HRP20000450A2 - Prevention and/or treatment of allergic conditions - Google Patents

Description

Ovaj izum se odnosi na prevenciju i/ili liječenje alergijskih stanja i osobito takvih stanja u kojima potencijalni alergen mora prijeći epitelnu barijeru. Ovaj izum ima posebnu, ali ne jedinu, primjenu u prevenciji i/ili liječenju astme.

Astma je najčešća kronična bolest u djetinjstvu i glavni uzrok slabljenja i stanje opasno po život. Karakterizirana je akutnom hiperosjetljivošću, kroničnom bronhijalnom reaktivnošću i oštećenjem i razaranjem plućnog epitela.

Primarni faktor rizika kod astme je osjetljivost pluća na alergene koji se nalaze u zraku kao što su proteini koje izlučuju u fekalnim česticama grinje iz kućne prašine (HDM) koje pripadaju koljenu Dermatophagoides (na pr. D. pteronyssinus. D. Farinae). Kada se udahnu, HDM fekalne čestice djeluju preko epitelne površine dišnih puteva velikog promjera koja je pokrivena tekućinom. Posljedična hidracija HDM fekalnih čestica će pokrenuti brzo i potpuno otpuštanje glavnine alergenskih proteina i tako ostvariti visoku lokalnu koncentraciju HDM proteina u dišnim putevima. Senzibilizacija uključuje otkrivanje alergena putem stanica koje prezentiraju antigen koje su normalno zaštićene od okoline pomoću plućnog epitela. Mehanizam putem kojega alergeni mogu prijeći epitelnu barijeru nije u potpunosti razumljiv.

Danas je sve više dokaza da nekoliko glavnih alergena iz HDM pokazuju katalitičko djelovanje poput enzima i to je potaknulo mišljenja da ova enzimatska djelovanja mogu biti važna u alergijskoj senzibilizaciji i trajnosti uspostavljenih alergijskih upalnih reakcija.

Većina podataka koji se odnose na aktivnost proteinaza u alergenima grinja trenutno se odnose na one u skupinama 1, 3, 6 i 9 iz grinja iz koljena Dermatophagoides. Alergeni iz skupine 1 su cistein proteinaze i oni su predmetom najvećeg istraživanja dok postoji manja količina informacija koja se odnosi na enzimatske učinke alergena iz skupine 3, skupine 6 i skupine 9 koji dijele sekvencijski identitet sa arhetipskim serin proteinazama i koje su same po sebi katalitički kompetentne.

Postoji mišljenje da je aktivnost cistein proteinaze važna u pogoršanju alergijskog odgovora kod astme jer cijepa CD23, IgE receptor niskog afiniteta, na površini stanica koje produciraju protutijela. Cijepanje rezultira pozitivnim povratnim odgovorom koji uzrokuje povećanje IgE sekrecije, i tako pojačava alergijski odgovor. Temeljem ovoga, WO-A-97/04004 (Peptide Therapeutics) predlaže da se inhibitori cistein proteinaze mogu između ostaloga koristiti za profilaksu astme. Međutim, mi ne vjerujemo da mehanizam koji se predlaže u WO-A-97/04004 djeluje in vivo. Razlog za to je da se svi pokusi na cijepanju CD23 izvode na staničnoj kulturi i koncentracije Der p i koje su potrebne za cijepanje su prema našem gledištu nerealno velike. Stanice o kojima je riječ bi, in vivo, bile smjeŠtene u tkivu ili krvi. To je, prema našem gledištu, izuzetno nevjerojatno da koncentracije alergena dosegnu razine potrebne za cijepanje CD23 na ovim mjestima. Nema dokaza da se to događa, niti da se cijepanje CD23 uopće događa in vivo.

Kalsheker N. i sur. (1996) Biochem. Biophys. Res. Comms. (USA) 221/1 strane 59-61 otkrivaju da alfai-antitripsin serin proteinaza štiti donji respiratorni trakt od oštećenja pomoću proteinaza koje se otpuštanju u plućima za vrijeme upale. Pokazalo se da cistein proteinaza Der p 1 cijepa predloženu reaktivnu omču inhibitora alfai-antitripsin serin proteinaze i taj mehanizam se predlaže važnim u patogenezi astme. Također se otkriva daje nedostatak alfai-antitripsina povezan sa incidencijom astme u djetinjstvu. Međutim, nema objašnjenja kako se mogu liječiti ili spriječiti alergijska stanja (kao što je astma) u kojima alergen mora prijeći epitelnu barijeru.

Stewart G. i sur. (1991)Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 95/2-3 strane 248-256 otkrivaju da izmet grinja iz prašine sadrži tri serin proteinaze i cistein proteinazu zajedno sa različitim drugim enzimima. Također otkriva da su cistein proteinaza i najmanje jedna od serin proteinaza alergeni. Međutim nema otkrića kako se alergijska stanja kao što je astma u kojima alergen mora prijeći epitelnu barijeru mogu liječiti ili spriječiti.

Unatoč velikom naporu koji se poduzima na polju istraživanja astme, ostaje potreba za poboljšanim metodama u prevenciji i/ili liječenju astme (i drugih alergijskih stanja u kojima mogući alergen mora prijeći epitelnu barijeru).

U svom prvom, najširem gledištu ovaj izum govori o sprječavanju i/ili liječenju alergijskih stanja ( tip u kojem mogući alergen mora prijeći epitelnu barijeru ) pomoću inhibicije aktivnosti cistein proteinaze i aktivnosti serin proteinaze.

Ovaj izum je posebice primjenjiv (ali ne isključivo) na liječenje astme kod koje je aktivnost cistein proteinaze koju treba inhibirati poželjno Der p 1 s time da aktivnost serin proteinaze koju treba inhibirati može biti bilo koja druga serin proteinaza osim tripsina, poželjno neka alergenska serin proteinaza i još bolje Der p 3, Der p 6 i/ili Der p 9.

Ovaj izum se temelji na našim eksperimentalnim studijama ( kasnije podrobno prikazane) koje su pokazale daje ključni početni korak u alergijskoj preosjetljivosti na alergene grinja iz kućne prašine posredovan aktivnošću obiju cistein i serin proteinaza. Našli smo da je ova aktivnost uzrokom pucanja tijesnih veza između epitelnih stanica povećavajući tako permeabilnost epitela i dozvoljavajući alergenu da prijeđe epitel. Na ovaj način, alergen može pristupiti i medudjelovati sa dendritičkim stanicama koje prezentiraju antigen da bi se proizveo alergijski odgovor. Inhibitori cistein protinaze inhibiraju alergene cistein proteinaze ali ne inhibiraju alergene serin proteinaze i tako ne zaustavljaju u potpunosti pucanje tijesne veze. Slično, inhibitori serin proteinaze zaustavljaju učinke alergena serin proteinaze ali ne inhibiraju alergene cistein proteinaze i tako ne sprječavaju u potpunosti pucanje tijesne veze. Djelomična inhibicija još uvijek dozvoljava pojavu alergijskog odgovora. Inhibicija aktivnosti obiju cistein i serin proteinaza alergena je neophodna za sprječavanje pucanja tijesnih veza u potpunosti i stvaranje alergijskog odgovora.

Iako je ovaj izum posebice primjenjiv za sprječavanje i/ili liječenje astme može se primijeniti na druga alergijska stanja uključujući rinitis, alergijski konjunktivitis, atopijski dermatitits i alergije na hranu.

Liječenje i/ili prevencija alergijskih stanja može se ostvariti putem slijedećih sredstava

(i) formulacije (koja pokazuje drugo gledište izuma) koja ima serin i cistein proteinaza inhibitornu aktivnost; ili

(ii) kit (koji osigurava treće gledište izuma)

obuhvaćajući inhibitor aktivnosti cistein proteinaze i inhibitor aktivnosti serin proteinaze.

U formulaciji iz drugog gledišta ovog izuma, jedan inhibitorni spoj može osigurati potrebnu inhibiciju aktivnosti serin ili cistein proteinaze. Međutim, više uobičajeno, i u skladu sa poželjnim oblikom iz drugog gledišta ovog izuma, inhibicija aktivnosti cistein proteinaze i aktivnosti serin proteinaze će se osigurati odvojenim inhibitornim spojevima.

Kada se koriste odvojeni inhibitorni spojevi kao u kitu iz trećeg gledišta ovog izuma, mogu se koristiti ili istovremeno jedan s drugim ili u slijedu Jedan iza drugog.

Ako je neophodno može se koristiti više od jednog tipa inhibitora aktivnosti cistein proteinaze i/ili više od jednog tipa inhibitora aktivnosti serin proteinaze da se osigura potreban spektar djelovanja.

Ovaj izum je prije svega primjenjiv (ali ne isključivo) na terapijsko liječenje.

Stoga u skladu sa četvrtim gledištem ovog izuma osigurava se upotreba inhibitora aktivnosti cistein proteinaze u spoju sa inhibitorom aktivnosti bilo koje druge serin proteinaze osim tripsina za proizvodnju lijeka za liječenje ili sprječavanje stanja kod kojih alergen prelazi epitelnu barijeru.

U skladu sa petim gledištem ovog izuma osigurava se metoda za sprječavanje ili liječenje stanja u kojima alergen prelazi epitelnu barijeru obuhvaćajući primjenu terapeutski učinkovite količine(a) inhibitora aktivnosti cistein proteinaze i inhibitora aktivnosti serin proteinaze.

Ova terapijska liječenja mogu se ostvariti upotrebom pripravka iz drugog gledišta ovog izuma ili kita iz trećeg gledišta ovog izuma.

Četvrto i peto gledište ovog izuma su posebice primjenjivi za liječenje astme i još više za njezinu profilaksu. Pod pojmom profilaktičkog liječenja mi uključujemo bilo koje liječenje koje se primjenjuje za sprječavanje ili ublažavanje učinka astmatičkog napada. Profilaktičko liječenje se može dati, na primjer, periodički osobi za koju se zna da pati od astmatičkih napada s namjerom sprječavanja ili smanjenja učestalosti takvih napada. Drugačije se profilaktičko liječenje može dati temeljem ad hoc procjene osobi koja pati od astme i koja je izložena okolini (npr. okolina zaražena nekim alergenom) koja može vrlo vjerojatno započeti astmatski napad. Dalja mogućnost je da se primijeni profilaktičko liječenje na osobi koja nije razvila astmu, ali za koju se iz nekog razloga vjeruje da je pod takvim rizikom.

U svrhu terapijske primjene, inhibitorni spoj(evi) se oblikuju u farmaceutski prihvatljiv ekscipijent za isporuku u plućni epitel. Najpoželjnije je da se inhibitorni spoj(evi) primjene putem aerosola kao što je uobičajeno za anti-astmatsko liječenje. Mi međutim ne isključujemo druge puteve primjene.

Količina inhibitornog spoja(eva) koji se primjenjuje bit će, naravno, u terapeutski učinkovitoj dozi. Raspon doze će ovisiti o faktorima kao što je tjelesna težina bolesnika koji se liječi, težina astmatskog stanja koje se liječi i aktivnost inhibitora. Međutim tipične doze će biti u rasponu od 1 do 1000 mikrograma na dan.

lako se ovaj izum do sad opisivao osobito u odnosu na terapijsko liječenje astme, mi nalazimo da se inhibicija aktivnosti cistein i serin proteinaza kod alergena iz grinja iz kućne prašine može koristiti izvan polja terapijskog liječenja. Tako je, na primjer, moguće tretirati nežive substrate koji posjeduju ili mogu posjedovati alergene grinja iz kućne prašine sa inhibitorima aktivnosti cistein ili serin proteinaza, tako da ovi substrati postanu hipoalergenični. Primjeri takvih substrata su oni koji su uopćeno pridruženi relativno visokoj razini alergena (na pr. tepisi, posteljina, tkanine za presvlačenje namještaja itd.).

Primjeri inhibitora aktivnosti cistein proteinaze koji se mogu koristiti u bilo kojem gledištu ovog izuma uključuju L-trans-epoksisukcinil-leucilamid-(4-gvanidino)-butan (E-64) jednako kao i inhibitori cistein proteinaze otkriveni u WO-A-97/04004.

Primjeri inhibitora aktivnosti serin proteinaze koji se mogu koristiti u bilo kojem gledištu ovog izuma uključuju 4-(2-aminoetil)-benzensulfbnii fluorid hidroklorid (AEBSF).

Izum je ilustriran slijedećim ne-ograničavajućim primjerom (i pratećim slikama) koje daju rezultate primjera.

PRIMJER

Koristeći metode koje su kasnije podrobnije opisane, primjer prikazuje učinak na permeabilnost epitela kod

(i) frakcija cistein i serin proteinaza izdvojenih iz grinja kućne prašine, i

(ii) frakcija koje se navode pod (i) u kombinaciji sa inhibitorima aktivnosti cistein i serin proteinaza

METODE

Stanična kultura

Calu-3 i MDCK stanice se koriste kao paradigma za istraživanje međustaničnih veza epitela i njihove osjetljivosti na HDM proteinaze i moguće inhibitore. Obje stanične linije izražavaju tijesne veze, zonulae adherenstes i desmosome i tako su prihvatljivi modeli za mehanizme stanične adhezije u dišnim putevima. Calu-3 je stanična linija adenokarcinoma dobivena od 25-godižnjeg Kavkažanina. Ona je bila predmetom relativno malog broja istraživanja, ali je poznato temeljem elektrofizioloških studija da ispoljava svojstva tijesne barijere (Shen i sur, 1994; Haws i sur. 1994) i temeljem naše vlastite imunocitokemijske karakterizacije (nije prikazano). Stanice se množe u Eagle-ovom minimalnom esencijalnom mediju sa Earlov-im solima (EMEM) obogaćenim sa 10% v/v fetalnim goveđim serumom koji se inaktivira grijanjem (FCS), 2 mM L-glutaminom, ne-esencijalnim amino kiselinama, 10 μM natrijeva piruvata i 50U/ml penicilina i 50μg/ml streptomicina.

Epitelne stanice psećeg bubrega Madin -Darby (MDKC) se kultiviraju u EMEM-u koji sadrži 50U ml -1 penicilina, 50ug ml-1 streptomicina, 2mM L-glutamina, ne-esencijalne amino kiseline i 10 % v/v FCS inaktiviranog grijanjem. Za subkultivaciju obaju staničnih tipova, stanice se isperu u fosfatnom puferu (PBS) bez kalcija i magnezija i zatim djelomice digestiraju upotrebom 0,05% (w/v) tripsina i 0.02 % (w/v) EDTA otopine.

Sve kulture se umnažaju na 37°C u vlažnoj atmosferi sa 5% ugljičnog dioksida u zraku.

OBAVIJANJE TRANSWELL™ UMETAKA SA MATRIGELOM

Mjerenja klirensa manitola se izvode najednom sloju konfluentnih stanica koje su se umnožile na Costar Transwell™ umetku sa promjerom pora od 0.4 μm obavijenim sa ultra-tankim podslojem Matrigela. Obavijanje se izvede dodavanjem 250 μl Matrigela (rezrijeđen 1:500 v/v u EMEM) u unutrašnjost umetka nakon čega slijedi inkubacija na temperaturi okoline kroz 60 min pod aseptičkim uvjetima. Otopina se zatim aspirira i umetak nježno ispere sa medijumom prije dodavanja stanične suspenzije konfluentne gustoće.

PROTOKOLI TRETIRANJA STANICA 1 MJERENJE KLIRENSA

Stanice (2-5 x 105 po cm2 područja rasta) se stave na Matrigelom obavijene umetke. Mi koristimo pojam "umetak" u značenju jedinice filtera koja sadrži stanice i pojam "zdenac" za oznaku šupljina na pločici za kultivaciju. Za praćenje rasta i integriteta, umetci se uzimaju randomizirano, nježno isperu u PBS-u i obojaju pod prigušenim svjetlom sa akridin orange-om i etidium bromidom (1 mg ml-1 svaki u PBS-u). Umetci se pregledaju pod fluorescentnim mikroskopom i koriste samo kada se ostvari konfluencija sa visokom viabilnošću.

Kod konfluencije, medij se aspirira iz zdenaca i zamijeni sa EMEM-om bez seruma i bikarbonata puferiranim sa 20 mM HEPES-a koji sadrži 2 mM L-glutamina. Medij iz umetaka se zatim nježno odstrani i zamijeni sa 300 μl EMEM-a bez seruma koji sadrži [14C] -manitol (1 μCi ml-1 i 1 mg ml -1 neoznačenog manitola u HEPES puferiranom mediju). TranswellTM pločice se zatim ekvilibriraju kroz 30 min na 37°C na Luckham-ovoj R100 kružnoj miješalici (šejker). Uzmu se tri uzorka od po 100 μl nekorištene označene otopine manitola i odredi njihov radioaktivni sadržaj pomoću tekuće scintilacijske spektrometrije (Beckman LS6000IC) nakon čega se doda 5 ml Opti-fluora.

Nakon ekvilibracijskog razdoblja, umetci se stave u nove zdence koji sadrže 1 ml HEPES- a bez seruma puferiranog sa EMEM-om i inkubiraju na 37°C sa kontinuiranim nježnim miješanjem (šejker). Medij iz izvornih zdenaca se zadrži i odredi njegova radioaktivnost nakon dodavanja 10 ml Opti-fluora. Rezultati se koriste za određivanje koncentracije u tragovima u nultom vremenu. U vremenskim intervalima, odstrani se 20 μl bazolateralne tekućine i odredi količina 14C manitola kao što je gore opisano za izračunavanje volumena klirensa.

IZRAČUNAVANJE EPITELNE PERMEABILNOSTI

Paracelularna permeabilnost manitola se odredi u skladu sa postupkom opisnim u našoj U.K. Patent Application No. 9715058 i izračuna iz mjerenja volumena klirensa u određenoj točki vremena. Procjene klirensa se naprave kroz 3-5 sati i izračunaju u skladu sa odnosom:

[image]

gdje:

Vprobe je volumen klirensa u svakoj točki vremena

VA je abluminalni volumen u svakoj točki vremena

A[A]i je povećanje koncentracije u tragovima između točki vremena

[L]i je luminalna koncentracija u tragovima u svakoj točki vremena

Pod uvjetima gdje je difuzija jedino sredstvo transepitelnog kretanja otopine, dVprobe/dt tijesno aproksimira permeabilnom području površine proizvoda dozvoljavajući tako procjenu permeabilnosti manitola u složenom sustavu stanica, filtera, nepromiješanih slojeva i obavijanja proteina (Pt). Epitelna permeabilnost se može izračunati iz izmjerene varijable uzevši u obzir Matrigelom obavijeni filter i nepromiješane slojeve kao sustav serijskih permeabilnosti. Tako:

[image]

i

[image]

gdje

Pt je složena permeabilnost sustava

P1 je komponenta od samih epitelnih stanica

P2 komponenta od strane filtera bez Matrigela

P3 je komponenta nepromiješanog sloja

P4 je permeabilnost filtera obavijenog Matrigelom

U čistim difuzijskim sustavima

[image]

gdje

D je slobodni difuzijski koeficijent manitola

δ je ukupna debljina nepromiješanih slojeva

Debljine nepromiješanih slojeva su neovisne o membranskoj permeabilnosti pod idealnim uvjetima, tako su P3 u jednadžbi (3) i (4) jednaki. Jednadžbe (2) i (3) tako dozvoljavaju izračunavanje permeabilnoasti epitelnog monosloja (5).

[image]

Analiza varijance se izvede nakon log transformacije podataka permeabilnosti i vrijednosti vjerojatnosti za označene različite tretmane upotrebom testa najmanje signifikantne diferencije. Podatci se prikažu kao geometrijske srednje vrijednosti sa prikazanom standardnom pogreškom za n eksperimentalne opservacije. Razine vjerojatnosti od p<0.05 se smatraju statistički značajnim.

SPRAVLJANJE FRAKCIJA PROTEINAZE IZ MEDIJA HDM KULTURE

Alergeni HDM proteinaze se još ne proizvode u katalitički kompetentnom obliku pomoću rekombinantne stanične ekspresije zrelog enzimskog proteina. Da bismo omogućili budući skrining u širokom rasponu mogućih inhibitora u odsutnosti katalitički aktivnih rekombiniranih proteina, mi smo izdvojili aktivnost cistein i serin proteinaze pomoću jednostavne biokemijske frakcinacije medija u kojemu su rasle HDM. Za vrijeme kultivacije HDM otpuštaju alergene u medij što rezultira nakupljanjem proteina prikladnih za pročišćavanje. Medij iz kulture D. pteronyssinus (Commonwealth Serum Laboratory, Parkville, Australia) se otopi u 5 volumena fosfatnog pufera i zatim centrifugira na 48,400 x g i 40C kroz 20 min. Supernatantu koji se miješa na 40C postepeno se doda amonijev sulfat da se dobije 50% zasićena otopina. Nakon centrifugiranja (48,400 x g, 20 min, 4°C) čestica, za koju se našlo enzimatskim testom da je obogaćena aktivnošću cistein proteinaze, se ponovo otopi u minimalnom volumenu destilirane vode. Supernatantu se doda amonijev sulfat da se dobije 80% zasićenje. Čestica koja se dobije daljim centrifugiranjem, za koju se nađe da je obogaćena aktivnošću serin proteinaze. se resuspendira u minimalnom volumenu destilirane vode. Frakcije cistein (50% precipitat) i serin proteinaze (50-80% precipitat) se odvojeno dijaliziraju iz destilirane vode preko noći i zatim liofiliziraju prije rekonstitucije u EMEM-u. Proteinski sadržaj ekstrakata se izmjeri upotrebom Coomassie Blue tehnike sa serumskim albuminom kao standardom (Smith i sur., 1985). Aktivnost proteinaze se izmjeri upotrebom Azocoll degradacijskog testa kao što je ranije opisano (Herbert i sur., 1995; Chavira i sur., 1984). Ekstrakti se također testiraju na prisustvo endotoksina upotrebom testa Limulus amebocitne lize (Endotec ???? , ICN Biomedicals, Thame, Oxfordshire). U svim slučajevima razine endotoksina su bile ispod granice detekcije testa (<0.06 ng ml-1 ).

IMUNOBLOTING FRAKCIJA HDM PROTEINAZE

Frakcije proteinaze se odvoje pomoću SDS-PAGE i elektroforetski prenesu na nitroceluloznu membranu. Nespecifično proteinsko vezanje se blokira sa 5% w/v nemasnog mlijeka i 0,1% v/v Tween-20 u Tris-puferiranoj otopini (TBS) nakon čega slijedi inkubacija sa mAb 5H8 (anti-Der p 1) razrijeđen u TBS koji sadrži 2% w/v goveđeg serumskog albumina i 0.1% v/v Tween-20. Detekcija se izvede putem pospješene kemiluminiscencijske tehnike (Amersham International, Buckinghamshire).

TESTOVI ZA STANIČNU SMRT

Stanice se stave u petrijevke 60 x 15 mm i ostave rasti kroz 2-4 dana EMEM-u koji sadrži serum pod uvjetima za kultivaciju u atmosferi od 5% CO2. Stanice se zatim izlože tretmanima u EMEM-u bez seruma koji sadrži 20 mM HEPES-a pod aerobnom inkubacijom na 37°C. U određenim vremenskim točkama, stanice se žanju zajedno sa odvojenim stanicama u supernatantu. Stanice se cenirifugiraju na 550 x g kroz 5 min i ekstrahira njihova DNA (Nucleon II, Scotlab, Coatbridge, Stratchclyde). Ekstrahirana DNA se resuspendira u 100 (j.i TE pufera (10 mM Tris-HCL i 1 mM Na2EDTA) preko noći na sobnoj temperaturi, i njihova čistoća se odredi spektrofotometrijski. Jednake količine DNA se stave u 4:1 omjer sa uzorkom pufera (0,25% bromfenol plavilo i 40% w/v sukroza u vodi) u svaki red od 2% (w/v) agaroza gela i izvede elektroforeza na 50V kroz 2-3 sata u TAE puferu (0.04M Tris-acetat i 0,001M EDTA). Trake DNA u gelovima (koji imaju ugrađen etidium bromid) se vizualiziraju ultravioletnim svjetlom.

Preraspodjela fosfatidilserina u vanjski sloj staničnih membrana koja se događa za vrijeme inicijacije apoptoze se promatra uporabom aneksin V bojanja. Ovo se izvodi u petrijevkama 60 x 15 koje su modificirane tako da se izbuši rupa od 1 cm u promjeru na bazi svake petrijevke i vanjska strana pokrije sa pokrovnicom osiguranom putem Sylgard-a (Dow Corning, Midland, MI, USA). Poliamidni prsten se napravi pomoću cijanoakrilatnog adheziva na unutarnjoj strani petrijevke da se stvori zdenac staklenog dna koji se zatim obavije sa ultratankim slojem Matrigela. Stanice (3 x 104) se stave u svaki zdenac ostave rasti kroz 2-3 dana, nakon čega se izlože željenom eksperimentalnom tretmanu. Nakon ovoga, stanice se isperu u PBS-u i zatim u 200 ml vezajućeg pufera prije dodavanja aneksin V-FITC (AV) i propidij jodida (PI) pod prigušenim svjetlom. Nakon inkubacije od 15 min stanice se isperu sa vezajućim puferom i pregledaju fluorescentnim mikroskopom uz uporabu plavog i zelenog ekscitacijskog seta (Zeiss Axiovert 10 sa uljnom imerzijom Fluar objektivima). Uporabom ove tehnike, stanice u ranoj apoptozi se oboje zeleno jer se FITC-konjugirani aneksin V veže za fosfatidilserin koji je postao orijentiran na vanjski sloj stanične membrane (Fadok i sur., 1992; Koopman i sur, 1994; Vermes i sur, 1995; Homburg i sur, 1995). Mrtve stanice se također obojaju crveno sa PI jer mu povećana permeabilnost nuklearne membrane dozvoljava vezanje za nukleinske kiseline. Fotografska dokumentacija se napravi upotrebom Contax 167 MT kamere i Kodak TMAX 400 filma za crno bijele slike ili Ektachrome 160T za slike u boji.

LDH aktivnost se izmjeri uporabom piruvične kiseline kao substrata i spektrofotometrijskim praćenjem stvaranja fenilhidrazonskog derivata iz mliječne kiseline. MDCK ili Calu-3 stanice se zasiju na pločicu sa 12 zdenaca i ostave rasti do konfluencije. Monoslojevi stanica se izlože kroz 18 sati ili kontrolnim tretmanima (EMEM bez seruma i fenola, sa 0.6 mM ditiotreitola u sluČaju za kontrolu frakcije cistein proteinaze) ili frakcije HDM proteinaze razrijedene u istom mediju (sa 0.6 mM ditiotreitola prisutnog u frakciji cistein proteinaze). Na kraju pokusa, inkubacijski medij se žanje i centrifugira na sobnoj temperaturi da se sedimentiraju sve stanice koje su se odvojile od podloge za vrijeme tretmana. Prva frakcija supernatanta se testira izravno na LDH aktivnost, s time da se čestice koje se stvaraju od bilo kojih odvojenih stanica podvrgnu hipotoničkoj lizi sa destiliranom vodom (5 min na sobnoj temperaturi) prije kratkog centrifugiranja da se odstrani stanični debris. Drugi supernatant se zatim testira na LDH aktivnost. Stanice koje ostanu pričvršćene za zdence za vrijeme tretmana se liziraju kao što je opisano gore i izmjeri se LDH aktivnost. Budući da nije bilo značajnog odvajanja stanica za vrijeme tretmana sa kontrolnim medijem, ukupna stanična LDH aktivnost se definira kao ona koja je prisutna u lizatu od pričvršćenih stanica koje su teretirane sa samim EMEM-om bez seruma i fenol crvenila.

IMUNOCITOKEMIJSKA VEZUALIZACIJA UČINAKA INHIBITORA NA CIJEPANJE MEĐUSTANIČNIH VEZA POSREDOVANO PROTEINAZOM

Da se istraže učinci proteinaza i inhibitora na međustanične veze, MDCK stanice se kultiviraju na pokrovnice i obrade sa odgovarajućom proteinazom i/ili inhibitorom u željenom vremenskom razdoblju. Stanice se fiksiraju u ledeno-hladnom metanolu prije vezanja štakosrkog anti-ZO-1 (mAb R40.76) (Stevenson i sur., 1986; Anderson i sur., 1988) i mišjeg anti-desmoplakina(mAb 11-5F) (Parrish i sur., 1987). Neizravno bojanje fluorescentnim protutijelima se izvede uporabom FITC- i TRITC-konjugiranih drugih protutijela. Mikroskopira se na Zeiss Axiovert mikroskopu sa Fluar objektivom za uljnu imerziju i x40 povećanjem. Uzorci se osvijetle uporabom ekscitacijskih i emisijskih filtera za FITC i TRITC. Stanice se slikaju kao što je gore opisano.

MATERIJALI

Svi mediji i reagensi stanične kulture se dobiju od ICN Biomedicals Ltd (Thame, Oxfbrdshire), osim onih gdje je drugačije naznačeno. HBSS se dobije od Gibco BRL, Life Technologies Ltd (Paisley). Manitol i Triton X-100 se dobiju od Sigma-Aldrich Ltd (Poole, Dorset) i fetalni goveđi serum koji je inaktiviran grijanjem od Labtech International Ltd (Uckfield, East Sussex). Matrigel se dobije od Universal Biologicals, London. Klirens manitola se mjeri u Transwell-u čiji je promjer 12 mm sa veličinom pore na membrani od 0.4 μm i debljinom membrane od 10 μm (Costar UK Ltd, High Wycombe, Buckinghamshire). D-[14C] manitol se dobije od NEN Du Pont Research Products (Stevenage, Hertfordshire), i Opti -Fluor scintilant i scintilacijske posude od Canberra Packard Ltd (Pangbourne, Berkshire). MDCK stanice se uzgoje od zalihe iz našeg laboratorija. Calu-3 se izvorno dobiju od American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA) i umnože serijskim pasažama da se dobije lokalna banka krioprezerviranih stanica. Stanice se kultiviraju u posudi za staničnu kulturu od 75 cm2 (Marathon Laboratory Supplies, London), Costar-ovim pločicama za kultivaciju ili Transwell umetcima u skladu sa prirodom pokusa. Agaroza (molekularnog stupnja) se dobije od Promega (Southampton, Hampshire). Kitovi za mjerenje LDH se dobiju od Sigma-e; Apoalert kitovi od Cambridge Bioscience-a. Akridin oranž, etidium bromid i sve druge opće laboratorijske reagencije se dobiju od BDH (Poole, Dorset). Spoj E-64 (L-trans-epoksisukcinil-leucilamid-(4-gvanidino)-butan, inhibitor cistein proteinaze, se dobije od Sigma-e. Koncentrirane vodene otopine se smrznute pohrane do upotrebe. Inhibitor serin proteinaze 4-(2-aminoetil)-benzensulfbnil fluorid hidroklorid (AEBFS) se dobije od Pentapharm-a, Basel, Switzerland. Inhibitor matriks metaloproteinaze (MMP) BB-250 ([4-(N-hidroksiamino)-2R-izobutil-3S-(tiofen-2-il-sulfonilmetil)sukcinil]-L-fenilalalnin-N-metilamid) se dobije od British Biotech Pharmaceuticals Ltd. Svi inhibitori se naprave kao koncentrirane otopine u suhom Me2SO i razrijede po potrebi sa medijem koJi se upotrebljava u pokusu. Odgovarajuće kontrole za Me2SO vehikulum su uključene u pokus po potrebi. Monoklonska protutijela R40.76 na ZO-I smo dobili ljubaznošću dr Bruce Stevenson-a, University ofAlberta. Monoklonska Der p 1 protutijela 5H8 su ljubazan poklon od dr Martin Chapman-a, University ofVirginia , USA.

REZULTATI

FRAKCIONIRANJE MEDIJA U KOJEMU SU KULTIVIRANE GRINJE

Medij se razdijeli u dvije frakcije precipitacijom sa amonij sulfatom. Frakcija koja se dobije precipitaciojm sa 50% amonijeva sulfata se sastoji od glavnih proteinskih traka na ~ 22 kDa i 38 kDa (slika 1a, linija 2). Testovi enzimske razgradnje koji koriste kromogene substrate pokazuju daje katalitičku aktivnost 50% precipitata moguće inhibirati sa E-64 (nije prikazano). Imunoblot analize 50% precipitata uporabom mAb 5H8 za Der p1 otkrivaju nazočnost velike trake sa masom od ~ 22 kDa i manje trake od 38 kDa (slika 1b, linija 2). U SDS-PAGE i imunoblot analizama frakcija cistein proteinaze se ponašala identično kao i kao Der p 1 pročišćena putem kombinacije imunoafinitetne kromatografije, gel filtracije i izoelektnčkog fokusiranja (usporedi liniju 1 i 2 prikaz a, b na slici 1). Usporedba linija 2 i 3 na imunoblotu prikazanom na slici 1b pokazuje da 5H8 mAb također reagira sa dodatnim rasponom proteina koji su nazočni u 50-80% amonij sulfatnog precipitata. U odsutnosti reducirajuće tvari 50-80% amonij sulfat precipitatne frakcije pokazuje visoku katalitičku aktivnost koja se smanjila putem inhibitora arhetipske serin proteinaze (nije prikazano). Zbog jednostavnosti, u ovom tekstu 50% precipitat se navodi kao frakcija cistein proteinaze i 50-80% precipitat kao frakcija serin proteinaze.

UČINCI HDM FRAKCIJA PROTEINAZE NA EPITELNU PERMEABILNOST

U ovim pokusima koriste se pod kontroliranim uvjetima obje MDKC i Calu-3 epitelne stanične linije u gustom jednom sloju sa permeabilitetima za manitol u rasponu od 0.7-1.2 x 10 -6 cm s-1. Izlaganjem staničnog monosloja ili MDKC ili Calu-3 stanica frakciji serin proteinaze dobije se promjena u permeabilnosti ovisna o koncentraciji (slika 2). Koncentracijska ovisnost frakcije cistein proteinaze nije testirana u ovoj seriji pokusa, ali učinke čistog alergena cistein proteinaze Der p 1 smo ranije prikazali na sličnom in vitro modelu (Herbert i sur., 1990; 1995).

Učinci frakcije cistein proteinaze na MDKC staničnom monosloju su oslabljeni pomoću inhibitora cistein proteinaze E-64 (slika 3a). E-64 nije imao vidljivog učinka na intrinzička svojstva permeabilnosti staničnog monosloja (slika 3a). Inhibitori serin proteinaze AEBSF i, manje učinkovito, SBTI inhibiraju djelovanje frakcije serin proteinaze u MDKC stanicama (slika 3b). Inhibitor per se nije pokazao bilo koji vidljivi učinak na epitelnu permeabilnost (slika 3b). Inhibitori su također bili učinkoviti u istoj koncentraciji u Calu-3 staničnom monosloju. Calu-3 stanični monosloj tretiran sa frakcijom cistein proteinaze imao je permeabilnost manitola od (8.44 ± 0.43 ) x 10-6 cm s-1 koji je smanjen do (4.84 ± 0.32 ) x 10-6 cm s-1 pomoću E-64 (P<0.05, n=5). Calu-3 stanični monoslojevi koji su tretirani sa frakcijom serin proteinaze imali su permeabilnost manitola od (1.81 ± 0.02 ) x 10-6 cm s-1 koja se smanjila do (10.20 ± 0.01 ) x 10-6 cm s-1 pomoću AEBSF (P<0.05, n=5).

Inhibitori proteinaze specifičnog razreda su bili učinkoviti samo protiv poznatih enzimskih frakcija deriviranih iz HDM kultura. Slika 4 prikazuje da AEBSF, u koncentraciji koja je smanjila učinke frakcije serin proteinaze, nije uspio inhibirati aktivnost frakcije cistein proteinaze na Calu-3 stanicama. Obratno, E-64 nije inhibirao promjenu permeabilnosti uzrokovanu frakcijom serin proteinaze (slika 4).

Slika 5 prikazuje da tretiranje MDCK staničnog monosloja sa frakcijom cistein ili serin proteinaze dovodi do razaranja normalno graničnog perifernog modela bojanja TJ proteina ZO-1 i točkastog bojanja desmoplakina. Dodavanjem E-64 frakciji cistein proteinaze ili AEBSF frakciji serin proteinaze inhibira se promjene ovisne o proteinazi (slika 5).

HDM PROTEINAZE INDUCIRAJU STANIČNU SMRT U EPITELU

Kontrolna inkubacija MDKC ili Calu-3 stanica kroz 18 sati u EMEM-u bez seruma stvara neznatno otpuštanje LDH sve dok se ne podvrgnu hipotoničkoj lizi na kraju pokusa (slika 6). Obrada stanica obaju staničnih tipova sa frakcijama cistein ili serin proteinaze također nije uspjela dovesti do otpuštanja značajnih količina LDH u inkubacijski medij (slika 6), unatoč činjenici da su se neke stanice odvojile od substratnog matriksa za vrijeme pokusa. Liza odvojenih stanica i adheriranih stanica rezultirala je nalazom LDH u jednakoj količini koja se našla kod netretiranog staničnog lizata (slika 6).

Stanična smrt se također istražila pregledom DNA fragmentacije i ispitivanjem staničnog bojanja sa Avi PI. Slika 7 a, b prikazuje vidljivu DNA fragmentaciju kod MDCK i Calu-3 stanica nakon tretmana sa HDM proteinazama pod uvjetima koji rezultiraju povećanjem permeabilnosti epitela. Učinci obiju frakcija HDM proteinaza su bili smanjeni pomoću inhibitora matriks metaloproteinaza BB-250 (slika 7b). E-64 je inhibirao učinke frakcije cistein proteinaze, ali ne i frakcije serin proteinaze (slika 7b). Slika 7 također prikazuje da obrada MDKC ili Calu-3 stanica sa frakcijom serin proteinaze rezultira kod nekih stanica vezanjem samo aneksina V (AV+PI+), što ukazuje na ranu apoptozu u ovih stanica, a kod drugih koje su se obojale sa aneksinom V i PI (AV+PI+) što ukazuje na staničnu smrt (vidi sliku 7d,f,h,j). Prostorna raspodjela AV+PI- stanica sa ranom apoptozom i AV+PI+ mrtvih stanica je takva da se stanice nakupljaju oko područja gdje je došlo do jasnog propadanja stanične adhezije (npr. vidi sliku 7d,f).

DISKUSIJA

HDM čestice fekalnih proteina su glavni uzrok alergijske astme (Tovey i sur., 1981) i velikim dijelom čine pozadinu povećane prevalencije bolesti (Dowse i sur., 1985). U ovoj studiji mi smo pokazali da proteinaze iz fekalnih čestica Z). pteronyssinus iskazuju moćne biološke učinke na epitelnim stanicama. HDM proteinaze su bile frakcionirane putem amonij sulfat precipitacije u cistein i serin razrede. Oba precipitata su imala slične učinke u pokusnim sustavima koje smo istraživali. Oni su proizveli povećanje u permeabilnosti epitela, uzrokovali cijepanje lateralne stanične adhezije, i odvajanje stnaica od biomatriks substrata. Cijepanje i odvajanje stanica nije bilo povezano sa velikim otpuštanjem LDH, ali smo našli vidljivu ranu apoptozu i staničnu smrt sa pucanjem jezgre. Pregledom stanica obojanih sa AV i PI otkrilo se daje bojanje bilo lokalizirano na područjima staničnog razaranja/odvajanja. Nadalje smo pokazali da se stanična smrt može oslabiti pomoću inhibitora proteinaze.

Precipitacija amonij sulfatom se pokazala učinkovitim sredstvom za odvajanje glavnih razreda aktivnosti proteinaze u mediju za kultivaciju HDM. Frakcija koja precipitira pomoću 50% amonij sulfata je imala aktivnost cistein proteinaze i njezin učinak povećane permeabilnosti na epitelnim stanicama je bio inhibiran pomoću E-64 ali nije sa inhibitorom serin proteinaze AEBSF. SDS-PAGE i imunoblot analiza sa mAb 5H8 je na HDM alergen Der p 1 (cistein proteinaza) otkrila nazočnost traka sa molekulskim masama od 22kDa i -38kDa u ovoj frakciji. Suprotno, frakcija precipitirana sa 50-80% zasićenog amonij sulfata je imala aktivnost serin proteinaze i njezini učinci na eptelnim stanicama su bili inhibirani sa AEBSF, i u manjem stupnju SBTI, ali uopće ne sa E-64. Mi zaključujemo iz studija sa inhibitorima daje bio minimalni funkcionalni prijenos alergena cistein proteinaze u ovu frakciju. SDS-PAGE i imunoblot analiza su otkrile nazočnost nekoliko proteinskih traka u frakciji serin proteinaze, od kojih su neke prepoznate pomoću mAb 5H8 (npr. približne mase 22, 26, 28, 29 i 38 kDa). mAb 5H8 se na široko primjenjuje za pročišćavanje i kvantificiranje Der p 1, ali njihova specifičnost je nedavno dovedena u pitanje (Cambra & Berrens, 1996). Tako, slučajan nalaz iz naše studije je razlogom za dalju zabrinutost u vezi specifičnosti ovih protutijela. Proteinske trake otkrivene u 50-80% amonij sulfat precipitatu su u skladu sa nazočnosti alergena serin proteinaze Der p 3, Der p 6 i Der p 9. Temeljem ovih zapažanja mi smatramo daje amonij sulfat frakcionacija ekstrakata HDM kulture jednostavno i učinkovito sredstvo za istraživanje bioloških učinaka alergena HDM proteinaze i također za identifikaciju novih inhibitora njihovih učinaka.

Ranije smo pokazali da visoko pročišćeni alergen Der p 1 inducira povećanje transepitelnog iscjedka serumskog albumina u mukozu dišnih puteva, uzrokuje pucanje epitelne arhitekture i odvajanje MDKC stanica od prirodnog biopolimernog substrata (Herbert i sur., 1990; 1995). Također smo pokazali da su ovi učinci Der p 1 bili rezultatom njegove aktivnosti cistein proteinaze jer su bili osjetljivi na inhibiciju pomoću E-64, relativno specifičnog inhibitora većine cistein proteinaza (Barrett i sur., 1982; Shaw, 1994; Herberti sur., 1995). lako usporedbe slijeda amino kiselina predviđaju da je Der p 1 moguća cistein proteinaza (Chua i sur., 1988; Stewart, 1994; Topham i sur., 1994; Robinson i sur., 1997), drugi predlažu da bi ona mogla djelovati kao bifunkcionalna cistein-serin proteinaza jer je njezina aktivnost također bila inhibirana pomoću APMSF, jednog inhibitora serin proteinaza (Wewitt i sur., 1995,1997). Ako je tako, ova predložena bifunkcionalnost bi imala potencijalno važan utjecaj na građu specifičnih inhibitora Der pl. Međutim, u ovoj studiji mi imamo primjedbu na funkcionalni značaj navedene bifunkcionalnosti tako što smo pokazali da (i) frakcija cistein proteinaze derivirana iz HDM kultura nije mogla biti inhibirana pomoću koncentracija AEBSF koje su značajno inhibirale aktivnost frakcije serin proteinaze, i (ii) daje frakcija serin proteinaze bila otporna na inhibiciju sa E-64 u koncentracijama u kojima ovaj inhibitor blokira aktivnost cistein proteinaze. Drugi dokazi protiv tvrdnje da je Der p 1 miješana cistein-serin proteinaza su nedavno objavljeni (Chambers i sur., 1997).

Propusna selektivnost bronhijalnog epitela prema hidrofilnim otopinama je određena putem TJ-a koji su izraženi kružno na vrhu pola svake stanice (Schneeberger & Lynch, 1992). Prigušena ekspresija TJ proteina jedne stanice u blizini susjednih stanica sa TJ proteinima smatra se razlogom sposobnosti epitela da razvije njegovo svojstvo čvrstine (Anderson & Van Itallie, 1995; Robinson, 1995). Razaranje međudjelovanja TJ proteina između stanica, na primjer stvaranjem diskontinuiteta na njihovim perijunkcionalnim mjestima, je pridruženo propadanju epitelnih barijera (Horwath i sur., 1994; Zhong i sur., 1994; Stuart i sur., 1994; Stuart & Nigam. 1995). Obje frakcije HDM proteinaza koje su se koristile u ovoj studiji uzrokovale su pucanje TJ-a što se vidi gubitkom perijunkcionalnog bojanja ZO-L Također su primijećena pucanja desmosoma. Razaranje TJ-a rezultira povećanom permeabilnošću epitelnog sloja, i eventualno fizičkim odvajanjem stanica od substrata. Gubitak ZO-1 iz TJ i desmoplakina iz desmosoma je ovisio o eksogenoj aktivnosti proteinaze jer je proces bio oslabljen pomoću E-64 (u slučaju frakcije cistein proteinaze) i AEBSF (u slučaju frakcije serin proteinaze). lako su ZO-1 i desmoplakin intracelularni proteini, i stoga nije vjerojatno da će se razgraditi pomoću eksogenih proteinaza, njihovo razaranje je izraženo kao posljedica pucanja drugih, na membrani izloženih, komponenti TJ i desmosoma. Smatra se da sličan mehanizam sudjeluje u promjenama drugih intracelularnih proteina nakon cijepanja međustaničnih veza (Volk i sur., 1990).

Učinci proteinaza nisu imali za posljedicu zančajno otpuštanje LDH od strane stanica. Međutim, obrada sa bilo kojom od frakcija proteinaza u nekih stanica je rezultirala znacima rane apoptoze (AV+PI-) ili staničnom smrću (AV+PI+). Stanice mogu postati apoptotične putem mnogih mehanizama (pregled u Hale i sur., 1996) uključujući promjene u homotipskoji i heterotipskoj staničnoj adheziji i prijanjanju staničnog matriksa (Boudreau u sur., 1995, 1996; Mehida i sur., 1996; Firsch & Francis, 1994). Rani signalni događaj u programiranoj staničnoj smrti je pucanje fosfolipid-vezujućih citoskeletnih proteina koji vode do transmembranske preraspodjele fosfatidilserina (Martin i sur., 1995a,b). Sustav citoskeletnih proteina je normalno stabiliziran i nadziran putem izravnog međudjelovanja sa proteinskim komponentama iz međustaničnih veza (Furse i sur., 1994; Anderson & Van Itallie, 1995) iz čega slijedi da proteoliza međustaničnih adhezija, osobito TJ, može biti kritični događaj u orkestriranju staničnog odgovora na alergene proteinaza. Sposobnost E-64 da inhibira djelovanje cistein ali ne i serin frakcije proteinaze pokazuje da je E-64 radije djelovao na proksimalnom koraku u procesu koji vodi do promjena permeabilnosti i apoptoze, nego putem inhibicije distalnog proteolitičkog koraka u mehanizmu transdukcije. Nadalje, proteinaze intracelularne signalizacije iz ICE/ced-3 obitelji koje se između ostalog aktiviraju putem Fas/APO-1 ligacije u apoptozi (Los i sur., 1995; Mariani i sur., 1995; Kayagaki i sur., 1995; Tanaka i sur., 1996) imaju neuobičajen inhibitorni profil jer su neosjetljive na E-64. Suprotno, inhibitorno djelovanje BB-250 se može pojaviti tako da se spriječi otpuštanje Fas liganda (Mariani i sur., 1995; Kayagaki i sur., 1995).

Senzibilizacija pluća na alergene iz zraka kao što su HDM je središnji događaj u patogenezi alergijske astme. Plućni epitel stvara barijeru koju strani proteini moraju prijeći prije nego uspiju izazvati alergijsku senzibilizaciju, ali mehanizam pomoću kojega alergeni prelaze epitelnu barijeruje slabo razumljiv (Robinson i sur., 1997). Enzimatska priroda proteina deriviranih iz fekalnih čestica HDM predstavlja jedno objašnjenje mehanizma pomoću kojega alergeni djeluju na imuni sustav. Uzrokujući žarišna pucanja čvrstih veza, i konačno gubitak umiruće stanice, HDM proteinaze mogu povećati paracelularnu propusnost alergena do stanica koje prezentiraju antigen. Vrijedno je zapaziti da lokalizirana trauma i stanična smrt koje su posljedice proteolitičkog cijepanja međustaničnih veza može također ispuniti neke uvjete "modela opasnosti" za adaptivni imunološki odgovor i tako objasniti zašto su pokrenuti odgovori usmjereni protutijelima (Metzinger, 1994; Rodge i sur., 1996). Dalju potporu ovom gledištu daju i noviji dokazi da kada se apoptoza (često smatrana imunološki "tihim" oblikom stanične smrti) javlja u nazočnosti tkivnog oštećenja, rezultirajući kombinirani stimulans je zapravo prijetnja stanicama koje prezentiraju antigen ( Boockvar i sur., 1994; Casciola-Rosen i sur., 1994; Ibrahim i sur., 1996).

U sažetku, ovi rezultati pokazuju da HDM proteinaze djeluju na ephelne stanice koje vjerojatno promoviraju alergijsku senzibilizaciju. Sposobnost specifičnih inhibitora da interferiraju sa odgovorom epitelnih stanica na alergene proteinaza predstavlja razlog za prevenciju i/ili liječenje alergijskih stanja.

Reference

ANDERSON, J.M., STEVENSON, B.R., JESAITIS, L.A., GOODENOUGH, D.A. & MOOSEKER, M.S. (1988). Karakterizacija ZO-1, proteinske komponenete čvrste veze stanica mišje jetre i stanica psećeg bubrega Madin-Darby. J Cell Biol., 106, 1141-1149.

ANDERSON, J.M. & VAN ITALLIE, C.M. (1995). Čvrste veze i molekularna osnova za regulaciju paracelularne permeabilnosti. Am. J. Physiol , 269, G467-475.

BARRET, A.J.. KEMBKAVI, A.A., BROWN, M.A., KIRSCHKE, H., KNIGHT.C.G., TAMAI, M. & HANADA. K. (1982). L-trans-epoksisukcinil-leucilamido(4-gvanidino)butan (E-64) i njegovi analozi kao inhibitori cistein proteinaza uključujući katepsine B,H iL. Biochem.J., 201. 189-198.

BOOCKVAR, K.S., GRANGER, D.L., POSTON,R.M., MAYBODI, M.,WASHINGTON M.K., HIBBS, J.B.Jr & KURLANDER, R.L. (1994). Nitritni oskid koji se proizvodi za vrijeme murine listerioze je zaštitni. Infect. Immun., 62,1089-1100.

BOUDREAU, N., WERB, Z. & BISSELL. M.J. (1996). Supresija apoptoze pomoću bazalne membrane zahtijeva trodimenzionalnu organizaciju tkiva i povlačenje iz staničnog ciklusa. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 3509-3513.

BOUDREAU, N., SYMPSON, C.J., WERB, Z. & BISSELL, M.J. (1995). Ssupresija ICE i apoptoze u epitelnim stanicama dojke pomoću ekstracelularnog matriksa. Science, 267, 891-893.

CASCIOLA-ROSEN, L.A., ANHALT, G. & ROSEN, A. (1994). Napadnuti autoantigeni u sistemskom lupus eritematozusu se nakupljaju u dvije populacije površnih struktura na apoptotičnim keratinocitima. J. Exp. Med., 179, 1317-1330.

CHAMBERS. L. SUNEAL, K., SREEDHARAN, S. D., KALSHEKER, N. & BROCKLEHURST, K. (1997). Da li je Der p 1 alergen grinja iz prašine cistein proteinaza? Biochem. Soc. trans., 25, 85S.

CHAVIRA, R.. BURNETT, T.J.JR. & HAGEMAN, J.H. (1984). Testiranje proeinaza sa Azocoll-om. Anal. Biochem., 136, 446-450.

CHUA, K. Y., STEWART, G.A. & THOMAS, W.R.. SIMPSON, R.J., DILWORTH, R.J., PLOZZA, T.M. & TURNER, K.J., (1988). Sekvencijska analiza cDNA kodiranja za glavni alergen grinja iz kućne prašine, Der p 1. Homolognost sa cistein proteinazom. J. Exp. Med., 167,175-182.

CHUA, K.Y., KEHAL. P.K. & THOMAS, W. R. (1993). Sekvencijski polimorfizmi cDNA klonova koji kodiraju alergen grinja Der pl. Int. Arch. Allery Immunol., 101.364-368.

COZENS.A.L., YEZZI, M.J., KUNZELMAN. K., OHRUI, T., ENG, K.,FINKBEINER, W.E., WIDDICOMBE, J.H. & GRUENERT, D.C.(1994) CFTR ekspresija i sekrecija klorida u polariziranim besmrtnim stanicama ljudskog bronhijalnog epitela. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 10, 38-47.

DOWSE, G.K., TURNER, K.J., STEWART, G.A., ALPERS, M.P. & WOOLCOCK, A.J. (1985). Veza između grinja Dermatofagoides i povećane prevalencije astme u seoskim naseljima na visoravnima Papua-e Nova Gvineja. J. Allergy Clin. Immunol., 75, 75-83.

FADOK, V.A., VOELKER, D.R., CAMPBELL, P.A., COHEN, J.J., BRATTON, D.L. & HENSON, P. M.(1992). Izlaganje fosfatidilserina na površini apoptotičnih limfocita pokreče specifično prepoznavanje i odstranjivanje putem makrofaga. J. Immunol. 148, 2207-2216.

FRISCH, S.M. & FRANCIS, H. (1994). Razaranje epitelnih međudjelovanja stanica-matriks inducira apoptozu. J. Cell Biol. 124, 619-626.

FURUSE, M., ITOH, M., HIRASE, T., NAGAFUCHI, A., YONEMURA, S., TSUKITA, S. & TSUKITA, S. (1994). Izravna veza između okludina i ZO-1 i njihova moguća uključenost u lokalizaciji okludina na čvrstim vezama. J. Cell Biol., 127, 1617-1626.

HALE, A.J., SMITH, C.A., SUTHERLAND, L.C., STONEMAN, V.E.. LONGTHORNE, V.L., CULHANE, A.C. & WILLIAMS, G.T. (1996). Apoptoza: molekularna regulacija stanične smrti. Eur.J. Biochem., 236, 1-26. Vidi također objavljeni erratum Eur.J.Biochem., 237, 884.

HAWS, C., FINKBEINER, W.E., WIDDICOMBE, J H. & WINE, J.J. (1994). CFTR u Calu-3 ljudskim stanicama dišnih putova: svojstva kanala i uloga u cAMP-aktiviranoj Cl provodljivosti. Am. J. Physiol.,

266, L502-L512.

HERBERT, C.A.. ARTHUR, M.J.P., ROBINSON,C. (1996). Eozinofili povećavaju aktivnost želatinaze u sluznici dišnih putova. Usporedni učinci kao mogući medijator epitelnog oštećenja. Br. J. Pharmacol., 117, 667-674.

HERBERT, C.A., EDWARDS. D., BOOT, J.R., ROBINSON,C. (1993). Stimulirani eozinofili i proteinaze povećavaju transepitelni izljev albumina u goveđoj bronhalnoj sluznici. Br. J. Pharmacol., 110, 840-846.

HERBERT, C.A., KING, C.M., RING, P.C., HOLGATE, S.T.. STEWART, G.A., THOMPSON, P.J., ROBINSON, C. (1995). Povećanje permeabilnosti u bronhijalnom epitelu pomoću alergena grinja iz kućne prašine, Der p 1. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. , 12, 369-378.

HERBERT, C.A., OMARI, T.I., SPARROW, M.P. & ROBINSON, C. (1994). Ljudski eozinoflli i rekombinantna matriks metaloproteinaza-2 povećavaju permeabilnost dišnih putova goveda i svinje. Br. J. Pharmacol., 112, 461P.

HERBERT, C.A., HOLGATE, S.T.. ROBINSON, C. THOMPSON, P.J. & STEWART, G.A. (1990). Učinak alergena grinja na permeabilnost bronhijalne sluznice. Lancet 2, 1132.

HEWITT, C.R.A.. BRROWN, A.P., HART, B.J. & PRITCHARD, D.I. (1995). Glavni alergen grinja iz kućne prašine razara mrežu imunoglobulina E pomoću selektivnog cijepanja CD23; svojstvena zaštita pomoću antiproteinaza. J. Exp. Med., 182, 1537-1544.

HEWITT, C.R.A., HORTON, H., JONES, R.M. & PRITCHARD, D.L (1997). Heterogena proteolitička specifičnost i aktivnost alergena proteinaze grinja iz kućne prašine Der pl. Clin. Exp. Allergy. 27, 201-207.

HOLT, P.G. (1993). Regulacija funkcije(a) stanice koja prezentira antigen u plućima i tkivu dišnih putova. Eur. Respir.J., 6, 120-129.

HOLT, P.G.(1995). Populacije makrofaga i dendritičkih stanica u respiratornom traktu.

U: Holgate S.T. ur. Imunofarmakologija respiratornog sustava. London: Academic Press 1-12.

HOLT, P.G., McMENAMIN, C., SCHON-HEGRAD, M.A., STRICKLAND, D., NELSON, D.,WILKES, L., BILYK, N., OLIVER, J., HOLT, B.J. & McMENAMIN, P.G. (1991). Imunoregulacija astme: kontrola aktivacije T-limfocita u respiratornom trktu. Eur. Respir. J., 4, S6-S15.

HOLT, P.G., SCHON, H.M., OLIVER, J., HOLT, B.J. & McMENAMIN, P.G. (1990). Granična mreža dendritičkih stanica koje prezentiraju antigen unutar respiratornog epitela. Int. Arch. Allergy Appl. Immunol., 91, 155-159.

HOMBURG, C.H.E., HAAS, M., von DEM BORNE, A.E.G.Kr , VERHOEVEN, A.J., REUTELINGSPERGER, C.P.M. & ROOS, D. (1995). Ljudski neutrofili izgube njihov površinski FcyRIII i stječu aneksin V vezna mjesta za vrijeme apoptoze in vitro. Blood, 85, 532-540.

HOVVARTH, A.G., SINGER, K.L. & STEVENSON, B.R. (1994). Analiza raspodjele i stanja fosforilacije ZO-1 u MDCK i neepitelnim stanicama. J. Membr. Biol., 137, 261-270.

IBRAHIM, M.A.A., CHAIN, B.M. & KATZ, D.R. (1996). Oštećena stanica; uloga sustava dendritičnih stanica kao zastitnog receptorskog puta. Immunol.Today, 16, 181-186.

KAYAGAKI, N., KAWASAKI, A., EBATA, T., OHMOTO. H., IKEDA, S., INOUE, S., VOSHINO. K., OKAMURA, K. & YAGITA, H. (1995). Metaloproteinazom posredovano otpuštanje ljudskog Fas liganda. J.Exp. Med., 182, 1777-1783.

KING, C.. SIMPSON, R.J., MORITZ, R.L., REED, G.E., THOMPSON, P.J. & STEWART, G.A. (1996). Izolacija i karakterizacija novog kolagenolitičkog alergena serin proteinaze(Der p 9) iz grinje iz prašine, Dermatophagoides pteronyssimus. J. Allergy Clin. Immunology, 98, 739-747.

KOOPMAN, G., REUTELINGSPERGER, C.P.M., KUIJTEN, G.A.AM., KEEHNENE, R.M.J., PALS, S.T., & van OERS, M.H.J. (1994). Aneksin V za protočno citometrijsko otkrivanje ekspresije fosfatidilserina na B stanicama koje podliježu apoptozi. Blood, 84,1415-1420.

LOS, M., VAN DE CRAEN. M., PENNING, L.C., SCHRENK, H., VVESTENDORP, M., BAEUERLE, P., DROGE, W., KRAMMER, P.H., FIERS, W & SCHULTZ-OSTHOFF, K. (1995). Potreba za ICE/CED-3 proteazom za Fas/APO-1-posredovanom apoptozom. Nature, 375, 81-83.

MAHIDA, Y.R., MAKH, S., HYDE, S., GRAY, T. & BORRIELLO.S.P. (1996). Učinak toksina A iz Clostridium difficile na ljudske crijevne epitelne stanice: indukcija IL-8 produkcije i apoptoza nakon staničnog odvajanja. Gut, 38, 337-347.

MARIANI, S.M., MATIBA, B., BAUMLER.C. & KRAMMER, P.H. (1995). Regulacija ekspresije APO-1/Fas (CD95) liganda na površini stanice pomoću metaloproteinaza. Eur. J. Immuno., 25, 2303-2307.

MARTIN, S.J., O'BRIEN, G.A., NISHIOKA, W.K., McGAHON, AJ., MAHBOUBI, A., SAIDO, T.C. & GREEN, D.R. (1995). Proteoliza Fodrina (ne-eritroidnog spektrina)za vrijeme apoptoze. J. Biol. Chem., 270, 6425-6428.

MARTIN, SJ., REUTELINGSPERGER, C.P.M., McGAHON, AJ., RADER, J.A., van SCHIE, R.C.A.A., LaFACE, D.M. & GREEN, D.R. (1995). Rana redistribucija plazma membranskog fosfatidilserina je opća značajka apoptoze bez obzira na inicijalni stimulans; inhibicija pomoću preizraženosti Bcl-2 i Abl. J. Exp. Med. 182, 1545-1556.

MATZINGER, P. (1994). Tolerancija, opasnost i proširena obitelj. Annu. Rev. Immunol., 12, 991-1045.

OMARI, TJ. & SPARROW, M.P. (1992). Razaranje epitela pomoću proteaza povećava sposobnost odgovora kod svinjskih bronhijalnih segmenata.Clin. Exp. Pharmacol. Physiol., 19, 785-794.

PARRISH. E.P., STEART, P.V., GARROD, D.R. & WELLER, R.O. (1987). Antidesmosomsko monoklonsko protutijelo u dijagnostici intrakranijalnih tumora. J. Pathol., 153, 265-273.

PLATTS-MILLS. T.A.E., THOMAS, W.R., AALBERSE, R.C., BERVOLET, D., CHAPMAN. M.D., BISCHOFF, E., BRUIJNSEEL-KOOMEN, C.A.F.M., CHARPIN, D., COLLOF, M.J., EGGLESTON, P.A., EHNERT, B., GOLDSTEIN, R.A., van HAGE-HAMSTEN, M., HART, B.J., HOLGATE, S.T.. HONG, C.S., JOHANSSON, S.G.O., KORGGAARD, J & LAU,S.(1992). Alergeni grinja iz prašine i astma -izvješće sa druge međunarodne radionice. J. Allergy Clin. Immunol. 89, 1046-1060.

RIDGE, J.P., FUCHS, E.J. & MATZINGER, P. (1996). Ponovo posjećena neonatalna tolerancija: ukapčanje novorođenačkih T stanica sa dendritičkim stanicama. Science, 271, 1723-1726.

ROBINSON, C. (1995). Epitel dišnih puteva: podrijetlo i cilj upalnih bolesti i ozljeda dišnih puteva. U: Holgate S.T., ur. Immunopharmacology ofthe respiratory system. London: Academic Press 187-207.

ROBINSON.C., KALSHEKER, N.A.. SRINIVASAN, N., KING, C.M., GARROD, D.R., THOMPSON. P.J. & STEWART, G A. (1997). O mogućem značaju enzimatske aktivnosti alergena grinja do imunogenosti. Ključevi za strukturu i funkciju otkriveni putem molekularne karakterizaicje. Clin. Exp. Allergv, 27, 10-21.

SCHNEEBERGER. E.E. & LYNCH, R.D. (1992). Struktura, funkcija i regulacija staničnih čvrstih veza. Am. J. Phvsiol., 262, L647-L661.

SEARS, M.R., HERBISON, G.P., HOLDAWAY, M.D., HEWITT. C.J., FLANNERY, E.M. & SILVA, P.A. (1989). Relativni rizici zbog osjetljivosti na pelud iz trave, grinja iz kućne prašine u razvoju astme u djetinjstvu. Clin. Exp. Allergy, 19, 419-424.

SHAW, E. (1990). Cisteinil proteinaze i njihova selektivna inaktivacija. Adv. Enzymol., 63, 271-347.

SHEN, B.-Q., FINKBEINER, W.E., WINE, J.J., MRSNY, R.J. & WIDDOCOMBE, J.H. (1994). Calu-3: ljudska stanična linija epitela iz dišnih putova koja pokazuje C1 sekreciju ovisnu o cAMP. Am. J. Physiol., 266, L493-L501.

SMITH. P.K., KROHN, R.L, HERMANSON, G.T., MALLIA, A.K., GARTNER, F.H., PROVENZANO, M.D., FUJIMOTO, E.K., GOEKE, N.M., OLSON, B.J. & KLENK, D.C. (1985). Mjerenje proteina upotrebom bicinhoninične kiseline. Anal. Biochem. 150, 76-85. ( i objavljeni erratum, 163, 279 (1987)).

STEVENSON, B.R., SICILIANO, J.D., MOOSEKER, M.S., GOODENOUGH, D.A. (1986). Identifikacija ZO-1: polipeptida visoke molekularne težine udruženog sa čvrstom vezom (zonulae occludens) u različitim epitelima. J. Cell Biol., 103, 755-766.

STEWART, G.A. (1994). Molekularna biologija alergena. U: Busse WW, Holgate ST, ur: Astma i rinitis. Oxfbrd: Blackvvell Science. 898-932,

SREWART, G.A., WARD, L.D., SIMPSON, R.J. & THOMPSON, P.J. (1992). Alergen iz skupine III iz grinja iz kućne prašine Dermatophagoides pteronyssinus je enzim sličan tripsinu. Immunology 75, 29-35.

STUART, R.O., DUN, A., PANICHAS, M., HEBERT. S.C., BRENNER, B.M. & NIGAM, S.K. (1994). Kritična uloga intracelularnog kalcija u biogenezi čvrste veze. J. Cellul. Physiol. 159, 423-433.

STUART, R.O. & NIGAM, S.K. (1995). Regulacija spajanja čvrstih veza putem protein kinaze. C. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 6072-6076.

TANAKA, M. SUDA, T., HAZE, K., NAKAMURA, M., SATO, K., KIMURA, F., MOTOYOSHI, K., MIZUKI. M., TAGAWA, S., OHAGA, S., HATAKE, K., DRUMMOND, A.H. & NAGATA, S. (1996). Fas lignd u ljudskom serumu. Nature Med., 2, 317-322.

TOPHAM, C.M., SRINIVASAN, N., THORPE, C.J.. OVERINGTON, J.P. & KALSHEKER, N.A.(1994). Komparativno oblikovanje glavnog alergena grinja iz kućne prašine Der pl: strukturna valjanost uz uporabu tablice za proširene amino kiseline iz okoline. Protein Engng., 7, 869-894.

TOVEY, E.R.. CHAPMAN. M.D. & PLATTS-MILLS, T.A.E. (1981). Izmet grinja je glavni izvor alergena iz kućne prašine. Nature, 289, 592-593.

VERMES, I., HAANEN, C., STEFFENS-NAKKEN, H. & REUTELINGSPERGER, C. (1994). Novi test za apoptoza protočno citometrijsko otkrivanje ekspresije fosfatidilserina na rano apoptotičnim stanicama uporabom aneksina V koji je obilježen fluoresceinom. J. Immunol. Methods., 184, 39-51.

VOLK, T., VOLBERG, T., SABANAY, I. & GEIGER, B. (1990). Cijepanje A-CAM pomoću endogenih proteinaza u kulturi stanica leće i u pilećem embriju u razvoju. Dev. Biol., 139, 314-326.

YASUEDA, H., MITA., H. & AKIYAMA, K., SHIDA, T., ANDO, T., SUGIYAMA. S. & YAMAKAWA, H. (1993). Alergeni iz grinja Dermatophagoides sa kimotriptičkom aktivnošću. Clin. Exp. Allergy, 23, 384-390.

ZHONG, Y., ENOMOTO, K., ISOMURA, H., SAWADA, N., MINASE, T.. OYAMADA, M., KONISHI, Y. & MORI, M. (1994). Lokalizacija 7H6 antigena i čvrstih veza korelira sa funkcijom paracelularne barijere MDCK stanica- Exp. Cell. Res.. 214, 614-620.

LEGENDE ZA SLIKE

Slika 1.

SDS - PAGE (slika a) i imunoblot analiza (slika b) frakcija HDM proteinaza. Ključ za linije na slici a: imunoafinitetom pročišćeni Der p 1(1); frakcija HDM cistein proteinaze (2) i frakcija HDM serin proteinaze (3). Proteini se učine vidljivim pomoću coomassie plavog bojanja. Slika b prikazuje imunoblot priređen iz gela na slici a. Proteini su otkriveni uporabom mAb 5H8 (anti-Der p1) i učinjeni vidljivima pomoću ECL tehnike. Zapazite detekciju imunoreaktivnih proteina pomoću mAb 5H8 u frakciji serin proteinaze u dodatku kod očekivane imunorekativnosti frakcije cistein proteinaze. Ispunjeni krugovi pokazuju standarde za kalibraciju mase i strelice pokazuju vidljive molekularne mase traka iz kretanja standarda označenih bojom.

Slika 2.

Krivulje dilution-response (razrijeđenje-odgovor) prikazuju učinke 18-satnog izlaganja staničnog sloja frakciji serin proteinaze pripremljene iz HDM kulture. Slika (a) prikazuje permeabilnost za manitol MDCK epitelnih stanica pod kontroliranim uvjetima (samo EMEM bez seruma) i nakon obrade (frakcija proteinaze razrijeđena u EMEM-u bez seruma). Slika (b) pokazuje slične studije koje su izvedene na Calu-3 bronhijalnim epitelnim stanicama. Podatci su prosjek ± s.p. sredina od 4-6 pokusa. Aktivnost alergena protinaze (izražena u azocoll jedinicama ml-1) je prikazana pomoću brojeva ispod pune linije. Zvjezdice pokazuju statistički značajne razlike sa poštivanjem neobrađenog kontrolnog odgovora (EMEM medij bez seruma) za svaki stnaični tip.

Slika 3.

Inhibicija učinaka frakcija HDM proteinaza na permeabilnost za manitol u MDCK staničnom sloju. Slika (a) prikazuje učinke E-64 (10 UM) na učinak proizveden pomoću frakcije cistein proteinaze (80 azocoll jedinica ml-1). Kontrolne stanice su bile izložene EMEM-u bez seruma koji sadrži 0.5mM reduciranog glutationa. Slika (b) pokazuje učinke AEBSF-a (100 μM) na učinke frakcije serin proteinaze (127 azocoll jedinica ml-1) . Podatci su prosjek ± s.p. sredina od 3-5 pokusa. U svim slučajevima je kontaktno vrijeme od 18 sati. Na objema slikama (a) i (b) postoje statistički značajne razlike između permeabilnosti kontrole i sloja tretiranog sa proteinazom i također između slojeva tretiranih sa proteinazama u prisutnosti ili odsutnosti inhibitora. Značajne usporedbe su prikazane na slici pomoću uglatih linija i pokazuju vrijednosti vjerojatnosti.

Slika 4.

Slika (a) ilustrira učinke 100 μM AEBSF-a na promjene u permeabilnosti za manitol u Calu-3 staničnom sloju nakon 18-satnog izlaganja frakciji cistein proteinaze (80 azocoll jedinica ml-1). Podatci su prosjek ± s.p. sredina od 3 pokusa. Slika (b) ilustrira učinke 10 μM E-64 na promjene u permeabilnosti za manitol u Calu-3 staničnom sloju nakon 18-satnog izlaganja frakciji serin proteinaze (94 azocoll jedinica ml-1). Podatci su projsek ± s.p. sredina od 3 pokusa. U oba primjera, kontrolne stanice se obrade sa samim EMEM medijem bez seruma (sa 0.5 mM reduciranog glutationa u slučaju frakcije cistein proteinaze).

Slika 5.

Imunobojanje TJ proteina ZO-1 (slike a-e) i desmosomskog plak proteina desmoplakina (slike f-j) u MDCK staničnom sloju. Slike a, f prikazuju imunobojanje stanica izloženih EMEM-u bez seruma kao kontroli. Model imunobojanja nakon obrade sa frakcijom cistein proteinaze (80 azocoll jedinica ml-1) je prikazan na slici b, g i modifikacija ovog odgovora pomoću E-64 (10 μM) na slici c, h. Model imunobojanja nakon obrade sa frakcijom serin proteinaze (94 azocoll jedinice ml-1) je prikazan na slikama d,i i modifikacija ovog odgovora pomoću AEBSF-a (100 μM) na slikama e,j.

Slika 6.

Mjerenje otpuštanja LDH nakon obrade MDKC ili Calu-3 stanica sa frakcijama HDM proteinaze kroz 18 sati. Slika a prikazuje izostanak otpuštanja LDH iz stanica pod kontroliranim uvjetima sve dok sloj stanica nije bio podvrgnut hipotoničnoj lizi. Slika a također prikazuje da obrada sa frakcijom cistein proteinaze (80 azocoll jedinica ml -1 nakon aktivacije sa 0,5 mM reduciranog glutationa) rezultira neotpuštanjem LDH u medij za vrijeme trajanja tretmana. Zapazite da su sve stanice bile odvojene od zdenaca za vrijeme obrade i da je hipotonična liza odvojenih stanica rezultirala otkrivanjem iste količine LDH aktivnosti izmjerene u kontrolnim stanicama. Slika b ilustrira sličan pokus uz uporabu frakcije serin proteinaze (114 azocoll jedinica ml -1). Zapazite da nisu sve stanice bile odvojene za vrijeme trajanja tretmana, ali daje zbroj LDH aktivnosti u liziranim adheriranim i liziranim odvojenim stanicama korespondirao detektiranoj količini u kontrolnim stanicama. Slike c i d prikazuju slične pokuse izvedene u Calu-3 stanicama. Zapazite da je bilo malo pozadinsko otpuštanje LDH iz ovih stanica (<10% ukupnog staničnog LDH) pod kontroliranim uvjetima i da se ovo nije značajno mijenjalo obradom sa proteinazom. Prikazani podatci su prosjek + s.p- sredina od 4 pokusa.

Slika 7.

Elektroforeza DNA u agaroza gelu (slike a,b) i stanično bojanje sa AV i PI (slike c-j) nakon obrade MDKC i Calu-3 stanica sa frakcijama HDM proteinaza. Slika a prikazuje fragmentaciju DNA induciranu proteinazom u MDKC stanicama. Ključ za linije: DNA markeri (1, 10); netretirane stanice (2,3); stanice tretirane kroz 18 sati sa 10 μM kamptotecina (pozitivna kontrola) (4,5); stanice tretirane kroz 18 sati sa frakcijom serin proteinaze (114 azocoll jedinica ml-1) (6,7) i stanice tretirane sa frakcijom cistein proteinaze (80 azocoll jedinica ml-1 nakon aktivacije) kroz 18 sati (8,9). Slika b prikazuje DNA fragmentaciju u Calu-3 stanicama. Ključ za linije: DNA markeri (1, 11); netretirane stanice (2); stanice tretirane kroz X sati sa frakcijom serin proteinaze (94 azocoll jedinice ml-1) (3); stanice tretirane sa frakcijom cistein proteinaze (80 azocoll jedinica ml-1 nakon aktivacije) kroz 18 sati (4); netretirane stanice u prisutnosti BB-250 (5 μM) (5); kao linija 3, ali stanice tretirane u prisutnosti 5 μM BB-250 (7); netretirane stanice u prisutnosti 10 μM E-64 (8); kao linija 3, ali stanice tretirane u prisutnosti 10 μM E.64 (9); kao linija 4, ali stanice tretirane u prisutnosti 10 μM E-64 (10). Slike c - f prikazuju fluorescentnu mikroskopiju AV i PI (e,f) bojanja Calu-3 staničnog sloja pod kontroliranim uvjetima (c,e) i nakon obrade kroz 18 sati sa frakcijom serin proteinaze (135 azocoll jedinica ml-1) (d,f). Slike c,d prikazuju model bojanja pod ekscitacijom plavog svjetla i e,f to prikazuju pod ekscitacijom zelenog svjetla. Slike g-j prikazuju primjere MDCK staničnih slojeva isto kao i slike c.f. U oba stanična tipa treba zapaziti virtuelno odsustvo AV i PI bojanja kod netretiranih stanica. Na slikama d,f model bojanja djelomice opisuje područje staničnog odvajanja u sloju i zapazite da neke stanice pokazuju oba AV i PI bojanja. Na slikama h,j većina obojanih stanica su pozitivne za oba AV i PI i nema vidljivog značajnog odvajanja stanica od substrata.

Claims (10)

1. Prevencija i/ili liječenje alergijskih stanja (tip u kojem mogući alergen mora prijeći epitelnu barijeru) naznačeni time što se sprovode pomoću inhibicije aktivnosti cistein proteinaze i aktivnosti serin proteinaze.

2. Pripravak koji je naznačen time što ima inhibicijsku aktivnost cistein i serin proteinaze.

3. Kit koji je naznačen time da sadrži inhibitor aktivnosti cistein proteinaze i inhibitor aktivnosti serin proteinaze.

4. Uporaba inhibitora aktivnosti cistein proteinaze zajedno sa inhibitorom aktivnosti serin proteinaze naznačena time da se koriste za proizvodnju lijeka za prevenciju ili liječenje stanja u kojima alergen prelazi epitelnu barijeru.

5. Uporaba u skladu sa zahtjevom 4 naznačena time da je alergijsko stanje astma.

6. Uporaba u skladu sa zahtjevom 4 naznačena time da je alergijsko stanje izabrano između rinitisa, alergijskog konjunktivitisa, atopijskog dermatitisa ili alergijom izazvanom hranom.

7. Metoda tretiranja osobe radi prevencije ili liječenja stanja u kojem alergen prelazi epitelnu barijeru a koja je naznačena time da obuhvaća primjenu terapeutski učinkovite količine(a) inhibitora aktivnosti cistein proteinaze i inhibitora aktivnosti serin proteinaze.

8. Uporaba inhibitora aktivnosti cistein proteinaze zajedno sa inhibitorom aktivnosti bilo koje druge serin proteinaze osim tripsina naznačena time da se koriste za proizvodnju lijeka za prevenciju ili liječenje stanja u kojem alergen prelazi epitelnu barijeru.

9. Uporaba inhibitora aktivnosti cistein proteinaze zajedno sa inhibitorom aktivnosti alergen serin proteinaze naznačena time da se koriste za proizvodnju lijeka za prevenciju ili liječenje stanja u kojem alergen prelazi epitelnu barijeru.

10. Uporaba inhibitora aktivnosti cistein proteinaze zajedno sa inhibitorom aktivnosti Der p 3, Der p6 i Der p 9 serin proteinaze naznačena time da se koriste za proizvodnju lijeka za prevenciju ili liječenje stanja u kojem alergen prelazi epitelnu barijeru.