ES2199884T3

ES2199884T3 - Composiciones antibioticas de azalida.

Info

Publication number: ES2199884T3
Application number: ES00979850T
Authority: ES
Inventors: Wayne Alan Boettner
Original assignee: Pfizer Products Inc
Current assignee: Pfizer Products Inc
Priority date: 2000-01-27
Filing date: 2000-11-30
Publication date: 2004-03-01
Anticipated expiration: 2020-11-30
Also published as: AU1722801A; US6514945B1; ATE243703T1; TW201006476A; JP2004500384A; AU779748B2; NZ518665A; JP3893059B2; US6667393B2; EP1250343A1; WO2001055158A1; JP2006282676A; TWI331527B; PE20011050A1; US20030073825A1; PA8509801A1; AR030045A1; CA2398485C; BR0017013A; ZA200205958B

Abstract

Una composición que comprende: (a) el compuesto de fórmula I y el compuesto de fórmula II **(Fórmulas)** en una relación de 90 +- 4% a 10% +- 4%, respectivamente (b) agua, y (c) uno o más ácidos que se encuentran en una concentración total de 0, 2 mmol a 1, 0 mmol por ml de composición.

Description

Composiciones antibioticas de azalida.

Antecedentes de la invención

La presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden una mezcla equilibrada de isómeros de un compuesto antibiótico azálido y a métodos para prepararlas. Esta invención se refiere, además, a formas estabilizadas de las composiciones antes mencionadas y a métodos para estabilizarlas. Esta invención se refiere, además, a métodos para tratar mamíferos, que comprenden la administración de una composición farmacéutica de la invención a un mamífero que necesite este tipo de tratamiento.

Se ha informado con anterioridad sobre antibióticos macrólidos activos contra una gama amplia de infecciones bacterianas o protozoarias en mamíferos, peces y pájaros (véase, por ej., International Patent Publications WO 98/56802 y WO 99/12552). Por lo general, estos compuestos tienen un anillo lactónico macrocíclico de 12 a 22 átomos de carbono a los que se unen uno o más fragmentos de azúcares. Los antibióticos macrólidos actúan sobre la subunidad ribosomal 50S para inhibir la síntesis proteica de los microrganismos. Entre los ejemplos de antibióticos macrólidos se incluyen: la lincomicina, la azitromicina, que es un derivado de la eritromicina A, y otros compuestos azálidos.

El desarrollo de composiciones farmacéuticas que contienen compuestos azálidos como sustancia activa ha presentado desafíos importantes. Algunos azálidos son capaces de formar isómeros en solución. Por consiguiente, ha sido difícil la producción de una composición antibiótica reproducible que comprenda un solo isómero o una relación fija de isómeros. En segundo lugar, una composición que contiene una cantidad fija de un isómero azálido particular puede cambiar con el tiempo. En tercer lugar, el anillo lactónico y los azúcares de los azálidos se hidrolizan con facilidad incluso en medios con pH levemente ácido o alcalino, disminuyendo la potencia y la duración de una composición antibiótica durante su almacenamiento.

Conforme a lo anterior, es un objetivo de la presente invención proporcionar composiciones antibióticas y métodos para prepararlas que superen las desventajas antes mencionadas.

La cita de cualquier referencia en el presente documento no debe interpretarse como indicativa de que dicha referencia está comprendida en los conocimientos técnicos revelados antes de la presente invención.

Resumen de la invención

En una primera realización, la presente invención se refiere a una composición que comprende: (a) el compuesto de fórmula I:

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y el compuesto de fórmula II:

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en una relación de alrededor del 90% \pm 4% del compuesto de fórmula I a alrededor del 10% \pm 4% del compuesto de fórmula II; (b) agua; y (c) uno o más ácidos que se encuentran en una concentración total de alrededor de 0,2 mmol a alrededor de 1,0 mmol por ml de composición.

La presente invención se refiere a un método para obtener una composición que comprende: (a) el compuesto de fórmula I y el compuesto de fórmula II en una relación de alrededor del 90% \pm 4% del compuesto de fórmula I a alrededor del 10% \pm 4% del compuesto de fórmula II; (b) agua; y (c) uno o más ácidos que se encuentran en una concentración total de alrededor de 0,2 mmol a alrededor de 1,0 mmol por ml de composición, el cual comprende el paso de calentamiento hasta una temperatura comprendida entre alrededor de los 50ºC y alrededor de los 90ºC de una mezcla que incluye: (a) el compuesto de fórmula I, (b) agua, y (c) uno o más ácidos en una cantidad total que varía entre alrededor de 0,2 mmol y alrededor de 1,0 mmol por ml de la mezcla. En una realización preferida, el pH de la mezcla varía desde alrededor de 5,0 hasta alrededor de 8,0 y, más preferiblemente, desde alrededor de 5,0 hasta alrededor de 6,0.

La presente invención se refiere a un método para tratar una infección bacteriana o protozoaria en un mamífero que comprende la administración, a un mamífero que requiera este tipo de tratamiento, de una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que comprende: (a) el compuesto de fórmula I y el compuesto de fórmula II en una relación de alrededor del 90% \pm 4 del compuesto de fórmula I a alrededor del 10% \pm 4% del compuesto de fórmula II; (b) agua; y (c) uno o más ácidos que se encuentran en una concentración total de alrededor de 0,2 mmol a alrededor de 1,0 mmol por ml de la composición. En una realización preferida, el pH de la mezcla varía desde alrededor de 5,0 hasta alrededor de 8,0 y, más preferiblemente, desde alrededor de 5,0 hasta alrededor del 6,0. En otra realización preferida, la infección bacteriana o protozoaria se limita al grupo formado por la enfermedad respiratoria bovina, la pleuroneumonía porcina, la neumonía, coccidiosis, la anaplasmosis y la queratitis infecciosa.

La presente invención se refiere a una composición que comprende: (a) una mezcla que comprende: (i) el compuesto de fórmula I y el compuesto de fórmula II en una relación de alrededor del 90% \pm 4% del compuesto de fórmula I a alrededor del 10% \pm 4% del compuesto de fórmula II; (ii) agua; y (iii) uno o más ácidos que se encuentran en una concentración total de alrededor de 0,2 mmol hasta alrededor de 1,0 mmol por ml de la mezcla; y (b) uno o más codisolventes miscibles en agua que se encuentran en una cantidad total de alrededor de 250 hasta alrededor de 750 mg por ml de composición.

La presente invención se refiere a un método para obtener una composición que comprende: (a) una mezcla que comprende: (i) el compuesto de fórmula I y el compuesto de fórmula II en una relación de alrededor del 90% \pm 4% del compuesto de fórmula I a alrededor del 10% \pm 4% del compuesto de fórmula II; (ii) agua; y (iii) uno o más ácidos que se encuentran en una concentración total de alrededor de 0,2 mmol hasta alrededor de 1,0 mmol por ml de la mezcla; y (b) uno o más codisolventes miscibles en agua en una cantidad total de alrededor de 250 hasta alrededor de 750 mg por ml de composición, que comprende el paso de agregado a la mezcla de uno o más codisolventes miscibles en agua en una cantidad total de alrededor de 250 hasta alrededor de 750 ml de la composición.

La presente invención se refiere a un método para obtener una composición que comprende: (a) una primera mezcla que comprende: (i) el compuesto de fórmula I y el compuesto de fórmula II en una relación de alrededor del 90% \pm 4% del compuesto de fórmula I a alrededor del 10% \pm 4% del compuesto de fórmula II; (ii) agua; y (iii) uno o más ácidos que se encuentran en una concentración total de alrededor de 0,2 mmol hasta alrededor de 1,0 mmol por ml de la mezcla; y (b) uno o más codisolventes miscibles en agua en una cantidad total de alrededor de 250 hasta alrededor de 750 mg por ml de composición, que comprende el paso de calentamiento, hasta una temperatura comprendida entre alrededor de los 50ºC y alrededor de los 90ºC, de una mezcla que comprende el compuesto de fórmula I, agua, y uno o más ácidos en una cantidad total que varía entre alrededor de 0,2 mmol y alrededor de 1,0 mmol por ml de la mezcla a la cual se agregan uno o más codisolventes miscibles en agua antes, durante o después del paso de calentamiento en una cantidad total de alrededor de 250 hasta alrededor de 750 ml de la composición.

La presente invención se refiere a un método para mantener la integridad estructural del compuesto de fórmula I o del compuesto de fórmula II que comprende el paso de formación de una composición mediante el agregado de uno o más codisolventes miscibles en agua a una composición que comprende: (a) el compuesto de fórmula I y el compuesto de fórmula II; (b) agua; y (c) uno o más ácidos que se encuentran en una cantidad total de alrededor de 0,2 mmol hasta alrededor de 1,0 mmol por ml de la mezcla, siendo la cantidad del codisolvente miscible en agua agregada de alrededor de 250 hasta alrededor de 750 mg por ml de la composición.

La presente invención se refiere a un método para tratar una infección bacteriana o protozoaria en un mamífero que comprende la administración, a un mamífero que requiera este tipo de tratamiento, de una cantidad eficaz de una composición que comprende: (a) una mezcla que comprende: (i) el compuesto de fórmula I y el compuesto de fórmula II en una relación de alrededor del 90% \pm 4% del compuesto de fórmula I a alrededor del 10% \pm 4% del compuesto de fórmula II; (ii) agua; y (iii) uno o más ácidos que se encuentran en una concentración total de alrededor de 0,2 mmol hasta alrededor de 1,0 mmol por ml de la mezcla; y (b) uno o más codisolventes miscibles en agua que se encuentran en una cantidad total de alrededor de 250 hasta alrededor de 750 mg por ml de composición.

En una realización de la composición de la invención, dicho uno o más ácidos se eligen de un grupo que comprende los ácidos: acético, bencenosulfónico, cítrico, bromhídrico, clorhídrico, D-láctico y L-láctico, metanosulfónico, fosfórico, succínico, sulfúrico, D-tartárico y L-tartárico, p-toluenosulfónico, adípico, aspártico, canforsulfónico, 1,2-etanodisulfónico, laurilsulfúrico, glucoheptónico, glucónico, 3-hidroxi-2-naftoico, 1-hidroxi-2-naftoico, 2-hidroxietanosulfónico, málico, múcico, nítrico, naftalenosulfónico, palmítico, D-glucárico, esteárico, maleico, malónico, fumárico, benzoico, cólico, etanosulfónico, glucurónico, glutámico, hipúrico, lactobiónico, lisínico, mandélico, napadisílico, nicotínico, poligalacturónico, salicílico, sulfosalicílico, triptofánico y mezclas de los mismos.

En una realización preferida de la composición de la invención, dicho uno o más ácidos son el ácido cítrico. En otra realización preferida de la misma, dicho uno o más ácidos son el ácido cítrico y el clorhídrico. En una realización más preferida de la misma, el ácido cítrico se encuentra en una cantidad de alrededor de 0,02 mmol hasta alrededor de 0,3 mmol por ml de la composición, y el ácido clorhídrico se encuentra en una cantidad suficiente como para alcanzar un pH de la composición de alrededor de 5 hasta alrededor de 6.

En una realización de las composiciones de la invención, dicho uno o más codisolventes miscibles en agua se eligen del grupo formado por: etanol, isopropanol, éter monometílico de dietilenglicol, éter butílico de dietilenglicol, éter monoetílico de dietilenglicol, éter dibutílico de dietilenglicol, polietilenglicol-300, polietilenglicol-400, polietilenglicol, glicerina, 2-pirrolidona, N-metil, 2-pirrolidona, glicerina formal, dimetilsulfóxido, sebacato de dibutilo, polisorbato 80 y mezclas de los mismos.

En una realización de la misma, dicho uno o más codisolventes miscibles en agua son el propilenglicol. En una realización preferida de la misma, el propilenglicol se encuentra en una cantidad de 450 a 550 mg por ml de composición.

En una realización de las composiciones de la invención, la composición incluye, además, uno o más antioxidantes que se encuentran en una cantidad de alrededor de 0,01 mg hasta alrededor de 10 mg por ml de composición. En una realización preferida de la misma, dicho uno o más antioxidantes se eligen de un grupo formado por: bisulfito de sodio, sulfito de sodio, metabisulfito de sodio, tiosulfato de sodio, sulfoxilato sódico de formaldehído, ácido L-ascórbico, ácido eritórbico, acetilcisteína, cisteína, monotioglicerol, ácido tioglicólico, ácido tioláctico, tiourea, ditiotreitol, ditioeritreitol, glutationa, palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado, ácido nordihidroguaiarético, galato de propilo, \alpha-tocoferol y mezclas de los mismos. En una realización más preferida de los mismos dicho uno o más antioxidantes son el monotioglicerol. En una realización especialmente preferida de la misma, el monotioglicerol se encuentra en una cantidad de alrededor de 4 mg/ml hasta alrededor de 6 mg/ml de la composición.

En una realización de las composiciones de la invención, la primera mezcla (del compuesto I y del compuesto II) de la composición se encuentra en una concentración de alrededor de 50 mg/ml hasta alrededor de 200 mg/ml. En una realización preferida de la misma, la primera mezcla de la composición se encuentra en una concentración de alrededor de 90 mg/ml hasta alrededor de 110 mg/ml.

En una realización especialmente preferida de la composición de la presente invención, el ácido cítrico se encuentra en una cantidad de alrededor de 0,02 mmol hasta alrededor de 0,3 mmol por ml de composición, y el ácido clorhídrico se encuentra en una cantidad suficiente como para conseguir un pH de la composición de alrededor de 5 hasta alrededor de 6; en la que el propilenglicol se encuentra en una cantidad de alrededor de 450 hasta alrededor de 550 por ml de la composición, y en la que el monotioglicerol se encuentra en una cantidad de alrededor de 4 mg/ml hasta alrededor de 6 mg/ml de la composición.

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Esta invención también se refiere a un compuesto de fórmula:

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o a una sal farmacéuticamente aceptable del mismo;

en el que R^{1} es OH o

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y en la que R^{2} es H o CH^{3}

La presente invención puede entenderse mejor consultando la descripción detallada y los ejemplos ilustrativos que tienen el propósito de ejemplificar las realizaciones de la invención sin limitarlas.

Descripción detallada de la invención

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Isómero I

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Isómero II

La presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden un isómero I y un isómero II (en conjunto los "isómeros azálidos") en una relación de alrededor del 90% \pm 4% a alrededor del 10% \pm 4%. El nombre químico del isómero I es (2R,3S,4R,5R,8R,10R,11R,12S,13S,14R)-13-((2,6-dideoxi-3-C-metil-3-O-metil-4-C-((propilamino)-metil)-\alpha-L-ribo-hexopiranosil) oxi-2-etil-3,4,10-trihidroxi-3,5,8,10,12,14-hexametil-11-((3,4, 6-trideoxi-3-(dimetilamino)-\beta-D-xilo-hexopiranosil)oxi)-1-oxa-6-azaciclopentadecan-15-ona. El nombre químico del isómero II es (3R,6R,8R,9R,10S,11S,12R)-11-((2,6-dideoxi-3-C-metil-3-O-metil-4-C-((propilamino)-metil)-\alpha-L-ribo-hexopiranosil)oxi-2-((1R,2R)-1, 2-dihidroxi-1-metilbutil)-8-hidroxi-3,6,8,10,12-pentametil-9-((3,4, 6-trideoxi-3-(dimetilamino)-\beta-D-xilo-hexopiranosil)oxi)-1-oxa-4-azaciclotridecan-13-ona. El isómero I se puede formar a partir de una reacción de translactonización del isómero II. Asimismo, el isómero II se puede formar a partir de una reacción de translactonización del isómero I. Los métodos para obtener el isómero I se revelan en la publicación Internacional nº WO 98/56802, incorporada aquí como referencia. Los métodos para obtener el isómero II se hacen públicos más abajo en el Ejemplo 1. Los isómeros azálidos son agentes antibióticos activos. Sin circunscribirse a ninguna teoría, la invención se basa en parte en el sorprendente descubrimiento por parte de los Solicitantes de que, usando los métodos hechos públicos aquí, es posible obtener con rapidez una composición compuesta por un isómero I y un isómero II en una relación de alrededor del 90% \pm 4 del isómero I a alrededor del 10% \pm 4% del isómero II, independiente de la relación inicial de isómeros azálidos. Al no tener una certeza absoluta, los solicitantes consideran que una relación de alrededor del 90% \pm 4 del isómero I y alrededor del 10% \pm 4% del isómero II constituye una mezcla equilibrada de isómeros azálidos. Conforme a lo anterior, la expresión "mezcla equilibrada de isómeros" según se la utiliza aquí se refiere a una mezcla del isómero I y el isómero II en una relación de aproximadamente 90% \pm 4% del isómero I a alrededor del 10% \pm 4% del isómero II. Es posible producir una composición antibiótica que comprende la mezcla equilibrada de isómeros con características constantes, y proporciona un patrón para evaluaciones y para el uso por parte del consumidor. Por tanto, es muy conveniente poder contar con una composición que comprenda la mezcla equilibrada de isómeros.

La presente invención se refiere, además, a un método para preparar una composición que comprende una mezcla equilibrada de isómeros. En una de las realizaciones, la mezcla equilibrada de isómeros se obtiene a partir de una solución del isómero I sustancialmente pura. A no ser que se indique lo contrario, la expresión "sustancialmente pura", según se la utiliza aquí, quiere decir que tiene una pureza de un 97% como mínimo. En otra realización, la mezcla equilibrada de isómeros se obtiene a partir de una solución que comprende una mezcla del isómero I y el isómero II. En general, una mezcla equilibrada de isómeros se genera calentando una solución acuosa del isómero I, preferiblemente el isómero I sustancialmente puro, o una mezcla del isómero I y el isómero II en presencia de uno o más ácidos. En una realización preferida, una solución acuosa del isómero I y uno o más ácidos se calienta hasta una temperatura comprendida entre alrededor de los 50ºC y alrededor de los 90ºC, preferiblemente entre alrededor de los 60ºC y alrededor de los 80ºC, durante alrededor de 0,5 hasta alrededor de 24 horas, preferiblemente alrededor de 1 hora hasta alrededor de 10 horas a un pH de alrededor de 5,0 hasta alrededor de 8,0, preferiblemente alrededor de 6,0 hasta alrededor de 8,0. Más preferiblemente, una solución del isómero I y el isómero II se calienta hasta una temperatura comprendida entre alrededor de los 65ºC y alrededor de los 75ºC durante alrededor de 1 hora hasta alrededor de 8 horas a un pH de alrededor de 6,5 hasta alrededor de 7,5 en presencia de uno o más ácidos. La concentración del isómero I o de la mezcla del isómero I y el isómero II a equilibrar puede variar desde alrededor de 50 mg/ml hasta alrededor de 500 mg/ml, más preferiblemente desde alrededor de 100 mg/ml hasta alrededor de 300 mg/ml, y más preferiblemente desde alrededor de 225 mg/ml hasta alrededor de 275 mg/ml de solución.

Entre los ácidos adecuados útiles para obtener la mezcla equilibrada de isómeros se incluyen los ácidos siguientes, aunque no se limitan a estos: acético, bencenosulfónico, cítrico, bromhídrico, clorhídrico, D-láctico y L-láctico, metanosulfónico, fosfórico, succínico, sulfúrico, D-tartárico y L-tartárico, p-toluenosulfónico, adípico, aspártico, canforsulfónico, 1,2-etanodisulfónico, laurilsulfúrico, glucoheptónico, glucónico, 3-hidroxi-2-naftoico, 1-hidroxi-2-naftoico, 2-hidroxietanosulfónico, málico, múcico, nítrico, naftalenosulfónico, palmítico, D-glucárico, esteárico, maleico, malónico, fumárico, benzoico, cólico, etanosulfónico, glucurónico, glutámico, hipúrico, lactobiónico, lisínico, mandélico, napadisílico, nicotínico, poligalacturónico, salicílico, sulfosalicílico, triptofánico y mezclas de los mismos. Preferiblemente, dicho uno o más ácidos son el ácido cítrico y el ácido clorhídrico. Cuando está presente el ácido cítrico se lo encuentra en una concentración de alrededor de 0,02 mmol hasta alrededor de 0,3 mmol por ml de solución. En una realización se usa una concentración de ácido de alrededor de 0,2 mmol hasta alrededor de 1,0 mmol por ml de solución. Sin circunscribirse a ninguna teoría, los Solicitantes consideran que la sal formada por el agregado de un ácido a la solución del isómero I ejerce un efecto tampón, porque los mismos isómeros azálidos actúan como una base. Los expertos en este campo técnico advertirán que la cantidad de ácido necesaria para obtener un pH deseado variará según el ácido a usar, y que para mantener el pH dentro del intervalo deseado se puede agregar más ácido o base a la solución de ácido e isómero I, hidróxidos y carbonatos de metales alcalinos, bicarbonatos de metales alcalinos, e hidróxidos y carbonatos alcalinotérreos. Se prefieren el hidróxido de sodio y el hidróxido de potasio. Los ácidos y bases descritos más arriba se usan convenientemente en forma de sus soluciones acuosas.

Las composiciones que comprenden la mezcla equilibrada de isómeros ("composiciones equilibradas") son útiles para tratar infecciones bacterianas o protozoarias en un mamífero. Las composiciones equilibradas también son útiles como medios para la formación de composiciones equilibradas estables.

La presente invención se refiere, además, a composiciones equilibradas estables, y a métodos para estabilizarlas que comprenden la dilución las composiciones equilibradas con uno o más solventes orgánicos miscibles en agua ("codisolventes"). El codisolvente no afecta significativamente la relación de los isómeros I y II de las composiciones equilibradas y, de hecho, mantiene su integridad estructural. "Mantener la integridad estructural" del isómero I y el isómero II según se usa aquí, incluye, aunque sin limitarse a ello, el retraso de su tasa de hidrólisis a, por ejemplo, el azálido descladinosa, y el retraso de su tasa de formación de subproductos, por ejemplo, un producto resultante de la inserción de formaldehído y un producto resultante de la adición de acetaldehído, definidos más abajo. Sin circunscribirse a ninguna teoría, los Solicitantes consideran que la dilución con el codisolvente mejora la estabilidad de los isómeros azálidos. Asimismo, en virtud de la presencia del codisolvente, todo dolor experimentado tras la inyección de las composiciones equilibradas estabilizadas puede ser menor que el experimentado por la inyección de una composición no tan estabilizada. Entre los codisolventes útiles para estabilizar las composiciones equilibradas se incluyen los siguientes, aunque no se limitan a estos: alcoholes como el etanol y el isopropanol; éteres de glicol como el éter de dietilenglicol monometilo, éter de dietilenglicol butilo, éter de monoetilglicol dietileno y éter de dietilenglicol dibutilo; propilenglicoles como el polietilenglicol-300 y el propiletilenglicol-400; glicoles como el propilenglicol ("PG") y la glicerina; pirrolidonas como la 2-pirrolidona y N-metil-2-pirrolidona; glicerina formal; dimetilsulfóxido, dibutil sebacato de dibutilo; ésteres de sorbitano polioxietilenados como el polisorbato 80 y mezclas de los mismos. Preferiblemente, entre los codisolventes útiles para estabilizar las composiciones equilibradas de las soluciones inyectables se incluyen los siguientes aunque no se limitan a estos: etanol, polietilenglicoles como el propilenglicoles como el polietilenglicol-300 y el propiletilenglicol-400; glicoles como el propilenglicol y la glicerina; pirrolidonas como la 2-pirrolidona y N-metil-2-pirrolidona; glicerina formal; dimetilsulfóxido; ésteres de sorbitano polioxietilenados como el polisorbato 80 y mezclas de los mismos; y más preferiblemente, glicerina formal, N-metil-2-pirrolidona y propilenglicol, y más preferiblemente, propilenglicol. En una realización, el codisolvente se usa en una cantidad de alrededor de 250 mg hasta alrededor de 750 mg por ml de las composiciones farmacéuticas para estabilizarlas. En una realización preferida, se usa desde alrededor de 400 mg hasta alrededor de 600 mg de codisolvente por ml de las composiciones farmacéuticas. En una realización más preferida se usa desde alrededor de 450 hasta alrededor de 550 mg de codisolvente por ml de las composiciones farmacéuticas.

En una realización se agrega uno o más codisolventes al isómero I o a una mezcla del isómero I y el isómero II antes de que se establezca el equilibrio. En este caso la mezcla resultante se calienta hasta una temperatura comprendida entre alrededor de los 50ºC y alrededor de los 90ºC, preferiblemente alrededor de los 60ºC hasta alrededor de los 80ºC, durante alrededor de 0,5 hasta alrededor de 24 horas, preferiblemente alrededor de 1 hasta alrededor de 10 horas, a un pH de alrededor de 5,0 hasta alrededor de 8,0, preferiblemente a un pH de alrededor de 6,0 hasta alrededor de 8,0. En una realización preferida, el equilibro entre los isómeros azálidos se lleva a cabo en ausencia de codisolvente, el cual se agrega a las composiciones equilibradas después de haberse enfriado a una temperatura en torno a la temperatura ambiente.

Después del agregado del codisolvente, se puede reajustar el pH de la solución resultante para mejorar aún más la estabilidad de la composición. El pH se ajusta por los métodos conocidos por los expertos en este campo técnico, como por ejemplo, el agregado de una cantidad de ácido o base descrito más arriba, por ejemplo, solución madre al 10% (p/p) y midiendo el pH de la solución resultante usando, por ejemplo, un medidor de pH. En otra realización, si fuera necesario se reajusta el pH de la solución resultante a un valor que varia entre alrededor de 4,5 y alrededor de 7,5; preferiblemente entre alrededor de 5,0 y alrededor de 6,0; más preferiblemente, entre alrededor de 5,2 y alrededor de 5,6.

La presente invención se refiere, además, a composiciones farmacéuticas que comprenden una mezcla equilibrada de isómeros, agua, uno o más ácidos y uno o más codisolventes miscibles en agua. La cantidad de isómeros azálidos de las composiciones farmacéuticas varía desde alrededor de 50 mg de isómeros azálidos por ml de composición farmacéutica hasta alrededor de 200 mg de isómeros azálidos por ml de composición farmacéutica. Preferiblemente, las composiciones farmacéuticas comprenden desde alrededor de 75 mg hasta alrededor de 150 mg, más preferiblemente, desde alrededor de 90 hasta alrededor de 110 mg de isómeros azálidos por ml de composición farmacéutica.

Las composiciones farmacéuticas pueden incluir, además, uno o más antioxidantes. Los antioxidantes retrasan la tasa o evitan la degradación oxidativa de las composiciones farmacéuticas. Entre los antioxidantes adecuados se incluyen los siguientes aunque no se limitan a estos: bisulfito de sodio, sulfito de sodio, metabisulfito de sodio, tiosulfato de sodio, sulfoxilato sódico de formaldehído, ácido L-ascórbico, ácido eritórbico, acetilcisteína, cisteína, monotioglicerol ("MTG"), ácido tioglicólico, ácido tioláctico, tiourea, ditiotreitol, ditioeritreitol, glutationa, palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado, ácido nordihidroguaiarético, galato de propilo, \alpha-tocoferol y mezclas de los mismos. Los expertos en este campo técnico advertirán que la cantidad de antioxidante variará según el antioxidante usado. En una realización preferida el antioxidante, cuando está presente, se encuentra en una cantidad de alrededor de 0,01 mg hasta alrededor de 10 mg por ml de composición. En una realización más preferida, el antioxidante es el monotioglicerol y se encuentra en una cantidad de alrededor de 1 mg hasta alrededor de 8 mg por ml de composición farmacéutica. En una realización sumamente preferida, el antioxidante es el monotioglicerol y se encuentra en una cantidad de alrededor de 4 mg hasta alrededor de 6 mg por ml de composición farmacéutica.

Las composiciones farmacéuticas opcionalmente comprenden uno o más conservantes. Los conservantes son útiles para retrasar la tasa o evitar la proliferación de microrganismos, en especial cuando las composiciones farmacéuticas se exponen al aire. Los conservantes útiles son: eficaces contra una espectro amplio de microrganismos; estabilizantes de las composiciones farmacéuticas desde el punto de vista físico, químico y microbiológico durante su vida útil; atóxicos; adecuadamente solubles; compatibles con otros componentes de la composición y aceptables en cuanto a sabor y olor. Entre los conservantes adecuados se incluyen los siguientes, aunque no se limitan a estos: cloruro de benzalconio, cloruro de benzetonio, ácido benzoico, alcohol bencílico, metilparabeno, etilparabeno, propilparabeno, butilparabeno, benzoato de sodio, fenol y mezclas de los mismos. En una realización preferida dicho uno o más conservantes se eligen del grupo formado por: alcohol bencílico, metilparabeno, propilparabeno, una combinación de metilparabeno y propilparabeno, y fenol. Cuando están presentes, dicho uno o más conservantes se encuentran en una cantidad de alrededor de 0,01 a 10 mg por ml de composiciones farmacéuticas. Preferiblemente, dicho uno o más conservantes son el fenol y se encuentra en una cantidad de alrededor de 2,0 hasta alrededor de 5,0 mg por ml, más preferiblemente desde alrededor de 2,0 hasta alrededor de 3,0 mg por ml de las composiciones farmacéuticas. Los expertos en este campo técnico advertirán que la cantidad a usar de un conservante en las presentes composiciones dependerá del conservante elegido, y que algunos conservantes se pueden usar en concentraciones inferiores, incluso menores a alrededor de 0,01 mg por ml de las composiciones farmacéuticas.

En una realización preferida, las composiciones farmacéuticas de la invención tienen un pH de alrededor de 5,0 hasta alrededor de 7,0 y comprenden: (1) una mezcla equilibrada de isómeros que se encuentra en una cantidad de alrededor de 50 mg hasta alrededor de 200 mg por ml de la composición farmacéutica; (2) ácido cítrico que se encuentra en una concentración de alrededor de 0,02 mmol hasta alrededor de 0,3 mmol por ml de la composición farmacéutica y, opcionalmente, una cantidad de ácido clorhídrico eficaz para obtener el intervalo de pH; (3) propilenglicol, presente en una concentración de alrededor de 250 hasta alrededor de 750 mg por ml de la composición farmacéutica; (4) monotioglicerol, presente en una cantidad de alrededor de 1 mg hasta alrededor de 15 mg de la composición farmacéutica; y (5) agua, presente en una cantidad de alrededor de 100 mg hasta alrededor de 750 mg por ml de composición farmacéutica.

En una realización más preferida, las composiciones farmacéuticas de la invención tienen un pH de alrededor de 5,0 hasta alrededor de 6,0 y comprenden: (1) una mezcla equilibrada de isómeros que se encuentran en una cantidad de alrededor de 75 mg hasta alrededor de 150 mg por ml de la composición farmacéutica; (2) ácido cítrico presente en una cantidad de alrededor de 0,05 mmol hasta alrededor de 0,15 mmol por ml de composición farmacéutica y, opcionalmente, una cantidad de ácido clorhídrico eficaz para obtener el intervalo de pH; (3) propilenglicol, presente en una cantidad de alrededor de 400 hasta alrededor de 600 mg por ml de la composición farmacéutica; (4) monotioglicerol que se encuentra en una cantidad de alrededor de 1 mg hasta alrededor de 8 mg por ml de composición farmacéutica; y (5) agua, presente en una cantidad de alrededor de 250 hasta alrededor de 550 mg por ml de la composición farmacéutica.

En una realización sumamente preferida, las composiciones farmacéuticas de la invención tienen un pH de alrededor de 5,2 hasta alrededor de 5,6 y comprenden: (1) una mezcla equilibrada de isómeros que se encuentra en una cantidad de alrededor de 90 mg hasta alrededor de 110 mg por ml de composición farmacéutica; (2) ácido cítrico que se encuentra en una cantidad de alrededor de 0,075 mmol hasta alrededor de 0,125 mmol por ml de composición farmacéutica y una cantidad de ácido clorhídrico eficaz para obtener el intervalo de pH; (3) propilenglicol, que se encuentra en una cantidad de alrededor de 450 hasta alrededor de 550 mg por ml de composición farmacéutica; (4) monotioglicerol que se encuentra en una cantidad de alrededor de 4 mg hasta alrededor de 6 mg por ml de composición farmacéutica; y (5) agua, presente en una cantidad de alrededor de 300 hasta alrededor de 500 mg por ml de la composición farmacéutica.

Las composiciones farmacéuticas se pueden preparar de la siguiente forma. Se introducen los reactivos en un recipiente revestido de acero inoxidable o vidrio, con una capa sobrepuesta de nitrógeno opcional. Se agrega el agua para inyección al recipiente de reacción y se inicia la agitación. Se agrega cada componente adicional mientras se agita continuamente la mezcla. Se agrega ácido en una concentración de alrededor de 0,02 mmol hasta alrededor de 0,5 mmol por ml de agua y se deja disolver. Opcionalmente puede agregarse una solución acuosa de un ácido, por ejemplo una solución de solución acuosa de ácido clorhídrico al 10% (p/p), para ajustar el pH hasta el intervalo deseado y se mezcla la solución. En este punto, se agrega el isómero I o una mezcla de los isómeros I y II a la mezcla de agua y ácido, lentamente y en cantidades pequeñas para evitar la aglutinación. Se deja disolver el isómero I, o una mezcla del isómero I y el isómero II, y se mide el pH de la solución resultante. En una realización el isómero I, o de la mezcla del isómero I y el isómero II, se encuentran en una concentración de alrededor de 50 mg hasta alrededor de 500 mg por ml, preferiblemente de alrededor de 100 hasta alrededor de 300 mg por ml, y más preferiblemente de alrededor de 225 hasta alrededor de 275 mg por ml de la solución resultante. Luego se calienta la solución preferiblemente hasta una temperatura de 70ºC \pm 10ºC y se mantiene a esta temperatura hasta que se obtiene una mezcla equilibrada de isómeros. Los métodos para comprobar que se ha obtenido una mezcla equilibrada de isómeros incluyen la cromatografía en gel, la cromatografía en capa fina y la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). Por lo general, usado las condiciones descritas aquí se obtiene una mezcla equilibrada de isómeros en alrededor de 1 hasta alrededor de 8 horas. Una vez que se ha obtenido la mezcla equilibrada de isómeros, se enfría la solución resultante hasta 25ºC \pm 10ºC. Esta solución se puede usar como composición farmacéutica. Preferiblemente, se agrega codisolvente en una cantidad de alrededor de 250 hasta alrededor de 750 mg por ml de composición farmacéutica. El antioxidante se agrega opcionalmente, en una cantidad de alrededor de 0,01 mg hasta alrededor de 10 mg por ml de composición farmacéutica. Si está presente, el conservante se agrega en una cantidad de alrededor de 0,01 hasta alrededor de 10 mg por ml de la composición farmacéutica y se ajusta el pH entre alrededor de 5,0 hasta alrededor de 8,0, preferiblemente entre alrededor de 5,0 hasta alrededor de 6,0 agregando ácido o base, por ejemplo, como solución acuosa al 10% (p/p) o en forma sólida. La mezcla resultante se diluye hasta el volumen deseado. En otra realización la mezcla equilibrada de isómeros se encuentra en una concentración final de alrededor de 50 mg hasta alrededor de 200 mg, preferiblemente de alrededor de 75 mg hasta alrededor de 150 mg y, más preferiblemente, de alrededor de 90 mg hasta alrededor de 110 mg por ml de la composición farmacéutica resultante.

Preferiblemente las composiciones resultantes se esterilizan, por ejemplo, pasando las composiciones a través de un prefiltro, por ejemplo, un filtro de 5-10 micras y luego a través de un filtro esterilizante final de 0,2 micras previamente esterilizado. El filtro esterilizante se esteriliza en autoclave con calor húmedo durante 60 minutos a 121ºC, y se comprueba la integridad usando un método de mantenimiento de la presión antes de la esterilización y después de la filtración del producto. La solución estéril se introduce en recipientes adecuados, por ejemplo, viales de vidrio, que se esterilizan y despirogenan a 250ºC durante 240 minutos en túnel de calor seco. Sobre el espacio de la cabeza del recipiente se aplica un gas inerte, por ejemplo argón o, preferiblemente, nitrógeno. Se tapan los recipientes con tapones despirogenados mediante lavado y se esterilizan en autoclave con calor húmedo durante 60 minutos a 121ºC. Los recipientes se cierran con un segundo sello. Los expertos en este campo técnico advertirán que es posible hacer modificaciones mínimas a lo descrito más arriba para preparar composiciones estériles.

La presente invención se refiere, además, a métodos para tratar mamíferos que comprenden la administración de una cantidad farmacéuticamente eficaz de una composición farmacéutica de la invención a un mamífero que requiera este tipo de tratamiento. Las composiciones farmacéuticas de la invención se pueden usar para tratar infecciones de bacterias grampositivas, bacterias gramnegativas, protozoos y micoplasmas, incluyendo los siguientes microrganismos aunque sin limitarse a los mismos: Actinobacillus pleuropneumonia, Pasteurella multocida, Pasteurella haemolytica, H. parasuis, B. brochiseptica, S. choleraesuis, S. pilo, Moraxella bovis, H. somnus, M. bovis, Eimeria zuernii, Eimeria bovis, A. marginale, M. hyopneumoniae, Lawsonia intracellularis, Staphylococcus, Salmonella, Chlamydia, Coccidia, E. coli, Cryptosporidia, Haemophilus, neospora y especies de Streptococcus.

A no ser que se indique lo contrario, el término "tratamiento", según se lo utiliza aquí, incluye el tratamiento o la prevención de las infecciones bacterianas o protozoarias según se facilita con el método de la presente invención.

A no ser que se indique lo contrario, los términos "infeccione/s bacteriana/s" e "infección/ones protozoaria/s" según se los utiliza aquí incluyen varias infecciones bacterianas y protozoarias que se producen en los mamíferos, peces y pájaros además de los trastornos relacionados con las infecciones bacterianas y protozoarias que pueden tratarse o evitarse administrando antibióticos como los compuestos de la presente invención. Las infecciones bacterianas o protozoarias de ese tipo incluyen las siguientes: neumonía, otitis media, sinusitis, bronquitis, tonsilitis y mastoiditis asociadas a la infección por Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Moraxella catarrhalis, Staphylococcus aureus, o Peptostreptococcus spp.; faringitis, fiebre reumática y glomerulonefritis asociadas a la infección por Streptococcus pyogenes, estreptococos de los grupos C y G, Clostridium diptheriae o Actinobacillus haemolyticum; infecciones de las vías respiratorias relacionadas con la infección por Mycoplasma pneumoniae, Legionella pneumophila, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae o Chlamydia pneumoniae; infecciones de la piel y los tejidos blandos sin complicaciones, abscesos y osteomielitis y fiebre puerperal asociadas a la infección por Staphylococcus aureus, estafilococos coagulasa-positivos (esto es, S. epidermidis, S. hemolyticus, etcétera), Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactia, estreptocócicos de los Grupos C-F (estreptococos de colonia diminuta), estreptococos viridans, Corynebacterium minutissimum, Clostridium spp., o Bartonella henselae; infecciones urinarias agudas vinculadas a la infección por Staphylococcus saprophyticus o Enterococcus spp.; uretritis y cervicitis; y enfermedades de transmisión sexual asociadas a la infección por Chlamydia trachomatis, Haemophilus ducreyi, Treponema pallidum, Ureaplasma urealyticum o Neiserria gonorrheae; enfermedades producidas por toxinas asociadas a la infección por S. aureus (intoxicación alimentaria o síndrome de choque tóxico) o estreptococos de los Grupos A, B y C; úlceras asociadas a la infección por Helicobacter pylori, síndromes febriles diseminados asociados a la infección por Borrelia recurrentis; enfermedad de Lyme asociada a la infección por Borrelia burgdorferi; conjuntivitis, queratitis y dacrocistitis asociadas a la infección por Chlamydia Trachomatis, Neisseria gonorrhoeae; S. aureus, S. pneumoniae, S. pyogenes, H. influenzae o Listeria spp., enfermedad del complejo de Mycobacterium avium (MAC) diseminada asociada a la infección por Mycobacterium avium o Mycobacterium intracellulare; gastroenteritis asociada a la infección por Campylobacter jejuni; protozoarios intestinales asociados a la infección por Cryptosporidium spp.; infección odontógena asociada a estreptococos viridans; tos persistente asociada a la infección por Bordetella pertussis; gangrena gaseosa asociada a la infección por Clostridium perfringens o Bacteroides spp.; y ateroesclerosis asociada a la infección por Helicobacter pylori o Chlamydia pneumoniae. Infecciones bacterianas e infecciones y trastornos protozoarios asociados a las infecciones como las que pueden tratarse o evitarse en animales incluyen las siguientes: enfermedad respiratoria bovina asociada a la infección por P. haem., P. multocida, Mycoplasma bovis, o Bordetella spp.; enfermedad intestinal de la vaca asociada a la infección por E. coli o protozoos (esto es, Coccidia, Cryptosporidia, etcétera); mastitis de la vaca lechera asociada a la infección por Staph. aureus, Strep. uberis, Strep. agalactiae, Strep. dysgalactiae, Klebsiella spp., Corynebacterium o Enterococcus spp.; pleuroneumonía porcina asociada a la infección por A. pleuro., P. multocida o Mycoplasma spp.; enfermedad intestinal del cerdo asociada a la infección por E. coli, Lawsonia intracellularis, Salmonella o Serpulina hyodyisinteriae; inflamación de las pezuñas de la vaca asociada a la infección por Fusobacterium spp.; metritis de la vaca asociada a la infección por E. coli; verrugas pilosas de la vaca Fusobacterium necrophorum o Bacteroides nodosus, queratoconjuntivitis bovina asociada a la infección por Moraxella bovis; aborto prematuro bovino asociado a protozoos (esto es, neosporium); enfermedades de las vías urinarias de perros y gatos asociadas a la infección por E. coli; enfermedades de la piel y los tejidos blandos en perros y gatos asociados a la infección por Staph. epidermidis, S. intermedius, estafilococos coagulasa-negativos o P. multocida; e infecciones dentales y bucales en perros y gatos asociadas a la infección por Alcaligenes spp., Bacteroides spp., Clostridium spp., Enterobacter spp., Eubacterium, Peptostreptococcus, Porphyromonas o Prevotella. Otras infecciones bacterianas y protozoarias y trastornos asociados a esas infecciones que pueden tratarse y evitarse de acuerdo con el método de la presente invención se mencionan en J.P. Sanford et al., "The Sanford Guide To Antimicrobial Therapy", 26ª edición (Antimicrobial Therapy, Inc., 1996).

La actividad antibacteriana y antiprotozoaria de los compuestos de la presente invención contra los patógenos bacterianos y protozoarios se demuestra por la capacidad de los compuestos de inhibir el crecimiento de cepas definidas de patógenos humanos o animales.

Prueba I

La prueba I, descrita a continuación, emplea la metodología y los criterios de interpretación convencionales, y está diseñada para proporcionar orientación para las modificaciones químicas que pueden dar lugar a compuestos que soslayen los mecanismos de resistencia a los macrólidos. En la prueba I, se reúne un grupo de cepas bacterianas que incluye diversas especies patógenas objetivo, entre ellas representantes que cuentan con los mecanismos de resistencia a los macrólidos que se han caracterizado. El uso de este grupo permite determinar la relación entre la estructura química y la actividad con respecto a la potencia, el espectro de actividad, y los elementos estructurales y modificaciones que pueden ser necesarios para evitar los mecanismos de resistencia. Los patógenos bacterianos que comprenden el grupo de cribado se presentan en la tabla incluida más abajo. En muchos casos se dispone tanto la cepa parental susceptible a los macrólidos como de la cepa resistente a los macrólidos derivada de esta para proporcionar una evaluación más precisa de la capacidad de los compuestos de evitar los mecanismos de resistencia. Las cepas que contienen el gen denominado ermA/ermB/ermC son resistentes a los antibióticos macrólidos, lincosamidas y estreptogramina B debido a modificaciones (metilación) de las moléculas 23S rARN por una metilasa codificada por el erm; por esa razón, normalmente evitan la unión de las tres clases estructurales. Se han descrito dos tipos de eflujos por macrólidos: msrA codifica un componente de un sistema de eflujos en los estafilococos que evita la entrada de macrólidos y estreptograminas, mientras que mefA/E codifica una proteína transmembrana que parece efluir sólo por los macrólidos. La inactivación de los antibióticos macrólidos puede producirse y puede estar mediada por una fosforilación del 2N-hidroxilo (mph) o por la escisión de la lactona macrocíclica (esterasa). Las cepas se pueden caracterizar usando la tecnología de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR: polymerase chain reaction) o la secuenciación del determinante de la resistencia. El uso de la tecnología PCR en esta aplicación se describe en J. Sutcliffe et al., "Detection Of Erythromycin-Resistant Determinants By PCR", Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 40(11), 2562-2566 (1996). La prueba se realiza en bandejas de microtitulación y se interpreta según los criterios de sensibilidad antimicrobiana del Comité de Estandarización de los Laboratorios Clínicos de EE.UU. [Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests, sexta edición, estandarización aprobada publicada por The National Committee for Clinical Laboratory Standard (NCCLS)]. Para comparar las cepas se usa la concentración mínima inhibitoria (MIC: minimum inhibitory concentration). La mezcla equilibrada de isómeros azálidos se disuelve inicialmente en dimetilsulfóxido (DMSO) como solución madre de 40 mg/ml.

Nombre de la cepa	Mecanismo(s) de resistencia a macrólidos
Staphylococcus aureus 1116	progenitor susceptible
Staphylococcus aureus 1117	ermB
Staphylococcus aureus 0052	progenitor susceptible
Staphylococcus aureus 1120	ermC
Staphylococcus aureus 1032	msrA, mph, esterasa
Staphylococcus hemolyticus 1006	msrA, mph
Streptococcus pyogenes 0203	progenitor susceptible
Streptococcus pyogenes 1079	ermB
Streptococcus pyogenes 1062	progenitor susceptible
Streptococcus pyogenes 1061	ermB
Streptococcus pyogenes 1064	ermB
Streptococcus agalactiae 1024	progenitor susceptible
Streptococcus agalactiae 1023	ermB
Streptococcus pneumoniae 1016	susceptible
Streptococcus pneumoniae 1146	ermB
Streptococcus pneumoniae 1095	ermB
Streptococcus pneumoniae 1175	mefE
Streptococcus pneumoniae 0085	susceptible
Haemophilus influenzae 0131	susceptible
Moraxella catarrhalis 0040	susceptible
Moraxella catarrhalis 1055	Resistencia intermedia a la eritromicina
Escherichia coli 0266	susceptible

La prueba II se usa para comprobar la actividad contra Pasteurella multocida y la Prueba III para comprobar la actividad contra Pasteurella haemolytica.

Prueba II

Esta prueba se basa en el método de la dilución líquida en formato de micrólitro. Una única colonia de P. multocida (cepa 59A067) se inocula en 5 ml de caldo infusión cerebro-corazón (BHI: brain heart infusion). La mezcla equilibrada de isómeros azálidos se prepara solubilizando 1 mg de mezcla en 125 \mul de dimetilsulfóxido (DMSO). Se preparan diluciones de la mezcla equilibrada de isómeros azálidos preparadas usando un caldo BHI sin inocular. Las concentraciones usadas de la mezcla equilibrada de isómeros azálidos varían entre 200 \mug/ml y 0,098 \mug/ml preparadas por diluciones consecutivas a la mitad. El BHI inoculado con P. multocida se diluye en caldo BHI sin inocular para obtener una suspensión de 10^{4} células por 200 \mul. Las suspensiones de BHI se mezclan con las respectivas diluciones en serie de la mezcla de isómeros de azálidos en equilibro y se inoculan a 37ºC durante 18 horas. La mínima concentración inhibitoria (MIC) es igual a la concentración de la mezcla que inhibe el 100% del crecimiento de P. multocida según lo determinado por comparación con un control sin inocular.

Prueba III

Esta prueba se basa en el método de dilución en agar usando un replicador Steers Replicator. Dos a cinco colonias aisladas de una placa de agar se inoculan en el caldo BHI y se incuban durante toda una noche a 37ºC con agitación (200 rpm). A la mañana siguiente, 300 \mul del precultivo de P. haemolytica totalmente desarrollado se inoculan en 3 ml de caldo BHI fresco y se incuban a 37ºC con agitación (200 rpm). Se disuelven cantidades adecuadas de la mezcla equilibrada de isómeros azálidos en etanol, y se prepara una serie de diluciones consecutivas a la mitad. Dos ml de las respectivas diluciones consecutivas se mezclan con 18 ml de agar BHI derretido y se solidifica. Cuando el cultivo inoculado con P. haemolytica alcanza una densidad estándar de 0,5 McFarland, se inoculan aproximadamente 5 \mul del cultivo de P. haemolytica en las placas de agar con BHI con las diversas concentraciones de la mezcla equilibrada de isómeros azálidos, usando un replicador Steers Replicator, y se incuba durante 18 horas a 37ºC. Las concentraciones iniciales de la mezcla varían de 100-200 \mug/ml. El MIC es igual a la concentración de la mezcla que muestra el 100% de la inhibición del crecimiento de P. haemolytica según lo comprobado por comparación con un control sin inocular.

Más preferiblemente, la prueba de la microdilución se realiza usando un caldo Mueller-Hinton ajustado por cationes según el criterio M31-A del NCCLS, vol. 19, nº 11, "Performance standards for antimicrobial disk and dilution susceptibility tests of bacteria isolated from animals". Junio de 1999 (ISBN 1-56238-377-9), que se incorpora aquí como referencia. Este análisis se puede usar para determinar la MIC de un compuesto contra caldo con P. haemolytica y P. multocida. Por ejemplo, la mezcla equilibrada de isómeros se evaluó siguiendo este criterio, contra P. haemolytica (ATCC 14003) y se encontró que tenía una MIC de 1 \mug/ml. Cuando la mezcla equilibrada de isómeros se evaluó según este criterio, contra P. multocida (ATCC 43137) se encontró que la MIC era de 1 \mug/ml.

Prueba IV

La actividad in vivo de las composiciones farmacéuticas de la presente invención se puede verificar por estudios convencionales de protección animal bien conocidos por los expertos en este campo técnico que se realizan normalmente en ratones.

Tras la llegada de los ratones se los asigna a diferentes jaulas (10 por jaula), y se los deja aclimatar durante un mínimo de 48 horas antes de usarse. Se inoculan los animales con 0,5 ml de una suspensión de bacterias (P. multocida cepa 59A006) por vía intraperitoneal. Cada experimento tiene al menos 3 grupos de control sin medicar, entre ellos, uno infectado con una dosis de provocación de 0,1X y dos infectados con una dosis de provocación de 1X; también puede usarse un grupo de datos de provocación 10X. Por lo general, todos los ratones de un estudio determinado se pueden provocar en 30-90 minutos, en especial si se usa una jeringa para dosis repetidas (como la jeringa Cornwall7) para administrar la provocación. Treinta minutos después de iniciada la provocación se administra el primer tratamiento con composición farmacéutica. Es posible que sea necesario que una segunda persona inicie la dosificación de la composición farmacéutica si no se han provocado todos los animales en 30 minutos. Las vías de administración son subcutánea u oral. Las dosis subcutáneas se administran en la piel laxa de la nuca; mientras que las dosis orales se administran mediante una aguja de alimentación. En ambos casos, se usa un volumen de 0,2 ml por ratón. Se administran las composiciones 30 minutos, 4 horas y 24 horas después de la provocación. En cada prueba se incluye una composición de control con eficacia conocida administrada por la misma vía. Se observan los animales a diario y se registra el número de supervivientes de cada grupo. El modelo de control de P. multocida continúa durante 96 horas después de la provocación (cuatro días).

La LD_{50} es la dosis calculada a la cual la composición farmacéutica probada protege al 50% de un grupo de ratones de la muerte debida a la infección bacteriana que sería mortal en ausencia de tratamiento.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención muestran actividad antibacteriana en una de las pruebas descritas más arriba, en particular en la prueba IV.

Las composiciones farmacéuticas de la invención se pueden usar para tratar seres humanos, vacas, caballos, ovejas, cerdos, cabras, conejos, gatos, perros y otros mamíferos que necesiten este tipo de tratamiento. En particular las composiciones farmacéuticas de la invención se pueden usar para tratar, por ejemplo, la enfermedad respiratoria bovina, la pleuroneumonía porcina, la neumonía, la pasteurelosis, la coccidiosis, la anaplasmosis y la queratitis infecciosa. Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar por las vías oral, intramuscular, intravenosa, subcutánea, intraocular, parenteral, tópica, intravaginal o rectal. Para administrar a vacas, cerdos u otros animales domésticos, las composiciones farmacéuticas se pueden administrar con el alimento o por vía oral como una composición empapada. Preferiblemente las composiciones farmacéuticas se administran por inyección intramuscular, intravenosa o subcutánea. En una realización preferida las composiciones farmacéuticas se administran en dosis que varían desde alrededor de 0,5 mg de mezcla equilibrada de isómeros por kilo de peso corporal por día (mg/kg/día) hasta alrededor de 20 mg/kg/día. En una realización más preferida las composiciones farmacéuticas se administran en dosis que varían desde alrededor de 1 mg/kg/día hasta alrededor de 10 mg/kg/día. En una realización sumamente preferida, las composiciones farmacéuticas se administran en dosis que varían desde alrededor de 1,25 mg/kg/día hasta alrededor de 5,0 mg/kg/día. Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar hasta varias veces al día durante alrededor de 1 a 15 días, preferiblemente 1 a 5 días, y repetirse cuando sea necesario. Los expertos en este campo técnico advertirán fácilmente que la dosis puede variar dependiendo de la especie, el peso y el estado del individuo a tratar, su respuesta individual a las composiciones farmacéuticas y la vía de administración particular elegida. En algunos casos, niveles de dosis por debajo del límite inferior de los intervalos mencionados más arriba pueden ser eficaces terapéuticamente, mientras que en otros casos pueden usarse dosis aún mayores sin causar ningún efecto secundario perjudicial, siempre que esas dosis mayores se dividan primero en varias dosis pequeñas para administrarlas a lo largo del día.

Los ejemplos siguientes complementan la descripción de las composiciones y los métodos de la presente invención. Se debe entender que la presente invención no se limita a los detalles específicos de los ejemplos proporcionados a continuación.

Ejemplo 1

Síntesis del isómero II. En un matraz de Erlenmeyer de 2 litros se introdujo desmetilazitromicina (190,5 g; 259,2 mmol), cloruro de metileno (572 ml) y sulfato de magnesio (38 g). Se agitó la mezcla durante 10 minutos, luego se filtró en un matraz de 5 litros de fondo redondo. Se agregó una cantidad adicional de cloruro de metileno (2.285 ml) a la solución enfriada hasta 0-5ºC. Luego se agregó cloroformato de bencilo (CBZ-Cl) (58,4 ml) en 10 minutos. Se agitó la reacción a 0ºC durante 6 horas y luego a temperatura ambiente durante toda la noche. El análisis por HPLC indicó la presencia de material inicial residual de modo se volvió a enfriar la reacción a \backsimeq 0ºC y se agregó más CBZ-Cl (19,5 ml) de una sola vez. Se agitó la reacción durante 5,5 horas a 0ºC, luego durante 2,5 horas a temperatura ambiente. La TLC indicó una reacción completa. Se detuvo la reacción con bicarbonato de sodio acuoso saturado (953 ml) y se separaron las fases. La fase orgánica se secó sobre sulfato de magnesio, luego se filtró y se concentró para proporcionar el compuesto de fórmula (III):

6

En un matraz de 5 litros de fondo redondo que contenía el compuesto de fórmula (III) (225,3 g) en cloruro de metileno (901 ml) y DMSO (450 ml) a -65ºC, se agregó anhídrido trifluoracético (82,4 ml). Se mantuvo la temperatura a -60ºC durante el agregado el cual se completó en 9 minutos. Se agitó la reacción a -65 hasta -70ºC durante 20 minutos. Se detuvo la reacción con trietilamina (145 ml) luego se agitó a una temperatura entre -60 y -65ºC durante 20 minutos. Luego se agregó agua (1.127 ml) a la mezcla reactiva en 3 minutos, momento en el que la temperatura alcanzó los -2ºC. La mezcla reactiva se agitó durante 10 minutos y se dejó separar las fases. La fase orgánica se lavó con agua (675 ml) y luego con solución acuosa saturada de cloruro de sodio (675 ml). La fase orgánica se secó sobre sulfato de magnesio, luego se filtró y se eliminaron los solventes orgánicos por destilación. Se agregó MTBE, y se destiló para eliminar todas las trazas de cloruro de metileno y DMSO. Se agregó MTBE adicional hasta un volumen total de 3.380 ml. Se agregó monohidrato de ácido dibenzoil-D-tartárico (87,8 g) en MTBE (1.126 ml) para formar una suspensión espesa. Se calentó la mezcla a reflujo y se agitó durante toda la noche. Después de enfriar hasta la temperatura ambiente, se recogieron los sólidos en un embudo de Buchner y se enjuagaron con MTBE. Se secaron los sólidos en un horno para secado a 40ºC para obtener 258,3 g de sal tartrato de dibenzoilo del compuesto de fórmula (IV):

7

En un matraz de fondo redondo de 3 litros se introdujo cloruro de metileno (800 ml) y la sal tartrato de dibenzoilo del compuesto de fórmula (IV) (188 g). Se agregaron agua (400 ml) y carbonato de potasio (45,5 g) y se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 5 minutos. Se separó la fase orgánica, luego se lavó con agua (250 ml) y se secó sobre sulfato de magnesio. El agente secante se eliminó por filtración y la solución resultante se evaporó bajo un chorro de nitrógeno hasta un volumen final de 623 ml hasta obtener cetona en base libre.

En un matraz de fondo redondo de 5 litros se introdujo THF (623 ml) y bromuro de trimetilsufolnio (74,7 g). La suspensión resultante se enfrió a -10ºC y se agregó terc-butóxido potásico (54,4 g). La mezcla reactiva se agitó durante 10 minutos a -10ºC y luego se enfrió a -70ºC en 5 minutos. Se agregó una solución de cetona en base libre en 11 minutos, manteniendo la temperatura entre -60 y -65ºC. La HPLC indicó que la reacción estaba acabada después de 90 minutos. La reacción se detuvo a -60ºC usando una solución de cloruro de amonio (315 g) en agua (1.800 ml). La temperatura aumentó a -5ºC durante la detención. La mezcla reactiva se calentó hasta 5-10ºC y se separaron las fases. Se secó la fase orgánica sobre la solución de sulfato de sodio, luego se filtró y se concentró para obtener el compuesto de fórmula (V) (117,4 g) en forma de espuma amarilla. La HPLC indicó una pureza del 61,4% por área máxima.

8

A una solución del compuesto de fórmula (V) (275 g, 312 mmol) en metanol seco (2,75 l) se agregó ioduro de potasio (518 g; 3,12 mol) y n-propilamina (250 ml; 3,04 mol). Se agitó la mezcla durante toda la noche a 45ºC. La TLC indicó una reacción completa. La reacción se concentró sobre un evaporador rotatorio y el residuo se fraccionó entre agua (2,5 l) y cloruro de metileno (2,5 l). Se ajustó el pH de la fase acuosa a 6,7 usando HCl acuoso 3 N. Se repitió la extracción una vez más. Las fases acuosas combinadas se combinaron con cloruro de metileno fresco (1,5 l) y se ajustó el pH de la fase acuosa a 8,5 usando carbonato de potasio sólido. Se separaron las fases y la fase acuosa volvió a extraerse dos veces con cloruro de metileno adicional. Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre sulfato de sodio y luego se filtraron. El filtrado se concentró sobre un evaporador rotatorio para obtener una espuma beige (230 g). Se realizó la purificación de la espuma sobre una columna preparada con gel de sílice en suspensión usando 19/3 (v/v) de hexanos-dietilamina como fase móvil. De esta forma, 125 g de producto bruto produjeron 72 g de isómero I en forma de espuma blanca amorfa.

El isómero I se disolvió en acetonitrilo (0,5 l) a temperatura ambiente. Luego se agregó agua desionizada (1 l) lo cual causó precipitación. Luego se agregó más acetonitrilo (0,5 l) para dar una solución homogénea que se agitó a temperatura ambiente durante 30 horas. El análisis por HPLC indicó la formación de un componente nuevo que comprendía el \backsimeq 20% del área máxima total.

Se eliminó el solvente orgánico en un evaporador rotatorio. Se agregó carbonato de potasio (30 g) al residuo acuoso seguido de cloruro de metileno (0,3 l). Se agitó la mezcla y se eliminó la fase orgánica inferior. También se realizaron dos extracciones más (2 x 0,3 l). Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre sulfato de sodio, luego se filtraron y la solución resultante se concentró hasta obtener una espuma seca (\backsimeq 10 g).

La mezcla de isómero I e isómero II resultante, se disolvió en una mezcla de cloruro de metileno y 19/3 (v/v) de hexanos-dietilamina, y se colocó sobre una columna preparada con gel de sílice en suspensión, luego se eluyó con el sistema 19/3. El eluyente se cambió a 19/6 hexanos-dietilamina en la fracción 56. Las fracciones 9-17 se combinaron y se concentraron hasta formar una espuma seca que contenía sólo el material inicial sin reaccionar. Las fracciones 52-72 se combinaron y se concentraron, y contenían el isómero II (79% de pureza por HPLC).

Ejemplo 2

La Tabla 1 incluida más abajo muestra el efecto del pH, la temperatura, el tipo de ácido y la concentración del isómero I sobre la tasa de la reacción de equilibrio y los niveles de las principales impurezas después del equilibrio. Repeticiones del experimento (datos no mostrados) han demostrado la reproducibilidad de los resultados. La relación de los isómeros I y II en el equilibrio (alrededor del 90% \pm 4% del isómero I y alrededor del 10% \pm 4% del isómero II) fue similar en todos los experimentos. El análisis de los datos indica que el pH y la temperatura tienen un efecto significativo sobre el tiempo requerido para que se establezca el equilibrio. Sin circunscribirse a ninguna teoría, por lo general las temperaturas de equilibrio inferiores y los valores de pH inferiores dan como resultado tiempos hasta el equilibrio sustancialmente más prolongados. El tiempo hasta el equilibrio también puede depender, por ejemplo, de la concentración de las sustancias de partida, y del tipo y la concentración del ácido usado. El isómero I a una concentración de aproximadamente 300 mg por ml de la composición como máximo se calentó hasta una temperatura comprendida entre alrededor de los 40ºC y alrededor de los 80ºC en presencia de uno o más ácidos a una concentración de alrededor de 0,2 mmol hasta alrededor de 1,0 mmol por ml de mezcla y con una cantidad suficiente de ácido clorhídrico para lograr un pH de alrededor de 6,5 hasta alrededor de 7,5 durante un máximo de 20 horas para producir una mezcla equilibrada de isómeros que tiene una pureza del 95%-98%. Los parámetros cinéticos del equilibrio y los niveles de impurezas en el equilibrio de los isómeros de azálidos I y II se determinaron en función del pH, la temperatura del equilibrio, el tipo de ácido y la concentración del isómero I, y se enumeran en la Tabla 1. Para identificar las impurezas pueden usarse los métodos conocidos incluyendo la cromatografía líquida de alta resolución ("HPLC"), la espectroscopia de resonancia magnética nuclear ("MNR"), la cromatografía de gases ("GC"), la espectrometría de masas ("MS"), la cromatografía líquida y espectrometría de masas ("LC/MS"), GC/MS, y la cromatografía en capa fina ("TLC"). "DS" se refiere al isómero I antes del equilibrio y se incluye para comparar.

Las mezclas equilibradas de isómeros se prepararon y se analizaron de la siguiente forma. Se prepararon 40 ml de solución en cada uno de los experimentos 1A-11A, se dividió cada solución en alícuotas de 1 ml antes del calentamiento para analizar con mayor facilidad el equilibrio en diferentes momentos de evaluación. Se prepararon 20 ml de solución en cada uno de los experimentos 12B-24B y cada solución se dividió en alícuotas de 0,7 ml antes del calentamiento. Se prepararon 100 ml de solución en cada uno de los experimentos 25C-28C, 200 ml de solución en cada uno de los experimentos 29C-30C y se analizó el equilibrio a partir de alícuotas de 0,5 ml extraídas de las soluciones. Se prepararon 60 ml de solución en cada uno de los experimentos 31D-33D y 35D-41D, 170 ml de solución en el experimento 34D y se analizó el equilibrio a partir de alícuotas de 0,5 ml extraídas de las soluciones. Se prepararon entre 7.200 a 54.000 ml de solución en cada uno de los experimentos 42E-46E y se analizó el equilibrio extrayendo alícuotas de 2 ml a 5 ml de la solución. Se prepararon 35 ml a 50 ml de solución en cada uno de los experimentos 47F-50G, y se dividió cada solución en alícuotas de 1 ml antes del calentamiento. Se agregó agua al recipiente correspondiente, seguida por el tipo y la cantidad de ácido enumerados en la columna 4 de la Tabla 1. Los términos "qs" que preceden al tipo de ácido se refieren a la cantidad de ácido suficiente como para lograr el pH indicado en la columna 2. Cuando se usó ácido cítrico o tartárico 0,1 M, también se agregó ácido clorhídrico en una cantidad suficiente como para obtener el pH indicado en la columna 2. Cuando se incluye la concentración de un ácido en la columna 4 (por ejemplo, "ácido cítrico 0,1 M"), esa es la concentración de ácido de una solución que tiene una mezcla equilibrada del isómero I y el isómero II que se encuentra en una concentración de 100 mg/ml. Se agitó la mezcla de agua y ácido hasta que se disolvió todo el ácido (alrededor de 5 minutos o menos para los volúmenes más pequeños, y alrededor de 20 minutos para los volúmenes mayores). El isómero I se agregó lentamente y en partes pequeñas para evitar aglutinación, y la mezcla resultante se agitó vigorosamente hasta la disolución (menos de 30 minutos para los volúmenes menores y alrededor de 60-120 minutos para los volúmenes mayores). Después de la disolución del isómero I, se midió el pH resultante de la solución. Si el pH era inferior al pH indicado en la columna 2, se aumentaba el pH de la columna 2 con hidróxido de sodio al 10%. Si el pH era mayor que el pH indicado en la columna 2, se lo disminuía con el ácido o los ácidos adecuados. Para cada experimento se calentó la solución a la temperatura indicada en la columna 3 hasta que se obtenía una mezcla equilibrada de isómeros, según lo determinado por los análisis por HPLC descritos más abajo. En algunos experimentos, se calentaron las mezclas durante un periodo mayor al requerido para el equilibrio (porcentajes mayores al 100% de la columna 8) para determinar los efectos del calor prolongado sobre el grado de impurezas.

Para analizar el equilibrio entre los isómeros azálidos, se analizaron alícuotas de la mezcla reactiva por HPLC en varios momentos durante el proceso de equilibrio. Para la mayoría de los experimentos que se muestran en la Tabla 1, se diluyeron alícuotas con 40 mM de tampón fosfato de potasio (pH 6,0) hasta una concentración de aproximadamente 0,5 mg de isómeros azálidos por ml de volumen total de la muestra, y se sometieron a cromatografía usando una columna Asahipak ODP-50, 5 \mum, 250 x 4,0 mm (40% de acetonitrilo/35% de metanol/25% de fosfato de potasio 40 mM; pH de la fase móvil 8,5; flujo 0,7 ml/min; temperatura ambiente) sobre un Cromatógrafo líquido HP 1090 equipado con un Detector de absorbancia programable externo Applied Biosystems 783A. Los máximos se detectaron observando la absorción ultravioleta a 210 nm. Para el resto de los experimentos de equilibrio que se presentan en la Tabla 1 (experimentos 31D-46E), se diluyeron alícuotas con 20% de acetonitrilo/50% de metanol, 30% de fosfato de potasio 50 mM (pH 5,5) hasta una concentración de 1,0 mg de isómeros azálidos por ml de volumen total de muestra y se sometieron a cromatografía usando una columna YMC Pro-Pack C_{18}, 3 \mum, 50 x 2,0 mm (20% de acetonitrilo/50% de metanol/30% de fosfato de potasio 50 mM; pH de la fase móvil 7,0; flujo 0,5 ml/min.; temperatura ambiente) en un Cromatógrafo líquido HP 1090 con Detector de UV interno. Los máximos se detectaron midiendo la absorción en el ultravioleta a 210 nm. Las cantidades relativas del isómero I y el isómero II se determinaron tomando la relación de sus áreas máximas del cromatograma. Con las condiciones de HPLC arriba mencionadas, el isómero I tiene un tiempo de retención de alrededor de 13-23 minutos y el isómero II tiene un tiempo de retención relativo ("RRT") de alrededor de 0,8 a 0,9. Por "RRT" se entiende un tiempo de retención relativo al del isómero I con las condiciones de HPLC descritas más arriba.

La pureza de las muestras equilibradas de la Tabla 1 se determinó usando HPLC según uno de los tres procedimientos. En los experimentos 1A-24B, 48F y 50G, se diluyeron alícuotas con tampón fosfato de potasio 25 mM (pH 5,5) hasta una concentración de 1,25 mg de isómeros azálidos por ml de volumen total de muestra y se analizaron usando una columna Eclipse XDB-C_{8}, 5 \mum, 250 x 4,6 mm (22% de acetonitrilo/58% de metanol/20% de 25 mM de fosfato de potasio; pH de la fase móvil 8,0; flujo 0,6 ml/min; temperatura ambiente) en un Módulo de separación Waters Alliance 2690 con un Detector amperimétrico BAS CC-5/LC-4C. Se detectaron los máximos electroquímicamente con un electrodo a +0,70 V, un segundo electrodo a +0,88 V y con un intervalo de 0,5 \muA. En los experimentos 25C-41D, se diluyeron las alícuotas con 50 mM de ácido cítrico (pH 5,5) hasta una concentración de 0,25 mg de isómeros azálidos por ml de volumen total de muestra y se analizaron usando una columna YMC Pro-Pack C_{18}, 3 \mum, 150 x 4,6 mm (70% de metanol/30% de fosfato de potasio 50 mM; pH de la fase móvil 7,0; flujo 1 ml/min.; temperatura ambiente) en el sistema Waters Alliance. Se detectaron los máximos electroquímicamente con un electrodo a +0,90 V. En los experimentos 42E-43E, se diluyeron alícuotas con ácido cítrico 50 mM (pH 5,5) hasta una concentración de 0,25 mg de isómeros azálidos por ml de volumen total de muestra y se evaluaron usando una columna YMC Pro-Pack C_{18}, 3 \mum, 150 x 4,6 mm (70% de metanol/30% de fosfato 50 mM; fase móvil pH 7,0; flujo 1 ml/min; temperatura ambiente) en un Cromatógrafo líquido HP 1090 con un detector amperimétrico BAS CC-5/LC. Los máximos se detectaron electroquímicamente con un solo electrodo a +90V. El porcentaje de la mezcla equilibrada de isómeros (columna 9) y las impurezas (columna 10) relativas a la muestra evaluada se determinaron usando las áreas bajo los máximos de los cromatogramas. Algunas de las impurezas detectadas fueron: un azálido descladinosa (siendo su RRT de alrededor de 0,26 sobre una columna Eclipse XDB-C_{8}), un producto resultante de la inserción de acetaldehído (siendo su RRT de aproximadamente 1,75 en una columna Eclipse XDB-C_{8}), y un producto resultante de la inserción de formaldehído (siendo su RRT de aproximadamente 1,6 en una columna Eclipse XDB-C_{8}).

El azálido descladinosa tiene la estructura:

9

\newpage

El producto resultante de la inserción de acetaldehído tiene la estructura:

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El producto resultante de la inserción de formaldehído tiene la estructura:

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El azálido descladinosa, el producto resultante de la inserción de acetaldehído y el producto resultante de la inserción de formaldehído y las sales farmacéuticamente aceptables de lo mismos tienen propiedades antibióticas y son útiles como agentes antibióticos.

Los experimentos de los grupos A y B (identificados por la letra que sigue al número de experimento) de la Tabla 1 se realizaron para determinar los efectos del pH, la temperatura, el tipo de ácido, la concentración de ácido y la concentración del isómero I sobre el equilibrio. Los experimentos del grupo C de la Tabla 1 ilustran los efectos del pH y la temperatura sobre el equilibrio. Los experimentos del grupo D de la Tabla 1 ilustran los efectos del pH, la temperatura y la concentración de ácido sobre el equilibrio. Los experimentos del grupo E de la Tabla 1 ilustran un método preferido de equilibrio, es decir, con un pH de alrededor de 7,0, una temperatura del equilibrio de alrededor de 70ºC y una concentración del isómero I de alrededor de 250 mg/ml. Los experimentos del grupo F evaluaron los efectos de ácidos alternativos y de las temperaturas del equilibrio, y el experimento G se realizó en presencia de un 50% del codisolvente propilenglicol.

Los resultados de estos experimentos indican que, incluso en condiciones diversas, el equilibrio de los isómeros azálidos da resultados consistentes en la formación de alrededor de un 90% \pm 4% del isómero 1 y alrededor de un 10% \pm 4% del isómero II. La temperatura de equilibrio y el pH parecen tener un efecto mayor sobre la tasa del equilibrio, con temperaturas mayores generalmente conduciendo a tasas mayores, incluso con concentraciones del isómero I mayores. Sin embargo, en la mayoría de los casos, los tiempos hasta el equilibrio mayores dieron como resultado mayores concentraciones de impurezas y, por tanto, las condiciones óptimas para el equilibrio son las que conducen a tasas de equilibrio relativamente altas, es decir, que forman la mezcla equilibrada de isómeros en 1-3 horas.

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Ejemplo 3

En la Tabla 2 incluida más abajo se muestra la estabilidad de las composiciones equilibradas almacenadas a 50ºC durante 12 semanas y estabilizadas con codisolvente. Los resultados indican que las composiciones que no contienen codisolvente son significativamente menos estables que las composiciones que contienen codisolvente en una cantidad de alrededor de 250 hasta alrededor de 500 mg por ml de composición (experimentos 1A-11B). Las composiciones que tienen un pH de alrededor de 5,4 que contienen propilenglicol ("PG") en una cantidad de alrededor de 450 hasta alrededor de 550 mg por ml de composición son las más estables. Se pueden usar otros codisolventes para estabilizar las composiciones (experimentos 1E-2E); sin embargo, se prefiere el propilenglicol. Como se muestra en la Tabla 2, la estabilidad depende del pH y también puede depender del tipo y la cantidad de ácido usado y de la concentración de la mezcla de isómeros equilibrada.

Estas composiciones se prepararon de la siguiente forma. Después de calentar hasta la temperatura deseada (columna 2) y dejando que la mezcla de agua, ácido e isómero I se equilibre durante el tiempo que indica la columna 3, las mezclas equilibradas de isómeros se dejaron enfriar hasta la temperatura ambiente. Cuando las mezclas alcanzaban la temperatura ambiente, se agregaba la cantidad adecuada del codisolvente deseado (columna 6). El porcentaje de codisolvente que se muestra en la columna 6 es un porcentaje de peso a volumen (por ejemplo, 50% de PG es 500 mg de propilenglicol por ml de composición farmacéutica). Si se usaba un antioxidante o un conservante, se agregaban las cantidades adecuadas (columnas 8 y 9). Se midió el pH de la solución y se ajustó hasta el valor de la columna 5 agregando uno o más ácidos o 10% p/p de solución de hidróxido de sodio. Luego se ajustaron los volúmenes de las soluciones resultantes agregando agua. Se filtraron las composiciones a través de filtros esterilizantes de 0,2 micras. Se llenaron los viales bajo una campana de flujo laminar y antes de sellar se aplicó un chorro de la mezcla de gases correspondiente (columna 10) sobre el espacio de la cabeza del vial.

Se analizaron el equilibrio y la pureza usando una HPLC según lo descrito en el Ejemplo 2 antes descrito. Se determinó la estabilidad de las composiciones equilibradas selladas en viales de vidrio almacenadas durante 12 semanas a 50ºC. Se estudiaron los efectos de la concentración de la mezcla equilibrada de isómeros, el pH, la cantidad y el tipo de codisolvente, el tipo y la concentración del ácido, la exposición al aire, la presencia de conservantes y la presencia de antioxidantes. Los resultados se muestran en la Tabla 2.

Los experimentos 1A-3A se realizaron para estudiar el efecto de la concentración de la mezcla equilibrada sobre la estabilidad. Los experimentos 2A, 6A y 7A se realizaron para comprobar el efecto del pH sobre la estabilidad. Los experimentos 2A, 4A y 5A demuestran el efecto de la cantidad de codisolvente sobre la estabilidad, y los experimentos 3A y 8A muestran el efecto de usar el ácido cítrico solo, en lugar de las mezclas de ácido cítrico y ácido fosfórico, para obtener un pH ácido. Los experimentos 1B-11B muestran los efectos del pH y del codisolvente propilenglicol ("PG") sobre la estabilidad. Los experimentos 1C y 2C muestran el efecto de usar el ácido tartárico solo, en lugar de la mezcla de ácido tartárico y ácido clorhídrico, para obtener un pH ácido. Los experimentos 9B-11B y 3C muestran los efectos de un conservante sobre la estabilidad de la mezcla, y los experimentos 9B-11B, 4C y 5C muestran los efectos de un antioxidante sobre la estabilidad de la mezcla. Los experimentos 6C y 7C muestran los efectos de usar una mezcla de ácido tartárico y de ácido clorhídrico, o de una mezcla de ácido cítrico y ácido clorhídrico, sobre la estabilidad. Los experimentos 1D-12D muestran los efectos de las diferentes cantidades del antioxidante monotioglicerol ("MTG") y de diferentes grados de exposición al oxígeno sobre la estabilidad. Los experimentos 4D-6D y 13D-18D demuestran los efectos del pH de la composición y de la concentración de ácido sobre la estabilidad.

Los resultados de estos experimentos indican que después de permanecer almacenadas durante 12 semanas a 50ºC, las composiciones equilibradas que contienen al menos un 50% de propilenglicol y que tienen un pH que varía entre alrededor de 5,2 y alrededor de 5,5 mantienen más del 93% de la concentración inicial de la mezcla equilibrada de isómeros. El nivel más alto de impurezas se encontró en una composición sin codisolvente (experimento 4A). Conforme a lo anterior, la presencia de codisolvente sorprendentemente e inesperadamente limita la cantidad de impurezas. Se encontraron niveles altos de impurezas tras 12 semanas en composiciones con menos de un 40% de codisolvente y un pH de menor de 5,0. La concentración del ácido también afecta la estabilidad de las composiciones farmacéuticas. Composiciones con concentraciones relativamente bajas de ácido (alrededor de 20 mM) y un pH de alrededor de 5,4 muestran la mayor estabilidad después del almacenamiento. Sin embargo, concentraciones bajas de ácido dan como resultado una fuerza tampón baja, lo cual lleva a un pH fluctuante y puede producir un grado relativamente alto de impurezas en otras condiciones de tiempo o temperatura.

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Ejemplo 4

Se prepararon cincuenta y dos litros de una composición farmacéutica inyectable con 100 mg de mezcla equilibrada de isómeros por ml de composición de la siguiente forma. Se introdujeron 16,584 kg de agua para inyección (grado USP) lavados con nitrógeno (grado NF) en un recipiente para preparar compuestos y se inició la agitación. También se usó nitrógeno como capa sobrepuesta para reducir la exposición de la solución al oxígeno en el recipiente para compuestos durante la elaboración. Se agregó al agua aproximadamente 1 kg de ácido cítrico anhidro (grado USP) y la mezcla resultante se agitó hasta la disolución del ácido. Posteriormente se agregaron a la mezcla 1,511 kg de solución de ácido clorhídrico al 10% (p/p) (grado NF) en agua (grado USP). Se agregaron lentamente a la mezcla mientras se agitaba 5,357 kg de una mezcla de aproximadamente un 97% de isómero I e isómero II (en una relación de alrededor de 99:1) y un 3% de una o más impurezas y se dejó disolver. El pH de la solución resultante se ajustó a 7,0 \pm 0,5 agregando 0,224 kg de una solución de ácido clorhídrico en agua al 10% (p/p). Se logró el equilibrio de los isómeros I y II calentando la solución a 70ºC \pm 10ºC durante 105 minutos. Una vez terminado el equilibrio, según se comprobó usando HPLC, se dejó enfriar la solución hasta 25ºC + 10ºC, y se agregaron 26,008 kg de propilenglicol (grado USP) a la mezcla mientras se agitaba. Una vez mezclado completamente el propilenglicol en 0,26 kg de monotioglicerol (grado NF), se agregó a la solución y se reajustó el pH a 5,4 \pm 0,3 agregado de 2,349 kg de ácido clorhídrico al 10% (p/p) en agua. El volumen final se ajustó a 52,015 litros agregando 1,843 kg de agua. La composición resultante contenía 100 mg de la mezcla equilibrada de isómeros por ml de composición, 500 mg por ml de propilenglicol, ácido cítrico a una concentración de 0,1 M y monotioglicerol a una concentración de 5 mg/ml de composición.

La composición se filtró a través de un prefiltro de 6 micras y luego a través de un filtro esterilizante final de 0,2 micras que se esterilizó en autoclave con calor húmedo durante 60 minutos a 121ºC, y se evaluó la integridad usando el método de mantenimiento de la presión tanto antes de la esterilización como después de la filtración. Se esterilizaron viales de vidrio flint de tipo I para suero de 20 ml (Wheaton Science Products, Millville, New Yersey, EE.UU.) y se despirogenaron en un túnel de calor seco a 250ºC durante 240 minutos. Se despirogenaron tapones siliconados de clorobutilo gris 4432/50 de 20 mm (The West Company, Lionville, Pennsylvania, EE.UU.) por lavado y se esterilizaron en autoclave con calor húmedo durante 60 minutos a 121ºC. Cada uno de los 2.525 viales se llenó en condiciones estériles con 20 ml de la composición resultante más 0,6 ml de sobrellenado (20,6 ml/vial son 2,06 g/vial de potencia unitaria de composición farmacéutica a 100 mg/ml de la mezcla equilibrada de isómeros basada en una potencia real del lote de sustancia farmacológica de 97,1%), se aplicó un chorro de nitrógeno sobre el espacio de la cabeza del vial, y se sellaron los viales con tapones y segundos sellos (sellos de aluminio de 20 mm producto número 5120-1125, The West Company, Lionville, Pennsylvania, EE.UU.).

El campo de aplicación de la presente invención no se limita a las realizaciones específicas reveladas en los Ejemplos, que tienen la intención de ilustrar unos pocos aspectos de la invención. Todas las realizaciones que sean funcionalmente equivalentes están abarcadas por esta invención. En realidad, los expertos en este campo técnico advertirán que hay varias modificaciones posibles a la invención además de las ya expuestas y descritas y se considera que las mismas están comprendidas en las reivindicaciones adjuntas.

Todas las referencias desveladas en la presente memoria se incorporan en su totalidad por referencia.

Claims

1. Una composición que comprende:

(a): el compuesto de fórmula I

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y el compuesto de fórmula II:

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en una relación de 90 \pm 4% a 10% \pm 4%, respectivamente

(b): agua, y

(c): uno o más ácidos que se encuentran en una concentración total de 0,2 mmol a 1,0 mmol por ml de composición.

2. Una composición que comprende:

(a): una primera mezcla de:

(i): el compuesto de fórmula (I):

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y

el compuesto de fórmula (II):

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en una relación del 90% \pm 4% a 10% \pm 4%, respectivamente;

(ii): agua; y

(iii): uno o más ácidos que se encuentran en una concentración total de 0,2 mmol a 1,0 mmol por ml de la primera mezcla; y

(b): uno o más codisolventes miscibles en agua que se encuentran en una cantidad de 250 hasta 750 mg por ml de composición.

3. Una composición de acuerdo con la reivindicación 2 en la que la concentración de la primera mezcla de la composición varía entre los 50 mg/ml y los 200 mg/ml.

4. Una composición de acuerdo con la reivindicación 3, en la que la concentración de la primera mezcla de la composición varía entre los 90 mg/ml y los 110 mg/ml.

5. Una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4 en la que dicho uno o más codisolventes miscibles en agua se eligen de un grupo formado por: etanol, isopropanol, éter monometílico de dietilenglicol, éter butílico de dietilenglicol, éter monoetílico de dietilenglicol, éter dibutílico de dietilenglicol, polietilenglicol-300, polietilenglicol-400, polietilenglicol, glicerina, 2-pirrolidona, N-metil,2-pirrolidona, glicerina formal, dimetilsulfóxido, sebacato de dibutilo, polisorbato 80 y mezclas de los mismos.

6. Una composición de acuerdo con la reivindicación 5, en la que dicho uno o más codisolventes miscibles en agua son el propilenglicol

7. Una composición de acuerdo con la reivindicación 6, en la que el propilenglicol se encuentra en una cantidad de 450 hasta 550 mg por ml de composición.

8. Una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en la que el ácido o los ácidos se eligen de un grupo formado por los ácidos: acético, bencenosulfónico, cítrico, bromhídrico, clorhídrico, D-láctico y L-láctico, metanosulfónico, fosfórico, succínico, sulfúrico, D-tartárico y L-tartárico, p-toluenosulfónico, adípico, aspártico, canforsulfónico, 1,2-etanodisulfónico, laurilsulfúrico, glucoheptónico, glucónico, 3-hidroxi-2-naftoico, 1-hidroxi-2-naftoico, 2-hidroxietanosulfónico, málico, múcico, nítrico, naftalenosulfónico, palmítico, D-glucárico, esteárico, maleico, malónico, fumárico, benzoico, cólico, etanosulfónico, glucurónico, glutámico, hipúrico, lactobiónico, lisínico, mandélico, napadisílico, nicotínico, poligalacturónico, salicílico, sulfosalicílico, triptofánico y mezclas de los mismos.

9. Una composición de acuerdo con la reivindicación 8 en la que dicho uno o más ácidos es el ácido cítrico.

10. Una composición de acuerdo con la reivindicación 9 en la que el ácido cítrico se encuentra en una cantidad de 0,02 mmol a 0,3 mmol por ml de composición.

11. Una composición de acuerdo con la reivindicación 10, en la que dicho uno o más ácidos son el ácido cítrico y el ácido clorhídrico.

12. Una composición de acuerdo con la reivindicación 11, en la que el ácido cítrico se encuentra en una cantidad de 0,02 mmol hasta 0,3 mmol por ml de composición y el ácido clorhídrico se encuentra en una cantidad suficiente como para lograr una composición de pH 5 a 6.

13. Una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, que comprende uno o más antioxidantes que se encuentran en una cantidad de 0,01 mg a 10 mg por ml de la composición.

14. Una composición de acuerdo con la reivindicación 13, en la que dicho uno o más antioxidantes se elige de un grupo formado por: bisulfito de sodio, sulfito de sodio, metabisulfito de sodio, tiosulfato de sodio, sulfoxilato sódico de formaldehído, ácido L-ascórbico, ácido eritórbico, acetilcisteína, cisteína, monotioglicerol, ácido tioglicólico, ácido tioláctico, tiourea, ditiotreitol, ditioeritreitol, glutationa, palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado, ácido nordihidroguaiarético, galato de propilo, \alpha-tocoferol y mezclas de los mismos.

15. Una composición de acuerdo con la reivindicación 14 en la que dicho uno o más antioxidantes son el monotioglicerol.

16. Una composición de acuerdo con la reivindicación 15, en la que el monotioglicerol se encuentra una cantidad de 4 mg/ml hasta 6 mg/ml de la composición.

17. Una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en la que dicho uno o más ácidos son el ácido cítrico, en una cantidad de 0,02 mmol hasta 0,3 mmol por ml de composición, y el ácido clorhídrico, en una cantidad suficiente como para obtener una composición de pH 5 a 6, en la que uno o más codisolventes miscibles en agua es el propilenglicol en una cantidad de 450 a 550 mg por ml de composición incluyendo, además, monotioglicerol en una cantidad de 4 mg a 6 mg por ml de la composición.

18. El uso de una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 para la preparación de un medicamento para el tratamiento de una infección bacteriana o protozoaria en un mamífero.

19. El uso de acuerdo con la reivindicación 18 en el que la infección bacteriana o protozoaria es: la enfermedad respiratoria bovina, la pleuroneumonía porcina, la neumonía, la coccidiosis, la anaplasmosis y la queratitis infecciosa.

20. Un proceso para la preparación de una composición como la reivindicada en la reivindicación 1 que comprende el paso de calentamiento hasta una temperatura de 50ºC a 90ºC de una mezcla que comprende:

(a): el compuesto de fórmula (I)

(b): agua, y

(c): uno o más ácidos en una cantidad que varía entre 0,2 mmol hasta 1,0 mmol por ml de mezcla;

en el que el pH de la mezcla varía entre 5 y 8.

21. Un proceso para la preparación de una composición como la reivindicada en la reivindicación 2 que comprende el paso de calentamiento hasta una temperatura de 50ºC a 90ºC de una mezcla que comprende:

(a): el compuesto de fórmula (I);

(b): agua; y

(c): uno o más ácidos en una cantidad que varia entre 0,2 mmol hasta 1,0 mml por ml de mezcla.

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en el que se agrega dicho uno o más codisolventes miscibles en agua antes, durante o después del paso de calentamiento, en una cantidad de 250 hasta 750 mg ml de la composición

22. Un compuesto de fórmula:

16

o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma; en la que R^{1} es

17

y en la que R_{2} es H o CH_{3}.