JP2010155831A - アレルギー症状の予防および/または治療 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】システインプロテイナーゼ活性の阻害剤と、トリプシン以外のセリンプロテイナーゼ活性の阻害剤との組み合わせてなる使用。また、セリンおよびシステインプロテイナーゼ阻害剤を含有する処方およびキットも包含し、アレルゲンが上皮障壁を通過する症状の治療または予防におけるその使用も包含する。
【選択図】なし
Description
喘息について特に危険な因子は、肺の、デルマトファゴイデス(Dermatophagoides)属(例えば、デルマトファゴイデス・プテロニシヌス(D.pteronyssinus)、デルマトファゴイデス・ファリナエ(D.Farinae))に属するヒョウヒダニ(house dust mite)(HDM)の糞粒中に排泄される蛋白などの空気系アレルゲンに対する感作である。HDM糞粒が吸入されると、それは径の大きな気道の流体で覆われている上皮表面と衝突する。その結果、HDM糞粒が水和され、主たるアレルゲン性蛋白の急速かつ全体的な放出が起こり、その気道上に局所的な高濃度のHDM蛋白が生じる。感作は、通常、肺上皮細胞により外界より保護されている抗原提示細胞がアレルゲンを検出することと関連している。アレルゲンが上皮障壁を通過しうる機構は十分に理解されていない。
ダニアレルゲンのプロテイナーゼ活性に関するデータの大部分は、一般に、デルマトファゴイデス属のダニ由来の群1、3、6および9のデータに関するものである。群1のアレルゲンはシステインプロテイナーゼであり、最も詳しく調査されている対象であるのに対して、原型的なセリンプロテイナーゼと配列同一性を共有し、それ自身が触媒能力を有する、群3、群6および群9のアレルゲンの酵素的作用に関する情報はあまりない。
本発明は、阻害されるべきシステインプロテイナーゼ活性がDer p1のものであるのが好ましいのに対して、阻害されるべきセリンプロテイナーゼ活性がトリプシン以外のセリンプロテイナーゼのもの、好ましくはアレルゲンセリンプロテイナーゼ、さらに好ましくはDer p3、Der p6および/またはDer p9のものであってもよい、喘息の治療に、特に(排除するものではないが)使用することができる。
アレルギー症状の治療および/または予防は、以下の手段:
(i)システインおよびセリンプロテイナーゼ阻害剤活性を有する処方(本発明の第2の態様を提供する);または
(ii)システインプロテイナーゼ活性の阻害剤およびセリンプロテイナーゼ活性の阻害剤を含むキット(本発明の第3の態様を提要する)
により行うことができる。
別々の阻害剤化合物を本発明の第3の態様のキットにて用いる場合、それらの化合物は相互に同時にまたは連続的に用いることができる。
要すれば、1以上の型のシステインプロテイナーゼ活性およひ/または1以上の型のセリンプロテアーゼ活性を用いて所望の範囲にある活性を得ることができる。
したがって、本発明の第4の態様によれば、アレルゲンが上皮障壁を通過する症状の予防または治療用の医薬を製造するための、トリプシン以外のセリンプロテイナーゼ活性の阻害剤と組み合わせたシステインプロテイナーゼ活性の阻害剤の使用を提供する。
本発明の第5の態様によれば、アレルゲンが上皮障壁を通過する症状を予防または治療するための対象の治療法であって、該対象に治療上有効量のシステインプロテイナーゼ活性の阻害剤およびセリンプロテイナーゼ活性の阻害剤を投与することからなる方法が提供される。
本発明の第4および第5の態様は、喘息の治療に、より詳細にはその予防的処置に用いることができる。予防的処置なる語は、本発明者らによれば、その後の喘息発作の作用を防止または緩和するのに用いられるいずれの処理も包含する。その予防的処置は、例えば、喘息の発作を予防あるいはその頻度を減少させる観点から、喘息を患っていることがわかっているヒトに定期的に行うことができる。また、予防的処置は、喘息を患っており、喘息発作を発病する可能性がより高い環境(例えば、アレルゲン感染環境)に供されているヒトに特別に行うこともできる。さらなる可能性は、喘息を発病していないが、ある理由または別の理由のため、喘息を発病する危険性が高いと思われるヒトに行う予防的処置についてのものである。
阻害剤化合物の投与量は、もちろん、治療上効果的な量である。その投与量は治療すべき患者の体重、治療すべき喘息症状の重度、および阻害剤の活性などの因子に依存する。しかし、典型的な量は1ないし1000μg/日の範囲にある。
本発明のいずれかの態様に用いることのできるセリンプロテイナーゼ活性の阻害剤の例は、4-(2-アミノエチル)ベンゼンスルホニルフルオリド塩酸塩(AEBSF)を包含する。
本発明を以下の限定するものではない実施例(および実施例の結果を示す添付図面)を用いて説明する。
(i)ヒョウヒダニより分離したシステインおよびセリンプロテイナーゼフラクション、および
(ii)システインおよびセリンプロテイナーゼ活性の阻害剤と組み合わせた(i)で特定されるフラクション
の上皮透過性に対する作用を明らかにするものである。
細胞培養
典型例として、Calu−3およびMDCK細胞を、上皮の細胞間結合およびそのHDMプロテイナーゼに対する感受性および阻害剤の可能性を試験するのに使用した。両方の細胞系は共に密な結合、毛様小帯付着体およびデスモソームを発現し、かくしてそれらは共に気道にて生じる細胞付着機構を実験するための許容されるモデルである。Calu−3は25歳齢のカフカス地方の男性より由来の腺癌細胞系である。それは電気生理学の研究(Shenら、1994;Hawsら、1994)および本発明者ら自身の免疫細胞化学的特徴付け(特定せず)に基づき、密な障壁特性を発現することが知られているが、比較的あまり研究されていないものを対象とする。10%v/vの熱不活性化ウシ胎児血清(FCS)、2mM L−グルタミン、非必須アミノ酸、10μM ピルビン酸ナトリウムを補足し、50U/mlのペニシリンおよび50μg/mlのストレプトマイシンを含有する、アール(Earle's)塩を含むイーグル最小必須培地(Eagle's minimum essential medium)(EMEM)で細胞を増殖させる。
培養物はすべて、37℃で空気中5%二酸化炭素の湿った環境下で繁殖させた。
マンニトールクリアランスの測定を、非ゲル状のマトリゲルを超薄く下塗りして被覆した0.4μmの孔径のコスター・トランスウェルTMインサート(Coster TranswellTM insert)上で繁殖させた、集密状態の細胞の単層上で行った。被覆は、250μlのアリコートのマトリゲル(EMEM中に1:500v/vに希釈)をインサートの内部に添加し、つづいて無菌状態下に60分間室温でインキュベートすることで行った。ついで溶液を吸引し、集密密度の細胞懸濁液を添加する前に、インサートをゆっくりと培地で洗浄した。
細胞(2−5x105個/cm2成長域)をマトリゲル被覆インサート上に置いた。本発明者らは、「インサート」なる語を細胞を含有するフィルターユニットを意味するものとして使用し、「ウェル」なる語を組織培養プレートのキャビティを言うものとする。成長および一体性をモニターするために、インサートを無作為に取り、PBS中にゆっくりと洗浄し、アクリジンオレンジおよび臭化エチジウム(PBS中、各々、1mg/ml)を用いて緩やかな照明下で染色させた。インサートを蛍光顕微鏡測定法により試験し、高い生存率の集密が得られた場合にだけ使用した。
マンニトールのパラ細胞透過性を本発明者らの現在継続している英国特許出願番号9715058に記載の操作にしたがって測定し、所定の時点でクリアランス容量の測定値より計算した。クリアランス評価は3ないし5時間にわたって行い、以下の関係式にしたがって計算する。
式中:
VProbetは各時点でのクリアランス容量であり、
VAiは各時点でのアブルミナル(abluminal)容量であり、
Δ[A]iは時点間のトレーサー濃度の増加量であり、
[L]iは各時点でのルミナルトレーサー濃度を意味する。
および
Ptは系の組成透過性であり、
P1は上皮細胞単独による成分であり、
P2はマトリゲルを含まないフィルターによる成分であり、
P3は非攪拌層の成分であり、
P4はマトリゲルを被覆したフィルターの透過性である。
HDMプロテイナーゼアレルゲンは、これまで、成熟酵素蛋白を組換え細胞発現させることで触媒上反応能を有する形態にて調製されたことはない。将来の触媒上活性な組換え蛋白がなくても潜在的な阻害剤を大規模にスクリーニングできるように、本発明者らは、HMDを増殖させた消費培地を簡単な生化学分画に付すことでシステインおよびセリンプロテイナーゼ活性を分離しようと試みた。培養している間、HDMはアレルゲンを培地に放出し、その結果、精製するのに適する蛋白が蓄積した。デルマトファゴイデス・プテロニシヌス(オーストラリア、パークビル、コモンウェルス・セラム・ラボラトリー)の培養基からの消費培地を5倍容量のリン酸塩緩衝セイラインに溶かし、ついで48400xgで4℃で20分間遠心分離に付した。硫酸アンモニウムをその攪拌上清に4℃で徐々に加えて50%の飽和溶液を得た。遠心分離(48400xg、20分、4℃)に付した後、酵素アッセイにより、システインプロテイナーゼ活性に富むとわかったペレットを最小容量の蒸留水に再び溶かした。最初に分離したものの上清に硫酸アンモニウムを加えて80%の飽和溶液を得た。さらに遠心分離に付して得られたペレットはセリンプロテイナーゼ活性に富むことがわかり、最小量の蒸留水に再び懸濁させた。システインプロテイナーゼ(50%沈降物)およびセリンプロテイナーゼ(50−80%沈降物)フラクションを別々に一夜にわたって蒸留水に対して透析し、ついで凍結乾燥させ、つづいてEMEM中に復元させた。抽出物の蛋白含量を、血清アルブミンを標体とする、クマシーブルー技法を用いて測定した(Smithら、1985)。プロテイナーゼ活性はアゾコール(Azocoll)分解アッセイ(Herbertら、1995;Chaviraら、1984)を用いて測定した。抽出物をさらにリムラス(Limulus)遊走細胞溶解アッセイを用いてエンドトキシンの存在についてアッセイした(EndotectTM、ICN Biomedicals、ターム、オックスフォードシャー)。あらゆる場合において、エンドトキシンのレベルはアッセイの検出限界よりも下にあった(<0.06ng/ml)。
プロテイナーゼフラクションをSDS−PAGEで分離し、それを電気泳動によりニトロセルロース膜に移した。非特異的蛋白結合をトリス緩衝化セイライン(TBS)中5%w/v脱脂乳および0.1%v/vツゥーン20で遮断し、つづいて2%w/vウシ血清アルブミンおよび0.1%v/vツゥーン20を含有するTBSに希釈したmAb 5H8(抗−Der p1)と一緒にインキュベートした。検出を化学ルミネセンス技法により増強させた(Amersham International、バッキンガムシャー)。
細胞を60x15mmのペトリ皿に入れ、5%CO2環境にある組織培養条件下で血清含有EMEMにて2ないし4日間増殖させた。ついで細胞を、37℃での無菌培養下で、20mM HEPES含有の血清不含EMEMの処置に曝した。所定の時点で、細胞をこすり落して収穫し、懸濁液中にある分離細胞をプールした。細胞を550xgで5分間遠心分離に付し、そのDNAを抽出した(Nucleon、Scotlab、Coatbridge、Stratchclyde)。抽出したDNAを100μlのTE緩衝液(10mM トリス塩酸および1mM Na2EDTA)に室温で一夜再び懸濁させ、その純度を分光測光法により測定した。等量のDNAを試料緩衝液(水中0.25%ブロモフェノールブルーおよび40%w/vシュークロース)と4:1の割合で2%(w/v)アガロースゲルの各レーンに加え、TAE緩衝液(0.04M トリス−酢酸塩および0.001M EDTA)中50Vで2ないし3時間電気泳動を行った。そのゲル中のDNAのバンド(臭化エチジウムをその中に組み入れた)を紫外線光を用いて可視化した。
プロテイナーゼおよび阻害剤の細胞間結合における効果を研究するために、MDCK細胞をカバーグラス上に培養し、適当なプロテイナーゼおよび/または阻害剤で所望の期間処置した。細胞を氷冷メタノールに固定し、ラット抗−ZO−1(mAb R40.76)(Stevensonら、1986;Andersonら、1988)およびマウス抗−デスモプラキン(mAb 11−5F)(Parrishら、1987)を結合させた。間接的蛍光抗体染色は、FITC−およびTRITC−結合した第2抗体を用いて行った。顕微鏡法をx40倍率の油浸Fluar対物レンズを備えたZeiss Axiovert顕微鏡を用いて行った。試料をFITCおよびTRITC用の励起および放出フィルターを用いて照射した。細胞を上記したように写真撮影した。
特に限定した場合を除いて、培地および細胞培養試薬はすべてICN Biomedicals Ltd(ターム、オックスフォードシャー)より購入した。HBSSはGibcoBRL、Life Technologies Ltd(ペイズリー)より入手した。マンニトールおよびトリトンX−100はSigma−Aldrich Ltd(プール、ドーセット)より入手し、熱不活性化ウシ胎児血清はLabtech International Ltd(ウックフィールド、イースト・サセックス)より入手した。マトリゲルはUniversal Biologicals、ロンドンより入手した。マンニトールクリアランス測定は、0.4μmの膜孔径と10μmの膜厚を有する12mm径のトランスウェル(Costar UK Ltd、ハイウィコム、バッキンガムシャー)で行った。D−[14C]−マンニトールをNEN Du Pont Research Products(スティーヴェネッジ、ハートフォードシャー)より入手し、Opti−FluorシンチラントおよびシンチレーションバイアルはCanberra Packard Ltd(パンボーン、バークシャー)より手に入れた。MDCK細胞は実験室にあるストック溶液で培養した。Calu−3細胞は、初めに、American Type Culture Collection(ロックビル、メリーランド州、米国)より入手し、継代させて増やし、低温保存した細胞のローカルバンクを創製した。細胞を、実験に応じて、75cm2のファルコン細胞培養フラスコ(Marathon Laboratory Supplies、ロンドン)、コースターマルチウェル組織培養プレートまたはトランスウェルインサート中に培養した。アガロース(分子等級)はPromega(サウスアンプトン、ハンプシャー)より入手した。LDH測定用のアッセイキットはSigmaより購入し;ApoalertキットはCambridge Biocscienceより購入した。アクリジンオレンジ、臭化エチジウムおよび他の汎用されている実験室試薬はBDH(プール、ドーセット)より入手した。化合物E−64(L-トランス-エポキシスクシニル-ロイシルアミド-(4-グアニジノ)-ブタン、システインプロテイナーゼの阻害剤は、Sigmaより入手した。濃縮ストック水溶液は必要となるまで凍結保存した。セリンプロテイナーゼ阻害剤である4-(2-アミノエチル)ベンゼンスルホニルフルオリド塩酸塩(AEBSF)はPentapharm、バスル、スイスより手に入れた。マトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)阻害剤BB−250([4-(N-ヒドロキシアミノ)-2R-イソブチル-3S-(チオフェン-2-イル-スルホニルメチル)スクシニル]-L-フェニルアラニン-N-メチルアミド)は、British Biotech Pharmaceuticals Ltdより供給された。阻害剤はすべて乾燥Me2SO中濃縮ストック溶液として製造し、必要な時に、実験で使用する媒体で希釈した。Me2SOビヒクルのような適当な対照を要すれば実験中に組み入れた。ZO−1に対して反応性のモノクローナル抗体R40.76はBruce Stevenson博士(アルバータ大学)より手に入れた。モノクローナル抗体Der p1抗体5H8はMartin Chapman博士(米国、ヴァージニア大学)の進呈を受けた。
消費ダニ培地の分画化
消費ダニ培地を硫酸アンモニウム沈降法により2つのフラクションに分けた。50%硫酸アンモニウムを用いる沈降法により得られたフラクションは、約22kDaと38kDaに主たる蛋白バンドを有した(図1a、レーン2)。発色体基質を用いる酵素分解の試験により、50%沈降物質の触媒活性がE−64で阻害され得ることが明らかにされた(図示せず)。Der p1に拮抗して生じるmAb5H8を用いる50%沈降物質のイムノブロット解析により約22kDaの見かけ質量を有する主バンドの存在、および38kDaにある副バンドの存在が明らかになった(図1b、レーン2)。SDS−PAGEおよびイムノブロット解析において、システインプロテイナーゼフラクションは、イムノアフィニティクロマトグラフィー、ゲル濾過および等電点電気泳動を組み合わせて精製したDer p1と同じように行動した(図1のパネルa、bのレーン1および2を比較すること)。図1bのイムノブロットのレーン2と3を比較すると、5H8 mAbはさらに50−80%硫酸アンモニウム沈降物の存在下にあるさらなる範囲の蛋白と反応することがわかる。還元剤の不在下では、50−80%硫酸アンモニウム沈降フラクションは、原型的セリンプロテイナーゼの阻害剤により弱毒化される、高い触媒活性を示した(図示せず)。便宜上、本願明細書にて、50%沈降物は、以下、システインプロテイナーゼフラクションといい、50−80%沈降物はセリンプロテイナーゼフラクションという。
これらの実験にて用いる制御条件下では、MDCKおよびCalu−3上皮細胞系は共に0.7−1.2x10-6cm/sの範囲にあるマンニトール透過性を有する密な単層を形成する。MDCKまたはCalu−3細胞単層のいずれかをセリンプロテイナーゼフラクションに曝し、濃度関連の透過性の変化を作成した(図2)。システインプロテイナーゼフラクションの濃度依存性はこの特定の一連の実験では試験していないが、本発明者らは、以前に類似するインビトロ実験(Herbertら、1990;1995)にて純粋なシステインプロテイナーゼアレルゲンDer p1の効果を明らかにしている。
MDCKまたはCalu−3細胞の単層を血清不含EMEM中で18時間の制御培養に付した場合、単層は実験の最後に低張性溶解作用に付されるまでLDHをわずかに放出しただけであった(図6)。実験の間にいくつかの細胞はマトリックス基層より分離したにも拘わらず、いずれかの細胞型の単層をシステインおよびセリンプロテイナーゼフラクションで処理してもまた、有意な量のLDHを培地に放出することはなかった。分離細胞および付着細胞の溶解は未処理細胞溶菌液に見られる数に等しい数のLDHの回収をもたらした(図6)。
HDM糞粒蛋白はアレルギー喘息の主な原因であり(Roveyら、1981)、この疾患の罹患率の増加に大きく寄与している(Dowseら、1985)。この研究において、本発明者らは、デルマトファゴイデス・プテロニシヌス糞粒からのプロテイナーゼが上皮細胞に対して強い生物学的作用を及ぼすことを明らかにした。HDMプロテイナーゼを硫酸アンモニウム沈降法によりシステインとセリン種に分画した。両方の沈降物は試験した実験系にて同様の作用を有した。当該物質は上皮細胞の単層の透過性を増大させ、外側にある細胞の付着を切り離し、細胞をバイオマトリックス基層から分離させた。細胞の切断および分離はLDHの著しい放出と結び付けて考えられなかったが、その証拠が初期アポトーシスおよび核破壊を伴う完全な細胞死にて見出された。AVおよびPIを用いて染色した細胞を検査することで、染色が細胞破壊/分離した領域に局在化していることが明らかにされた。本発明者らはさらにプロテイナーゼ阻害剤により細胞死を弱めることができることを明らかにした。
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Claims (7)
- アレルゲンが上皮障壁を通過する症状の予防または治療用医薬を製造するための、システインプロテイナーゼ活性の阻害剤とセリンプロテイナーゼ活性の阻害剤の組み合わせにおける使用。
- アレルギー症状が喘息である請求項1記載の使用。
- アレルギー症状が鼻炎、アレルギー性結膜炎、アトピー性皮膚炎または食物アレルギーより選択される症状である請求項1記載の使用。
- セリンプロテイナーゼ活性の阻害剤が、トリプシン以外のセリンプロテイナーゼ活性の阻害剤である、請求項1ないし3のいずれか1項に記載の使用。
- セリンプロテイナーゼ活性の阻害剤が、アレルゲンセリンプロテイナーゼ活性の阻害剤である、請求項1ないし3のいずれか1項に記載の使用。
- セリンプロテイナーゼ活性の阻害剤が、Der p3、Der p6またはDer p9セリンプロテイナーゼ活性の阻害剤である、請求項1ないし3のいずれか1項に記載の使用。
- E64(L−トランス−エポキシスクシニル−ロイシルアミド−(4−グアニジノ)ブタン)とAEBSF(4−(2−アミノエチル)ベンゼンスルホニルフルオリド塩酸塩)の組み合わせである請求項1記載の使用。
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