DE69815143T2

DE69815143T2 - Behandlung von allergischen zuständen mit cystein- und serin-proteinase inhibitoren

Info

Publication number: DE69815143T2
Application number: DE69815143T
Authority: DE
Inventors: David Ronald Altrincham GARROD; Clive Robinson
Original assignee: ST GEORG S HOSPITAL MEDICAL SC; St Georg's Hospital Medical School; Victoria University of Manchester; University of Manchester
Current assignee: Manchester Manchester Gb, University of; ST GEORG'S HOSPITAL MEDICAL SCHOOL LONDON GB
Priority date: 1997-12-11
Filing date: 1998-12-11
Publication date: 2004-04-01
Anticipated expiration: 2018-12-12
Also published as: EP1032415A2; HRP20000450A2; AU1498599A; AU747723C; US6440938B1; ES2200394T3; JP2010155831A; WO1999029339A3; PT1032415E; WO1999029339A2; DE69815143D1; CA2313653A1; JP2001525374A; ATE241383T1; HUP0100788A2; AU747723B2; CA2313653C; EP1032415B1; GB9726114D0

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Mittel für die Verhütung und/oder Behandlung von allergischen Leiden und insbesondere von solchen Leiden, bei welchen ein potentielles Allergen eine Epithelbarriere überqueren muß. Die Erfindung hat spezielle, aber nicht einzige Anwendung für die Verhütung und/oder Behandlung von Asthma.
Asthma ist die am meisten verbreitete chronische Kinderkrankheit und ein wichtiges schwächendes und lebensbedrohliches Leiden. Es ist durch akute Überempfindlichkeit, chronische Bronchialreaktivität sowie Schädigung und Zerstörung von Lungenepithel gekennzeichnet.
Ein primärer Risikofaktor für Asthma ist die Sensibilisierung der Lunge für luftübertragene Allergene, wie beispielsweise Proteine, die in den Fäkalpellets von Hausstaubmilben (HDM), die zur Gattung Dermatophagoiden gehören (z. B. D. pteronyssinus, D. farinae), ausgeschieden werden. Wenn eingeatmet, stoßen HDM-Fäkalpellets auf die flüssigkeitsbedeckte Epitheloberfläche von Luftwegen mit großem Durchmesser. Die resultierende Wasseranlagerung der HDM-Fäkalpellets löst einen schnellen und totalen Austritt der hauptsächlichen allergenen Proteine aus, wobei so eine hohe örtliche Konzentration von HDM-Proteinen auf der Auskleidung der Luftröhre erreicht wird. Sensibilisierung beinhaltet Allergenwahrnehmung durch Antigen anbietende Zellen, die normalerweise durch das Lungenepithel vor der Umwelt geschützt sind. Der Mechanismus, nach dem die Allergene imstande sind, die Epithelbarriere zu überwinden, ist nicht vollständig verstanden.
Es gibt jetzt eine zunehmende Masse von Beweisen, daß mehrere Hauptallergene von HDMs katalytische Kompetenz als Enzyme zeigen, und dies hat Vermutungen veranlaßt, daß diese Enzymwirkungen bei der allergischen Sensibilisierung und für die Fortdauer bestehender allergischer entzündlicher Reaktionen wichtig sein könnten.
Die meisten Daten, die Proteinase-Aktivität bei Milbenallergenen betreffen, beziehen sich gegenwärtig auf diejenigen der Gruppen 1, 3, 6 und 9 von Milben der Gattung Dermatophagoides. Die Gruppe-1-Allergene sind Cystein-Proteinasen und sind der Gegenstand größter Untersuchung gewesen, während eine kleinere Menge an Information existiert, die die enzymatischen Auswirkungen der Allergene der Gruppe 3, Gruppe 6 und Gruppe 9 betrifft, welche sich Sequenzidentität mit archetypischen Serin-Proteinasen teilen und welche selbst katalytisch kompetent sind.
Es ist vorgeschlagen worden, daß die Cystein-Proteinase-Aktivität wichtig bei der Verschlimmerung der allergischen Reaktion bei Asthma ist, da sie CD23, einen IgE-Rezeptor mit geringer Affinität, auf der Oberfläche von Antikörper erzeugenden Zellen spaltet. Spaltung führt zu positiver Rückkopplung, die eine Zunahme der IgE-Sekretion verursacht und so die allergische Reaktion vergrößert. Auf dieser Basis schlägt WO-A-97/04004 (Peptide Therapeutics (Peptidtherapeutik)) vor, daß Inhibitoren von Cystein-Proteinasen unter anderem für Asthmaprophylaxe verwendet werden könnten. Wir glauben jedoch nicht an die Wahrscheinlichkeit, daß der in WO-A-97/04004 vorgeschlagene Mechanismus in vivo funktioniert. Der Grund dafür ist, daß alle Experimente über die Spaltung von CD23 an Zellen in Kultur ausgeführt worden sind und die Konzentrationen an Der p 1, die erforderlich waren, um Spaltung zu erzeugen, unserer Ansicht nach unrealistisch groß waren. Die betroffenen Zellen würden sich in vivo in den Geweben oder dem Blut befinden. Es ist unserer Ansicht nach extrem unwahrscheinlich, daß Allergenkonzentrationen die Niveaus erreichen würden, die erforderlich sind, um an diesen Orten CD23- Spaltung zu erzeugen. Es gibt weder einen Beweis, daß sie es tun, noch, daß in vivo CD23-Spaltung stattfindet.
Kalsheker N., et al. (1996), Biochem. Biophys. Res. Comms. (USA) 221/1, S. 59–61 offenbaren, daß der Serin-Proteinase-Inhibitor α₁-Antitrypsin den unteren Respirationstrakt vor Beschädigung durch Proteinasen, die in der Lunge während der Entzündung freigesetzt werden, schützt. Es wird gezeigt, daß die Cystein-Proteinase Der p 1 die vorgeschlagene reaktive Schleife des Serin-Proteinase-Inhibitors α₁-Antitrypsin spaltet, und es wird vorgeschlagen, daß dieser Mechanismus in der Pathogenese von Asthma wichtig ist. Es wird ebenfalls offenbart, daß α₁-Antitrypsin-Mangel mit dem Auftreten von Kindheitsasthma verknüpft ist. Es gibt jedoch keine Offenbarung, wie allergische Leiden (wie beispielsweise Asthma), bei welchen ein Allergen eine Epithelbarriere überqueren muß, behandelt oder verhütet werden können.
Stewart G. et al., (1991) Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 95/2-3 S. 248–256 offenbaren, daß Staubmilbenfaeces zusammen mit verschiedenen anderen Enzymen drei Serin-Proteinasen und eine Cystein-Proteinase enthalten. Es wird auch offenbart, daß die Cystein-Proteinase und mindestens eine der Serin-Proteinasen allergen sind. Es gibt jedoch keine Offenbarung, wie allergische Leiden, wie beispielsweise Asthma, bei welchem ein Allergen eine Epithelbarriere überqueren muß, behandelt oder verhütet werden können.
Trotz der beträchtlichen Anstrengung, die auf dem Gebiet der Asthmaforschung unternommen worden ist, verbleibt ein Bedarf an verbesserten Verfahren für die Verhütung und/oder Behandlung von Asthma (und anderen allergischen Leiden, bei denen ein potentielles Allergen eine Epithelbarriere überqueren muß).
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung eines Inhibitors der Cystein-Proteinase-Aktivität in Verbindung mit einem Inhibitor der Serin-Proteinase-Aktivität für die Herstellung eines Medikaments für die Verhütung oder Behandlung eines Leidens, bei welchem ein Allergen eine Epithelbarriere überquert, bereitgestellt.
Die Erfindung ist besonders (aber nicht ausschließlich) auf die Behandlung von Asthma anwendbar, für welches die Cystein-Proteinase-Aktivität, die gehemmt werden soll, vorzugsweise die von Der p 1 ist, während die Serin-Proteinase-Aktivität, die gehemmt werden soll, diejenige einer beliebigen Serin-Proteinase sein kann, die eine andere ist als Trypsin, vorzugsweise eine Allergen-Serin-Proteinase und stärker bevorzugt Der p 3, Der p 6 und/oder Der p 9.
Die Erfindung beruht auf unseren experimentellen Untersuchungen (nachstehend ausführlicher dargelegt), welche demonstriert haben, daß der anfängliche Schlüsselschritt bei der allergischen Sensibilisierung gegen Hausstaubmilbenallergene durch sowohl Cystein- als auch Serin-Proteinase-Aktivität vermittelt wird. Wie haben gefunden, daß diese Aktivität Zerstörung von Tight- junctions zwischen den Zellen des Epithels bewirkt und so die Epithelpermeabilität vergrößert und dem Allergen gestattet, das Epithel zu durchqueren. Hierdurch können die Allergene Zugang zu dendritisches Antigen darbietenden Zellen gewinnen und mit ihnen wechselwirken, wobei eine allergische Reaktion erzeugt wird. Cystein-Proteinase-Inhibitoren hemmen die Cystein-Proteinase-Allergene, aber nicht die Serin-Proteinase-Allergene und blockieren so nicht vollständig den Zusammenbruch der Tight-junctions. Ähnlich blockieren Serin-Proteinase-Inhibitoren die Wirkungen der Serin-Proteinase-Allergene, aber nicht der Cystein- Proteinase-Allergene und blockieren so nicht vollständig den Zusammenbruch der Tight-junctions. Teilweise Hemmung würde noch erlauben, daß eine allergische Reaktion erzeugt wird. Hemmung sowohl der Cystein- als auch der Proteinase-Aktivität der Allergene ist notwendig, um die Zerstörung der Tight-junctions und somit die Erzeugung einer allergischen Reaktion vollständig zu hemmen.
Obwohl die Erfindung besonders für die Verhütung und/oder Behandlung von Asthma anwendbar ist, kann sie auf einen Bereich anderer allergischer Leiden, einschließlich Rhinitis, allergische Konjunktivitis, Atopik-Dermatitis und Nahrungsmittelallergien, angewendet werden.
Die Behandlung und/oder Verhütung des allergischen Leidens kann bewirkt werden mittels:

(i) einer Formulierung mit Cystein- und Serin-Proteinase hemmender Aktivität; oder
(ii) eines Kits, umfassend einen Inhibitor der Cystein-Proteinase-Aktivität und einen Inhibitor der Serin-Proteinase-Aktivität.

In der Formulierung kann eine einzige Inhibitorverbindung die erforderliche Hemmung der Serin- und Cystein-Proteinase-Aktivität bereitstellen. Jedoch wird stärker üblich die Hemmung der Cystein-Proteinase-Aktivität und der Serin-Proteinase-Aktivität durch gesonderte Inhibitorverbindungen bereitgestellt.
Wo gesonderte Inhibitorverbindungen verwendet werden, wie in dem Kit, können sie gleichzeitig miteinander oder aufeinanderfolgend verwendet werden.
Wenn notwendig, kann mehr als ein Typ von Cystein-Proteinase-Aktivität und/oder mehr als ein Typ von Serin-Proteinase-Aktivität verwendet werden, um das erforderliche Spektrum von Aktivität bereitzustellen.
Die Erfindung ist besonders für die Behandlung von Asthma einschließlich der prophylaktischen Behandlung davon anwendbar. Mit dem Begriff prophylaktische Behandlung schließen wir jede Behandlung ein, die angewandt wird, um einen nachfolgenden Asthmaanfall zu verhüten oder die Wirkung zu mildern. Die prophylaktische Behandlung kann zum Beispiel periodisch einer Person gegeben werden, von der bekannt ist, daß sie unter Asthmaanfällen leidet, mit der Absicht, solche Anfälle zu verhüten oder ihre Häufigkeit zu verringern. Alternativ kann die prophylaktische Behandlung auf einer ad-hoc-Basis einer Person gegeben werden, die an Asthma leidet und die einer Umgebung ausgesetzt werden soll (zum Beispiel einer allergeninfizierten Umgebung), die den Beginn eines Asthmaanfalls wahrscheinlicher machen würde. Eine weitere Möglichkeit ist, daß die prophylaktische Behandlung einer Person gegeben wird, die kein Asthma entwickelt hat, aber von der aus diesem oder jenem Grund angenommen wird, daß sie dafür gefährdet ist.
Für den Zweck therapeutischer Verabreichung wird (werden) die Inhibitorverbindung(en) in einem pharmazeutisch verträglichen Excipienten für die Zuführung zu dem Lungenepithel formuliert. Am meisten bevorzugt wird (werden) die Inhibitorverbindung(en) mittels eines Aerosols zugeführt, wie es für Antiasthmabehandlungen herkömmlich ist. Wir schließen jedoch andere Zuführungswege nicht aus.
Die Menge der zu verabreichenden Inhibitorverbindung(en) ist natürlich eine therapeutisch wirksame Dosis. Die Dosierungsrate hängt von Faktoren wie dem Gewicht des zu behandelnden Patienten, der Schwere des zu behandelnden Asthmaleidens und der Aktivität der Inhibitoren ab. Jedoch liegen typische Dosierungen in dem Bereich von 1 bis 1000 Mikrogramm pro Tag.
Zu Beispielen von Inhibitoren der Cystein-Proteinase-Aktivität, die für einen beliebigen Aspekt der Erfindung verwendet werden können, gehören L-trans-Epoxysuccinyl-leucylamido-(4-guanidino)-butan (E-64) ebenso wie die Cystein-Proteinase-Inhibitoren, die in WO-A-97/04004 offenbart sind.
Zu Beispielen von Inhibitoren der Serin-Proteinase-Aktivität, die für einen beliebigen Aspekt der Erfindung verwendet werden können, gehören 4-(2-Aminoethyl)-benzolsulfonylfluorid-Hydrochlorid (AEBSF).
Die Erfindung wird durch das folgende, nicht begrenzende Beispiel (und begleitende Figuren) veranschaulicht, die Ergebnisse des Beispiels angeben.
BEISPIEL
Unter Verwendung der Verfahren, die nachstehend ausführlicher beschrieben sind, demonstriert das Beispiel die Wirkung auf die Epithelpermeabilität von

(i) Cystein- und Serin-Proteinase-Fraktionen, abgesondert von Hausstaubmilben, und
(ii) den unter (i) spezifizierten Fraktionen in Kombination mit Inhibitoren der Cystein- und Serin-Proteinase-Aktivität.

VERFAHREN ZELLKULTUR
Calu-3- und MDCK-Zellen wurden als Paradigmen zur Untersuchung interzellulärer Verbindungen von Epithelien und ihre Suszeptibilität gegenüber HDM-Proteinasen und potentiellen Inhibitoren verwendet. Beide Zelllinien exprimieren Tight junctions, Zonulae adherentes und Desmosomen und sind so annehmbare Modelle für Zellhaftungsmechanismen, die in dem Luftweg vorhanden sind. Calu-3 ist eine Adenokarzinomzelllinie, erhalten von einem 25 Jahre alten kaukasischen Mann. Sie ist der Gegenstand relativ weniger Untersuchungen gewesen, es ist aber auf der Basis elektrophysiologischer Untersuchungen (Shen et al., 1994; Haws et al., 1994) und unserer eigenen immunozytochemischen Charakterisierung (nicht gezeigt) bekannt, daß sie die Eigenschaften einer dichtschließenden Barriere exprimiert. Zellen wurden in Eagle's Minimum Essential Medium mit Earle's Salzen (EMEM), ergänzt mit 10% Vol./Vol. hitzeinaktiviertem fetalen Kälberserum (FCS), 2 mM L-Glutamin, nichtessentiellen Aminosäuren, 10 μM Natriumpyruvat und enthaltend 50 E/ml Penicillin und 50 μg/ml Streptomycin, vermehrt.
Epithelzellen von Madin-Darby-Hundenieren (MDCK) wurden in EMEM, enthaltend 50 E ml^–1 Penicillin, 50 μg ml^–1 Streptomycin, 2 mM L-Glutamin, nichtessentielle Aminosäuren und 10% Vol./Vol. hitzeinaktiviertes FCS, kultiviert. Für die Subkultur beider Zelltypen wurden die Zellen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) ohne Calcium und Magnesium gespült und dann unter Verwendung einer Lösung mit 0,05% (Gew./Vol.) Trypsin und 0,02 % (Gew./Vol.) EDTA teilweise digeriert.
Alle Kulturen wurden bei 37°C in einer feuchten Atmosphäre mit 5% Kohlendioxid in Luft vermehrt.
BESCHICHTUNG VON TRANSWELL^TM-EINSÄTZEN MIT MATRIGEL
Messungen der Mannitol-Clearance wurden an konfluierenden Zellmonoschichten durchgeführt, die auf Costar-Transwell^TM-Einsätzen mit 0,4 μm Porendurchmesser, beschichtet mit einer ungelierten ultradünnen Unterschicht von Matrigel, vermehrt worden waren. Die Beschichtung wurde durch Zugabe von 250-μl-Aliquoten von Matrigel (verdünnt 1 : 500 Vol./Vol. in EMEM) in das Innere des Einsatzes und nachfolgende Inkubation in der Umgebung für 60 min unter aseptischen Bedingungen erreicht. Die Lösung wurde dann abgesaugt und die Einsätze vor der Zugabe einer konfluierenden Dichte von Zellsuspension vorsichtig mit Medium gewaschen.
ZELLBEHANDLUNGSPROTOKOLLE UND MESSUNG DER CLEARANCE
Zellen (2–5 × 10⁵ pro cm² Wachstumsfläche) wurden auf mit Matrigel beschichtete Einsätze aufgebracht. Wir verwenden den Begriff „Einsatz" als Bezeichnung der Filtereinheit, die die Zellen enthält, und den Begriff „Vertiefung" als Bezugnahme auf die Höhlungen der Gewebekulturplatte. Um Wachstum und Integrität zu überwachen, wurden die Einsätze statistisch entnommen, vorsichtig in PBS gewaschen und unter gedämpfter Beleuchtung mit Acridinorange und Ethidiumbromid (1 mg ml^–1 jeweils in PBS) angefärbt. Die Einsätze wurden durch Fluoreszenzmikroskopie untersucht und wurden nur verwendet, wenn Konfluenz mit hoher Lebensfähigkeit erreicht war.
Bei Konfluenz wurde das Medium aus den Vertiefungen abgesaugt und durch Serum- und bicarbonatfreies EMEM, gepuffert mit 20 mM HEPES und enthaltend 2 mM L-Glutamin, ersetzt. Das Medium von den Einsätzen wurde dann vorsichtig entfernt und durch 300 μl serumfreies EMEM, enthaltend [¹⁴C]-Mannitol (1 μCi ml^–1 und 1 mg ml^–1 ummarkiertes Mannitol in HEPES-gepuffertem Medium, ersetzt. Die Transwell^TM-Platten wurden dann auf einem Orbital-Shaker Luckham R100 für 30 min bei 37°C äquilibriert. Dreifache 100-μl-Aliquote der nichtverwendeten markierten Mannitollösung wurden als Probe entnommen und ihr Gehalt an Radioaktivität nach Zugabe von 5 ml Opti-Fluor durch Flüssigkeitsszintillationsspektrometrie (Beckman LS6000IC) bestimmt.
Nach dem Zeitraum der Äquilibrierung wurden die Einsätze in frische Vertiefungen, enthaltend 1 ml mit serumfreiem HEPES gepuffertes EMEM, gebracht und bei 37°C unter kontinuierlichem vorsichtigen Schütteln inkubiert. Das Medium von den ursprünglichen Vertiefungen wurde zurückbehalten und sein Gehalt an Radioaktivität nach der Zugabe von 10 ml Opti-Fluor bestimmt. Diese Ergebnisse wurden verwendet, um die Tracerkonzentration zur Zeit null zu bestimmen. In zeitlich festgelegten Abständen wurden 20-μl-Aliquote der basolateralen Badflüssigkeit entfernt und für die Berechnung des Clearance-Volumens wie vorstehend beschrieben die Menge von¹⁴C-Mannitol quantifiziert.
BERECHNUNG DER EPITHELPERMEABILITÄT
Die parazelluläre Permeabilität von Mannitol wurde in Übereinstimmung mit der Verfahrensweise, beschrieben in unserer gleichzeitig anhängigen UK-Patentanmeldung 9715058, bestimmt und wurde aus Messungen des Clearance-Volumens zu definierten Zeitpunkten berechnet. Clearance-Abschätzungen wurden über 3–5 Stunden ausgeführt und wurden entsprechend der Beziehung:
berechnet, wo:
V_Sonde _t das Clearance-Volumen zu jedem Zeitpunkt ist
VA_i das abluminale Volumen zu jedem Zeitpunkt ist
Δ[A]_i die Zunahme der Tracerkonzentration zwischen den Zeitpunkten ist
[L]_i die luminale Tracerkonzentration zu jedem Zeitpunkt ist
Unter Bedingungen, wo Diffusion das einzige Mittel transepithelialer Bewegung des gelösten Stoffes ist, nähert sieh dV_Sonde/dt nahe an das Produkt Permeabilität-Oberfläche an und erlaubt so die Abschätzung der Permeabilität von Mannitol in dem Verbundstoffsystem von Zellen, Filter, ungestörten Schichten und Proteinbeschichtung (P₁). Die Epithelpermeabilität kann aus der gemessenen Variable durch Betrachten des Matrigel-beschichteten Filters und ungestörter Schichten als System von Serienpermeabilitäten berechnet werden. So:
wo
P_t die Verbundstoffpermeabilität des Systems ist
P₁ die Komponente auf Grund der Epithelzellen allein ist
P₂ die Komponente auf Grund des Filters ohne Matrigel ist
P₃ die Komponente der ungestörten Schicht ist
P₄ die Permeabilität des Filters mit der Matrigelbeschichtung ist
In reinen Diffusionssystemen
wo
D der freie Diffusionskoeffizient von Mannitol ist
δ die summierte Dicke ungestörter Schichten ist
Die Dicken der ungestörten Schicht sind unter idealen Bedingungen unabhängig von der Membranpermeabilität, so sind die P₃ in den Gleichungen (3) und (4) identisch. Subtrahieren der Gleichungen (2) und (3) gestattet so die Berechnung der Permeabilität der Epithelmonoschicht (5).
Die Varianzanalyse wurde nach log-Transformation der Permeabilitätsdaten und Wahrscheinlichkeitswerte für die verschiedenen Behandlungen, zugeordnet unter Verwendung des Tests der niedrigwertigsten Differenz, durchgeführt. Die Daten werden als die geometrischen Mittelwerte mit angegebenen Standardfehlern von n experimentellen Beobachtungen dargeboten. Wahrscheinlichkeitsniveaus von P < 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen.
HERSTELLUNG VON PROTEINASE-FRAKTIONEN AUS HDM-KULTURMEDIUM
HDM-Proteinase-Allergene sind in katalytisch kompetenter Form durch rekombinante Zellexpression des reifen Enzymproteins noch nicht hergestellt worden. Der Bequemlichkeit halber und um zukünftiges Screening potentieller Inhibitoren in großem Maßstab in Abwesenheit katalytisch aktiver rekombinanter Proteine zu ermöglichen, haben wir versucht, die Cystein- und Serin-Proteinase-Aktivität durch einfache biochemische Fraktionierung von verbrauchtem Medium, in dem HDM gezüchtet worden war, zu trennen. Während der Kultur setzen die HDM Allergene in das Medium frei, was in einer Anhäufung von Proteinen resultiert, die für eine Reinigung geeignet sind. Verbrauchtes Medium aus Kulturen von D. pteronyssinus (Commonwealth Serum Laboratory, Parkville, Australia) wurde in 5 Volumen phospatgepufferter Kochsalzlösung gelöst und dann bei 48400 × g und 4°C für 20 min zentrifugiert. Ammoniumsulfat wurde allmählich zu der gerührten überstehenden Lösung bei 4°C hinzugegeben, um eine 50 %ige gesättigte Lösung zu erreichen. Nach Zentrifugation (48400 × g, 20 min, 4°C) wurde das Pellet, von dem durch enzymatische Analyse gefunden wurde, daß es in Cystein-Proteinase-Aktivität angereichert ist, in einem minimalen Volumen von destilliertem Wasser wieder aufgelöst. Ammoniumsulfat wurde zu der überstehenden Lösung aus dem ersten Schnitt hinzugegeben, um 80 %ige Sättigung zu erreichen. Das aus weiterer Zentrifugation resultierende Pellet, von dem gefunden wurde, daß es in Serin-Proteinase-Aktivität angereichert ist, wurde in einem minimalen Volumen von destilliertem Wasser resuspendiert. Die Fraktionen von Cystein- (50%-Niederschlag) und Serin-Proteinase (50–80%-Niederschlag) wurden getrennt über Nacht gegen destilliertes Wasser dialysiert und dann vor der Wiederherstellung in EMEM lyophilisiert. Der Proteingehalt der Extrakte wurde unter Verwendung der Coomassie-Blue-Technik mit Serumalbumin als Standard (Smith et al., 1985) gemessen. Die Proteinase-Aktivität wurde unter Verwendung der Prüfung des Azocoll-Abbaus gemessen, wie anderswo (Herbert et al., 1995; Chavira et al., 1984) beschrieben ist. Die Extrakte wurden außerdem unter Verwendung der Prüfung der Limulus-Amöbozyten-Lyse (Endotect^TM, ICN Biomedicals, Thame, Oxfordshire) auf das Vorhandensein von Endotoxin geprüft. In allen Fällen waren die Spiegel von Endotoxin unter der Analysennachweisgrenze (< 0,06 ng ml^–1).
IMMUNOBLOTTING VON HDM-PROTEINASE-FRAKTIONEN
Proteinase-Fraktionen wurden durch SDS-PAGE getrennt und elektrophoretisch zu Mikrocellulosemembranen überführt. Unspezifische Proteinbindung wurde mit 5% (Gew./Vol.) Magermilch und 0,1% Vol./Vol. Tween-20 in Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS) und nachfolgende Inkubation mit mAb 5H8 (anti-Der p 1), verdünnt in TBS, enthaltend 2% Gew./Vol. Rinderserumalbumin und 0,1% Vol./Vol. Tween-20, blockiert. Der Nachweis erfolgte mit verbesserter Chemilumineszenztechnik (Amersham International, Buckinghamshire).
PRÜFUNGEN DES ZELLTODS
Es wurden Zellen auf Petrischalen von 60 × 15 mm aufgebracht und für 2–4 Tage in serumhaltigem EMEM unter Gewebekulturbedingungen in einer Atmosphäre mit 5% CO₂ gezüchtet. Die Zellen wurden dann, während sie unter aerober Inkubation bei 37°C waren, Behandlungen in serumfreiem EMEM ausgesetzt, das 20 mM HEPES enthielt. Zu definierten Zeitpunkten wurden die Zellen mit einem Schaber geerntet und mit den abgelösten Zellen in der überstehenden Lösung zusammengefaßt. Die Zellen wurden bei 550 × g für 5 min zentrifugiert und ihre DNA extrahiert (Nucleon II, Scotlab, Coatbridge, Stratchclyde). Die extrahierte DNA wurde in 100 μl TE-Puffer (10 mM Tris-HCl und 1 mM Na₂EDTA) über Nacht bei Raumtemperatur resuspendiert und ihre Reinheit spektroskopisch bestimmt. Gleiche Mengen DNA wurden im 4 : 1-Verhältnis mit Probenpuffer (0,25% Bromphenolblau und 40% Gew./Vol. Saccharose in Wasser) zu jeder Bahn von 2% (Gew./Vol.) Agarosegelen aufgebracht und Elektrophorese bei 50 V für 2–3 h in TAE-Puffer (0,04 M Tris-Acetat und 0,001 M EDTA) durchgeführt. Banden von DNA in den Gelen (in welche Ethidiumbromid eingelagert worden war) wurden durch ultraviolettes Licht sichtbar gemacht.
Die Wiederverteilung von Phosphatidylserin in die äußere Schicht von Zellmembranen, die während der Initiierung von Apoptose erfolgt, wurde unter Verwendung von Annexin-V-Färbung untersucht. Diese wurde in Petrischalen von 60 × 15 mm durchgeführt, die modifiziert worden waren, indem ein Loch mit 1 cm Durchmesser in den Boden jeder Schale gebohrt wurde und die äußere Fläche davon mit einem Deckglas bedeckt wurde, das durch Sylgard (Dow Corning, Midland, MI, USA) in der Lage gehalten wurde. Ein Polyamidring wurde mittels Cyanoacrylatkleber auf der inneren Fläche der Schale befestigt, um eine Vertiefung mit einem Glasboden zu erzeugen, welche dann mit einer ultradünnen Schicht von Matrigel beschichtet wurde. Zellen (3 × 10⁴) wurden in jede Vertiefung eingebracht und für 2–3 Tage wachsen gelassen, wonach sie der gewünschten experimentellen Behandlung unterworfen wurden. Im Anschluß daran wurden die Zellen vor der Zugabe von Annexin-V-FITC (AV) und Propidiumiodid (PI) unter gedämpften Beleuchtungsbedingungen in PBS und dann in 200 ml Bindungspuffer gespült. Nach 15 min Inkubation wurden die Zellen mit Bindungspuffer gespült und unter Verwendung von Filtersätzen mit blauer und grüner Anregung (Zeiss Axiovert 10 mit Ölimmersions-Fluar-Objektiven) durch Fluoreszenzmikroskopie untersucht. Bei Verwendung dieser Technik färben sich Zellen in früher Apoptose grün, da FITC-konjugiertes Annexin V an Phosphatidylserin bindet, welches in das äußere Blättchen der Zellmembran (Fadok et al., 1992; Koopman et al., 1994; Vermes et al., 1995; Homburg et al., 1995) reorientiert worden ist. Tote Zellen zeigen außerdem mit PI rote Färbung, weil zunehmende Permeabilität der Kernmembran ihm erlaubt, an Nukleinsäuren zu binden. Eine fotografische Dokumentation wurde unter Verwendung einer Kamera Contax 167MT und eines Films Kodak TMAX 400 für Schwarz-Weiß-Drucke oder Ektachrome 160T für Farbumkehrbilder gemacht.
Die LDH-Aktivität wurde unter Verwendung von Pyruvinsäure als Substrat und mit spektrophotometrischer Überwachung der Erzeugung eines Phenylhydrazonderivats aus Milchsäure gemessen. MDCK- oder Calu-3-Zellen wurden auf Platten mit 12 Vertiefungen als Kultur angesetzt und bis zur Konfluenz gezüchtet. Die Zellmonoschichten wurden für 18 Stunden entweder Kontrollbehandlungen (serum- und phenolrotfreies EMEM, mit 0,6 mM Dithiothreitol in dem Fall der Kontrolle für die Cystein-Proteinase-Fraktion) oder den HDM-Proteinase-Fraktionen, verdünnt in dem gleichen Medium (mit 0,6 mM Dithiothreitol, vorhanden in der Cystein-Proteinase-Fraktion), ausgesetzt. Am Ende des Experiments wurde das Inkubationsmedium geerntet und bei Raumtemperatur zentrifugiert, um alle Zellen zu sedimentieren, die sich während der Behandlung von den Vertiefungen abgelöst hatten. Die erste überstehende Fraktion wurde direkt auf LDH-Aktivität geprüft, während das aus allen abgelösten Zellen erzeugte Pellet vor kurzer Zentrifugation, um Zellbruchstücke zu entfernen, hypotonischer Lyse mit destilliertem Wasser (5 Minuten bei Raumtemperatur) unterworfen wurde. Die so erhaltene zweite überstehende Lösung wurde dann auf LDH-Aktivität geprüft. Zellen, die während der Behandlung an den Vertiefungen haften geblieben waren, wurden wie vorstehend beschrieben lysiert, und die LDH-Aktivität wurde gemessen. Da während der Behandlung mit Kontrollmedien keine signifikante Ablösung erfolgte, wurde die gesamte zelluläre LDH-Aktivität als diejenige definiert, die in dem Lysat von anhaftenden Zellen, behandelt allein mit serum- und phenolrotfreiem EMEM, vorhanden ist.
IMMUNOZYTOCHEMISCHE SICHTBARMACHUNG DER WIRKUNGEN VON INHIBITOREN AUF PROTEINASE-VERMITTELTE SPALTUNG INTERZELLULÄRER VERBINDUNGEN
Um die Wirkungen von Proteinasen und Inhibitoren auf interzelluläre Verbindungen zu untersuchen, wurden MDCK-Zellen auf Deckgläsern kultiviert und für den gewünschten Zeitraum mit der geeigneten Proteinase und/oder dem Inhibitor behandelt. Die Zellen wurden vor Bindung von Ratten-anti-ZO-1 (mAb R40.76) (Stevenson et al., 1986; Anderson et al., 1988) und Mäuse-anti-Desmoplakin (mAb 11-5F) (Parrish et al., 1987) in eiskaltem Methanol fixiert. Indirekte Fluoreszenz-Antikörper-Färbung wurde unter Verwendung von FITC- und TRITC-konjugierten zweiten Antikörpern durchgeführt. Mikroskopie wurde unter Verwendung eines Zeiss-Axiovert-Mikroskops mit Ölimmersions-Fluar-Objektiv mit × 40-Vergrößerung ausgeführt. Die Prüfstücke wurden unter Verwendung von Erregungs- und Emissions-Filtersätzen für FITC und TRITC beleuchtet. Die Zellen wurden wie vorstehend beschrieben photographiert.
MATERIALIEN
Alle Medien und Zellkulturreagenzien wurden, außer wenn angegeben, von ICN Biochemicals Ltd. (Thame, Oxfordshire) gekauft. HBSS wurde von GibcoBRL, Life Technologies Ltd. (Paisley) erhalten. Mannitol und Triton X-100 wurden von Sigma-Aldrich Ltd. (Poole, Dorset) erhalten, und hitzeinaktiviertes fetales Kälberserum war von Labtech International Ltd. (Uckfield, East Sussex). Matrigel wurde von Universal Biologicals, London erhalten. Mannitol-Clearance-Messungen wurden in Transwells von 12 mm Durchmesser mit 0,4 μm Membranporengröße und 10 μm Membrandicke (Costar UK Ltd., High Wycombe, Buckinghamshire) gemacht. D-[¹⁴C]-Mannitol wurde von NEN DuPont Research Products (Stevenage, Hertfordshire) erhalten und die Opti-Fluor-Szintillationssubstanz und die Scintillationsröhrchen waren von Canberra Packard Ltd. (Pangbourne, Berkshire). MDCK-Zellen wurden aus Ausgangsmaterial in unserem Laboratorium gezüchtet. Calu-3-Zellen wurden ursprünglich von der American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA) erhalten und durch serielle Passage expandiert, um eine örtliche Bank von kryokonservierten Zellen zu erzeugen. Die Zellen wurden entsprechend der Natur des Experiments in Falcon-75-cm²-Zellkulturkolben (Marathon Laboratory Supplies, London), Costar-Gewebekulturplatten mit vielen Vertiefungen oder Transwell-Einsätzen kultiviert. Agarose (molekulare Qualität) war von Promega (Southampton, Hampshire). Prüfkits für LDH-Messung wurden von Sigma gekauft; Apoalert-Kits wurden von Cambridge Bioscience gekauft. Acridinorange, Ethidiumbromid und alle anderen allgemeinen Laborreagenzien wurden von BDH (Poole, Dorset) erhalten. Die Verbindung E-64 (L-trans-Epoxysuccinylleucylamid-(4-guanidino)-butan, ein Inhibitor von Cystein-Proteinasen, wurde von Sigma erhalten. Konzentrierte wässerige Vorratslösungen wurden gefroren aufbewahrt, bis sie benötigt wurden.
Der Serin-Proteinase-Inhibitor 4-(2-Aminoethyl)-benzolsulfonylfluorid-Hydrochlorid (AEBSF) wurde von Pentapharm, Basel, Schweiz, erhalten. Der Matrix-Metalloproteinase-(MMP)-Inhibitor BB-250 ([4-(N-Hydroxyamino)-2R-isobutyl-3S-(thiophen-2-yl-sulfonyhnethyl)succinyl]-L-phenylalanin-N-methylamid) wurde von British Biotech Pharmaceuticals Ltd. bereitgestellt. Alle Inhibitoren wurden als konzentrierte Vorratslösungen in trockenem Me₂SO hergestellt und zur Verwendung in Experimenten wie erforderlich mit Medium verdünnt. Geeignete Kontrollen für das Me₂SO-Vehikel wurden wie erforderlich in die Experimente eingefügt. Monoklonaler Antikörper R40.76, reaktiv gegen ZO-1, wurde großzügigerweise von Dr. Bruce Stevenson, University of Alberta, bereitgestellt. Monoklonaler Der p 1 Antikörper 5H8 war eine freundliche Gabe von Dr. Martin Chapman, University of Virginia, USA.
ERGEBNISSE FRAKTIONIERUNG VON VERBRAUCHTEM MILBEN-MEDIUM
Verbrauchtes Milben-Medium wurde durch Ammoniumsulfat-Ausfällung in zwei Fraktionen getrennt. Die Fraktion, die sich durch Fällung mit 50%igem Ammoniumsulfat ergab, bestand aus Hauptproteinbanden bei ~ 22 kDa und 38 kDa (1a, Bahn 2). Tests des Enzymabbaus unter Verwendung chromogener Substrate zeigten, daß die katalytische Aktivität des 50%-Niederschlags durch E-64 hemmbar war (nicht gezeigt). Immunoblot-Analyse des 50%-Niederschlags unter Verwendung von mAb 5H8, gesteigert gegenüber Der p 1, enthüllte das Vorhandensein einer Hauptbande mit einer scheinbaren Masse von ~ 22 kDa und einer Nebenbande bei 38 kDa (1B, Bahn 2). In der SDS-PAGE- und Immunoblotting-Analyse verhielt sich die Cystein-Proteinase-Fraktion identisch zu Der p 1, gereinigt durch eine Kombination von Immunoaffinitäts-Chromatographie, Gelfiltration und isoelektrischer Fokussierung (man vergleiche die Bahnen 1 und 2 in den Feldern a, b von 1). Vergleich der Bahnen 2 und 3 des Immunoblots, gezeigt in 1b, demonstriert, daß das 5H8 Mb auch mit einem zusätzlichen Bereich von Proteinen reagierte, der in dem 50–80%-Ammoniumsulfat-Niederschlag vorhanden war. In Abwesenheit von Reduktionsmittel zeigte die Fraktion mit dem 50–80%-Ammoniumsulfat-Niederschlag hohe katalytische Aktivität, welche durch Inhibitoren archetypischer Serin-Proteinasen geschwächt wurde (nicht gezeigt). Der Bequemlichkeit halber wird in diesem Manuskript der 50%-Niederschlag nachfolgend als die Cystein-Proteinase-Fraktion und der 50–80%-Niederschlag als die Serin-Proteinase-Fraktion bezeichnet.
WIRKUNGEN VON HDM-PROTEINASE-FRAKTIONEN AUF DIE EPITHELPERMEABILITÄT
Unter den Kontrollbedingungen, die in diesen Experimenten verwendet werden, erzeugen sowohl MDCK- als auch Calu-3-Epithelzelllinien dichtschließende Monoschichten mit Mannitol-Permeabilitäten in dem Bereich 0,7–1,2 × 10^–6 cm s^–1. Einwirkung der Serin-Proteinase-Fraktion auf entweder MDCK- oder Calu-3-Zelhnonoschichten erzeugte eine konzentrationsbezogene Änderung in der Permeabilität (2). Die Konzentrationsabhängigkeit der Cystein-Proteinase-Fraktion wurde in dieser speziellen Serie von Experimenten nicht getestet, aber die Wirkungen des reinen Cystein-Proteinase-Allergens Der p 1 sind früher von uns in ähnlichen in-vitro-Modellen demonstriert worden (Herbert et al., 1990; 1995).
Die Wirkungen der Cystein-Proteinase-Fraktion in MDCK-Zelhnonoschichten wurden durch den Cystein-Proteinase-Inhibitor E-64 geschwächt (3a). E-64 hatte keine wahrnehmbare Wirkung auf die intrinsischen Permeabilitätseigenschaften der Zellmonoschicht (3a). Die Serin-Proteinase-Inhibitoren AEBSF und, weniger wirksam, SBTI hemmten beide die Wirkung der Serin-Proteinase-Fraktion in MDCK-Zellen (3b). Keiner von beiden Inhibitoren übte für sich irgendeine wahrnehmbare Wirkung auf die Epithelpermeabilität aus (3b). Die Inhibitoren waren auch wirksam, wenn sie mit der gleichen Konzentration in Calu-3-Zelhnonoschichten getestet wurden. Calu-3-Zelhnonoschichten, die mit der Cystein-Proteinase-Fraktion behandelt waren, hatten eine Mannitol-Permeabilität von (8,44 ± 0,43) × 10^–6 cm s^–1, die durch E-64 (P < 0,05), n = 5) auf (4,84 ± 0,32) × 10^–6 cm s^–1 verringert wurde. Calu-3-Zelhnonoschichten, die mit der Serin-Proteinase-Fraktion behandelt waren, hatten eine Mannitol-Permeabilität von (18,1 ± 0,02) × 10^–6 cm s^–1, die durch AEBSF (P < 0,05, n = 5) auf (10,20 ± 0,01) × 10^–6 cm s^–1 verringert wurde.
Die klassenspezifischen Proteinase-Inhibitoren waren nur gegen die aus den HDM-Kulturen erhaltenen verwandten Enzym-Fraktionen wirksam. 4 zeigt, daß AEBSF bei einer Konzentration, die die Wirkungen der Serin-Proteinase-Fraktion ablöste, bei der Hemmung der Wirkung der Cystein-Proteinase-Fraktion auf Calu-3-Zelhnonoschichten versagte. Umgekehrt hemmte E-64 die Permeabilitätsänderung nicht, die durch die Serin-Proteinase-Fraktion verursacht wurde (4).
5 zeigt, daß die Behandlung von MDCK-Monoschichten mit entweder der Cystein- oder der Serin-Proteinase-Fraktion eine Zerstörung des normalerweise zusammenhängenden peripheren Färbungsmusters von dem TJ-Protein ZO-1 und der punktierten Färbung von Desmoplakin erzeugte. Zugabe von E-64 zu der Cystein-Proteinase-Fraktion oder AEBSF zu der Serin-Proteinase-Fraktion hemmte die Proteinase-abhängigen Veränderungen (5).
HDM-PROTEINASEN INDUZIEREN ZELLTOD IN EPITHELIEN
Kontrollinkubation von MDCK- oder Calu-3-Zelhnonoschichten für 18 h in serumfreiem EMEM erzeugte vernachlässigbare Freisetzung von LDH, bis sie am Ende des Experiments (6) hypotonischer Lyse unterworfen wurden. Behandlung von Monoschichten jedes Zelltyps mit den Cystein- und Serin-Proteinase-Fraktionen versagte ebenfalls, trotz der Tatsache, daß sich während des Experiments einige Zellen von dem Matrixsubstrat lösten, bei der Freisetzung signifikanter Mengen von LDH in das Inkubationsmedium (6). Lyse der abgelösten Zellen und der anhaftenden Zellen resultierte in der Gewinnung von LDH, äquivalent in der Menge zu der, die in unbehandelten Zell-Lysaten gefunden wurde (6).
Durch Überprüfen der DNA-Fragmentierung und Untersuchen der Färbung von Zellen mit AV und PI wurde auch der Zelltod untersucht. 7a, b zeigt den Nachweis von DNA-Fragmentierung in MDCK- und Calu-3-Zellen nach der Behandlung mit HDM-Proteinasen unter Bedingungen, die zu einer Zunahme an Permeabilität von Epithelmonoschichten führen. Die Wirkungen beider HDM-Proteinase-Fraktionen wurden durch den Matrix-Metalloproteinase-Inhibitor BB-250 vermindert (7b). E-64 hemmte die Wirkungen der Cystein-Proteinase-Fraktion, aber nicht die der Serin-Proteinase-Fraktion ( 7b). 7 zeigt auch, daß die Behandlung von MDCK- oder Calu-3-Zellen mit der Serin-Proteinase-Fraktion zu einigen Zellen innerhalb der Monoschichten führte, die allein Annexin V binden (AV⁺PI^–), ein Anzeichen für frühe Apoptose in diesen Zellen, und anderen, die sich mit sowohl Annexin V als auch PI färbten (AV⁺PI^–) und Zelltod anzeigen (siehe 7d, f, h, j). Die räumliche Verteilung von frühen apoptotischen AV⁺PI^–-Zellen und toten AV⁺PI^–-Zellen war um Gebiete herum angehäuft, wo es klare Zerstörung der Zellhaftung gab (z. B. siehe 7d, f).
DISKUSSION
Proteine von HDM-Fäkalpellets sind eine Hauptursache von allergischem Asthma (Tovey et al., 1981) und liegen zum großen Teil der wachsenden Prävalenz der Krankheit zu Grunde (Dowse et al., 1985). In dieser Untersuchung haben wir gezeigt, daß Proteinasen aus den Fäkalpellets von D. pteronyssinus starke biologische Wirkungen auf Epithelzellen ausüben. Die HDM-Proteinasen wurden durch Ammoniumsulfat-Ausfällung in eine Cystein- und eine Serin-Klasse fraktioniert. Beide Niederschläge hatten in den untersuchten experimentellen Systemen ähnliche Wirkungen. Sie erzeugten eine Zunahme der Permeabilität von Epithelmonoschichten, verursachten Spaltung der lateralen Zellhaftung und lösten Zellen von dem Biomatrixsubstrat ab. Spaltung und Ablösung von Zellen war nicht mit üppiger Freisetzung von LDH verknüpft, aber es wurde ein Anzeichen von früher Apoptose und völligem Zelltod mit Kernzerreißung gefunden. Inspektion von mit AV und PI gefärbten Zellen enthüllte, daß die Färbung auf Flächen von Zellzerstörung/-ablösung begrenzt war. Wir demonstrierten weiterhin, daß Zelltod durch Proteinase-Inhibitoren vermindert werden konnte.
Ammoniumsulfat-Fällung erwies sich als ein wirksames Mittel zur Trennung der Hauptklassen der Proteinase-Aktivität in dem verbrauchten HDM-Kulturmedium. Die mit 50%igem Ammoniumsulfat ausgefällte Fraktion hatte Cystin-Proteinase-Aktivität und ihre die Permeabilität fördernde Wirkung auf Epithelzellmonoschichten wurde durch E-64, aber nicht den Serin-Proteinase-Inhibitor AEBSF gehemmt. SDS-PAGE- und Immunoblot-Analyse mit mAb 5H8, gesteigert gegenüber dem HDM-Allergen Der p 1 (eine Cystein-Proteinase), enthüllte das Vorhandensein von Banden mit scheinbaren Molekülmassen von ~ 22kDa und ~ 38kDa in dieser Fraktion. Im Gegensatz dazu hatte die mit 50–80%igem gesättigten Ammoniumsulfat ausgefällte Fraktion Serin-Proteinase-Aktivität, und ihre Wirkungen auf Epithelzellen wurden durch AEBSF und zu einem geringeren Grad SBTI, aber überhaupt nicht durch E-64 gehemmt. Wir schließen aus den Untersuchungen mit Inhibitoren, daß es eine minimale funktionale Verschleppung des Cystein-Proteinase-Allergens in diese Fraktion gab. SDS-PAGE- und Immunoblot-Analyse enthüllten das Vorhandensein mehrerer Protein-Banden in der Serin-Proteinase-Fraktion, einige von diesen wurden durch mAb 5H8 erkannt (z. B. ungefähre scheinbare Massen 22, 26, 28, 29 und 38 kDa). Das mAb 5H8 wird in weitem Maße verwendet, um Der p 1 zu reinigen und zu quantifizieren, aber seine Spezifität wurde kürzlich in Frage gestellt (Cambra & Benens, 1996). So ist eine zufällige Erkenntnis aus unserer Untersuchung Grund für weitere Bedenken in Bezug auf die Spezifität dieses Antikörpers. Die Proteinbanden, die in dem 50–80%-Ammoniumsulfat-Niederschlag nachgewiesen wurden, stimmen mit dem Vorhandensein der Serin-Proteinase-Allergene Der p 3, Der p 6 und Der p 9 überein. Auf der Grundlage dieser Beobachtungen schlagen wir vor, daß die Ammoniumsulfat-Fraktionierung von HDM-Kultur-Extrakten ein einfaches und wirksames Mittel bereitstellt, um die biologischen Wirkungen von HDM-Proteinase-Allergenen zu untersuchen und außerdem neue Inhibitoren ihrer Wirkungen zu identifizieren.
Wir haben früher gezeigt, daß hochgereinigtes Allergen Der p 1 eine Zunahme des transepithelialen Flusses von Serumalbumin in der Schleimhaut des Luftweges induziert, eine Zerstörung der Epithelarchitektur verursacht und MDCK-Zellen von natürlichen Biopolymersubstraten ablöst (Herbert et al., 1990; 1995). Wir haben auch demonstriert, daß diese Wirkungen von Der p 1 ein Ergebnis ihrer Cystein-Proteinase-Aktivität waren, weil sie empfindlich gegenüber Hemmung durch E-64, ein relativ spezifischer Inhibitor der meisten Cystein-Proteinasen, waren (Barrett et al., 1982; Shaw, 1994; Herbert et al., 1995). Obgleich Vergleiche der Aminosäuresequenz vorhersagen, daß Der p 1 eine mutmaßliche Cystein-Proteinase ist (Chua et al., 1988; 1993; Stewart, 1994; Topham et al., 1994; Robinson et al., 1997), haben andere vorgeschlagen, daß es als bifunktionelle Cystein-Serin-Proteinase wirken könnte, weil auch berichtet wurde, daß seine Aktivität durch APMSF, ein Inhibitor von Serin-Proteinasen (Hewitt et al., 1995, 1997) gehemmt wird. Wenn das korrekt ist, würde diese vorgeschlagene Bifunktionalität potentiell wichtige Folgen für die Gestaltung spezifischer Inhibitoren von Der p 1 haben. Jedoch argumentieren wir in der vorliegenden Untersuchung gegen die funktionelle Bedeutung der beanspruchten Bifunktionalität, indem wir zeigen (i), daß die Cystein-Proteinase-Fraktion, erhalten aus HDM-Kulturen, durch Konzentrationen von AEBSF, die signifikant die Aktivität der Serin-Proteinase-Fraktion hemmten, nicht gehemmt werden konnte, und (ü), daß die Serin-Proteinase-Fraktion resistent gegen Hemmung durch E-64 bei Konzentrationen ist, bei denen dieser Inhibitor die Cystein-Proteinase-Aktivität blockiert. Ein anderer Beweis dagegen, daß Der p 1 eine gemischte Cystein-Serin-Proteinase ist, ist ebenfalls kürzlich erbracht worden (Chambers et al., 1997).
Die Permselektivität des Bronchialepithels gegenüber hydrophilen gelösten Stoffen wird durch TJs bestimmt, welche peripherisch an dem apikalen Pol jeder Zelle exprimiert werden (Schneeberger & Lynch, 1992). Es wird angenommen, daß zusammenhängende Expression der TJ-Proteine einer Zelle und ihr nahes Gegenüberstehen mit TJ-Proteinen auf angrenzenden Zellen dazu führt, daß das Epithel imstande ist, seine dichtschließenden Eigenschaften zu entwickeln (Anderson & Van Itallie, 1995; Robinson 1995). Zerstörung der Wechselwirkung der TJ-Proteine zwischen den Zellen, zum Beispiel durch die Bildung von Diskontinuitäten in ihrer perijunktionalen Lokalisation, ist mit dem Versagen von Epithelbarrieren verbunden (Howarth et al., 1994; Zhong et al., 1994; Stuart et al., 1994; Stuart & Nigam, 1995). Beide Fraktionen von HDM-Proteinase, die in dieser Untersuchung verwendet wurden, verursachten den Zusammenbruch von TJs, wie durch den Verlust perijunktionaler Färbung von ZO-1 eingeschätzt wurde. Etwas Zerstörung von Desmosomen wurde ebenfalls beobachtet. Der Zusammenbruch von TJs führte zu einer vergrößerten Permeabilität von Epithelmonoschichten, und schließlich erfolgte physikalische Ablösung von Zellen von dem Substrat. Der Verlust von ZO-1 von TJ und Desmoplakin von Desmosomen war von exogener Proteinase-Aktivität abhängig, weil der Vorgang durch E-64 (in dem Fall der Cystein-Proteinase-Fraktion) und AEBSF (in dem Fall der Serin-Proteinase-Fraktion) geschwächt wurde. Obwohl ZO-1 und Desmoplakin intrazelluläre Proteine sind und es so unwahrscheinlich ist, daß sie durch exogene Proteinasen abgebaut werden, ist ihr Zusammenbruch als Folgerung der Zerstörung anderer Komponenten von TJ und Desmosomen mit freigelegter Membran erklärbar. Es wurde sich auf einen ähnlichen Mechanismus berufen, um Änderungen in anderen intrazellulären Proteinen nach der Spaltung interzellulärer Kontakte zu erklären (Volk et al., 1990).
Die Wirkungen der Proteinasen führten nicht zu signifikanter Freisetzung von LDH durch die Zellen. Jedoch führte die Behandlung mit jeder der beiden Proteinase-Fraktionen zu einigen Zellen, die Zeichen von früher Apoptose (AV⁺PI^–) oder völligen Zelltod (AV⁺PI^–) zeigten. Die Zellen können nach mehrfachen Mechanismen in Apoptose eintreten (eine Übersicht ist bei Hale et al., 1996 gegeben), die Änderungen in homotypischer und heterotypischer Zellhaftung und Zell-Matrix-Bindung (Boudreau et al., 1995, 1996; Mahida et al., 1996; Frisch & Francis, 1994) einschließen. Ein frühes signalisierendes Ereignis bei programmiertem Zelltod ist die Zerstörung von zytoskeletalen Proteinen mit Phospholipid-Bindung, die zu der transmembranen Neuverteilung von Phosphatidylserin führt (Martin et al., 1995 a, b). Das Gerüst zytoskeletaler Proteine wird normalerweise durch direkte Wechselwirkung mit Proteinkomponenten interzellulärer Verbindungen stabilisiert und gehalten (Furuse et al., 1994; Anderson & Van Itallie, 1995), was darauf schließen läßt, daß Proteolyse interzellulärer Adhäsionen, speziell TJ, das kritische Ereignis beim Aufbau der Zellreaktion gegenüber Proteinase-Allergenen sein könnte. Die Fähigkeit von E-64, die Wirkung der Cystein-, aber nicht der Serin-Proteinase-Fraktion zu hemmen, läßt darauf schließen, daß E-64 in dem Prozeß, der zu Permeabilitätsänderungen und Apoptose führt, anstatt durch Hemmen eines distalen proteolytischen Schritts in einem Überführungsmechanismus in einem proximalen Schritt wirkte. Weiterhin haben intrazelluläre signalisierende Proteinasen der ICE/ced-3-Caspase-Familie, die bei Apoptose unter anderem durch Fas/APO-1-Ligation aktiviert werden (Los et al., 1995; Mariani et al., 1995; Kayagaki et al., 1995; Tanaka et al., 1996), ein ungewöhnliches Inhibitorprofil, indem sie unempfindlich gegenüber E-64 sind. Im Gegensatz dazu kann die hemmende Wirkung von BB-250 durch die Verhinderung der Freisetzung von Fas-Ligand erfolgen (Mariani et al., 1995; Kayagaki et al., 1995).
Lungensensibilisierung für luftübertragene Allergene wie beispielsweise diejenigen von HDM ist für die Pathogenese von allergischem Asthma zentral. Das Lungenepithel bildet ein Barriere, die fremde Proteine durchqueren müssen, bevor sie allergische Sensibilisierung verursachen können, aber der Mechanismus, durch welchen Allergene die Epithelbarriere durchqueren, wird schlecht verstanden (Robinson et al., 1997). Die enzymatische Natur von Proteinen, die aus HDM-Fäkalpellets erhalten werden, stellt eine Erklärung des Mechanismus bereit, durch welchen Allergene auf das Immunsystem treffen. Durch Verursachen fokaler Zerstörung von Tight junctions und letztendlich den Verlust einer sterbenden Zelle würden HDM-Proteinasen fähig sein, die parazelluläre Permeation von Allergenen zu Antigen darbietenden Zellen zu verstärken. Es ist bemerkenswert, daß das lokalisierte Trauma und der Zelltod, erzeugt durch proteolytische Spaltung interzellulärer Verbindungen, auch einige Bedingungen des „Gefahrenmodells" adaptiver immunologischer Reaktion erfüllen und so erklären kann, warum auf Antikörper gerichtete Reaktionen hervorgerufen werden (Matzinger, 1994; Ridge et al., 1996). In weiterer Unterstützung für diese Ansicht hat neueres Beweismaterial vermuten lassen, daß, wenn bei Vorhandensein von Gewebeverletzung Apoptose (oft als eine immunologisch „stille" Form von Zelltod angesehen) erfolgt, der resultierende vereinte Stimulus tatsächlich bedrohlich für Antigen darbietende Zellen ist (Bockvar et al., 1994; Casciola-Rosen et al., 1994; Ibrahim et al., 1996).
Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, daß HDM-Proteinasen Wirkungen auf Epithelzellen haben, die wahrscheinlich allergische Sensibilisierung fördern. Die Fähigkeit spezifischer Inhibitoren, die Reaktionen von Epithelzellen auf Proteinase-Allergene zu stören, stellt ein Grundprinzip für die Verhütung und/oder Behandlung allergischer Leiden bereit.
DOKUMENTE
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LEGENDEN ZU DEN FIGUREN
1.
SDS-PAGE (Feld a) und Immunoblot-Analyse (Feld b) von HDM-Proteinase-Fraktionen. Schlüssel zu Bahnen in Feld a: Immunoaffinitäts-gereinigtes Der p 1 (1); HDM-Cystein-Proteinase-Fraktion (2) und HDM-Serin-Proteinase-Fraktion (3). Die Proteine wurden mit Coomassie-Blaufärbung sichtbar gemacht. Feld b zeigt das Imnmunoblot, hergestellt aus dem Gel in Feld a. Die Proteine wurden unter Verwendung von mAb 5H8 (anti-Der p 1) nachgewiesen und durch ECL-Technik sichtbar gemacht. Man beachte den Nachweis von immunoreaktiven Proteinen durch mAb 5H8 in der Serin-Proteinase-Fraktion zusätzlich zu der erwarteten Immunoreaktivität der Cystein-Proteinase-Fraktion. Volle Kreise zeigen Massenkalibrierungsstandards an und Pfeile zeigen scheinbare Molekülmassen von Banden an, die aus den Mobilitäten von farbstoffmarkierten Standards berechnet wurden.
2.
Verdünnungsreaktionskurven, die die Wirkungen von 18 h Einwirkung der Serin-Proteinase-Fraktion, hergestellt aus HDM-Kulturen, auf Zellmonoschichten zeigen. Feld (a) zeigt die Mannitol-Permeabilität von MDCK-Epithelzellen unter Kontrollbedingungen (serumfreies EMEM allein) und nach Behandlung (Proteinase-Fraktion verdünnt in serumfreiem EMEM). Feld (b) veranschaulicht ähnliche Untersuchungen, durchgeführt in Calu-3-Bronchialepithelzellen. Die Daten sind der Mittelwert ± mittlerer Standardfehler aus 4–6 Experimenten. Proteinase-Allergen-Aktivität (ausgedrückt in Azocoll-Einheiten ml ^–1) ist durch die Zahlen unter den vollen Säulen angezeigt. Sterne zeigen statistisch signifikante Unterschiede im Hinblick auf die Reaktion der unbehandelten Kontrolle (serumfreise EMEM-Medium) für jeden Zelltyp an.
3.
Hemmung der Wirkungen von HDM-Proteinase-Fraktionen auf die Mannitol-Permeabilität in MDCK-Zelhnonoschichten. Feld (a) zeigt die Wirkungen von E-64 (10 μM) auf die Wirkung, die durch die Cystein-Proteinase-Fraktion (80 Azocoll-Einheiten ml^–1) erzeugt wird. Kontrollzellen wurden serumfreiem EMEM ausgesetzt, das 0,5 mM reduziertes Glutathion enthielt. Feld (b) veranschaulicht die Wirkungen von AEBSF (100 μM) auf die Wirkungen der Serin-Proteinase-Fraktion (127 Azocoll-Einheiten ml^–1). Die Daten sind der Mittelwert ± mittlerer Standardfehler aus 3–5 Experimenten. Die Kontaktzeit betrug in allen Fällen 18 h. In beiden Feldern (a) und (b) gibt es statistisch signifikante Unterschiede zwischen den Permeabilitäten der Kontrolle und der mit Proteinase behandelten Monoschichten und auch zwischen den Monoschichten, die mit den Proteinasen in Anwesenheit und Abwesenheit von Inhibitoren behandelt wurden. Signifikante Vergleiche werden in der Figur durch die eingabelnden Linien und die angezeigten Wahrscheinlichkeitswerte gezeigt.
4
Feld (a) veranschaulicht die Wirkungen von 100 μM AEBSF auf die Änderungen der Mannitol-Permeabilität, hervorgerufen in Calu-3-Zelhnonoschichten, nach 18 h Einwirken der Cystein-Proteinase-Fraktion (80 Azocoll-Einheiten ml^–1). Die Daten sind der Mittelwert ± mittlerer Standardfehler in 3 Experimenten. Feld (b) veranschaulicht die Wirkungen von 10 μM E-64 auf die Änderungen in der Mannitol-Permeabilität, hervorgerufen in Calu-3-Zelhnonoschichten, nach 18 h Einwirken der Serin-Proteinase-Fraktion (94 Azocoll-Einheiten ml^–1). Die Daten sind der Mittelwert ± mittlerer Standardfehler aus 3 Experimenten. In beiden Beispielen wurden die Kontrollzellen mit serumfreiem EMEM-Medium allein (mit 0,5 mM reduziertem Glutathion in dem Fall der Cystein-Proteinase -Fraktion) behandelt.
5
Immunfärbung des TJ-Proteins ZO-1 (Felder a–e) und des desmosomalen Plaque-Proteins Desmoplakin (Felder f–j) in MDCK-Zelhnonoschichten. Die Felder a, f zeigen Immunfärbung von Zellen, die serumfreiem EMEM als Kontrolle ausgesetzt waren. Das Muster der Immunfärbung nach Behandlung mit der Cystein-Proteinase-Fraktion (80 Azocoll-Einheiten ml^–1) ist in den Feldern b, g, und die Modifizierung dieser Reaktion durch E-64 (10 μM) in den Feldern c, h gezeigt. Das Muster der Immunfärbung nach der Behandlung mit der Serin-Proteinase-Fraktion (94 Azocoll-Einheiten ml^–1) ist in den Feldern d, i und die Modifizierung dieser Reaktion durch AEBSF (100 μM) in den Feldern e, j gezeigt.
6
Messung der LDH-Freisetzung nach Behandlung von MDCK- oder Calu-3-Zellen mit HDM-Proteinase-Fraktionen für 18 h. Feld a zeigt das Fehlen der Freisetzung von LDH von Zellen unter Kontrollbedingungen, bis die Monoschicht hypotonischer Lyse unterworfen wurde. Feld a zeigt auch, daß Behandlung mit der Cystein-Proteinase-Fraktion (80 Azocoll-Einheiten ml^–1 nach Aktivierung mit 0,5 mM reduziertem Glutathion) zu keiner Freisetzung von LDH in das Medium während des Behandlungszeitraums führte. Man beachte, daß während der Behandlung alle Zellen von den Vertiefungen abgelöst wurden und daß die hypotonische Lyse der abgelösten Zellen zu der Wiedergewinnung der gleichen Menge von LDH-Aktivität führte, die in den Kontrollzellen gemessen wurde. Feld b veranschaulicht ein ähnliches Experiment unter Verwendung der Serin-Proteinase-Fraktion (114 Azocoll-Einheiten ml^–1). Man beachte, daß während des Behandlungszeitraums nicht alle Zellen abgelöst wurden, aber daß die Summe der LDH-Aktivität in lysierten anhaftenden und lysierten abgelösten Zellen der Menge entspricht, die in Kontrollzellen nachgewiesen wurde. Die Felder c und d zeigen ähnliche Experimente, durchgeführt in Calu-3-Zellen. Man beachte, daß es unter Kontrollbedingungen eine kleine Hintergrundfreisetzung von LDH aus diesen Zellen (< 10% des gesamten Zell-LDH) gab und daß dies durch Proteinasebehandlung nicht signifikant geändert wurde. Die gezeigten Daten sind der Mittelwert ± mittlerer Standardfehler aus 4 Experimenten.
7
Agarosegel-Elektrophorese von DNA (Felder a, b) und Zellfärbung mit AV und PI (Felder c–j) nach der Behandlung von MDCK- und Calu-3-Zellen mit HDM-Proteinase-Fraktionen. Feld a zeigt Proteinaseinduzierte DNA-Fragmentierung in MDCK-Zellen. Schlüssel zu den Bahnen: DNA-Marker (1, 10); unbehandelte Zellen (2, 3); Zellen, behandelt für 18 h mit 10 μM Camptothecin (positive Kontrolle) (4, 5); Zellen, behandelt für 18 h mit Serein-Proteinase-Fraktion (114 Azocoll-Einheiten ml^–1) (6, 7) und Zellen, behandelt mit Cystein-Proteinase-Fraktion (80 Azocoll-Einheiten ml^–1 nach Aktivierung) für 18 h (8, 9). Feld b zeigt DNA-Fragmentierung in Calu-3-Zellen. Schlüssel zu den Bahnen: DNA-Marker (1, 11); unbehandelte Zellen (2); Zellen, behandelt für X h mit Serin-Proteinase-Fraktion (94 Azocoll-Einheiten ml ^–1) (3); Zellen, behandelt mit Cystein-Proteinase-Fraktion (80 Azocoll-Einheiten ml^–1 nach Aktivierung) für 18 h (4); unbehandelte Zellen bei Vorhandensein von BB-250 (5 μM) (5); wie Bahn 3, aber Zellen behandelt bei Vorhandensein von 5 μM BB-250 (6); wie Bahn 4, aber Zellen behandelt bei Vorhandensein von 5 μM BB-250 (7); unbehandelte Zellen bei Vorhandensein von 10 μM E-64 (8); wie Bahn 3, aber Zellen behandelt bei Vorhandensein von 10 μM E-64 (9); wie Bahn 4, aber Zellen behandelt bei Vorhandensein von 10 μM E-64 (10). Die Felder c–f zeigen Fluoreszenzmikroskopie von AV- und PI-(e, f)-Färbung von Calu-3-Zellmonoschichten unter Kontrollbedingungen (c, e) und nach Behandlung für 18 h mit der Serin-Proteinase-Fraktion (135 Azocoll-Einheiten ml^–1) (d, f). Die Felder c, d zeigen das Färbungsmuster unter Blaulichtanregung und e, f zeigen dieses unter Grünlichtanregung. Die Felder g–j zeigen Beispiele von MDCK-Zellmonoschichten mit der gleichen Anlage wie die Felder c-f. Bei beiden Zelltypen beachte man die praktische Abwesenheit von AV- und PI-Färbung in unbehandelten Zellen. In den Feldern d, f umgrenzt das Färbungsmuster teilweise ein Gebiet von Zellablösung in der Monoschicht, und man beachte, daß einige Zellen sowohl AV- wie auch PI-Färbung zeigen. In den Feldern h, j ist die Mehrzahl der gefärbten Zellen positiv für sowohl AV als auch PI und es war keine signifikante Ablösung von Zellen aus dem Substrat ersichtlich.

Claims

Verwendung eines Inhibitors der Cystein-Proteinase-Aktivität in Verbindung mit einem Inhibitor der Serin-Proteinase-Aktivität für die Herstellung eines Medikaments für die Verhütung oder Behandlung eines Leidens, bei welchem ein Allergen eine Epithelbarriere überquert.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das allergische Leiden Asthma ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das allergische Leiden ein allergisches Leiden, ausgewählt aus Rhinitis, allergischer Konjunktivitis, Atopik-Dermatitis oder Nahrungsmittelallergien, ist.
Verwendung nach Anspruch 1 bis 3, wobei der Serin-Proteinase-Inhibitor die Aktivität einer beliebigen Serin-Proteinase, die eine andere als Trypsin ist, hemmt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Inhibitor der Serin-Proteinase-Aktivität ein Inhibitor der Serin-Proteinase-Aktivität eines Allergens ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Inhibitor der Serin-Proteinase-Aktivität ein Inhibitor der Serin-Proteinase-Aktivität von Der p3, Der p6 oder Der p9 ist.