JPH11509543A

JPH11509543A - ＩｇＥ媒介アレルギー性疾患の治療において使用するためのシステインプロテアーゼ阻害剤

Info

Publication number: JPH11509543A
Application number: JP9506421A
Authority: JP
Inventors: トニージョンソン; テランスハート; ピーターラング; ファロークシェイキブ; マーティンキーベル
Original assignee: ペプチドセラピュティックスリミテッド
Priority date: 1995-07-17
Filing date: 1996-07-17
Publication date: 1999-08-24
Also published as: CA2227198A1; EP0839155B1; ES2230566T3; AU716716B2; EP0839155A1; US6034066A; AU6524296A; ATE279433T1; DE69633623T2; WO1997004004A1; DE69633623D1

Abstract

(57)【要約】本発明は、若年性喘息および湿疹を包含する、アレルギー性諸疾患の治療で使用するための化合物に関する。これらの化合物は、主な環境上のおよび職業上のアレルゲンに対する、IgE 媒介反応を阻害することができる。これらは、またアレルギーに罹る可能性のある個体（例えば、遺伝的に喘息に罹患する危険のある個体および作業場で職業上のアレルゲンに暴露される個体）に投与した場合に、環境上のおよび職業上のアレルゲンに対するアレルギー感作を防止することにより、アレルギー性疾患に対して予防作用をもつことができる。本発明の化合物はまた、その場でのアレルゲンのアレルゲン性を不活性化または減衰するためにも有用であり得る。本発明は、新規な化合物およびリガンド自体、該化合物を含有する薬理組成物、該化合物および該薬理組成物の製法、該化合物および該組成物を、IgE 媒介アレルギー性疾患の治療または予防において、並びにその場でのアレルゲンの不活性化または減衰における使用法を提供する。本発明は、またアレルギー−発生生物の生存性を低下もしくは該生物を破壊するための手段をも提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 IgE 媒介アレルギー性疾患の治療において使用するためのシステインプロテアーゼ阻害剤発明の分野本発明は若年性喘息および湿疹を包含するアレルギー性諸疾患の治療において使用するための化合物に関するものである。本発明の化合物は、主な環境上のおよび職業上のアレルゲンに対する、IgE 媒介反応を阻害することができる。これら化合物は、また発症の可能性のある個体（例えば、遺伝的に喘息の可能性のある者および作業場において、職業上アレルゲンに暴露されている者）に投与した場合に、環境上並びに職業上の抗原に対する、アレルギー感作を防止することにより、アレルギー性諸疾患を予防する作用をも有する。本発明の化合物は、またその場でのアレルゲンの不活化またはそのアレルギー性の緩和のためにも有用であり得る。本発明は、新規な化合物およびリガンド自体、該化合物を含有する薬理組成物、該化合物および薬理組成物の製法、およびIgE 媒介アレルギー性疾患の治療における、およびその場でのアレルゲンの不活化または減衰における、該化合物および組成物の使用方法をも提供する。更に、本発明はアレルギー−発生生物の生存性を減じもしくは該生物を破壊するための手段をも提供する。本発明は、IgE 媒介アレルギー性疾患における、CD23としても知られるIgE(Fc eRII)に対する、低−アフィニティーレセプタの役割に関する我々の新たな解釈により可能となった。関連技術の説明 CD23の複数の役割：CD23は、免疫応答の調節、特にIgE 応答の調節において重要な役割を演じている。CD23は、細胞表面タンパクの一種であり、原形質膜から柄を介して伸びており、該柄は免疫応答中にタンパク分解反応的に開裂される。我々は、CD23がDer pIにより開裂されることを立証した。ここで該Der pIはハウスダストダニの主なアレルゲンであるプロテアーゼであるが、CD23の開裂を行う内因性のプロテアーゼは、同定されていない。CD23は、その膜結合型において、 IgE に対する細胞性レセプタとして機能し、かつＢ細胞、Ｔ細胞、血小板、好酸球、ケラチン細胞を包含する種々の細胞型上に、並びにＴおよびＢリンパ細胞に対する抗原を提示する、抗原提示細胞（小胞樹状細胞を含む）上に見出される。該細胞表面におけるCD23の発現レベルが、その機能性を決定し、かつサイトカイン、特にIL4 により調節される。その膜結合型において、CD23は好酸球が抗原−特異的IgE を介して寄生虫に付着することを可能とする。これは、またＢリンパ細胞（抗体を産生する）に対して重要な調節的役割をも演ずる。恐らくアレルゲンと免疫錯体の形状にある、可溶性のIgE の存在下で、細胞表面CD23は、IgE で占有され、阻害シグナルをB-リンパ細胞に搬送する。これは、IgE 合成の調節における、重要な負のフィードバックループであると考えられている。膜結合CD23のIgE による占有は、CD23をタンパク分解反応による開裂から保護し、可溶性CD23（以下を参照のこと）の「サイトカイン活性」型の遊離を阻害する。該可溶性CD23は、免疫グロブリンの他の組に抗して、IgE の生産を有利にする。 CD23は、IgE 以外のリガンド（または「対抗構造(counterstructures)」）とも相互作用する。活性化されたＢ細胞上のCD23と、リンパ節の小胞の樹状細胞上の CD21（２補体レセプタ“CR2”型）と結合することにより、細胞表面CD23は細胞間接着分子として機能する。CD23のこの機能は、胚中心Ｂリンパ細胞を、「アポプトーシス(apoptosis)」（即ち、プログラム化された細胞の死）から救済し、さもなくば死に至るであろう抗体産生クローンの生存を可能とする上で重要である。また、CD23が、Ｔリンパ細胞（即ち、HLA クラス-II 分子）に対して抗原性ペプチドを提示する、該細胞表面分子と結合することは明らかであり、また結果として、Ｔリンパ細胞に対する抗原の提示に影響を与える可能性がある。更に、ランゲルハンス細胞（抗原提示細胞の一種）上のCD23の発現の存在およびその程度、並びにアレルゲンおよびIgE を含む免疫錯体に対するそのアフィニティーも、このような錯体がどの程度プロセッシングされ、Ｔリンパ細胞に対して提示されるかを決定するであろう。CD23は、従ってＢおよびＴリンパ細胞両者に対する抗原提示に影響を与え、外来抗原に対する免疫応答性の程度および性質を決定するようにプロセッシングされる。 CD23のタンパク分解による開裂：天然のCD23(45 kDa)は、柄領域内の幾つかのサイトにおけるタンパク分解による消化により、該細胞表面から開裂された、可溶性のCD23(sCD23)を生成できる。最大の可溶性フラグメントは、37 kDaのものである。膜−遠位レクチンドメインにより近接した開裂は、このレクチンドメインと、C-末端尾部とを含有する33、29および25 kDaの可溶性フラグメントを与える。sCD23 の幾つかの型（特に37 kDaのもの）は他の細胞上で活性である。かくして、ガディエリ(Ghadieri)等およびボネフォイ(Bonnefoy)等は、sCD23(37kDa) が、nm／ml程度の濃度にて、脱顆粒を引き起こすマスト細胞の強力な刺激剤であることを立証した。更に、sCD23 のより大きな型のものも、サイトカイン活性をもち、該活性は、アレルギー性、抗−寄生虫性および慢性型の免疫応答と関連した、IgE およびIgG4サブクラス抗体の生産を有利なものとする。事実、インビトロ実験は、IL4 の存在下で、sCD23 が、IgE 産生Ｂ細胞の原形質細胞への分化を誘発することを示した（リュー(Liu),ゴードン(Gordon)）。IgE 合成に関するCD 23の調製機能は、CD23に対する抗体（これは抗原−特異的IgE 応答を阻害する）を使用し、またCD23遺伝子−ノックアウトマウス（ここでは抗原−特異的IgE 応答が大きくされている）を使用して、インビボで確認されている。これらの動物実験から得たデータに加えて、sCD23 およびCD23正末梢血リンパ細胞の高い濃度が、アトピー個体において観測されることが報告されており（ガディエリ(Ghadieri)等）、このことはCD23がIgE 免疫応答における重要な調節因子であることと関連する。これらの考察から、CD23が免疫応答の性能および量を決定する上で、特に体液性免疫性能（即ち、特異的抗体の生産）に影響を与える、重要な調節機能をもつことが明白である。更に、CD23の物理的形状（即ち、細胞型対可溶性型）は、特にＢリンパ細胞のIgE 応答の場合に、その調節機能に大きな影響を与える。かくして、CD23はその細胞型において、IgE 合成の負のフィードバック阻害に関連している。これとは対照的に、CD23はその可溶性型において、そのサイトカイン活性を介して、IgE 産生を刺激する。従って、CD23の細胞型と可溶性型との間のバランスは、免疫応答の特性決定において、特にIgE が特定の抗原に対して生成されたか否か、およびどれほどのIgE が生成されたかを決定する上で重要な役割を演じていることが分かっている。しかしながら、CD23の開裂をもたらし、かつ膜結合型と可溶性型との間のバランスを決定ずけるプロテアーゼの特性は、未だ確立されていないが、周辺的な証拠によってしか支持されていない、一般的な理論は、CD23が自己触媒的であり、該原形質膜からのそれ自身の開裂をもたらすというものである。マウスおよびヒトにおける、幾つかの環境および職業上のアレルゲン研究の、タンパク分解活性は、環境的アレルゲンのアレルギー感作能力が、幾つかの場合にはそのタンパク分解活性と関連していることを示唆している。かくして、パパイン（パパイヤのシステイニルプロテアーゼ）は、ヒトにおける強力なアレルゲンである。また、吸入されたブロメライン（パインアップルのシステイニルプロテアーゼ）は、職業的なアレルギーおよび喘息を発生する(ガイホッファー(Gaih offer)，1988)。また、多くの喘息に罹った個体が感受性をもつ、ハウスダストダニの主なアレルゲン(Der pI)は、タンパク分解活性をもつ。環境的抗原および寄生虫のタンパク分解酵素は、Ｔリンパ細胞応答の性能に影響を与えて、IgE 産生を有利なものとする（フィンケルマン(Finkelmann)，1992により概説されている）が、どのようにしてこれを実行するかは未だ確立されていない。従って、マウスの幾つかの種に、パパインを毎日皮下注射したところ、非−特異的なIgE の顕著な増加をもたらし、これは該酵素の触媒活性を予め不活性化することにより大幅に低下する。活性パパインによる全IgE レベルの増大は、T-ヘルパーリンパ球のＴ_N ２サブセットのサイトカイン特性の発生と関連しており、該T-ヘルパーリンパ球のＴ_N ２サブセットは、アレルギーおよび抗−寄生虫応答に関与している。しかしながら、パパインがIgE 産生を高める、このタンパク分解メカニズムの基質は、未だ同定されていない。発明の概要一般的な教示によれば、CD23は推定上の自己タンパク分解活性（即ち、基質としてのCD23に対する、CD23自体のタンパク分解活性）により、原形質膜から開裂される。CD23以外の、（内因性または外因性の）候補プロテアーゼは提案されていない。更に、CD23の推定上の「自己タンパク分解(autoproteolytic)」活性は、未だ立証されていない。従って、驚いたことに、高純度の形状の、該外因性プロテアーゼおよびアレルゲンDer pIは、培養Ｂリンパ細胞の該原形質膜からCD23を開裂する際に、極めて効果的かつ特異的であることが、今や見出された。CD23の開裂は、IgE 合成を支配する重要な調節段階であるから、Der pIの強力なアレルギー感作活性（即ち、そのアレルゲン性）は、部分的に、該細胞表面からCD23を開裂するその能力に存在する。Der pIのタンパク分解活性がそのアレルゲン性と関連しているであろうことが、以前に予想されてはいたが、この推定上のタンパク分解事象のメカニズムに関する説明は何等提出されず、しかもこのタンパク分解活性に関する基質として、如何なる候補も以前に提案されていない。本発明の第一の局面において、我々は、（ゴードン等）によるCD23の開裂が、 i)システインにより刺激され、ii) 特異的なシステイニルプロテアーゼ阻害剤E6 4 により阻害され、かつiii)トリプシンプロテアーゼ阻害剤α-1- アンチトリプシン（これは、トリプシン同様に、種々のトリプシン−様プロテアーゼを阻害する）によっては阻害されない。この化合物E64 は、L-トランス−エポキシサクシニル−ロイシルアミド（4-グアニジノ）ブタン（UKプーレ(Poole)のシグマ(Sigm a)社）である。これらの発見は、Der pIが実際に、初期の研究により示唆されたように、システイニルプロテアーゼであることを立証しており、更にCD23の開裂を行うのが、 Der pIの該システイニルプロテアーゼ活性であることをも立証している。これらの考察から、（E64と同様に）システイニルプロテアーゼを阻害できる、E64 以外の本発明の化合物も、Der pIによるCD23の開裂を阻害するであろうことが分かる。これは、Der pIにより開裂される、CD23の該開裂サイトを含むペプチド配列並びにその類似体を包含するであろう。CD 4の生物学的に活性な類似体についてファンリゲンモータル(Van Regenmortal)等により最近記載されているように、該類似体は、排他的に天然の開裂サイトのD-アミノ酸およびその逆配列を生成する「逆-D(reverse-D)」ペプチドを包含する、D-アミノ酸類似体を包含するであろう。本発明の第二の局面においては、我々は今や、該プロテアーゼ阻害剤ヒトα-1 - アンチトリプシンは、Der pIを阻害するというよりも、寧ろ特異的サイトにおいて開裂されるDer pIに対する基質であることを立証した。このサイトは、1995 年７月17日以来、“QVS/SGF”であると同定された（カルシュカー(Kalsheker)N. 等，1996）。（CD23開裂サイトについて上記したような）ペプチド類似体および該サイトの非−ペプチド模倣体も、Der pIの特異的な阻害剤である。本発明のこのような化合物は、従ってDer pIの阻害剤について上記したような用途（即ち、 Der pIによるCD23のインビボ開裂の阻害）をもつ可能性がある。更に、Der pIはハウスダストダニの体外消化酵素の一つであるから、Der pIの阻害剤は、この酵素の失活による「非消化」（即ち、栄養欠乏）状態を、該ダストダニに生ぜしめることを可能とする。事実、該ハウスダストダニの食物は、主としてヒトの皮膚片（これはα-1- アンチトリプシンを含む）を含有するので、該皮膚片を消化するためには、Der pIは、α-1- アンチトリプシンを破壊もしくは不活性化する必要がある。従って、本発明の第三の局面において、Der pIの阻害剤は、ハウスダストダニに対して、（栄養欠乏を介して）「毒性」作用を及ぼすものと予想される。 Der pIの阻害剤は、Der pIのアレルゲン性（即ち、感作活性）を減衰することに加えて、その場でハウスダストダニを殺すのに有用であり得る。我々は、これらの作用が相乗的に機能して、家具（ベッド、カーペット等）に適用するための高度に効果的な抗−喘息薬を与えるものと考える。ここで、該家具はハウスダストダニの自然の棲息地である。 Der pIにより放出された、CD23の天然の45 kDa型の主な開裂フラグメントは、 (SDS-電気泳動によっては)CD23の主な天然産の開裂フラグメント、即ち25 kDaのフラグメントから識別できない。しかしながら、Der pIにより遊離される該フラグメントのN-末端の配列分析は、Der pIにより認識される該開裂サイトQVS/SGF が、この25 kDaのフラグメントを生成する、該天然の開裂サイトと区別されることを立証している。少量の、CD23のより大きな(多分「サイトカイン活性な」)型も、Der pIにより生成され、このことは該柄領域のより膜に近い付随的な開裂サイトの存在を示している。更なるC-末端尾部における開裂サイトも、我々により SAE/SMG として同定されている。 Der pIの該CD23開裂活性をもつ阻害剤（例えば、E64 およびその類似体）も、 CD23を開裂する内在性プロテアーゼを阻害できるので、該プロテアーゼがDer pI に対する特異性において同等であろうとなかろうと、本発明は、外因性プロテアーゼ、例えばDer pIおよびブロメライン並びにタンパク分解活性をもつ幾つかの他の環境上のアレルゲンに加えて、CD23を開裂する内因性プロテアーゼの阻害剤を含む。合法的に許容されるように、本発明はアレルギー性諸疾患、例えば若年性喘息および湿疹の治療のための、CD23の酵素的開裂（内因性または外因性プロテアーゼの何れによるものであれ）の阻害剤の使用、並びに環境上の感作試薬またはアレルゲン、例えばDer pIおよびブロメラインのタンパク分解活性の不活性化のための、このような阻害剤の使用をも包含する。第三の局面において、本発明は新規な化合物を提供し、該化合物はシステイニルプロテアーゼ阻害剤活性を有し、L-トランス−エポキシサクシニル−ロイシルアミド（4-グアニジノ）ブタン(E64)を除き、インビボで膜結合CD23のタンパク分解による開裂を阻害することができる。第四の局面において、本発明はシステイニルプロテアーゼ阻害性化合物を提供し、該化合物は、E64 を除く、酵素Der pIの阻害剤と本質的に等価な構造をとることができる化学組成物を含み、場合によってはアレルギー性疾患の治療に使用するための、製薬上許容される担体または賦形剤をも含む。第五の局面において、本発明は、E64 を除く、Der pIの阻害剤の部分の薬作用発生団パターンと本質的に等価な、薬作用発生団パターンをもつ構造をとることができる、システイニルプロテアーゼ阻害性化合物を提供する。第六の局面においては、本発明はリガンドを提供し、該リガンドは、システイニルプロテアーゼ阻害性化合物と交叉反応し、また該阻害性化合物は、E64 を除く、酵素Der pIを阻害する。該化合物は以下のものを含むモチーフの１以上のコピーを含む： i) 水素結合供与体、 ii) ３つの疎水性部分、および iii)水素結合受容体。第七の局面において、本発明は以下の一般式(I)の化合物又はリガンドを提供する。ここでＸ、ＹおよびＺはＮまたはCHであり、 R₁はN-末端窒素原子の遮断基であり、 R₂、R₃およびR₄はＸ、ＹおよびＺ上の側鎖であり、Ｗは、Der pIの活性システインのチオールと不可逆的に反応する基である。第八の局面において、本発明はIgE 媒介アレルギー疾患の治療用の薬物を提供し、該薬物は活性成分として、有効量の、システイニルプロテアーゼ阻害剤、特異的サイトにおいてDer pIと反応する、Der pIに対する基質、およびDer pIのタンパク分解酵素活性を阻害できるDer pI阻害剤からなる群から選ばれる化合物を含み、該薬物は場合により１種以上の製薬上許容される担体、アジュバントまたは賦形剤を含む。第九の局面において、本発明はDer pIのアレルゲン性を減衰しまたは不活性化するための薬剤を提供し、これは活性成分として、有効量の、Der pI阻害活性を有する化合物を含み、該薬物は場合により１種以上の製薬上許容される担体、アジュバントまたは賦形剤を含む。第十の局面において、本発明はハウスダストダニの生存性を減じもしくはこれを破壊するための薬物を提供し、該薬物は活性成分として、有効量の、Der pI阻害活性を有する化合物を含み、該薬物は場合により１種以上の製薬上許容される担体、アジュバントまたは賦形剤を含む。第11の局面において、本発明は、本発明の化合物またはリガンドの製法を提供し、該方法はシステイニルプロテアーゼ阻害性化合物またはリガンドを合成し、および場合により該化合物またはリガンドを担体と複合化する工程を含む。従って、まとめると、本発明は、ハウスダストダニ分泌物（Der pI）の主なアレルゲンが、B-リンパ細胞の細胞表面由来のおよび恐らく他の細胞型由来のCD23 （IgE に対する低アフィニティーレセプタ）を開裂することができる。我々は、この活性がシステインにより刺激され、かつ周知のシステイニルプロテアーゼ阻害剤E64 により壊滅できることを立証した。本発明は、特に外因性プロテアーゼ（例えばDer pI）による、細胞の原形質膜からのCD23のタンパク分解による開裂を阻害することのできる化合物および該細胞からCD23を開裂する、内因性プロテアーゼを阻害できる化合物に関する。これらの化合物は、またアレルギー症状を呈する危険性のある個体（例えば、遺伝的に喘息に罹る可能性のある個体および職業的にアレルゲンに暴露される個体）に投与した場合に、環境的および職業的抗原に対するアレルギー性の感作を防止することによる、アレルギー性諸疾患に対する予防効果をももつことができる。本発明の化合物は、またその場で環境的なアレルゲン（例えば、ベッド、カーペットおよび電気掃除機中のハウスダストダニ分泌物アレルゲンDer pI）の、タンパク分解活性の不活性化のために使用することもできる。これらアレルゲンのタンパク分解活性の不活性化は、該細胞表面由来のCD23を開裂する能力に基づくそのアレルゲン性（即ち、アレルギーおよび喘息を発生する能力）を減衰することを可能とする。本発明の化合物は、また栄養欠乏により、ハウスダストダニを殺すこともできる。本発明は、非限定的な例のみにより、第１〜18図を参照しつつ、以下に説明する。ここで、第１図は、FITC標識したマウスのモノクローナル抗−CD23抗体を使用した、RP MI 8866 ヒトＢ細胞による、CD23の発現を示す図である。第２図は、Der pIのタンパク分解作用が、CD23について特異的であることを示す図である。第３図は、Der pIが、レクチンドメインに近接するCD23を優先的に開裂することを示す図である。第４図は、該システイニルプロテアーゼDer pIの薬作用発生団の図である。第５図は、第４図に示した薬作用発生団の、距離的制約を示す図である。第６図は、第４図に示した薬作用発生団の、角度に関する制約の図である。第７図は、該薬作用発生団を示し、かつ化合物８が如何に該薬作用発生団と適合しているかを示す図である。第８図は、該薬作用発生団を示し、かつ化合物40が如何に該薬作用発生団と適合しているかを示す図である。第９図は、該薬作用発生団を示し、かつ化合物25が如何に該薬作用発生団と適合しているかを示す図である。第10図は、第４図の該薬作用発生団の点1-4-5 間の距離的および角度的制約を示す図である。第11図は、第４図の該薬作用発生団の点1-2-4 間の距離的および角度的制約を示す図である。第12図は、第４図の該薬作用発生団の点1-2-5 間の距離的および角度的制約を示す図である。第13図は、第４図の該薬作用発生団の点1-2-3 間の距離的および角度的制約を示す図である。第14図は、第４図の該薬作用発生団の点2-3-5 間の距離的および角度的制約を示す図である。第15図は、第４図の該薬作用発生団の点2-4-5 間の距離的および角度的制約を示す図である。第16図は、第４図の該薬作用発生団の点1-3-5 間の距離的および角度的制約を示す図である。第18図は、第４図の該薬作用発生団の点1-3-4 間の距離的および角度的制約を示す図である。第19図は、第４図の該薬作用発生団の点3-4-6 間の距離的および角度的制約を示す図である。実施例ここでは、我々はDer pI、即ち主なハウスダストダニ（デルマトファゴイデスプテロニシナス(Dermatophagoides pteronyssinus)）の主なアレルゲンである、 Der pIが、培養ヒトＢ細胞(RPMI 8866 B細胞系)表面由来のCD23を開裂することを立証した。このＢ細胞表面からの該レセプタの開裂は、該培養上澄中のsCD23 における並行した増加と関連していた。標識した抗体実験およびプロテアーゼ阻害アッセイは、Der pIが、CD23の２SKフラグメントを直接開裂するシステインプロテアーゼであることを明確に示している。Der pIのこのタンパク分解作用はCD 23に対して特異的である。というのは、テストした他のＢ細胞マーカー(CD20、H LA-DR、CD71およびCD49d)の何れも影響されなかったからである。これらのデータは、Der pIが、タンパク分解によりsCD23 を遊離し、結果としてIgE 合成を調節する能力により、ダストダニアレルギーに罹った患者の80% において、IgE 抗体応答を誘発することを示唆している。我々はダストダニ抽出物からDer pIをアフィニティー精製し、FITC標識したモノクローナル抗−ヒトCD23(Bu38)を使用して、培養したRPMI 8866 Ｂ細胞上で発現したCD23をタンパク分解的に開裂するその能力についてテストした。これらのデータは、システイン(5mM)の存在下で、Der pIが投与量−依存的に膜CD23を開裂し、結果としてsCD23 を培養上澄中に遊離することを示している(第1a図および第1b図)。Der pIのタンパク分解活性は、E64(システインプロテアーゼ阻害剤) により阻害されるが、α-1- アンチトリプシン（セリンプロテアーゼ阻害剤）によっては阻害されず、従ってこれによりDer pIがシステインプロテアーゼ特性をもつことが確認された（第1c図）。我々は、実際にDer pIがα-1- アンチトリプシン(1:10 モル比)を完全に開裂して、十分に特徴付けされたシステインプロテアーゼである、パパインにより形成されるものと類似する、分解パターンを形成することを明らかにした（第1d図）。第１図のより詳しい説明は以下の通りである。細胞は、660Ｖの線形蛍光設定により、FACScan(UK，オックスフォードのベクトンディッキンソン(Becton Dickinson)社)で分析した。蛍光(FL1)プロフィール対前方散乱(FSC)を、該細胞を追跡するのに使用し、増幅スケールは、蛍光のレベルに応じて変えた。各サンプルに対して、4000事象を集め、次いでフローメイト(flowMate)プログラム(UK,ハイワイコーム(High Wycombe)のダコ(DAKO)社)を利用して分析した。提示したデータは３回の繰り返し実験の代表的な結果であり、ａ〜ｃにおける各点は２回の測定の平均を表す。第1(a)図は、Der pIによる CD23開裂の投与量およびシステイン依存性を示す（精製法については、以下の第 1(d)図を参照）。Der pIは、５mMのシステインと共に、またはその不在下で、予備インキュベート（37℃にて15分間）し、全体積200 mlのRPMI 1640+10mM HEPES 中の、2-3x10⁵RPMI 8866細胞に添加した。次いで、この混合物をインキュベート (37 ℃にて１時間）し、遠心分離により集めた細胞をRPMI 1640+10mM HEPES中で洗浄し、FITC複合化抗-CD23モノクローナル抗体(Bu38 UKバーミンガムのザバインディングサイト(The Binding Site))と共にインキュベート(室温にて30分間) した。第1(b)図。膜CD23の開裂は、培養上澄におけるsCD23 の並行的な投与量依存性遊離と関連していた。該上澄は、Der pIで処理（上記のように）した、培養 RPMI 8866 細胞から集め、かつELISA によるsCD23 測定（白抜きの丸）のために 1/5に希釈した（UKバーミンガムのザバインディングサイト）。このELISA アッセイにおいて、Der pIとsCD23 との間には交叉反応性は見られなかった。第1(c) 図。システインプロテアーゼのクラス特異的阻害剤は、Der pIによる膜CD23開裂を阻止する。E64(L-トランス−エポキシサクシニル−ロイシルアミド(4- グアニジノ)ブタン)(UK，プーレのシグマ社）は、Der pIによるCD23の開裂を完全に阻害するが、天然産のヒトセリンプロテアーゼ阻害剤であるα-1- アンチトリプシンについては、このような阻害作用は立証されていない。５g/mlのDer pI100 ml を、10mlのE64 またはα-1- アンチトリプシンと共に予備−インキュベート（37 ℃にて30分間）し、次いで（上記のような）該RPMI 8866 細胞に添加した。矢印はDer pIの存在下（下部の矢印）および不在下（上部の矢印）でのCD23の発現レベルを示す。第1(d)図。Der pI処方物、ヒトα-1- アンチトリプシンの銀染色SD S-PAGE(12%ゲル)分析およびDer pIのα-1- アンチトリプシンに及ぼす作用。Der pIは抗−Der pI抗体(4C1、UK，Clwyd インドアバイオテクノロテジー(Indoor B ioterchnologies))を使用したアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。該処方物の純度は、N-末端配列決定により確認し、該配列決定は自動アミノ酸配列決定装置（USA，CA フォスターシティーのアプライドバイオシステムズ(A pplied Biosystems)社）により実施した。得られた配列(Thr-Asn-Ala-Cys-Ser-I le-Asn-Gly-Asn-AlaまたはTNACSINGNA; SEQ ID No.1)は、Der pIの公開されている配列と一致した。該α-1- アンチトリプシン処方物の活性はウシキモトリプシン（Dr．デービッドロマス(David Lomas);パーソナルコミュニケーション）に対する活性サイト滴定により確認した。該ゲルはDer pI（レーン１）およびα-1- アンチトリプシン（レーン２）に対する各単一のバンドを示した。全体積10ml中でのDer pI(0.25 mg)とα-1- アンチトリプシン(5 mg)とのインキュベーション（37℃にて２時間）は、α-1- アンチトリプシン（レーン３）からの大きなフラグメント（矢印）の開裂をもたらす。このパターンはパパインにより生成されるものと一致する。質量標準は左側に示されている。 CD23に対するDer pIの酵素特異性を検討するために、我々は2.5mg/ml（最終濃度）のDer pIで処理した後に、他のＢ細胞マーカーの発現を追跡した。CD23の最大の開裂を与えることが示されている（第1a図）、このDer pI濃度において、CD 20、HLA-DR、CD71およびCD49d の有意な損失は観測されなかった（第２図）。更に詳しい第２図の説明は以下の通りである。 RPMI 8866 細胞を5mg/mlのDer pI溶液100 mlで処理し、膜CD23の発現を、他のＢ細胞表面マーカー(CD20、HLA-DR、CD71およびCD49d)と共に追跡した。これらのマーカーは抗−CD20(L27)、抗−HLA-DR(L243)(UK オックスフォードのベクトンディッキンソン)、抗−CD71(Ber-T9)(UKバッキンガムシーアのダコ)および抗- CD49d(HP2.1)(USA，ME ウエストブルックのイムノテック(Immunotech)社)抗体をそれぞれ使用して検出した。各対の結果は、Der pIの不在下（白抜きの棒）およびその存在下（黒棒）におけるマーカーの発現を表す。提示したデータは、３回の実験の代表的な結果を表し、各点は２回の測定の平均を表す。 CD23上のDer pI開裂サイトに関する知見を得るために、それぞれレクチンドメインおよび柄領域に対する、Bu38およびEBVCSIモノクローナル抗−CD23抗体を使用して、該タンパク分解による開裂過程を追跡した。かくして、Bu38は25 kDaまでの全てのフラグメントを検出し、一方EBVCSIは25 kDaを越えるフラグメントのみを識別する(J．ゴードン(Gordon)，パーソナルコミュニケーション)。これらの結果は、Der pIが該レクチンドメインに近接するサイトにおいてCD23を開裂することを示している。というのは、EBVCSI抗体は、依然として、該レセプタの残留膜結合部分に結合できるからである（第３図）。しかしながら、１mg/ml を越えるDer pI濃度において、25 kDaを越えるCD23フラグメントの幾分かの開裂が観測される。Der pIの最大濃度(2.5g/ml)が、Bu38結合の完全な喪失およびEBVCSI の僅かに部分的な喪失をもたらしたことから、Der pIによるCD23の初期開裂の好ましいサイトは該レクチンドメインに近接するものと考えられる。第３図のより詳細な説明は以下の通りである。 RPMI 8866 細胞を、上記のようにDer pIで処理し、膜CD23の発現を、２種のモノクローナル抗−CD23抗体：Bu38（該レクチンドメインを識別する）およびEBVC SI（25 kDaのフラグメント間の柄領域を識別する）を使用して、追跡した。かくして、Bu38は完全な分子および全ての可溶性フラグメントを識別し、一方でEBVC SIは、該25 kDaのフラグメント(sCD23)の開裂後の、完全な分子および残留膜結合部分を識別する(J．ゴードン(Gordon)，パーソナルコミュニケーション)。この実験は、Der pIが、１mg/ml までの濃度において、選択的にCD23の25 kDaのフラグメントを遊離することを立証している。提示されたデータは、３回の実験の代表的な結果を表し、各点は２回の測定の平均を表す。 25 kDaのフラグメントを生ずるCD23の好ましい開裂サイトは、上に詳細に述べたように、我々により同定された。可溶性CD23は、IgE 生産に必要とされる原形質細胞となる、Ｂ細胞のIgE 産生を誘発することが知られているシグナルの一つである。従って、インビボでCD23 を開裂する該プロテアーゼのこの特性は極めて興味深いものである。CD23は自己タンパク分解活性をもつことが示唆されているが、どのプロテアーゼが膜CD23を開裂するかについて、以前は気付いていなかった。我々は、外因性のシステインプロテアーゼであるDer pIがこの機能を満たすことを立証した。Der pIは、ダストダニアレルギーに罹った患者の80% において、IgE 抗体応答を引出し、またこのような患者がsCD23 の高い循環レベルを有することに関する、インビボの証拠がある。この至る所で吸引されるアレルゲンは、明らかに高い免疫原性をもつものであり、また我々はその免疫原性が、部分的にはその酵素活性によるものであると考えている。実際に、Der pIと配列類似性を示すシステインプロテアーゼであるパパインのアレルゲン性は、その酵素活性と大きな関連性を有している。 Der pIがタンパク分解により膜CD23を開裂することの証明は、このアレルギー過程におけるIgE の役割に関する疑問を生ずる。先ず、Der pIに特異的なIgE はＢリンパ細胞および他のCD23担持細胞（例えば、好酸球）に対するDer pIを標的とすることができ、結果として該細胞表面上での、このアレルゲンの高い濃度の設定を助ける。第二に、IgE のCD23に対する結合が、Der pIによるタンパク分解攻撃から、該レセプタを保護することができる。 Der pIタンパクの精製粗製ダニ抽出物（-100mg、スミスクライン−ビーチャム(SmithKline-Beecham) 社）を、５mlの塩酸塩緩衝塩水(PBS; 50mMの燐酸カリウム、pH 7.4、150mM NaCl を含有)に溶解した。Der pIを、CNBr活性化セファロース4B(UK ミルトンカインズのファルマーシア(Pharmacia)社)上に固定化した、4C1 抗体(U.K．ディーサイドのインドアバイオテクノロジー(Indoor Biotechnology)社)を使用したアフィニティーカラムクロマトグラフィーにより精製した。この粗製処方物を-2mlのアフィニティー樹脂と２時間４℃にて混合し、次いで2-3 体積のPBS により洗浄した。結合タンパクの溶出は、５mMのグリシンを含有する50%(v/v)のエチレングリコールを使用して実施した。画分(1-2ml)を集め、0.2Mの燐酸ナトリウムバッファー(pH 7.0)0.8 mlにより中和した。該画分をプールし、４ｌのPBS に対して一夜透析し、次いで２ｌのPBS に対して2-3 時間第二の透析にかけた。限外濾過によって、所定の濃度まで、全タンパクを濃縮した(UK フローゲンの(MacroSep)社 )。かくして、95% を越える純度のタンパクを得た。ここで、該純度はSDS の存在下での変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動、C4逆相高速液体クロマトグラフィー(RP-HPLC)および高圧サイズ排除クロマトグラフィー(HP-SEC)により判定し、他の混入プロテアーゼ活性は検出できなかった。 Der pIの阻害剤精製したDer pIを使用して、驚くべきことに、該酵素に対する阻害剤が生成できることを見出した。これらの阻害剤は以下の一般式で表されるものである：ここで、Ｘ、ＹおよびＺはＮまたはCHであり得る。 R₁はN-末端アミノ酸窒素原子の遮断基である（T.グリーン(Greene)，有機合成における保護基(Protective Groups in Organic Synthesis))。 R₂、R₃およびR₄はＸ、ＹおよびＺ上の側鎖である。Ｗは、Der pIの活性システインのチオールと不可逆的に反応する基である。ＸおよびＹがCHである場合、立体化学は排他的に“S”配座をとり、L-α−アミノ酸残基を与える。ＺがCHである場合、該配座はＷに依存して“R”または“S ”であり得るが、キラル中心は、立体特異的に、L-α−アミノ酸プリカーサ由来の構造を維持するように誘導される。Ｘ、ＹおよびＺがＮである場合、該残基はペプチド類似の、「アザペプチド(azapeptide)」である。好ましくは、R₁は、場合により置換され、場合によりヘテロ原子(O、S、N、P) を介してカルボニル基と結合した、疎水性アリールまたはヘテロアリール基を表す。ＮまたはＰを介して結合している場合、該ヘテロ原子は、モノまたはジアリール、またはモノまたはジヘテロアリール置換されていてもよい。また、R₁は炭素原子数３以上の、直鎖または分岐鎖の、場合によりヘテロ原子 (O、S、N、P)を介してカルボニル基と結合した、疎水性脂肪族基である。ＮまたはＰを介して結合している場合、該ヘテロ原子は、モノまたはジ−置換されていてもよい。これらの化合物は、また場合により置換されたアリール基、例えば場合により置換されたフェニル、ナフチルまたは未置換2-ナフチルまたは9-アンスラシルであり得る。また、場合により置換されたフェニルは、未置換フェニルまたは１〜５個のフルオロ置換基を有するフェニル基、または１〜３個の置換基を有するフェニル基（ここで、該置換基は独立に低級アルキル、低級アルコキシ、ニトロ、ハロ、アセチル、ベンゾイル、ヒドロキシ、アミノ、メチルアミノ、-COOH、-CO NH₂、-COOR²およびNHCOR²（ここで、R²は低級アルキル基である）からなる群から選ばれるものである）であり得る。場合により置換された1-ナフチル基は、未置換1-ナフチル基およびその2-位において低級アルキル、低級アルコキシまたはトリフルオロメチル基で置換された 1-ナフチル基を包含する。場合により置換されたヘテロアリールは、場合により置換された５または６員の、Ｏ、Ｓ、Ｎから選択されるヘテロ原子を１〜４個含む芳香族基、Ｏ、ＳおよびＮから選択されるヘテロ原子を１〜４個含むことができる1-または2-ナフチルまたは9-アンスラシル基を包含する。最も好ましいR₁は、フェニル、ジフェニルアミノ基、9-キサンテニル、ピペロニル、フェニルアミノ基、t-ブトキシ、CF₃-フェニル、モノまたはジ−置換フェニル（ここで、該置換基は低級C_1-3アルキル、低級C_1-3アルコキシである）、モノ2-または3-アミノまたはカルボキシ置換フェニルを表す。これらの基準は、またジフェニルアミノ基および9-キサンテニルについても適用されるであろう。更に、直鎖および分枝鎖脂肪族基、例えばピボリル(pivolyl)、n-ブチルおよびC₈ までのこれらの変形体であってもよい。好ましいR₂は、市販品として入手できるアミノ酸のC-αに結合していることが分かっている、疎水性の側鎖を表す。疎水性とは、直鎖または分枝鎖アルキル( メチル、例えばAla); シクロヘキシルメチル; 2-メチルプロピル、即ちLeu;n-ブチル、即ちノルロイシン; 1-メチルエチル、即ちVal;1-メチルプロピル、即ちIl e;3-メチルブチル、即ちホモロイシン; エチル、即ちAbu を意味する。また、該疎水性鎖は、例えばＮ、Ｏ、Ｓ等のヘテロ原子を含み、例えば2-メチルチオエチル（メチオニン）、4-アミノブチル、即ちLys;またはエチル-2- カルボアミド、即ちGln であってもよい。更に、該疎水性鎖は、場合により窒素原子を含有し、あるいはフェニルリング上で-OH、アルコキシ、フェニル、またはC_1-3アルキルで置換されている、フェニルメチル基であり得る。最も好ましいR₂はビフェニルメチル、1-メチルエチル、即ちバリン、メチル、即ちアラニン、またはシクロヘキシルメチル、即ちシクロヘキシルアラニンを表す。好ましいR₃は、場合によりヘテロ原子ＯまたはＦにより置換されたC₁アルキル基を表す。また、R₃は4-アミノブチル、即ちLys;エチル-2- カルボキサミド、即ちGln;2-（メチルチオオキシ）エチル、即ちMet(O)であり得る。最も好ましいR₃はメチル、即ちアラニンを表す。好ましくは、R₄は、R₂について規定した、かつこれについて記載したような残基をもつ疎水性側鎖を表す。更に、2-ヒドロキシエチル、即ちThr;または2-フルオロエチルであってもよい。最も好ましくは、R₄は3-メチルブチル、即ちホモLeu;シクロヘキシルメチル、即ちcha;2-メチルプロピル、即ちロイシン; またはn-ブチル、即ちノルロイシンを表す。好ましいＷは以下に示す基からなる群から選ばれる：好ましいＥは、以下に列挙する基からなる群から選ばれる： i) OAr またはSAr ii) -O-CO-R または-S-CO-R iii) ヘテロアリール iv) ハロゲン原子 v) -O-SO2-R vi) -O-PO(R)-R vii) -O-PO(OR)-OR ここで、好ましいＲはアルキルおよびArを含む群から選ばれるものである。好ましいArは、場合により置換されたアリールまたはヘテロアリールからなる群から選ばれる。好ましいＹは、エステル、スルホン、カルボキシレート、アミド、ホスホネート、ケトン、スルホネート、ニトリル、スルホンアミドおよびニトロ化合物を含む群から選択される。定義場合により置換されたアリールは、好ましくは、場合により置換されたフェニル、ベンジルまたはナフチルである。場合により置換されたフェニルは、好ましくは未置換フェニルまたは１〜５個のフルオロ置換基をもつフェニル、または１〜３個の置換基をもつフェニル基であって、該置換基が独立に低級アルキル、低級アルコキシ、ニトロ、ハロ、アセチル、ベンゾイル、ヒドロキシ、アミノ、メチルアミノ、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、メチルチオ、シアノ、トリフルオロメチル、フェニルスルホンアミドカルボニル(-CONHSO₂C₆H₅)、-COOH、-CONH 、-COOR、-NHCOR₂(ここで、R₂は低級アルキルである)および2,3,5,6-テトラメチル-4- カルボキシ−フェニル(-C₆H₅(CH₃)₄-COOH)を含む群から選ばれる。場合により置換された1-ナフチルは、無置換の1-ナフチルおよび2-位において低級アルキル、低級アルコキシまたはトリフルオロメチル基で置換された1-ナフチルを包含する。ハロゲンは、好ましくはブロモ、クロロまたはフルオロである。アルキルは、好ましくは分枝鎖または直鎖の、指定された炭素原子数のあるいは炭素原子数が指定されていない場合には、８個までの炭素原子を有する、飽和脂肪族炭化水素基である。接頭部アルク(alk-)とは、特に述べない限り、該当する基のアルキル部分に、８個までの炭素原子をもつ基を表す。アルキルの例はメチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、t-ブチル、n-ペンチル、 n-ヘキシル等を包含する。用語「低級アルキル」および「炭素原子数１〜４のアルキル」とは、本明細書の範囲内において、同義語であり互換性あるものとして使用される。場合により(optional またはoptionally)とは、その後に記載する事象または状況が起こっても起こらなくともよいことを示し、また該記載は該事象または状況が起こる場合の例および該事象または状況が起こらない場合の例を包含する。例えば、「場合により置換されたフェニル」とは、該フェニル基は置換されていても、未置換であってもよく、またその記載が未置換のフェニル基および置換基が存在するフェニル基両者を含むことを意味する。これらの阻害剤は以下の実施例により具体化され、これら実施例は説明のために記載した。 Der pI阻害剤の合成 Der pIに対する強力な阻害剤を、以下に記載する一般的な方法によって合成した。合成に引き続き、該化合物をエレクトロスプレーまたはMALDI-TOF マススペクトル法(MS)分析にかけ、得られた結果を示す。化合物１：N-ベンゾイル-L- バリル-L- アラニル-L- ノルロイシン固相ベンゾイル化ペプチド合成樹脂付加（工程１） 2-クロロトリチルクロリド樹脂(4.9g，1.05mM/g,ノババイオケム(Novabiochem ))をジクロロメタン(40ml)中で膨潤させ、Fmoc-L- ノルロイシンの懸濁液を添加し、５分間攪拌した。DCM 中のジイソプロピルエチルアミンの溶液(10ml,溶媒30 ml中57mM)を５分かけて添加し、得られた混合物を室温にて２時間攪拌した。メタノール(5ml)を添加し、反応混合物を更に10分間攪拌した後、樹脂を濾別し、3 xDCM、2x DMF、2x2-プロパノール、2x DMF、2x2-プロパノール、メタノール、2x エーテルで洗浄し、かつ真空下で24時間乾燥した。アミノ酸の脱保護（工程２） Fmoc-L- ノルロイシンを付加した樹脂を、４時間 DMFの20% ピペリジン溶液で処理することにより脱保護した。この膨潤した樹脂を濾過し、5x DMFおよび2xエーテルで洗浄し、かつ真空下で24時間乾燥した。ペプチド鎖伸長（工程３） L-ノルロイシン付加樹脂(5mM)を、Fmoc-L- アラニン(6.23g，20 mM)、ヒドロキシベンゾトリアゾール(3.0g，20mM)、2-(1-H- ベンゾトリアゾール-1- イル)- 1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(7.59g，20 mM)およびジイソプロピルエチルアミン(6.97ml，40mM)を含有するDMF(20 ml)溶液に添加し、４時間に渡り穏やかに攪拌しつつ膨潤させた。樹脂を濾別し、4x DMFおよび2xエーテルで洗浄し、かつ一夜真空下で乾燥させた。工程２および３を、Fmoc-L- アラニンおよびFmoc-L- バリンを使用して繰り返し実施して、樹脂に結合したトリペプチドH-L-バリル-L- アラニル-L- ノルロイシンを得た。ペプチド鎖のベンゾイル化（工程４） L-バリル-L- アラニル-L- ノルロイシン担持樹脂(1g,約１mM)を安息香酸(0.48 8g，４mM)、ヒドロキシベンゾトリアゾール(0.6g，４mM)2-(1-H-ベンゾトリアゾール-1- イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(1 .52g，4mM)およびジイソプロピルエチルアミン(1.40ml，８mM)を含有するDMF(5m l)溶液に添加し、６時間に渡り穏やかに攪拌しつつ膨潤させた。この樹脂を濾別し、4x DMFおよび2xエーテルで洗浄し、かつ一夜真空下で乾燥させた。樹脂の開裂（工程５） N-ベンゾイル-L- バリル-L- アラニル-L- ノルロイシン(1.0g,約１mM)を、トリフルオロ酢酸を、トリエチルシラン(320μl，2mM)を含有するジクロロメタン( 20ml)に溶解した1%溶液で１時間処理した。樹脂を濾別し、ジクロロメタン(3x10 ml)で洗浄した。有機相を集め、蒸発させ、エーテルで圧潰して、N-ベンゾイル-L- バリル-L- アラニル-L- ノルロイシン(285mg)を得た。エレクトロスプレーMS m/z 407[MH⁺]。化合物２：N-ベンゾイル-L- バリル-L- アラニル-L- ノルロイシンブロモメチルケトン N-ベンゾイル-L- バリル-L- アラニル-L- ノルロイシン(140mg，0.34 mM)を無水THF(3ml)中に懸濁し、無水DMF を滴下して、均一にした。この反応混合物を-1 0℃に冷却し、イソブチルクロロホルメート(129μl，1.0 mM)およびN-メチルモルホリン(109μl，1.0 mM)をアルゴン雰囲気下で攪拌しつつ添加した。この混合物を30分間攪拌した後、ジアゾメタンのエーテル溶液(5ml，約2mM)を添加した。この反応混合物を、約１時間に渡り室温まで加温し、その後酢酸と50%HBr(1ml， 3.0mM HBr)との1:1 溶液を滴下し、15分間攪拌した。得られた有機相を酢酸エチル(40ml)で希釈し、水(10ml)、塩水(10ml)および飽和重炭酸塩溶液(2x10ml)で洗浄し、MgSO₄上で乾燥し、溶媒を真空下で除去した。これにより灰白色の固体(15 2mg)が得られ、これは分取HPLCにより必要とされる純度に精製した。エレクトロスプレーMS m/z 482[MH⁺]、484[MH⁺]。化合物３：N-ベンゾイル-L- バリル-L- アラニル-L- ノルロイシン2,6-ビス（トリフルオロメチル）ベンゾイルオキシメチルケトン無水DMF(500 μl)中の、フッ化カリウム(0.1mM，6mg)と2,6-ビス（トリフルオロメチル）安息香酸(0.066mM，17mg)との混合物を、室温にて分子篩上で５分間攪拌した。無水DMF(500 μl)に溶解した、N-ベンゾイル-L- バリル-L- アラニル -L- ノルロイシンブロモメチルケトン(0.033mM,16mg)の溶液を添加し、得られた反応混合物を１時間攪拌した。この反応混合物を、短いシリカカラム(plug)に通し、5%のメタノールを含有するジクロロメタンで洗浄した。溶媒を真空下で除去し、残渣を分取HPLCで精製した。凍結乾燥により、白色の凍結乾燥品(6.4 mg)を得た。エレクトロスプレーMS m/z 660[MH⁺]。同様にして、以下の化合物を調製した。化合物４：N-ベンゾイル-L- バリル-L- アラニル-L- ノルロイシン2,6-ジメチルベンゾイルオキシメチルケトン（エレクトロスプレーMS m/z 552[MH⁺]，N-ベンゾイル-L- バリル-L- アラニル- L- ノルロイシンブロモメチルケトンと、2,6-ジメチル安息香酸とから）化合物５：N-ベンゾイル-L- バリル-L- アラニル-L- ノルロイシン2-ヒドロキシベンゾイルオキシメチルケトン（エレクトロスプレーMS m/z 540[MH⁺]，N-ベンゾイル-L- バリル-L- アラニル- L- ノルロイシンブロモメチルケトンと、2-ヒドロキシ安息香酸とから）化合物６：N-ベンゾイル-L- バリル-L- アラニル-L- ノルロイシン2,6-ジクロロベンゾイルオキシメチルケトン（エレクトロスプレーMS m/z 592[MH⁺]および594[MH⁺]，N-ベンゾイル-L- バリル-L- アラニル-L- ノルロイシンブロモメチルケトンと、2,6-ジクロロ安息香酸とから）化合物７：N-ベンゾイル-L- バリル-L- アラニル-L- ノルロイシンベンゾイルオキシメチルケトン（エレクトロスプレーMS m/z 524[MH⁺]，N-ベンゾイル-L- バリル-L- アラニル- L- ノルロイシンブロモメチルケトンと安息香酸とから）化合物８：N-ベンゾイル-L- バリル-L- アラニル-L- ノルロイシン2,3,4,5,6-ペンタフルオロベンゾイルオキシメチルケトン（エレクトロスプレーMS m/z 614[MH⁺]，N-ベンゾイル-L- バリル-L- アラニル- L- ノルロイシンブロモメチルケトンと、2,3,4,5,6-ペンタフルオロ安息香酸とから）化合物９：N-ベンゾイル-L- バリル-L- アラニル-L- ノルロイシン1,1-ジメチルプロピルオキシメチルケトン（エレクトロスプレーMS m/z 504[MH⁺]，N-ベンゾイル-L- バリル-L- アラニル- L- ノルロイシンブロモメチルケトンと1,1-ジメチルプロパン酸とから）化合物10：N-ベンゾイル-L- バリル-L- アラニル-L- ノルロイシンN-(ベンジルオキシカルボニル)-D-セリニル-(O-t-ブチル)オキシメチルケトン（エレクトロスプレーMS m/z 697[MH⁺]，N-ベンゾイル-L- バリル-L- アラニル- L- ノルロイシンブロモメチルケトンと、N-ベンジルオキシカルボニル-D- セリニル-O-t- ブチルエーテルとから）化合物11：N-ベンゾイル-L- バリル-L- アラニル-L- ノルロイシンN-(ベンジルオキシカルボニル)-D-セリニルオキシメチルケトン（エレクトロスプレーMS m/z 641[MH⁺]，N-ベンゾイル-L- バリル-L- アラニル-L- ノルロイシンブロモメチルケトンと、N-ベンジルオキシカルボニル-D- セリンとから）化合物12：N-ベンゾイル-L- バリル-L- アラニル-L- ノルロイシン2-フランオキシメチルケトン（エレクトロスプレーMS m/z 514[MH⁺]，N-ベンゾイル-L- バリル-L- アラニル- L- ノルロイシンブロモメチルケトンと、2-フランカルボン酸とから）化合物13：N-ベンゾイル-L- バリル-L- アラニル-L- ノルロイシン2,6-ジクロロフェニルアシルオキシメチルケトン（エレクトロスプレーMS m/z 606[MH⁺] 608[MH⁺]，N-ベンゾイル-L- バリル-L- アラニル-L- ノルロイシンブロモメチルケトンと、2,6-ジクロロフェニル酢酸とから）標準的な分取HPLCの条件を使用して、これら化合物を分析した。即ち、C4分取 HPLCシステム(ビダック(Vydac)，22x250mm)を使用し、30分に渡り、5-95%(90%アセトニトリル(0.1% TFA))の勾配にて、10ml／分の割合で溶出した。化合物14：N-ベンゾイルアミノ-L- バリル-L- アラニル-L- ノルロイシル−ヒドロキサム酸プラスチック反応容器中の、Bz-Val-Ala-norLeu-OH(50mg，0.12mM)をTHF(5ml) に分散した懸濁液に、エーテル1.5 mlにジアゾメタン(0.3 ml)を分散したものを添加した。ガスの発生が観測され、この生成した透明な溶液に、酢酸(0.05ml)を添加し、得られた溶液を蒸発乾固した。得られた残渣をメタノール(2 ml)に溶解し、メタノール(2 ml)中のヒドロキシアミン(2 mM)を添加し、得られる溶液を室温にて５時間攪拌した。この溶液を濃縮し、水(2 ml)を添加し、生成した固体を濾別し、乾燥して33mg(65%)の表記化合物を得た。化合物15：N-(ベンゾイルアミノ-L- バリル-L- アラニル-L- ノルロイシル)-O- ベンゾイルヒドロキサメート Bz-Val-Ala-norLeu-OH(10mg，0.022 mM)を、-10 ℃にて無水ピリジンに溶解した溶液に、塩化ベンゾイル(0.004ml，0.03 mM)を添加し、２時間攪拌した。この溶液を、エチル-(S)-(E)-3-((N- ベンゾイルバリルアラニル)アミノ-6- メチル −ヘプテ-2- ノエートの調製において記載した方法に従って、蒸発させかつ精製し、25-27 分に溶出したピークを集め、表記化合物を0.5 mg（5%）得た。エレクトロスプレーMS m/z 525[MH⁺]。化合物16：N-(N- ベンゾイル-L- バリル-L- アラニル-L- ノルロイシル)-O-2,6- ジメチル−ベンゾイルヒドロキサメート 2,6-ジメチル安息香酸(4mg，0.024mM)を無水DMF(1ml)に溶解し、０℃に冷却した溶液に、1-ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾール(3.2mg，0.023mM)、O-7-アザベンゾトリアゾール-1- イル-1,1,3,3- テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(9mg,0.023 mM)およびN-メチルモルホリン(0.008ml，0.07 mM)を添加し、かつこの溶液を５分間攪拌した。このヒドロキサム酸Bz-Val-Ala-norLe u-OH(10mg，0.02mM)を添加し、得られた反応生成物を一夜攪拌した。該溶液を、エチル-(S)-(E)-3-((N- ベンゾイルバリルアラニル)アミノ-6- メチル−ヘプテ- 2-ノエートの調製において記載した方法に従って、蒸発させかつ精製し、26-28 分における溶出ピークを集め、表記化合物を0.9 mg(6%)得た。エレクトロスプレーMS m/z 553[MH⁺]、575[MH⁺]。化合物17：N,O-ジメチル(t-ブトキシカルボニルアミノ-L- ロイシル)ヒドロキシラミンの調製 Boc-Leu-OH(80.3mM)とN-メチルモルホリン(88mM)とをTHF(35ml)に溶解した溶液を、予備冷却した、イソブチルクロロホルメート(88mM)のTHF(65ml)溶液に、- 10〜-15℃の範囲の温度にて、窒素雰囲気下で40分間かけて添加した。この反応混合物を-10℃にて１時間攪拌し、その後にN-メチルモルホリン(88mM)を添加し、次いでN,O-ジメチルヒドロキシラミンを-10〜０℃にて少量づつ添加した。次に、この反応混合物を-10℃にて１時間攪拌し、更に一夜に渡り室温まで昇温させた。次に、該THF を真空下で除去し、水(50ml)および酢酸エチル(200 ml)を添加した。次いで、得られた有機相を0.1Mクエン酸溶液で(4x50ml)、次に飽和重炭酸ナトリウム溶液で(4x50ml)洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥し、次いで真空下で濃縮して、表記化合物を形成した。化合物18：N,O-ジメチル（アミノ-L- ロイシル）ヒドロキシラミンの調製ジオキサン中に分散させた塩酸(4M，75ml)を、冷却しつつBoc-Leu-N(OMe)Me(3 3mM)に添加し、次いで室温にて１時間攪拌した。この溶液を、次に真空下で濃縮した。ジエチルエーテル(100 ml)を添加し、蒸発乾固する操作を、３回繰り返して、上記生成物を得た。化合物19：N,O-ジメチル(t- ブトキシカルボニルアミノ-L- アラニル-L- ロイシル)ヒドロキシラミンの調製 Boc-Ala-OH(46mM)とN-メチルモルホリン(46mM)とをTHF(20ml)に溶解した溶液を、予備冷却した、イソブチルクロロホルメート(46mM)のTHF(30ml)溶液に、-10 〜-15℃の範囲の温度にて、窒素雰囲気下で30分間かけて添加した。この反応混合物を-10℃にて１時間攪拌し、その後1,4-ジオキサン(20ml)に溶解したN-メチルモルホリン(46mM)およびHCl.H₂N-Leu-N(OMe)Me(41.8mM)の溶液を、徐々に滴添した。この反応混合物を-10℃にて１時間放置し、次に室温まで昇温させた。この溶液を高真空下で濃縮した後、水(50ml)および酢酸エチル(200 ml)を添加した。次いで、得られた有機相を0.1Mクエン酸溶液で(4x50ml)、次に飽和重炭酸ナトリウム溶液で(4x50ml)洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥し、次いで真空下で濃縮して、表記化合物を形成した。化合物20：N,O-ジメチル（アミノ-L- アラニル-L- ロイシル）ヒドロキシラミンの調製ジオキサン中に分散させた塩酸(4M，80ml)を、冷却しつつBoc-Ala-Leu-N(OMe) Me(33mM)に添加し、次いで室温にて1.5 時間攪拌した。この溶液を、次に真空下で濃縮した。ジエチルエーテル(100 ml)を添加し、蒸発乾固する操作を、３回繰り返して、上記生成物を得た。化合物21：N,O-ジメチル（t-ブトキシカルボニル−アミノ-L- バリル-L- アラニル-L- ロイシル）ヒドロキシラミンの調製 Boc-Val-OH(46mM)とN-メチルモルホリン(46mM)とをTHF(20ml)に溶解した溶液を、予備冷却した、イソブチルクロロホルメート(46mM)のTHF(30ml)溶液に、-10 〜-15℃の範囲の温度にて、窒素雰囲気下で30分間かけて添加した。この反応混合物を-10℃にて１時間攪拌し、その後1,4-ジオキサン(30ml)に溶解したN-メチルモルホリン(46mM)およびHCl.H₂N-Ala-Leu-N(OMe)Me(41.8mM)の溶液を、徐々に滴添した。この反応混合物を-10℃にて１時間放置し、次に室温まで昇温させた。この溶液を高真空下で濃縮した後、水(50ml)および酢酸エチル(200 ml)を添加した。次いで、得られた有機相を0.1Mクエン酸溶液で(3x50ml)、次に飽和重炭酸ナトリウム溶液で(3x50ml)洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥し、次いで真空下で濃縮して、表記化合物を形成した。エレクトロスプレーMS m/z 445[MH⁺]。化合物22：t-ブトキシカルボニルアミノ-L- バリル-L- アラニル-L- ロイシルアルデヒドの調製水素化リチウムアルミニウム(4.5 mM)をTHF(24.5ml)に溶解した溶液を-15〜-1 0℃に冷却した。Boc-Val-Ala-Leu-N(OMe)Me(2.2 mM)をTHF(10ml)に溶解した溶液を、低温を維持するように非常にゆっくりと添加した。40分後に、酢酸エチル(1 0ml)を-15℃にてゆっくり添加し、次いで10分間放置した。次に、水(2ml)を、同様に-15℃にて極めてゆっくりと添加し、更にこの反応混合物を室温まで昇温させた。次いで、クエン酸溶液(100ml，0.5M)を添加し、生成物を酢酸エチルで抽出した。この酢酸エチル相を100 mlの飽和重炭酸ナトリウム溶液で、次に100 ml の水で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥した。この溶液を、次に濃縮して、表記生成物を得、これは引き続き粗製状態で使用した。エレクトロスプレーMS m/z 386[MH⁺]。化合物23：エチル-(S)-(E)-3-((t- ブトキシカルボニルアミノ-L- バリル-L- アラニル)アミノ-6- メチル−ヘプテ-2- ノエート０℃に冷却した、無水THF(4ml)に分散した水素化ナトリウム(46mg，1.9 mM)の懸濁液に、トリエチルホスホノアセテート(420mg，1.9mM)をTHF(2ml)に溶解した溶液を、５分間に渡り滴下し、得られた混合物をガス発生が停止するまで攪拌した。この溶液を、Boc-Val-Ala-ロイシルアルデヒド(600mg，1.56mM)を無水THFに溶解し、-10℃に冷却した溶液に滴下した。この反応混合物を１時間撹拌し、飽和塩化アンモニウム(10ml)を添加した。白色固体が沈殿し、これを濾過により取り出し、濾液を酢酸エチルと水との間に分配させた。該有機相を硫酸マグネシウムで乾燥し、蒸発させて油を得、該油をアセトニトリル／水から再結晶させて表記化合物を640mg(91%)得た。エレクトロスプレーMS m/z 456[M⁺+H]，356[(M⁺ - ^tBOC)+1]。化合物24：(S)-(E)-3-((t-ブトキシカルボニルアミノ-L- バリル-L- アラニル) アミノ-6- メチル−ヘプテン酸-2 エチル-(S)-(E)-3-((t- ブトキシカルボニルアミノバリルアラニル)アミノ-6- メチル−ヘプテ-2-ノエート(455mg，1mM)をジオキサン(10ml)に溶解し、水を添加し、次いで水酸化リチウム(126mg，3mM)を添加した。この溶液を３時間攪拌し、1M HCl水性溶液を、中性pHとなるまで添加した。このジオキサンをロータリーエバポレーターにより除去し、1M HCl水性溶液でpHを４に調製した。表記化合物が沈殿し、これを濾過し、水洗して、該化合物420mg(98%)を得た。エレクトロスプレーMS m/z 428[M⁺+H]。化合物25：1,1,1-トリフルオロエチル-(S)-(E)-3-((t- ブトキシカルボニルアミノ-L- バリル-L- アラニル)アミノ-6- メチル−ヘプテ-2- ノエート該酸(Boc-Val-Ala-Leu-OH)(50mg，0.117 mM)およびジメチルアミノピリジン(2 9mg，0.24mM)を無水ジクロロメタン(1 ml)に溶解し、０℃に冷却した。0.5 mlのジクロロメタンに溶解した、水溶性カルボジイミド塩酸塩(26mg，0.13mM)を添加し、この溶液を５分間攪拌した。1,1,1-トリフルオロエタン(0.017ml，0.23 mM)の0.5 mlジクロロメタン溶液を添加し、この反応混合物を、１時間後に室温まで昇温させ、該反応混合物を一夜攪拌した。この反応混合物を0.5Mのクエン酸溶液（2x2 ml）、水（1x2 ml）、飽和重炭酸ナトリウム溶液（1x2 ml）および水（1x2 ml）で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥し、蒸発乾固して、表記化合物を得た。エレクトロスプレーMS m/z 510[M⁺+H]，410[(M⁺ - ^tBOC)+1]，454[(M⁺ - ^tBu)+1 ]。化合物26：チル-(S)-(E)-3-((N- ベンゾイル-L- バリル-L- アラニル)アミノ-6- メチル−ヘプテ-2- ノエートエチル-(S)-(E)-3-((t- ブトキシカルボニルアミノバリルアラニル)アミノ-6- メチル−ヘプテ-2-ノエート(16.6mg，0.036mM)を、ジオキサン(2 ml)中の4.0M H Clに溶解し、室温にて30分間攪拌し、蒸発乾固させた。得られた残渣をDMF(0.5m l)に溶解し、N-メチルモルホリン(7.36mg，0.073mM)を添加し、次いで0.5 mlの DMF中に溶解した塩化ベンゾイル(5.4mg，0.038mM)を添加した。この反応混合物を２時間攪拌し、0.1%のトリフルオロ酢酸溶液(4 ml)およびアセトニトリル(2ml )で希釈し、C4分取HPLCシステム(22x250mm)に注入し、215 nmにおける吸収により追跡しつつ、10-90%の系Ｂの勾配により、25分間に渡って10ml／分で溶出し、 90% にて15分間維持した。系Ａ＝0.1% TFA水性溶液、系Ｂ＝90% アセトニトリル，10% 系Ａ。26-28 分にて溶出するピークを集め、凍結乾燥して、白色固体4.5m g(27%)を得た。エレクトロスプレーMS m/z 460[M⁺+H]。上記と同様な方法で、以下の化合物を調製した。化合物27：エチル-(S)-(E)-3-((2- トリフルオロメチル-N- ベンゾイル-L- バリル-L- アラニル)アミノ-6- メチル−ヘプテ-2- ノエート収量3.7mg(22%)で得た。エレクトロスプレーMS m/z 528[M⁺+H]。化合物28：エチル-(S)-(E)-3-（(ピペロニロイルアミノ-L- バリル-L-アラニル) アミノ-6- メチルヘプテ-2- ノエート収量3.8mg(23%)で得た。エレクトロスプレーMS m/z 504[M⁺+H]。化合物29：エチル-(S)-(E)-3-（(フェニルカルバモイルアミノ-L- バリル-L- アラニル)アミノ-6- メチルヘプテ-2- ノエート上記のような方法に従って製造したが、但しフェニルイソシアネートを、酸クロリドの代わりに使用した。収量1.5mg(10%)で得た。エレクトロスプレーMS m/z 475[M⁺+H]。化合物30：エチル-(S)-(E)-3-（(ジフェニルカルバモイルアミノ-L- バリル-L- アラニル)アミノ-6- メチルヘプテ-2- ノエート収量2.3mg(13%)で得た。エレクトロスプレーMS m/z 551[M⁺+H]。化合物31：エチル-(S)-(E)-3-（(ナフトイルアミノ-L- バリル-L- アラニル)アミノ-6- メチルヘプテ-2- ノエート収量１mg(6%)で得た。エレクトロスプレーMS m/z 510[M⁺+H]。化合物32：エチル-(S)-(E)-3-（(キナゾロイルアミノ-L- バリル-L- アラニル) アミノ-6- メチルヘプテ-2- ノエート収量1.5 mg(9%)で得た。エレクトロスプレーMS m/z 512[M⁺+H]。化合物33：エチル-(S)-(E)-3-（(モルホリノイルアミノ-L- バリル-L-アラニル) アミノ-6- メチルヘプテ-2- ノエート収量2.9mg(19%)で得た。エレクトロスプレーMS m/z 469[M⁺+H]。化合物34：エチル-(S)-(E)-3-（(キサンテン-9- オイルアミノ-L- バリル-L- アラニル)アミノ-6- メチルヘプテ-2- ノエート上記の方法に従って製造したが、但しキサンテン-9- カルボン酸(8.1mg，0.03 6mM)を該酸クロリドの代わりに使用した。この酸のカップリングは、2-(1H-ベンゾトリアゾール-1- イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(13.6mg，0.036 mM)を活性化剤としておよび1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(5.5mg，0.036mM)を触媒として使用し、N-メチルモルホリン(10.8mg，0.1 08 mM)の存在下で実施した。収量1.7mg(9%)で得た。エレクトロスプレーMS m/z 564[M⁺+H]。化合物35：ジエチルフェニルスルホニルメチルホスホネート（I.シャーク(Shahak)，J.アルモグ(Almog)，Synthesis，1970，145 の改良）。市販品として入手可能なジエチルフェニルチオメチルホスホネート(1.0ml，4. 1mM)をジクロロメタン(10ml)に溶解した。硫酸(10ml，25%)を添加し、この混合物を氷中で冷却した。次いで、固形過マンガン酸カリウムを、攪拌しつつ、少量づつ添加(3x0.5g)し、その後該反応は完了したものと考えられた。固形メタ重亜硫酸ナトリウムを、ゆっくりと、該混合物が無色となるまで添加した。これを、次に酢酸エチル(x3)で抽出し、併合した有機洗液を、飽和重炭酸ナトリウム溶液次いで塩水で洗浄し、その後硫酸ナトリウム上で乾燥させた。次に、揮発性物質を真空下で除去した。得られた残渣をシリカ上でのフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。ここで溶出は、まず酢酸エチル／ヘキサンの8/2 混合物で、次いで純酢酸エチルで実施した。このようにして、所定の生成物、ジエチルフェニルスルホニルメチルホスホネート(1.0g,定量的)を無色固体として得た。MS(MA LDI-TOF):理論値（M⁺(C₁₁H₁₇O₅PS)+1）= 292;実測値(M⁺+1)=292。化合物36：(S)-(E)-3-((t-ブトキシカルボニルアミノ-L- バリル)-L-アラニル) アミノ-1- フェニルスルホニル-5- メチル-1- ヘキセンジエチルフェニルスルホニルメチルホスホネート(38mg，129 mM)を無水THF(10 ml)に溶解し、次いで窒素雰囲気下で０℃に冷却した。水素化ナトリウム(油中 6 0%分散液 8mg，200mM)を添加し、この混合物を15分攪拌した（盛んな起泡）。次いで、上記アルデヒド ^tBOC-Val-Ala-ロイシルアルデヒド(50mg，129 mM)を得られた溶液に添加し、この混合物を60分間攪拌した。この反応を希塩酸(0.1M)の添加により停止させ、次いで酢酸エチルで抽出した(x3)。分離された有機相を周期的に飽和重炭酸ナトリウム溶液および塩水で洗浄し、その後硫酸ナトリウム上で乾燥させた。真空下で、揮発性成分を除去した。得られた残渣を、シリカ上でのフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。ここで溶出は、酢酸エチル／ヘキサンの4/6 混合物で実施した。未確認の副生成物が、先ず最初に溶出(12mg)され、次いで所定の生成物、(s)-(E)-3-((t-ブトキシカルボニルアミノ-L- バリル -L-アラニル)アミノ- フェニルスルホニル-5- メチル-1- ヘキセン(22mg，32%) が、固体として得られた。エレクトロスプレーMS m/z 546[M⁺+Na]，424[(M - ^tB oc)+1]。化合物37：ジエチルメチルスルホニルメチルホスホネート市販品として入手できるジエチルメチルチオメチルホスホネートを、I.シャーク(Shahak)およびJ.アルモグ(Almog)，Synthesis，1969，171 の方法を利用して表記化合物に転化した：化合物38：(S)-(E)-3-((t-ブトキシカルボニルアミノ-L- バリル)-L-アラニル) アミノ-1- メチルスルホニル-5- メチル-1- ヘキセンジエチルメチルスルホニルメチルホスホネート(30mg，130 mM)を無水THF(5ml) に溶解し、次いで窒素雰囲気下で０℃に冷却した。水素化ナトリウム(油中 60% 分散液 7mg，175mM)を添加し、この混合物を15分攪拌した（盛んな起泡）。次いで、上記アルデヒド ^tBOC-Val-Ala-ロイシルアルデヒド(50mg，129 mM)を得られた溶液に添加し、次いでこの混合物を60分間攪拌した。この反応を希塩酸(0.1M) の添加により停止させ、次いで酢酸エチルで抽出した(x3)。分離された有機相を周期的に飽和重炭酸ナトリウム溶液および塩水で洗浄し、その後硫酸ナトリウム上で乾燥させた。真空下で、揮発性成分を除去した。得られた残渣を、シリカ上でのフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。ここで溶出は、酢酸エチル／ヘキサンの8/2 混合物で実施した。未確認の副生成物が先ず溶出(4 mg)され、次いで所定の生成物、(s)-(E)-3-((t-ブトキシカルボニルアミノ- バリル)アラニル)アミノ- メチルスルホニル-5- メチル-1- ヘキセン(24mg，40%)を固体として得た。エレクトロスプレーMS m/z 484[M⁺+Na]，362[(M- ^tBoc)+1]。化合物39：エチルジエチルホスホリルメチルスルホネート L.ゴゼッツ(Ghosez)等，Tetrahedron，1987, 43, p.5125 に記載の手順Ｂに従って調製した。エレクトロスプレーMS m/z 261[M⁺+H]，283[M⁺+Na]。化合物40：エチル(S)-(E)-3-((t-ブトキシカルボニルアミノ-L- バリル)-L-アラニル)アミノ-5- メチルヘキセニルスルホネートエチルジエチルホスホリルメタンスルホネート(36mg，138 mM)を無水THF(5ml) に溶解し、次いで窒素雰囲気下で０℃に冷却した。水素化ナトリウム(油中 60% 分散液 8mg，200mM)を添加し、この混合物を15分攪拌した（盛んな起泡）。次いで、上記アルデヒド ^tBOC-Val-Ala-ロイシルアルデヒド(50mg，129 mM)を、得られた溶液に添加し、次いでこの混合物を30分間攪拌した。この反応を希塩酸(0.1 M)の添加により停止させ、引き続き酢酸エチルで抽出した(x3)。分離した有機相を、周期的に飽和重炭酸ナトリウム溶液および塩水で洗浄し、その後硫酸ナトリウム上で乾燥させた。真空下で、揮発性成分を除去した。生成残渣を、シリカ上でのフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。ここで溶出は、酢酸エチル／ヘキサンの1/1 混合物で実施した。所定の生成物、ジエチル(s)-(E)-3-((t-ブトキシカルボニルアミノ- バリル)アラニル)アミノ-5- メチルヘキセニルスルホネート(22mg，35%)を固体として得た。エレクトロスプレーMS m/z 492[M⁺+1]，3 92[(M- ^tBoc)+1]。 Der pI基質に対する速度定数の測定全てのDer pI酵素アッセイは、pH8.25の、１mMエチレンジアミンテトラ酢酸(E DTA)および１mMのジチオスレイトール(DTT)を含有する50mM燐酸カリウム中でルーチン作業的に実施した。生成物の形成を、時間に関連して、420 nmにおける蛍光発光および320 nmにおける励起光の増加を測定することにより追跡した。全てのアッセイは25℃にて実施した。種々の基質および／または阻害剤の母液は、10 0%ジメチルスルホキシド(DMSO)溶液として作成した。速度定数(K_mおよびk_cat)は、種々の基質濃度における該酵素反応の初期速度から算出した。これらデータを、回帰分析により、ミカエリス−メンテンの式に適合させて、該速度定数を得た。不活性化速度論酵素と阻害剤との反応は２段階を含む。第一の段階は酵素と阻害剤とを結合して、酵素−阻害剤錯体(E・ I)を生成するものである。この段階は、他方の段階に対して迅速かつ可逆的であり、また化学反応は起こさない。この場合、k₁は、該 E・I錯体の形成に対する二次速度定数であり、またk_-1は該E・I錯体の分解についての一次速度定数である。この工程の、速度k₂で生ずる第二の段階は、該酵素の不可逆的な不活性化をもたらす、酵素−阻害剤共有結合錯体(EI)の形成である。酵素の不活性化速度論の実際は、２つの標準的な受容された方法（スキーム１および２）によって記載されている。その第一のもの（スキーム１）は、キッツ (Kitz)，C.G.およびウイルソン(Wilson)，I.B.，(1962)，J．Biol．Chem.，237, 3245-3249に記載されている、希釈法である。この場合、酵素および阻害剤は所定の期間予備−インキュベートされ、その後に過剰量の基質の添加により、この反応を停止させる。該第二の方法（スキーム２）は、基質と不可逆的な阻害剤との存在下で、酵素の不活性化を追跡することである。この方法は、以前に記載されており（チャン(Tian)，W.-X．＆ツー(Tsou)，C.-L.，(1982)，Biochemistry, 21，1028-1032; モリソン(Morrison)，J.F.＆ウォルシュ(Walsh)，C.T.，(1988) ,Adv．Enzymol．Relat．Areas Mol．Biol.，61，201-301）、またこの速度論を記載する式は以下に示される（式１、２および３）。何れの場合も、使用する阻害剤濃度を、酵素濃度の少なくとも10倍より大きくして、擬−一次条件を維持する。 k_app=k₂[I]/1+[S]/K_M([I]+k₁) 式１〔生成物〕＝ν_st+(ν_o-ν_s)[1-exp(-k_appt)]/k_app+d 式２二次速度定数=(k_app/[I])(1+[S]/K_M) 式３見掛け上の不活性化速度定数(k_app)は式２を使用して算出した。ここで、ν₀ はこの反応の初期速度であり、ν_sはこの反応の漸近的定常状態速度であり、ｄは時間０における切片である。二次速度は式３を使用して算出した。 Der pIの阻害速度論アッセイは、pH8.25の、１mMエチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA)および１mMのジチオスレイトール(DTT)を含有する50mM燐酸カリウム中でルーチン作業的に実施した。Der pI酵素活性を追跡するために使用したフルオロジェニック(fluorog enic)基質は2-アミノベンゾイルバリルアラニルノルロイシルセリル-(3-ニトロ) チロシニルアスパルチルアミドであった。生成物形成は、時間について、420 nm における蛍光発光および320 nmにおける励起光の増加を測定することにより追跡した。アッセイは25℃にて実施した。種々の阻害剤の母液は、100%ジメチルスルホキシド(DMSO)溶液として作成した。種々の阻害剤に関する不活性化速度論は、既に記載した技術を使用して実施した。上記希釈法においては、一般的に100 nMDer pIを、0.5-10μM の該阻害剤と混合し、かつ一緒にインキュベートし、所定の時点（サンプル時間）においてアリコートを採取し、、残留している酵素活性を、飽和量の基質を含有するアッセイバッファー中に10倍希釈することにより測定した。該残留活性は、該サンプル時間と関連付けられ、その曲線は、コンピュータによる非線形最小二乗回帰解析により適合させた。該二次速度定数が10⁵M^-1S^-1よりも大きい場合には、二次条件（即ち、酵素および阻害剤の等モル量）を使用した。一般的には、化学量論量の酵素および阻害剤を、所定の時間間隔（サンプル時間）でインキュベートし、この混合物を、アッセイバッファー中の飽和量の基質により、10倍希釈することによって、該反応を停止した。酵素濃度の逆数対サンプル時間のプロットは、線形最小二乗回帰解析により適合させて、該二次不活性化速度定数を得た。酵素、阻害剤および基質の存在下で、不活性化速度を算出する場合には、以下の諸条件を使用した。一般的に、12.5mMの基質および0.1-10mMの阻害剤を含有する溶液を25℃にて、５分間インキュベートし、その後酵素(10nM)を添加して、該反応を開始させた。阻害剤の不在下では、生成物の生成は時間について線形であった。酵素の不活性化は、蛍光の増大における下向きの曲率により示された。見掛けの不活性化速度定数(k_app)は、これらのカーブを、線形最小二乗回帰解析を利用して式２に適合させることにより決定し、また該二次速度定数は式３を利用して算出した。分析結果化合物番号 k_obs/[I](M^-1S^-1) ３ > 10⁷ ４ 1.6 ×10⁷ ６ 6.8 ×10⁷ ７ 3.7 ×10⁵ ８ > 10⁷ ９ 2.3 ×10⁶ 10 1.9 ×10⁶ 11 1.2 ×10⁶ 12 1.9 ×10⁵ 13 6.6 ×10⁵ 15 1.5 ×10⁵ 16 1.6 ×10⁴ 23 1.7 ×10³ 25 3.1 ×10³ 26 4.1 ×10³ 27 6.3 ×10³ 28 6.8 ×10³ 29 4.6 ×10³ 30 7.5 ×10³ 34 1.1 ×10⁴ 36 6.4 ×10³ 38 1.1 ×10³ 40 6.9 ×10⁴ 阻害データが示されていない化合物は、更なる化合物の生成における重要な中間体であるか、または極めて不安定であってテスト不能であり、従ってより安定な化合物に対する中間体であった。薬作用発生団の定義および規格 Der pIに対する生物学的活性をもつ化合物の集合を、トレーニングセット(tra ining set)として準備した。このトレーニングセット内の各化合物は、十分に配座分析した(J．Comp．Chem.，1995，16，171-187)。コンフォーマー(conformer) の幾つかが、最低エネルギー配座を越える所定のエネルギー範囲に渡り、生成された（J．Chem．Inf．Comp．Sci.，1995，35，285-294およびJ．Chem．Inf．Com p．Sci.，1995，35，295-304）。この情報を、薬作用発生団を誘導するのに使用した(７つの化学的特徴型のルールに基づく)(J．Chem．Inf．Comp．Sci.，1994，34，1297-1308)。該薬作用発生団は観測された生物学的活性と相関関係をもつ。該トレーニングセットにおける分子は全て、同一の作用様式で、同一のターゲットに作用する。少なくとも以下の化学的特徴を含む薬作用発生団は、Der pIの強力な阻害剤の化学的モチーフを規定する。水素結合受容特性、３つの疎水性(J．Comp．Chem.，1986，7，565-577)特性および水素結合供与特性；水素結合受容特性は、表面で利用可能である、以下の原子型または原子群と適合する。・spまたはsp²窒素。この窒素原子は不対電子対および０に等しいまたはそれ以下の電荷を有する。・sp³酸素または硫黄原子。これらは不対電子対および０に等しいまたはそれ以下の電荷を有する。・非−塩基性アミン。これらは不対電子対を有する。水素結合供与体特性は、これが塩基性の窒素原子をも含むことを除き、該水素結合受容体と、同一の化学的規則性を有する。即ち、この特性は同一の原子または原子群と適合する。電子−欠乏ピリジンおよびイミダゾールは除外されない。この特徴は以下の原子型または原子群と適合する：・非−酸性ヒドロキシル；・チオール；・アセチレン性水素；・NH部分（テトラゾールおよびトリフルオロメチルスルホンアミド水素原子を除く）。疎水性特性は以下のように定義される即ち、電荷の集中部分（帯電した原子または電気陰性原子）の近傍にはない、連続する一連の原子であって、該原子が表面での利用可能性もつような配座にあり、フェニル、シクロアルキル、イソプロピルおよびメチル基を包含する。これは、また部分的に疎水性特性を有する、例えばリジルまたはグルタミニルアミノ酸側鎖等の残基を含むこともできる。本明細書で使用する用語「薬作用発生団(pharmacophore)」とは、あらゆる薬理活性をもつことを意味するのではない。この用語は、レセプタとの分子的相互作用に関する好ましい要件を構成し、かつ具現する、化学的特徴並びに三次元空間における分布を意味する。例えば、該レセプタは、該システインプロテアーゼDe r pIの触媒活性サイトであり得る。第４図は、Der pIの薬作用発生団を図式的に示す図である。この図において、水素結合受容体は２つの球からなるベクトル作用によって表される。小さい方の球（半径少なくとも1.6 Åから2.6 Åまで）は、該リガンド上の水素結合受容体のセントロイド(centroid)を規定し、一方で大きな球（半径少なくとも2.2 Åから2.6 Åまで）は、該レセプタからの該水素結合受容体の突出点(projected poi nt)を規定する。これら２つの球は少なくとも3.0 Å離れている。同様に、該水素結合供与体は、該水素結合受容体に関する上記と同様な方法で定義される、２球のベクトル作用によって表される。上記疎水性特性は、半径少なくとも1.6 Åから2.6 Åまでの球によって表される。各特徴の完全球セントロイド位置は以下のように三次元で定義される：・疎水性部１は直交座標XYZ -6.272，3.372，-1.200 を有する。・疎水性部２は座標-3.320，-2.305，0.906 を有する。・疎水性部３は座標-0.612，-4.088，-1.740を有する。・水素結合供与体原点の座標：0.007，0.926，4.168 ・水素結合供与体投影点の座標：-0.743，0.926，4.168 ・水素結合受容体原点の座標：5.155，-0.25，-2.528 ・水素結合受容体投影点の座標：7.413，0.349，-4.426 距離的制約は第５図、第10図および第19図に示されている。角度上の制約は第６図、第10図および第19図に示されている。化学的特徴間の全ての距離に関する許容度は+/-0.5Åであり、また幾何学的角度の許容度は+/-20°である。参考文献 1. サットン(Sutton)，B.J.＆ゴールド(Gould)，H.J.，Nature，1993，366，42 1-428 2. フロレス−ロモ(Flores-Romo)，L．等，Science，1993，261，1038-1041 3. ユー(Yu)，P.等，Nature，1994，369，753-756 4. スティーフ(Stief)，A．等，J．Immunol.，1994，152，3378-3390 5. フジワラ(Fujiwara)，H.等，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A.，1994，91，6 835-6839 6. チャップマン(Chapman)，M.D．等，J．Allergy Clin．Immunol.，1983，72 ，27-33 7. クリリス(Krillis)，S．等，J．Allergy Clin．Immunol.，1984，74，132-1 41 8. バレット(Barrett)，A.J．等，Biochem．J.，1982，201，189-198 9. 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26．バレリオ(Valerio)，R.M.,ブレイ(Bray)，A.M．&マエジ(Maeji)，N.J.，Int ．J．Pept．Prot．Res.，1994，44，158-165

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ０７Ｋ 5/083 Ｃ０７Ｋ 7/06 7/06 Ａ６１Ｋ 37/64 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ハートテランスイギリスケンブリッジシービー３０アールエスクラークマックスウェルロードペリーコート 12 (72)発明者ラングピーターイギリスケンブリッジシービー４５ジェイイーウィーリンガムニューイングトン 43 (72)発明者シェイキブファロークイギリスノッティンガムエヌジー９３イーユーブラムコートディーンウッドアベニュー 14 (72)発明者キーベルマーティンイギリスケンブリッジシービー１４ワイゼットチェリーヒントンスピードウェルクローズ 114

Claims

【特許請求の範囲】１．システイニルプロテアーゼ阻害活性を有し、インビボで膜結合CD23のタンパク分解開裂を阻害できる、L-トランス−エポキシサクシニル−ロイシルアミド（ 4-グアニジノ）ブタン(E64)を除く、新規化合物。２．Der pIに対する基質であり、E64 類似体、ペプチド模倣体およびその模倣体からなる群から選ばれる、請求の範囲第１項に記載の化合物。３．Der pIにより開裂できる開裂サイトを含む、ペプチド配列およびその類似体並びに模倣体からなる群から選ばれる、請求の範囲第１項に記載の化合物。４．システイニルプロテアーゼ阻害性化合物であって、E64 を除く、酵素Der pI の阻害剤と本質的に等価な構造をとることのできる、化学組成を含み、場合によりアレルギー性諸疾患の治療に使用するための、製薬上許容される担体または賦形剤と共に使用される、上記化合物。５．E64 を除く、Der pIの阻害剤の一部分の薬作用発生団パターンと本質的に等価な薬作用発生団パターンをもつ構造をとることのできる、システイニルプロテアーゼ阻害性化合物。６．E64 を除く、酵素Der pIを阻害するシステイニルプロテアーゼ阻害性化合物と交叉反応し、該化合物は i) 水素結合供与体、 ii) ３つの疎水性部分、および iii)水素結合受容体を含むモチーフの１以上のコピーを含むことを特徴とする、リガンド。７．以下に定義する薬作用発生団と本質的に等価な構造を含む、請求の範囲第６項に記載のリガンド：該薬作用発生団が少なくとも５つの化学的特徴、即ち３つの疎水性特性、水素結合受容特性および水素結合供与特性を含み、これらの特徴が更に以下のように定義され： (1) 水素結合受容特性は、表面で利用可能である、以下の原子型または原子群と適合し；・spまたはsp²窒素、この窒素原子は不対電子対および０に等しいまたはそれ以下の電荷を有する；・sp³酸素または硫黄原子、これらは不対電子対および０に等しいまたはそれ以下の電荷を有する；・非−塩基性アミン、これらは不対電子対を有する； (2) 水素結合供与体特性は、これが塩基性の窒素原子をも含むことを除き、該水素結合受容体と、同一の化学的特徴を有し（電子−欠乏ピリジンおよびイミダゾールは除外されない）、この特徴は以下の原子型または原子群と適合し：・非−酸性ヒドロキシル；・チオール；・アセチレン性水素；・NH部分（テトラゾールおよびトリフルオロメチルスルホンアミド水素原子を除く）、 (3) 疎水性特性は、電荷の集中部分（帯電した原子または電気陰性原子）の近傍にはない、連続する一連の原子であって、該原子団が表面での利用可能性もつような配座にあり、フェニル、シクロアルキル、イソプロピルおよびメチルを包含し、これは、また部分的に疎水性特性を有する、例えばリジルまたはグルタミニルアミノ酸側鎖等の残基を含み、 (i) 水素結合受容体は２つの球からなるベクトル作用によって表され、小さい球（半径少なくとも1.6 Åから2.6 Åまで）は、該リガンド上の水素結合受容体のセントロイドを規定し、一方で大きな球（半径少なくとも2.2 Åから2.6 Åまで）は、該レセプタからの該水素結合受容体の突出点を規定し、これら２つの球は少なくとも3.0 Å離れており、 (ii) 上記(i) と同様に、該水素結合供与体は、２球のベクトル作用によって表され、 (iii)該疎水性特性は、半径少なくとも1.6 Åから2.6 Åまでの球によって表され、これら特徴間の全ての距離に関する許容度は+/-0.5Åであり、また幾何学的角度の許容度は+/-20°であり、かつ該距離および角度は第４、５および10〜19 図に示されている。８．以下の一般式(I) で表される、上記請求の範囲第１〜７項に記載の化合物またはリガンド：ここでＸ、ＹおよびＺはＮまたはCHであり、 R₁はN-末端窒素原子の遮断基であり、 R₂、R₃およびR₄はＸ、ＹおよびＺ上の側鎖であり、Ｗは、Der pIの活性システインチオールと不可逆的に反応する基である。９．該Ｘ、ＹおよびＺがCHであり、かつ立体化学的には、排他的に“S”配座にある、請求の範囲第８項に記載の化合物またはリガンド。 10．該Ｘ、ＹおよびＺが窒素原子であり、かつＩがペプチド模倣体、「アザペプチド」である、請求の範囲第８または９項に記載の化合物またはリガンド。 11．R₁が、フェニル、ナフチルまたは未置換2-ナフチルまたは9-アンスラシルからなる群から選ばれる、場合により置換された疎水性アリール基；または、場合によりヘテロ原子(O、S、N、P)を介してカルボニル基と結合した、ヘテロアリール基を表し、ＮまたはＰを介して結合している場合、該ヘテロ原子は、モノまたはジアリール、またはモノまたはジヘテロアリール置換されていてもよく、あるいはまた、R₁は炭素原子数３以上の、直鎖または分岐鎖の、場合によりヘテロ原子(O、S、N、P)を介してカルボニル基と結合した、疎水性脂肪族基を表し、ＮまたはＰを介して結合している場合、該ヘテロ原子は、モノまたはジ−置換されていてもよい、請求の範囲第８〜10項の何れか１項に記載の化合物またはリガンド。 12．場合により置換されたフェニルが、未置換フェニルまたは１〜５個のフルオロ置換基を有するフェニル基、または１〜３個の置換基を有するフェニル基（ここで、該置換基は独立に低級アルキル、低級アルコキシ、ニトロ、ハロ、アセチル、ベンゾイル、ヒドロキシ、アミノ、メチルアミノ、-COOH、-CONH₂、- COOR₂およびNHCOR₂（ここで、R₂は低級アルキル基である）からなる群から選ばれるものである）である、請求の範囲第８〜11項の何れか１項に記載の化合物またはリガンド。 13．R₁が、ピボリル、n-ブチルおよびC₈までのこれらの変形体である、直鎖および分枝鎖脂肪族基、フェニル、ジフェニルアミノ基、9-キサンテニル、ピペロニル、フェニルアミノ基、t-ブトキシ、CF₃-フェニル、モノまたはジ−置換フェニル、ジフェニルアミノ基または9-キサンテニル（ここで、該置換基は低級C_1-3アルキル、低級C_1-3アルコキシである）、モノ2-または3-アミノまたはカルボキシ置換フェニルを表す、請求の範囲第８〜12項の何れか１項に記載の化合物またはリガンド。 14．R₂が、直鎖または分枝鎖型の疎水性の側鎖であり、該疎水性側鎖は、アルキル、メチル(Ala);シクロヘキシルメチル; 2-メチルプロピル、即ちLeu；n-ブチル、即ちノルロイシン; 1-メチルエチル、即ち Val；1-メチルプロピル、即ち I le；3-メチルブチル、即ちホモロイシン; エチル、即ち Abuであり、あるいは該疎水性鎖は、例えばＮ、Ｏ、Ｐ、Ｓ等のヘテロ原子を含み、例えば2-メチルチオエチル（メチオニン）、4-アミノブチル、即ちLys;またはエチル-2-カルボアミド、即ちGln であってもよく、あるいは該疎水性鎖は、場合により窒素原子を含有し、あるいはフェニルリング上で-OH、アルコキシ、フェニル、またはC_1-3アルキルで置換されている、フェニルメチル基であってもよい、請求の範囲第８〜 13項の何れか１項に記載の化合物またはリガンド。 15．R₂が、ビフェニルメチル、1-メチルエチル、即ちバリン；メチル、即ちアラニン；またはシクロヘキシルメチル、即ちシクロヘキシルアラニンを表す、請求の範囲第８〜14項の何れか１項に記載の化合物またはリガンド。 16．R₃は、場合によりヘテロ原子ＯまたはＦにより置換されたC₁アルキル基を表し、またR₃が4-アミノブチル、即ちLys;エチル-2- カルボキサミド、即ちGln;2- （メチルチオオキシ）エチル、即ちMet(O)を表す、請求の範囲第８〜15項の何れか１項に記載の化合物またはリガンド。 17．R₃がメチル、即ちアラニンを表す、請求の範囲第8〜16項の何れか１項に記載の化合物またはリガンド。 18．R₄が、直鎖または分枝鎖型の疎水性の側鎖であり、該疎水性側鎖は、アルキル、メチル(Ala);シクロヘキシルメチル; 2-メチルプロピル、即ち Leu；n-ブチル、即ちノルロイシン; 1-メチルエチル、即ち Val；1-メチルプロピル、即ち I le；3-メチルブチル、即ちホモロイシン; エチル、即ち Abuであり、あるいは該疎水性鎖は、例えばＮ、Ｏ、Ｐ、Ｓ等のヘテロ原子を含み、例えば2-メチルチオエチル（メチオニン）、4-アミノブチル、即ちLys;またはエチル-2-カルボアミド、即ちGln であってもよく、あるいは該疎水性鎖は、場合により窒素原子を含有し、あるいはフェニルリング上で-OH、アルコキシ、フェニル、またはC_1-3アルキルで置換されている、フェニルメチル基であってもよい、請求の範囲第8〜1 7項の何れか１項に記載の化合物またはリガンド。 19．R₄が、3-メチルブチル、即ちホモLeu;シクロヘキシルメチル、即ちcha;2-メチルプロピル、即ちロイシン; またはn-ブチル、即ちノルロイシンを表す、請求の範囲第８〜18項の何れか１項に記載の化合物またはリガンド。 20．Ｗが以下に示す基からなる群から選ばれ：Ｅが、以下に列挙する基からなる群から選ばれ： i) OAr またはSAr ii) -O-CO-R または-S-CO-R iii) ヘテロアリール iv) ハロゲン原子 v) -O-SO₂-R vi) -O-PO(R)-R vii) -O-PO(OR)-OR ここで、ＲはアルキルおよびArを含む群から選ばれるものであり、 Arは、場合により置換されたアリールまたはヘテロアリールからなる群から選ばれ、Ｙは、エステル、スルホン、カルボキシレート、アミド、ホスホネート、ケトン、スルホネート、ニトリル、スルホンアミドおよびニトロ化合物を含む群から選択されるものである、請求の範囲第８〜19項の何れか１項に記載の化合物またはリガンド。 21．Der pIのタンパク分解酵素活性の阻害を可能とする、Der pI阻害活性を有する、請求の範囲第８〜20項の何れか１項に記載の化合物またはリガンド、その類似体、ペプチド模倣体および模倣体。 22．該酵素Der pIの活性サイトに結合して、その活性を阻害する、請求の範囲第８〜21項の何れか１項に記載の化合物またはリガンド、その類似体、ペプチド模倣体および模倣体。 23．Der pIに対する基質であり、かつ特異的サイトにおいてDer pIと反応する新規化合物、その類似体、ペプチド模倣体および模倣体。 24．IgE 媒介アレルギー性疾患の治療用の薬物であって、活性成分として、システイニルプロテアーゼ阻害剤、特異的サイトにおいてDer pIと反応する、Der pI に対する基質、およびDer pIの該タンパク分解酵素活性を阻害することができる Der pI阻害剤からなる群から選ばれる化合物を、その有効量で含み、該薬物が場合により１種以上の製薬上許容される担体、アジュバント、賦形剤をも含有することを特徴とする、上記治療薬。 25．Der pIのアレルゲン性を減衰しまたはDer pIを不活性化するための薬物であって、活性成分として、Der pI阻害活性を有する化合物を、その有効量で含み、場合により１種以上の担体、アジュバント、賦形剤をも含有することを特徴とする、上記薬物。 26．ハウスダストダニの生存性を減じもしくは破壊するための薬物であって、活性成分として、Der pI阻害活性を有する化合物を、その有効量で含み、場合により１種以上の製薬上許容される担体、アジュバント、賦形剤をも含有することを特徴とする、上記薬物。 27．膜結合CD23の、タンパク分解による開裂を阻止するための、インビボでの、システイニルプロテアーゼ阻害活性を有する化合物の使用。 28．Der pIのタンパク分解酵素活性を阻害するための、Der pI阻害活性を有する化合物の使用。 29．Der pIのアレルゲン性を減衰しまたはDer pIを不活性化するための、Der pI 阻害活性を有する化合物の使用。 30．ハウスダストダニの生存性を減じもしくは破壊するための、Der pI阻害活性を有する化合物の使用。 31．Der pIのタンパク分解酵素活性を阻害するための、特異的サイトにおいてDe r pIと反応する、Der pIに対する基質またはその類似体もしくは模倣体である化合物の使用。 32．Der pIのアレルゲン性を減衰しまたはDer pIを不活性化するための、Der pI に対する基質またはその類似体もしくは模倣体である化合物の使用。 33．IgE 媒介アレルギー性疾患の治療のための、請求の範囲第27〜32項の何れか１項に記載の使用。 34．請求の範囲第１〜23項の何れか１項に記載の化合物またはリガンドの製法であって、請求の範囲第１〜11項の何れか１項に規定したシステイニルプロテアーゼ阻害性化合物を合成し、場合により該化合物またはリガンドと担体とを複合化する工程を含むことを特徴とする、上記方法。 35．更に、該化合物またはリガンドを単離し、かつ精製する工程をも含む、請求の範囲第34項に記載の方法。 36．有効成分として、少なくとも１種の、請求の範囲第１〜23項の何れか１項に記載の化合物またはリガンドを含み、かつ場合によりアジュバントまたは賦形剤をも含有することを特徴とする、薬理組成物。 37．若年性喘息および湿疹を包含するアレルギー性諸疾患の治療で使用するための、請求の範囲第36項に記載の薬理組成物。 38．若年性喘息および湿疹を包含するアレルギー性諸疾患の予防において使用するための、請求の範囲第36項に記載の薬理組成物。 39．有効量の、請求の範囲第１〜23項の何れか１項に記載の化合物またはリガンドを投与する工程を含む、若年性喘息および湿疹を包含するアレルギー性諸疾患の治療法。 40．有効量の、請求の範囲第36項に記載の薬理組成物を投与する工程を含む、若年性喘息および湿疹を包含するアレルギー性諸疾患の治療法。 41．有効量の、請求の範囲第１〜23項の何れか１項に記載の化合物またはリガンドを投与する工程を含む、若年性喘息および湿疹を包含するアレルギー性諸疾患を抑制することによる、予防方法。 42．有効量の、請求の範囲第36項に記載の薬理組成物を投与する工程を含む、若年性喘息および湿疹を包含するアレルギー性諸疾患を抑制することによる、予防方法。 43．若年性喘息および湿疹を包含する、アレルギー性諸疾患の治療用薬物の製造における、請求の範囲第１〜23項の何れか１項に記載の化合物またはリガンドの使用。 44．若年性喘息および湿疹を包含する、アレルギー性疾患の治療用薬物の製造における、請求の範囲第36項に記載の薬理組成物の使用。 45．若年性喘息および湿疹を包含する、アレルギー性疾患の予防用薬物の製造における、請求の範囲第１〜23項の何れか１項に記載の化合物またはリガンドの使用。 46．若年性喘息および湿疹を包含する、アレルギー性疾患の予防用薬物の製造における、請求の範囲第36項に記載の薬理組成物の使用。 47．以下に列挙する化合物からなる群から選ばれる、システイニルプロテアーゼ阻害性化合物：化合物１：N-ベンゾイル-L- バリル-L- アラニル-L- ノルロイシン化合物２：N-ベンゾイル-L- バリル-L- アラニル-L- ノルロイシンブロモメチルケトン化合物３：N-ベンゾイル-L- バリル-L- アラニル-L- ノルロイシン2,6-ビス（トリフルオロメチル）ベンゾイルオキシメチルケトン化合物４：N-ベンゾイル-L- バリル-L- アラニル-L- ノルロイシン2,6-ジメチルベンゾイルオキシメチルケトン化合物５：N-ベンゾイル-L- バリル-L- アラニル-L- ノルロイシン2-ヒドロキシベンゾイルオキシメチルケトン化合物６：N-ベンゾイル-L- バリル-L- アラニル-L- ノルロイシン2,6-ジクロロベンゾイルオキシメチルケトン化合物７：N-ベンゾイル-L- バリル-L- アラニル-L- ノルロイシンベンゾイルオキシメチルケトン化合物８：N-ベンゾイル-L- バリル-L- アラニル-L- ノルロイシン2,3,4,5,6- ペンタフルオロベンゾイルオキシメチルケトン化合物９：N-ベンゾイル-L- バリル-L- アラニル-L- ノルロイシン1,1-ジメチルプロピルオキシメチルケトン化合物10：N-ベンゾイル-L- バリル-L- アラニル-L- ノルロイシンN-(ベンジルオキシカルボニル)-D-セリニル-(O-t-ブチル)オキシメチルケトン化合物11：N-ベンゾイル-L- バリル-L- アラニル-L- ノルロイシンN-(ベンジルオキシカルボニル)-D-セリニルオキシメチルケトン化合物12：N-ベンゾイル-L- バリル-L- アラニル-L- ノルロイシン2-フランオキシメチルケトン化合物13：N-ベンゾイル-L- バリル-L- アラニル-L- ノルロイシン2,6-ジクロロフェニルアシルオキシメチルケトン化合物14：N-ベンゾイルアミノ-L- バリル-L- アラニル-L- ノルロイシル−ヒドロキサム酸化合物15：N-(ベンゾイルアミノ-L- バリル-L- アラニル-L- ノルロイシル)- O-ベンゾイルヒドロキサメート化合物16：N-(N- ベンゾイル-L- バリル-L- アラニル-L- ノルロイシル)-O- 2,6-ジメチル−ベンゾイルヒドロキサメート化合物17：N,O-ジメチル(t- ブトキシカルボニルアミノ-L- ロイシル)ヒドロキシラミンの調製化合物18：N,O-ジメチル（アミノ-L- ロイシル）ヒドロキシラミンの調製化合物19：N,O-ジメチル(t- ブトキシカルボニルアミノ-L- アラニル-L- ロイシル)ヒドロキシラミンの調製化合物20：N,O-ジメチル（アミノ-L- アラニル-L- ロイシル）ヒドロキシラミンの調製化合物21：N,O-ジメチル（t-ブトキシカルボニル−アミノ-L- バリル-L- アラニル-L- ロイシル）ヒドロキシラミンの調製化合物22：t-ブトキシカルボニルアミノ-L- バリル-L- アラニル-L- ロイシルアルデヒドの調製化合物23：エチル-(S)-(E)-3-((t- ブトキシカルボニルアミノ-L- バリル-L- アラニル)アミノ-6- メチル−ヘプテ-2- ノエート化合物24：(S)-(E)-3-((t-ブトキシカルボニルアミノ-L- バリル-L- アラニル)アミノ-6- メチル−ヘプテン酸-2 化合物25：1,1,1-トリフルオロエチル-(S)-(E)-3-((t- ブトキシカルボニルアミノ-L- バリル-L- アラニル)アミノ-6- メチル−ヘプテ-2- ノエート化合物26：エチル-(S)-(E)-3-((N- ベンゾイル-L- バリル-L- アラニル)アミノ-6- メチル−ヘプテ-2- ノエート化合物27：エチル-(S)-(E)-3-((2- トリフルオロメチル-N- ベンゾイル-L- バリル-L- アラニル)アミノ-6- メチル−ヘプテ-2- ノエート化合物28：エチル-(S)-(E)-3-（(ピペロニロイルアミノ-L- バリル-L- アラニル)アミノ-6- メチルヘプテ-2- ノエート化合物29：エチル-(S)-(E)-3-（(フェニルカルバモイルアミノ-L- バリル-L- アラニル)アミノ-6-メチルヘプテ-2- ノエート化合物30：エチル-(S)-(E)-3-（(ジフェニルカルバモイルアミノ-L- バリル -L- アラニル)アミノ-6- メチルヘプテ-2- ノエート化合物31：エチル-(S)-(E)-3-（(ナフトイルアミノ-L- バリル-L- アラニル) アミノ-6- メチルヘプテ-2- ノエート化合物32：エチル-(S)-(E)-3-（(キナゾロイルアミノ-L- バリル-L- アラニル)アミノ-6- メチルヘプテ-2- ノエート化合物33：エチル-(S)-(E)-3-（(モルホリノイルアミノ-L- バリル-L- アラニル)アミノ化合物34：エチル-(S)-(E)-3-（(キサンテン-9- オイルアミノ-L- バリル-L- アラニル)アミノ-6- メチルヘプテ-2- ノエート化合物35：ジエチルフェニルスルホニルメチルホスホネート化合物36：(S)-(E)-3-((t-ブトキシカルボニルアミノ-L- バリル)-L-アラニル)アミノ-1- フェニルスルホニル-5- メチル-1- ヘキセン化合物37：ジエチルメチルスルホニルメチルホスホネート化合物38：(S)-(E)-3-((t-ブトキシカルボニルアミノ-L-バリル)-L-アラニル)アミノ-1- メチルスルホニル-5- メチル-1- ヘキセン化合物39：チルジエチルホスホリルメチルスルホネート化合物40：エチル(S)-(E)-3-((t-ブトキシカルボニルアミノ-L- バリル)-L-アラニル)アミノ-5- メチルヘキセニルスルホネート 48．実質的に上記したような、（公知のE64 を除く）化合物またはリガンドもしくは薬理組成物。