CZ20002907A3 - Přípravek pro léčení alergických onemocnění - Google Patents

Abstract

Toto řešení se týká použití inhibitoru aktivity cysteinové proteinázy společně s inhibitorem aktivity jakékoliv serinové proteinázy s výjimkou trypsinu pro výrobu léku k prevenci nebo léčení onemocnění, při kterém alergen prochází epiteliální bariérou, jako je například astma. Dále se řešení týká přípravku a soupravy, které obsahují inhibitory aktivity serinové a cysteinové proteinázy a které jsou vhodné k prevenci nebo léčení onemocnění, při kterých alergen prochází epiteliální bariérou.

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká prevence a/nebo léčení alergií, a zejména takových alergií, kde potenciální alergen musí projít epiteliální bariérou. Vynález lze využít zejména, ale ne výlučně, k prevenci a/nebo léčení astmatu.

Dosavadní stav techniky

Astma je nejrozšířenější chronickou nemocí dětského věku a jednou z hlavních invalidizujících a život ohrožujících nemocí. Nemoc je charakterizována akutní hypersenzitivitou, chronickou bronchiální reaktivitou a poškozením a narušením plicního epitelu.

Hlavním rizikovým faktorem astmatu je vznik citlivosti plic (alergizace) na vzduchem přenášené alergeny jako jsou např. proteiny vylučované ve výkalech roztočů (HDM) vyskytujících se v prachu v domácnostech, zejména roztočů rodu Dermatophagoides (např. D. pteronyssinus_r D. Farinae) . Po vdechnutí dopadají výkaly HDM na tekutinou pokrytý povrch epitelu v dýchacích cestách s velkým průměrem. V důsledku toho dochází k rehydrataci výkalů, což spustí rychlé a úplné uvolnění hlavních alergenních proteinů, takže tyto HDM proteiny dosáhnou vysoké lokální koncentrace na epitelu dýchacích cest. Alergizace zahrnuje detekci alergenu buňkami prezentujícími antigen, které jsou normálně chráněny proti vnějšímu prostředí plicním epitelem. Mechanismus, kterým alergeny procházejí epiteliální bariérou, není dostatečně ······ · ·· ·· · · ··· ···· ···· poznán.

V současnosti se hromadí důkazy o tom, že některé hlavní alergeny z HMD vykazují katalytické vlastnosti jako enzymy a tudíž vznikla domněnka, že ^: toto enzymatické působení je důležité v alergizaci a udržování již vzniklé alergické zánětlivé reakce.

Většina údajů týkajících se proteinázové aktivity . alergenů roztočů se týká převážně skupin 1, 3, 6 a 9 roztočů rodu Dermatophagoides. Skupina alergenů 1 jsou cysteinové proteinázy a dosud byly nejvíce zkoumány, zatímco mnohem méně informací je známo o ostatních skupinách alergenů 3, 6 a 9, které sdílejí sekvenční identitu s archetypovou serinovou proteinázou a jsou samy také katalyticky účinné.

Bylo navrženo, že aktivita cysteinové proteinázy je důležitá při exacerbaci alergické reakce při astmatu, neboť štěpí CD23, receptor IgE s nízkou afinitou, vyskytující se na povrchu buněk produkujících protilátky. Štěpení vede k pozitivní zpětné vazbě, která způsobuje zvýšení sekrece IgE a tím podporuje alergickou reakci. Na základě těchto skutečností se v patentové přihlášce WO A 97/04004 (Peptide Therapeutics) navrhuje, že mohou být kromě jiného užity inhibitory cysteinových proteináz v profylaxi astmatu. Avšak , mechanismus působení navržený v dokumentu WO A 97/04004 pravděpodobně nefunguje v podmínkách in vivo. Důvodem je to, * že všechny pokusy štěpení CD23 byly prováděny na buňkách v kultuře a koncentrace Der pl potřebná ke štěpení je podle názoru původců předkládaného vynálezu příliš vysoká. Uvedené buňky by v podmínkách in vivo byly ve tkáni nebo v krvi, a tak je velmi nepravděpodobné, že by koncentrace alergenu dosáhla takové úrovně, která je potřebná ke štěpení CD23 v takových místech. Nejsou žádné důkazy, že k tomu dochází, ani důkazy o tom, že in vivo dochází ke štěpení CD23.

··· ···· ···· • · · · ··· ···« • · · · · ··· ·· · • · ·······

Kalsheker, N. et al., 1996, Biochem. Biophys. Res. Comms. USA 221/1: 59-61, popsali, že serinová proteináza αι-antitrypsin chrání dolní cesty dýchací před poškozením působením proteináz, které se uvolňují v plicích při zánětu. Bylo ukázáno, že cysteinová proteináza Der pl štěpí předpokládanou reaktivní smyčku ou-antitrypsinu, inhibitoru serinové proteinázy, a tento mechanismus byl navržen jako důležitý mechanismus v patogenezi astmatu. Bylo také popsáno, že deficience ou-antitrypsinu je spojena s výskytem dětského astmatu. Ale nebylo nijak zjištěno, jak zabránit a nebo léčit alergii (např. jako je astma), kde alergen musí překonat epiteliální bariéru.

Stewart, G. et al., 1991, Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 95/2-3: 248-256 popsali, že výkaly roztočů z domácího prachu obsahují kromě jiných enzymů tři serinové proteinázy a cysteinovou proteinázu. Bylo také zjištěno, že cysteinová proteináza a alespoň jedna serinová proteináza jsou alergenní. Ale taktéž zde nebylo nijak popsáno, jak zabránit a nebo léčit alergií (např. jako je astma), kde alergen musí překonat epiteliální bariéru.

I přes značné úsilí věnované výzkumu astmatu, stále je potřeba nalézat účinné metody prevence a léčení astmatu (a dalších alergických onemocnění, kdy potenciální alergen musí překonat epiteliální bariéru).

Podstata vynálezu

První nejširší aspekt předkládaného vynálezu umožňuje prevenci a/nebo léčení alergické nemoci (takového typu, kdy potenciální alergen musí překonat epiteliální bariéru) tím, že se inhibuje aktivita cysťeinové proteinázy a serinové

proteinázy.

Vynález je využitelný (ale ne výlučně) k léčení astmatu, kdy cysteinová proteináza, kterou je třeba inhibovat, je výhodně Der pl, zatímco serinová proteináza, kterou je třeba inhibovat, je kterákoliv ze serinových proteináz kromě trypsinu, výhodně alergenní serinová proteináza a ještě výhodněji Der p3, Der p6 a/nebo Der p9.

Předkládaný vynález je založen na výzkumu, který prováděli původci (a jehož výsledky jsou podrobněji dále popsány) a který ukázal, že klíčový počáteční krok v alergizaci na alergeny roztočů z domácího prachu je zprostředkován aktivitou cysteinové a serinové proteinázy. Původci zjistili, že tato aktivita způsobuje narušení těsného spojení mezi buňkami epitelu a tak zvyšuje propustnost epitelu a umožňuje průnik alergenu epitelem. Tak může alergen získat přístup k dendritickým buňkám prezentujícím antigen a reagovat s nimi, což vede ke vzniku alergické reakce. Inhibitory cysteinové proteinázy inhibují alergeny cysteinové proteinázy, ale nikoliv alergeny serinové proteinázy, a tudíž neblokují úplně rozpad těsného spojení. A obdobně inhibitory serinové proteinázy blokují účinky alergenů serinové proteinázy, ale nikoliv alergeny cysteinové proteinázy, a tudíž neblokují úplně rozpad těsného spojení. Částečná inhibice stále ještě umožňuje rozvoj alergické reakce. Pro úplnou inhibici rozpadu těsného spojení a tím inhibici alergické reakce je proto nezbytná inhibice jak cysteinové tak i serinové proteinázové aktivity alergenů.

Ačkoliv je vynález využitelný zejména při prevenci a/nebo léčení astmatu, lze ho využít také pro celou řadu dalších alergických onemocnění včetně alergické rýmy, alergického zánětu spojivek, atopické dermatitidy a potravinových alergií.

I)

přípravku vynálezu),

II)

Léčení a/nebo prevenci alergického onemocnění lze provádět pomocí (který sám je předmětem předkládaného který vykazuje inhibiční aktivitu pro cysteinové a serinové proteinázy, nebo soupravy (která sama je dalším předmětem předkládaného vynálezu), která obsahuje inhibitor aktivity cysteinové proteinázy a inhibitor aktivity serinové proteinázy.

V přípravku podle vynálezu jediná inhibitorová sloučenina může poskytnout požadovanou inhibici aktivity cysteinové a serinové proteinázy. Avšak obvykle, a v souladu s výhodným provedením vynálezu, inhibice aktivity cysteinové a serinové proteinázy se provádí dvěma odlišnými inhibitorovými sloučeninami.

Pokud jsou v soupravě, která je také předmětem vynálezu, užity samostatné inhibitorové sloučeniny, je třeba je užít současně a nebo postupně.

Pokud je to potřeba, užije se více než jeden typ cysteinové proteinázy a/nebo více než jeden typ serinová proteinázy, aby se dosáhlo požadovaného spektra aktivity.

Vynález je využitelný hlavně (avšak ne výlučně) při léčení.

Další aspekt vynálezu poskytuje použití inhibitoru cysteinové proteinázy ve spojení s inhibitorem serinová proteinázy jiné než trypsin pro výrobu léku pro prevenci nebo léčení nemocí, kdy alergen prochází epiteliální bariérou.

Dále se tudíž vynález týká prevence nebo léčení nemoci subjektu, kdy alergen prochází epiteliální bariérou, přičemž léčení spočívá v tom, že se subjektu podává terapeuticky účinné množství inhibitoru cysteinové proteinázy a inhibitoru serinové proteinázy.

• · · · · ·

Při tomto léčení se užívá přípravek, který je předmětem vynálezu, nebo souprava, která je také předmětem vynálezu.

Vynález je zejména využitelný při léčení astmatu a konkrétně při prevenci astmatu. Prevencí astmatu se rozumí jakékoliv léčení vedoucí k zabránění nebo zmírnění účinků astmatického záchvatu. Preventivní léčení lze provádět např. periodicky u osob, o kterých se vím že trpí astmatickými záchvaty, aby se zabránilo těmto záchvatům nebo snížila frekvence jejich výskytu. Alternativně lze preventivní léčení provádět ad hoc u lidí, kteří trpí astmatem a kteří mají být vystaveni prostředí (např. prostředí infikované alergenem), které pravděpodobně vyvolá astmatický záchvat. Další možností je poskytovat preventivní léčení osobám, které sice netrpí astmatem, ale ať už z jakéhokoliv důvodu je u nich nebezpečí vzniku astmatu.

Pro potřeby terapeutické podávání jsou inhibitorové sloučeniny formulovány užitím farmaceuticky přijatelných excipientu do lékové formy pro podávání na plicní epitel. nejvýhodnější je formulace inhibitorových sloučenin do aerosolových přípravků, což je obvyklá forma pro antiastmatika. Ale ani jiné způsoby podávání nejsou vyloučeny.

Množství inhibitorových sloučenin, které je podáváno, je samozřejmě terapeuticky účinná dávka. Dávkování je přitom závislé na různých faktorech, jako je např. hmotnost léčeného pacienta, závažnost astmatického onemocnění a účinnost inhibitorů. Typické dávkování je 1 až 1000 μμ na den.

I když dosavadní popis vynálezu byl věnován využití vynález při léčení astmatu, původci ukázali, že inhibice aktivity cysteinové a serinové proteinázy alergenů roztočů z domácího prachu je možné využít i jiným způsobem. Tak např. je možné ošetřit substráty, které obsahují nebo mohou • 0 0000 0 0 0 0 00

- Ί obsahovat alergeny domácích roztočů, inhibitory aktivity cysteinové a serinové proteinázy, čímž se tyto substráty stanou hypoalergenními. K příkladům takových substrátů patří substráty typicky spojené s vysokou hladinou alergenů (jako je např. polstrování, koberce, ložní prádlo apod.).

K příkladům inhibitorů aktivity cysteinové proteinázy, které lze užít předkládaného vynálezu, patří L-transepoxysukcinylleucylamid-(4-guanidino)-butan (E-64) a také inhibitory cysteinové proteinázy popsané v přihlášce

WO-A-97/04004.

K příkladům inhibitorů aktivity serinové proteinázy, které lze užít předkládaného vynálezu, patří 4-(2-aminoetyl)benzensulfonylfluorid hydrochlorid (AEBSF).

Předkládaný vynález je dále podrobněji popsán formou příkladů (a připojených obrázků), které vynález ilustrují, avšak nijak neomezují.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Tento příklad demonstruje vliv

I) frakcí s aktivitou serinové a cysteinové proteinázy separovaných z roztočů z domácího prachu, a

II) frakcí podle bodu (I) v kombinaci s inhibitory aktivity cysteinové a serinové proteinázy na permeabilitu epitelu.

φ φφ φφ φφ φφφ φ φ φφ φ φφφ φφφφ ·· φφφφ • φ φφφ· φ · φφφφφφφ φφφφ φφφ φφφ φφ φφ φφ

- 8 Metody

Buněčná kultura

Buňky Calu-3 a MDCK byly použity jako příklady intercelulárních spojů epitelu a jejich citlivosti k proteinázám HDM a potenciálním inhibitorům. U obou buněčných linií se objevují těsné spoje, tzv. zonulae adherentes a desmosomy, a jsou tudíž vhodnými modely pro mechanismus buněčné adheze přítomný v dýchacích cestách. Calu-3 je adenokarcinomová buněčná linie získaná z buněk 251etého bělocha. Byla dosud relativně málo zkoumána, ale na základě elektrofyziologických studií (Shen et al., 1994, Haws et al., 1994) a na základě imunocytochemické charakterizace provedené původci předkládaného vynálezu (není zde uvedeno) je známo, že vykazuje vlastnosti těsné bariéry. Buňky byly množeny v minimálním esenciálním Eagleho médiu s Eagleho solemi (EMEM) s přídavkem 10 % (objem.) tepeleně inaktivovaného telecího fetálního séra (FCS), 2mM L-glutaminu, neesenciálních aminokyselin, 10 μΜ pyruvátu sodného a obsahem 50 U/ml penicilinu a 50 pg/ml streptomycinu.

Madin-Darby buňky epitelu ledvin psa (MDCK) byly pěstovány v médiu EMEM obsahujícím 50 U/ml penicilinu, 50 pg/ml streptomycinu, 2 mM L-glutaminu, 10 % (objem.) tepelně inaktivovaného telecího fetálního séra (FCS) a neesenciální aminokyseliny.

Pro subkultivaci buněk obou typů byly buňky opláchnuty v solném roztoku pufrovaném fosfátem (PBS) bez vápníku a hořčíku) a pak parciálně štěpeny užitím 0,05% (hmotnost/objem) trypsin a 0,02% (hmotnost/objem) EDTA.

Všechny kultury byly množeny ve 37 °C a ve zvlhčovaném vzduchu obsahujícím 5 % C0₂.

- 9 99 »9·9 • ·

V * ·» ·· 99

9 9 9

9 9 9

Potahování inzertů Transwell™ Matrigelem

Měření clearance manitolu bylo provedeno na konfluentní monovrstvě buněk, které byly namnoženy na inzertech Costar Transwell™ potažených nezgelovatělou ultratenkou vrstvou Matrigelu. Potažení bylo provedeno nanesením 250μ1 alikvotu Matrigelu (naředěného 1:500 (objem.) v EMEM) do vnitřku inzertu a pak inkubací 60 minut v aseptických podmínkách. Roztok byl pak odsát a inzerty byly opláchnuty jemně médiem před tím, než na ně byla nanesena buněčná suspenze v konfluentní hustotě.

Protokol ošetření buněk a měření clearance

Buňky (2 až 5 x 10⁵ na 1 cm² kultivační plochy) byly vysety na inzerty potažené Matrigelem. Termínem inzerty jsou zde označeny filtrové jednotky (vložky) obsahující buňky a termín jamka označuje dutinu v destičce pro tkáňové kultury. Pro monitorování růstu a integrity, byly inzerty náhodně odebrány, jemně opláchnuty PBS a pak za tlumeného světla obarveny akridinovou oranží a etidiumbromidem (obě barviva 1 mg/ml). Inzerty pak byly pak prozkoumány fluorescenční mikroskopií a byly použity pouze v případě, že bylo dosaženo konfluence s vysokou životaschopností.

Při konfluenci bylo médium z jamek odsáto a nahrazeno EMEM médiem bez séra bikarbonátem pufrovaným 20mM HEPES a obsahujícím 20mM L-glutamin. Médium z inzertů bylo jemně odstraněno a nahrazeno 300 μΐ EMEM bez séra obsahujícím [^Cj-manitol (1 μ<3ΐ/πι1 a lmg/ml neznačeného manitolu v médiu pufrovaném HEPES). Destičky Transwell™ pak byly ekvilibrovány 30 minut ve 37 °C na orbitální třepačce Luckham R100. Alikvoty po 100 μΐ ve třech opakováních nepoužitého roztoku značeného manitolu byly odebrány jako vzorky a obsah

- 10 • w ί»Φ· • φ * • ··>

• φ φ • φ ·· 9 · Φ · φ Φ • · Φ V φ φ « • · ΦΦΦ Φφ *

Φ · Φ ΦΦΦΦ

ΦΦΦ ΦΦ ΦΦ ΦΦ radioaktivity byl stanoven po přidáni 5 ml scintilačního roztoku Opti-Fluor kapalinovou scintilační spektrometrií (Beckman LS6000IC).

Po ekvilibračním čase byly inzerty vloženy do čerstvých jamek obsahujících 1 ml EMEM pufrovaného HEPES bez séra a inkubovány za stálého jemného třepání ve 37 °C. Médium z původních jamek bylo uchováno a po přidání 10 ml scintilačního roztoku Opti-Fluor byl stanoven obsah radioaktivity. Tyto výsledky byly užity ke' stanovení stopové koncentrace v čase 0. V definovaných intervalech byly odebírány 20 μΐ vzorky basolaterální tekutiny a bylo v nich kvantifikováno množství [¹⁴C]-manitolu, jak bylo popsáno výše pro výpočet objemu clearance.

Výpočet permeability epitelu

Paracelulární permeabilita manitolu byla stanovena postupem popsaným v již podané patentové přihlášce UK 9715058 a byla vypočtena z měření clearance objemu v definovaných časových okamžicích. Stanovení clearance bylo provedeno v průběhu 3 až 5 hodin a byla vypočtena podle následujícího vzorce:

V probo —

VAíA[A]í “ [LJi (1) kde

Vprobet je objem clearance v daném časovém bodě,

VAi je abluminální objem v daném časovém bodě,

Δ[Α]_χ je zvýšení stopové koncentrace mezi dvěma časovými body, [L]t je luminální stopová koncentrace v každém časovém bodě.

V podmínkách, kdy difúze je jediným prostředkem transpeiteliálního pohybu solutu, dV_probet/dt se blíží součinu permeabilta-povrchová plocha, což dovoluje určit permeabilitu ·

- 11 manitolu ve složeném systému buněk, filtru, nemíchaných vrstev a proteinového povlaku (P_t). Epiteliální permeabilita se pak může vypočítat z měřených proměnných tak, že se systém filtru potaženého Matri-gelem považuje za systém v sérii zařazených permeabilit. A tudíž:

(2) a

¹ - 1 4.JL pZL p, ⁽³⁾ kde

P_t je složená permeabilita systému,

Pi je složka odpovídající samotným epitelovým buňkám,

P₂ je složka odpovídající filtru bez Matrigelu,

P₃ je složka odpovídající nemíchané vrstvě a

P₄ je permeabilita filtru potaženého Matrigelem .

V čistě difúzních systémech platí

P, = £ (4) o

kde

D je difúzní koeficient manitolu δ je součet tlouštěk nemíchaných vrstev.

Tloušťky nemíchaných vrstev jsou v ideálních podmínkách nezávislé na membránové permeabilitě, takže P₃ v rovnicích (3) a (4) jsou identické. Odečtením rovnic (2) a (3) je tak možné vypočítat permeabilitu epitelové monovrstvy podle

následující rovnice (5)

Pi _L

Pí ;5)

Analýza transformaci rozptylu byla provedena po hodnot permeability a přiřazení logaritmické hodnot pravděpodobnosti pro různá ošetření na základě testu nejmenší významné odchylky. Údaje geometrického průměru se experimentálních pozorování.

byla považována za statisticky významnou.

jsou uvedeny jako hodnoty střední chybou pro počet n Hladina pravděpodobnosti P<0,05

Příprava proteinázových frakcí z HMD kultivačního média

HMD proteinázové alergeny nebyly dosud připraveny v katalyticky kompetentní podobě rekombinantní buněčnou expresí zralých proteinů - enzymů. Kvůli výhodnosti a také pro pozdější screening potenciálních inhibitorů bez katalyticky aktivních rekombinantních proteinů ve velkém měřítku, cílem původců bylo separovat cysteinové a serinové proteinázy jednoduchou biochemickou frakcionací vyčerpaného média, ve kterém byly HDM pěstovány. V průběhu kultivace HDM uvolňují alergeny do média, což vede k akumulaci proteinů, které jsou vhodné pro purifikaci. Použité médium z kultur D. pteronyssimus (Commonwealth Sérum Laboratory, Parkwille, Australia) bylo rozpuštěno v 5násobném objemu solného roztoku pufrovaného fosfátem a pak centrifugováno 20 minut při 48400xg ve 4 °C. Postupně při současném promíchávání byl k supernatantu přidáván síran amonný při 4 °C, až do koncentrace odpovídající 50 % nasyceného roztoku. Po centrifugací (48400 g, 20 minut, 4 °C) byl pelet, který je bohatý na aktivitu cysteinové proteinázy, jak prokázal φ φ φφφφ » · · • φφφ

- 13 enzymatický test, rozpuštěn v minimálním objemu destilované vody. K supernatantu z prvního odběru byl přidán síran amonný až do 80 % nasycení. Pelet získaný další centrifugací, který byl bohatý na aktivitu serinové proteinázy, jak prokázal enzymatický test, byl rozpuštěn v minimálním objemu destilované vody. Frakce obsahující cysteinovou proteinázu (50% precipitát) a serinovou proteinázu (50-80% precipitát) byly odděleně dialyzovány proti destilované vodě přes noc a pak lyofilizovány před tím, než byly rozpuštěny v EMEM. Obsah proteinu v extraktech byl měřen pomocí barvení užitím sérového albuminu jako standardu 1985). Aktivita proteinázy byla měřena degradačním testem s Azocollem, jak bylo již jinde popsáno (Herbert et al. , 1995, Chavira et al., 1984). Extrakty byly také testovány na přítomnost endotoxinů pomocí testů lýze amebocytů Limulus (Enodtect™, ICN Biomedicals, Thame, Oxfordshire). Ve všech případech hladiny endotoxinů byly pod detekční hladinou testů (< 0,06 ng/ml).

Coomassie modří (Smith et al.,

Imunopřenos (immunoblotting) HDM proteinázových frakcí

Proteinázové frakce byly separovány pomoci SDS-PAGE a pak elektroforeticky přeneseny na nitrocelulózovou membránu. nespecifická vazba proteinů byla blokována 5% (hmot./objem) netučným mlékem a 0,1% (objem.) Tween-20 v solném roztoku pufrovaném Tris (TBS). Pak následovala inkubace s mAB 5H8 (anti-Der pl) naředěné v TBS s 2% (hmot./objem) hovězím sérovým albuminem a 0,1% (objem.) Tween-20. Detekce byla provedena chemiluminiscenční technikou (Amersham International, Buckinghamshire).

- 14 •· 9 99 9 • 9 • · · · • ·

dny v EMEM Pak byly buňky

Testy buněčné smrti

Buňky byly vysety na Petriho misky 60 x 15 mm a kultivovány jako buněčné kultury 2 až obsahujícím sérum v atmosféře s 5% CO2.

přeneseny do EMEM bez séra s 20mM HEPES a kultivovány aerobně ve 37 °C. V definovaných časových intervalech byly buňky sklizeny škrabkou a sloučeny se supernatantem s volnými buňkami. Buňky pak byly centrifugovány 5 minut při 550xg a byla z nich extrahována DNA (Nucleon Coatbridge, Stratchclyde). Extrahovaná

II, Scotlab, DNA byla (lOOmM Tris-Cl a resuspendována ve 100 μΐ

TE pufru lmM Na₂EDTA) přes noc při teplotě místnosti a její čistota byly určena spektrofotomericky. Shodná množství DNA naředěné 4:1 s nanášecím pufrem (0,25% bromfenolová modř, 40% (hmot./objem) sacharóza ve vodě) byly naneseny do jamek ve 2% (hmot./objem) agarózovém gelu a pak rozděleny elektroforézou 2 až 3 hodiny při 50 V v TAE pufru (0,04M tris-acetát a 0,001M EDTA). Pásy DNA na gelu (které inkorporovaly etidiumbromid) byly vizualizovány pomocí ultrafialového světla.

Redistribuce fofatidylserinu do vnější vrstvy buněčné membrány, ke které dochází při iniciaci apoptózy (buněčné smrti) byla zkoumána pomocí barvení annexinem V. To bylo provedeno na Petriho miskách 60 x 15 mm, které byly upraveny tak, že do dna byl vyvrtán otvor o průměru 1 cm, který byl zvenčí zakryt krycím sklíčkem upevněným pomocí Sylgardu (Dow Corning, Midland, MI, ISA). Polyamidový kroužek byl přilepen kyanoakrylátovým lepidlem na vnitřní stranu misky, čímž vznikla jamka se skleněným dnem, která pak byla potažena ultratenkou vrstvou Matrigelu. Buňky (po 3 x 10⁴) byly umístěny do jamek a ponechány růst 2 až 3 dny, pak byl

- 15 • ·

proveden požadovaný experimentální zásah. Poté byly buňky opláchnuty PBS a bylo přidáno 200 μΐ vazebného pufru před přidáním annexinu V-FITC (AV) a propidiumjodidu (PI) za tlumeného světla. PO 15minutové inkubaci byly buňky opláchnuty vazebným pufrem a prohlédnuty fluorescenční mikroskopií užitím modrého a sady zeleného excitačního filtru (Zeiss Axiovert 10 s objektivem Fluar s olejovou imerzí). Užité této techniky vedlo k tomu, že buňky v časném stádiu apoptózy se barvily zeleně, neboť anexin V konjugovaný s FITC se váže na fosfatidylserin, které je přesouván do vnějších vrstev buněčné membrány (Fadok et al., 1992, Koopman et al., 1994, Vermes et al. , 1995, Homburg et al. , 1995) . Mrtvé buňky se PI zbarvují červeně vzhledem k tomu, že zvýšena permeabilita jaderné membrány dovoluje navázání PI na nukleové kyseliny. Fotografická dokumentace byla provedena kamerou Contax 167MT a filmem Kodak TMAX 400 pro černobílou fotografii nebo Ektachrome 160T pro barevné diapozitivy.

Aktivita LDH byla měřena užitím pyruvátu jakožto substrátu a spektrofotometrickým měřením tvorby fenylhydrazonového derivátu laktátu. Buňky MDCK nebo Calu-3 byly vysety na 12jamkové misky a kultivovány do konfluentního stavu. Buněčné monovrstvy byly po 18 hodin buďto vystaveny kontrolním podmínkám (EMEM bez sér- a bez fenolové červeně, s 0,6mM dithiotreitolem v případě kontroly u frakce s cysteinovou proteinázou) nebo působeni HDM proteinázové frakce naředěné ve stejném médiu (s 0,6mM dithiotreitolem v případě frakce s cysteinovou proteinázou). Na konci experimentu bylo inkubační médium odebráno a centrifugováno při teplotě místnosti, aby se odstranily všechny buňky, které se z jamek uvolnily. První frakce supernatantu byla testována přímo na aktivitu LDH, zatímco pelet vytvořený z uvolněných • · 0 0 • · · » • · · · · · · • 0 0 0 buněk byl hypotonicky lyžován destilovanou vodou (5 minut při teplotě místnosti) a pak krátce centrifugován k odstranění zbytků buněk. Výsledný druhý supernatant byl také testován na LDH aktivitu. Buňky, které zůstaly přisedlé v jamkách během experimentu, byla lyžovány jak bylo popsáno výše a pak byla testována LDH aktivita. Vzhledem k tomu, že u kontrol nebylo pozorováno uvolňování buněk, celková buněčná aktivita LDH byla definována jako samotná aktivita přítomná v lyzátu z adherentních buněk v EMEM bez séra a bez fenolové červeně.

Imunocytochemická vizualizace účinků inhibitorů na proteázou zprostředkované štěpení interceluláních spojů

Ke zkoumání účinků proteináz a inhibitorů na intercelulární spoje byly buňky MDCK kultivovány na krycích sklíčkách a podrobeny působení příslušné proteinázy a/nebo inhibitoru po požadovaný časový interval. Buňky byly fixovány v ledovém metanolu před navázáním potkanních monoklonálních protilátek anti-ZO-1 (mAb R40.76) (Stevenson et al., 1986, Anderson et al., 1988) a myších monoklonálních protilátek anti-desmoplakin (mAb 11-5F)(Parrish et al, 1987). Nepřímé fluorescenční značení protilátek bylo provedeno pomocí FITC a TRITC konjugovaných k sekundární protilátce, mikroskopická analýza byla provedena mikroskopem Zeiss Axiovert 10 s objektivem Fluar s olejovou imerzí se zvětšením 40x. Vzorky byly osvětleny pomocí sad excitačních a emisních filtrů pro FITC a TRITC. Buňky byly fotografovány, jak bylo popsáno výše.

Materiály

Všechna média a reagencie pro buněčné kultury byly zakoupeny od fimy ICN Biomedicals, Ltd (Thame, Oxfordshire), pokud není specificky uvedeno jinak. HBSS byla získána od • ♦ ··· · ► · · • · ··

GobcoBRL, Life technologies Ltd. (Paisley) . Manitol a Triton X-100 byly od Sigma Aldrich Ltd. (Poole, Dorset) a tepelně inaktivované telecí fetální sérum bylo od Labtech International Ltd. (Uckfield, East Sussex). Matrigel byl získán od Universal Biologicals, Londýn.

Měření clearance manitolu byla prováděna pomocí destiček Tranwells s jamkami o průměru 12 mm s membránou o síle 10 gm a velikosti póru 0,4 gm (Costar UK Ltd., High Wycombe,

Buckinghamshire)

D-[¹'¹C]manitol byl získán od NEN DuPont

Research Products (Stevenage, Hertfordshire) a scintilační koktejl Opti-Fluor a scintilační viálky od Canberra Packard Ltd. (Pangbourne, Berkshire) . Buňky MDCK byly namnoženy ze zásobního kmene v laboratoři původců. Buňky Calu-3 byly původně získány z Americké sbírky mikroorganismů ATCC (Rockville, MD, USA) a řadou pasážování byly namnoženy a vytvořena lokální banka kryoprezervovaných buněk. Buňky byly, v závislosti na povaze experimentu, kultivovány v kultivačních lahvích pro buněčné kultury Falcon 75 cm² (Marathon Laboratory Supplies, Londýn), vícejamkových kultivačních destičkách firmy Costar nebo inzertech Transwell. Agaróza (čistota pro molekulární biologii) byla od firmy Promega (Southampton, Hamshire). Souprava pro testování LDH byla od Sigma, soupravy Apoalert byly od Cambridge Bioscience. Akridinová oranž, etidiumbromid a další obecné laboratorní reagencie byly získány od BDH (Poole, Dorset).

E-64 (L-trans-epoxysukcinyl-leucylamid-(4inhibitor cysteinových proteináz, byl Koncentrované vodné roztoky byly až do použití uchovány v zamraženém stavu. Inhibitor serinové proteinázy 4-(2-aminoetyl)-benzensulfonylfluorid hydrochlorid (AEBSF) byl získán od Pentapharm, Basilej, Švýcarsko. BB-250 ([4-(N-hydroxyamino)-2R-isobutyl-3S-(thiopen-2-yl-sulSloučenina guanidino)-butan), získán od Sigma.

00

0 1

0 1

0 <

» 0 0 4

0 00

I 000 · • 0 • 0 ·· » 0

- 18 fonylmetyl) sukcinyl]-L-fenylalanin-N-metylamid) , tj . inhibitor metaloproteináz mimobuněčné hmoty (MMP) byl získán od British Biotech Pharmaceuticals Ltd. všechny inhibitory byly připraveny jako koncentrované zásobní roztoky v suchém Me₂SO a naředěny médiem podle potřeby těsně před použitím. Vhodné kontroly pro vehikulum Me₂SO byly také součástí experimentů. Monoklonální protilátky R40.76 reaktivní proti ZO-1 laskavě poskytl Dr. Bruče Stevenson, University of Alberta. Monoklonální protilátka 5H8 proti Derpl byla laskavým darem od Dr. Martina Chapmana, University of Virginia, USA.

Výsledky

Frakcionace média užitého pro kultivaci roztočů

Médium, které bylo použito pro kultivaci roztočů, bylo separováno na 2 frakce precipitací síranem amonným. Frakce získaná precipitací 50% síranem amonným obsahovala hlavní proteinovové pásy velikosti přibližně 22 kDa a 38 kDa (obr. la, dráha 2) . Testy enzymtické degradace pomocí chromogenního substrátu ukázaly, že katalytická aktivita 50% precipitátu byla inhibovatelná E-64 (není zde ukázáno). Imunopřenosová analýza 50% precipitátu užitím mAb 5H8 připravené proti Derpl ukázala přítomnost hlavního pásu se zjevnou molekulovou hmotností 22 kDa a méně významný pás velikosti 38 kDa (obr. lb, dráha 2). Při analýze pomocí SDSPAGE a imunopřenosu se frakce cysteinové proteinázy chovala stejně jako Der pl purifikovaná kombinací imunoafinitní chromatografíe, gelové filtrace a isoelektrické fokusace (srovnej dráhy 1 a 2 na panelech A, B obr. 1). Srovnání dráhy 2 a 3 na imunopřenosu, uvedené na obr. lb, ukazuje, že monoklonální protilátka 5H8 reaguje také s celým rozsahem proteinů přítomných v precipitátu s 50-80% síranem amonným.

φφ φφφφ • φ φ φ ΦΦΦ φ φ φ • ·* φφ φφ • · φ φ φ φ φ ♦ φ φ φ · φ φ φ φ φ φ φ φ

- 19 precipitovaná katalytickou archetypových

V nepřítomnosti redukujícího činidla frakce 50-80% síranem amonným vykazuje vysokou aktivitu, která byla zeslabena inhibitory serinových proteináz (není zde ukázáno). Pro zjednodušení popisu je v dalším textu frakce precipitovaná 50 % označena jako frakce cysteinové proteinázy a frakce precipitovaná 50-80 % označena jako frakce serinové proteinázy.

Účinky HDM proteinázových frakcí na epiteliální permeabilitu

V kontrolních podmínkách v tomto experimentu jak buňky MDCK tak epiteliální buňky Calu-3 vytvářely těsně zapojené monovrstvy s permeabilitou pro manitol v rozmezí 0,7 až 1,2 x 10⁶ cm s^-1. Expozice MDCK nebo Calu-3 buněčných monovrstev působení frakce serinové proteinázy vedlo ke změně permeability, která byla závislá ne koncentraci (obr. 2). Koncentrační závislost frakce cysteinové proteinázy nebyla testována v této sérii pokusů, ale účinek čistého cystein-proteinázového alergenu Derpl byl již dříve prokázán v laboratoři původců na podobných modelech in vitro (Herbert et al., 1990, 1995).

Účinky frakce cysteinové proteinázy na monovrstvu buněk MDCK byly zeslabeny inhibitorem cysteinové proteinázy E-64 (obr. 3a). E-64 přitom neměl žádný pozorovatelný účinek na vnitřní permeabilitu monovrstvy (obr. 3a) . Inhibitory serinových proteináz AEBSF a, méně účinně i SBTI, inhibovaly působení frakce serinové proteinázy na buňky MDCK (obr. 3b). Žádný inhibitor sám o sobě nejevil účinek na epiteliální permeabilitu (obr. 3b) . Inhibitory byly také účinné, když byly testovány ve stejné koncentraci na monovrstvě buněk Calu-3. Monovrstva buněk Calu-3 pod vlivem frakce cysteinové proteinázy měla permeabilitu pro manitol 8,44 ± 0,43 x 10~⁶ cm s'¹, která byla snížena působením E-64 na 4,84 ± 0,32 x · ♦* * · • · · • ··· ··

10^-6 cm s^-1 (P<0,05, n=5) . Monovrstva buněk Calu-3 pod vlivem, frakce serinové proteinázy měla permeabilitu pro manitol 18,1 ± 0,02 x 10'⁶ cm s“¹, která byla snížena působením AEBSF na 10,20 ±0,01 x 10“⁶ cm s“¹ (P<0,05, n=5) .

Inhibitory proteináz specifické pro třídy byly účinné jen proti analogickým enzymovým frakcím získaným z HDM kultur. Obr. 4 ukazuje, že AEBSF v koncentraci, která odstranila účinek frakce serinové proteinázy, neinhibovala aktivitu frakce serinové proteinázy na monovrstvě buněk Calu-3. A naopak, E-64 neinhibovala změny permeability způsobené frakcí serinové proteinázy (obr. 4).

Obr. 5 ukazuje, že působení jak frakce cysteinové tak frakce serinové proteinázy na monovrstvu buněk MDCK vedlo k narušení normálního vzorce souvislého periferního barvení TJ proteinu ZO-1 a skvrnitého barvení desmoplakinu. Přidání E-64 k frakci cysteinové proteinázy nebo AEBSF k frakci serinové proteinázy inhibovalo změny závislé na proteináze (obr. 5).

HDM proteinázy způsobují buněčnou smrt v epitelu

Kontrolní inkubace monovrstev buněk MDCK nebo Calu-3 po dobu 18 hodin v EMEM bez séra vedla k minimálnímu uvolnění LDH aktivity, dokud nebyly buňky hypotonicky lyžovány na konci pokusu (ob. 6) . Působení frakcí cysteinové a serinové proteinázy na oba typy buněk také nevedlo k významnému uvolnění LDH do inkubačního média (obr. 6), i přes to, že některé buňky se uvolnily od původního nosičového substrátu v průběhu pokusu. Lýze uvolněných buněk a adherentních buněk vedla k získání LDH, které bylo ekvivalentní množství nacházející se v lyzátech neošetřených buněk (obr. 6).

Buněčná smrt byla zkoumána pomocí fragmentace DNA a barvením buněk pomocí AV a PI. Obr. 7a, 7b ukazují důkazy • ♦ · · • · · · • Β »«·· • ·

9 99

9

9 9 9

99

- 21 fragmentace DNA v buňkách MDCK a Calu-3 po ošetření HDM proteinázami v podmínkách, které vedly ke zvýšené permeabilitě epiteliální monovrstvy. Účinek obou HDM proteinázových frakcí byl zeslaben inhibitorem matrixových metaloproteináz BB-250 (obr.¹ 7b). E-64 inhiboval účinek frakce cysteinové proteinázy, ale nikoliv účinek frakce serinové proteinázy (obr. 7b). Obr. 7 také ukazuje, že ošetření buněk MDCK nebo Calu-3 frakcí serinové proteinázy vedlo k tomu, že některé buňky vázaly samotný annexin-V (AV⁺PI~) , což by ukazovalo na časnou apoptózu těchto buněk, a jiné buňky se barvily jak annexinem V tak i PI (AV⁺PI ⁺ ) , byly již apoptické (viz obr. 7 d, f, h, j). Prostorová distribuce časně apoptických buněk AV⁺PI~ a již odumřelých buněk AV⁺PI⁺ byla nahloučena v oblastech, kde byla viditelně narušena buněčná adheze (viz obr. 7 d, f).

Diskuse

Proteiny fekálních peletu HDM jsou hlavní příčinou alergického astmatu (Tovey et al., 1981) a z velké části odpovídají za zvyšující se výskyt tohoto onemocnění (Dowse et al., 1985). V této studii bylo prokázáno, že proteinázy z fekálních pelet D. pteronyssinus vykazují významné biologické účinky na epiteliální buňky. HDM proteinázy byly frakcionovány precipitací se síranem amonným na frakci (třídu) cysteinové a serinové proteinázy . Obě frakce měly podobné účinky v experimentálním systému použitém k tomuto výzkumu. Vedly ke zvýšení permeability monovrstvy epiteliálních buněk, způsobovaly rozrušení postranních buněčných spojení a uvolňovaly buňky od biologického nosiče. Štěpení mezibuněčných spojení a uvolňování od nosiče nebylo sice spojeno s podstatným uvolnění LDH aktivity, ale byly zjištěny příznaky časné apoptózy a naprostého odumření buněk

9 9 9 9 9

9 9

9 9

99 • 9 * 9

9

999 99 s rupturou jádra. Vyšetření buněk barvených AV a PI ukázalo, že barvení bylo lokalizováno do oblastí narušení buněk nebo buněčných spojů, dále bylo ukázáno, že apoptóza buněk může být zmírněna inhibitory proteináz.

Precipitace síranem amonným se ukázala být účinným prostředkem pro separaci hlavních tříd proteinázových aktivit ve spotřebovaném kultivačním médiu. Frakce precipitovaná 50% síranem amonným obsahovala aktivitu cysteinové proteinázy a zvyšování permeability epiteliální monovrstvy jejím působením bylo inhibováno E-64, ale nikoliv AEBSF, inhibitorem serinové proteinázy. Analýza SDS-PAGE a ímunopřenos s monoklonální protilátkou 5H8 proti HDM alergenu Der pl (cysteinová proteináza) ukázaly v této frakci přítomnost pásů odpovídajících molekulové hmotnosti 22 kDa a 38 kDa. Naproti tomu frakce precipitovaná 50-80% saturovaným síranem amonným vykazovala aktivitu serinové proteinázy a její účinek na epiteliální permeabilitu byl inhibován vlivem AEBSF, a v menší míře i SBTI, ale nikoliv E-64. Z těchto studií s inhibitory lze konstatovat, že zde byla minimální kontaminace této frakce cystein-proteinázovým alergenem. Analýza SDS-PAGE a ímunopřenos prokázaly několik proteinových pásů ve frakci serinové proteinázy, z nichž některé byly rozpoznávány monoklonální protilátkou 5H8 (např. pásy se zjevnou molekulovou hmotností 22, 26, 28, 29 a 38 kDa. Monoklonání protilátka 5H8 se široce užívá k purifikaci a kvantifikaci Der pl, ale její specifita byla nedávno zpochybněna (Cambra a Barrens, 1996). Takže náhodné zjištění z této studie je příčinou dalších úvah o specifitě této protilátky. Proteinové pásy detekované ve frakci precipitované 50-80% síranem amonným jsou v souladu s přítomností serin-proteinázových alergenů Der p3, Der p6, Der p9. Na základě těchto zjištění lze uzavřít, že

9

9

9

9

9

9

9 frakcionace síranem amonným extraktů z kultur HDM poskytuje jednoduchý a účinný prostředek ke studiu biologických účinků HDM proteinázových alergenů a také pro identifikaci nových inhibitorů těchto proteináz.

Již dříve bylo původci předkládaného vynálezu ukázáno, že vysoce purifikovaný alergen Der pl indukuje zvýšení transepiteliálního toku sérového albuminu ve sliznici dýchacích cest, způsobuje narušení epiteliální architektury a uvolňuje buňky MDCK od substrátu jakým je přírodní biopolymer (Herbert et al., 1990, 1995) . Bylo také ukázáno, že tyto účinky Der pl jsou důsledkem aktivity cysteinové proteinázy , neboť jsou citlivé na působení inhibitoru E-64, což je relativně specifický inhibitor většiny cysteinových proteináz (Barrett et al., 1982, Shaw, 1994, Herbert et al., 1995) . Ačkoliv srovnání aminokyselinových sekvencí predikuje, že Der pl je pravděpodobně cysteinová proteináza (Chua et al., 1988, 1993, Stewart, 1994, Topham et al., 1994, Robinson et al, 1997), jiní předpokládali, že může působit jako bifunkční cystein-serinová proteináza, neboť byla popsána její inhibice také APMSF, což je inhibitor serinových proteináz (Hewitt et al., 1995, 1997). Pokud je to pravda, tato předpokládaní bifunkční aktivita by měla velmi důležité důsledky pro návrh specifického inhibitoru Der pl. Avšak na základě zde popsaného výzkumu původci argumentují proti předpokládané bifunkční aktivitě, neboť bylo ukázáno, že (I) frakce cysteinové proteinázy z HDM kultur nebyla inhibována AEBSF v koncentracích, které významně inhibují aktivitu frakce serinové proteinázy , a (II) frakce serinové proteinázy je rezistentní k inhibici E-64 v koncentracích, ve kterých tento inhibitor blokuje aktivitu cysteinové proteinázy. Další důkazy proti tomu, že Der pl je smíšená «9 *00« • * • · «· • 9 9 ··»»»··» « · ······· «,'·· ·»· *00 99 99 99

- 24 cystein-serinová proteináza byl také nedávno publikovány (Chambers et al., 1997).

Permselektivita bronchiálního epitelu pro hydrofilní soluty je určena TJ, které jsou exprimovány po obvodu apikálního pólu každé buňky (Schneeberger a Lynch, 1992). Souvislá exprese TJ proteinů na jedné buňce a jejich blízká poloha vůči TJ proteinům na sousední buňce způsobují, že se epitel se vyvíjí jako velmi těsná struktura (Anderson a Van Itallie 1995, Robinson 1995). Narušení interakcí TJ proteinů mezi buňkami, např. vytvořením mezer v jejich lokalizaci po obvodu spoje, je spojeno s porušením těsnosti epiteliální bariéry (Howarth et al., 1994, Zhong et al., 1994, Stuart et al., 1994, Stuart and Nigam 1995). Obě frakce HDM proteináz použité v předkládané studii způsobovaly rozpad TJ, jak se dalo soudit na základě ztráty zabarvení ZO-1 v okolí spojů, bylo také pozorováno narušení desmosomů. Rozpad TJ vedl ke zvýšení permeability epiteliální monovrstvy a nakonec došlo k fyzickému odloučení buněk od substrátu. Ztráta ZO-1 z TJ a desmoplakinu z desmosomů byla závislá na exogenní proteinázové aktivitě, neboť celý proces byl zeslaben E-64 (v případě frakce cysteinové proteinázy) a AEBSF (v případě frakce serinové proteinázy). Ačkoliv ZO-1 a desmoplakin jsou intracelulární proteiny a tudíž pravděpodobně nejsou degradovány exogenními proteinázami, jejich rozpad je vysvětlitelný jako důsledek narušení jiných, na membráně exponovaných, složek TJ a desmosomů. Má se za to, že podobný mechanismus zodpovídá za změny jiných intracelulárních proteinů po narušení intercelulárních kontaktů (Volk et al.,

1990).

Účinek proteináz nevedl k významnému uvolnění LDH z buněk. Avšak působení obou proteinázových frakcí vedlo *· φφφφ » · · • ··· • * • φφ ·· φφ φφφφ φφφφ φφφ φφφφ φφ φφφ ·Φ · φφφ φ- · φ φ φφφ φφ φφ Φ· k tomu, že u některých buněk s projevily příznaky časné apoptózy (AV+PI-) nebo úplná buněčná smrt (AV+PI+). Buňky vstupují do apoptózy mnohými mechanismy (viz přehled hale et al., 1996), ke kterým patří také změny v heterotypické i homotypické buněčné adhezi a ve spojení mezi buňkami a extracelulární hmotou (matrix)(Boudreau et al., 1995, 1996, Mahida et al., 1996, Frisch a Francis 1994). Časnou signalizační událostí v průběhu programované buněčné smrti je narušení proteinů vázajících se na fosfolipidy v cytoskeletu, což vede ke transmembránové redistribuci fosfatidylserinu (martin et al., 1995). Rámec proteinů cytoskeletu je normálně stabilizována a omezován přímými interakcemi s proteinovými složkami intercelulárních spojů Anderson a Van Itallie, 1995), (Furuse et al., 1994, což vede k domněnce, že proteolýza intecelulárníchj adhezi, zejména TJ, by mohla být kritickým momentem v organizaci buněčné odpovědi na proteinázové alergeny. Schopnost E-64 inhibovat působení cysteinové proteinázy, ale nikoliv serinové proteinázy, naznačuje, že E-64 působí v některém proximálním kroku celého procesu vedoucího ke změně permeability a apoptóze, spíše než že inhibuje distální proteolytický krok v mechanismu transdukce. Kromě toho intracelulámí signální proteinázy rodiny ICE/ced-3 kaspázy, které jsou mj . aktivovány navázáním fas/APO-1 v apoptóze (Los et al., 1995, Mariani et al. , 1995, Kayagaki et al., 1995, Tanaka et al., 1996), mají netypický inhibitorový profil, neboť jsou necitlivé k E-64. Naproti tomu, inhibiční působení BB-250 se může projevit tím, že zabrání uvolnění ligand Fas (Mariani et al., 1995, Kayagaki et al., 1995).

Senzibilizace (vznik vnímavosti) plic na vzduchem přenášené alergeny jako jsou HDM je hlavní příčinou • · ···· · ·· ·· · · • · · · · · · · « · · ···· ·· · · ·· ·

alergického astmatu. Plicní epitel vyváří bariéru, kterou musí projít cizorodé proteiny před tím, než mohou způsobit alergickou senzibilizaci, přičemž ale tento mechanismus, kterým alergeny procházejí epiteliální bariérou, je jen velmi nedokonale poznán (Robinson et al., 1997). Enzymatická povaha proteinů pocházejících z fekálních pelet HDM poskytuje jedno vysvětlení mechanismu, kterým alergeny napadají imunitní systém. Tím, že způsobují ohniskové narušení těsných spojů, a nakonec i ztrátu odumírajících buněk, proteinázy HDM jsou schopné zvýšit paracelulární pronikání alergenů do buněk prezentujících antigen. Je významné, že lokalizované trauma a buněčná smrt, ke kterým dochází v důsledku proteolytického štěpení intercelulárních spojů by mohly splňovat některé předpoklady modelu nebezpečí adaptivní imunitní reakce a tak vysvětlit, proč je vyvolána protilátkami řízená reakce (Matzinger 1994, Ridge et al., 1996). Jako další podpora tohoto názoru, nedávné důkazy ukázaly, že když apoptóza (často považovaná za imunologicky umlčenou formu buněčné smrti) se objevuje v přítomnosti poškození tkání, výsledný kombinovaný stimul je skutečně hrozbou pro antigen prezentující buňky (Boockvar et al., 1994, Casciola-Rosen et al., 1994, Ibrahim et al., 1996).

Nakonec lze shrnout, že výsledky ukázaly, že HDM proteinázy měly na epiteliální buňky takové účinky, které pravděpodobně podporují alergickou senzibilizaci. Schopnost specifických inhibitorů zrušit reakci epitelových buněk na proteinázové alergeny představuje racionální základ pro prevenci a/nebo léčení alergií.

- 27 Popis obrázků

Obrázek 1

Analýza SDS-PAGE (panel a) a imunopřenosem (imunoblot, panel b) HDM proteinázových frakcí.

Popis jednotlivých drah na panelu a: imunoafinitně purifikovaný Der pl (1), frakce cysteinové proteinázy HDM (2), frakce serinové proteinázy HDM (3). Proteiny byly vizualizovány barvením Coomassie modří.

Panel b ukazuje imunoblot připravený z gelu ukázaného na panelu a. Proteiny byly detekovány pomocí monoklonální protilátky 5H8 (anti-Der pl) a vizualizovány technikou ECL. Na obrázku je vidět, že ve frakci serinové proteinázy byly pomocí mAb 5H8 detekovány další imunoreaktivní proteiny kromě očekávaných imunoreaktivních proteinů ve frakci cysteinové proteinázy. Plné kroužky ukazují zjevné molekulové hmotnosti pásů vypočtené na základě mobility hmotnosti obarvených standardů.

Obrázek 2

Závislosti odezvy na ředění (dilution-response curve) na tomto obrázku ukazují účinek 18hodinové expozice monovrstvy buněk působení frakce serinové proteinázy z kultur HDM.

Panel a ukazuje permeabilitu vrstvy buněk MDCK pro manitol v kontrolních podmínkách (samotné médium EMEM bez séra) a po ošetření (proteinázová frakce naředěná v médiu EMEM bez séra).

Panel b ukazuje výsledek podobné studie provedené s buňkami bronchiálního epitelu Calu-3.

Uvedené hodnoty představují průměr ± střední chyba průměru ze 4 až 6 měření. Aktivita proteinázového alergenu • 9 · · · 9 · · • 9

- 28 (uvedená v jednotkách azocoll/ml) je uvedena pod sloupci v grafu. Hvězdička znamená statisticky významný rozdíl ve srovnání s neošetřenou kontrolou (tj . v samotném médiu EMEM bez séra) pro každý buněčný typ.

Obrázek 3

Inhibice účinků proteinázových frakcí HDM na permeabilitu monovrstvy buněk MDCK pro manitol.

Panel (a) ukazuje účinek E-64 (10 μΜ) na působení frakce cysteinové proteinázy (80 azocoll jednotek/ml). Kontrolní buňky byly vystaveny působení média EMEM bez séra obsahujícího 0,5mM redukovaný glutathion.

Panel (b) ukazuje účinek AEBSF (100 μΜ) na působení frakce serinové proteinázy (127 azocoll jednotek/ml).

Uvedené hodnoty představují průměr ± střední chyba průměru ze 3 až 5 případech 18 hodin měření. Kontaktní čas byl ve všech V obou panelech (a) a (b) byly statisticky významné rozdíly mezi permeabilitami kontrolní a proteinázami ošetřené buněčné monovrstvy a také mezi permeabilitami proteinázami ošetřené v přítomnosti a nebo bez inhibitorů, rozdíly jsou znázorněny závorkami statistické pravděpodobnosti.

buněčné monovrstvy Statisticky významné a uvedením hladiny

Obrázek 4

Panel (a) ilustruje účinek 100 μΜ AEBSF na změnu permeability pro manitol u monovrstvy buněk Calu-3 po 18hodinovém působení frakce cysteinové proteinázy (80 azocoll jednotek/ml). Uvedené hodnoty představují průměr ± střední chyba průměru ze 3 měření.

Panel (b) ilustruje účinek 10 μΜ E-64na změnu ·· · · · · · ·· · · · · ··· · · · · · · · · permeability pro manitol u monovrstvy buněk Calu-3 po 18hodinovém působení frakce serinové proteinázy (94 azocoll jednotek/ml). Uvedené hodnoty představují průměr ± střední chyba průměru ze 3 měření.

V obou případech byly kontrolní buňky vystaveny působení samotného média EMEM bez séra (obsahujícího v případě cysteinové proteinázy 0,5mM redukovaný glutathion).

Obrázek 5

Imunoznačení TJ proteinu ZO-1 (panely a - e) a proteinu desmosomálních plaků desmoplakinu (panely f - j) v monovrstvě buněk MDCK.

Panely a, f ukazují imunoznačení kontrolních buněk vystavených působení samotného média EMEM bez séra. Vzorec značení po působení frakce cysteinové proteinázy (80 azocoll jednotek/ml) je ukázán na panelech b, g a modifikace této reakce vlivem E-64 (10 μΜ) na panelech c,h. Vzorec značení po působení frakce serinové proteinázy (94 azocoll jednotek/ml) je ukázán na panelech d, i a modifikace této reakce vlivem AEBSF (100 μΜ) na panelech e, j .

Obrázek 6

Měření uvolňování LDH po 18hodinovém působení frakcí proteináz HDM na buňky Calu-3 a MDCK.

Panel (a) ukazuje, že u buněk v kontrolních podmínkách nedocházelo k uvolňování LDH z buněk dokud nebyla buněčná monovrstva podrobena hypotonické lýzi. Panel (a) ukazuje také, že působení frakce cysteinové proteinázy (80 azocoll jednotek/ml po aktivaci 0,5 μΜ redukovaným glutathionem) nevedlo k uvolňování LDH do média v průběhu celé doby působení. V průběhu pokusu byly všechny buňky odloučeny od jamek a že hypotonická lýze volných buněk vedla ke stejné

hodnotě aktivity LDH jaká byla naměřena u kontrolních buněk.

Panel (b) ilustruje podobný experiment, kdy byla užita frakce serinové proteinázy (114 azocoll jednotek/ml). je vidět, že ne všechny buňky se odloučily v průběhu pokusu, ale součet aktivity LDH v lyžovaných přisedlých a lyžovaných volných buňkách odpovídal hodnotě detekované u kontrolních buněk.

Panely (c) a (d) ukazují obdobné experimenty provedené s buňkami Calu-3. Je vidět, že v kontrolních podmínkách existovalo slabé základní uvolňování LDH z těchto buněk (< 10 % celkové buněčné LDH), které nebylo významně změněno působením proteináz. Uvedené hodnoty představují průměr ± střední chyba průměru ze 4 měření.

Obrázek 7

Elektroforéza DNA na agarózovém gelu (panely a, b) a barvení buněk pomocí AV a PI (panely c - j) po ošetření buněk MDCK a Calu-3 proteinázovými frakcemi HDM.

Panel (a) ukazuje proteinázami indukovanou fragmentaci DNA v buňkách MDCK. Popis jednotlivých drah: DNA markéry (1, 10), neošetřené buňky (2, 3), buňky po 18hodinovém působení camptothecinu jako pozitivní kontroly (4, 5), buňky po 18hodinovém působení frakce serinové proteinázy (114 azocoll jednotek/ml)(6, 7) a buňky po 18hodinovém působení frakce cysteinové proteinázy (80 azocoll jednotek/ml po aktivaci) (8, 9) .

Panel (b) ukazuje fragmentaci DNA u buněk Calu-3. Popis jednotlivých drah: DNA markéry (1, 11), neošetřené buňky (2), buňky po IShodinovém působení frakce serinové proteinázy (94 azocoll jednotek/ml)(3), buňky po 18hodinovém působení frakce cysteinové proteinázy (80 azocoll jednotek/ml po aktivaci)(4), neošetřené buňky v přítomnosti BB-250 (5 μΜ) φφφφ φ ·· φ φ · φ • · φφφφ · · φ · • · · φ φ φ · · φ φ · • · ·······

Φ·ΦΦ ·«« ··· φφ φφ φφ

- 31 (5) , buňky jako ve (3) ale ošetřené v přítomnosti 5 μΜ BB-250 (6) , buňky jako ve (4) ale ošetřené v přítomnosti 5 μΜ BB-250 (7) , neošetřené buňky v přítomnosti 10 μΜ E-64 (8) , buňky jako ve (3) ale ošetřené v přítomnosti 10 μΜ E-64 (9), buňky jako ve (4) ale ošetřené v přítomnosti 10 μΜ E-64 (10).

Panely c -f ukazují fluorescenční mikroskopii po barvení AV a Pl (e,f) monovrstvy buněk Calu-3 v kontrolních podmínkách (c, e) a po 18hodinovém působení frakce serinové proteinázy (135 azocoll jednotek/ml)(d, f).

Panely c, d ukazují vzorec barvení při modrém excitačním světle a e, f to samé při zeleném excitačním světle.

Panely g - j ukazují příklady monovrstev buněk MDCK analogické panelům c - f.

U obou buněčných typů nedošlo u neošetřených buněk prakticky k žádnému obarvení AV ani Pl. Na panelech d, f je vidět vzorec barvení, který obklopuje oblast odloučení buněk z monovrstvy a některé buňky jsou obarveny jak AV tak i Pl.

Na panelech h - j je většina obarvených buněk pozitivních jak na AV tak i Pl a nedošlo k žádnému evidentnímu odloučení buněk od substrátu.

/

,.

• · · · · » • · · · • · · · ♦ » · • · ·

9 99

Seznam citované literatury

ANDERSON, J.M., STEVENSON, B.R., JESAITIS, L.A., GOODENOUGH, D.A. & MOOSEKER, M.S. (1988). Characterization ofZO-1, a protein component of the tight junction mouše liver and Madin-Darby canine kidney cells. J. Cell Biol., 106, 1141-1149.

ANDERSON, J.M. & VAN ITALL1E, C.M. (1995). Tight junctions and the molecular basis for regulation of paracellular permeability. Am. J. Physiol., 269, G467-475.

BARRETT, A.J., KEMBHAVI, AA., BROWN, M.A., KIRSCHKE, H., KNIGHT, C.G., TAMAI, M. & HANADA, K. (1982). L-/ram>-Epoxysuccinyl-leucylamido(4guanidino)butane (E-64) and its analogues as inhibitors of cysteine proteinases including cathepsins Β, H and L. Biochem. J., 201, 189-198.

BOOCKVAR, K.S., GRANGER D.L., POSTON, R.M., MAYBODI, M., WASHINGTON M.K., HIBBS, J.B.Jr. & KURLANDER, R.L. (1994). Nitric oxide produced during murine listeriosis is protective. Infecl. Immun., 62, 1089-1100.

BOUDREAU, N., WERB, Z. & BISSELL, M.J. (1996). Suppression of apoptosis by basement membrane requires three-dimensional tissue organization and withdrawal from the cell cycle. Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 93, 3509-3513.

BOUDREAU, N., SYMPSON, C.J., WERB, Z. & BISSELL, M.J. (1995). Suppression of ICE and apoptosis in mammary epithelial cells by extracellular matrix. Science, 267, 891-893.

CASCIOLA-ROSEN, L.A., ANHALT, G. & ROSEN, A. (1994). Autoantigens targeted in systemic lupus erythematosus are clustered in two populations of surface structures on apoptotic keratinocytes. J. Exp. Med., 179, 1317-1330.

·· · · • 9 · 9 • 9 9 · • · · · 9 · *·

- 33 CHAMBERS, L., SUNEAL, K., SREEDHARAN, S.D., KALSHEKER, N. & BROCKLEHURST, K. (1997). Is the dust mite allergen Der p 1 a cysteine proteinase? Biochem. Soc. Trans., 25, 85S.

CHAVIRA, R., BURNETT, T.J. JR. & HAGEMAN, J.H. (1984). Assaying proteinases with Azocoll. Anal. Biochem., 136,446-450.

CHUA, K.Y., STEWART, G.A. & THOMAS, W.R., SIMPSON, R.J., DILWORTH, R.J., PLOZZA. T.M. & TURNER K.J. (1988). Sequence analysis of cDNA coding for a major house dust mite allergen, Der p 1. Homology with cysteine proteases. J. Exp. Med., 167,175-182.

CHUA, K.Y., KEHAL, P.K. & THOMAS, W.R. (1993). Sequence polymorphisms of cDNA dones encoding the mite allergen Der p I. Int. Arch. Allergy Immunol., 101, 364-368.

COZENS, A.L., YEZZ1, M.J., KUNZELMAN, K., OHRUI, T., ENG, K„ FINKBEINER, W.E., WIDDICOMBE, J.H. & GRUENERT, D.C. (1994). CFTR expression and chloride secretion in polarized immortal human bronchial epithelial cells. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 10, 38-47.

DOWSE, G.K., TURNER, K.J., STEWART, G.A., ALPERS, M.P. & WOOLCOCK, A.J. (1985). The association between Dermatophagoides mites and the increasing prevalence of asthma in village communities within the Papua New Guinea highlands. J. Allergy Clin. Immunol., 75, 75-83.

FADOK, V.A., VOELKER D.R., CAMPBELL, P.A., COHEN, J.J., BRATTON, D.L. & HENSON, P. M. (1992). Exposure of phosphatidylserine on the surface of • 0

000 • 0 00 • 0 0 4 > 0 0 4

- 34 apoptotic lymphocytes triggers specific recognition and removal by macrophages. J. Immunol. 148,2207-2216.

FR1SCH, S.M. & FRANC1S, H. (1994). Disruption of epithelial cell-matrix intercations induces apoptosis. J. Cell Biol., 124, 619-626.

FURUSE, Μ., ITOH, M., HIRASE, T., NAGAFUCHI, A., YONEMURA, S., TSUKITA, S. & TSUKITA, S. (1994). Direct association between occludin and ZO1 and its possible involvement in the localization of occludin at tight junctions. J. CellBioL, 127, 1617-1626.

HALE, A.J., SMITH, C.A., SUTHERLAND, L.C., STONEMAN, V.E.,

LONGTHORNE, V.L., CULHANE, A.C. & WILLIAMS, G.T. (1996). Apoptosis: molecular regulation of cell death. Eur. J. Biochem., 236, 1-26. See also published erratum Eur. J. Biochem., 237, 884.

HA WS, C., FINKBEINER, W.E., WIDDICOMBE, J.FI. & WINE, JJ. (1994). CFTR in Calu-3 human airway cells: channel propertíes and role in cAMP-activated ď conductance. Am. J. Physiol., 266, L502-L512.

HERBERT C.A., ARTHUR, M.J.P., ROBINSON, C. (1996). Eosinophils augment gelatinase activity in the airway mucosa. Comparative effects as a putative mediator of epithelial injury. Br. J. Pharmacol., 117, 667-674.

HERBERT, C.A., EDWARDS, D., BOOT, J.R., ROBINSON, C. (1993). Stimulated eosinophils and proteinases augment the transepithelial flux of albumin in bovine bronchial mucosa. Br. J. Pharmacol., 110, 840-846.

HERBERT, C.A., KING, C.M., RING, P.C., HOLGATE, S.T., STEWART, G.A., THOMPSON, P.J., ROBINSON, C. (1995). Augmentation of permeability in the

99 99 99

9 9 9 · 9 9 9

9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9

999 9 9 9 9 99

9· »«♦· ♦ · • 9 9 9

- 35 bronchial epithelium by the house dust mite allergen, Der p 1. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 12, 369-378.

HERBERT, C.A., OMARI, T.I., SPARROW, M.P. & ROBINSON, C. (1994). Human eosinophils and recombinant matrix metalloproteinase-2 increase the permeability of bovine and porcine airways. Br. J. Pharmacol., 112, 46IP.

HERBERT, C.A., HOLGATE, S.T, ROBINSON, C, THOMPSON, P.J. & STEWART, G.A. (1990). Effect of mite allergen on permeability of bronchial mucosa. Lancet 2, 1132.

HEWITT, C.R.A., BROWN, A.P, HART, B.J. & PRITCHARD, D.I. (1995). A major house dust mite allergen disrupts the immunoglobulin E network by selectivity cleaving CD23: innate protection by antiproteases. J. Exp. Med., 182, 1537-1544.

HEWITT, C.R.A., HORTON, H, JONES, R.M. & PRITCHARD, D.I. (1997). Heterogeneous proteolytic specificity and activity of the house dust mite proteinase allergen Der p I. Clin. Exp. Allergy, 27, 201-207.

HOLT, P.G. (1993). Regulation of antigen-presenting cell function(s) in lung and airway tissues. Eur. Respir J., 6, 120-129.

HOLT, P.G. (1995). Macrophage and dendritic cell populations in the respirátory tract.

In: Holgate S.T. ed. Immunopharmacology of the respirátory syslem. London: Academie Press 1-12.

HOLT, P.G., McMENAMIN, C, SCHON-HEGRAD, M.A., STRICKLAND, D, NELSON, D, WILKES, L, BILYK, N, OLIVER, J, HOLT, B.J. & McMENAMIN, ··»·«· · ·· ·· ·· • 9 · ·» · » ··** • »·· · φ · · φ φ · • 9 9 ΦΦΦΦΦΦΦΦ * Φ φ · · Φ Φ Φ 9 φφφφ 999 999 99 99 99

P.G. (1991). Immunoregulation ofasíhma: control of T-lymphocyte activation in the respirátory tract. Eur. Respir. J., 4, S6-S15.

HOLT, P.G., SCHON, H.M., OLIVER, J„ HOLT, B.J. & McMENAMIN, P.G. (1990). A contiguous network of dendritic antigen-presenting cells within the respirátory epithelium. Int. Arch. Allergy Appl. Immunol., 91, 155-159.

HOMBURG, C.H.E., HAAS, M., von DEM BORNE, A.E.G.Kr., VERHOEVEN,

A.J., REUTELINGSPERGER, C. Ρ. M. & ROOS, D. (1995). Human neutrophils lose their surface FcyRIII and acquire annexin V binding sites during apoptosis in vitro. Blood, 85, 532-540.

HOWARTH, A.G., SINGER, K.L. & STEVENSON, B.R. (1994). Analysis of the distribution and phosphorylation statě of ZO-1 in MDCK and nonepithelial cells. J. Membr. Biol., 137,261-270.

IBRAHIM, M.A.A., CHAIN. B.M. & KATZ, D.R. (1996). The injured cell: the role of the dendritic cell systém as a sentinel receptor pathway. Immunol. Today, 16, 181186.

KAYAGAKI, N„ KAWASAKI, A., EBATA, T., OHMOTO, H., IKEDA, S„ INOUE, S., YOSHINO, K., OKAMURA, K. & YAGITA, H. (1995). Metalloproteinasemediated release of human Fas ligand. J. Exp. Med., 182, 1777-1783.

KJNG, C„ SIMPSON, R.J., MORITZ, R.L., REED, G.E., THOMPSON, P.J. & STEWART, G.A. (1996). The isolation and characterization of a novel collagenolytic serine protease allergen (Der p 9) from the dust mite, Dermatophagoides pteronyssinus. J. Allergy Clin. Immunology, 98, 739-747.

·· ·*

KOOPMAN, G., REUTELINGSPERGER, C.P.M., KUIJTEN, G.A.M., KEEHNEN, R.M. J., PALS, S.T., & van OERS, M.H.J. (1994). Annexin V for flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on B cells undergoing apoptosis. Blood,

84, 1415-1420.

LOS, M., VAN DE CRAEN, M„ PENNING, L.C., SCHRENK, H., WESTENDORP, M., BAEUERLE, P., DROGE, W„ KRAMMER, P.H., FIERS, W. & SCHULTZOSTHOFF, K. (1995). Requirement ofan 1CE/CED-3 protease for Fas/APO-1mediated apoptosis. Nátuře, 375, 81-83.

MAHIDA, Y.R., MAKH, S„ HYDE, S„ GRAY, T. & BORRJELLO, S.P. (1996). Effect of Clostridium difficile toxin A on human intestinal epithelial cells: induction of IL-8 production and apoptosis after cell detachment. Gut, 38, 337-347.

MARIANI, S.M., MATIBA, B., BAUMLER, C. & KRAMMER, P.H. (1995). Regulation of cell surface APO-l/Fas (CD95) ligand expression by metalloproteases. Eur. J. lmmunol., 25, 2303-2307.

MARTIN, S.J., O’BRIEN, G.A., NISHIOKA, W.K., McGAHON, A.J., MAHBOUBI, A., SAIDO, T.C, & GREEN, D.R. (1995). Proteolysis of Fodrin (non-erythroid spectrin) during apoptosis. J. Biol. Chem., 270, 6425-6428.

MARTIN, S.J., REUTELINGSPERGER, C.P.M., McGAHON, A.J., RADER, J.A., van SCHIE R.C.A.A., LaFACE, D.M. & GREEN, D.R. (1995). Early redistribution of plasma membrane phosphatidylserine is a generál feature of apoptosis regardless of the initiating stimulus: inhibition by overexpression of Bcl-2 and Abl. J. Exp. Med., 182,1545-1556.

MATZINGER, P. (1994). Tolerance, danger, and the extended family. Annu. Rev. lmmunol., 12,991-1045.

·«<«*«, φ ·· φφ φφ φ·· φφφφ φφφφ φφφφ φφφ φφφφ φ φφ ΦΦΦΦΦΦΦΦ φ φ φφφφφφφ φφφφ φφφ φφφ φφ φφ φφ

OMAR], Τ.Ι. & SPARROW, Μ.Ρ. (1992). Epithelial disruption by proteases augments the responsiveness of porcine bronchial segments. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol., 19, 785-794.

PARRISH, E.P., STEART, P.V., GARROD, D.R. & WELLER, R.O. (1987). Antidesmosomal monoclonal antibody in the diagnosis of intracranial tumours. J. Palhol., 153, 265-273.

PLATTS-MILLS, T.A.E., THOMAS, W.R, AALBERSE, R.C., BERVOLET, D, CHAPMAN, M.D., BISCHOFF, E, BRUIJNSEEL-KOOMEN, C.A.F.M.,

CHARP1N, D.. COLLOF, M.J., EGGLESTON, P.A., EHNERT, B, GOLDSTEIN, R.A, van HAGE-HAMSTEN, M, HART, B.J., HOLGATE, S.T., HONG, C.S., JOHANSSON, S.G.O., KORGGAARD, J. & LAU, S. (1992). Dust mile allergens and asthma - report of a 2nd International workshop. J. Allergy Clin. Immunoí, 89, 1046-1060.

RIDGE, J.P., FUCHS E.J. & MATZINGER, P. (1996). Neonatal tolerance revisited: tuming on newbom T cells with dendritic cells. Science, 271, 1723-1726.

ROBINSON, C. (1995). The airway epithelium: the origin and target of inflammatory airways disease and injury. In Holgate S. T., ed. Immunopharmacology of the respirátory systém. London: Academie Press 187-207.

ROBINSON, C, KALSHEKER, N.A, SRJNIVASAN, N, KING, C.M., GARROD, D.R., THOMPSON, P.J. & STEWART, G.A. (1997). On the potential significance of the enzymatic activity of mite allergens to immunogenicity. Clues to structure and function revealed by molecular characterization. Clin. Exp. Allergy, 27, 10-21.

SCHNEEBERGER, E.E. & LYNCH, R.D. (1992). Structure, function and regulation of cellular tight junctions. Am. J. Physiol., 262, L647-L661.

• * · * Μ · φ · ·· ·· « · Φ 99 9 9 9 9 9 9 *··· Φ · · ΦΦΦΦ • ·♦ ΦΦ ΦΦφΦφφ • · Φ · Φ Φ Φ Φ φ ···· ··· 999 99 99 99

- 39 SEARS, M.R., HERBISON, G.P., HOLDAWAY, M.D., HEWITT, C.J.,

FLANNERY, E.M. & SILVA, P.A. (1989). The relative risks of sensitivity to grass pollen, house dust mite and cat dander in the development of childhood asthma. Clin. Exp. Allergy, 19, 419-424.

SHAW, E. (1990). Cysteinyl proteinases and their selective inactivation. Adv. Enzymol., 63, 271-347.

SHEN. B.-Q., FINKBEINER, W.E., WINE, J.J., MRSNY, R.J. & WIDDOCOMBE, J.H. (1994). Calu-3: a human airway epithelial cell line that shows cAMP-dependent C1‘ secretion. Am. J. Physiol., 266, L493-L501.

SMITH, P.K., KROHN, R.I., HERMANSON, G.T., MALLIA, A.K., GARTNER, F.H., PROVENZANO, M.D., FUJIMOTO, E.K., GOEKE, N.M., OLSON, B.J. & KLENK, D.C. (1985). Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem., 150, 76-85 (and published erratum, 163, 279 (1987)).

STEVENSON, B.R., SIC1LIANO, J.D., MOOSEKER, M.S., GOODENOUGH, D.A. (1986). Identification of ZO-1: a high molecular weight polypeptide associated with the tight junction (zonulae occludens) in a variety of epithelia. J. Cell Biol., 103, 755766.

STEWART, G.A. (1994). Molecular biology of allergens. In: Busse WW, Holgate ST, eds: Asthma and rhinitis. Oxford: Blackwell Science, 898-932.

STEWART, G.A., WARD, L.D., SIMPSON, R.J. & THOMPSON, P.J. (1992). The group III allergen from the house dust mite Dermatophagoidespteronyssinus is a trypsin-like enzyme. Immunology 75, 29-35.

··· * • 9

9 99

9 • ··

- 40 STUART, R.O., DUN, A., PANICHAS, M., HEBERT, S.C, BRENNER, B.M. & NIGAM, S.K. (1994). Critical role for intracellular calcium in tight junction bíogenesis. J. Cellul. Physiol. 159,423-433.

STUART, R.O. & NIGAM, S.K. (1995). Regulated assembly of tight junctions by protein kinase C. Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 92, 6072-6076.

TANAKA, M, SUDA, T, HAZE, K„ NAKAMURA, M, SÁTO, K, KIMURA, F, MOTOYOSHI, K, MIZUKI, M, TAGAWA, S, OHGA, S, HATAKE, K, DRUMMOND, A.H. & NAGATA, S. (1996). Fas ligand in human sérum. Nátuře Med, 2,317-322.

TOPHAM, C.M., SRINIVASAN, N, THORPE, C.J., OVERINGTON, J.P. & KALSHEKER, N.A. (1994). Comparative modelling of major house dust mite allergen Der p I: structure validation using an extended environmental amino acid propensity table. Protein Engng., 7, 869-894.

TOVEY, E.R., CHAPMAN, M.D. & PLATTS-MILLS, T.A.E. (1981). Mite faeces are a major source of house dust allergens. Nátuře, 289,592-593.

VERMES, I., HAANEN, C, STEFFENS-NAKKEN, H. & REUTELINGSPERGER, C. (1994). A novel assay for apoptosis ílow cytometric detection of phospbatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled AnnexinV. J. Immunol. Methods, 184,39-51.

VOLK, T, VOLBERG, T, SABANAY, I. & GEIGER, B. (1990). CleavageofACAM by endogenous proteinases in cultured lens cells and in developing chick embryos. Dev. Biol., 139, 314-326.

·♦ 9999 • 9 9

9 99

99 • * 9 9 · · · • · 9 · • · 9 ·

99

- 41 YÁSUEDA, Η., MITA, Η. & AKIYAMA, K., SHIDA, T., ANDO, T., SUGIYAMA,

S. & YAMAKAWA, H. (1993). Allergens from Dermaíophagoides mites with chymotryptic activity. Clin. Exp. Allergy, 23, 384-390.

ZHONG, Y., ENOMOTO, K., ISOMURA, H., SAWADA, N., MINASE, T„ OYAMADA, M., KON1SHI, Y. & MOŘI, M. (1994). Localization of the 7H6 antigen and tight junctions correlates with the paracellular barrier function of MDCK cells. Exp. Cell. Res., 214, 614-620.

Claims (8)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Přípravek vyznačující se tím, že projevuje aktivitu inhibující cysteinovou a serinovou proteinázu.
2. 2. Souprava vyznačující se tím, že obsahuje inhibitor cysteinové proteinázy a inhibitor serinové proteinázy.
3. 3. Použití inhibitoru aktivity cysteinové proteinázy společně s inhibitorem aktivity serinové proteinázy pro výrobu léku k prevenci nebo léčení onemocnění, při kterém alergen prochází epiteliální bariérou.
4. 4. Použití podle nároku 4, kdy alergickým onemocněním je astma.
5. 5. Použití podle nároku 4, kdy alergické onemocnění je vybráno z rhinitidy, alergické konjuktivitidy, atopické dermatitidy a potravinových alergií.
6. 6. Použití inhibitoru aktivity cysteinové proteinázy společně s inhibitorem aktivity jakékoliv serinové proteinázy kromě trypsinu pro výrobu léku k prevenci nebo léčení onemocnění, při kterém alergen prochází epiteliální bariérou.
7. 7. Použití inhibitoru aktivity cysteinové proteinázy společně s inhibitorem proteinázy pro výrobu onemocnění, při kterém alergenní aktivity serinové léku k prevenci nebo léčení alergen prochází epiteliální

   - 43 bariérou.
8. 8. Použití inhibitoru aktivity cysteinové proteinázy společně s inhibitorem aktivity serinové proteinázy

   Der p3, Der p6 nebo Der p9 pro výrobu léku k prevenci nebo léčení onemocnění, při kterém alergen prochází epiteliální bariérou.