ES2199431T3

ES2199431T3 - Generacion de diversidad en genotecas combinatorias.

Info

Publication number: ES2199431T3
Application number: ES98910631T
Authority: ES
Inventors: John Collins; Peter Rittgen
Original assignee: Cosmix Molecular Biologicals GmbH
Current assignee: Cosmix Molecular Biologicals GmbH
Priority date: 1997-01-31
Filing date: 1998-02-02
Publication date: 2004-02-16
Anticipated expiration: 2018-02-02
Also published as: EP0968283B1; DE69814059T2; EP1302540A3; DK0968283T3; JP2001509672A; WO1998033901A2; WO1998033901A9; EP1302540A2; DE69814059D1; WO1998033901A3; CA2279341A1; CN1246150A; AU6495198A; ATE239077T1; AU749249B2; IL131075A0; EP0968283A2

Abstract

La invención se refiere a bancos de genes y sus derivados combinatorios, que se preparan utilizando una representación de fagémidas o fagos en combinación con enzimas de restricción de tipo IIS y empaquetamiento de cósmidos; su utilización para aislar ligandos, incluyendo inhibidores de enzimas, agonistas y antagonistas para receptores, péptidos competitivos de unión a un objetivo definido, ligandos de diagnóstico para enfermedades y síndromes autoinmunes, incluyendo herramientas de supervivencia para el estado inmune, péptidos modificados de manera post-translacional y ligandos generados por esta tecnología.

Description

Generación de diversidad en genotecas combinatorias.

Métodos evolucionados de biotecnología, con inclusión de genotecas combinatorias y tecnología de presentación de fagos (PARMLEY & SMITH 1988; SCOTT & SMITH 1990, SMITH 1993), se utilizan en la investigación de nuevos ligandos de uso diagnóstico, biomédico y farmacéutico (reseñas: CORTESE 1996, COLLINS 1997). Estos métodos, que utilizan procedimientos empíricos para seleccionar moléculas con características requeridas, v.g. propiedades de fijación, a partir de grandes poblaciones de productos génicos variantes, se han comparado con el proceso de la evolución natural. La evolución incluye la generación de mutación, selección o funcionalidad a lo largo de un período de tiempo y la capacidad de los sistemas para auto-replicarse. En particular, los sistemas naturales utilizan la recombinación para reasociar las mutaciones acumuladas en la población seleccionada a fin de aumentar exponencialmente las combinaciones de mutaciones y aumentar así el número de variantes en la población. Este último aspecto, a saber, la introducción de recombinación dentro de genes mutantes ha sido aplicado sólo recientemente a los métodos evolutivos de la biotecnología, aunque se ha utilizado para aumentar el tamaño de las genotecas iniciales de presentación de fagos (v.g. WATERHOUSE 1993; TSURUSHITA 1996; SODOYER 1994; FISCH 1996). STEMMER 1994a, 1994b y 1995 exponen que la recombinación entre una población de moléculas de DNA puede realizarse in vitro por multiplicación mediante PCR de una mezcla de pequeños fragmentos solapantes con (1994a, 1994b) o sin (STEMMER 1995) secuencias iniciadoras de oligonucleótidos que se utilizan para impulsar la reacción PCR. El método no es aplicable a la recombinación dentro de una secuencia totalmente aleatoria (con gran número de mutaciones), dado que dicho método está basado en la alta homología de las secuencias solapantes en el sitio de recombinación. STEMMER 1994b y CRAMERI 1996a demuestran, sin embargo, la utilidad de la recombinación in vitro para la evolución molecular, demostrando también CRAMERI 1996b el uso del método en asociación con la presentación de fago, aun cuando su método se limita a regiones de baja densidad de mutaciones (aprox. 0,5-1% de las bases están mutadas en su método) cuando afirman que "las ventajas de la recombinación sobre los métodos de mutagénesis existentes aumentan probablemente con los números de ciclos de evolución molecular" (STEMMER 1994b). Los autores de la presente invención puntualizan que esto es debido al hecho evidente por sí mismo de que el número de variantes creadas por los cambios de bases que introducen mutagénesis en las estructuras mutantes existentes es una función aditiva, es decir de crecimiento lineal, mientras que el uso de recombinación entre las variantes mutadas produce nuevas variantes como una función exponencial del número inicial de variantes. Las genotecas clásicas de presentación de fagos se encuentran por consiguiente en gran desventaja para la generación de nuevas variantes; v.g. para abarcar todas las variantes posibles de una secuencia de octapéptidos se requerirían 20^{8} = 2,56 x 10^{10} variantes diferentes.

MARKS, 1992, establecen la importancia de la recombinación en la generación de mayor especificidad en las genotecas combinatorias, v.g. para obtener anticuerpos de mayor especificidad y constantes de fijación en la forma de cadenas ligeras y pesadas en remodelación de inmunoglobulinas presentadas en las genotecas de presentación de fagos. Estos autores no exponen el modo en que puede conseguirse la barajadura de todas las cadenas ligeras y pesadas en una población heterogénea en ambas cadenas, v.g. por un vector que permita la recombinación. Se seleccionaron cadenas pesadas y ligeras una tras otra, es decir se seleccionó primeramente una cadena pesada óptima a partir de una población heterogénea de cadenas pesadas en presencia de una cadena ligera constante, y luego por preparación de una nueva genoteca, una cadena ligera óptima en combinación con la cadena pesada óptima preseleccionada. Las estrategias de optimización secuencial utilizadas actualmente, que consumen gran cantidad de tiempo, con inclusión de genotecas de mutaciones consensuadas, mutagénesis in vivo, PCR propensa a error, así como la barajadura de cadenas, se resumen en las Figuras 5 y 6 de COLLINS 1997.

Antecedentes generales para las genotecas de fagos y presentación de fagos

Se han generado genotecas génicas que contienen un número extremadamente grande (10^{6} a 10^{10}) de variantes. Los segmentos de genes variantes se fusionan a un gen de la proteína de la cubierta de un bacteriófago filamentoso (v.g. M13, fd o f1), y el gen de fusión se inserta en el genoma del fago o de un fagémido. Un fagémido se define como un plásmido que contiene el origen de empaquetamiento y replicación del bacteriófago filamentoso. Esta última propiedad permite el empaquetamiento del genoma del fagémido en una cubierta de fago cuando está presente en una cepa huésped Escherichia coli infectada con un fago filamentoso (superinfección). Las partículas empaquetadas producidas, sean de fago o de fagémido, presentan la proteína de fusión en la superficie de las partículas secretadas al medio. Tales partículas empaquetadas son capaces de inyectar sus genomas en una nueva bacteria huésped, en la cual pueden propagarse como fago o plásmidos, respectivamente. La propiedad especial del sistema está basada en el hecho de que, dado que el empaquetamiento tiene lugar en células individuales infectadas usualmente por un fago/fagémido monovariante, las partículas producidas en la propagación contienen el gen codificante de la variante particular presentada en la superficie de la partícula. Varios ciclos de selección por afinidad para clones que exhiben las propiedades requeridas debido a la propiedad particular de la proteína variante presentada, v.g. la fijación a una molécula diana particular inmovilizada en una superficie, seguido por multiplicación de los clones enriquecidos, conducen al aislamiento de un pequeño número de clones diferentes que tienen estas propiedades. La estructura primaria de estas variantes puede ser esclarecida luego rápidamente por secuenciación del segmento hipermutado del gen variante.

\newpage

Eficiencia de la producción de genotecas combinatorias

Existen cierto número de factores que limitan el potencial de esta tecnología. El primero es el número y la diversidad de las variantes que pueden generarse en la genoteca primaria. La mayor parte de las genotecas se han generado por transformación de preparaciones ligadas de DNA en Escherichia coli por electroporación. Esto da una eficiencia de aprox. 0,1 a 1 x 10^{6} recombinantes/microgramo de DNA ligado de fago. La máxima eficiencia de clonación consignada (de 10^{7} recombinantes por microgramo de DNA insertado) se obtiene utilizando vectores lambda especiales en los cuales está insertado un vector simple de fago filamentoso, en un sitio de clonación especial, horquillado por una duplicación del origen de replicación/empaquetamiento del fago filamentoso (AMBERG 1993; HOGREFE 1993a+b). La construcción de DNA se introduce eficientemente en el huésped Escherichia coli después de empaquetamiento en una cubierta de bacteriófago lambda en una mezcla de empaquetamiento lambda in vitro. La infección de una cepa que lleve un fagémido híbrido de este tipo por un fago adyuvante M13 permite la escisión y secreción de la inserción empaquetada en una cubierta de fago filamentoso. Ni AMBERG 1993 ni HOGREFE 1993a+b exponen el modo en que puede utilizarse el método para introducir recombinación durante este procedimiento. Aunque dichos autores mencionan que la eficiencia puede mejorarse por el uso de endonucleasas de restricción de tipo IIs durante la construcción de los concatémeros utilizados como sustrato para el empaquetamiento in vitro, no se da ejemplo alguno, y en los cinco años subsiguientes no ha aparecido ejemplo alguno en la bibliografía. El procedimiento descrito en la presente invención utiliza también la alta eficiencia del empaquetamiento lambda in vitro, pero maximiza la capacidad del vector de clonación utilizando un vector de cósmido (8) en el cual están insertadas muchas copias (digamos 8) del fagémido en cada construcción. Uno de los aspectos innovadores sorprendentes de este procedimiento es el descubrimiento de varios protocolos para la síntesis de novo de grandes genotecas hipervariables. Un tipo es particularmente eficiente, en el sentido de que los vectores fagémido/cósmido se ven forzados a integrarse en los concatémeros híbridos orientados en la misma orientación. Cualquier variante del protocolo que no asegure esta propiedad no actúa eficazmente.

El uso de las endonucleasas de restricción de tipo IIs

SZYBALSKI 1991 expone un gran número de nuevas aplicaciones para las endonucleasas de restricción de tipo IIs, que incluyen recorte preciso de DNA, recuperación de DNA clonado, ensamblaje de genes, uso como enzima de restricción universal, escisión de DNA monocatenario, detección de mutaciones puntuales, multiplicación en tándem, reacciones de impresión-multiplicación y localización de bases metiladas. Dicho trabajo no proporciona instrucción alguna en cuanto al modo en que pueden utilizarse tales enzimas en la creación de recombinación con regiones altamente mutadas, v.g. dentro de una genoteca combinatoria.

Lista de referencias

Amberg, J. Hogrefe, H., Lovejoy, H. Hay, B., Shopes, B., Mullinax, R. y Sorge, J.A. (1993), Strategies, 5, 2-3. COLLINS, J. (1993) Phage Display. En Moos, W.H. et al. (compiladores) Annual reports in combinatorial chemistry and molecular diversity. Vol. 1., ESCOM Science publ., Leiden, pp. 210-262. Cortese, R. (compilador) (1996) Combinatorial libraries: Synthesis, Screening and Application Potential. Walter de Gruyter, Berlín. Crameri, A., Whitehorn, E.A., Tate, E. y Stemmer, W.P.C. (1996a) 14, 315-319.

CRAMERI A., Cwirla, S. y Stemmer, W.P.C. (1996b) Nat. Med. 2, pág. 100.

Fisch, I., Kontermann, R.E., Finnem, R., Hartley, O., Soler-González, A.S., Griffiths, A.D. y Winter, G. (1996) Proc. Natur. Acad. Sci. USA, 93, 7761.

Marks, J.D.; Griffiths, A.D.; Malmqvist, M.; Clackson, T.P.; Bye, J.M. y Winter, G. (1992) BioTechnol. 10, 779-783.

Hogrefe H.H., Amberg, J.R., Hay, B.N., Sorge, J.A. y Shopes, B. (1993) Gene, 137, 85-91.

Hogrefe, H.H., Mullinax R.L., Lovejoy, A.E., Hay, B.N. y Sorge, J.A. (1993) Gene 128, 119-126.

Parmley, S.F. y Smith, G.P. (1988) Gene 73, 305-318.

Scott, J.K. y Smith, G.P. (1990) Science 249, 386-390 Smith, G.P. (1993) Gene 128, 1-2.

Sodoyer, R., Aujume, L., Geoffrey, F., Pion, C., Puebez, I., Montegue, B., Jacqemot, P. y Dubayle, J. (1996) en Kay, B.K. et al. (compiladores). Phage display of peptides and proteins. A laboratory manual. Academic Press, San Diego. Pp. 215-226 STEMMER, W.P.C. (1994a) Nature (Londres) 370, 389-391 STEMMER, W.P.C. (1994b) Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 91, 10747-10751, STEMMER, W.P.C. (1995) Gene 164, 49-53.

SZYBALSKI, W., Kim, S.C., Hasan, N. y Podhajska, A.J. (1991) Gene 100, 13-26.

Tsurushita, M., Fu, H. Y Warren, C. (1996) Gene 172, 59.

Waterhouse, P., Griffiths, A.D., Johnson, K.S. y Winter, G. (1993a) Nucleic Acid Res. 2265-2269.

De acuerdo con una primera realización, la invención se refiere a un banco de genes, en el cual dichos genes comprenden una secuencia de DNA bicatenario que se representa por la fórmula siguiente de una de sus cadenas:

5'B_{1}B_{2}B_{3}...B_{n}X_{n+1} ...X_{n+a}Z_{n+a+1}Z_{n+a+2}X_{n+a+3}...X_{n+a+b}Q_{n+a+b+1} ...Q_{n+a+b+j}3'

en la cual n, a, b y j son números enteros y

n > 3, a > 1, b > 3 y j > 1,

en la cual X_{n+1}...X_{n+a+b} es una secuencia hipervariable y B, X, Z y Q representan adenina (A), citosina (C), guanina (G) o timina (T),

(i): Z representa G o T en una relación G:T de aproximadamente 1:1, y/o

(ii): Z representa C o T en una relación C:T de aproximadamente 1:1, y/o

(iii): Z representa A o G en una relación A:G de aproximadamente 1:1, y/o

(iv): Z representa A o C en una relación A:C de aproximadamente 1:1, y en la cual

las subsecuencias B_{1}...B_{n} y/o Q_{n+a+b+1}...Q_{n+a+b+j} representan sitios de reconocimiento para enzimas de restricción, y en la cual los sitios de reconocimiento están orientados de tal manera que su sitio de escisión genera al escindirse un extremo cohesivo que incluye las dos bases designadas Z.

La restricción de esta secuencia con una enzima de restricción de tipo IIs como la descrita, seguida por religación, conduce a la recombinación de las regiones hipervariables localizadas en 5' y 3' respecto al sitio de escisión. Esto constituye la esencia de la metodología que los autores de la presente invención designan "cosmix-plexing". En este procedimiento es esencial que los fragmentos generados en la escisión por la enzima de restricción se religuen en la orientación correcta ("cabeza-a-cola"), por lo cual las secuencias Z se seleccionan para las cuatro genotecas ((i) a (iv)) a fin de asegurar esto (véase más adelante) pero dejando todavía que todos los aminoácidos posibles se codifiquen en el sitio de escisión. Si no se garantiza esta orientación correcta, se producirá una reducción drástica tanto en el porcentaje de genes de proteínas de fusión reconstituidos correctamente, una reducción en la proporción de moléculas que pueden empaquetarse in vitro en los extractos de empaquetamiento lambda (que requiere la orientación correcta de los sitios cos), y una reducción en la proporción de copias de fagémido escindibles in vivo a partir del concatémero cósmido (la escisión requiere la orientación correcta de los orígenes de replicación de fago consecutivos), orientación correcta orientación correcta orientación incorrecta (ligación cabeza-a-cabeza).

1

Para evitar los problemas producidos como consecuencia de la orientación falsa (cabeza-a-cabeza) mencionados en el párrafo anterior, las cuatro genotecas génicas mencionadas en la reivindicación tienen que mantenerse separadas durante la estrategia cosmix-plexing. De hecho, con respecto a la formación de recombinantes, las genotecas se comportan como 1seis conjuntos separados que no pueden recombinarse unos con otros: se mantienen separadamente cuatro genotecas, en las cuales cada conjunto contiene cuatro extremos cohesivos posibles, v.g. la genoteca (i), con
Z = G o T contiene:

2

Es evidente que se producirán problemas de orientación falsa al mezclar las diferentes genotecas, v.g. la "genoteca" AC (iv) contendrá secuencias AA, AC, CA y CC que pueden aparearse en la orientación falsa con, respectivamente, cada uno de los extremos cohesivos generados en la genoteca (i).

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Una realización específica de la invención concierne a un banco de genes en el cual las subsecuencias B_{1}...B_{n} o Q_{n+a+b+1}...Q_{n+a+b+j} representan sitios de reconocimiento para enzimas de restricción de tipo IIs y en el cual los sitios de reconocimiento están orientados de tal manera que su sitio de escisión genera al escindirse un extremo cohesivo que incluye las dos bases designadas Z.

Adicionalmente, una realización específica concierne a un banco de genes, en el cual el extremo cohesivo es un extremo monocatenario de 2 pares de bases (pb) formado por las dos bases designadas Z.

Adicionalmente, una realización específica concierne a un banco de genes en el cual cada gen se proporciona como vector de presentación, especialmente como fago M13 o fago semejante a M13, o como fagémido.

Otra realización de la invención concierne a un conjunto de cuatro bancos de genes de acuerdo con la invención en el cual los bancos de genes se caracterizan como sigue:

: primer banco de genes: Z representa G o T, con preferencia en una

: relación G:T de aproximadamente 1:1;

: segundo banco de genes: Z representa C o T, con preferencia en una

: relación C:T de aproximadamente 1:1;

: tercer banco de genes: Z representa A o G, con preferencia en una

: relación A:G de aproximadamente 1:1; y

: cuarto banco de genes: Z representa A o C, con preferencia en una

: relación A:C de aproximadamente 1:1.

Una realización específica de la invención concierne a un conjunto de cuatro bancos de genes en los cuales se proporciona cada gen como un vector de presentación, especialmente como fago M13 o fago semejante a M13, o como fagémido.

Otra realización de la invención concierne a un banco de genes en el cual dichos genes comprenden una secuencia de DNA bicatenario que se representa por la fórmula siguiente de una de sus cadenas:

en la cual n, a, b y j son números enteros y

n > 3, a > 1, b > 3 y j > 1,

en la cual X_{n+1}...X_{n+a+b} es una secuencia hipervariable y B, X, Z y Q representan adenina (A), citosina (C) guanina (G) o timina (T), y en la cual están presentes cuatro conjuntos de secuencias de oligonucleótidos que comprenden Z_{n+a+1} y Z_{n+a+2}, con preferencia en una relación de (i):(ii):(iii):(iv) de aproximadamente 1:1:2:2, en la cual los cuatro conjuntos se caracterizan como sigue:

: primer conjunto: Z_{n+a+1} representa G y Z_{n+a+2} representa también G;

: segundo conjunto: Z_{n+a+1} representa C y Z_{n+a+2} representa T;

: tercer conjunto: Z_{n+a+1} representa A y Z_{n+a+2} representa A o C, con preferencia en una relación A:C de aproximadamente 1:1; y

: cuarto conjunto: Z_{n+a+1} representa T y Z_{n+a+2} representa C o G, con preferencia en una relación C:G de aproximadamente 1:1, y en el cual las secuencias B_{1}...B_{n} y/o Q_{n+a+b+1}...Q_{n+a+b+j} representan sitios de reconocimiento de tipo IIs para enzimas de restricción, en los cuales los sitios de reconocimiento están orientados de tal manera que su sitio de escisión genera al escindirse un extremo cohesivo que incluye las dos bases designadas Z.

Una realización específica de la invención concierne a un banco de genes en el cual los cuatro conjuntos de secuencias de oligonucleótidos están presentes en una relación de (i):(ii):(iii):(iv) de (0 a 1):(0 a 1):(0 a 1):(0 a 1) con la salvedad de que al menos está presente uno de dichos conjuntos.

Adicionalmente, una realización específica de la invención concierne a un banco de genes en el cual las subsecuencias B_{1}...B_{n} y Q_{n+a+b+1}...Q_{n+a+b+j} representan sitios de reconocimiento para enzimas de restricción y en el cual los sitios de reconocimiento están orientados de tal manera que su sitio de escisión genera al escindirse un extremo cohesivo que incluye las dos bases designadas Z.

Adicionalmente, una realización específica de la invención concierne a un banco de genes en el cual el extremo cohesivo es un extremo monocatenario de 2 pb formado por las dos bases designadas Z.

en la cual n, a, b y j son números enteros y

n > 3, a > 1, b > 3 y j > 1,

en la cual X_{n+1}...X_{n+a+b} es una secuencia hipervariable y B, X, Z y Q representan adenina (A), citosina (C) guanina (G) o timina (T), y en la cual están presentes los seis conjuntos siguientes de secuencias de oligonucleótidos que comprenden X_{n+a,} Z_{n+a+1} y Z_{n+a+2}, preferiblemente en una relación de (i):(ii):(iii):(iv):-(v):(vi) de aproximadamente 3:4:3:4:4:1, caracterizándose los seis conjuntos como sigue:

: primer conjunto: X_{n+a} representa A, G y/o T, con preferencia en una relación de aproximadamente 1:1:1 o X_{n+a} representa C, G y/o T, con preferencia en una relación de aproximadamente 1:1:1, Z_{n+a+1} representa G y Z_{n+a+2} representa G;

: segundo conjunto: X_{n+a} representa A, C, G y/o T, con preferencia en una relación de aproximadamente 1:1:1:1, Z_{n+a+1} representa C y Z_{n+a+2} representa T;

: tercer conjunto: X_{n+a} representa A, C y/o G, con preferencia en una relación de aproximadamente 1:1:1, Z_{n+a+1} representa A y Z_{n+a+2} representa A;

: cuarto conjunto: X_{n+a} representa A, C, G y/o T, con preferencia en una relación de aproximadamente 1:1:1:1, Z_{n+a+1} representa A y Z_{n+a+2} representa C;

: quinto conjunto: X_{n+a} representa A, C, G y/o T, con preferencia en una relación de aproximadamente 1:1:1:1, Z_{n+a+1} representa T y Z_{n+a+2} representa C;

: sexto conjunto: X_{n+a} representa A, Z_{n+a+1} representa T y Z_{n+a+2} representa G.

Método de "tubo simple" Problema

Debe desarrollarse un método que permita el proceso "cosmix-plexing" sin mantener genotecas separadas. Esto tendría la ventaja de reducir la manipulación, implicada en el escrutinio de las cuatro genotecas separadas, como se ha descrito previamente. Esto llevaría consigo una economía tanto en tiempo como en materiales. Esto se ha conseguido en dos versiones separadas de la invención.

Solución

Es posible seleccionar combinaciones de nucleótidos dentro de los extremos cohesivos generados por restricción de tipo IIs dentro de la secuencia mencionada anteriormente, es decir ZZ, en las cuales todos los clones están presentes en una sola genoteca y en las cuales se elimina la posibilidad de orientación falsa durante la ligación, y la pérdida consiguiente de eficiencia asociada con esto. Al mismo tiempo, el número de subconjuntos, definido por el número de extremos cohesivos diferentes que pueden generarse, que no pueden interaccionar (recombinarse) unos con otros, se reduce desde los 1seis conjuntos, como en la versión del método previamente descrita, a 6.

Designación de las secuencias

Las combinaciones de secuencias con extremos cohesivos monocatenarios de 2 pb que pueden generarse en ZZ son teóricamente como sigue:

3

De éstas, las secuencias con un eje de simetría invertido (palíndromos: AT, TA, GC, CG), pueden aparearse en ambas orientaciones y deben eliminarse por consiguiente de las genotecas "cosmix-plexing" por las razones dadas anteriormente. Las doce secuencias restantes son en realidad seis conjuntos de pares complementarios (v.g. CC + GG, AA + TT, CA + TG). Por selección de un miembro de cada par (total de 6) puede generarse un solo conjunto de extremos cohesivos que pueden aparearse únicamente en la orientación correcta de "cabeza-a-cola". La elección actual de secuencias tiene en cuenta el uso de codones, suponiendo que ZZ se eligen como la posición segunda y tercera del codón. Son determinantes los aminoácidos que son codificados por un solo codón o únicamente por dos codones, codón simple metionina (TG) y triptófano (GG); después de la eliminación de las secuencias palindrómicas, existen también únicamente codones simples disponibles que codifican ácido aspártico (Asp), asparagina (Asn), cistina (Cys), histidina (His) y tirosina (Tyr). Para codificar Asp, Asn, His y Tyr se requiere una secuencia AC. La selección de AC presenta el defecto de que tiene que evitarse la secuencia complementaria GT. Ésta es la única posibilidad de codificar Cys. Sin embargo, la inclusión de Cys dentro de la secuencia hipervariable causa a menudo problemas de plegado defectuoso y la formación de agregados dímeros, dependiendo del potencial rédox del entorno. Por esta razón se decidió crear un conjunto en el cual se eliminen los codones Cys, pero que sea de gran utilidad en muchas aplicaciones, con inclusión de la formación de genotecas de péptidos cíclicos. Si se selecciona la secuencia AA para codificar ácido glutámico (Glu), glutamina (Gln) y lisina (Lys) permitiendo también el codón de parada TAA, entonces tiene que eliminarse TT. La consecuencia de esto es que tiene que incluirse también TC a fin de que puedan codificarse fenilalanina (Phe) e isoleucina (Ile). La eliminación de la secuencia complementaria GA no tiene consecuencia alguna, dado que otro u otros codones GG codifican arginina (Arg) y glicina (Gly). La eliminación de CC carece entonces de consecuencias, dado que alanina (Ala), prolina (Pro), serina (Ser) y treonina (Thr) pueden ser codificadas por codones que contengan CT. Ésta es la argumentación para la selección de las secuencias ZZ designadas "combinación A" a continuación.

Para finalizar el razonamiento: si se omitiera el doblete AA y, como consecuencia, se incluyera TT, entonces tiene que incluirse AG para codificar Glu, Gln y Lys. A fin de codificar Ala y Pro, tiene que incluirse ahora o bien CT (combinación B) o CA (combinación C). Esto conduce a la inclusión de AG y CT (combinación B), o CA y TG (combinación C) como pares complementarios. Las combinaciones B y C no representan por tanto una solución adecuada al problema.

\hskip2mm combinación A

\hskip4mm combinación B

\hskip7mm combinación C

4

Las secuencias seleccionadas se representan en tipo negrita. Los pares complementarios son adyacentes uno a otro.

TABLA 1 Código genético; la selección de codones XZZ utilizada de acuerdo con la combinación A se muestra en tipo negrita

5

TABLA 2

Frecuencia de los aminoácidos, comparando la combinación seleccionada A (anterior) y la frecuencia
natural de todos los codones
Aminoácido	Frecuencia natural	Combinación A
Ala	4	1
Arg	6	2
Asp	2	1
Asn	2	1
Cys	2	0
Glu	2	1
Gln	2	1
Gly	4	1
His	2	1
Ile	3	1
Leu	6	3
Lys	2	1
Met	1	1
Phe	2	1
Pro	4	1
Ser	6	1
Thr	4	1
Trp	1	1
Tyr	2	1
Val	4	2
Parada	3	1
Total 21	64	24

Creación de un conjunto de cuatro oligonucleótidos de acuerdo con la combinación A

Pueden crearse genotecas génicas de acuerdo con los requerimientos de la combinación A, por creación de cuatro conjuntos de nucleótidos en los cuales Z_{n+a}Z_{n+a+1}Z_{n+a+2} son:

i) NGG

ii) NCT

iii) NA (A o C)

iv) NT (C o G),

donde n es C, G, A o T.

Después de la síntesis de estos oligonucleótidos, se pueden combinar los mismos para obtener una genoteca génica "cosmix-plexing" de tubo único, con lo cual para obtener las frecuencias de codones relativas dadas en la Tabla 2, las genotecas génicas i) a iv) están presentes en la mezcla final en una relación de 1:1:2:2, respectivamente. Como se ha explicado anteriormente, esta mezcla dará siempre una orientación correcta en la religación de los fragmentos escindidos por enzimas de restricción de tipo IIs que tienen los extremos cohesivos monocatenarios de 2 pb ZZ.

Alternativamente: un conjunto de seis oligonucleótidos de acuerdo con la combinación A

Pueden crearse genotecas génicas de acuerdo con una modificación de la combinación A, en la cual se eliminan ambos codones de parada y cistina, y en la cual cada uno de los otros aminoácidos está representado en cada caso por un codón único, creando seis conjuntos de nucleótidos en los cuales X_{n+a}Z_{n+a+1}Z_{n+a+2} son:

i) (A, G o T)GG o (C, G o T)GG

ii) NCT

iii) (A, G o C)AA

iv) NAC

v) NTC

vi) ATG

Después de la síntesis de estos oligonucleótidos, se pueden combinar los mismos para obtener una genoteca génica "cosmix-plexing" de tubo único, con lo cual para obtener las frecuencias de codones equimolares para cada aminoácido las genotecas génicas i) a vi) están presentes en la mezcla final en una relación de 3:4:3:4:4:4:1, respectivamente. Como se ha explicado anteriormente, esta mezcla dará siempre una orientación correcta en la religación de los fragmentos escindidos por enzimas de restricción de tipo IIs que tienen los extremos cohesivos monocatenarios de 2 pb ZZ.

De nuevo, como en el caso de los conjuntos anteriores, esta genoteca de tubo simple representa seis subconjuntos que son incapaces de recombinarse unos con otros durante el proceso "cosmix-plexing".

*** la sección siguiente se ha alterado radicalmente. Las últimas Tablas ya no son necesarias.

Consideración del codón central de aminoácidos creado durante la recombinación "cosmix-plexing"

El aminoácido en el sitio de recombinación está determinado por el segmento hipervariable 5'. El conjunto de aminoácidos que pueden representarse en esta posición está definido para cada subconjunto, como se presenta en la Tabla 2.

Consideración del número de clones necesarios en una genoteca "representativa"

El número mínimo de clones requeridos en una genoteca para incluir todas las secuencias de aminoácidos posibles en un péptido aleatorio que contiene 'n' aminoácidos es 20^{n}, es decir para n = 9, 20^{9} = 5,12 x 10^{11}. De hecho, para un límite de confianza de, p. ej., 95%, esta cifra tiene que ser aproximadamente tres veces mayor, a fin de permitir la estadística de muestreo, es decir, aprox. 1,5 x 10^{12}. En la práctica, esta cifra puede ser mayor debido v.g. a la síntesis no aleatoria de los oligonucleótidos utilizados para generar la genoteca así como la representación de codones sesgada (para una exposición detallada véase COLLINS 1997).

Consideración del número de clones recombinados generados por "cosmix-plexing"

La estrategia "cosmix-plexing" está basada en el concepto de que en los experimentos de selección iniciales, las poblaciones de clones se enriquecerán para secuencias que contengan elementos estructurales basados en la secuencia primaria del segmento modificado. Aun cuando la secuencia óptima no esté presente debido a las limitaciones impuestas por el tamaño limitado de la genoteca inicial, la estrategia "cosmix-plexing" aumentará la probabilidad de encontrar exactamente dicha secuencia por proporcionar un gran número de nuevos recombinantes en los cuales las "mitades" 5' y 3' de la sección modificada están reasociadas, v.g. para la genoteca nonapeptídica hipervariable descrita en el ejemplo, las secuencias codificantes de los cinco aminoácidos amino-proximales se recombinan con las secuencias codificantes de los cuatro aminoácidos carboxi-proximales. Dado que los extremos cohesivos limitan esencialmente la recombinación a subconjuntos definidos, en los cuales un subconjunto no puede sufrir recombinación con cualquiera de los otros subconjuntos, el número real de recombinantes generado es menor que el que podría obtenerse con una recombinación totalmente aleatoria.

Para el protocolo inicial de cuatro tubos descrito, se utilizan cuatro genotecas separadas, cada una de las cuales contiene cuatro subconjuntos:

La recombinación aleatoria generaría, para un conjunto de N clones, N^{2} recombinantes, suponiendo que N^{2} es menor que o igual al número teórico de variantes (20^{n}, véase anteriormente) que pueden codificarse dentro del segmento hipervariable, o en caso contrario tenderá a 20^{n}.

Para el protocolo de cuatro tubos, se crean 16 subconjuntos, cada uno de los cuales representa una agrupación dentro de la cual puede tener lugar recombinación. Si el total de la genoteca está constituido por N clones, entonces el número de nuevos recombinantes que pueden formarse dentro de cada uno de los 16 subconjuntos es (N/16)^{2}. Realizando la suma para la totalidad de los 16 subconjuntos, el número de recombinantes que pueden generarse es
16 x (N/16)^{2} = N^{2}/16, suponiendo nuevamente que N^{2}/16 es menor que o igual al número teórico de variantes (20^{n}, véase anteriormente) que pueden codificarse dentro del segmento hipervariable, o en caso contrario tenderá a 20^{n}.

Para el protocolo de tubo simple, se crean únicamente 6 subconjuntos, cada uno de los cuales representa una agrupación dentro de la cual puede tener lugar recombinación. Si la genoteca total se compone de N clones, entonces el número de nuevos recombinantes que pueden formarse con cada uno de los 6 subconjuntos es (N/6)^{2}. Realizando la suma para la totalidad de los 6 subconjuntos, el número de recombinantes que pueden generarse es 6 x (N/6)^{2} = N^{2}/6, suponiendo nuevamente que N^{2}/6 es menor que o igual al número teórico de variantes (20^{n}, véase anteriormente) que pueden ser codificadas dentro del segmento hipervariable, o en caso contrario tenderá a 20^{n}.

Está claro, por tanto, que la versión de tubo simple de la invención es superior no sólo en términos de tiempo y economía del procedimiento, sino en el potencial para generar una mayor diversidad a partir de un número dado de clones durante la recombinación guiada por la estrategia "cosmix-plexing".

Una realización específica de la invención concierne a un banco de genes, en el cual los seis conjuntos de secuencias de oligonucleótidos están presentes en una relación de (i):(ii):(iii):(iv):(v):(vi) de (0 a 1):(0 a 1):(0 a 1):(0 a 1):(0 a 1):(0 a 1), con la salvedad de que al menos está presente uno de dichos conjuntos.

Adicionalmente, una realización específica de la invención concierne a un banco de genes, en el cual cada gen se proporciona como un vector de presentación, especialmente como fago M13 o fago semejante a M13, o como fagémido.

Adicionalmente, una realización específica de la invención concierne a un banco de genes en el cual la secuencia de DNA bicatenario está constituida por una región de DNA (fusB) que codifica un péptido o una proteína a presentar.

Adicionalmente, una realización específica de la invención concierne a un banco de genes caracterizado porque
n = j = 6, a = 14 y b = 16.

Adicionalmente, una realización específica de la invención concierne a un banco de genes que se

caracteriza porque

(a): la subsecuencia B_{1}...B_{n} es el sitio de reconocimiento por la enzima de restricción BpmI (CTGGAG) y la subsecuencia Q_{n+a+b+1}...Q_{n+a+b+j} es un sitio de reconocimiento BsgI invertido (CTGCAC); o

(b): la subsecuencia B_{1}...B_{n} es el sitio de reconocimiento por la enzima de restricción BsgI (GTGCAG) y la subsecuencia Q_{n+a+b+1}...Q_{n+a+b+j} es un sitio de reconocimiento BpmI invertido (CTCCAG).

Adicionalmente, una realización específica de la invención concierne a un banco de genes que se caracteriza porque la secuencia hipervariable X_{n+1}...X_{n+a+b} contiene NNB o NNK, donde N = adenina (A), citosina (C), guanina (G) o timina (T);

B = citosina (C), guanina (G) o timina (T); y

K = guanina (G) o timina (T).

Otra realización de la invención concierne a un fagémido pROCOS4/7 de la secuencia que se muestra en Fig. 6.

Otra realización adicional de la invención concierne a un fagémido pROCOSS/3 de la secuencia que se muestra en Fig. 7.

Otra realización de la invención concierne a un método para la producción de grandes

- genotecas de presentación de fago o

- genotecas de presentación de fagémido,

que contienen o están constituidas por vectores de presentación recombinados opcionalmente empaquetados, en los cuales tiene lugar recombinación en el o los sitios de escisión para una enzima de restricción de tipo IIs (enzima de corte (B); flecha en Fig. 3) y en los cuales

(a): a (b) se seleccionan un DNA bicatenario preparado a partir de células de Escherichia coli que contienen una población de vectores de presentación, constituida por fagos M13 o fagos semejantes a M13 o constituida por fagémidos de acuerdo con la invención; un vector de cósmido; una enzima de restricción de tipo IIs para el corte (B) y una enzima de restricción para el corte (A), donde

(i): la enzima de corte (B) escinde los vectores de presentación en la región codificante del péptido presentado o la proteína presentada (flecha en Fig. 3) y genera extremos cohesivos asimétricos singulares, en los cuales cada extremo cohesivo es un extremo monocatenario de 2 pb formado por las dos bases designadas Z, y

(ii): la enzima de corte (A) escinde los vectores de presentación y el vector de cósmido y genera al escindirse extremos cohesivos asimétricos singulares (fusA) que difieren de los resultantes del corte (B),

(c): los vectores de presentación son escindidos con la primera enzima de restricción,

(d): el vector de presentación y el vector de cósmido se escinden con la segunda enzima de restricción,

(e): los vectores de presentación escindidos se ligan con los vectores de cósmido escindidos formando concatémeros,

(f): el producto de ligación se somete a un empaquetamiento lambda y se transduce en un huésped Escherichia coli,

(g): en caso deseado, se hace selección para un gen presente en los vectores de presentación ligados,

(h): los vectores de presentación transducidos en el huésped Escherichia coli

-: o bien, en el caso de un vector de presentación de fago, se empaquetan espontáneamente en cubiertas de fago M13 o fago semejante a M13

-: o bien, en el caso de un vector de presentación de fagémido, se empaquetan por infección del huésped Escherichia coli con un fago adyuvante de tipo M13 (superinfección),

(i): los vectores de presentación empaquetados se someten a pasadas en un huésped Escherichia coli reciente y se forman genotecas de presentación de fago o presentación de fagémido y, en caso deseado,

(j): los vectores de presentación sometidos a pasadas

-: o bien, en el caso de un vector de presentación de fagémido, se empaquetan por infección del huésped Escherichia coli reciente con un fago adyuvante de tipo M13 (superinfección) y

se forman genotecas de presentación de fago o presentación de fagémido.

Una realización específica de la invención concierne a un método que se caracteriza porque en los pasos (a) a (b) se selecciona como enzima de restricción de tipo IIS, BgII, DraIII, BsgI o BmpI.

Adicionalmente, una realización específica de la invención concierne a un método que se caracteriza porque para los cortes (B) y (A) se selecciona la misma restricción y/o enzima de restricción.

Adicionalmente, una realización específica de la invención concierne a un método que se caracteriza porque como enzima de corte (B) y como enzima de corte (A) se utilizan enzimas diferentes (Fig. 3), preferiblemente BsgI o BpmI como enzima de corte (B) y DraIII como enzima de corte (A) (corte del origen de replicación de fd o M13).

Adicionalmente, una realización específica de la invención concierne a un método que se caracteriza porque en el paso (h) y facultativamente en el paso (j) se utiliza M13K07 como fago adyuvante de tipo M13.

Adicionalmente, una realización específica de la invención concierne a un método que se caracteriza porque el fagémido y el cósmido son idénticos y, adicionalmente, la presencia de y la escisión con la enzima de corte (A) es opcional y/o la enzima de corte (B) y la enzima de corte (A) son idénticas.

Adicionalmente, una realización específica de la invención concierne a un método que se caracteriza porque en el paso (i) la multiplicidad de infección (MOI) es menor que o igual a 1.

Adicionalmente, una realización específica de la invención concierne a un método en el cual el cósmido comprende un origen del bacteriófago fd o M13 (replicación/-empaquetamiento).

Adicionalmente, una realización específica de la invención concierne a un método en el cual en el paso (e) se utiliza una relación molar de vectores de presentación al vector de cósmido dentro del intervalo de 3:1 a 15:1, y preferiblemente 3:1 a 10:1.

Adicionalmente, una realización específica de la invención concierne a un método en el cual en el paso (e) se utiliza una concentración de vectores (que comprende vectores de presentación y vectores de cósmido) mayor que 100 \mug DNA/ml.

- genotecas de extensión de presentación de fago o

- genotecas de extensión de presentación de fagémido, en el cual

una casete de oligonucleótidos de d bases de longitud se inserta en un sitio de restricción (corte (B)) por la vía de los extremos cohesivos ZZ como se ha definido anteriormente para producir una secuencia (supra-secuencia) o un gen que comprende una secuencia de DNA bicatenario que se representa por la fórmula siguiente de una de sus cadenas:

5'B_{1}..B_{n}X_{n+1}..X_{n+a}Z_{n+a+1}Z_{n+a+2}X_{n+a+3}.. X_{n+a+d}Z_{n+a+d+1}Z_{n+a+d} _{+2}X_{n+a+d+3}..X_{n+a+d+b}Q_{n+a+d+b+1}..Q_{n+a+d+b+j}3'

en la cual d es un número entero y un múltiplo de 3, preferiblemente dentro del intervalo de 6 a 36; n, a, b y j y B, X, Z y Q tienen el mismo significado que en cualquiera de las reivindicaciones anteriores; y en el cual

(a): a (b) se seleccionan un DNA bicatenario preparado a partir de células de Escherichia coli que contienen una población de vectores de presentación, constituida por fagos M13 o fagos semejantes a M13 o constituida por fagémidos de acuerdo con la invención; un vector de cósmido; una enzima de restricción de tipo IIs para el corte (B); y una enzima de restricción para el corte (A), en los cuales

(i): la enzima de corte (B) escinde los vectores de presentación en la región codificante del péptido presentado o la proteína presentada y genera extremos cohesivos asimétricos singulares; en los cuales cada extremo cohesivo es un extremo monocatenario de 2 pb formado por las dos bases designadas Z,

(ii): la enzima de corte (A) escinde los vectores de presentación y el vector de cósmido de tal modo que se forman extremos cohesivos asimétricos singulares que difieren de los resultantes del corte (B),

(c1): los vectores de presentación se cortan con la enzima de restricción de corte (B),

(c2): se inserta una casete de DNA en el sitio de escisión con sus extremos cohesivos ZZ,

(d): el vector de presentación resultante y el vector de cósmido se escinden con la enzima de restricción de corte (A),

(f): el producto de ligación se somete a un empaquetamiento lambda y se transduce en un huésped Escherichia coli de tal modo que la casete de DNA se encuentra entre dos secuencias hipervariables (secuencias de extensión),

(i): los vectores de presentación empaquetados se someten a pasadas en un huésped Escherichia coli reciente y se forman genotecas de presentación de fago o presentación de fagémido, y, en caso deseado,

(j): los vectores de presentación sometidos a pasadas

-: o bien, en el caso de un vector de presentación de fagémido, se empaquetan por infección del huésped Escherichia coli reciente con fagos adyuvantes de tipo M13 (superinfección) y

se forman genotecas de extensión de presentación de fago o presentación de fagémido.

Otra realización de la invención concierne a un método para la reasociación de las extensiones 5' y/o 3' en la producción de grandes

-: genotecas recombinantes de extensión de presentación de fago o

-: genotecas recombinantes de extensión de presentación de fagémido,

que comprende la secuencia como se ha definido anteriormente en la cual tiene lugar recombinación en uno u otro, o consecutivamente en ambos sitios de escisión ZZ que horquillan la o las casetes insertadas, en el cual

(a): a (b) se seleccionan un DNA bicatenario preparado a partir de células de Escherichia coli que contienen una población de vectores de presentación, constituida por fagos M13 o fagos semejantes a M13 o constituida por fagémidos como vectores de presentación tales como se definen anteriormente; un vector de cósmido; una enzima de restricción de tipo IIs para el corte (B); y enzima de restricción para el corte (A), en los cuales

(i): la enzima de corte (B) escinde los vectores de presentación en la región codificante del péptido presentado o la proteína presentada y genera extremos cohesivos asimétricos singulares selectivamente en

-: la unión 5' de extensión y la casete (escisión por la enzima de restricción que reconoce el sitio de fijación B_{1}...B_{n} como se define anteriormente), o

-: en la unión 3' de extensión y la casete (escisión por la enzima de restricción que reconoce el sitio de fijación Q_{n+a+b+1}...Q_{n+a+b+j} como se define anteriormente, o Q_{n+a+d+b+1}...Q_{n+a+d+b+j} como se define anteriormente), en las cuales cada extremo cohesivo es un extremo monocatenario de 2 pb formado por las dos bases designadas Z,

(ii): la enzima de corte (A) escinde los vectores de presentación y el vector de cósmido y genera al escindirse extremos cohesivos asimétricos singulares que difieren de los resultantes del corte (B),

(b): los vectores de presentación se escinden con la primera enzima de restricción,

(c): el vector de presentación y el vector de cósmido se escinden con la segunda enzima de restricción,

-: o bien, en el caso de vectores de presentación de fagémido, se empaquetan por infección del huésped Escherichia coli con un bacteriófago adyuvante de tipo M13 (superinfección),

(j): los vectores de presentación sometidos a pasadas

-: o bien, en el caso de un vector de presentación de fago, se empaquetan espontáneamente en una cubierta de fago M13 o semejante a M13

-: o bien, en el caso de un vector de fagémido, se empaquetan por infección del huésped Escherichia coli reciente con fagos adyuvantes de tipo M13 (superinfección) y

se forman genotecas de presentación de fago o presentación de fagémido.

Una realización específica de la invención concierne a un método que se caracteriza porque en los pasos (a) a (b) se selecciona como enzima de restricción de tipo IIs BgII, DraIII, BsgI o BpmI.

Adicionalmente, una realización específica de la invención concierne a un método que se caracteriza porque para los cortes (i) y (ii) se selecciona el mismo sitio de restricción.

Adicionalmente, una realización específica de la invención concierne a un método que se caracteriza porque como enzima de corte (B) y como enzima de corte (A) se utilizan enzimas diferentes, preferiblemente BsgI o BpmI como enzima de corte (B) y DraIII como enzima de corte (A) (el origen de replicación de fd o M13 está cortado).

Adicionalmente, una realización específica de la invención concierne a un método que se caracteriza porque en el paso (h) y facultativamente en el paso (j) se utiliza M13K07 como el fago adyuvante de tipo M13.

Adicionalmente, una realización específica de la invención concierne a un método que se caracteriza porque en el paso (g) se hace la selección en cuanto a la presencia de un gen de resistencia a los antibióticos.

Adicionalmente, una realización específica de la invención concierne a un método que se caracteriza porque en el paso (i) la multiplicidad de infección (MOI) es menor que o igual a 1.

Adicionalmente, una realización específica de la invención concierne a un método en el cual el cósmido comprende un origen del bacteriófago fd o M13.

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Otra realización de la invención concierne a un método para la producción de novo de grandes

-: genotecas de presentación de fago o

-: genotecas de presentación de fagémido,

que comprenden secuencias de DNA como se definen anteriormente, y que pueden someterse a recombinación de acuerdo con un procedimiento como se ha definido anteriormente, en el cual la recombinación tiene lugar dentro de una secuencia de DNA como se ha definido anteriormente, en el cual

a): un vector de presentación, constituido por un fago M13 o fago semejante a M13 o constituido por un vector de presentación de fagémido que comprende un origen de replicación de bacteriófago, facultativamente un gen para un marcador seleccionable, preferiblemente un sitio de resistencia a los antibióticos, un sitio cos del bacteriófago lambda y una secuencia de "relleno" (Figura 5, superior derecha), que contiene dos sitios de fijación para una enzima de restricción de tipo IIs diferente de cualquiera de las enzimas que se han definido anteriormente (corte (B) y corte (A)), en el cual dichos dos sitios están orientados en orientación divergente y donde los extremos cohesivos generados en la escisión son asimétricos y difieren uno de otro en los dos sitios, y

b): un fragmento generado por PCR que comprende parte de una de las secuencias que se han definido anteriormente, que incluye una (o las) secuencias hipervariables, preferiblemente X_{n+1}...X_{n+a}Z_{n+a+1}Z_{n+a+2}X_{n+a+3}...X_{n+a+b} de acuerdo con la invención, horquilladas por los mismos sitios de fijación de enzimas de restricción de tipo IIs definidos en (a), pero en este caso orientadas ambas hacia dentro con respecto a la secuencia hipervariable (Figura 5, lado izquierdo) y donde, como resultado de la escisión por esta enzima de restricción, se generan dos extremos monocatenarios asimétricos diferentes uno de otro, donde el primer extremo (a' en Fig. 5) es complementario a uno de los extremos (a en Fig. 5) generados en el fragmento vector grande en (a) y el segundo extremo (b' en Fig. 5) es complementario al otro extremo (b en Fig. 5) generado en el fragmento vector grande en (a),

c): los dos sistemas de la reacción de escisión (a) y (b) que contienen todavía la enzima de restricción activa de tipo IIs se mezclan entre sí en proporciones aproximadamente equimolares y se someten a ligación en presencia de DNA-ligasa;

: los fragmentos que contienen los sitios de fijación de las enzimas de restricción se eliminan constantemente (fragmento de "relleno" y extremo exterior del producto PCR) mientras que

: los otros dos componentes, a saber el fragmento vector grande y la secuencia de inserción (fragmento central procedente de la región PCR) son impulsados para formar

A): un híbrido concatémero si la ligación se lleva a cabo a > 100 \mug DNA/ml (Figura 5), o

B): un híbrido circular si la ligación se lleva a cabo a < o = 40 \mug DNA/ml,

d1): en el caso del protocolo A), el DNA se empaqueta en partículas lambda y se transduce en un huésped Escherichia coli,

d2): en el caso del protocolo B) el DNA se transforma en un huésped Escherichia coli,

e): en caso deseado, se hace selección para un gen presente en los vectores de presentación ligados,

f): los vectores de presentación transducidos en el huésped Escherichia coli

g): los vectores de presentación empaquetados se someten a pasadas en un huésped Escherichia coli reciente y se forman genotecas de presentación de fago o presentación de fagémido y, en caso deseado

h): los vectores de presentación sometidos a pasadas

se forman genotecas de presentación de fago o presentación de fagémido.

Una realización específica de la invención concierne a un método que se caracteriza porque en los pasos (a) a (b), como enzima de restricción de tipo IIs se selecciona preferiblemente BpII, BsgI o BpmI.

Adicionalmente, una realización específica de la invención concierne a un método que se caracteriza porque en el paso (f) y facultativamente en el paso (h), se utiliza M13KO7 como el fago adyuvante de tipo M13.

Adicionalmente, una realización específica de la invención concierne a un método que se caracteriza porque en el paso (e) se hace selección para la presencia de un gen de resistencia a los antibióticos.

Adicionalmente, una realización específica de la invención concierne a un método que se caracteriza porque en el paso (g) la multiplicidad de infección (MOI) es menor que o igual a 1.

Otra realización de la invención concierne a una genoteca de presentación de fago o una genoteca de presentación de fagémido en la forma de partículas empaquetadas que pueden obtenerse de acuerdo con cualquiera de los métodos que se han descrito anteriormente.

Otra realización de la invención concierne a una genoteca de presentación de fago o una genoteca de presentación de fagémido en la forma de vectores de presentación constituidos por una o más poblaciones de Escherichia coli que pueden obtenerse de acuerdo con cualquiera de los métodos que se han descrito anteriormente.

Otra realización de la invención concierne a genotecas de presentación de fago o genotecas de fagémido que se caracterizan por uno o más genes como se han definido anteriormente y que pueden obtenerse de acuerdo con la invención, en las cuales el término "grande" tal como se utiliza anteriormente se define como superior a 10^{6} clones variantes, con preferencia 10^{8} a 10^{11} clones variantes.

Descripción detallada

La invención se refiere a una nueva combinación de tecnologías de DNA recombinante para producir grandes bancos de genes hipervariables para la selección de nuevos ligandos de importancia farmacéutica, diagnóstica, biotecnológica, veterinaria, agrícola y biomédica con un eficiencia mayor que la que era alcanzable hasta ahora.

El tamaño del banco de genes hipervariables está considerado actualmente como el factor más esencial que limita la utilidad de la metodología para tales propósitos dado que, como método empírico, depende de la diversidad (número de variantes diferentes) generada inicialmente en el banco (genoteca de genes hipervariables). En contraste con esta opinión tradicional, los autores de la presente invención consideran que, cuando se desarrolla un método de alta eficiencia, como el que se representa en esta memoria, para generar una gran proporción de las posibles combinaciones de segmentos mutados de las variantes a partir de una subpoblación preseleccionada, se generará una población enriquecida para los elementos estructurales deseados que habría estado representada solamente en una población que se aproximara a N^{x}, donde N es el tamaño de la población original y x es el número de segmentos a recombinar.

La primera parte de la invención se refiere a nuevas secuencias que permiten la recombinación dentro de secuencias de DNA hipervariables que codifican regiones (dominios) de péptidos o proteínas variables presentados en genotecas combinatorias de presentación de fago/fagémido utilizando endonucleasas de restricción de tipo IIs (a) para introducir un corte en el sitio de recombinación y (b) para generar sustratos orientados para una reacción de ligación, donde los productos de ligación se someten luego a reclonación con alta eficiencia después de empaquetamiento in vitro en una mezcla de empaquetamiento lambda. El protocolo completo proporciona eficiencias (clones por DNA de entrada) que exceden de cualquier tecnología descrita (> 10^{8} clones por microgramo de DNA ligado).

Las combinaciones de secuencias (vectores) y protocolos se reivindican tanto para la producción de las genotecas iniciales como para procedimientos recombinatorios a fin de generar una diversidad incrementada dentro de la genoteca o una subpoblación seleccionada en cualquier momento. En particular, tales secuencias y procedimientos se reivindican para la generación y el uso de genotecas combinatorias de presentación de fago/fagémido.

Los autores de la invención reconocen que el principal factor por el cual se determina la generación eficiente de variación adicional es la producción eficiente de genotecas combinatorias a partir de las genotecas iniciales, por la vía de reasociación de elementos más pequeños (secuencias de péptidos específicos dentro de la región hipervariable, y/o reasociación de dominios estructurales) que contribuyen a las propiedades seleccionadas. La invención presenta un método de este tipo, que tiene la propiedad singular de que el sitio de recombinación puede estar dentro de la región hipervariable, con lo cual no se impone restricción alguna en cuanto a la secuencia dentro de la región hipervariable implicada. Alternativamente, el método puede utilizarse para reasociar dominios de proteínas o subunidades de proteínas heterómeras (proteínas compuestas de dos o más cadenas de polipéptidos variantes diferentes), cada una de las cuales puede contener regiones hipervariables, sin recurrir a la reclonación de fragmentos de DNA aislados o la generación de nuevas genotecas que contengan nuevos oligonucleótidos sintéticos. Debe observarse que este método ofrece por tanto una economía tanto en tiempo como en materiales cuando se optimiza una estructura para una propiedad predeterminada sobre la base de una población de clones preseleccionada (subpoblación), y teniendo en cuenta el aumento geométrico en la posible variabilidad ofrecida puede representar una característica cualitativamente nueva en el sentido de que algunas estructuras raras pueden ser obtenidas únicamente por la nueva estrategia descrita.

El método, que los autores de la presente invención designan cosmix-plexing^{7}, está basado en el diseño de los vectores de clonación, las inserciones utilizadas y una combinación de protocolos especiales de DNA recombinante, que utilizan en particular i) la escisión del DNA de fago/fagémido con enzimas de restricción de tipo IIs, ii) la ligación subsiguiente a concatémeros que iii) se empaquetan in vitro con un sistema de empaquetamiento lambda para iv) transducción eficiente en cepas de E. coli, donde aquéllos v) se empaquetan luego nuevamente in vivo en cubiertas de fago filamentoso. El uso de la estrategia cosmix-plexing^{7}, así definido, en una población heterogénea de fago/fagémido genera un aumento enorme en nuevas variantes en cualquier momento durante la experimentación ulterior, v.g. después de cualquier paso de enriquecimiento para estructuras que tengan la propiedad o propiedades predeterminadas.

En particular, las subpoblaciones que se enriquecen a partir de la genoteca original en cuanto a una propiedad específica se enriquecerán para un motivo de consenso (un conjunto degenerado de secuencias afines dentro de la o las regiones modificadas, todas las cuales exhiben en cierto grado la propiedad requerida), que puede incluir (y probablemente incluirá) la secuencia óptima en términos de la propiedad requerida. La reasociación de estas regiones o porciones de una secuencia hipervariable singular por la estrategia cosmix-plexing^{7} aumentará la probabilidad de obtener la secuencia óptima. Las subpoblaciones pueden aislarse por selección diferencial basada en afinidad sobre una diana definida, o procedimientos de enriquecimientos basados en otras propiedades seleccionables deseadas (ejemplo 1: propiedades del sustrato tales como fosforilación por una proteína-quinasa particular enriquecida por fijación en anticuerpos que reconocen el sustrato modificado (en este caso fosforilado); o ejemplo 2: escisión de la secuencia variante por una endoproteasa, utilizando liberación selectiva del fago o fagémido fijado previamente por una interacción entre una estructura de proteína terminal (de anclaje) y su ligando inmovilizado a, o atrapado posteriormente en, una superficie).

La invención abarca adicionalmente la generación de genotecas de extensión en las cuales, v.g., una "casete específica de proyecto" se inserta en el sitio de recombinación dentro del banco de genes. La optimización de ligandos puede ocurrir luego por la generación de genotecas combinatorias adicionales a partir de clones seleccionados en los cuales las regiones adyacentes pueden "barajarse" eficientemente, sea individualmente o ambas a la vez. hasta donde conocen los autores de la presente invención, ningún otro sistema proporciona esta característica de "inserción/intercambio" de "casete".

Leyendas de las figuras Figura 1 Representación diagramática de los pasos implicados en la creación de recombinación dentro de las regiones hipervariables de genotecas cosmix-plexing^{7}

Fagémido bicatenario de un número de clones (que puede ser un cósmido propiamente dicho) y DNA de cósmido (si el fagémido no es un cósmido) se escinden con una enzima de restricción de tipo IIs (sitios de escisión indicados por una pequeña barra) dentro de la región hipervariable y se ligan entre sí a alta concentración de DNA de tal manera que se forman concatémeros largos de las moléculas de DNA, todos los cuales están orientados en la misma dirección, v.g. con respecto a los orígenes de empaquetamiento de M13, es decir, sin que se forme región palindrómica alguna. Los vectores contienen uno o más sitios de restricción para la enzima de restricción de tipo IIs de tal modo que no se forma extremo cohesivo alguno que pudieran formar en la ligación estructuras palindrómicas (es decir, cabeza-a-cabeza o cola-a-cola). Cuando los extremos cohesivos producidos en la escisión por la enzima de restricción son en sí mismos no palindrómicos y singulares con respecto a cada sitio de restricción dentro de cada plásmido/fagémido, únicamente pueden formarse cierre de anillo y formación de concatémeros. Para concentraciones de DNA mayores (es decir, superiores a 200 \mug DNA/ml) se preferirá la formación de concatémeros. Una presentación más detallada de las estructuras moleculares formadas se da en las Figuras 2 y 3. El producto de ligación se añade a un extracto de empaquetamiento lambda in vitro en el cual el DNA está empaquetado en una cubierta de bacteriófago lambda como un DNA lineal de 37 a 50 kb escindido en un sitio cos lambda. En el paso siguiente, al que se hace referencia como transducción, estas partículas que llevan el DNA híbrido cósmido-fagémido se añaden a células de Escherichia coli (representadas como grandes elipses en el diagrama) en las cuales se inyecta el DNA propiamente dicho. En la célula, el mismo se circulariza por cierre del sitio cos escindido utilizando la DNA-ligasa endógena. Se propaga luego como un híbrido cósmido-fagémido grande, que se replica desde el o los orígenes de replicación del DNA plasmídico. Se añade un fago adyuvante tipo M13 (v.g. M13KO7) a estas células en el paso designado como superinfección. A la entrada del fago adyuvante, se inicia una replicación de cadena simple desde los orígenes de replicación de M13 presentes en las copias individuales del fagémido contenido en el concatémero. Durante este proceso, el fago se empaqueta también en cubiertas de M13, y se secreta al medio. El fagémido puede cosecharse a partir del sobrenadante del cultivo. Un segundo paso, a saber, la transducción en un huésped E. coli y el re-empaquetamiento por superinfección con fago adyuvante es necesario antes de utilizar estos fagémidos en un procedimiento de selección a fin de asegurar que se presente una proteína variante particular únicamente en la partícula que lleva el gen para dicha proteína variante particular. Debe observarse que éste es un proceso altamente eficiente en el cual puede alcanzarse un rendimiento mayor que 10^{8} fagémidos diferentes por microgramo de DNA de alimentación ligado.

Figura 2

El diagrama ilustra las estructuras de DNA formadas cuando se realiza el protocolo cosmix-plexing^{7} como se muestra en la Figura 1. Diferentes variantes se designan por diferentes patrones para el plásmido entero. Inicialmente, se escinde DNA bicatenario con una enzima de restricción A de tipo IIs. El producto de ligación se ilustra como un concatémero en el cual cada fagémido está orientado en la misma orientación. Se muestran los productos de 37 a 50 kb introducidos después de empaquetamiento lambda in vitro e introducción en células de E. coli (elipses sombreadas), pudiendo estar presentes por ejemplo 8 a 10 copias de un fagémido de 4,5 kb por célula. En el re-empaquetamiento, se obtienen los mismos fagémidos que estaban presentes antes de la escisión y ligación. El protocolo que se muestra aquí, en el cual el sitio de empaquetamiento/replicación de M13 y el sitio de restricción para la enzima A son idénticos, es simplemente un método eficiente de multiplicación cuando se parte de DNA bicatenario.

Figura 3

El diagrama ilustra una variante del protocolo ilustrado en las Figuras 1 y 2, en la cual se efectúa la recombinación entre variantes de fagémido diferentes. El punto de cruzamiento para la recombinación es el sitio de escisión para la enzima de restricción B de tipo IIs (representada como una flecha hueca) que escinde con preferencia dentro de una región hipervariable o entre dos regiones variables diferentes (véase también la Figura 4, en la cual pueden recombinarse simultáneamente sitios de escisión adicionales dentro de otras regiones variables). De nuevo, como se menciona en la leyenda de la Figura 1, cada fagémido puede ser un cósmido en sí mismo, en cuyo caso es innecesaria la adición de otro cósmido. En este ejemplo, la escisión con la enzima de restricción A es opcional. Aunque las Figuras 2 y 3 son prácticamente idénticas, debe indicarse que los productos del esquema en la Figura 3 están todos ellos recombinados, es decir, son híbridos de los dos lados de variantes diferentes. Es preciso un nuevo sometimiento a pasadas antes de la utilización en la genoteca recombinada para experimentos de selección, por las mismas razones expuestas en las dos figuras anteriores.

Figura 4 Estrategias de la estrategia cosmix-plexing^{7}

La parte izquierda de la Figura muestra las secuencias de DNA hipervariables que codifican la porción variable del péptido o proteína presentado en el fago/fagémido. Las cuatro barras designadas "variantes N" muestran que existen diferentes secuencias en cada lado del sitio de escisión por restricción de tipo IIs. El DNA de fagémido de los clones variantes puede escindirse con la enzima de restricción de tipo IIs y religarse para dar el número indicado de clones recombinantes, dentro de los límites de la eficiencia de clonación. Si se parte de una subpoblación de variantes previamente enriquecidas a partir de la genoteca primaria (por ejemplo 4 x 10^{4} clones) entonces puede obtenerse una dieciseisava parte de todos los recombinantes posibles (10^{8}).

La construcción de "genotecas de extensión" se muestra bajo la línea de puntos. En este caso, una casete específica de proyecto que contiene una distribución de codones sesgada que codifica algunos elementos de la secuencia definidos primeramente como ventajosos para fijación a la diana se inserta en la secuencia hipervariable en el sitio de la escisión por restricción de tipo IIs. La gran genoteca así generada codifica una proteína que contiene tres segmentos (dominios B, A y C), en la cual el dominio central A está codificado por la casete específica del proyecto, y está bordeado por los dominios hipervariables B y C.

Las fórmulas para los números de variantes obtenidos se realizan para el protocolo en el cual se construyen cuatro genotecas separadas.

El lado derecho de la Figura ilustra de qué modo la proteína variante podría fijarse a una proteína diana. Se espera que las variantes seleccionadas de la genoteca de extensión tengan una mayor superficie de interacción y exhiban así una fijación más fuerte y/o más específica a la diana definida. La diana puede ser una célula, una proteína o péptido (parcialmente) purificada(o) v.g. enzima, anticuerpo, hormona o linfoquina, un receptor celular o, de hecho, cualquier superficie o suspensión de partículas definida, recubierta posiblemente con una de las dianas mencionadas anteriormente, que es susceptible de separación física, es decir la pared de un recipiente (tubo, tubería, matraz, placa de microtitulación, una superficie plana), o una partícula (v.g. perlas, bolitas magnéticas, o gotitas en un sistema líquido de dos fases).

\newpage

Figura 5 Clonación impulsada dirigida (DDC)

Esta Figura ilustra un ejemplo de un protocolo de clonación que tiene propiedades excelentes para la construcción muy eficiente de genotecas hipervariables y genotecas de extensión, que pueden utilizarse con el método cosmix-plexing^{7}. El lado izquierdo de la Figura muestra la preparación de la casete hipervariable a insertar en el vector bicatenario cósmido-fagémido. El vector de cósmido-fagémido que contiene un "fragmento de relleno" se muestra a la derecha. Tanto el producto PCR que contiene la secuencia hipervariable, representada como una línea de asteriscos, como el vector que contiene el "relleno" se escinden con la misma o las mismas enzima(s) de restricción de tipo IIs. Debe indicarse que los sitios de reconocimiento para esta(s) enzima(s) están orientados en direcciones opuestas, es decir hacia fuera desde el relleno en el caso del vector, y hacia dentro en el caso del producto PCR. Como resultado de la escisión, ni la casete hipervariable a insertar ni el vector contienen ninguno de los sitios de reconocimiento originales por la enzima de restricción del tipo IIs. Los vectores y la inserción están, sin embargo, diseñados de modo que tengan extremos cohesivos no palindrómicos en sus términos, generados por la escisión con la enzima de restricción, de tal manera que una ligación de inserción y vector conduce a una inserción orientada de la región hipervariable. Adicionalmente, el vector no puede sufrir cierre de anillo en ausencia de la casete de inserción, ni los fragmentos de inserción pueden ligarse unos a otros. Dado que la ligación se lleva a cabo a alta concentración de DNA y en presencia continuada de la enzima de restricción, cualquier producto de ligación que se asemeje al vector inicial o producto PCR no escindido o parcialmente escindido sufrirá una nueva escisión inmediatamente. Esta combinación de extremos cohesivos no palindrómicos orientados y re-escisión de los productos de ligación no deseados, impulsa, especialmente a alta concentración de DNA, en cuyo caso la formación de cierre de anillo de un híbrido vector-inserción se encuentra en desventaja, la formación de concatémeros bicatenarios orientados de la estructura requerida para empaquetamiento del cósmido altamente eficiente. La genoteca primaria "cosmix-plexing" se forma finalmente por transducción de los híbridos cósmido-fagémido empaquetados en un huésped E. coli que contiene, o está superinfectado con, un fago adyuvante semejante a M13. Los fagémidos se someten nuevamente a pasadas en un segundo paso de empaquetamiento del fago M13 antes de su utilización en la selección a fin de que se deriven clones de fago individuales a partir de las células infectadas singularmente. Esto es necesario a fin de que cada partícula de fagémido lleve la variante codificada en su genoma.

Ésta no es la situación en el primer paso de empaquetamiento en el cual el huésped E. coli contiene un concatémero de aproximadamente 8 fagémidos de variantes diferentes.

La recombinación puede realizarse dentro de la región hipervariable del gen que codifica la proteína o péptido presentado(a) en el fagémido de acuerdo con el esquema que se ilustra en la Figura 1. Con las genotecas de extensión, o bien la extensión izquierda (5') o la derecha (3'), o ambas, pueden reasociarse por escisión con una enzima de restricción de tipo IIs que reconoce un sitio contiguo al extremo izquierdo, al extremo derecho (orientación opuesta) o a ambos extremos respectivamente, como se describe para las secuencias B_{1}-B_{n} y Q_{n+a+1}...Q_{n+a+1} en la

\hbox{reivindicación 3.}

El uso de secuencias hipervariables en la descripción de la invención implica en general que los autores de la invención intentan utilizar series de oligonucleótidos en las cuales las "secuencias aleatorizadas" codifican aminoácidos en relaciones próximas a la encontrada normalmente en las proteínas naturales, con lo cual se reduce la frecuencia de codones de parada. Los autores de la invención son sabedores de que, para ciertas aplicaciones, pueden ser preferibles subconjuntos sesgados en la construcción de subgenotecas específicas.

Ejemplo 1 "Cosmix-plexing" utilizando el método de cuatro tubos (de acuerdo con las reivindicaciones 1-10) 1a) Generación de la genoteca

Secuencias de oligonucleótidos:

NONA-CA:

6

donde X significa: A, C, y G; N: A, C, G y T; K: G y T; R: G y A; Y: C y T; M: C y A:

NONA PCR-L:

5' GGCGAAGCTCCCGTGCAGC 3'

NONA PCR-R:

5' TCGGGGTACCTGGAGCA 3'

Los sitios de reconocimiento por las enzimas de restricción KpnI (GGTACC) y SacI (GAGCTC) están marcados en tipo negrita.

Secuencias importantes del DNA vector:

pROCOS4/7:

7

pROCOS4/7-Stuffert:

8

fragmento Eco47III de 952 pb

del plásmido pBR322

Los sitios de reconocimiento por las enzimas de restricción KpnI (GGTACC), SacI (GAGCTC), BsgI (GTGCAG), Eco47III (AGCGCT), y BpmI (CTGGAG) están marcados en tipo negrita. Se indica el primer codón de la proteína madura pIII (GAA).

Para la generación de inserciones de DNA bicatenario, los oligómeros de DNA monocatenarios hipervariables NONA-CA, NONA-CT, NONA-GA y NONA-GT se multiplican utilizando los oligonucleótidos de DNA monocatenario NONA PCR-L y NONA PCR-R como iniciadores de PCR de acuerdo con el protocolo siguiente:

Observación: ¡Los cuatro oligonucleótidos de DNA hipervariables tienen que mantenerse estrictamente separados!

Multiplicación por PCR de oligómeros de DNA

Tampón de PCR (10X)
KCl	500 mM
Tris-HCl (pH 9,0)	100 mM
Triton X-100	1%

DNA-polimerasa Taq (Promega) en tampón de almacenamiento A
Glicerol	50%
Tris-HCl (pH 8,0)	50 mM
NaCl	100 mM
EDTA	0,1 mM
DTT	1 mM
Triton X-100	1%

Tampón TE (1X)
Tris-HCl (pH 8,0)	10 mM
EDTA	0,1 mM

1. Transferir 2 \mul de una solución de 10 pmol/\mul de los oligómeros hipervariables NONA-CA, -CT, -GA y -GT en un tubo de reacción PCR de 0,2 ml (cuatro tubos).

2. mezclar lo siguiente en un tubo de reacción Eppendorf:

ddH_{2}O	276,75 \mul
Tampón PCR (10X)	45,0 \mul
NONA-PCR-L (100 pmol/\mul)	9,0 \mul

(Continuación)

NONA PCR-R (100 pmol/\mul)	9,0 \mul
DNTPs (10 mM cada uno)	9,0 \mul
DNA-polimerasa Taq (5 U/\mul)	2,25 \mul

3. Transferir 78 \mul de esta mezcla a cada uno de los tubos PCR que contienen los oligómeros hipervariables

\hbox{(paso 1).}

4. Mezclar 45 \mul de MgCl_{2} (25 mm) y 45 \mul de ddH_{2}O en tubo de reacción Eppendorf.

5. Precalentar un termociclador PCR a 94ºC (si es posible utilizar una tapa calentada).

6. Transferir 20 \mul de la solución de MgCl_{2} (paso 4) a cada uno de los tubos PCR (paso 3).

7. Poner los tubos directamente en el termociclador (arranque en caliente simplificado) y ejecutar el programa siguiente:

1.: 94ºC 30s

2.: 94ºC 10s

3.: 52ºC 10s

4.: Repetir 9 veces los pasos 2 y 3

5.: Mantener a 4ºC

8. Tomar una parte alícuota de 5 \mul para correr un gel de agarosa al 4,5%.

9. Añadir 200 \mul de ddH_{2}O a cada tubo, extraer con fenol, precipitar con etanol y resuspender el DNA en 120 \mul de tampón TE.

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Para la clonación, los oligo-DNA multiplicados se cortan con KpnI y SacI. Asimismo, el DNA vector tiene que cortarse con ambas enzimas. Como DNA vector puede utilizarse pROCOS4/7 o un derivado del mismo denominado pROCOS4/7-RellenoI que contiene un fragmento DNA-Relleno para control más fácil de la reacción de doble digestión, sin consecuencia alguna en relación con los resultados finales de la clonación. Las digestiones se realizan de acuerdo con los protocolos siguientes:

Tampón B + TX-100 (1X)
Tris-HCl (pH 7,5)	10 mM
MgCl_{2}	10 mM
BSA	0,1 Mg/ml
Triton X-100	0,02%

Tampón A (1X)
Tris-acetato (pH 7,9)	33 mM
Acetato de magnesio	10 mM
Acetato de potasio	66 mM
Ditiotreitol	5 mM

Digestión del DNA vector

1. Para la digestión con restricción del DNA vector con KpnI se prepara la mezcla siguiente:

pROCOS4/7-RellenoI	X \mul (220 \mug)
Tampón B + TX-100 (10X)	150 \mul
BSA (10 mg/ml = 100X)	15 \mul
KpnI	X \mul (400 U)
ddH_{2}O	hasta 1500 \mul

Incubar a 37ºC durante 3 h y detener la reacción por incubación a 65ºC durante 20 min.

2. Tomar una parte alícuota de 3 \mul y correr un gel de agarosa al 1% con DNA no escindido como control.

3. Extraer con fenol, precipitar con etanol y resuspender el DNA en 820 \mul de tampón TE.

4. Guardar una parte alícuota de 20 \mul del DNA digerido a -20ºC y mezclar lo siguiente para la digestión con SacI:

pROCOS4/7-Relleno/KpnI	800 \mul
Tampón A (10X)	100 \mul
SacI	X \mul (400 U)
ddH_{2}O	1000 \mul

Incubar a 37ºC durante 3 h.

5. Tomar una parte alícuota de 3 \mul y correr un gel de agarosa al 1% utilizando DNA no escindido y de un solo corte como control.

6. Extraer con fenol, precipitar con etanol y resuspender el DNA en 550 \mul de tampón TE.

Digestión de oligo-DNA

1. Para la digestión del oligo-DNA bicatenario (ds) con KpnI, disponer las cuatro mezclas siguientes:

ds DNA NONA-CA, -CT, -GA o –GT	100 \mul
Tampón B + TX-100 (10X)	50 \mul
BSA (10 mg/ml = 100X)	5 \mul
KpnI	X \mul (400 U)
ddH_{2}O	hasta 500 \mul

Incubar a 37ºC durante 5 h.

NOTA: No calentar el oligo-DNA.

2. Tomar una parte alícuota de 5 \mul y correr un gel de agarosa al 4,5% con DNA no escindido como control.

3. Extraer con fenol, precipitar con etanol y resuspender el DNA en 110 \mul de tampón TE.

4. Guardar una parte alícuota de 10 \mul del DNA digerido a -20ºC y disponer las cuatro mezclas siguientes para la digestión con SacI:

NONA-CA, -CT, -GA o -GT/KpnI	100 \mul
Tampón A (10X)	50 \mul
SacI	X \mul (400 U)
ddH_{2}O	hasta 500 \mul

Incubar a 37ºC durante 5 h.

5. Tomar una parte alícuota de 5 \mul y correr un gel de agarosa al 4,5% utilizando DNA no escindido de un solo corte como control.

6. Extraer con fenol, precipitar con etanol y resuspender el DNA en 55 \mul de tampón TE.

El fragmento DNA vector puede purificarse utilizando el protocolo siguiente:

Purificación de fragmentos DNA vector por extracción en gel

1. Para separar el fragmento DNA vector pROCOS4/7 del fragmento de relleno, preparar un gel horizontal de agarosa al 1% utilizando un peine de un solo diente.

2. Mezclar el DNA con 1/10 vol de tampón de carga de gel, cargar sobre el gel y someter a electroforesis a 100 V hasta que ambos fragmentos se separan claramente.

3. Poner el gel en el transiluminador UV y cortar el fragmento de DNA vector pROCOS4/7 de 5,5 kb.

4. Extraer la rodaja de agarosa utilizando el estuche de extracción con gel JETsorb (Genomed GmbH, Alemania).

Los fragmentos de DNA vector y de inserción se ligan y transforman de acuerdo con los protocolos siguientes:

Ligación de fragmentos de DNA

Comprobar la integridad de los fragmentos de DNA vector y de inserción por electroforesis en gel de agarosa (1% y 4,5% respectivamente). La concentración del DNA de inserción puede estimarse por comparación de su tinción con bromuro de etidio con patrones de cantidad conocida de oligonucleótidos ensamblados análogos. Para determinar la concentración del DNA vector se determina la absorbancia a 260/280 nm.

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Tampón de DNA-ligasa T4 (1X)
Tris-HCL (pH 7,5)	50 mM
MgCl_{2}	10 mM
Ditiotreitol	10 mM
ATP	1 mM
BSA	25 \mug/ml

Ligación de ensayo

1. Para determinar la relación apropiada de DNA de inserción a DNA vector puede realizarse una serie de ligaciones de ensayo. Para esto, se ensamblan reacciones de ligación compuestas de:

Fragmento de DNA vector	X \mul (0,5 \mug)
Tampón de DNA-ligasa T4 (10X)	1 \mul
ddH_{2}O	hasta 9 \mul

2. Preparar tres diluciones al doble de los DNA de inserción en ddH_{2}O y añadir 1 \mul de DNA sin diluir así como 1 \mul de cada dilución a una de las reacciones de ligación.

NOTA: La finalidad de esto es crear relaciones de DNA vector a inserción (V/I) de 1:5 a 2:1.

3. Añadir 1 unidad de DNA-ligasa T4 a cada reacción e incubar durante una noche a 15ºC.

NOTA: Como control, debería incluirse una reacción sin DNA de inserción y una sin ligasa.

4. Añadir 1 vol de ddH_{2}O a cada reacción e incubar a 65ºC durante 10 min.

5. Precipitar el DNA con etanol y resuspenderlo en 10 \mul de tampón TE.

6. Transformar células electrocompetentes de E. coli JM110\lambda con el contenido de cada tubo y extender en placas diluciones sobre placas de agar LB que contienen ampicilina.

Ligación en gran escala

1. Para crear las genotecas, disponer cuatro de las mezclas siguientes:

Fragmento DNA vector	X \mul (1/4 de la prep. total)
DNA de inserción	X \mul (para crear la relación V/I óptima)
Tampón de DNA-ligasa T4 (10X)	X \mul (1/10 del vol final)
DNA-ligasa T4	X \mul (2 U/\mug DNA)
ddH_{2}O	para crear una conc. de DNA de 0,5 \mug/\mul

Incubar durante una noche a 15ºC.

2. Extraer con fenol, precipitar con etanol y resuspender cada una de las mezclas de ligación en suficiente tampón TE para ajustar la concentración de DNA hasta 0,1-0,2 \mug/\mul.

Preparación de las células competentes

1. Inocular 20 ml de medio LB con una sola colonia de E. coli JM110\lambda e incubar a 37ºC y 180 rpm durante una noche.

2. Al día siguiente, inocular 2x1 litro de medio LB (2 x 21 matraces Erlenmeyer) al 1% con el cultivo desarrollado durante una noche e incubar de nuevo en las mismas condiciones hasta que se ha alcanzado una densidad óptica de DO_{600} = 0,6.

3. Transferir partes alícuotas de 250 ml del cultivo a tubos de centrífuga (GS3), enfriar las células en hielo y centrifugar durante 15 min a 8000 rpm y 4ºC (centrífuga Sorvall RC5C; rotor GS3). Decantar el sobrenadante.

4. Resuspender cada sedimento en 250 ml de ddH_{2}O enfriada en hielo, centrifugar de nuevo (paso 3) y decantar el sobrenadante.

5. Resuspender cada sedimento en 125 ml de ddH_{2}O enfriada en hielo, recoger cada una de dos partes alícuotas en un tubo, centrifugar de nuevo (paso 3) y decantar el sobrenadante.

6. Resuspender cada sedimento en 10 ml de glicerol estéril enfriado en hielo (10%), recoger todas las partes alícuotas en un tubo de centrífuga GSA, centrifugar durante 15 min a 8000 rpm y aspirar el sobrenadante.

7. Resuspender el sedimento bacteriano en 10 ml de glicerol estéril enfriado en hielo (10%).

8. Introducir partes alícuotas de 100 \mul en tubos de reacción Eppendorf estériles previamente enfriados, congelar inmediatamente en nitrógeno líquido y guardar a -70ºC.

Transformación de células E. coli por electroporación

1. Poner partes alícuotas congeladas de células competentes E. coli en hielo y dejar que se descongelen.

2. Añadir a cada parte alícuota hasta 2 \mug de DNA en menos de 10 \mul e incubar en hielo durante 1 minuto.

3. Introducir la suspensión en una cubeta de electroporación previamente enfriada (0,2 cm de recorrido), poner la cubeta en la guía de electroporación y aplicar un pulso a un voltaje de 2,5 kV, una capacidad de 25 \muF y una resistencia de 200 \Omega (Gene Pulser and Puls Controller, Bio-Rad).

4. Añadir inmediatamente 1 ml de medio LB (complementado con glucosa 20 mM), mezclar y transferir la suspensión a un tubo de reacción Eppendorf.

5. Incubar durante una hora a 37ºC y extender sobre placas de agar LB que contienen ampicilina (100 \mug/ml). Incubar durante una noche a 37ºC.

NOTA: para determinar el tamaño de las genotecas extender también en placa diluciones de las células transformadas.

6. para crear stocks de genoteca, resuspender las células en medio LB/ampicilina, mezclar con 1 vol de glicerol estéril al 87% y guardar a -70ºC.

1b) Recombinación

Para la recombinación dentro de las Secuencias Hipervariables de acuerdo con la estrategia cosmix-plexing de cuatro tubos, pueden preseleccionarse las genotecas. para este propósito, las células E. coli que contienen las genotecas de fagémido, se someten a superinfección con fagos adyuvantes M13K07, se recogen los fagos de la progenie que presentan proteínas de fusión y se utilizan para la primera tanda de un lavado en batea de acuerdo con métodos estándar, v.g.:

Preparación de los Stocks de Fago M13K07

Solución PEG/NaCl:
	(16,7%/3,3 M)
	100 g PEG 8000
	116,9 g NaCl
	475 ml H_{2}O
Tampón de PBS (IX):
	8,0 g NaCl
	0,2 g KCl
	1,43 g Na_{2}HPO_{4}+2H_{2}O
	0,2 g KH_{2}PO_{4}
	H_{2}O hasta 1 l
	pH 6,8-7

1. Utilizar una pipeta Pasteur desechable para recoger una calva individual M13K07 bien separada de un césped de E. coli WK6 cultivado durante una noche sobre una placa de LB/kanamicina (Km), inocular 20 ml de medio
LB(2X)/Km (matraz Erlenmeyer de 100 ml) con esta rodaja de agar e incubar durante un día a 37ºC en una máquina de sacudidas a 180 rpm.

\newpage

2. Inocular 2 x 500 ml de medio LB(2X)/Km (en matraces Erlenmeyer de 2 l) con 10 ml de precultivo e incubar durante una noche (37ºC, 180 rpm).

3. Al día siguiente, centrifugar cuatro partes alícuotas de 250 ml durante 15 minutos a 8000 rpm y 4ºC (centrífuga Sorvall RC5C; rotor GS3). Transferir el sobrenadante a botellas de centrífuga, centrifugar y transferir una vez más el sobrenadante a botellas de centrífuga nuevas.

4. Añadir 0,15 vol de solución PEG/NaCl mezclar e incubar en hielo durante al menos 2 horas.

5. Centrifugar durante 60 min a 8000 rpm (rotor GS3), decantar el sobrenadante, centrifugar durante unos cuantos segundos hasta 4000 rpm y separar las últimas trazas del sobrenadante utilizando una pipeta.

6. Resuspender cada sedimento de PEG en 2,5 ml de solución PBS y recoger los fagos resuspendidos en una botella de centrífuga SS34. para clarificar la suspensión, centrifugar de nuevo durante 10 min a 12000 rpm (rotor SS34). Recuperar el sobrenadante (pipeta), añadir NaN_{3} hasta una concentración final de 0,02% y guardar los fagos a 4ºC.

Empaquetamiento de fagémidos (¡mantener cada genoteca separada!)

1. Inocular 100 ml de medio LAB/Amp (matraz Erlenmeyer de 1 l) con 1 ml de células E. coli JM110\lambda que contienen fagémidos (procedentes de cultivo nocturno o de células resuspendidas) e incubar a 37ºC y 180 rpm hasta que DO_{600} = 0,5 (\sim 2,5 h).

2. Añadir 500 \mul de solución stock de M13K07 (10^{11}-10^{12} cfu (unidades formadoras de colonia)/ml), incubar a 37ºC durante 15 min y continuar agitando mediante sacudidas a 37ºC y 180 rpm durante una noche.

3. Al día siguiente, centrifugar durante 10 min a 8000 rpm (rotor GSA), decantar el sobrenadante en una botella nueva y repetir el paso de centrifugación.

4. Añadir 0,15 vol de solución PEG/NaCl e incubar en hielo durante al menos 2 horas.

5. Centrifugar durante 60 min a 10000 rpm (rotor GSA), decantar el sobrenadante y repetir la centrifugación y eliminar el sobrenadante por completo.

6. Disolver el sedimento en 1 ml de tampón PBS y transferir la solución a un tubo de reacción Eppendorf. Centrifugar durante 10 min a 13000 rpm (centrífuga de lotes), recuperar la solución clarificada y añadir NaN_{3} (concentración final de 0,02%). Guardar a 4ºC.

Procedimiento de lavado en batea (¡mantener cada genoteca separada!)

Solución de T-PBS:

Tampón PBS que contiene 0,5% de Tween 20

Solución de bloqueo:

Tampón PBS que contiene 2% de leche desnatada en polvo

Tampón de elución:

Glicina (0,1 M; pH 2,2)

1. Recubrimiento de las placas de microtitulación

Introducir 100 \mul de solución de ligando (100 \mug/ml de PBS) en los pocillos de una placa de microtitulación de 96 pocillos (Nunc Maxisorb) e incubar durante una noche a 4ºC o al menos 2 horas a la temperatura ambiente.

Agitar los pocillos mediante sacudidas, volcar de un golpe la placa sobre una toalla de papel y lavar los pocillos una sola vez con solución T-PBS (lavador de placas ELISA o manualmente).

2. Bloqueo

Llenar los pocillos con 400 \mul de solución de bloqueo e incubar a la temperatura ambiente durante \sim 1 hora. Agitar los pocillos mediante sacudidas, volcar de un golpe la placa sobre una toalla de papel y lavar los pocillos una sola vez con T-PBS.

3. Fijación

Llenar el pocillo recubierto y un pocillo sin recubrimiento (como control) con 100 \mul de preparaciones de fago diluidas en relación 1:1 con leche desnatada en polvo (usualmente \sim 10^{10}-10^{11} fagos/pocillo) e incubar a la temperatura ambiente durante 1 a 3 horas.

4. Lavado

Retirar las soluciones utilizando una pipeta y volcar de un golpe la placa sobre una toalla de papel.

En la primera tanda de lavado en batea, lavar los pocillos una sola vez con T-PBS, incubar durante 10 min con 400 \mul de solución de bloqueo, lavar nuevamente con T-PBS y por último dos veces con agua. Durante todas las tandas ulteriores, repetir tres veces los pasos de lavado con T-PBS. Todos los pasos de lavado pueden realizarse manualmente utilizando una pipeta o con un lavador de placas ELISA.

5. Elución

Golpear la placa y llenar los pocillos con 100 \mul de tampón de elución, incubar a la temperatura ambiente durante 15 min y transferir la solución a un tubo de reacción Eppendorf que contiene 6 \mul de Tris (2 M).

6. Determinar el título de los fagos eluidos como se describe en 3.1.3. Reinfección de las células de E. coli (¡mantener cada genoteca separada!)

1. Mezclar los fagos eluidos y 10 ml de células E. coli JM110\lambda en fase logarítmica e incubar durante 30 min a 37ºC.

2. Recoger las células por centrifugación (5 min, 8000 rpm, rotor SS34) y resuspender el sedimento en 400 \mul de medio LB/Amp.

3. Extender en placa cada suspensión sobre una placa de agar LB/Amp (\diameter 14,5 cm) e incubar durante una noche a 37ºC.

Después de una tanda de lavado en batea, son de esperar poblaciones de aproximadamente 10^{5} clones individuales enriquecidos hacia la fijación de una. Para la recombinación, el DNA de fagémido tiene que aislarse de acuerdo con protocolos estándar, v.g.:

Preparación de DNA-fagémido a partir de células reinfectadas

1. Resuspender las células de E. coli reinfectadas en 20 ml de medio LB/Amp y utilizar 200 \mul para la inoculación de 3 ml de medio LB/Amp.

2. Incubar a 180 rpm y 37ºC durante una hora.

3. Preparar el DNA utilizando Estuches Jepquick Plasmid Miniprep Spin (Genomed GmbH, Alemania), de acuerdo con las instrucciones del suministrador.

Utilizando este método pueden aislarse hasta 30 \mug de DNA. para genotecas basadas en pROCOS4/7, el tamaño del fagémido es 4,3 kb, correspondiente a un peso molecular de 2,9 x 10^{6} g/mol o en torno a 2 x 10^{11} moléculas de fagémido/\mug de DNA. Por consiguiente, 10 \mug de DNA recombinado contienen más moléculas que el número teórico de variantes diferentes que pueden crearse a partir de 10^{5} clones ((10^{5})^{2} = 10^{10}).

Para la recombinación, el DNA de fagémido de cada genoteca preseleccionada se corta por separado, v.g. con BpmI o, alternativamente, con BsgI:

Digestión del DNA de fagémido

Tampón NEB3 (1X)
NaCl	100 mM
Tris-HCl (pH 7,9)	50 mM
MgCl_{2}	10 mM
Ditiotreitol	1 mM

1. Preparar la reacción siguiente

DNA de fagémido	10 \mug
BpmI (2 u/\mul)	5 \mul
NEB3 (10X)	4 \mul
BSA (1 mg/ml)	4 \mul
H_{2}O	hasta 40 \mul

Incubar a 37ºC durante 5 h.

2. Tomar una parte alícuota de 4 \mul y correr un gel de agarosa al 1% para comprobar la digestión.

3. Extraer con fenol, precipitar con etanol y resuspender el DNA en tampón TE.

Los DNA de fagémido digeridos se religan a alta concentración (= 0,2 \mug/\mul) para favorecer la formación de concatémeros, se empaquetan en partículas de fago \lambda y se utilizan para la transfección de células E. coli (de acuerdo con "Packaging of Bacteriophage \lambda DNA in vitro; protocol I" p. 2.100-2.104, In: Molecular Cloning-a Laboratory Manual, Sambrook et al. (compiladores), segunda edición, 1989, Cold Spring Harbour Laboratory Press). Los fagémidos transfectados se separan por reinfección de empaquetamiento utilizando fagos adyuvantes M13K07 (véase anteriormente).

Ejemplo 2 "Cosmix-plexing" utilizando el método de un solo tubo (de acuerdo con las reivindicaciones 11-17 y 44) 2a) Generación de la genoteca

Secuencias de oligonucleótidos:

NONACOS-NGG: BpiI BsgI

9

NONACOS-NCT:

10

NONACOS-NAM:

11

NONACOS-NTS:

12

donde N significa: A, C, G o T; B: C, G o T; M: A o C, y S: C, G o T.

NONACOS-PCR-L: BpiI BsgI

5' GGCTCTGATGGAAGACGTGCAG 3'

NONACOS-PCR-R: BpiI BpmI

5' CGACAGGAGGAAGACTCTGGAG 3'

Están marcados en tipo negrita los sitios de reconocimiento por las enzimas de restricción BpiI (GAAGAC), BsgI (GTGCAG) y BpmI (CTCCAG). Los sitios de corte por BpiI están marcados con flechas.

Secuencias de DNA vector importantes de pROCOSS/3:

13

14

Los sitios de reconocimiento por las enzimas de restricción BpiI (GAAGAC), BsgI (GTGCAG), Eco47III
(AGCGCT) y BpmI (CTCCAG) están marcados en tipo negrita. Los sitios de corte por BpiI están marcados por flechas. Se indica también el primer codón de la proteína madura pIII (GAA).

Para crear genotecas de acuerdo con el método de un solo tubo, los oligómeros hipervariables NONACOS-NGG, -NCT. -NAM y -NTS se multiplican utilizando el iniciador de PCR NONACOS-R y NONACOS-L como se describe en el ejemplo 1, excepto que los oligo-DNA's no tienen que mantenerse por separado.

Después de esto, el DNA vector de pROCOS5/3 y el oligo-DNA bicatenario (ds) se digieren con BpiI y se ligan al mismo tiempo de acuerdo con el protocolo siguiente:

Digestión/Ligación

1. Preparar la mezcla siguiente

DNA de pROCOS5/3	200 \mug
dsDNA de NONACOS-NGG, -NCT, -NAM y –NTS	100 \mul
BpiI	200 \mu
Tampón G (10X)	40 \mul
BSA (10 mg/ml)	4 \mul
H_{2}O	hasta 400 \mul

Incubar a 37ºC durante 2 h, añadir 200 unidades de DNA-ligasa T4 y continuar la incubación a 15 hasta 30ºC durante una noche.

2. Tomar una parte alícuota de 3 \mul y correr un gel de agarosa al 1% como control.

Este protocolo favorece la producción de concatémeros del producto deseado, que pueden empaquetarse por ejemplo en células E. coli JM110\lambda por empaquetamiento \lambda de acuerdo con el ejemplo 1.

2b) Recombinación

Para lavado en batea y recombinación pueden utilizarse los mismos métodos descritos para el ejemplo 1, excepto que se utiliza una sola genoteca en lugar de cuatro genotecas separadas.

\newpage

Lista de signos de referencia Figura 1

1: Genoteca de fagémido in vitro

2

1.: Restricción con tipo IIs y ligación

2.: Empaquetamiento in vitro en una mezcla de empaquetamiento lambda

3.: Transducción en E. coli: eficiencia = 10^{7}/microgramo de DNA ligado

3: Cósmido que contiene un concatémero de fagémido

4: Superinfección por M13K07

5: Se liberan aprox. 7 a 8 fagémidos diferentes por clon de E. coli. Eficiencia total = 10^{8}/microgramo de DNA ligado

6: Partículas de fagémido que presentan cada una proteínas variantes diferentes

Figura 2

1: Escisión con enzima A (tipo IIs) y ligación a concatémeros

2: Empaquetamiento lambda in vitro + transducción en E. coli

3: Superinfección con el fago adyuvante M13 (re-empaquetamiento de fagémido individual a partir del concatenato)

4: Lo que se pone es lo que se obtiene.

Figura 3

1: Origen de replicación/empaquetamiento de M13 = sitio de escisión por la enzima A de tipo IIs

2: Escisión con enzima A+B (tipo IIs) y ligación a concatémeros

3: Empaquetamiento lambda in vitro + transducción en E. coli

4: Superinfección con el fago adyuvante M13 (re-empaquetamiento de fagémido individual a partir del concatenato)

5: Se recombinan el lado izquierdo y el lado derecho del sitio de escisión B de tipo IIs.

Figura 4

Estrategias "cosmix-plexing"®

1: Reasociación después de escisión y reempaquetamiento

2: Casete específica de proyecto

3: Reasociación después de escisión y reempaquetamiento 4 Diana

5: Selección por lavado en batea con una genoteca "cosmix-plexing"® estándar

6: Ligando primario seleccionado (dominio A)

7: Selección por lavado en batea con una estrategia "cosmix-plexing"® insertando la casete de consenso procedente de la genoteca inicial en una genoteca de extensión

8: Ligando optimizado secundario seleccionado de una genoteca de extensión (dominios B, A+C; B+C procedente de las extensiones)

\newpage

9: ¿Continuar la optimización?

1.: Reasociar, extensión izquierda y/o derecha

2.: Insertar otra casete reinsertar las casetes

: centrales en la nueva genoteca de extensión

3.: Repetir cualesquiera pasadas ......

Figura 5

Clonación dirigida impulsada (DDC) para la construcción de genotecas primarias

1: Región hipervariable

2: Escisión con enzima de restricción de tipo IIs

3: Ligación en presencia de enzima de restricción

4: "Relleno"

5: Empaquetamiento de cósmido y empaquetamiento de fagémido + fago adyuvante de tipo M13

6: Fagémido híbrido.

Claims

1. Un banco de genes, en el cual dichos genes comprenden una secuencia de DNA bicatenario que se representa por la fórmula siguiente de una de sus cadenas:

en la cual n, a, b y j son números enteros y

n > 3, a > 1, b > 3 y j > 1,

(i): Z representa G o T en una relación G:T de aproximadamente 1:1, y/o

(ii): Z representa C o T en una relación C:T de aproximadamente 1:1, y/o

(iii): Z representa A o G paren una relación A:G de aproximadamente 1:1, y/o

las subsecuencias B_{1}...B_{n} y Q_{n+a+b+1}...Q_{n+a+b+j} representan sitios de reconocimiento para enzimas de restricción de tipo ITs, y en la cual los sitios de reconocimiento están orientados de tal manera que su sitio de escisión genera al escindirse un extremo cohesivo que incluye las dos bases designadas Z.

2. Un banco de genes, en el cual dichos genes comprenden una secuencia de DNA bicatenario que se representa por la fórmula siguiente de una de sus cadenas:

en la cual n, a, b y j son números enteros y

n > 3, a > 1, b > 3 y j > 1,

(i): Z representa G o T en una relación G:T de aproximadamente 1:1, y/o

(ii): Z representa C o T en una relación C:T de aproximadamente 1:1, y/o

(iv): Z representa A o C en una relación A:C de aproximadamente 1:1, y en la cual las subsecuencias B_{1}...B_{n} o Q_{n+a+b+1}...Q_{n+a+b+j} representan sitios de reconocimiento para enzimas de restricción de tipo IIs, y en la cual los sitios de reconocimiento están orientados de tal manera que su sitio de escisión genera al escindirse un extremo cohesivo que incluye las dos bases designadas Z.

3. Un banco de genes de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el cual el extremo cohesivo es un extremo monocatenario de 2 pb formado por las dos bases designadas Z.

4. Un banco de genes de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el cual cada gen se proporciona como un vector de presentación, especialmente como fago M13 o fago semejante a M13, o como fagémido.

5. Un conjunto de cuatro bancos de genes de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual los bancos de genes se caracterizan como sigue:

: primer banco de genes: Z representa G o T, con preferencia en una relación G:T de aproximadamente 1:1;

: segundo banco de genes: Z representa C o T, con preferencia en una relación C:T de aproximadamente 1:1;

: tercer banco de genes: Z representa A o G, con preferencia en una relación A:G de aproximadamente 1:1; y

: cuarto banco de genes: Z representa A o C, con preferencia en una relación A:C de aproximadamente 1:1.

6. Un conjunto de cuatro bancos de genes de acuerdo con la reivindicación 5, en el cual cada gen se proporciona como un vector de presentación, especialmente como fago M13 o fago semejante a M13, o como fagémido.

7. Un banco de genes, en el cual dichos genes comprenden una secuencia de DNA bicatenario que se representa por la fórmula siguiente de una de sus cadenas:

en la cual n, a, b y j son números enteros y

n > 3, a > 1, b > 3 y j > 1,

en la cual X_{n+1}...X_{n+a+b} es una secuencia hipervariable y B, X, Z y Q representan adenina (A), citosina (C) guanina (G) o timina (T), y en la cual

están presentes cuatro conjuntos de secuencias de oligonucleótidos que comprenden Z_{n+a+1} y Z_{n+a+2}, en la cual los cuatro conjuntos se caracterizan como sigue:

(i): primer conjunto: Z_{n+a+1} representa G y Z_{n+a+2} representa también G;

(ii): segundo conjunto: Z_{n+a+1} representa C y Z_{n+a+2} representa T;

(iii): tercer conjunto: Z_{n+a+1} representa A y Z_{n+a+2} representa A o C, con preferencia en una relación A:C de aproximadamente 1:1; y

(iv): cuarto conjunto: Z_{n+a+1} representa T y Z_{n+a+2} representa C o G, con preferencia en una relación C:G de aproximadamente 1:1,

: y en el cual

: las secuencias B_{1}...B_{n} y Q_{n+a+b+1}...Q_{n+a+b+j} representan sitios de reconocimiento de tipo IIs para enzimas de restricción de tipo IIs,

en los cuales los sitios de reconocimiento están orientados de tal manera que su sitio de escisión genera al escindirse un extremo cohesivo que incluye las dos bases designadas Z.

8. Un banco de genes, en el cual dichos genes comprenden una secuencia de DNA bicatenario que se representa por la fórmula siguiente de una de sus cadenas:

en la cual n, a, b y j son números enteros y

n > 3, a > 1, b > 3 y j > 1,

(ii): segundo conjunto: Z_{n+a+1} representa C y Z_{n+a+2} representa T;

: y en el cual

: las secuencias B_{1}...B_{n} o Q_{n+a+b+1}...Q_{n+a+b+j} representan sitios de reconocimiento de tipo IIs para enzimas de restricción de tipo IIs,

9. Un banco de genes de acuerdo con la reivindicación 7 ó 8, en el cual los cuatro conjuntos de secuencias de oligonucleótidos están presentes en una relación de (i):(ii):(iii):(iv) de (0 a 1):(0 a 1):(0 a 1):(0 a 1) con la salvedad de que está presente al menos uno de dichos conjuntos.

10. Un banco de genes de acuerdo con la reivindicación 7, 8 ó 9, en el cual el extremo cohesivo es un extremo monocatenario de 2 pb formado por las dos bases designadas Z.

11. Un banco de genes de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, en el cual los cuatro conjuntos de oligonucleótidos están presentes en una relación de (i):(ii):(iii):(iv) de aproximadamente 1:1:2:2.

12. Un banco de genes en el cual dichos genes comprenden una secuencia de DNA bicatenario que se representa por la fórmula siguiente de una de sus cadenas:

5'B_{1}B_{2}B_{3}...B_{n}X_{n-1} ...X_{n+a}Z_{n+a+1}Z_{n+a+2}X_{n+a+3}...X_{n+a+b}Q_{n+a+b+1} ...Q_{n+a+b+j}3'

en la cual n, a, b y j son números enteros y

n > 3, a > 1, b > 3 y j > 1,

están presentes los seis conjuntos siguientes de secuencias de oligonucleótidos que comprenden X_{n+a,} Z_{n+a+1} y Z_{n+a+2}, caracterizándose los seis conjuntos como sigue:

(i): primer conjunto: X_{n+a} representa A, G y/o T, con preferencia en una relación de aproximadamente 1:1:1 o X_{n+a} representa C, G y/o T, con preferencia en una relación de aproximadamente 1:1:1, Z_{n+a+1} representa G y Z_{n+a+2} representa G;

(ii): segundo conjunto: X_{n+a} representa A, C, G y/o T, con preferencia en una relación de aproximadamente 1:1:1:1, Z_{n+a+1} representa C y Z_{n+a+2} representa T;

(iii): tercer conjunto: X_{n+a} representa A, C y/o G, con preferencia en una relación de aproximadamente 1:1:1, Z_{n+a+1} representa A y Z_{n+a+2} representa A;

(iv): cuarto conjunto: X_{n+a} representa A, C, G y/o T, con preferencia en una relación de aproximadamente 1:1:1:1, Z_{n+a+1} representa A y Z_{n+a+2} representa C;

(v): quinto conjunto: X_{n+a} representa A, C, G y/o T, con preferencia en una relación de aproximadamente 1:1:1:1, Z_{n+a+1} representa T y Z_{n+a+2} representa C;

(vi): sexto conjunto: X_{n+a} representa A, Z_{n+a+1} representa T y Z_{n+a+2} representa G, y en la cual las secuencias B_{1}...B_{n} y Q_{n+a+b+1}...Q_{n+a+b+j} representan sitios de reconocimiento para enzimas de restricción de tipo IIs, estando orientados los sitios de reconocimiento de tal modo que su sitio de escisión genera al escindirse un extremo cohesivo que incluye las dos bases designadas Z.

13. Un banco de genes en el cual dichos genes comprenden una secuencia de DNA bicatenario que se representa por la fórmula siguiente de una de sus cadenas:

en la cual n, a, b y j son números enteros y

n > 3, a > 1, b > 3 y j > 1,

en la cual X_{n+1}...X_{n+a+b} es una secuencia hipervariable y B, X, Z y Q representan adenina (A), citosina (C), guanina (G) o timina (T), y en la cual están presentes los seis conjuntos siguientes de secuencias de oligonucleótidos que comprenden X_{n+a}, Z_{n+a+1} y Z_{n+a+2}, caracterizándose los seis conjuntos como sigue:

(i): primer conjunto: X_{n+a} representa A, G y/o T, con preferencia en una relación de aproximadamente 1:1:1, o X_{n+a} representa C, G y/o T, con preferencia en una relación de aproximadamente 1:1:1, Z_{n+a+1} representa G y Z_{n+a+2} representa G;

(vi): sexto conjunto: X_{n+a} representa A, Z_{n+a+1} representa T y Z_{n+a+2} representa G, y en el cual las secuencias B_{1}...B_{n} o Q_{n+a+b+1}...Q_{n+a+b+j} representan sitios de reconocimiento para enzimas de restricción de tipo IIs, estando orientados los sitios de reconocimiento de tal manera que su sitio de escisión genera al escindirse un extremo cohesivo que incluye las dos bases designadas Z.

14. Un banco de genes de acuerdo con la reivindicación 12 ó 13, en el cual los seis conjuntos de secuencias de oligonucleótidos están presentes en una relación (i):(ii):(iii):(iv):(v):(vi) de (0 a 1):(0 a 1):(0 a 1):(0 a 1):(0 a 1):(0 a 1), con la salvedad de que está presente al menos uno de dichos conjuntos.

15. Un banco de genes de acuerdo con la reivindicación 12 ó 13, en el cual los seis conjuntos de secuencias de oligonucleótidos están presentes en una relación de (i):(ii):(iii):(iv):(v):(vi) de aproximadamente 3:4:3:4:-4:1.

16. Un banco de genes de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 15, en el cual cada gen se proporciona como un vector de presentación, especialmente como fago M13 o como fago semejante a M13, o como fagémido.

17. Un banco de genes de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual la secuencia de DNA bicatenario de acuerdo con la reivindicación 1, 2, 7 o la reivindicación 8 está constituida por una región de DNA que codifica un péptido o una proteína a presentar.

18. Un banco de genes de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque
n = j = 6, a = 14 y b = 16.

19. Un banco de genes de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, la enzima de restricción de tipo IIs es BglI, DraIII, BsgI o BpmI.

20. Un banco de genes de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores,

caracterizado porque

21. Un banco de genes de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la secuencia hipervariable X_{n+1}...X_{n+a+b} contiene NNB o NNK, donde N = adenina (A), citosina (C), guanina (G) o timina (T);

B = citosina (C), guanina (G) o timina (T); y

K = guanina (G) o timina (T).

22. Un fagémido pROCOS4/7 de la secuencia que se muestra en Fig. 6B.

23. Un fagémido pROCOS5/3 de la secuencia que se muestra en Fig. 7B.

24. Un método para la producción de grandes

-: genotecas de presentación de fago o

-: genotecas de presentación de fagémido,

que contienen o están constituidas por vectores de presentación recombinados opcionalmente empaquetados, en los cuales tiene lugar recombinación en el o los sitios de escisión para una enzima de restricción de tipo IIs y en los cuales

(a-b): se seleccionan un DNA bicatenario preparado a partir de células de Escherichia coli que contienen una población de vectores de presentación, constituida por fagos M13 o fagos semejantes a M13 o constituida por fagémidos; un vector de cósmido; una primera enzima de restricción que es una enzima de restricción de tipo IIs para un corte designado (B); y una segunda enzima de restricción para el corte (A), donde

(i): la primera enzima de restricción de tipo IIs escinde los vectores de presentación en la región codificante del péptido presentado o la proteína presentada y genera extremos cohesivos asimétricos singulares, en los cuales cada extremo cohesivo es un extremo monocatenario de 2 pb formado por las dos bases designadas Z, y

(ii): la segunda enzima de restricción escinde los vectores de presentación y el vector de cósmido y genera al escindirse extremos cohesivos asimétricos singulares que difieren de los resultantes del corte con la primera enzima de restricción (corte B),

(d): el vector de presentación y el vector de cósmido son escindidos con la segunda enzima de restricción,

(g): opcionalmente, se hace selección para un gen presente en los vectores de presentación ligados,

(i): los vectores de presentación empaquetados se someten a pasadas en un huésped Escherichia coli reciente y se forman genotecas de presentación de fago o presentación de fagémido y, opcionalmente,

(j): los vectores de presentación sometidos a pasadas

se forman genotecas de presentación de fago o presentación de fagémido.

25. Método de acuerdo con la reivindicación 24, caracterizado porque en los pasos (a) a (b), se selecciona BglI, DraIII, BsgI o BpmI como enzima de restricción de tipo IIs.

26. Método de acuerdo con la reivindicación 24 ó 25, caracterizado porque para los cortes (B) y (A) se selecciona la misma restricción y/o enzima de restricción.

27. Método de acuerdo con la reivindicación 24 ó 26, caracterizado porque como enzima de corte (B) y como enzima de corte (A) se utilizan enzimas diferentes, preferiblemente BpmI o BmpI como enzima de restricción de tipo IIs para el corte (B) y DraIII como enzima para el corte (A) (corte del origen de replicación fd o M13).

28. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 24 a 27, caracterizado porque en el paso (h) y facultativamente en el paso (j) se utiliza M13K07 como fago adyuvante de tipo M13.

29. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 24 a 28, caracterizado porque el fagémido y el cósmido son idénticos y la presencia y escisión con la enzima de corte (A) es opcional y/o la enzima de corte (B) y la enzima de corte (A) son idénticas.

30. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 24 a 29, caracterizado porque en el paso (i) la multiplicidad de infección (MOI) es menor que o igual a 1.

31. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 24 a 30, en el cual el cósmido comprende un origen del bacteriófago fd o M13 (replicación/empaquetamiento).

32. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 24 a 31, en el cual en el paso (e) de acuerdo con la reivindicación 24, se utiliza una relación molar de vectores de presentación al vector de cósmido comprendida dentro del intervalo de 3:1 a 15:1, y preferiblemente 3:1 a 10:1.

33. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 24 a 32, en el cual en el paso (e) de acuerdo con la reivindicación 24 se utiliza una concentración de vectores (que comprende vectores de presentación y vectores de cósmido) mayor que 100 \mug DNA/ml.

34. Un método para la producción de grandes

-: genotecas de extensión de presentación de fago o

-: genotecas de extensión de presentación de fagémido, en el cual una casete de oligonucleótidos de d bases de longitud se inserta en un sitio de restricción (corte (B)) por la vía de los extremos cohesivos ZZ como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21 para producir una secuencia o un gen que comprende una secuencia de DNA bicatenario que se representa por la fórmula siguiente de una de sus cadenas:

5'B_{1}..B_{n}X_{n+1}..X_{n+a}Z_{n+a+1}Z_{n+a+2}X_{n+a+3}..X_{n+a+d}Z_{n+a+d+1}Z_{n+a+d+2}X_{n+a+d+3}..X_{n+a+d+b}Q_{n+a+d+b+1}..Q_{n+a+d+b+j}3'

(a-b): se seleccionan un DNA bicatenario preparado a partir de células de Escherichia coli que contienen una población de vectores de presentación, constituida por fagos M13 o fagos semejantes a M13 o constituida por fagémidos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores; un vector de cósmido; una enzima de restricción de tipo IIs para el corte (B); y una enzima de restricción para el corte (A), en los cuales

(i): la enzima de corte (B) de tipo IIs escinde los vectores de presentación en la región codificante del péptido presentado o la proteína presentada y genera extremos cohesivos asimétricos singulares; en los cuales cada extremo cohesivo es un extremo monocatenario de 2 pb formado por las dos bases designadas Z,

(i): los vectores de presentación empaquetados se someten a pasadas en un huésped Escherichia coli reciente y se forman genotecas de presentación de fago o presentación de fagémido, y, opcionalmente,

(j): los vectores de presentación sometidos a pasadas

35. Un método para la reasociación de las extensiones 5' y/o 3' en la producción de grandes

-: genotecas recombinantes de extensión de presentación de fago o

-: genotecas recombinantes de extensión de presentación de fagémido,

que comprende la secuencia definida en la reivindicación 34, en la cual tiene lugar recombinación en uno u otro, o consecutivamente en ambos sitios de escisión ZZ que horquillan la o las casetes insertadas, en el cual

(a): a (b) se seleccionan un DNA bicatenario preparado a partir de células de Escherichia coli que contienen una población de vectores de presentación, constituida por fagos M13 o fagos semejantes a M13 o constituida por fagémidos como vectores de presentación de acuerdo con la reivindicación 34; un vector de cósmido; una enzima de restricción de tipo IIs para el corte (B); y enzima de restricción para el corte (A), en los cuales

(i): la enzima de corte (B) escinde los vectores de presentación en la región codificante del péptido presentado o la proteína presentada y genera extremos cohesivos asimétricos singulares selectivamente en la unión 5' de extensión y la casete (escisión por la enzima de restricción que reconoce el sitio de fijación B_{1}...B_{n} en las reivindicaciones 1,2 y 34), o

: en la unión 3' de extensión y la casete (escisión por la enzima de restricción que reconoce el sitio de fijación Q_{n+a+b+1}...Q_{n+a+b+j} en la reivindicación 1,2 o Q_{n+a+d+b+1}...Q_{n+a+d+b+j} en la reivindicación 34), en las cuales cada extremo cohesivo es un extremo monocatenario de 2 pb formado por las dos bases designadas Z,

(j): los vectores de presentación sometidos a pasadas

se forman genotecas de presentación de fago o presentación de fagémido.

36. Método de acuerdo con la reivindicación 34 ó 35, caracterizado porque en los pasos (a) a (b), se selecciona BglI, DraIII, BsgI o BpmI como enzima de restricción de tipo IIs.

37. Método de acuerdo con la reivindicación 34 ó 35, caracterizado porque para los cortes (B) y (A) se selecciona la misma restricción y/o la misma enzima de restricción.

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38. Método de acuerdo con la reivindicación 34 ó 35, caracterizado porque como enzima de corte (B) y como enzima del corte (A) se utilizan diferentes enzimas, preferiblemente BsgI o BpmI como enzima del corte (B) y DraIII como enzima del corte (A) (el origen de replicación de fd o M13 está cortado).

39. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 24 a 38, caracterizado porque en el paso (h) y facultativamente el paso (j) se utiliza M13K07 como el fago adyuvante de tipo M13.

40. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 34 a 39, caracterizado porque en el paso (g) se hace selección respecto a la presencia de un gen de resistencia a los antibióticos.

41. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 34 a 40, caracterizado porque en el paso (i) la multiplicidad de infección (MOI) es menor que o igual a 1.

42. Método de acuerdo con las reivindicaciones 34 a 41, en el cual el cósmido comprende un origen del bacteriófago fd o M13.

43. Método de acuerdo con las reivindicaciones 34 a 42, en el cual en el paso (e) de acuerdo con la reivindicación 34 ó 35 se utiliza una relación molar de vectores de presentación al vector de cósmido dentro del intervalo de 3:1 a 15:1, y preferiblemente 3:1 a 10:1.

44. Método de acuerdo con la reivindicaciones 34 a 43, en el cual en el paso (e) de acuerdo con la reivindicación 34 ó 35 se utiliza una concentración de vectores (que comprende vectores de presentación y vectores de cósmido) mayor que 100 \mug DNA/ml.

45. Método para la producción de novo de grandes

-: genotecas de presentación de fago o

-: genotecas de presentación de fagémido,

que comprenden secuencias de DNA de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 21, y que pueden someterse a recombinación de acuerdo con un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 24 a 44, en el cual la recombinación tiene lugar dentro de una secuencia de DNA de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, especialmente la reivindicación 24 ó 34, en el cual

a): un vector de presentación, constituido por un fago M13 o fago semejante a M13 o constituido por un vector de presentación de fagémido que comprende un origen de replicación de bacteriófago, facultativamente un gen para un marcador seleccionable, preferiblemente para un sitio de resistencia a los antibióticos, un sitio cos del bacteriófago lambda y una secuencia de "relleno" (Figura 5, superior derecha), que contiene dos sitios de fijación para una enzima de restricción de tipo IIs diferente de cualquiera de las enzimas de acuerdo con los cortes anteriores, en el cual dichos dos sitios están orientados en orientación divergente y donde los extremos cohesivos generados en la escisión son asimétricos y difieren uno de otro en los dos sitios, y

b): un fragmento generado por PCR que comprende parte de una de las secuencias de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 34, que incluye una (o las) secuencias hipervariables, preferiblemente X_{n+1}...X_{n+a}Z_{n+a+1}-Z_{n+a+2}X_{n+a+3}...X_{n+a+b} de acuerdo con la reivindicación 1, horquilladas por los mismos sitios de fijación de enzimas de restricción de tipo IIs definidos en (a), pero en este caso orientadas ambas hacia dentro con respecto a la secuencia hipervariable (Figura 5, lado izquierdo) y donde, como resultado de la escisión por esta enzima de restricción, se generan dos extremos monocatenarios asimétricos diferentes uno de otro, donde el primer extremo (a en Fig. 5) es complementario a uno de los extremos (a en Fig. 5) generados en el fragmento vector grande en (a) y el segundo extremo (b en Fig. 5) es complementario al otro extremo (b en Fig. 5) generado en el fragmento vector grande en (a),

c): los dos sistemas de la reacción de escisión (a) y (b) que contienen todavía la enzima de restricción activa de tipo IIs se mezclan entre sí en proporciones aproximadamente equimolares y se someten a ligación en presencia de DNA-ligasa; los fragmentos que contienen los sitios de fijación de las enzimas de restricción se eliminan constantemente (fragmento de "relleno" y extremo exterior del producto PCR) mientras que

-: los otros dos componentes, a saber el fragmento vector grande y la secuencia de inserción (fragmento central procedente de la región PCR) son impulsados para formar

e): opcionalmente, se hace selección para un gen presente en los vectores de presentación ligados,

g): los vectores de presentación empaquetados se someten a pasadas en un huésped Escherichia coli reciente y se forman genotecas de presentación de fago presentación de fagémido y, en caso deseado

h): los vectores de presentación sometidos a pasadas

se forman genotecas de presentación de fago o presentación de fagémido.

46. Método de acuerdo con la reivindicación 45, caracterizado porque en los pasos (a) a (b), se selecciona BpiI, BsgI o BpmI como enzima de restricción de tipo IIs.

47. Método de acuerdo con la reivindicaciones 45 ó 46, caracterizado porque en el paso (f) y facultativamente en el paso (h) se utiliza M13K07 como el fago adyuvante de tipo M13.

48. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 45 a 47, caracterizado porque en el paso (e) se hace selección respecto a la presencia de un gen de resistencia a los antibióticos.

49. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 45 a 48, caracterizado porque en el paso (g) la multiplicidad de infección (MOI) es menor que o igual a 1.

50. Genotecas de presentación de fago o genotecas de presentación de fagémido, caracterizadas por genes de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23 y que comprenden un exceso de 10^{6} clones variantes, con preferencia 10^{8} a 10^{11} clones variantes.

51. Una genoteca de presentación de fago o una genoteca de presentación de fagémido de acuerdo con la reivindicación 50, en la forma de partículas empaquetadas.

52. Genotecas de presentación de fago o genotecas de fagémido, de acuerdo con la reivindicación 50 en la forma de vectores presentados constituidos por poblaciones de Escherichia coli.

53. Uso de un banco de genes como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21 para la producción de genotecas de presentación de fago o genotecas de presentación de fagémido.