HRP20000450A2 - Prevention and/or treatment of allergic conditions - Google Patents
Prevention and/or treatment of allergic conditions Download PDFInfo
- Publication number
- HRP20000450A2 HRP20000450A2 HR20000450A HRP20000450A HRP20000450A2 HR P20000450 A2 HRP20000450 A2 HR P20000450A2 HR 20000450 A HR20000450 A HR 20000450A HR P20000450 A HRP20000450 A HR P20000450A HR P20000450 A2 HRP20000450 A2 HR P20000450A2
- Authority
- HR
- Croatia
- Prior art keywords
- cells
- activity
- proteinase
- inhibitor
- cysteine
- Prior art date
Links
- 238000011282 treatment Methods 0.000 title claims abstract description 48
- 230000002265 prevention Effects 0.000 title claims abstract description 17
- 206010027654 Allergic conditions Diseases 0.000 title claims description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 94
- 108010005843 Cysteine Proteases Proteins 0.000 claims abstract description 63
- 102000005927 Cysteine Proteases Human genes 0.000 claims abstract description 63
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 claims abstract description 63
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 claims abstract description 63
- 239000013566 allergen Substances 0.000 claims abstract description 52
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims abstract description 44
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 claims abstract description 26
- 210000004082 barrier epithelial cell Anatomy 0.000 claims abstract description 18
- 230000004890 epithelial barrier function Effects 0.000 claims abstract description 18
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 6
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 claims abstract description 5
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 claims abstract description 5
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims description 14
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 12
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 11
- 108010061612 Dermatophagoides pteronyssinus antigen p 3 Proteins 0.000 claims description 3
- 206010039083 rhinitis Diseases 0.000 claims description 3
- 206010010744 Conjunctivitis allergic Diseases 0.000 claims description 2
- 206010012438 Dermatitis atopic Diseases 0.000 claims description 2
- 208000004262 Food Hypersensitivity Diseases 0.000 claims description 2
- 208000002205 allergic conjunctivitis Diseases 0.000 claims description 2
- 208000024998 atopic conjunctivitis Diseases 0.000 claims description 2
- 201000008937 atopic dermatitis Diseases 0.000 claims description 2
- 235000020932 food allergy Nutrition 0.000 claims description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims 4
- 206010016946 Food allergy Diseases 0.000 claims 1
- 239000003001 serine protease inhibitor Substances 0.000 abstract description 8
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 5
- 239000002852 cysteine proteinase inhibitor Substances 0.000 abstract description 5
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 abstract description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 4
- 238000009472 formulation Methods 0.000 abstract description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 109
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 43
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 43
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 41
- 241000238711 Pyroglyphidae Species 0.000 description 37
- 229940046533 house dust mites Drugs 0.000 description 37
- 229960004784 allergens Drugs 0.000 description 25
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 25
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 22
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 22
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 19
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 19
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 17
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 17
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 17
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 17
- 108010027805 Azocoll Proteins 0.000 description 15
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 15
- WRDABNWSWOHGMS-UHFFFAOYSA-N AEBSF hydrochloride Chemical compound Cl.NCCC1=CC=C(S(F)(=O)=O)C=C1 WRDABNWSWOHGMS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 108010040476 FITC-annexin A5 Proteins 0.000 description 14
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 14
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 13
- 108010061629 Dermatophagoides pteronyssinus antigen p 1 Proteins 0.000 description 12
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 12
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 10
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 10
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 10
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 10
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 10
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 9
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 9
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 9
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 9
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 9
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 9
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 9
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 8
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 8
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 8
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 8
- 210000001578 tight junction Anatomy 0.000 description 8
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 7
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 7
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 7
- 239000000428 dust Substances 0.000 description 7
- 230000004887 epithelial permeability Effects 0.000 description 7
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 7
- 230000004044 response Effects 0.000 description 7
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 7
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 6
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 6
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 6
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 5
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 5
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 5
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 5
- TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoserine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OC[C@H](N)C(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 0.000 description 4
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108090000672 Annexin A5 Proteins 0.000 description 4
- 102000004121 Annexin A5 Human genes 0.000 description 4
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000029792 Desmoplakin Human genes 0.000 description 4
- 108091000074 Desmoplakin Proteins 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylserin Natural products OC(=O)C(N)COP(O)(=O)OCC(O)CO ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 4
- 101000878605 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin epsilon Fc receptor Proteins 0.000 description 4
- 102100038007 Low affinity immunoglobulin epsilon Fc receptor Human genes 0.000 description 4
- 101710187074 Serine proteinase inhibitor Proteins 0.000 description 4
- 230000002009 allergenic effect Effects 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 4
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 4
- 210000001047 desmosome Anatomy 0.000 description 4
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 4
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 4
- 230000002550 fecal effect Effects 0.000 description 4
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 4
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 4
- 210000004692 intercellular junction Anatomy 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 241000238710 Dermatophagoides Species 0.000 description 3
- 241000238740 Dermatophagoides pteronyssinus Species 0.000 description 3
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000000591 Tight Junction Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010002321 Tight Junction Proteins Proteins 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 230000037446 allergic sensitization Effects 0.000 description 3
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 3
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 3
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 3
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 3
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 3
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 3
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 3
- 239000003656 tris buffered saline Substances 0.000 description 3
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 3
- 241000238876 Acari Species 0.000 description 2
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100028007 Cystatin-SA Human genes 0.000 description 2
- 101710144510 Cysteine proteinase inhibitor Proteins 0.000 description 2
- 108010061636 Dermatophagoides pteronyssinus antigen p 6 Proteins 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 2
- 102000002274 Matrix Metalloproteinases Human genes 0.000 description 2
- 108010000684 Matrix Metalloproteinases Proteins 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N Pyruvic acid Chemical compound CC(=O)C(O)=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 2
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 2
- 108050002568 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 6 Proteins 0.000 description 2
- 102100031988 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 6 Human genes 0.000 description 2
- DPKHZNPWBDQZCN-UHFFFAOYSA-N acridine orange free base Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC2=NC3=CC(N(C)C)=CC=C3C=C21 DPKHZNPWBDQZCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 239000013572 airborne allergen Substances 0.000 description 2
- 201000009961 allergic asthma Diseases 0.000 description 2
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 2
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 2
- 229940019748 antifibrinolytic proteinase inhibitors Drugs 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 2
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 2
- DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N benzoquinolinylidene Natural products C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3N=C21 DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 2
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N dimethyl sulfoxide Natural products CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 2
- 238000001378 electrochemiluminescence detection Methods 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 2
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 2
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 230000009610 hypersensitivity Effects 0.000 description 2
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 2
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- JGVWCANSWKRBCS-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine thiocyanate Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=C(SC#N)C=C1C(O)=O JGVWCANSWKRBCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-JYKPICNFSA-N (2s,3s,4r,5r)-hexane-1,2,3,4,5,6-hexol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[14CH2]O FBPFZTCFMRRESA-JYKPICNFSA-N 0.000 description 1
- PMHUSCHKTSTQEP-UHFFFAOYSA-N (4-carbamimidoylphenyl)methanesulfonyl fluoride Chemical compound NC(=N)C1=CC=C(CS(F)(=O)=O)C=C1 PMHUSCHKTSTQEP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 102100021569 Apoptosis regulator Bcl-2 Human genes 0.000 description 1
- KLWPJMFMVPTNCC-UHFFFAOYSA-N Camptothecin Natural products CCC1(O)C(=O)OCC2=C1C=C3C4Nc5ccccc5C=C4CN3C2=O KLWPJMFMVPTNCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- 208000017667 Chronic Disease Diseases 0.000 description 1
- 238000011537 Coomassie blue staining Methods 0.000 description 1
- 102000010831 Cytoskeletal Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010037414 Cytoskeletal Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000238713 Dermatophagoides farinae Species 0.000 description 1
- 102100021238 Dynamin-2 Human genes 0.000 description 1
- ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L EDTA disodium salt (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].OC(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC(O)=O)CC([O-])=O ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000006145 Eagle's minimal essential medium Substances 0.000 description 1
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 1
- 101000971171 Homo sapiens Apoptosis regulator Bcl-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000817607 Homo sapiens Dynamin-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000611023 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 6 Proteins 0.000 description 1
- 108010073816 IgE Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000009438 IgE Receptors Human genes 0.000 description 1
- 241000239218 Limulus Species 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N Phenolsulfonephthalein Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1(C=2C=CC(O)=CC=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004952 Polyamide Substances 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 239000004830 Super Glue Substances 0.000 description 1
- 239000008049 TAE buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 102100040403 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 6 Human genes 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 230000033289 adaptive immune response Effects 0.000 description 1
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 1
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 1
- 230000001088 anti-asthma Effects 0.000 description 1
- 239000000924 antiasthmatic agent Substances 0.000 description 1
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 1
- 108010065901 antigen 7H6 Proteins 0.000 description 1
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003782 apoptosis assay Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 1
- 230000008436 biogenesis Effects 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000424 bronchial epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- VSJKWCGYPAHWDS-FQEVSTJZSA-N camptothecin Chemical compound C1=CC=C2C=C(CN3C4=CC5=C(C3=O)COC(=O)[C@]5(O)CC)C4=NC2=C1 VSJKWCGYPAHWDS-FQEVSTJZSA-N 0.000 description 1
- 229940127093 camptothecin Drugs 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 101150055276 ced-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 239000012578 cell culture reagent Substances 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000035289 cell-matrix adhesion Effects 0.000 description 1
- 210000003570 cell-matrix junction Anatomy 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 208000029771 childhood onset asthma Diseases 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- VSJKWCGYPAHWDS-UHFFFAOYSA-N dl-camptothecin Natural products C1=CC=C2C=C(CN3C4=CC5=C(C3=O)COC(=O)C5(O)CC)C4=NC2=C1 VSJKWCGYPAHWDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005553 drilling Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 description 1
- 210000005081 epithelial layer Anatomy 0.000 description 1
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 1
- FGBJXOREULPLGL-UHFFFAOYSA-N ethyl cyanoacrylate Chemical compound CCOC(=O)C(=C)C#N FGBJXOREULPLGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003090 exacerbative effect Effects 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 235000013861 fat-free Nutrition 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 235000012907 honey Nutrition 0.000 description 1
- 230000036571 hydration Effects 0.000 description 1
- 238000006703 hydration reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000774 hypoallergenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000010874 in vitro model Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000005732 intercellular adhesion Effects 0.000 description 1
- 230000004068 intracellular signaling Effects 0.000 description 1
- 238000007917 intracranial administration Methods 0.000 description 1
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 1
- 210000001985 kidney epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 1
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000010150 least significant difference test Methods 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 238000011551 log transformation method Methods 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 239000003771 matrix metalloproteinase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229940121386 matrix metalloproteinase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 210000000633 nuclear envelope Anatomy 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- PHPUXYRXPHEJDF-UHFFFAOYSA-N oxyphenisatine acetate Chemical compound C1=CC(OC(=O)C)=CC=C1C1(C=2C=CC(OC(C)=O)=CC=2)C2=CC=CC=C2NC1=O PHPUXYRXPHEJDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 229960003531 phenolsulfonphthalein Drugs 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 229920002647 polyamide Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000005522 programmed cell death Effects 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 230000006916 protein interaction Effects 0.000 description 1
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 229940107700 pyruvic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 239000012047 saturated solution Substances 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 230000007781 signaling event Effects 0.000 description 1
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000013337 sub-cultivation Methods 0.000 description 1
- 125000002730 succinyl group Chemical group C(CCC(=O)*)(=O)* 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 description 1
- 231100000827 tissue damage Toxicity 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 1
- PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N tris acetate Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001810 trypsinlike Effects 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/55—Protease inhibitors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
- A61P11/02—Nasal agents, e.g. decongestants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
- A61P11/06—Antiasthmatics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
- A61P27/14—Decongestants or antiallergics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
- A61P29/02—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID] without antiinflammatory effect
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/08—Antiallergic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Ophthalmology & Optometry (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Otolaryngology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
Description
Ovaj izum se odnosi na prevenciju i/ili liječenje alergijskih stanja i osobito takvih stanja u kojima potencijalni alergen mora prijeći epitelnu barijeru. Ovaj izum ima posebnu, ali ne jedinu, primjenu u prevenciji i/ili liječenju astme.
Astma je najčešća kronična bolest u djetinjstvu i glavni uzrok slabljenja i stanje opasno po život. Karakterizirana je akutnom hiperosjetljivošću, kroničnom bronhijalnom reaktivnošću i oštećenjem i razaranjem plućnog epitela.
Primarni faktor rizika kod astme je osjetljivost pluća na alergene koji se nalaze u zraku kao što su proteini koje izlučuju u fekalnim česticama grinje iz kućne prašine (HDM) koje pripadaju koljenu Dermatophagoides (na pr. D. pteronyssinus. D. Farinae). Kada se udahnu, HDM fekalne čestice djeluju preko epitelne površine dišnih puteva velikog promjera koja je pokrivena tekućinom. Posljedična hidracija HDM fekalnih čestica će pokrenuti brzo i potpuno otpuštanje glavnine alergenskih proteina i tako ostvariti visoku lokalnu koncentraciju HDM proteina u dišnim putevima. Senzibilizacija uključuje otkrivanje alergena putem stanica koje prezentiraju antigen koje su normalno zaštićene od okoline pomoću plućnog epitela. Mehanizam putem kojega alergeni mogu prijeći epitelnu barijeru nije u potpunosti razumljiv.
Danas je sve više dokaza da nekoliko glavnih alergena iz HDM pokazuju katalitičko djelovanje poput enzima i to je potaknulo mišljenja da ova enzimatska djelovanja mogu biti važna u alergijskoj senzibilizaciji i trajnosti uspostavljenih alergijskih upalnih reakcija.
Većina podataka koji se odnose na aktivnost proteinaza u alergenima grinja trenutno se odnose na one u skupinama 1, 3, 6 i 9 iz grinja iz koljena Dermatophagoides. Alergeni iz skupine 1 su cistein proteinaze i oni su predmetom najvećeg istraživanja dok postoji manja količina informacija koja se odnosi na enzimatske učinke alergena iz skupine 3, skupine 6 i skupine 9 koji dijele sekvencijski identitet sa arhetipskim serin proteinazama i koje su same po sebi katalitički kompetentne.
Postoji mišljenje da je aktivnost cistein proteinaze važna u pogoršanju alergijskog odgovora kod astme jer cijepa CD23, IgE receptor niskog afiniteta, na površini stanica koje produciraju protutijela. Cijepanje rezultira pozitivnim povratnim odgovorom koji uzrokuje povećanje IgE sekrecije, i tako pojačava alergijski odgovor. Temeljem ovoga, WO-A-97/04004 (Peptide Therapeutics) predlaže da se inhibitori cistein proteinaze mogu između ostaloga koristiti za profilaksu astme. Međutim, mi ne vjerujemo da mehanizam koji se predlaže u WO-A-97/04004 djeluje in vivo. Razlog za to je da se svi pokusi na cijepanju CD23 izvode na staničnoj kulturi i koncentracije Der p i koje su potrebne za cijepanje su prema našem gledištu nerealno velike. Stanice o kojima je riječ bi, in vivo, bile smjeŠtene u tkivu ili krvi. To je, prema našem gledištu, izuzetno nevjerojatno da koncentracije alergena dosegnu razine potrebne za cijepanje CD23 na ovim mjestima. Nema dokaza da se to događa, niti da se cijepanje CD23 uopće događa in vivo.
Kalsheker N. i sur. (1996) Biochem. Biophys. Res. Comms. (USA) 221/1 strane 59-61 otkrivaju da alfai-antitripsin serin proteinaza štiti donji respiratorni trakt od oštećenja pomoću proteinaza koje se otpuštanju u plućima za vrijeme upale. Pokazalo se da cistein proteinaza Der p 1 cijepa predloženu reaktivnu omču inhibitora alfai-antitripsin serin proteinaze i taj mehanizam se predlaže važnim u patogenezi astme. Također se otkriva daje nedostatak alfai-antitripsina povezan sa incidencijom astme u djetinjstvu. Međutim, nema objašnjenja kako se mogu liječiti ili spriječiti alergijska stanja (kao što je astma) u kojima alergen mora prijeći epitelnu barijeru.
Stewart G. i sur. (1991)Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 95/2-3 strane 248-256 otkrivaju da izmet grinja iz prašine sadrži tri serin proteinaze i cistein proteinazu zajedno sa različitim drugim enzimima. Također otkriva da su cistein proteinaza i najmanje jedna od serin proteinaza alergeni. Međutim nema otkrića kako se alergijska stanja kao što je astma u kojima alergen mora prijeći epitelnu barijeru mogu liječiti ili spriječiti.
Unatoč velikom naporu koji se poduzima na polju istraživanja astme, ostaje potreba za poboljšanim metodama u prevenciji i/ili liječenju astme (i drugih alergijskih stanja u kojima mogući alergen mora prijeći epitelnu barijeru).
U svom prvom, najširem gledištu ovaj izum govori o sprječavanju i/ili liječenju alergijskih stanja ( tip u kojem mogući alergen mora prijeći epitelnu barijeru ) pomoću inhibicije aktivnosti cistein proteinaze i aktivnosti serin proteinaze.
Ovaj izum je posebice primjenjiv (ali ne isključivo) na liječenje astme kod koje je aktivnost cistein proteinaze koju treba inhibirati poželjno Der p 1 s time da aktivnost serin proteinaze koju treba inhibirati može biti bilo koja druga serin proteinaza osim tripsina, poželjno neka alergenska serin proteinaza i još bolje Der p 3, Der p 6 i/ili Der p 9.
Ovaj izum se temelji na našim eksperimentalnim studijama ( kasnije podrobno prikazane) koje su pokazale daje ključni početni korak u alergijskoj preosjetljivosti na alergene grinja iz kućne prašine posredovan aktivnošću obiju cistein i serin proteinaza. Našli smo da je ova aktivnost uzrokom pucanja tijesnih veza između epitelnih stanica povećavajući tako permeabilnost epitela i dozvoljavajući alergenu da prijeđe epitel. Na ovaj način, alergen može pristupiti i medudjelovati sa dendritičkim stanicama koje prezentiraju antigen da bi se proizveo alergijski odgovor. Inhibitori cistein protinaze inhibiraju alergene cistein proteinaze ali ne inhibiraju alergene serin proteinaze i tako ne zaustavljaju u potpunosti pucanje tijesne veze. Slično, inhibitori serin proteinaze zaustavljaju učinke alergena serin proteinaze ali ne inhibiraju alergene cistein proteinaze i tako ne sprječavaju u potpunosti pucanje tijesne veze. Djelomična inhibicija još uvijek dozvoljava pojavu alergijskog odgovora. Inhibicija aktivnosti obiju cistein i serin proteinaza alergena je neophodna za sprječavanje pucanja tijesnih veza u potpunosti i stvaranje alergijskog odgovora.
Iako je ovaj izum posebice primjenjiv za sprječavanje i/ili liječenje astme može se primijeniti na druga alergijska stanja uključujući rinitis, alergijski konjunktivitis, atopijski dermatitits i alergije na hranu.
Liječenje i/ili prevencija alergijskih stanja može se ostvariti putem slijedećih sredstava
(i) formulacije (koja pokazuje drugo gledište izuma) koja ima serin i cistein proteinaza inhibitornu aktivnost; ili
(ii) kit (koji osigurava treće gledište izuma)
obuhvaćajući inhibitor aktivnosti cistein proteinaze i inhibitor aktivnosti serin proteinaze.
U formulaciji iz drugog gledišta ovog izuma, jedan inhibitorni spoj može osigurati potrebnu inhibiciju aktivnosti serin ili cistein proteinaze. Međutim, više uobičajeno, i u skladu sa poželjnim oblikom iz drugog gledišta ovog izuma, inhibicija aktivnosti cistein proteinaze i aktivnosti serin proteinaze će se osigurati odvojenim inhibitornim spojevima.
Kada se koriste odvojeni inhibitorni spojevi kao u kitu iz trećeg gledišta ovog izuma, mogu se koristiti ili istovremeno jedan s drugim ili u slijedu Jedan iza drugog.
Ako je neophodno može se koristiti više od jednog tipa inhibitora aktivnosti cistein proteinaze i/ili više od jednog tipa inhibitora aktivnosti serin proteinaze da se osigura potreban spektar djelovanja.
Ovaj izum je prije svega primjenjiv (ali ne isključivo) na terapijsko liječenje.
Stoga u skladu sa četvrtim gledištem ovog izuma osigurava se upotreba inhibitora aktivnosti cistein proteinaze u spoju sa inhibitorom aktivnosti bilo koje druge serin proteinaze osim tripsina za proizvodnju lijeka za liječenje ili sprječavanje stanja kod kojih alergen prelazi epitelnu barijeru.
U skladu sa petim gledištem ovog izuma osigurava se metoda za sprječavanje ili liječenje stanja u kojima alergen prelazi epitelnu barijeru obuhvaćajući primjenu terapeutski učinkovite količine(a) inhibitora aktivnosti cistein proteinaze i inhibitora aktivnosti serin proteinaze.
Ova terapijska liječenja mogu se ostvariti upotrebom pripravka iz drugog gledišta ovog izuma ili kita iz trećeg gledišta ovog izuma.
Četvrto i peto gledište ovog izuma su posebice primjenjivi za liječenje astme i još više za njezinu profilaksu. Pod pojmom profilaktičkog liječenja mi uključujemo bilo koje liječenje koje se primjenjuje za sprječavanje ili ublažavanje učinka astmatičkog napada. Profilaktičko liječenje se može dati, na primjer, periodički osobi za koju se zna da pati od astmatičkih napada s namjerom sprječavanja ili smanjenja učestalosti takvih napada. Drugačije se profilaktičko liječenje može dati temeljem ad hoc procjene osobi koja pati od astme i koja je izložena okolini (npr. okolina zaražena nekim alergenom) koja može vrlo vjerojatno započeti astmatski napad. Dalja mogućnost je da se primijeni profilaktičko liječenje na osobi koja nije razvila astmu, ali za koju se iz nekog razloga vjeruje da je pod takvim rizikom.
U svrhu terapijske primjene, inhibitorni spoj(evi) se oblikuju u farmaceutski prihvatljiv ekscipijent za isporuku u plućni epitel. Najpoželjnije je da se inhibitorni spoj(evi) primjene putem aerosola kao što je uobičajeno za anti-astmatsko liječenje. Mi međutim ne isključujemo druge puteve primjene.
Količina inhibitornog spoja(eva) koji se primjenjuje bit će, naravno, u terapeutski učinkovitoj dozi. Raspon doze će ovisiti o faktorima kao što je tjelesna težina bolesnika koji se liječi, težina astmatskog stanja koje se liječi i aktivnost inhibitora. Međutim tipične doze će biti u rasponu od 1 do 1000 mikrograma na dan.
lako se ovaj izum do sad opisivao osobito u odnosu na terapijsko liječenje astme, mi nalazimo da se inhibicija aktivnosti cistein i serin proteinaza kod alergena iz grinja iz kućne prašine može koristiti izvan polja terapijskog liječenja. Tako je, na primjer, moguće tretirati nežive substrate koji posjeduju ili mogu posjedovati alergene grinja iz kućne prašine sa inhibitorima aktivnosti cistein ili serin proteinaza, tako da ovi substrati postanu hipoalergenični. Primjeri takvih substrata su oni koji su uopćeno pridruženi relativno visokoj razini alergena (na pr. tepisi, posteljina, tkanine za presvlačenje namještaja itd.).
Primjeri inhibitora aktivnosti cistein proteinaze koji se mogu koristiti u bilo kojem gledištu ovog izuma uključuju L-trans-epoksisukcinil-leucilamid-(4-gvanidino)-butan (E-64) jednako kao i inhibitori cistein proteinaze otkriveni u WO-A-97/04004.
Primjeri inhibitora aktivnosti serin proteinaze koji se mogu koristiti u bilo kojem gledištu ovog izuma uključuju 4-(2-aminoetil)-benzensulfbnii fluorid hidroklorid (AEBSF).
Izum je ilustriran slijedećim ne-ograničavajućim primjerom (i pratećim slikama) koje daju rezultate primjera.
PRIMJER
Koristeći metode koje su kasnije podrobnije opisane, primjer prikazuje učinak na permeabilnost epitela kod
(i) frakcija cistein i serin proteinaza izdvojenih iz grinja kućne prašine, i
(ii) frakcija koje se navode pod (i) u kombinaciji sa inhibitorima aktivnosti cistein i serin proteinaza
METODE
Stanična kultura
Calu-3 i MDCK stanice se koriste kao paradigma za istraživanje međustaničnih veza epitela i njihove osjetljivosti na HDM proteinaze i moguće inhibitore. Obje stanične linije izražavaju tijesne veze, zonulae adherenstes i desmosome i tako su prihvatljivi modeli za mehanizme stanične adhezije u dišnim putevima. Calu-3 je stanična linija adenokarcinoma dobivena od 25-godižnjeg Kavkažanina. Ona je bila predmetom relativno malog broja istraživanja, ali je poznato temeljem elektrofizioloških studija da ispoljava svojstva tijesne barijere (Shen i sur, 1994; Haws i sur. 1994) i temeljem naše vlastite imunocitokemijske karakterizacije (nije prikazano). Stanice se množe u Eagle-ovom minimalnom esencijalnom mediju sa Earlov-im solima (EMEM) obogaćenim sa 10% v/v fetalnim goveđim serumom koji se inaktivira grijanjem (FCS), 2 mM L-glutaminom, ne-esencijalnim amino kiselinama, 10 μM natrijeva piruvata i 50U/ml penicilina i 50μg/ml streptomicina.
Epitelne stanice psećeg bubrega Madin -Darby (MDKC) se kultiviraju u EMEM-u koji sadrži 50U ml -1 penicilina, 50ug ml-1 streptomicina, 2mM L-glutamina, ne-esencijalne amino kiseline i 10 % v/v FCS inaktiviranog grijanjem. Za subkultivaciju obaju staničnih tipova, stanice se isperu u fosfatnom puferu (PBS) bez kalcija i magnezija i zatim djelomice digestiraju upotrebom 0,05% (w/v) tripsina i 0.02 % (w/v) EDTA otopine.
Sve kulture se umnažaju na 37°C u vlažnoj atmosferi sa 5% ugljičnog dioksida u zraku.
OBAVIJANJE TRANSWELL™ UMETAKA SA MATRIGELOM
Mjerenja klirensa manitola se izvode najednom sloju konfluentnih stanica koje su se umnožile na Costar Transwell™ umetku sa promjerom pora od 0.4 μm obavijenim sa ultra-tankim podslojem Matrigela. Obavijanje se izvede dodavanjem 250 μl Matrigela (rezrijeđen 1:500 v/v u EMEM) u unutrašnjost umetka nakon čega slijedi inkubacija na temperaturi okoline kroz 60 min pod aseptičkim uvjetima. Otopina se zatim aspirira i umetak nježno ispere sa medijumom prije dodavanja stanične suspenzije konfluentne gustoće.
PROTOKOLI TRETIRANJA STANICA 1 MJERENJE KLIRENSA
Stanice (2-5 x 105 po cm2 područja rasta) se stave na Matrigelom obavijene umetke. Mi koristimo pojam "umetak" u značenju jedinice filtera koja sadrži stanice i pojam "zdenac" za oznaku šupljina na pločici za kultivaciju. Za praćenje rasta i integriteta, umetci se uzimaju randomizirano, nježno isperu u PBS-u i obojaju pod prigušenim svjetlom sa akridin orange-om i etidium bromidom (1 mg ml-1 svaki u PBS-u). Umetci se pregledaju pod fluorescentnim mikroskopom i koriste samo kada se ostvari konfluencija sa visokom viabilnošću.
Kod konfluencije, medij se aspirira iz zdenaca i zamijeni sa EMEM-om bez seruma i bikarbonata puferiranim sa 20 mM HEPES-a koji sadrži 2 mM L-glutamina. Medij iz umetaka se zatim nježno odstrani i zamijeni sa 300 μl EMEM-a bez seruma koji sadrži [14C] -manitol (1 μCi ml-1 i 1 mg ml -1 neoznačenog manitola u HEPES puferiranom mediju). TranswellTM pločice se zatim ekvilibriraju kroz 30 min na 37°C na Luckham-ovoj R100 kružnoj miješalici (šejker). Uzmu se tri uzorka od po 100 μl nekorištene označene otopine manitola i odredi njihov radioaktivni sadržaj pomoću tekuće scintilacijske spektrometrije (Beckman LS6000IC) nakon čega se doda 5 ml Opti-fluora.
Nakon ekvilibracijskog razdoblja, umetci se stave u nove zdence koji sadrže 1 ml HEPES- a bez seruma puferiranog sa EMEM-om i inkubiraju na 37°C sa kontinuiranim nježnim miješanjem (šejker). Medij iz izvornih zdenaca se zadrži i odredi njegova radioaktivnost nakon dodavanja 10 ml Opti-fluora. Rezultati se koriste za određivanje koncentracije u tragovima u nultom vremenu. U vremenskim intervalima, odstrani se 20 μl bazolateralne tekućine i odredi količina 14C manitola kao što je gore opisano za izračunavanje volumena klirensa.
IZRAČUNAVANJE EPITELNE PERMEABILNOSTI
Paracelularna permeabilnost manitola se odredi u skladu sa postupkom opisnim u našoj U.K. Patent Application No. 9715058 i izračuna iz mjerenja volumena klirensa u određenoj točki vremena. Procjene klirensa se naprave kroz 3-5 sati i izračunaju u skladu sa odnosom:
[image]
gdje:
Vprobe je volumen klirensa u svakoj točki vremena
VA je abluminalni volumen u svakoj točki vremena
A[A]i je povećanje koncentracije u tragovima između točki vremena
[L]i je luminalna koncentracija u tragovima u svakoj točki vremena
Pod uvjetima gdje je difuzija jedino sredstvo transepitelnog kretanja otopine, dVprobe/dt tijesno aproksimira permeabilnom području površine proizvoda dozvoljavajući tako procjenu permeabilnosti manitola u složenom sustavu stanica, filtera, nepromiješanih slojeva i obavijanja proteina (Pt). Epitelna permeabilnost se može izračunati iz izmjerene varijable uzevši u obzir Matrigelom obavijeni filter i nepromiješane slojeve kao sustav serijskih permeabilnosti. Tako:
[image]
i
[image]
gdje
Pt je složena permeabilnost sustava
P1 je komponenta od samih epitelnih stanica
P2 komponenta od strane filtera bez Matrigela
P3 je komponenta nepromiješanog sloja
P4 je permeabilnost filtera obavijenog Matrigelom
U čistim difuzijskim sustavima
[image]
gdje
D je slobodni difuzijski koeficijent manitola
δ je ukupna debljina nepromiješanih slojeva
Debljine nepromiješanih slojeva su neovisne o membranskoj permeabilnosti pod idealnim uvjetima, tako su P3 u jednadžbi (3) i (4) jednaki. Jednadžbe (2) i (3) tako dozvoljavaju izračunavanje permeabilnoasti epitelnog monosloja (5).
[image]
Analiza varijance se izvede nakon log transformacije podataka permeabilnosti i vrijednosti vjerojatnosti za označene različite tretmane upotrebom testa najmanje signifikantne diferencije. Podatci se prikažu kao geometrijske srednje vrijednosti sa prikazanom standardnom pogreškom za n eksperimentalne opservacije. Razine vjerojatnosti od p<0.05 se smatraju statistički značajnim.
SPRAVLJANJE FRAKCIJA PROTEINAZE IZ MEDIJA HDM KULTURE
Alergeni HDM proteinaze se još ne proizvode u katalitički kompetentnom obliku pomoću rekombinantne stanične ekspresije zrelog enzimskog proteina. Da bismo omogućili budući skrining u širokom rasponu mogućih inhibitora u odsutnosti katalitički aktivnih rekombiniranih proteina, mi smo izdvojili aktivnost cistein i serin proteinaze pomoću jednostavne biokemijske frakcinacije medija u kojemu su rasle HDM. Za vrijeme kultivacije HDM otpuštaju alergene u medij što rezultira nakupljanjem proteina prikladnih za pročišćavanje. Medij iz kulture D. pteronyssinus (Commonwealth Serum Laboratory, Parkville, Australia) se otopi u 5 volumena fosfatnog pufera i zatim centrifugira na 48,400 x g i 40C kroz 20 min. Supernatantu koji se miješa na 40C postepeno se doda amonijev sulfat da se dobije 50% zasićena otopina. Nakon centrifugiranja (48,400 x g, 20 min, 4°C) čestica, za koju se našlo enzimatskim testom da je obogaćena aktivnošću cistein proteinaze, se ponovo otopi u minimalnom volumenu destilirane vode. Supernatantu se doda amonijev sulfat da se dobije 80% zasićenje. Čestica koja se dobije daljim centrifugiranjem, za koju se nađe da je obogaćena aktivnošću serin proteinaze. se resuspendira u minimalnom volumenu destilirane vode. Frakcije cistein (50% precipitat) i serin proteinaze (50-80% precipitat) se odvojeno dijaliziraju iz destilirane vode preko noći i zatim liofiliziraju prije rekonstitucije u EMEM-u. Proteinski sadržaj ekstrakata se izmjeri upotrebom Coomassie Blue tehnike sa serumskim albuminom kao standardom (Smith i sur., 1985). Aktivnost proteinaze se izmjeri upotrebom Azocoll degradacijskog testa kao što je ranije opisano (Herbert i sur., 1995; Chavira i sur., 1984). Ekstrakti se također testiraju na prisustvo endotoksina upotrebom testa Limulus amebocitne lize (Endotec ???? , ICN Biomedicals, Thame, Oxfordshire). U svim slučajevima razine endotoksina su bile ispod granice detekcije testa (<0.06 ng ml-1 ).
IMUNOBLOTING FRAKCIJA HDM PROTEINAZE
Frakcije proteinaze se odvoje pomoću SDS-PAGE i elektroforetski prenesu na nitroceluloznu membranu. Nespecifično proteinsko vezanje se blokira sa 5% w/v nemasnog mlijeka i 0,1% v/v Tween-20 u Tris-puferiranoj otopini (TBS) nakon čega slijedi inkubacija sa mAb 5H8 (anti-Der p 1) razrijeđen u TBS koji sadrži 2% w/v goveđeg serumskog albumina i 0.1% v/v Tween-20. Detekcija se izvede putem pospješene kemiluminiscencijske tehnike (Amersham International, Buckinghamshire).
TESTOVI ZA STANIČNU SMRT
Stanice se stave u petrijevke 60 x 15 mm i ostave rasti kroz 2-4 dana EMEM-u koji sadrži serum pod uvjetima za kultivaciju u atmosferi od 5% CO2. Stanice se zatim izlože tretmanima u EMEM-u bez seruma koji sadrži 20 mM HEPES-a pod aerobnom inkubacijom na 37°C. U određenim vremenskim točkama, stanice se žanju zajedno sa odvojenim stanicama u supernatantu. Stanice se cenirifugiraju na 550 x g kroz 5 min i ekstrahira njihova DNA (Nucleon II, Scotlab, Coatbridge, Stratchclyde). Ekstrahirana DNA se resuspendira u 100 (j.i TE pufera (10 mM Tris-HCL i 1 mM Na2EDTA) preko noći na sobnoj temperaturi, i njihova čistoća se odredi spektrofotometrijski. Jednake količine DNA se stave u 4:1 omjer sa uzorkom pufera (0,25% bromfenol plavilo i 40% w/v sukroza u vodi) u svaki red od 2% (w/v) agaroza gela i izvede elektroforeza na 50V kroz 2-3 sata u TAE puferu (0.04M Tris-acetat i 0,001M EDTA). Trake DNA u gelovima (koji imaju ugrađen etidium bromid) se vizualiziraju ultravioletnim svjetlom.
Preraspodjela fosfatidilserina u vanjski sloj staničnih membrana koja se događa za vrijeme inicijacije apoptoze se promatra uporabom aneksin V bojanja. Ovo se izvodi u petrijevkama 60 x 15 koje su modificirane tako da se izbuši rupa od 1 cm u promjeru na bazi svake petrijevke i vanjska strana pokrije sa pokrovnicom osiguranom putem Sylgard-a (Dow Corning, Midland, MI, USA). Poliamidni prsten se napravi pomoću cijanoakrilatnog adheziva na unutarnjoj strani petrijevke da se stvori zdenac staklenog dna koji se zatim obavije sa ultratankim slojem Matrigela. Stanice (3 x 104) se stave u svaki zdenac ostave rasti kroz 2-3 dana, nakon čega se izlože željenom eksperimentalnom tretmanu. Nakon ovoga, stanice se isperu u PBS-u i zatim u 200 ml vezajućeg pufera prije dodavanja aneksin V-FITC (AV) i propidij jodida (PI) pod prigušenim svjetlom. Nakon inkubacije od 15 min stanice se isperu sa vezajućim puferom i pregledaju fluorescentnim mikroskopom uz uporabu plavog i zelenog ekscitacijskog seta (Zeiss Axiovert 10 sa uljnom imerzijom Fluar objektivima). Uporabom ove tehnike, stanice u ranoj apoptozi se oboje zeleno jer se FITC-konjugirani aneksin V veže za fosfatidilserin koji je postao orijentiran na vanjski sloj stanične membrane (Fadok i sur., 1992; Koopman i sur, 1994; Vermes i sur, 1995; Homburg i sur, 1995). Mrtve stanice se također obojaju crveno sa PI jer mu povećana permeabilnost nuklearne membrane dozvoljava vezanje za nukleinske kiseline. Fotografska dokumentacija se napravi upotrebom Contax 167 MT kamere i Kodak TMAX 400 filma za crno bijele slike ili Ektachrome 160T za slike u boji.
LDH aktivnost se izmjeri uporabom piruvične kiseline kao substrata i spektrofotometrijskim praćenjem stvaranja fenilhidrazonskog derivata iz mliječne kiseline. MDCK ili Calu-3 stanice se zasiju na pločicu sa 12 zdenaca i ostave rasti do konfluencije. Monoslojevi stanica se izlože kroz 18 sati ili kontrolnim tretmanima (EMEM bez seruma i fenola, sa 0.6 mM ditiotreitola u sluČaju za kontrolu frakcije cistein proteinaze) ili frakcije HDM proteinaze razrijedene u istom mediju (sa 0.6 mM ditiotreitola prisutnog u frakciji cistein proteinaze). Na kraju pokusa, inkubacijski medij se žanje i centrifugira na sobnoj temperaturi da se sedimentiraju sve stanice koje su se odvojile od podloge za vrijeme tretmana. Prva frakcija supernatanta se testira izravno na LDH aktivnost, s time da se čestice koje se stvaraju od bilo kojih odvojenih stanica podvrgnu hipotoničkoj lizi sa destiliranom vodom (5 min na sobnoj temperaturi) prije kratkog centrifugiranja da se odstrani stanični debris. Drugi supernatant se zatim testira na LDH aktivnost. Stanice koje ostanu pričvršćene za zdence za vrijeme tretmana se liziraju kao što je opisano gore i izmjeri se LDH aktivnost. Budući da nije bilo značajnog odvajanja stanica za vrijeme tretmana sa kontrolnim medijem, ukupna stanična LDH aktivnost se definira kao ona koja je prisutna u lizatu od pričvršćenih stanica koje su teretirane sa samim EMEM-om bez seruma i fenol crvenila.
IMUNOCITOKEMIJSKA VEZUALIZACIJA UČINAKA INHIBITORA NA CIJEPANJE MEĐUSTANIČNIH VEZA POSREDOVANO PROTEINAZOM
Da se istraže učinci proteinaza i inhibitora na međustanične veze, MDCK stanice se kultiviraju na pokrovnice i obrade sa odgovarajućom proteinazom i/ili inhibitorom u željenom vremenskom razdoblju. Stanice se fiksiraju u ledeno-hladnom metanolu prije vezanja štakosrkog anti-ZO-1 (mAb R40.76) (Stevenson i sur., 1986; Anderson i sur., 1988) i mišjeg anti-desmoplakina(mAb 11-5F) (Parrish i sur., 1987). Neizravno bojanje fluorescentnim protutijelima se izvede uporabom FITC- i TRITC-konjugiranih drugih protutijela. Mikroskopira se na Zeiss Axiovert mikroskopu sa Fluar objektivom za uljnu imerziju i x40 povećanjem. Uzorci se osvijetle uporabom ekscitacijskih i emisijskih filtera za FITC i TRITC. Stanice se slikaju kao što je gore opisano.
MATERIJALI
Svi mediji i reagensi stanične kulture se dobiju od ICN Biomedicals Ltd (Thame, Oxfbrdshire), osim onih gdje je drugačije naznačeno. HBSS se dobije od Gibco BRL, Life Technologies Ltd (Paisley). Manitol i Triton X-100 se dobiju od Sigma-Aldrich Ltd (Poole, Dorset) i fetalni goveđi serum koji je inaktiviran grijanjem od Labtech International Ltd (Uckfield, East Sussex). Matrigel se dobije od Universal Biologicals, London. Klirens manitola se mjeri u Transwell-u čiji je promjer 12 mm sa veličinom pore na membrani od 0.4 μm i debljinom membrane od 10 μm (Costar UK Ltd, High Wycombe, Buckinghamshire). D-[14C] manitol se dobije od NEN Du Pont Research Products (Stevenage, Hertfordshire), i Opti -Fluor scintilant i scintilacijske posude od Canberra Packard Ltd (Pangbourne, Berkshire). MDCK stanice se uzgoje od zalihe iz našeg laboratorija. Calu-3 se izvorno dobiju od American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA) i umnože serijskim pasažama da se dobije lokalna banka krioprezerviranih stanica. Stanice se kultiviraju u posudi za staničnu kulturu od 75 cm2 (Marathon Laboratory Supplies, London), Costar-ovim pločicama za kultivaciju ili Transwell umetcima u skladu sa prirodom pokusa. Agaroza (molekularnog stupnja) se dobije od Promega (Southampton, Hampshire). Kitovi za mjerenje LDH se dobiju od Sigma-e; Apoalert kitovi od Cambridge Bioscience-a. Akridin oranž, etidium bromid i sve druge opće laboratorijske reagencije se dobiju od BDH (Poole, Dorset). Spoj E-64 (L-trans-epoksisukcinil-leucilamid-(4-gvanidino)-butan, inhibitor cistein proteinaze, se dobije od Sigma-e. Koncentrirane vodene otopine se smrznute pohrane do upotrebe. Inhibitor serin proteinaze 4-(2-aminoetil)-benzensulfbnil fluorid hidroklorid (AEBFS) se dobije od Pentapharm-a, Basel, Switzerland. Inhibitor matriks metaloproteinaze (MMP) BB-250 ([4-(N-hidroksiamino)-2R-izobutil-3S-(tiofen-2-il-sulfonilmetil)sukcinil]-L-fenilalalnin-N-metilamid) se dobije od British Biotech Pharmaceuticals Ltd. Svi inhibitori se naprave kao koncentrirane otopine u suhom Me2SO i razrijede po potrebi sa medijem koJi se upotrebljava u pokusu. Odgovarajuće kontrole za Me2SO vehikulum su uključene u pokus po potrebi. Monoklonska protutijela R40.76 na ZO-I smo dobili ljubaznošću dr Bruce Stevenson-a, University ofAlberta. Monoklonska Der p 1 protutijela 5H8 su ljubazan poklon od dr Martin Chapman-a, University ofVirginia , USA.
REZULTATI
FRAKCIONIRANJE MEDIJA U KOJEMU SU KULTIVIRANE GRINJE
Medij se razdijeli u dvije frakcije precipitacijom sa amonij sulfatom. Frakcija koja se dobije precipitaciojm sa 50% amonijeva sulfata se sastoji od glavnih proteinskih traka na ~ 22 kDa i 38 kDa (slika 1a, linija 2). Testovi enzimske razgradnje koji koriste kromogene substrate pokazuju daje katalitičku aktivnost 50% precipitata moguće inhibirati sa E-64 (nije prikazano). Imunoblot analize 50% precipitata uporabom mAb 5H8 za Der p1 otkrivaju nazočnost velike trake sa masom od ~ 22 kDa i manje trake od 38 kDa (slika 1b, linija 2). U SDS-PAGE i imunoblot analizama frakcija cistein proteinaze se ponašala identično kao i kao Der p 1 pročišćena putem kombinacije imunoafinitetne kromatografije, gel filtracije i izoelektnčkog fokusiranja (usporedi liniju 1 i 2 prikaz a, b na slici 1). Usporedba linija 2 i 3 na imunoblotu prikazanom na slici 1b pokazuje da 5H8 mAb također reagira sa dodatnim rasponom proteina koji su nazočni u 50-80% amonij sulfatnog precipitata. U odsutnosti reducirajuće tvari 50-80% amonij sulfat precipitatne frakcije pokazuje visoku katalitičku aktivnost koja se smanjila putem inhibitora arhetipske serin proteinaze (nije prikazano). Zbog jednostavnosti, u ovom tekstu 50% precipitat se navodi kao frakcija cistein proteinaze i 50-80% precipitat kao frakcija serin proteinaze.
UČINCI HDM FRAKCIJA PROTEINAZE NA EPITELNU PERMEABILNOST
U ovim pokusima koriste se pod kontroliranim uvjetima obje MDKC i Calu-3 epitelne stanične linije u gustom jednom sloju sa permeabilitetima za manitol u rasponu od 0.7-1.2 x 10 -6 cm s-1. Izlaganjem staničnog monosloja ili MDKC ili Calu-3 stanica frakciji serin proteinaze dobije se promjena u permeabilnosti ovisna o koncentraciji (slika 2). Koncentracijska ovisnost frakcije cistein proteinaze nije testirana u ovoj seriji pokusa, ali učinke čistog alergena cistein proteinaze Der p 1 smo ranije prikazali na sličnom in vitro modelu (Herbert i sur., 1990; 1995).
Učinci frakcije cistein proteinaze na MDKC staničnom monosloju su oslabljeni pomoću inhibitora cistein proteinaze E-64 (slika 3a). E-64 nije imao vidljivog učinka na intrinzička svojstva permeabilnosti staničnog monosloja (slika 3a). Inhibitori serin proteinaze AEBSF i, manje učinkovito, SBTI inhibiraju djelovanje frakcije serin proteinaze u MDKC stanicama (slika 3b). Inhibitor per se nije pokazao bilo koji vidljivi učinak na epitelnu permeabilnost (slika 3b). Inhibitori su također bili učinkoviti u istoj koncentraciji u Calu-3 staničnom monosloju. Calu-3 stanični monosloj tretiran sa frakcijom cistein proteinaze imao je permeabilnost manitola od (8.44 ± 0.43 ) x 10-6 cm s-1 koji je smanjen do (4.84 ± 0.32 ) x 10-6 cm s-1 pomoću E-64 (P<0.05, n=5). Calu-3 stanični monoslojevi koji su tretirani sa frakcijom serin proteinaze imali su permeabilnost manitola od (1.81 ± 0.02 ) x 10-6 cm s-1 koja se smanjila do (10.20 ± 0.01 ) x 10-6 cm s-1 pomoću AEBSF (P<0.05, n=5).
Inhibitori proteinaze specifičnog razreda su bili učinkoviti samo protiv poznatih enzimskih frakcija deriviranih iz HDM kultura. Slika 4 prikazuje da AEBSF, u koncentraciji koja je smanjila učinke frakcije serin proteinaze, nije uspio inhibirati aktivnost frakcije cistein proteinaze na Calu-3 stanicama. Obratno, E-64 nije inhibirao promjenu permeabilnosti uzrokovanu frakcijom serin proteinaze (slika 4).
Slika 5 prikazuje da tretiranje MDCK staničnog monosloja sa frakcijom cistein ili serin proteinaze dovodi do razaranja normalno graničnog perifernog modela bojanja TJ proteina ZO-1 i točkastog bojanja desmoplakina. Dodavanjem E-64 frakciji cistein proteinaze ili AEBSF frakciji serin proteinaze inhibira se promjene ovisne o proteinazi (slika 5).
HDM PROTEINAZE INDUCIRAJU STANIČNU SMRT U EPITELU
Kontrolna inkubacija MDKC ili Calu-3 stanica kroz 18 sati u EMEM-u bez seruma stvara neznatno otpuštanje LDH sve dok se ne podvrgnu hipotoničkoj lizi na kraju pokusa (slika 6). Obrada stanica obaju staničnih tipova sa frakcijama cistein ili serin proteinaze također nije uspjela dovesti do otpuštanja značajnih količina LDH u inkubacijski medij (slika 6), unatoč činjenici da su se neke stanice odvojile od substratnog matriksa za vrijeme pokusa. Liza odvojenih stanica i adheriranih stanica rezultirala je nalazom LDH u jednakoj količini koja se našla kod netretiranog staničnog lizata (slika 6).
Stanična smrt se također istražila pregledom DNA fragmentacije i ispitivanjem staničnog bojanja sa Avi PI. Slika 7 a, b prikazuje vidljivu DNA fragmentaciju kod MDCK i Calu-3 stanica nakon tretmana sa HDM proteinazama pod uvjetima koji rezultiraju povećanjem permeabilnosti epitela. Učinci obiju frakcija HDM proteinaza su bili smanjeni pomoću inhibitora matriks metaloproteinaza BB-250 (slika 7b). E-64 je inhibirao učinke frakcije cistein proteinaze, ali ne i frakcije serin proteinaze (slika 7b). Slika 7 također prikazuje da obrada MDKC ili Calu-3 stanica sa frakcijom serin proteinaze rezultira kod nekih stanica vezanjem samo aneksina V (AV+PI+), što ukazuje na ranu apoptozu u ovih stanica, a kod drugih koje su se obojale sa aneksinom V i PI (AV+PI+) što ukazuje na staničnu smrt (vidi sliku 7d,f,h,j). Prostorna raspodjela AV+PI- stanica sa ranom apoptozom i AV+PI+ mrtvih stanica je takva da se stanice nakupljaju oko područja gdje je došlo do jasnog propadanja stanične adhezije (npr. vidi sliku 7d,f).
DISKUSIJA
HDM čestice fekalnih proteina su glavni uzrok alergijske astme (Tovey i sur., 1981) i velikim dijelom čine pozadinu povećane prevalencije bolesti (Dowse i sur., 1985). U ovoj studiji mi smo pokazali da proteinaze iz fekalnih čestica Z). pteronyssinus iskazuju moćne biološke učinke na epitelnim stanicama. HDM proteinaze su bile frakcionirane putem amonij sulfat precipitacije u cistein i serin razrede. Oba precipitata su imala slične učinke u pokusnim sustavima koje smo istraživali. Oni su proizveli povećanje u permeabilnosti epitela, uzrokovali cijepanje lateralne stanične adhezije, i odvajanje stnaica od biomatriks substrata. Cijepanje i odvajanje stanica nije bilo povezano sa velikim otpuštanjem LDH, ali smo našli vidljivu ranu apoptozu i staničnu smrt sa pucanjem jezgre. Pregledom stanica obojanih sa AV i PI otkrilo se daje bojanje bilo lokalizirano na područjima staničnog razaranja/odvajanja. Nadalje smo pokazali da se stanična smrt može oslabiti pomoću inhibitora proteinaze.
Precipitacija amonij sulfatom se pokazala učinkovitim sredstvom za odvajanje glavnih razreda aktivnosti proteinaze u mediju za kultivaciju HDM. Frakcija koja precipitira pomoću 50% amonij sulfata je imala aktivnost cistein proteinaze i njezin učinak povećane permeabilnosti na epitelnim stanicama je bio inhibiran pomoću E-64 ali nije sa inhibitorom serin proteinaze AEBSF. SDS-PAGE i imunoblot analiza sa mAb 5H8 je na HDM alergen Der p 1 (cistein proteinaza) otkrila nazočnost traka sa molekulskim masama od 22kDa i -38kDa u ovoj frakciji. Suprotno, frakcija precipitirana sa 50-80% zasićenog amonij sulfata je imala aktivnost serin proteinaze i njezini učinci na eptelnim stanicama su bili inhibirani sa AEBSF, i u manjem stupnju SBTI, ali uopće ne sa E-64. Mi zaključujemo iz studija sa inhibitorima daje bio minimalni funkcionalni prijenos alergena cistein proteinaze u ovu frakciju. SDS-PAGE i imunoblot analiza su otkrile nazočnost nekoliko proteinskih traka u frakciji serin proteinaze, od kojih su neke prepoznate pomoću mAb 5H8 (npr. približne mase 22, 26, 28, 29 i 38 kDa). mAb 5H8 se na široko primjenjuje za pročišćavanje i kvantificiranje Der p 1, ali njihova specifičnost je nedavno dovedena u pitanje (Cambra & Berrens, 1996). Tako, slučajan nalaz iz naše studije je razlogom za dalju zabrinutost u vezi specifičnosti ovih protutijela. Proteinske trake otkrivene u 50-80% amonij sulfat precipitatu su u skladu sa nazočnosti alergena serin proteinaze Der p 3, Der p 6 i Der p 9. Temeljem ovih zapažanja mi smatramo daje amonij sulfat frakcionacija ekstrakata HDM kulture jednostavno i učinkovito sredstvo za istraživanje bioloških učinaka alergena HDM proteinaze i također za identifikaciju novih inhibitora njihovih učinaka.
Ranije smo pokazali da visoko pročišćeni alergen Der p 1 inducira povećanje transepitelnog iscjedka serumskog albumina u mukozu dišnih puteva, uzrokuje pucanje epitelne arhitekture i odvajanje MDKC stanica od prirodnog biopolimernog substrata (Herbert i sur., 1990; 1995). Također smo pokazali da su ovi učinci Der p 1 bili rezultatom njegove aktivnosti cistein proteinaze jer su bili osjetljivi na inhibiciju pomoću E-64, relativno specifičnog inhibitora većine cistein proteinaza (Barrett i sur., 1982; Shaw, 1994; Herberti sur., 1995). lako usporedbe slijeda amino kiselina predviđaju da je Der p 1 moguća cistein proteinaza (Chua i sur., 1988; Stewart, 1994; Topham i sur., 1994; Robinson i sur., 1997), drugi predlažu da bi ona mogla djelovati kao bifunkcionalna cistein-serin proteinaza jer je njezina aktivnost također bila inhibirana pomoću APMSF, jednog inhibitora serin proteinaza (Wewitt i sur., 1995,1997). Ako je tako, ova predložena bifunkcionalnost bi imala potencijalno važan utjecaj na građu specifičnih inhibitora Der pl. Međutim, u ovoj studiji mi imamo primjedbu na funkcionalni značaj navedene bifunkcionalnosti tako što smo pokazali da (i) frakcija cistein proteinaze derivirana iz HDM kultura nije mogla biti inhibirana pomoću koncentracija AEBSF koje su značajno inhibirale aktivnost frakcije serin proteinaze, i (ii) daje frakcija serin proteinaze bila otporna na inhibiciju sa E-64 u koncentracijama u kojima ovaj inhibitor blokira aktivnost cistein proteinaze. Drugi dokazi protiv tvrdnje da je Der p 1 miješana cistein-serin proteinaza su nedavno objavljeni (Chambers i sur., 1997).
Propusna selektivnost bronhijalnog epitela prema hidrofilnim otopinama je određena putem TJ-a koji su izraženi kružno na vrhu pola svake stanice (Schneeberger & Lynch, 1992). Prigušena ekspresija TJ proteina jedne stanice u blizini susjednih stanica sa TJ proteinima smatra se razlogom sposobnosti epitela da razvije njegovo svojstvo čvrstine (Anderson & Van Itallie, 1995; Robinson, 1995). Razaranje međudjelovanja TJ proteina između stanica, na primjer stvaranjem diskontinuiteta na njihovim perijunkcionalnim mjestima, je pridruženo propadanju epitelnih barijera (Horwath i sur., 1994; Zhong i sur., 1994; Stuart i sur., 1994; Stuart & Nigam. 1995). Obje frakcije HDM proteinaza koje su se koristile u ovoj studiji uzrokovale su pucanje TJ-a što se vidi gubitkom perijunkcionalnog bojanja ZO-L Također su primijećena pucanja desmosoma. Razaranje TJ-a rezultira povećanom permeabilnošću epitelnog sloja, i eventualno fizičkim odvajanjem stanica od substrata. Gubitak ZO-1 iz TJ i desmoplakina iz desmosoma je ovisio o eksogenoj aktivnosti proteinaze jer je proces bio oslabljen pomoću E-64 (u slučaju frakcije cistein proteinaze) i AEBSF (u slučaju frakcije serin proteinaze). lako su ZO-1 i desmoplakin intracelularni proteini, i stoga nije vjerojatno da će se razgraditi pomoću eksogenih proteinaza, njihovo razaranje je izraženo kao posljedica pucanja drugih, na membrani izloženih, komponenti TJ i desmosoma. Smatra se da sličan mehanizam sudjeluje u promjenama drugih intracelularnih proteina nakon cijepanja međustaničnih veza (Volk i sur., 1990).
Učinci proteinaza nisu imali za posljedicu zančajno otpuštanje LDH od strane stanica. Međutim, obrada sa bilo kojom od frakcija proteinaza u nekih stanica je rezultirala znacima rane apoptoze (AV+PI-) ili staničnom smrću (AV+PI+). Stanice mogu postati apoptotične putem mnogih mehanizama (pregled u Hale i sur., 1996) uključujući promjene u homotipskoji i heterotipskoj staničnoj adheziji i prijanjanju staničnog matriksa (Boudreau u sur., 1995, 1996; Mehida i sur., 1996; Firsch & Francis, 1994). Rani signalni događaj u programiranoj staničnoj smrti je pucanje fosfolipid-vezujućih citoskeletnih proteina koji vode do transmembranske preraspodjele fosfatidilserina (Martin i sur., 1995a,b). Sustav citoskeletnih proteina je normalno stabiliziran i nadziran putem izravnog međudjelovanja sa proteinskim komponentama iz međustaničnih veza (Furse i sur., 1994; Anderson & Van Itallie, 1995) iz čega slijedi da proteoliza međustaničnih adhezija, osobito TJ, može biti kritični događaj u orkestriranju staničnog odgovora na alergene proteinaza. Sposobnost E-64 da inhibira djelovanje cistein ali ne i serin frakcije proteinaze pokazuje da je E-64 radije djelovao na proksimalnom koraku u procesu koji vodi do promjena permeabilnosti i apoptoze, nego putem inhibicije distalnog proteolitičkog koraka u mehanizmu transdukcije. Nadalje, proteinaze intracelularne signalizacije iz ICE/ced-3 obitelji koje se između ostalog aktiviraju putem Fas/APO-1 ligacije u apoptozi (Los i sur., 1995; Mariani i sur., 1995; Kayagaki i sur., 1995; Tanaka i sur., 1996) imaju neuobičajen inhibitorni profil jer su neosjetljive na E-64. Suprotno, inhibitorno djelovanje BB-250 se može pojaviti tako da se spriječi otpuštanje Fas liganda (Mariani i sur., 1995; Kayagaki i sur., 1995).
Senzibilizacija pluća na alergene iz zraka kao što su HDM je središnji događaj u patogenezi alergijske astme. Plućni epitel stvara barijeru koju strani proteini moraju prijeći prije nego uspiju izazvati alergijsku senzibilizaciju, ali mehanizam pomoću kojega alergeni prelaze epitelnu barijeruje slabo razumljiv (Robinson i sur., 1997). Enzimatska priroda proteina deriviranih iz fekalnih čestica HDM predstavlja jedno objašnjenje mehanizma pomoću kojega alergeni djeluju na imuni sustav. Uzrokujući žarišna pucanja čvrstih veza, i konačno gubitak umiruće stanice, HDM proteinaze mogu povećati paracelularnu propusnost alergena do stanica koje prezentiraju antigen. Vrijedno je zapaziti da lokalizirana trauma i stanična smrt koje su posljedice proteolitičkog cijepanja međustaničnih veza može također ispuniti neke uvjete "modela opasnosti" za adaptivni imunološki odgovor i tako objasniti zašto su pokrenuti odgovori usmjereni protutijelima (Metzinger, 1994; Rodge i sur., 1996). Dalju potporu ovom gledištu daju i noviji dokazi da kada se apoptoza (često smatrana imunološki "tihim" oblikom stanične smrti) javlja u nazočnosti tkivnog oštećenja, rezultirajući kombinirani stimulans je zapravo prijetnja stanicama koje prezentiraju antigen ( Boockvar i sur., 1994; Casciola-Rosen i sur., 1994; Ibrahim i sur., 1996).
U sažetku, ovi rezultati pokazuju da HDM proteinaze djeluju na ephelne stanice koje vjerojatno promoviraju alergijsku senzibilizaciju. Sposobnost specifičnih inhibitora da interferiraju sa odgovorom epitelnih stanica na alergene proteinaza predstavlja razlog za prevenciju i/ili liječenje alergijskih stanja.
Reference
ANDERSON, J.M., STEVENSON, B.R., JESAITIS, L.A., GOODENOUGH, D.A. & MOOSEKER, M.S. (1988). Karakterizacija ZO-1, proteinske komponenete čvrste veze stanica mišje jetre i stanica psećeg bubrega Madin-Darby. J Cell Biol., 106, 1141-1149.
ANDERSON, J.M. & VAN ITALLIE, C.M. (1995). Čvrste veze i molekularna osnova za regulaciju paracelularne permeabilnosti. Am. J. Physiol , 269, G467-475.
BARRET, A.J.. KEMBKAVI, A.A., BROWN, M.A., KIRSCHKE, H., KNIGHT.C.G., TAMAI, M. & HANADA. K. (1982). L-trans-epoksisukcinil-leucilamido(4-gvanidino)butan (E-64) i njegovi analozi kao inhibitori cistein proteinaza uključujući katepsine B,H iL. Biochem.J., 201. 189-198.
BOOCKVAR, K.S., GRANGER, D.L., POSTON,R.M., MAYBODI, M.,WASHINGTON M.K., HIBBS, J.B.Jr & KURLANDER, R.L. (1994). Nitritni oskid koji se proizvodi za vrijeme murine listerioze je zaštitni. Infect. Immun., 62,1089-1100.
BOUDREAU, N., WERB, Z. & BISSELL. M.J. (1996). Supresija apoptoze pomoću bazalne membrane zahtijeva trodimenzionalnu organizaciju tkiva i povlačenje iz staničnog ciklusa. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 3509-3513.
BOUDREAU, N., SYMPSON, C.J., WERB, Z. & BISSELL, M.J. (1995). Ssupresija ICE i apoptoze u epitelnim stanicama dojke pomoću ekstracelularnog matriksa. Science, 267, 891-893.
CASCIOLA-ROSEN, L.A., ANHALT, G. & ROSEN, A. (1994). Napadnuti autoantigeni u sistemskom lupus eritematozusu se nakupljaju u dvije populacije površnih struktura na apoptotičnim keratinocitima. J. Exp. Med., 179, 1317-1330.
CHAMBERS. L. SUNEAL, K., SREEDHARAN, S. D., KALSHEKER, N. & BROCKLEHURST, K. (1997). Da li je Der p 1 alergen grinja iz prašine cistein proteinaza? Biochem. Soc. trans., 25, 85S.
CHAVIRA, R.. BURNETT, T.J.JR. & HAGEMAN, J.H. (1984). Testiranje proeinaza sa Azocoll-om. Anal. Biochem., 136, 446-450.
CHUA, K. Y., STEWART, G.A. & THOMAS, W.R.. SIMPSON, R.J., DILWORTH, R.J., PLOZZA, T.M. & TURNER, K.J., (1988). Sekvencijska analiza cDNA kodiranja za glavni alergen grinja iz kućne prašine, Der p 1. Homolognost sa cistein proteinazom. J. Exp. Med., 167,175-182.
CHUA, K.Y., KEHAL. P.K. & THOMAS, W. R. (1993). Sekvencijski polimorfizmi cDNA klonova koji kodiraju alergen grinja Der pl. Int. Arch. Allery Immunol., 101.364-368.
COZENS.A.L., YEZZI, M.J., KUNZELMAN. K., OHRUI, T., ENG, K.,FINKBEINER, W.E., WIDDICOMBE, J.H. & GRUENERT, D.C.(1994) CFTR ekspresija i sekrecija klorida u polariziranim besmrtnim stanicama ljudskog bronhijalnog epitela. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 10, 38-47.
DOWSE, G.K., TURNER, K.J., STEWART, G.A., ALPERS, M.P. & WOOLCOCK, A.J. (1985). Veza između grinja Dermatofagoides i povećane prevalencije astme u seoskim naseljima na visoravnima Papua-e Nova Gvineja. J. Allergy Clin. Immunol., 75, 75-83.
FADOK, V.A., VOELKER, D.R., CAMPBELL, P.A., COHEN, J.J., BRATTON, D.L. & HENSON, P. M.(1992). Izlaganje fosfatidilserina na površini apoptotičnih limfocita pokreče specifično prepoznavanje i odstranjivanje putem makrofaga. J. Immunol. 148, 2207-2216.
FRISCH, S.M. & FRANCIS, H. (1994). Razaranje epitelnih međudjelovanja stanica-matriks inducira apoptozu. J. Cell Biol. 124, 619-626.
FURUSE, M., ITOH, M., HIRASE, T., NAGAFUCHI, A., YONEMURA, S., TSUKITA, S. & TSUKITA, S. (1994). Izravna veza između okludina i ZO-1 i njihova moguća uključenost u lokalizaciji okludina na čvrstim vezama. J. Cell Biol., 127, 1617-1626.
HALE, A.J., SMITH, C.A., SUTHERLAND, L.C., STONEMAN, V.E.. LONGTHORNE, V.L., CULHANE, A.C. & WILLIAMS, G.T. (1996). Apoptoza: molekularna regulacija stanične smrti. Eur.J. Biochem., 236, 1-26. Vidi također objavljeni erratum Eur.J.Biochem., 237, 884.
HAWS, C., FINKBEINER, W.E., WIDDICOMBE, J H. & WINE, J.J. (1994). CFTR u Calu-3 ljudskim stanicama dišnih putova: svojstva kanala i uloga u cAMP-aktiviranoj Cl provodljivosti. Am. J. Physiol.,
266, L502-L512.
HERBERT, C.A.. ARTHUR, M.J.P., ROBINSON,C. (1996). Eozinofili povećavaju aktivnost želatinaze u sluznici dišnih putova. Usporedni učinci kao mogući medijator epitelnog oštećenja. Br. J. Pharmacol., 117, 667-674.
HERBERT, C.A., EDWARDS. D., BOOT, J.R., ROBINSON,C. (1993). Stimulirani eozinofili i proteinaze povećavaju transepitelni izljev albumina u goveđoj bronhalnoj sluznici. Br. J. Pharmacol., 110, 840-846.
HERBERT, C.A., KING, C.M., RING, P.C., HOLGATE, S.T.. STEWART, G.A., THOMPSON, P.J., ROBINSON, C. (1995). Povećanje permeabilnosti u bronhijalnom epitelu pomoću alergena grinja iz kućne prašine, Der p 1. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. , 12, 369-378.
HERBERT, C.A., OMARI, T.I., SPARROW, M.P. & ROBINSON, C. (1994). Ljudski eozinoflli i rekombinantna matriks metaloproteinaza-2 povećavaju permeabilnost dišnih putova goveda i svinje. Br. J. Pharmacol., 112, 461P.
HERBERT, C.A., HOLGATE, S.T.. ROBINSON, C. THOMPSON, P.J. & STEWART, G.A. (1990). Učinak alergena grinja na permeabilnost bronhijalne sluznice. Lancet 2, 1132.
HEWITT, C.R.A.. BRROWN, A.P., HART, B.J. & PRITCHARD, D.I. (1995). Glavni alergen grinja iz kućne prašine razara mrežu imunoglobulina E pomoću selektivnog cijepanja CD23; svojstvena zaštita pomoću antiproteinaza. J. Exp. Med., 182, 1537-1544.
HEWITT, C.R.A., HORTON, H., JONES, R.M. & PRITCHARD, D.L (1997). Heterogena proteolitička specifičnost i aktivnost alergena proteinaze grinja iz kućne prašine Der pl. Clin. Exp. Allergy. 27, 201-207.
HOLT, P.G. (1993). Regulacija funkcije(a) stanice koja prezentira antigen u plućima i tkivu dišnih putova. Eur. Respir.J., 6, 120-129.
HOLT, P.G.(1995). Populacije makrofaga i dendritičkih stanica u respiratornom traktu.
U: Holgate S.T. ur. Imunofarmakologija respiratornog sustava. London: Academic Press 1-12.
HOLT, P.G., McMENAMIN, C., SCHON-HEGRAD, M.A., STRICKLAND, D., NELSON, D.,WILKES, L., BILYK, N., OLIVER, J., HOLT, B.J. & McMENAMIN, P.G. (1991). Imunoregulacija astme: kontrola aktivacije T-limfocita u respiratornom trktu. Eur. Respir. J., 4, S6-S15.
HOLT, P.G., SCHON, H.M., OLIVER, J., HOLT, B.J. & McMENAMIN, P.G. (1990). Granična mreža dendritičkih stanica koje prezentiraju antigen unutar respiratornog epitela. Int. Arch. Allergy Appl. Immunol., 91, 155-159.
HOMBURG, C.H.E., HAAS, M., von DEM BORNE, A.E.G.Kr , VERHOEVEN, A.J., REUTELINGSPERGER, C.P.M. & ROOS, D. (1995). Ljudski neutrofili izgube njihov površinski FcyRIII i stječu aneksin V vezna mjesta za vrijeme apoptoze in vitro. Blood, 85, 532-540.
HOVVARTH, A.G., SINGER, K.L. & STEVENSON, B.R. (1994). Analiza raspodjele i stanja fosforilacije ZO-1 u MDCK i neepitelnim stanicama. J. Membr. Biol., 137, 261-270.
IBRAHIM, M.A.A., CHAIN, B.M. & KATZ, D.R. (1996). Oštećena stanica; uloga sustava dendritičnih stanica kao zastitnog receptorskog puta. Immunol.Today, 16, 181-186.
KAYAGAKI, N., KAWASAKI, A., EBATA, T., OHMOTO. H., IKEDA, S., INOUE, S., VOSHINO. K., OKAMURA, K. & YAGITA, H. (1995). Metaloproteinazom posredovano otpuštanje ljudskog Fas liganda. J.Exp. Med., 182, 1777-1783.
KING, C.. SIMPSON, R.J., MORITZ, R.L., REED, G.E., THOMPSON, P.J. & STEWART, G.A. (1996). Izolacija i karakterizacija novog kolagenolitičkog alergena serin proteinaze(Der p 9) iz grinje iz prašine, Dermatophagoides pteronyssimus. J. Allergy Clin. Immunology, 98, 739-747.
KOOPMAN, G., REUTELINGSPERGER, C.P.M., KUIJTEN, G.A.AM., KEEHNENE, R.M.J., PALS, S.T., & van OERS, M.H.J. (1994). Aneksin V za protočno citometrijsko otkrivanje ekspresije fosfatidilserina na B stanicama koje podliježu apoptozi. Blood, 84,1415-1420.
LOS, M., VAN DE CRAEN. M., PENNING, L.C., SCHRENK, H., VVESTENDORP, M., BAEUERLE, P., DROGE, W., KRAMMER, P.H., FIERS, W & SCHULTZ-OSTHOFF, K. (1995). Potreba za ICE/CED-3 proteazom za Fas/APO-1-posredovanom apoptozom. Nature, 375, 81-83.
MAHIDA, Y.R., MAKH, S., HYDE, S., GRAY, T. & BORRIELLO.S.P. (1996). Učinak toksina A iz Clostridium difficile na ljudske crijevne epitelne stanice: indukcija IL-8 produkcije i apoptoza nakon staničnog odvajanja. Gut, 38, 337-347.
MARIANI, S.M., MATIBA, B., BAUMLER.C. & KRAMMER, P.H. (1995). Regulacija ekspresije APO-1/Fas (CD95) liganda na površini stanice pomoću metaloproteinaza. Eur. J. Immuno., 25, 2303-2307.
MARTIN, S.J., O'BRIEN, G.A., NISHIOKA, W.K., McGAHON, AJ., MAHBOUBI, A., SAIDO, T.C. & GREEN, D.R. (1995). Proteoliza Fodrina (ne-eritroidnog spektrina)za vrijeme apoptoze. J. Biol. Chem., 270, 6425-6428.
MARTIN, SJ., REUTELINGSPERGER, C.P.M., McGAHON, AJ., RADER, J.A., van SCHIE, R.C.A.A., LaFACE, D.M. & GREEN, D.R. (1995). Rana redistribucija plazma membranskog fosfatidilserina je opća značajka apoptoze bez obzira na inicijalni stimulans; inhibicija pomoću preizraženosti Bcl-2 i Abl. J. Exp. Med. 182, 1545-1556.
MATZINGER, P. (1994). Tolerancija, opasnost i proširena obitelj. Annu. Rev. Immunol., 12, 991-1045.
OMARI, TJ. & SPARROW, M.P. (1992). Razaranje epitela pomoću proteaza povećava sposobnost odgovora kod svinjskih bronhijalnih segmenata.Clin. Exp. Pharmacol. Physiol., 19, 785-794.
PARRISH. E.P., STEART, P.V., GARROD, D.R. & WELLER, R.O. (1987). Antidesmosomsko monoklonsko protutijelo u dijagnostici intrakranijalnih tumora. J. Pathol., 153, 265-273.
PLATTS-MILLS. T.A.E., THOMAS, W.R., AALBERSE, R.C., BERVOLET, D., CHAPMAN. M.D., BISCHOFF, E., BRUIJNSEEL-KOOMEN, C.A.F.M., CHARPIN, D., COLLOF, M.J., EGGLESTON, P.A., EHNERT, B., GOLDSTEIN, R.A., van HAGE-HAMSTEN, M., HART, B.J., HOLGATE, S.T.. HONG, C.S., JOHANSSON, S.G.O., KORGGAARD, J & LAU,S.(1992). Alergeni grinja iz prašine i astma -izvješće sa druge međunarodne radionice. J. Allergy Clin. Immunol. 89, 1046-1060.
RIDGE, J.P., FUCHS, E.J. & MATZINGER, P. (1996). Ponovo posjećena neonatalna tolerancija: ukapčanje novorođenačkih T stanica sa dendritičkim stanicama. Science, 271, 1723-1726.
ROBINSON, C. (1995). Epitel dišnih puteva: podrijetlo i cilj upalnih bolesti i ozljeda dišnih puteva. U: Holgate S.T., ur. Immunopharmacology ofthe respiratory system. London: Academic Press 187-207.
ROBINSON.C., KALSHEKER, N.A.. SRINIVASAN, N., KING, C.M., GARROD, D.R., THOMPSON. P.J. & STEWART, G A. (1997). O mogućem značaju enzimatske aktivnosti alergena grinja do imunogenosti. Ključevi za strukturu i funkciju otkriveni putem molekularne karakterizaicje. Clin. Exp. Allergv, 27, 10-21.
SCHNEEBERGER. E.E. & LYNCH, R.D. (1992). Struktura, funkcija i regulacija staničnih čvrstih veza. Am. J. Phvsiol., 262, L647-L661.
SEARS, M.R., HERBISON, G.P., HOLDAWAY, M.D., HEWITT. C.J., FLANNERY, E.M. & SILVA, P.A. (1989). Relativni rizici zbog osjetljivosti na pelud iz trave, grinja iz kućne prašine u razvoju astme u djetinjstvu. Clin. Exp. Allergy, 19, 419-424.
SHAW, E. (1990). Cisteinil proteinaze i njihova selektivna inaktivacija. Adv. Enzymol., 63, 271-347.
SHEN, B.-Q., FINKBEINER, W.E., WINE, J.J., MRSNY, R.J. & WIDDOCOMBE, J.H. (1994). Calu-3: ljudska stanična linija epitela iz dišnih putova koja pokazuje C1 sekreciju ovisnu o cAMP. Am. J. Physiol., 266, L493-L501.
SMITH. P.K., KROHN, R.L, HERMANSON, G.T., MALLIA, A.K., GARTNER, F.H., PROVENZANO, M.D., FUJIMOTO, E.K., GOEKE, N.M., OLSON, B.J. & KLENK, D.C. (1985). Mjerenje proteina upotrebom bicinhoninične kiseline. Anal. Biochem. 150, 76-85. ( i objavljeni erratum, 163, 279 (1987)).
STEVENSON, B.R., SICILIANO, J.D., MOOSEKER, M.S., GOODENOUGH, D.A. (1986). Identifikacija ZO-1: polipeptida visoke molekularne težine udruženog sa čvrstom vezom (zonulae occludens) u različitim epitelima. J. Cell Biol., 103, 755-766.
STEWART, G.A. (1994). Molekularna biologija alergena. U: Busse WW, Holgate ST, ur: Astma i rinitis. Oxfbrd: Blackvvell Science. 898-932,
SREWART, G.A., WARD, L.D., SIMPSON, R.J. & THOMPSON, P.J. (1992). Alergen iz skupine III iz grinja iz kućne prašine Dermatophagoides pteronyssinus je enzim sličan tripsinu. Immunology 75, 29-35.
STUART, R.O., DUN, A., PANICHAS, M., HEBERT. S.C., BRENNER, B.M. & NIGAM, S.K. (1994). Kritična uloga intracelularnog kalcija u biogenezi čvrste veze. J. Cellul. Physiol. 159, 423-433.
STUART, R.O. & NIGAM, S.K. (1995). Regulacija spajanja čvrstih veza putem protein kinaze. C. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 6072-6076.
TANAKA, M. SUDA, T., HAZE, K., NAKAMURA, M., SATO, K., KIMURA, F., MOTOYOSHI, K., MIZUKI. M., TAGAWA, S., OHAGA, S., HATAKE, K., DRUMMOND, A.H. & NAGATA, S. (1996). Fas lignd u ljudskom serumu. Nature Med., 2, 317-322.
TOPHAM, C.M., SRINIVASAN, N., THORPE, C.J.. OVERINGTON, J.P. & KALSHEKER, N.A.(1994). Komparativno oblikovanje glavnog alergena grinja iz kućne prašine Der pl: strukturna valjanost uz uporabu tablice za proširene amino kiseline iz okoline. Protein Engng., 7, 869-894.
TOVEY, E.R.. CHAPMAN. M.D. & PLATTS-MILLS, T.A.E. (1981). Izmet grinja je glavni izvor alergena iz kućne prašine. Nature, 289, 592-593.
VERMES, I., HAANEN, C., STEFFENS-NAKKEN, H. & REUTELINGSPERGER, C. (1994). Novi test za apoptoza protočno citometrijsko otkrivanje ekspresije fosfatidilserina na rano apoptotičnim stanicama uporabom aneksina V koji je obilježen fluoresceinom. J. Immunol. Methods., 184, 39-51.
VOLK, T., VOLBERG, T., SABANAY, I. & GEIGER, B. (1990). Cijepanje A-CAM pomoću endogenih proteinaza u kulturi stanica leće i u pilećem embriju u razvoju. Dev. Biol., 139, 314-326.
YASUEDA, H., MITA., H. & AKIYAMA, K., SHIDA, T., ANDO, T., SUGIYAMA. S. & YAMAKAWA, H. (1993). Alergeni iz grinja Dermatophagoides sa kimotriptičkom aktivnošću. Clin. Exp. Allergy, 23, 384-390.
ZHONG, Y., ENOMOTO, K., ISOMURA, H., SAWADA, N., MINASE, T.. OYAMADA, M., KONISHI, Y. & MORI, M. (1994). Lokalizacija 7H6 antigena i čvrstih veza korelira sa funkcijom paracelularne barijere MDCK stanica- Exp. Cell. Res.. 214, 614-620.
LEGENDE ZA SLIKE
Slika 1.
SDS - PAGE (slika a) i imunoblot analiza (slika b) frakcija HDM proteinaza. Ključ za linije na slici a: imunoafinitetom pročišćeni Der p 1(1); frakcija HDM cistein proteinaze (2) i frakcija HDM serin proteinaze (3). Proteini se učine vidljivim pomoću coomassie plavog bojanja. Slika b prikazuje imunoblot priređen iz gela na slici a. Proteini su otkriveni uporabom mAb 5H8 (anti-Der p1) i učinjeni vidljivima pomoću ECL tehnike. Zapazite detekciju imunoreaktivnih proteina pomoću mAb 5H8 u frakciji serin proteinaze u dodatku kod očekivane imunorekativnosti frakcije cistein proteinaze. Ispunjeni krugovi pokazuju standarde za kalibraciju mase i strelice pokazuju vidljive molekularne mase traka iz kretanja standarda označenih bojom.
Slika 2.
Krivulje dilution-response (razrijeđenje-odgovor) prikazuju učinke 18-satnog izlaganja staničnog sloja frakciji serin proteinaze pripremljene iz HDM kulture. Slika (a) prikazuje permeabilnost za manitol MDCK epitelnih stanica pod kontroliranim uvjetima (samo EMEM bez seruma) i nakon obrade (frakcija proteinaze razrijeđena u EMEM-u bez seruma). Slika (b) pokazuje slične studije koje su izvedene na Calu-3 bronhijalnim epitelnim stanicama. Podatci su prosjek ± s.p. sredina od 4-6 pokusa. Aktivnost alergena protinaze (izražena u azocoll jedinicama ml-1) je prikazana pomoću brojeva ispod pune linije. Zvjezdice pokazuju statistički značajne razlike sa poštivanjem neobrađenog kontrolnog odgovora (EMEM medij bez seruma) za svaki stnaični tip.
Slika 3.
Inhibicija učinaka frakcija HDM proteinaza na permeabilnost za manitol u MDCK staničnom sloju. Slika (a) prikazuje učinke E-64 (10 UM) na učinak proizveden pomoću frakcije cistein proteinaze (80 azocoll jedinica ml-1). Kontrolne stanice su bile izložene EMEM-u bez seruma koji sadrži 0.5mM reduciranog glutationa. Slika (b) pokazuje učinke AEBSF-a (100 μM) na učinke frakcije serin proteinaze (127 azocoll jedinica ml-1) . Podatci su prosjek ± s.p. sredina od 3-5 pokusa. U svim slučajevima je kontaktno vrijeme od 18 sati. Na objema slikama (a) i (b) postoje statistički značajne razlike između permeabilnosti kontrole i sloja tretiranog sa proteinazom i također između slojeva tretiranih sa proteinazama u prisutnosti ili odsutnosti inhibitora. Značajne usporedbe su prikazane na slici pomoću uglatih linija i pokazuju vrijednosti vjerojatnosti.
Slika 4.
Slika (a) ilustrira učinke 100 μM AEBSF-a na promjene u permeabilnosti za manitol u Calu-3 staničnom sloju nakon 18-satnog izlaganja frakciji cistein proteinaze (80 azocoll jedinica ml-1). Podatci su prosjek ± s.p. sredina od 3 pokusa. Slika (b) ilustrira učinke 10 μM E-64 na promjene u permeabilnosti za manitol u Calu-3 staničnom sloju nakon 18-satnog izlaganja frakciji serin proteinaze (94 azocoll jedinica ml-1). Podatci su projsek ± s.p. sredina od 3 pokusa. U oba primjera, kontrolne stanice se obrade sa samim EMEM medijem bez seruma (sa 0.5 mM reduciranog glutationa u slučaju frakcije cistein proteinaze).
Slika 5.
Imunobojanje TJ proteina ZO-1 (slike a-e) i desmosomskog plak proteina desmoplakina (slike f-j) u MDCK staničnom sloju. Slike a, f prikazuju imunobojanje stanica izloženih EMEM-u bez seruma kao kontroli. Model imunobojanja nakon obrade sa frakcijom cistein proteinaze (80 azocoll jedinica ml-1) je prikazan na slici b, g i modifikacija ovog odgovora pomoću E-64 (10 μM) na slici c, h. Model imunobojanja nakon obrade sa frakcijom serin proteinaze (94 azocoll jedinice ml-1) je prikazan na slikama d,i i modifikacija ovog odgovora pomoću AEBSF-a (100 μM) na slikama e,j.
Slika 6.
Mjerenje otpuštanja LDH nakon obrade MDKC ili Calu-3 stanica sa frakcijama HDM proteinaze kroz 18 sati. Slika a prikazuje izostanak otpuštanja LDH iz stanica pod kontroliranim uvjetima sve dok sloj stanica nije bio podvrgnut hipotoničnoj lizi. Slika a također prikazuje da obrada sa frakcijom cistein proteinaze (80 azocoll jedinica ml -1 nakon aktivacije sa 0,5 mM reduciranog glutationa) rezultira neotpuštanjem LDH u medij za vrijeme trajanja tretmana. Zapazite da su sve stanice bile odvojene od zdenaca za vrijeme obrade i da je hipotonična liza odvojenih stanica rezultirala otkrivanjem iste količine LDH aktivnosti izmjerene u kontrolnim stanicama. Slika b ilustrira sličan pokus uz uporabu frakcije serin proteinaze (114 azocoll jedinica ml -1). Zapazite da nisu sve stanice bile odvojene za vrijeme trajanja tretmana, ali daje zbroj LDH aktivnosti u liziranim adheriranim i liziranim odvojenim stanicama korespondirao detektiranoj količini u kontrolnim stanicama. Slike c i d prikazuju slične pokuse izvedene u Calu-3 stanicama. Zapazite da je bilo malo pozadinsko otpuštanje LDH iz ovih stanica (<10% ukupnog staničnog LDH) pod kontroliranim uvjetima i da se ovo nije značajno mijenjalo obradom sa proteinazom. Prikazani podatci su prosjek + s.p- sredina od 4 pokusa.
Slika 7.
Elektroforeza DNA u agaroza gelu (slike a,b) i stanično bojanje sa AV i PI (slike c-j) nakon obrade MDKC i Calu-3 stanica sa frakcijama HDM proteinaza. Slika a prikazuje fragmentaciju DNA induciranu proteinazom u MDKC stanicama. Ključ za linije: DNA markeri (1, 10); netretirane stanice (2,3); stanice tretirane kroz 18 sati sa 10 μM kamptotecina (pozitivna kontrola) (4,5); stanice tretirane kroz 18 sati sa frakcijom serin proteinaze (114 azocoll jedinica ml-1) (6,7) i stanice tretirane sa frakcijom cistein proteinaze (80 azocoll jedinica ml-1 nakon aktivacije) kroz 18 sati (8,9). Slika b prikazuje DNA fragmentaciju u Calu-3 stanicama. Ključ za linije: DNA markeri (1, 11); netretirane stanice (2); stanice tretirane kroz X sati sa frakcijom serin proteinaze (94 azocoll jedinice ml-1) (3); stanice tretirane sa frakcijom cistein proteinaze (80 azocoll jedinica ml-1 nakon aktivacije) kroz 18 sati (4); netretirane stanice u prisutnosti BB-250 (5 μM) (5); kao linija 3, ali stanice tretirane u prisutnosti 5 μM BB-250 (7); netretirane stanice u prisutnosti 10 μM E-64 (8); kao linija 3, ali stanice tretirane u prisutnosti 10 μM E.64 (9); kao linija 4, ali stanice tretirane u prisutnosti 10 μM E-64 (10). Slike c - f prikazuju fluorescentnu mikroskopiju AV i PI (e,f) bojanja Calu-3 staničnog sloja pod kontroliranim uvjetima (c,e) i nakon obrade kroz 18 sati sa frakcijom serin proteinaze (135 azocoll jedinica ml-1) (d,f). Slike c,d prikazuju model bojanja pod ekscitacijom plavog svjetla i e,f to prikazuju pod ekscitacijom zelenog svjetla. Slike g-j prikazuju primjere MDCK staničnih slojeva isto kao i slike c.f. U oba stanična tipa treba zapaziti virtuelno odsustvo AV i PI bojanja kod netretiranih stanica. Na slikama d,f model bojanja djelomice opisuje područje staničnog odvajanja u sloju i zapazite da neke stanice pokazuju oba AV i PI bojanja. Na slikama h,j većina obojanih stanica su pozitivne za oba AV i PI i nema vidljivog značajnog odvajanja stanica od substrata.
Claims (10)
1. Prevencija i/ili liječenje alergijskih stanja (tip u kojem mogući alergen mora prijeći epitelnu barijeru) naznačeni time što se sprovode pomoću inhibicije aktivnosti cistein proteinaze i aktivnosti serin proteinaze.
2. Pripravak koji je naznačen time što ima inhibicijsku aktivnost cistein i serin proteinaze.
3. Kit koji je naznačen time da sadrži inhibitor aktivnosti cistein proteinaze i inhibitor aktivnosti serin proteinaze.
4. Uporaba inhibitora aktivnosti cistein proteinaze zajedno sa inhibitorom aktivnosti serin proteinaze naznačena time da se koriste za proizvodnju lijeka za prevenciju ili liječenje stanja u kojima alergen prelazi epitelnu barijeru.
5. Uporaba u skladu sa zahtjevom 4 naznačena time da je alergijsko stanje astma.
6. Uporaba u skladu sa zahtjevom 4 naznačena time da je alergijsko stanje izabrano između rinitisa, alergijskog konjunktivitisa, atopijskog dermatitisa ili alergijom izazvanom hranom.
7. Metoda tretiranja osobe radi prevencije ili liječenja stanja u kojem alergen prelazi epitelnu barijeru a koja je naznačena time da obuhvaća primjenu terapeutski učinkovite količine(a) inhibitora aktivnosti cistein proteinaze i inhibitora aktivnosti serin proteinaze.
8. Uporaba inhibitora aktivnosti cistein proteinaze zajedno sa inhibitorom aktivnosti bilo koje druge serin proteinaze osim tripsina naznačena time da se koriste za proizvodnju lijeka za prevenciju ili liječenje stanja u kojem alergen prelazi epitelnu barijeru.
9. Uporaba inhibitora aktivnosti cistein proteinaze zajedno sa inhibitorom aktivnosti alergen serin proteinaze naznačena time da se koriste za proizvodnju lijeka za prevenciju ili liječenje stanja u kojem alergen prelazi epitelnu barijeru.
10. Uporaba inhibitora aktivnosti cistein proteinaze zajedno sa inhibitorom aktivnosti Der p 3, Der p6 i Der p 9 serin proteinaze naznačena time da se koriste za proizvodnju lijeka za prevenciju ili liječenje stanja u kojem alergen prelazi epitelnu barijeru.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GBGB9726114.3A GB9726114D0 (en) | 1997-12-11 | 1997-12-11 | Prevention and/or treatment of allergic conditions |
PCT/GB1998/003721 WO1999029339A2 (en) | 1997-12-11 | 1998-12-11 | Prevention and/or treatment of allergic conditions |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
HRP20000450A2 true HRP20000450A2 (en) | 2001-06-30 |
Family
ID=10823401
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
HR20000450A HRP20000450A2 (en) | 1997-12-11 | 2000-07-05 | Prevention and/or treatment of allergic conditions |
Country Status (13)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US6440938B1 (hr) |
EP (1) | EP1032415B1 (hr) |
JP (2) | JP2001525374A (hr) |
AT (1) | ATE241383T1 (hr) |
AU (1) | AU747723C (hr) |
CA (1) | CA2313653C (hr) |
DE (1) | DE69815143T2 (hr) |
ES (1) | ES2200394T3 (hr) |
GB (1) | GB9726114D0 (hr) |
HR (1) | HRP20000450A2 (hr) |
HU (1) | HUP0100788A2 (hr) |
PT (1) | PT1032415E (hr) |
WO (1) | WO1999029339A2 (hr) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB0125594D0 (en) * | 2001-10-25 | 2001-12-19 | Univ Sheffield | Inhibitors for inactivating allergens |
US10744179B2 (en) | 2014-09-18 | 2020-08-18 | The Provost, Fellows, Foundation Scholars, & the Other Members of Board, of The College of the Holy | Method for treatment of inflammatory skin disorders with inhibitors of IL-36 proteolytic processing |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5166134A (en) * | 1986-12-24 | 1992-11-24 | John Lezdey | Treatment of allergic rhinitis |
ES2230566T3 (es) * | 1995-07-17 | 2005-05-01 | Medivir Uk Ltd | Inhibidores de la cisteina proteasa para el tratamiento de enfermedades alergicas mediadas por la inmunoglobulina e (ige). |
-
1997
- 1997-12-11 GB GBGB9726114.3A patent/GB9726114D0/en not_active Ceased
-
1998
- 1998-12-11 US US09/581,075 patent/US6440938B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-12-11 JP JP2000524008A patent/JP2001525374A/ja not_active Withdrawn
- 1998-12-11 AT AT98959056T patent/ATE241383T1/de not_active IP Right Cessation
- 1998-12-11 AU AU14985/99A patent/AU747723C/en not_active Ceased
- 1998-12-11 PT PT98959056T patent/PT1032415E/pt unknown
- 1998-12-11 HU HU0100788A patent/HUP0100788A2/hu unknown
- 1998-12-11 CA CA2313653A patent/CA2313653C/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-12-11 DE DE69815143T patent/DE69815143T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-12-11 EP EP98959056A patent/EP1032415B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-12-11 WO PCT/GB1998/003721 patent/WO1999029339A2/en not_active Application Discontinuation
- 1998-12-11 ES ES98959056T patent/ES2200394T3/es not_active Expired - Lifetime
-
2000
- 2000-07-05 HR HR20000450A patent/HRP20000450A2/hr not_active Application Discontinuation
-
2009
- 2009-12-25 JP JP2009295744A patent/JP2010155831A/ja active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
ATE241383T1 (de) | 2003-06-15 |
EP1032415A2 (en) | 2000-09-06 |
JP2010155831A (ja) | 2010-07-15 |
CA2313653A1 (en) | 1999-06-17 |
WO1999029339A3 (en) | 1999-08-12 |
PT1032415E (pt) | 2003-09-30 |
ES2200394T3 (es) | 2004-03-01 |
JP2001525374A (ja) | 2001-12-11 |
GB9726114D0 (en) | 1998-02-11 |
DE69815143D1 (de) | 2003-07-03 |
EP1032415B1 (en) | 2003-05-28 |
AU747723B2 (en) | 2002-05-23 |
CA2313653C (en) | 2011-02-01 |
AU747723C (en) | 2003-10-02 |
HUP0100788A2 (hu) | 2001-06-28 |
US6440938B1 (en) | 2002-08-27 |
WO1999029339A2 (en) | 1999-06-17 |
DE69815143T2 (de) | 2004-04-01 |
AU1498599A (en) | 1999-06-28 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Winton et al. | Class specific inhibition of house dust mite proteinases which cleave cell adhesion, induce cell death and which increase the permeability of lung epithelium | |
Wan et al. | The transmembrane protein occludin of epithelial tight junctions is a functional target for serine peptidases from faecal pellets of Dermatophagoides pteronyssinus | |
Sommerhoff et al. | Neutrophil elastase and cathepsin G stimulate secretion from cultured bovine airway gland serous cells. | |
KITSIS et al. | The role of the neutrophil in rheumatoid arthritis | |
Salonen et al. | Plasmin in tear fluid of patients with corneal ulcers: basis for new therapy | |
US7935682B2 (en) | Wound healing dressing for enhancing fibrocyte formation | |
Abbinante-Nissen et al. | Neutrophil elastase increases secretory leukocyte protease inhibitor transcript levels in airway epithelial cells | |
Mass et al. | Induction of experimental emphysema: cellular and species specificity | |
Masuda et al. | Two vascular apoptosis‐inducing proteins from snake venom are members of the metalloprotease/disintegrin family | |
Yang et al. | Reduction of arthritis severity in protease‐activated receptor–deficient mice | |
Remold-O'Donnell et al. | Two proteolytic pathways for down-regulation of the barrier molecule CD43 of human neutrophils. | |
Liu et al. | Apoptotic neutrophils undergoing secondary necrosis induce human lung epithelial cell detachment | |
Reeves et al. | Intracellular Secretory Leukoprotease Inhibitor Modulates Inositol 1, 4, 5‐Triphosphate Generation and Exerts an Anti‐Inflammatory Effect on Neutrophils of Individuals with Cystic Fibrosis and Chronic Obstructive Pulmonary Disease | |
Suzuki et al. | TLR signals in epithelial cells in the nasal cavity and paranasal sinuses | |
Chang et al. | Increased cathepsin B-like activity in alveolar macrophages and bronchoalveolar lavage fluid from smokers | |
KR20170044171A (ko) | 이상 섬유모세포 증식 및 세포외 기질 침착을 특징으로 하는 질병, 질환, 또는 과정의 예방 또는 치료용 조성물 및 방법 | |
HRP20000450A2 (en) | Prevention and/or treatment of allergic conditions | |
US20210338787A1 (en) | Methods for treating coronavirus infection | |
Wintroub | Inflammation and mediators. | |
CZ20002907A3 (cs) | Přípravek pro léčení alergických onemocnění | |
Yoshida et al. | Metalloproteinase inhibition has differential effects on alloimmunity, autoimmunity, and histopathology in the transplanted lung | |
US20190134153A1 (en) | Immunomodulatory effect of inhaled kinase inhibitor peptides in lung | |
Bignold et al. | CXCL12 drives pericyte accumulation and airway remodeling in allergic airway disease | |
CZ265896A3 (en) | Tryptase inhibitor, its use and pharmaceutical compositions containing thereof | |
del Río Oliva | Targeting the immunoproteasome and VCP/p97 in autoimmune disorders and viral infection |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A1OB | Publication of a patent application | ||
ODRP | Renewal fee for the maintenance of a patent |
Payment date: 20011211 Year of fee payment: 4 |
|
ARAI | Request for the grant of a patent on the basis of the submitted results of a substantive examination of a patent application | ||
OBST | Application withdrawn |