
Figure imgf000026_0001
El compuesto de fórmula II:
Figure imgf000026_0002
- El compuesto de fórmula III:
Figure imgf000026_0003
- El compuesto de fórmula IV:
Figure imgf000026_0004
- El compuesto de fórmula V:
Figure imgf000026_0005
sus sales farmacéuticamente aceptables, y mezclas de los mismos. La composición farmacéutica de administración nasal que comprende un compuesto inhibidor de la enzima ADAM17 para usarse de conformidad con la reivindicación 31, donde dicho compuesto es: 25
- El compuesto de fórmula I:
Figure imgf000027_0001
- El compuesto de fórmula II:
Figure imgf000027_0002
sus sales farmacéuticamente aceptables, y mezclas de los mismos.
33. La composición farmacéutica de administración nasal que comprende un compuesto inhibidor de la enzima ADAM17 para usarse de conformidad con la reivindicación 30 a 32, donde mediante dicha composición es administradle vía nasal dicho compuesto inhibidor de la enzima ADAM17 a una concentración de 1 a 20 mg/Kg de peso.
34. La composición farmacéutica de administración nasal que comprende un compuesto inhibidor de la enzima ADAM17 para usarse de conformidad con la reivindicación 33, donde mediante dicha composición es administradle vía nasal dicho compuesto inhibidor de la enzima ADAM17 a una concentración de 10 a 20 mg/Kg de peso.
35. Un método para el tratamiento efectivo de la COVID-19, que comprende administrar a un paciente afectado por dicha enfermedad un compuesto inhibidor de la enzima ADAM17.
36. El método para el tratamiento efectivo de la COVID-19 de conformidad con la reivindicación 35, donde dicho compuesto inhibidor de la enzima ADAM17 se selecciona del grupo que comprende:
- El compuesto de fórmula I:
Figure imgf000027_0003
- El compuesto de fórmula II:
Figure imgf000027_0004
- El compuesto de fórmula III:
Figure imgf000027_0005
- El compuesto de fórmula IV:
Figure imgf000028_0001
- El compuesto de fórmula V:
Figure imgf000028_0002
sus sales farmacéuticamente aceptables, y mezclas de los mismos.
37. El método para el tratamiento efectivo de la COVID-19 de conformidad con la reivindicación 36, donde dicho compuesto inhibidor de la enzima ADAM17 es:
- El compuesto de fórmula I:
Figure imgf000028_0003
- El compuesto de fórmula II:
Figure imgf000028_0004
sus sales farmacéuticamente aceptables, y mezclas de los mismos.
38. El método para el tratamiento efectivo de la COVID-19 de conformidad con la reivindicación 35 a 37, donde dicho compuesto inhibidor de la enzima ADAM17 se administra al paciente afectado a una concentración de 1 a 20 mg/Kg de peso.
39. El método para el tratamiento efectivo de la COVID-19 de conformidad con la reivindicación 38, donde dicho compuesto inhibidor de la enzima ADAM17 se administra al paciente afectado a una concentración de 10 a 20 mg/Kg de peso.
40. El método para el tratamiento efectivo de la COVID-19 de conformidad con la reivindicación 35 a 39, donde dicho compuesto inhibidor de la enzima ADAM17 se administra por vía parenteral o vía nasal al paciente afectado.
41. Un método para el tratamiento efectivo del síndrome respiratorio agudo severo (SARS), que comprende administrar a un paciente afectado por dicho síndrome un compuesto inhibidor de la enzima ADAM17.
42. El método para el tratamiento efectivo del síndrome respiratorio agudo severo (SARS) de conformidad con la reivindicación 41, donde dicho compuesto inhibidor de la enzima ADAM17 se selecciona del grupo que comprende:
- El compuesto de fórmula I: 27
Figure imgf000029_0001
- El compuesto de fórmula II:
Figure imgf000029_0002
- El compuesto de fórmula III:
Figure imgf000029_0003
- El compuesto de fórmula IV:
Figure imgf000029_0004
- El compuesto de fórmula V:
Figure imgf000029_0005
sus sales farmacéuticamente aceptables, y mezclas de los mismos. El método para el tratamiento efectivo del síndrome respiratorio agudo severo (SARS) de conformidad con la reivindicación 42, donde dicho compuesto inhibidor de la enzima ADAM17 es:
- El compuesto de fórmula I:
Figure imgf000029_0006
- El compuesto de fórmula II:
Figure imgf000030_0001
sus sales farmacéuticamente aceptables, y mezclas de los mismos.
44. El método para el tratamiento efectivo del síndrome respiratorio agudo severo (SARS) de conformidad con la reivindicación 41 a 43, donde dicho compuesto inhibidor de la enzima ADAM17 se administra al paciente afectado a una concentración de 1 a 20 mg/Kg de peso.
45. El método para el tratamiento efectivo del síndrome respiratorio agudo severo (SARS) de conformidad con la reivindicación 44, donde dicho compuesto inhibidor de la enzima ADAM17 se administra al paciente afectado a una concentración de 10 a 20 mg/Kg de peso.
46. El método para el tratamiento efectivo del síndrome respiratorio agudo severo (SARS) de conformidad con la reivindicación 41 a 45, donde dicho compuesto inhibidor de la enzima ADAM17 se administra por vía parenteral o vía nasal al paciente afectado.
47. Un método para obtener un modelo animal para el estudio de la COVID-19 y el síndrome respiratorio agudo severo (SARS), caracterizado porque comprende el paso de administrar al animal vía intratraqueal una composición que comprende PolikC y el fragmento RBD de la proteína Spike del virus SARS-CoV-2 con la SEQ.ID.No.l.
48. El método para obtener un modelo animal para el estudio de la COVID-19 y el síndrome respiratorio agudo severo (SARS) de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado porque PolikC se encuentra en una concentración de 10 mg/kg y el fragmento RBD de la proteína Spike del virus SARS-CoV-2 15 se encuentra en una concentración de 15 pg.
49. El método para obtener un modelo animal para el estudio de la COVID-19 y el síndrome respiratorio agudo severo (SARS) de conformidad con la reivindicación 47 y 48, caracterizado porque el modelo animal es murino.
50. El método para obtener un modelo animal para el estudio de la COVID-19 y el síndrome respiratorio agudo severo (SARS) de conformidad con la reivindicación 49, caracterizado porque el modelo murino es ratón de la cepa C57BL/6.
51. El uso de un compuesto inhibidor de la enzima ADAM17, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento efectivo de la COVID-19.
52. El uso de un compuesto inhibidor de la enzima ADAM17 de conformidad con la reivindicación 51, donde dicho compuesto inhibidor de la enzima ADAM17 se selecciona del grupo que comprende:
- El compuesto de fórmula I:
Figure imgf000030_0002
- El compuesto de fórmula II:
Figure imgf000030_0003
- El compuesto de fórmula III: 29
Figure imgf000031_0001
- El compuesto de fórmula IV:
Figure imgf000031_0002
- El compuesto de fórmula V:
Figure imgf000031_0003
sus sales farmacéuticamente aceptables, y mezclas de los mismos.
53. El uso de un compuesto inhibidor de la enzima ADAM17 de conformidad con la reivindicación 52, donde dicho compuesto inhibidor de la enzima ADAM17 es:
- El compuesto de fórmula I:
Figure imgf000031_0004
- El compuesto de fórmula II:
Figure imgf000031_0005
sus sales farmacéuticamente aceptables, y mezclas de los mismos.
54. El uso de un compuesto inhibidor de la enzima ADAM17 de conformidad con la reivindicación
51 a 53, donde dicho compuesto es administradle a una concentración de 1 a 20 mg/Kg de peso.
55. El uso de un compuesto inhibidor de la enzima ADAM17 de conformidad con la reivindicación
54, donde dicho compuesto es administradle a una concentración de 10 a 20 mg/Kg de peso.
56. El uso de un compuesto inhibidor de la enzima ADAM17 de conformidad con la reivindicación
51 a 55, donde dicho compuesto es administradle vía parenteral o vía nasal.
57. El uso de un compuesto inhibidor de la enzima ADAM17 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento efectivo del síndrome respiratorio agudo severo (SARS).
58. El uso de un compuesto inhibidor de la enzima ADAM17 de conformidad con la reivindicación
57, donde dicho compuesto inhibidor de la enzima ADAM17 se selecciona del grupo que comprende:
- El compuesto de fórmula I:
Figure imgf000032_0001
- El compuesto de fórmula II:
Figure imgf000032_0002
- El compuesto de fórmula III:
Figure imgf000032_0003
- El compuesto de fórmula IV:
Figure imgf000032_0004
- El compuesto de fórmula V:
Figure imgf000032_0005
sus sales farmacéuticamente aceptables, y mezclas de los mismos. 59. El uso de un compuesto inhibidor de la enzima ADAM17 de conformidad con la reivindicación 58, donde dicho compuesto inhibidor de la enzima ADAM17 es:
- El compuesto de fórmula I:
Figure imgf000032_0006
- El compuesto de fórmula II:
Figure imgf000033_0001
sus sales farmacéuticamente aceptables, y mezclas de los mismos. El uso de un compuesto inhibidor de la enzima ADAM17 de conformidad con la reivindicación
57 a 59, donde dicho compuesto es administradle a una concentración de 1 a 20 mg/Kg de peso. El uso de un compuesto inhibidor de la enzima ADAM17 de conformidad con la reivindicación
60, donde dicho compuesto es administradle a una concentración de 10 a 20 mg/Kg de peso. El uso de un compuesto inhibidor de la enzima ADAM17 de conformidad con la reivindicación
57 a 61, donde dicho compuesto es administradle vía parenteral o vía nasal.
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