ES2343648T3

ES2343648T3 - Metodo de mutagenesis.

Info

Publication number: ES2343648T3
Application number: ES06701755T
Authority: ES
Inventors: Ralph Raymond MedImmune Limited MINTER; Steven Godfrey MedImmune Limited LANE; Robert George Edward MedImmune Limited HOLGATE; Maria Anastasia Theresa MedImmune Limited GROVES
Original assignee: MedImmune Ltd
Current assignee: MedImmune Ltd
Priority date: 2005-01-10
Filing date: 2006-01-09
Publication date: 2010-08-05
Anticipated expiration: 2026-01-09
Also published as: PL1844144T3; AU2006204396A1; JP5789073B2; EP1844144B1; JP2008526223A; ATE464382T1; GB0600331D0; GB2421950B; WO2006072801A1; DK1844144T3; AU2006204396B2; CA2593417A1; JP2015171369A; CA2593417C; SI1844144T1; EP1844144A1; PT1844144E; DE602006013596D1; GB2421950A

Abstract

Un método para introducir una o más mutaciones en una molécula de ácido nucleico, que comprende las siguientes etapas: (a) sintetizar un cebador mutagénico a partir de una molécula plantilla de ácido nucleico, en donde dicho cebador mutagénico contiene una o más mutaciones respecto a una molécula de partida; (b) aislar una forma de cadena sencilla de dicho cebador mutagénico; (c) madurar dicho cebador mutagénico de cadena sencilla a una forma de cadena sencilla de dicha molécula de partida; y (d) sintetizar una cadena complementaria a partir de dicho cebador mutagénico para producir una molécula de ácido nucleico de forma circular que contenga dichas mutaciones.

Description

Método de mutagénesis.

La presente invención se refiere a un método para producir moléculas de ácido nucleico mutagenizadas. En particular, la presente invención se refiere a un método en el que el propio cebador usado en la reacción de mutagénesis (el cebador mutagénico) se sintetiza a partir de una molécula plantilla de ácido nucleico. El resultado de la reacción de mutagénesis es una molécula de ácido nucleico circular mutagenizada que puede ser transformada, por ejemplo, en bacterias sin necesidad de modificaciones adicionales. En las realizaciones preferidas, el método se aplica a poblaciones de moléculas, por ejemplo en la creación o en el escrutinio de poblaciones de moléculas. El método también puede usarse de un modo combinatorio, en el que se usan múltiples cebadores mutagénicos para mutar múltiples moléculas de partida.

Una de las etapas implicadas en las técnicas biológicas moleculares es la introducción de ácido nucleico en un vector. Por ejemplo, se puede digerir e introducir un fragmento de ADN o una población de fragmentos de ADN mediante incorporación a un vector. Por ejemplo, se puede digerir un fragmento de ADN (o población de fragmentos) y eliminarlo de un primer vector (por ejemplo, un plásmido) en un segundo vector en un proceso conocido como subclonación. De este modo, se digiere un primer vector con las mismas enzimas de restricción que el segundo vector de tal modo que se producen extremos sobresalientes complementarios para la ligación. El fragmento de ADN y el segundo vector son ligados entonces en virtud a sus extremos sobresalientes complementarios y el resultado es un vector completado, que contiene el fragmento de ADN, que puede ser replicado en una célula hospedante (por ejemplo, en bacterias).

Por lo tanto, se pueden producir grandes cantidades de ADN para su uso en diversas aplicaciones de biología molecular. O el vector en el que se ha introducido el ADN puede tener un propósito particular (por ejemplo, puede ser un vector de sobreexpresión). Una vez introducido en un vector de expresión de ese tipo, la proteína codificada por el fragmento de restricción puede ser expresada a partir del vector en una célula hospedante. Una vez expresada, la proteína resultante podría ser purificada para su uso final. O, particularmente cuando el método se use para incorporar una población de fragmentos de ADN en un vector de expresión, la proteína expresada puede usarse en un escrutinio (por ejemplo, mediante afinidad de unión a una diana molecular).

También se conocen varios métodos para introducir mutaciones en ADN. El trabajo de Barik (Barik, Methods in Molecular Biology Volumen 192: PCR Cloning Protocols, 2ª edición, páginas 189-196, Editores B-Y Chen y H. W Janes, Humana Press Inc, Totowa, NJ; Burke y Barik, Methods In Molecular Biology Volumen 226: PCR Protocols, 2ª edición, páginas 525-531, Editores JMS Bartless y D Stirling, Humana Press Inc, Totowa, NJ) muestra cómo usar una estrategia basada en PCR para introducir mutaciones en ADN lineal. Según dicho método, se han usado los denominados megaprímeros para introducir mutaciones en una plantilla lineal en una reacción de PCR. Sin embargo, dichos métodos dan como resultado un producto de ADN de doble cadena lineal que debe ser subclonado a su vez en un vector apropiado a fin de producir una forma replicante para, por ejemplo, el aumento de escala o para la expresión de proteínas.

Miyazaki propuso un método que implica PCR de un plásmido entero (Miyazaki, Methods In Molecular Biology: Directed Evolution Library Creation: Methods and Protocols. Editores Amold y Georglou, Humana Press Inc. Totowa, NJ; Biotechniques 33: 1033-1038). En este método se usa un plásmido de cadena doble como plantilla en una reacción PCR, al que se añade para cebado un producto de PCR de cadena doble que contiene la mutación que se va a introducir. Sin embargo, la propiedad de cadena doble del cebador y la plantilla pueden provocar una auto-maduración de las cadenas de cebador y las cadenas de plantilla en lugar de una maduración cruzada, y por lo tanto se usa una relación específica de cebador a plantilla para minimizar la auto-maduración. Wang y Malcolm (1999) también describen un método de mutagénesis basado en PCR de plásmidos (Wang y Malcolm, Biotechniques, volumen 26, nº 4, 1999, páginas 680-684).

Además de los problemas de auto-maduración que se producen con una plantilla de cadena doble, existen otros problemas cuando se usa una plantilla de cadena doble en una reacción PCR. En una reacción exponencial, la capacidad para introducir errores es elevada, ya que el error introducido en una ronda se traslada a cada ronda posterior en base exponencial. Además, cuando dicha plantilla de PCR es una plantilla grande, tal como un vector, por ejemplo un plásmido, esto aumenta aún más la probabilidad de introducir errores.

También se conoce el uso de oligonucleótidos sintéticos para mutar ADN (Kunkel y col., (1985) PNAS USA, volumen 82, páginas 488-492; Sidhu y col., Phage Display for the Selection of Novel Binding Peptides). La patente EP 1108783 también se refiere a un método de mutagénesis que usa oligonucleótidos sintéticos. Sin embargo, existen limitaciones en la longitud de los oligonucleótidos que pueden sintetizarse químicamente. Adicionalmente, para programar el sintetizador, se debe conocer la secuencia y debe introducirse por adelantado en el sintetizador para su producción.

Por tanto, existe una necesidad de métodos alternativos de mutagénesis. En particular, de métodos que produzcan un resultado que pueda ser transformado directamente en bacterias, fácil de usarse en etapas posteriores, tal como en escrutinios de expresión (evitando la necesidad de etapas adicionales de digestión y ligación para introducir ácido nucleico en un vector apropiado). También existe la necesidad de métodos de mutagénesis rápidos y eficaces, y de métodos que sean fácilmente escalables, por ejemplo, para uso en la producción de poblaciones para escrutinio o producción de bibliotecas.

La presente invención, en un aspecto, se refiere a un método para introducir una o más mutaciones en una molécula de ácido nucleico, que comprende: madurar una forma de cadena sencilla de un cebador mutagénico con una molécula de partida, habiendo sido sintetizado dicho cebador mutagénico a partir de una molécula de ácido nucleico plantilla y que contiene una o más mutaciones respecto a dicha molécula de partida; y sintetizar una cadena complementaria a partir de dicho cebador mutagénico de tal modo que se produzca una molécula de ácido nucleico de forma circular que contenga dichas mutaciones.

En un aspecto, la presente invención proporciona un método para introducir una o más mutaciones en una molécula de ácido nucleico, que comprende las siguientes etapas:

(a): sintetizar un cebador mutagénico a partir de una molécula de ácido nucleico plantilla, en donde dicho cebador mutagénico contiene una o más mutaciones respecto a una molécula de partida;

(b): aislar una forma de cadena sencilla de dicho cebador mutagénico;

(c): madurar dicho cebador mutagénico de cadena sencilla con una forma de cadena sencilla de dicha molécula de partida; y

(d): sintetizar una cadena complementaria a partir de dicho cebador mutagénico de tal modo que se produzca una molécula de ácido nucleico de forma circular que contenga dichas mutaciones.

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Por tanto, el cebador mutagénico es sintetizado a partir de una molécula de ácido nucleico plantilla usando una enzima adecuada, usando métodos conocidos en la técnica. Es preferible que dicho cebador mutagénico sea sintetizado usando un método basado en reacción en cadena de polimerasa (PCR).

La molécula plantilla y la molécula de partida pueden ser la misma, o pueden contener la misma secuencia, que forma la base de la síntesis del cebador mutagénico. Por tanto, en algunas realizaciones, la secuencia de la plantilla para la síntesis de cebador mutagénico es la misma que la encontrada en la molécula de partida. En estas realizaciones, las mutaciones pueden introducirse en virtud a la introducción de errores durante la síntesis del cebador mutagénico de la molécula de partida, por ejemplo, mediante una polimerasa propensa al error. Por tanto, en algunas realizaciones, el cebador mutagénico se sintetiza mediante un método de síntesis en el que se introducen errores cuando se sintetiza una segunda cadena a partir de una primera cadena, preferiblemente mediante PCR propensa al error (los especialistas en la técnica conocen métodos adecuados, por ejemplo Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2ª edición, Sambrook y col., 1989, Cold Spring Harbour Laboratory Press). En la técnica se dispone de varios kits para llevar a cabo PCR propensa a error, tal como Diversify (BDBiosciences 63070). En otra estrategia, la molécula plantilla puede ser transformada en una cepa de E. coli (en la técnica se dispone de cepas adecuadas, por ejemplo XL1-RED (Stratagene)), que introduce errores en la secuencia de ADN. El especialista en la técnica conocerá otros métodos para introducir errores en el cebador mutagénico cuando se produce a partir de la plantilla.

La plantilla y la molécula de partida pueden ser moléculas diferentes, es decir, pueden contener regiones en las que existe una diferencia en la secuencia entre la molécula de partida y la molécula plantilla, respectivamente. Por tanto, cuando se sintetiza el cebador mutagénico a partir de la plantilla contiene mutaciones en comparación con la molécula de partida (en esta situación no es necesaria una reacción que introduzca errores, por ejemplo una PCR propensa a error).

El especialista en la técnica conoce reactivos y condiciones de reacción adecuados para la síntesis del cebador mutagénico a partir de la plantilla (véase, por ejemplo, Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2ª edición, Sambrook y col., 1989, Cold Spring Harbour Laboratory Press). Cuando se sintetiza el cebador mutagénico usando la reacción en cadena de polimerasa, el especialista en la técnica selecciona los cebadores adecuados, teniendo en cuenta la plantilla que se está usando. Los cebadores usados para producir el cebador mutagénico se denominan en la presente memoria cebadores iniciales. Dichos cebadores iniciales comprenden un cebador directo y uno inverso, que generalmente se basan en los extremos de la secuencia que se va a amplificar, es decir, en los extremos de la secuencia que va a ser el cebador mutagénico. Los cebadores iniciales generalmente son oligonucleótidos sintéticos, producidos mediante métodos estándares usando un sintetizador de oligonucleótidos. Dichos cebadores iniciales pueden tener cualquier longitud adecuada, por ejemplo una longitud de alrededor de 15 a 100 nucleótidos, por ejemplo alrededor de 15 a 75 nucleótidos de longitud, alrededor de 15 a 50 nucleótidos de longitud, generalmente de 18 a 25 nucleótidos de longitud. El especialista puede elegir o diseñar cebadores iniciales adecuados en función de, por ejemplo, la secuencia de molécula plantilla, el tamaño del cebador mutagénico resultante y/o la aplicación del método.

Una ventaja adicional de la presente invención surge del hecho de que el cebador mutagénico se sintetiza a partir de una molécula plantilla de ácido nucleico, de tal modo que la secuencia del cebador mutagénico puede ser desconocida para el usuario. Por ejemplo, cuando el cebador mutagénico se produce mediante PCR usando los cebadores iniciales dirigidos a una parte conocida de la plantilla, la región amplificada por dichos cebadores puede ser desconocida. Por tanto, en determinadas realizaciones, la secuencia del cebador mutagénico es desconocida antes de dicha maduración. Esto es particularmente aplicable cuando el método de la invención se aplica a bibliotecas (discutido más adelante), aunque no se limita a ello. Existen otras muchas aplicaciones en las que una secuencia particular en la sub-clonación es desconocida pero las fronteras del vector en el que están contenidas son conocidas (un ejemplo sería la clonación al azar o "shotgun"). La persona especialista puede seleccionar cebadores iniciales adecuados en base a su conocimiento de la molécula de partida.

La molécula definida en la etapa (b) es por tanto un cebador mutagénico de cadena sencilla que ha sido aislado de su cadena complementaria. Los términos separados y aislados se usan intercambiablemente con respecto al cebador mutagénico. Se prefiere que esta separación o aislamiento del cebador mutagénico de cadena sencilla de su cadena complementaria se lleve a cabo usando un medio separativo (tal como perlas o una columna separativa), tal como se describe más adelante. De este modo se puede introducir un resto de unión en una de las cadenas del cebador mutagénico cuando se sintetiza, permitiendo así que una de las cadenas del cebador mutagénico sea aislada de la otra, por ejemplo, en una etapa de captura tal como se describe más adelante.

Se prefiere que el cebador de cadena sencilla definido en la etapa (b) se separe mediante el uso de un medio separativo. Por ejemplo, la etapa de sintetizar el cebador mutagénico puede introducir un resto de unión en la cadena positiva o en la cadena negativa del cebador mutagénico y la separación del cebador mutagénico en sus cadenas positiva y negativa puede llevarse a cabo entonces a través de la unión de dicho resto de unión con su pareja de unión en un medio separativo. El medio separativo puede ser cualquier medio de fase sólida, tal como perlas o una columna (por ejemplo, perlas o columna a las que está unida la pareja de unión).

Más particularmente, el resto de unión puede ser introducido en la cadena positiva del cebador mutagénico (por ejemplo, usando un cebador directo inicial en la reacción de mutagénesis que incorpora un resto de unión) y la cadena negativa del cebador mutagénico puede ser eluída a continuación después de que la forma de cadena positiva se una al medio separativo. Se prefiere que el resto de unión sea biotina y que dicha pareja de unión sea estreptavidina. Los especialistas en la técnica conocen otros restos de unión y parejas de unión adecuados e incluyen fluorosceína y digoxina, y anticuerpos (incluyendo fragmentos y derivados) y antígenos.

El especialista es consciente de que existen otros restos y parejas de unión que se podrían usar. Por ejemplo, además de estreptavidina se dispone de otras parejas de unión que se unen a biotina tales como avidina y neutravidina. La persona especialista puede seleccionar restos y parejas de unión adecuados para su uso en la etapa de captura implicada en la separación de cadena. Además se pueden usar análogos de biotina y/o estreptavidina (véase, por ejemplo, J Mol Biol (1994) Sep 30: 242 (4): 559-65). Biotina y estreptavidina son lo más preferible.

Por ejemplo, un resto antigénico particular podría incorporarse a una de las cadenas del cebador mutagénico durante su síntesis, de un modo similar al descrito para el ejemplo de biotina mencionado anteriormente. A continuación se podría separar una cadena de la otra usando una columna que contiene anticuerpos del antígeno.

Otra estrategia es usar un sistema separativo que contiene proteínas que se unen a secuencias específicas de ADN. Por ejemplo, en la técnica se sabe que la metilasa HaeIII se une a una secuencia de ADN 5' específica, otro ejemplo de proteína que se une a una secuencia de ADN específica es la P2A. Para una discusión de dicha estrategia véase Bertschinger y Neri "Protein, Engineering, Design and Selection" (2004), Volumen 17, página 699.

La pareja de unión y el resto de unión deberían tener una afinidad suficiente para soportar el tratamiento usado para la separación de las cadenas de ADN. Para la separación de cadenas se puede usar un pH alto o bajo. Cuando se usa un pH bajo preferiblemente es \leq a pH 3, más preferiblemente \leq a pH 2, incluso más preferiblemente \leq a pH 1. Los ácidos preferidos son ácido clorhídrico y ácido cítrico. Es más preferible un pH alto. Cuando se usa un pH alto preferiblemente es \geq a pH 13. Los agentes alcalinos preferidos incluyen hidróxido sódico y otros hidróxidos de Grupo I tales como LiOH ó KOH. También podrían usarse hidróxidos de Grupo II, excepto Be(OH)_{2} y Ba(OH)_{2}. Es más preferible que las cadenas se separen usando hidróxido sódico (por ejemplo, NaOH 0,1 N, que tiene un pH de 13). La persona especialista en la técnica puede seleccionar los agentes y condiciones apropiados. Lo más preferido es el uso de biotina y estreptavidina y/o sus análogos y un tratamiento de separación de cadenas a pH alto como el definido antes.

También se podrían usar grupos químicos para ligar químicamente una de las cadenas a un soporte. Por ejemplo, es posible sintetizar oligonucleótidos de tal modo que incorporen un grupo químico particular tal como un grupo amino o tiol. De hecho, dichos oligonucleótidos pueden adquirirse de suministradores. Cuando se usan oligonucleótidos como uno de los cebadores iniciales en la reacción de la invención, el grupo químico relevante se incorporará en la cadena relevante del cebador mutagénico resultante. La separación de las cadenas puede completarse entonces acoplando estos agentes químicos (que ya están incorporados en la cadena de ADN) a agentes de ligación de aminas o a agentes de ligación de tiol, a modo de ejemplo, y la persona especialista dispone de agentes adecuados en la técnica.

Después de generar la forma de cadena sencilla del cebador mutagénico tal como se ha descrito, a continuación se introduce en la molécula de partida para llevar a cabo la etapa de maduración (c). De este modo se añade entonces la forma de cadena sencilla del cebador mutagénico a la molécula de partida para su uso en la reacción de maduración.

En la etapa (c), la maduración del cebador mutagénico con la molécula de partida puede usar cualesquier condiciones y reactivos adecuados, dependiendo de, por ejemplo, el tamaño del cebador mutagénico. La persona especialista en la técnica conoce la selección de condiciones apropiadas. A modo de ejemplo, se puede usar una relación molar de cebador mutagénico a plantilla de 3:1. Las condiciones de reacción adecuadas son la incubación a 90ºC durante 2 minutos, 50ºC durante 3 minutos y 20ºC durante 5 minutos. Las condiciones pueden variarse si la persona especialista en la técnica lo considera necesario.

La molécula de ácido nucleico de forma circular resultante de la etapa (d) también es referida en la presente memoria como "producto de la reacción de mutagénesis" (o, abreviando, como "producto"). Preferiblemente, el producto de la reacción es replicativo, lo que significa que mediante transformación en una célula hospedante puede replicarse para producir copias de sí mismo. Esto presenta la ventaja de que el producto de la reacción de mutagénesis puede transformarse directamente en una célula hospedante (tal como una célula hospedante para el propósito de la expresión de proteína a partir de ácido nucleico) sin la necesidad de manipulaciones adicionales, por ejemplo, sin la necesidad de escindir la porción relevante del ácido nucleico con enzimas de restricción y ligarla en un plásmido adicional.

Alternativamente, o adicionalmente, es preferible que el producto de la reacción de mutagénesis sea de cadena doble para permitir la digestión con enzimas de restricción.

Es más preferible que la molécula de forma circular (producto de la reacción de mutagénesis) sea ADN circular cerrado covalentemente, preferiblemente de cadena doble.

Como se ha indicado, la etapa (d) produce un producto de reacción circular a partir de la molécula de partida. Dicha reacción implica la imprimación de síntesis de cadena complementaria a partir del cebador mutagénico madurado, de tal modo que la cadena complementaria resultante contenga las mutaciones del cebador mutagénico. En general, la mezcla de reacción contendrá cantidades adecuadas de las bases de nucleótidos, polimerasa de ADN, ligasa de ADN y un tampón apropiado (los ejemplos proporcionan cantidades adecuadas). Esto se incuba en las condiciones apropiadas para que la síntesis de la segunda cadena se complete. Dichos métodos son conocidos por la persona especialista en la técnica. Es preferible que esta reacción sea de tipo no-amplificación (por ejemplo, una reacción de tipo no-PCR) de tal modo que no implique ciclos sucesivos de amplificación y pueda por tanto describirse como una reacción lineal (es decir, se produce una cadena complementaria por cadena sencilla de molécula de partida). Por ejemplo, en el método de la invención, la reacción de mutagénesis de la molécula de partida de cadena sencilla produce una segunda cadena sencilla que es opuesta en sentido a la cadena sencilla de la molécula de partida. Por tanto, cuando la molécula de partida de cadena sencilla es una cadena positiva, la segunda cadena sintetizada en la reacción de mutagénesis será una cadena negativa.

Usando una plantilla de cadena sencilla y un cebador de cadena sencilla en la reacción de mutagénesis se evitan los problemas asociados a la auto-maduración. Además, el producto de la reacción de mutagénesis es de cadena doble y como tal transforma bacterias de forma más eficaz que una molécula de cadena sencilla. Por lo tanto, cuando se transforma en un hospedante bacteriano, la forma de doble cadena mutada transformará bacterias en preferencia con respecto a la plantilla de cadena sencilla (efectivamente una selección de la forma mutada sobre la plantilla no
mutada).

El método de la invención comprende las etapas enumeradas anteriormente (en la presente memoria el término "comprende" se usa en el sentido de incluir, es decir, permitir la presencia de una o más características, por ejemplo, etapas de reacción). Por tanto, el método de la invención puede incluir etapas adicionales, que incluyen, aunque sin limitación, aquellas etapas mencionadas en cualquier parte de la presente memoria. El método de la invención puede consistir alternativamente en las etapas enumeradas anteriormente, o mencionadas en la presente memoria. Las etapas de reacción pueden combinarse en recipientes de reacción sencillos, y no es necesario que cada etapa se lleve a cabo en un recipiente separado. Por ejemplo, la etapa de maduración del cebador mutagénico con la molécula de partida y la etapa de síntesis de una cadena complementaria pueden llevarse a cabo en un recipiente.

Preferiblemente, la molécula de partida de cadena sencilla es ADN circular de cadena sencilla. Por ejemplo, la molécula de partida de cadena sencilla pueden ser ADN circular de cadena sencilla que es extraído de partículas fago.

Preferiblemente en el método de la invención, antes de dicha etapa de maduración (c), existe la etapa separada de añadir la molécula de partida de cadena sencilla al cebador de cadena sencilla. Más preferiblemente, el método comprende además la etapa de aislar dicha molécula de partida de cadena sencilla antes de la etapa (c).

El orden de las etapas relacionadas con el cebador mutagénico y la molécula de partida, respectivamente, no es necesariamente consecutivo. Así, la forma de cadena sencilla del cebador mutagénico puede ser separada antes de que se aísle la forma de cadena sencilla de la molécula de partida. O la forma de cadena sencilla de la molécula de partida puede aislarse antes de que la forma de cadena sencilla del cebador mutagénico sea separada. O la separación del cebador mutagénico de cadena sencilla y el aislamiento de la molécula de partida de cadena sencilla, respectivamente, pueden llevarse a cabo por separado, o simultáneamente.

Es preferible que el método de la invención comprenda además una etapa de exclusión por tamaño llevada a cabo con dicha molécula de partida de cadena sencilla antes de la etapa (c). Por ejemplo, la molécula de partida de cadena sencilla se hace pasar a través de una resina porosa, los fragmentos pequeños quedan atrapados en la resina mientras que la molécula de partida, de mayor tamaño, pasa a través. Esta etapa elimina los fragmentos lineales cortos de ADN (que se cree son productos de degradación que co-purifican la plantilla). La eliminación de estos fragmentos mejora la eficacia de la mutagénesis evitando episodios de imprimación a partir de fragmentos cortos que no conducen a mutagénesis.

La molécula de partida contendrá los elementos de secuencia necesarios para el uso posterior del producto del método. En la técnica se dispone de vectores adecuados para uso como molécula de partida, o pueden ser construidos por el especialista usando técnicas convencionales. Dichos vectores comprenden secuencias reguladoras apropiadas, que incluyen secuencias promotoras, secuencias de terminación, secuencias potenciadoras, genes marcadores, etc. Los vectores pueden ser cualquier tipo adecuado, por ejemplo, plásmido, fago, fagémido, etc. Por ejemplo, cuando el producto del método se va a usar en la expresión de proteínas (por ejemplo, para escrutar el producto expresado) la molécula de partida contendrá las secuencias necesarias para la expresión de proteína en una célula hospedante.

Los sistemas de expresión adecuados son bien conocidos en la técnica, y se puede usar una variedad de células hospedantes. Éstas incluyen células de bacterias, levaduras, insectos y mamíferos (por ejemplo células HeLa, CHO ó BHK). Se prefieren las células de bacterias, más preferiblemente de E. coli. En la técnica se dispone de los vectores adecuados para cada uno de estos hospedantes, o pueden construirse empleando métodos rutinarios. También se pueden usar sistemas de expresión víricos, tales como sistemas de baculovirus o sistemas de expresión víricos de vegetales. Las técnicas de manipulación de ADN son bien conocidas en la técnica (por ejemplo, clonación, secuenciamiento, expresión y análisis, etc.). Se pueden encontrar más detalles de métodos conocidos en, por ejemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, Sambrook y col., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press; ó Current Protocols in Molecular Biology, segunda edición, Ausubel y col., editores, John Wiley & Sons, 1992.

El método de la invención además comprende la etapa de transformar la molécula de ácido nucleico mutagenizada en células hospedantes. La transformación puede realizarse mediante cualquier método adecuado conocido por el especialista en la técnica. Los ejemplos incluyen el método de choque térmico. Es preferible que dicha transformación sea llevada a cabo usando electroporación. La etapa de transformar el producto mutagenizado puede llevarse a cabo directamente después de la etapa (d), o puede haber etapas intermedias entre la etapa (d) y la transformación en una célula hospedante. En una realización preferida discutida más adelante, la transformación en una célula hospedante se usa para seleccionar preferencialmente la cadena complementaria mutada sobre la molécula de partida no mutada.

El método de la invención puede comprender una etapa llevada a cabo en las condiciones en las que se seleccione preferentemente la cadena complementaria que contiene las mutaciones. Dicha selección preferencial de la cadena complementaria puede ser el resultado de la digestión preferencial de la molécula de partida, o de la supervivencia preferencial de la cadena complementaria en una célula hospedante.

La molécula de partida puede contener modificaciones de tal modo que se seleccione preferencialmente la cadena complementaria. El método de la invención puede comprender además la etapa de introducir dichas modificaciones. En las realizaciones preferidas, las modificaciones en la molécula de partida incluyen la introducción de dU en lugar de dT. Cuando el método comprende además la etapa de introducir dichas mutaciones, se entiende que esto incluye realizaciones en las que la molécula de partida contiene dichas modificaciones inicialmente y se introducen modificaciones adicionales en esta etapa, y realizaciones en las que no hay modificaciones inicialmente y cualquier modificación de este tipo se introduce durante esta etapa.

La situación en la que dU reemplaza a dT puede explicarse como se indica a continuación. La molécula de partida se cultiva en una cepa de E. coli que soporta la introducción de uracilo, por ejemplo, una cepa "duf ung" tal como CJ236 (Kunkel y col., (1985) PNAS USA, Vol. 82, páginas 488-492; Sidhu y col., Phage Display for the Selection of Novel Binding Peptides, Methods in Enzymology 2000, Volumen 238, página 333-363). Según estos protocolos, la molécula de partida es multiplicada en E. coli en forma de fagémido. Mediante métodos estándares se extrae ADN que contienen uracilo de cadena sencilla (por ejemplo, el Qiagen M13 Spin Prep Kit). Tras la maduración del cebador mutagénico con el ADN que contiene uracilo de cadena sencilla, se sintetiza la cadena complementaria (se usa dT en la reacción de síntesis en lugar de dU). Esto da como resultado una molécula de ADN heterodúplex, en la que una cadena (la cadena de partida) contiene dU y no contiene las mutaciones deseadas, y la segunda cadena (la cadena complementaria sintetizada en la etapa (d)) contiene dT y contiene las mutaciones. La molécula resultante se transforma a continuación en un hospedante E. coli que no soporta la presencia de uracilo, por ejemplo un hospedante dut^{+} ung^{+} tal como JM101. Por tanto, la cadena complementaria que contiene la mutación es replicada preferentemente respecto a la cadena de partida que no contiene las mutaciones (la cadena de partida que contienen dU es hidrolizada mediante uracilo-glicosilasa en el hospedante dut^{+} ung^{+}).

Otros métodos de selección incluyen el uso de metilación. La molécula de partida se metilará en casi todas las cepas de E. coli. En la etapa (d), se puede sintetizar una cadena complementaria in vitro que no esté metilada, dando como resultado un heterodúplex que comprende una cadena de partida metilada que no contiene las mutaciones, y una cadena complementaria no metilada que sí contiene las mutaciones. A continuación el heterodúplex es digerido con enzima de restricción Dpn1, que corta el ADN de cadena doble en la posición 5'-Gm^{6}ATC-3' y que es específica para ADN metilado y hemimetilado. De este modo, la cadena de partida es digerida y la cadena complementaria que contiene las mutaciones no. Se pueden usar enzimas alternativas a la Dpn1.

Como posibilidad adicional para el método de selección, se puede usar un gen condicionalmente letal. Un ejemplo es ccdB, también conocido como gen de "control de muerte celular". Este gen podría insertarse en la molécula de partida en la región que sería reemplazada después de la reacción de mutagénesis. La molécula de partida se prepararía a partir de una cepa de E. coli que no es susceptible a este gen. La reacción de mutagénesis reemplazaría entonces el gen ccdB con el gen de interés. Las moléculas de partida no mutadas, que todavía expresan ccdB harían que sus hospedantes E. coli murieran. De este modo, se seleccionan las moléculas mutadas resultantes de la reacción de mutagénesis.

Se pueden usar otros sistemas y enzimas selectivas adecuadas siempre que impliquen la ruptura selectiva de la cadena de partida del heterodúplex. Los ejemplos incluyen endonucleasas y endoglicosilasas.

Por tanto el método implica el uso de una molécula de partida de cadena sencilla que comprende la modificación de los nucleótidos (por ejemplo, dU reemplaza a dT). La síntesis de la cadena complementaria imprimada a partir del cebador mutagénico produce una cadena mutada nueva sintetizada que no incluye dichas modificaciones (por ejemplo, usando dTPP en lugar de dUTP en la reacción de síntesis). La cadena mutada no modificada, sintetizada desde cero, se selecciona preferentemente (por ejemplo, mediante transformación de la molécula de heterodúplex en una célula hospedante que soporta sólo la replicación de la cadena mutada no modificada sintetizada nueva, o digiriendo la cadena de partida con una enzima selectiva).

La invención proporciona además un método en el que dicha selección preferencial se lleva a cabo transformando dicha molécula de forma circular de la etapa (d) en una célula hospedante que es selectiva para la cadena complementaria no modificada (la cadena mutada no modificada recién sintetizada).

Por lo tanto, en una realización la invención proporciona un método para introducir una o más mutaciones en una molécula de ácido nucleico que comprende las siguientes etapas:

(a): sintetizar (preferiblemente mediante PCR) un cebador mutagénico a partir de una molécula plantilla de ácido nucleico en donde dicho cebador mutagénico contiene una o más mutaciones respecto a la molécula de partida;

(b): separar una forma de cadena sencilla de dicho cebador mutagénico;

(c): madurar dicho cebador mutagénico de cadena sencilla con una forma de cadena sencilla de dicha molécula de partida, en donde dicha molécula de partida contiene una o más modificaciones seleccionables;

(d): sintetizar una cadena complementaria de dicho cebador mutagénico de tal modo que se produzca una molécula de ácido nucleico de forma circular que no contenga dichas modificaciones;

(e): llevar a cabo una etapa de selección en la que se seleccione la cadena complementaria preferentemente respecto a la molécula de partida.

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El método de la invención puede aplicarse a poblaciones de moléculas. Por tanto, se puede mutar una población de moléculas usando el método anterior, o se puede insertar una población de secuencias en un vector apropiado para escrutinio (por ejemplo, escrutinio de expresión).

Por ejemplo, el método puede usarse para crear una biblioteca de moléculas. De este modo, se pueden usar múltiples cebadores mutagénicos para mutar un vector adecuado para producir una biblioteca de productos. También se puede usar mutagénesis combinatoria usando múltiples cebadores mutagénicos y múltiples moléculas de partida para producir una biblioteca con permutaciones extensivas. Por ejemplo, se pueden usar múltiples moléculas de partida con una variación en una primera posición en dicha molécula en la reacción de mutagénesis, junto con múltiples cebadores mutagénicos que introduzcan mutaciones en una segunda posición, generando de este modo una biblioteca extensa como resultado de la combinación o permutación de las variaciones en la primera y segunda posiciones. Esto queda ilustrado en el ejemplo 1 y se muestra esquemáticamente en la Figura 6.

El método también puede usarse para facilitar el escrutinio de una población de moléculas. Por ejemplo una población de cebadores mutagénicos puede derivar de una población de moléculas plantilla. Esta población puede ser introducida entonces en, por ejemplo, un vector común, tal como un vector de expresión para escrutinio. Esto se ilustra en el ejemplo 2.

De este modo, el método puede aplicarse a poblaciones de moléculas, por ejemplo en el escrutinio de una población de moléculas o en la sub-clonación de una población de moléculas para crear una biblioteca. Por tanto, puede haber una pluralidad de moléculas de cebador mutagénico, plantilla y/o de partida. Dichas poblaciones pueden tener un tamaño de al menos 1000 moléculas, más preferiblemente al menos 10^{4}, más preferiblemente al menos 10^{5}, más preferiblemente al menos 10^{6}, más preferiblemente al menos 10^{7}, más preferiblemente al menos 10^{8}, más preferiblemente al menos 10^{9}, más preferiblemente al menos 10^{10}, más preferiblemente al menos 10^{11}, más preferiblemente al menos 10^{12}, más preferiblemente al menos 10^{13}.

Las ventajas asociadas a la aplicación del método de la invención a poblaciones, especialmente bibliotecas, se basan en parte en el hecho de que las secuencias de cebadores mutagénicos no necesitan ser conocidas en el inicio del protocolo. El conocimiento de una región o regiones cortas comunes en las moléculas plantilla (por ejemplo, una secuencia conocida que linda con una región de variabilidad, o una secuencia conocida en un vector que contiene la molécula(s) plantilla) permite el diseño de los cebadores iniciales. Dichos cebadores iniciales pueden por tanto ser usados para amplificar una población entera de moléculas que tienen regiones variables así como las regiones comunes a las que están dirigidos los cebadores iniciales. Igualmente, una población de moléculas puede ser insertada en una molécula de partida común (por ejemplo un vector) para escrutinio, tal como escrutinio de expresión, siempre que exista una región de complementariedad entre el cebador mutagénico y la molécula de partida. Esta región de complementariedad puede ser la misma, o parcialmente la misma, que la región a la que estaban dirigidos los cebadores iniciales en la molécula de partida.

Por tanto, en el método de la invención, puede haber múltiples plantillas, o múltiples formas de la plantilla. Por ejemplo, la plantilla puede ser una biblioteca de diferentes moléculas contenidas dentro de un vector, por ejemplo, un plásmido. De este modo, entonces se pueden usar múltiples cebadores mutagénicos producidos a partir de dicha biblioteca para producir una serie de productos mutagenizados de forma circular, ya que cada uno de los múltiples cebadores mutagénicos introduce diferentes mutaciones en la molécula de partida cuando se sintetiza la cadena de complementariedad en la etapa (d). Cuando estos múltiples productos son transformados en un hospedante adecuado, por ejemplo, un hospedante bacteriano, tal como E. coli, cada colonia resultante contiene el producto resultante de uno de los múltiples cebadores mutagénicos.

Cuando se van a producir diferentes cebadores mutagénicos a partir de una biblioteca, por ejemplo, una biblioteca de plásmidos, entonces los cebadores iniciales usados para sintetizar el cebador mutagénico se eligen de tal modo que sean complementarios con una región del vector, que es común a la biblioteca. Así, las múltiples plantillas pueden comprender una región de variabilidad y una región que está en común entre las plantillas múltiples. Por ejemplo, la región de variabilidad puede ser una región aleatoria de ácido nucleico que está adyacente a regiones que no son aleatorias. En otro ejemplo, la región de variabilidad puede ser producida mediante múltiples injertos que han sido introducidos en múltiples moléculas del mismo vector base. Los cebadores iniciales son elegidos por tanto para ser complementarios a una región de la plantilla que se encuentra fuera de la región de variabilidad, por ejemplo, complementaria a toda o a parte de la región no aleatoria de la plantilla, o a parte del vector base. De este modo se pueden producir múltiples cebadores mutagénicos en una reacción de síntesis usando los mismos cebadores
iniciales.

Alternativa o adicionalmente, puede haber múltiples moléculas de partida. Así, en la etapa (c) el cebador mutagénico puede ser madurado con múltiples moléculas de partida diferentes. Cuando hay múltiples cebadores mutagénicos, como se ha descrito previamente, éstos también pueden ser madurados con múltiples moléculas de partida. Por tanto se puede producir un efecto combinatorio, en el que múltiples cebadores mutagénicos son madurados con múltiples moléculas de partida, produciéndose combinaciones de cebadores mutagénicos y moléculas de partida.

Por tanto, el método de la invención puede incluir múltiples moléculas de partida y/o múltiples moléculas de cebador mutagénico.

Esto tiene la ventaja de que se puede usar para grandes repertorios de moléculas de partida y/o plantillas, por ejemplo para combinar grandes repertorios de moléculas de partida y/o plantillas. Los tamaños de repertorio preferidos son al menos de 100 moléculas de partida y/o plantillas, más preferiblemente de al menos 1000, incluso más preferiblemente de al menos 2500.

Usando la estrategia combinatoria se pueden producir grandes repertorios, por ejemplo tras combinar las diversas moléculas de partida con los diversos cebadores mutagénicos puede darse al menos 1000 productos resultantes, más preferiblemente al menos 10^{4}, más preferiblemente al menos 10^{5}, más preferiblemente al menos 10^{6}, más preferiblemente al menos 10^{7}, más preferiblemente al menos 10^{8}, más preferiblemente al menos 10^{9}, más preferiblemente al menos 10^{10}, más preferiblemente al menos 10^{11}, más preferiblemente al menos 10^{12}, más preferiblemente al menos 10^{13}.

Las mutaciones que pueden introducirse empleando este método incluyen sustituciones, eliminaciones y adiciones. Las mutaciones pueden producirse en una pluralidad de nucleótidos (pero también pueden darse únicamente en un solo nucleótido). Por ejemplo, se puede hacer una pluralidad de mutaciones en la molécula de partida mediante el cebador mutagénico, o se puede eliminar, o añadir, una serie de nucleótidos. También son posibles las combinaciones de los diferentes tipos de mutaciones. Por tanto, puede haber una combinación de sustituciones y eliminaciones, una combinación de sustituciones y adiciones, una combinación de adiciones y eliminaciones, o una combinación de adiciones, eliminaciones y sustituciones.

También puede haber múltiples regiones de mutaciones, por ejemplo, dos regiones en las que uno o más nucleótidos son sustituidos, separados por una región en la que no se ha realizado ningún cambio por el cebador mutagénico (debido a que en esta región intersticial existe complementariedad entre el cebador mutagénico y la molécula de partida).

Otras posibilidades incluyen: múltiples regiones en las que se han sustituido uno o más nucleótidos, separadas por regiones de complementariedad; múltiples regiones en las que se han añadido uno o más nucleótidos, separadas por regiones de complementariedad; múltiples regiones en las que se han eliminado uno o más nucleótidos, separadas por regiones de complementariedad. También son posibles combinaciones. Por tanto, puede haber: una o más regiones en las que los nucleótidos son sustituidos y una o más regiones en las que los nucleótidos son añadidos, separadas por regiones de complementariedad; uno o más regiones en las que los nucleótidos son sustituidos y una o más regiones en las que los nucleótidos son eliminados, separadas por regiones de complementariedad; una o más regiones en las que los nucleótidos son eliminados y una o más regiones en la que los nucleótidos son añadidos, separadas por regiones de complementariedad; y una o más regiones en las que los nucleótidos son añadidos, una o más regiones en las que los nucleótidos son añadidos, y una o más regiones en las que los nucleótidos son eliminados, separadas por regiones de complementariedad.

La naturaleza y el número de las mutaciones se determina mediante el número y naturaleza de diferencias entre la molécula de partida y el cebador mutagénico. Así, cuando existe una adición de un nucleótido sencillo en el cebador mutagénico en comparación con la molécula de partida, entonces se añadirá un solo nucleótido en virtud de la reacción de mutagénesis. Cuando hay regiones dispersas de diferencias entre el cebador mutagénico y la molécula de partida (por ejemplo, regiones dispersas de adiciones, eliminaciones y sustituciones tal como se ha establecido anteriormente), esto dará como resultado regiones dispersas de mutaciones correspondientes como resultado de la reacción de mutagénesis. Los cebadores mutagénicos pueden reemplazar tiras de nucleótidos en la molécula de partida. Por ejemplo, el cebador mutagénico puede contener una región con un 70% de complementariedad con la molécula de partida y por tanto, tras la reacción de mutagénesis, esta región de la molécula de partida es reemplazada por la región del 70% de complementariedad del cebador mutagénico.

Con el objetivo de que el cebador mutagénico sea madurado, debe haber un grado de complementariedad entre el cebador mutagénico y la molécula de partida. Normalmente debería haber regiones mínimas de complementariedad en los extremos del cebador mutagénico. Cuando se ha producido el cebador mutagénico mediante PCR y los cebadores iniciales (definidos anteriormente) son complementarios a la molécula de partida, entonces éstos proporcionan una región mínima de complementariedad de 18 a 25 pares base en los extremos del cebador mutagénico.

El grado de complementariedad sobre el total del cebador mutagénico es preferiblemente de al menos el 60%, más preferiblemente de al menos el 70%, más preferiblemente de al menos el 80%, más preferiblemente de al menos el 90%, más preferiblemente de al menos el 95%, más preferiblemente de al menos el 97%, más preferiblemente de al menos el 98%, más preferiblemente de al menos el 99%. A modo de ejemplo, una complementariedad de al menos el 97% corresponde a 20 diferencias en un cebador mutagénico con una longitud de 830 nucleótidos (complementariedad de 810). Una complementariedad de al menos el 60% corresponde a una región de diferencia en el cebador mutagénico que tiene una longitud de 730 nucleótidos y es un 70% idéntica a la molécula de partida en un cebador mutagénico con una longitud de 830 nucleótidos (siendo los dos extremos de cualquier lado de la "región del 70%" perfectamente complementarios con la molécula de partida). En las figuras se muestran ejemplos no limitantes de los cebadores mutagénicos.

El cebador mutagénico puede tener entre 100 nucleótidos y 4000 nucleótidos de longitud, preferiblemente entre 200 y 3000 nucleótidos, más preferiblemente entre 300 y 2000 nucleótidos, más preferiblemente entre 400 y 1500 nucleótidos, más preferiblemente entre 400 y 1000 nucleótidos, incluso más preferiblemente entre 400 y 850 nucleótidos de longitud o entre 800 y 1500 nucleótidos de longitud.

El tamaño del cebador mutagénico puede depender del tamaño de la molécula de partida. Por ejemplo, cuando la molécula de partida es de 5,5 kb, el cebador mutagénico preferiblemente es de 1 kb. Así, el cebador mutagénico preferiblemente tiene entre 1/50 y 1/5 el tamaño de la molécula de partida, más preferiblemente 1/25, más preferiblemente 3/10 el tamaño de la molécula de partida, más preferiblemente aproximadamente 1/5 el tamaño de la molécula de partida en longitud expresada en nucleótidos.

Se prefiere que la relación molar de cebador mutagénico a molécula de partida en la etapa (c) esté aproximadamente entre 2:1 y 5:1, más preferiblemente alrededor de 3:1.

Las aplicaciones del método de la invención incluyen el escrutinio o la creación de bibliotecas, en particular bibliotecas de anticuerpos. Por ejemplo, la molécula de partida puede ser un vector para la expresión de anticuerpos o dominios de anticuerpos. Habiendo introducido mutaciones en la molécula de partida (por ejemplo fabricando los cebadores mutagénicos a partid de una plantilla que comprende una biblioteca de dominios de anticuerpo), las moléculas de partida mutadas resultantes pueden ser expresadas en un hospedante adecuado y ser escrutadas contra un antígeno apropiado (para más información, véase Vaughan y col., (1996) Nature Biotechnology, Volumen 14, páginas 309 a 314; y Edwards y col., (2003) J. Mol. Biol., 334, páginas 103-118). Otros ejemplos relacionados con anticuerpos incluyen la sub-clonación de dominios de anticuerpo en un plásmido aceptor de inmunoglobulina, por ejemplo un plásmido aceptor de IgG (tal como un vector de expresión pEU IgG, véase Persic y col. (1997) Gene 187: 9-18. El término anticuerpo describe una inmunoglobulina e incluye las versiones naturales y las sintéticas. El término abarca polipéptidos que tiene un dominio de unión de anticuerpo, que es homólogo, o sustancialmente homólogo, a un dominio de unión de anticuerpo. Los ejemplos incluyen Fab (dominios V_{L}, V_{H}, CL y CH1), scFv (domino V_{H} y dominio V_{L} ligados mediante un enlace tal como (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)_{3}, por ejemplo, Bird y col., (1998), Science, 242, 423-426, Huston y col. (1998), PNAS USA, 85, páginas 5879-5883); Fv (dominios V_{L} y V_{H} de un único anticuerpo); Fd (dominios V_{H} y CH1); dAB (Holt y col. (2003), Trends in Biotech. 21, páginas 484-490) y diacuerpos
(WO94/13804).

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Por tanto, en determinadas realizaciones la molécula de partida, la plantilla o el cebador mutagénico comprenden secuencias que codifican un dominio variable de anticuerpo. El dominio variable de anticuerpo puede ser un dominio V_{H} o V_{L}. Preferiblemente, la molécula de partida comprende un scFv.

Cuando se menciona en la presente memoria un anticuerpo o dominio de anticuerpo en el contexto de ácido nucleico tal como vectores, debe entenderse que se refiere a la secuencia de ácido nucleico que codifica dicho anticuerpo o dominio.

El método también puede usarse para barajar dominios de anticuerpos para crear repertorios de anticuerpos. Así, la molécula de partida puede contener un dominio de anticuerpo V_{H} y la molécula de cebador mutagénico puede contener un dominio de anticuerpo V_{L}, o la molécula de partida puede contener un dominio de anticuerpo V_{L} y la molécula de cebador mutagénico puede contener un dominio de anticuerpo V_{H}. Se puede combinar (barajar) una biblioteca de dominios de anticuerpo V_{H} con una biblioteca de dominios de anticuerpo V_{L}, o viceversa. Por tanto, se puede usar una de las dos bibliotecas como plantilla para formar múltiples cebadores mutagénicos y la otra biblioteca puede estar presente como biblioteca en múltiples moléculas de partida.

Por tanto, la invención proporciona un método en el que la molécula de partida contiene un dominio de anticuerpo V_{H} y un dominio de anticuerpo V_{L} y la molécula de cebador mutagénico contiene un dominio de anticuerpo V_{L} para mutar el dominio V_{L} de la molécula de partida. La invención también proporciona un método en el que la molécula de partida contiene un dominio de anticuerpo V_{L} y un domino de anticuerpo V_{H} y la molécula de cebador mutagénico contiene un dominio de anticuerpo V_{H} para mutar el dominio de anticuerpo V_{H} de la molécula de partida. De este modo se puede combinar (barajar) una biblioteca de dominios de anticuerpo V_{H} con una biblioteca de dominios de anticuerpo V_{L}, o viceversa.

Puede ser deseable que sólo uno de los dominios V_{L} y V_{H} de la molécula de partida sea mutado, o puede ser deseable que ambos dominios V_{L} y V_{H} de la molécula de partida sean mutados. Los sistemas de dominio único también son abarcados, por ejemplo, aquellos en los que las construcciones contengan un dominio V_{L} (pero no un dominio V_{H}) y que el dominio V_{L} sea mutado por un cebador mutagénico de V_{L}, o por ejemplo, en donde la construcción contenga un dominio V_{H} (pero no un domino V_{L}) y que el dominio V_{H} sea mutado por un cebador mutagénico de V_{H}. La invención proporciona todas estas posibilidades.

Por tanto, la invención abarca la situación en la que ambos dominios V_{H} y V_{L} de la molécula de partida serán mutados por cebadores mutagénicos que contienen cada uno de estos dominios. De este modo, un cebador mutagénico de V_{H} mutaría el dominio V_{H} de la molécula de partida y un cebador mutagénico de V_{L} mutaría el dominio V_{L} de la molécula de partida. También podría usarse un único cebador mutagénico que contenga ambos dominios.

Por lo tanto, la invención proporciona un método, en el que se usa un primer y un segundo cebador mutagénico para mutar la molécula de partida, conteniendo el primer cebador mutagénico un dominio de anticuerpo V_{H} para mutar el dominio V_{H} de la molécula de partida, y conteniendo el segundo cebador mutagénico un domino de anticuerpo V_{L} para mutar el dominio V_{L} de la molécula de partida. El primer cebador mutagénico y el segundo cebador mutagénico pueden ser usados en etapas de reacción de mutagénesis separadas, en cuyo caso el primer cebador mutagénico y el segundo cebador mutagénico pueden tomar parte en reacciones de mutagénesis separadas en cualquier orden (es decir, el primer cebador mutagénico podría usarse en una reacción de mutagénesis que preceda o que suceda a la reacción de mutagénesis que implica al segundo cebador mutagénico). Otra posibilidad es que dicho primer cebador mutagénico y dicho segundo cebador mutagénico sean usados en la misma etapa de reacción de
mutagénesis.

Los aspectos descritos anteriormente en los que el método de la invención se usa para combinar (o barajar) bibliotecas de dominios V_{H} con bibliotecas de dominios V_{L} en el contexto de anticuerpo podría aplicarse a otros sistemas en los que el barajado de combinaciones de dominios es deseable, tal como otras moléculas relacionadas con las inmunoglobulinas y las proteínas multi-dominio en general. Por tanto, la invención proporciona un método para combinar una biblioteca de primeros dominios con una biblioteca de segundos dominios, tal como se ha descrito anteriormente para los aspectos de anticuerpo (en donde el primer dominio es el dominio V_{H} y el segundo dominio es el dominio V_{L}, o viceversa).

En algunas realizaciones preferidas, la molécula de partida comprende ácido nucleico que codifica un scFv.

La presente invención también proporciona kits para llevar a cabo los métodos anteriores. Por ejemplo, un kit de ese tipo puede comprender cebadores iniciales adecuados para sintetizar una molécula de cebador de cadena sencilla a partir de una molécula plantilla, una molécula de partida de cadena sencilla e instrucciones de uso. La molécula de partida puede modificarse tal como se describe en la presente memoria. También se pueden incluir los reactivos y tampones adecuados, tal como los especificados en la presente memoria. También se pueden incluir componentes adicionales del kit, según se defina en cualquiera de las realizaciones del método de la invención.

Como se ha indicado, los métodos y kits de la invención tienen una serie de aplicaciones, que incluyen las siguientes. Los métodos pueden usarse en sub-clonación, por ejemplo, una región de ácido nucleico puede ser generada en la etapa (a) e introducida en un vector apropiado mediante la reacción de mutagénesis, evitando la necesidad de digestión y ligación del ácido nucleico. Por ejemplo, se podría clonar un antígeno diana en un vector de expresión. Los métodos pueden aplicarse a la creación y al escrutinio de bibliotecas, como se ha mencionado antes. Utilidades más específicas se describen a continuación.

Los métodos descritos en la presente memoria se pueden usar para convertir fragmentos Fv de cadena sencilla (scFv) (dominios V_{H} y V_{L} ligados como un único péptido mediante un ligando) en moléculas IgG. De este modo, los dominios V_{H} y V_{L} pueden introducirse en plásmidos aceptores IgG_V_{H} e IgG_V_{L}. Usando cebadores iniciales que son oligonucleótidos denominados genéricos, dirigidos a partes no variables del vector que contiene el scFv, o al ligando entre los dos dominios (por ejemplo, un cebador inicial que está dirigido a la secuencia por encima o por debajo de cada uno de los dominios, y un segundo cebador inicial que está dirigido al ligando entre los dos dominios). Por ejemplo, si se usan los scFvs descritos en Vaughan y col., uno de los cebadores iniciales podría estar dirigido a la secuencia por encima del dominio V_{H} en pCantab6 y el otro al ligando (es decir, dirigido a parte de la secuencia que codifica (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)_{3}).

Los métodos de la invención también pueden usarse para generar bibliotecas ingenuas (es decir, bibliotecas de donantes humanos no inmunizados). Actualmente éstas se generan llevando a cabo PCR de regiones V_{H} y V_{L} de anticuerpos ingenuos procedentes de donantes humanos no inmunizados, seguida de digestión de restricción y de ligación en plásmidos aceptores. Usando el método de la invención, se pueden separar los cebadores mutagénicos de dichos productos PCR derivados de los donantes no inmunizados. Nuevamente, el uso de los anteriores métodos elimina la necesidad de restricción y ligación. Los cebadores adecuados pueden estar basados en secuencias en cada extremo de la cadena pesada y en cada extremo de la cadena ligera (véase, por ejemplo, Vaughan y col., ver más arriba).

Los aspectos y realizaciones de la invención se ilustrarán ahora a través de ejemplos y haciendo referencia a las figuras anexas, en las que:

Listado de figuras

La Figura 1 muestra los cebadores mutagénicos para uso en el método de la invención. En cada caso, los números son el número aproximado de bases y la región de diferencia está marcada en gris. La Figura 1a muestra el cebador mutagénico 1, usado en el Ejemplo 1 (recombinación V_{H}/V_{L}). La Figura 1b muestra el cebador mutagénico 2a, usado en el Ejemplo 2 (subclonación de Panel de Ribosoma) para variantes V_{H} CDR3. La Figura 1c muestra el cebador mutagénico 2b, usado en el Ejemplo 2 para variantes V_{L} CDR3. La Figura 1d muestra un cebador mutagénico para producir variantes V_{H} ó V_{L}. La región en gris es aproximadamente idéntica en un 70% a la plantilla del Ejemplo 2. La Figura 1e muestra cebadores mutagénicos para clonar en un plásmido aceptor IgG. La Figura 1f muestra cebadores mutagénicos para clonar en plásmidos aceptores V_{H} y V_{L} para la creación de bibliotecas ingenuas.

La Figura 2 muestra la posición de los cebadores iniciales para la síntesis del cebador mutagénico para el uso en las realizaciones de recombinación V_{H}/V_{L} (por ejemplo, Ejemplo 1). A y B muestran los cebadores directo e inverso, respectivamente.

La Figura 3 muestra la posición de los cebadores iniciales para la síntesis del cebador mutagénico para el uso en los aspectos de panel de ribosoma (por ejemplo, Ejemplo 2). A y B muestran los cebadores directo e inverso, respectivamente.

La Figura 4 muestra los resultados del procedimiento de mutagénesis del Ejemplo 1.

La Figura 5 es una visión esquemática del procedimiento de mutagénesis de la invención. En el esquema, el VHCDR3 de un plásmido que contiene scFv que contiene una mutación particular en el VHCDR3 (mostrada con una estrella) es amplificado mediante PCR y separado en forma de cadena sencilla mediante la introducción de biotina por acción de los cebadores en la reacción de PCR. Se purifica ADN de cadena sencilla a partir del plásmido que contiene scFV, que contiene una mutación particular en el VLCDR3 (también mostrada con una estrella). En la reacción de mutagénesis entre el producto de PCR de cadena sencilla que contiene la mutación de VHCDR3 y el plásmido de cadena sencilla que contiene la mutación de VLCDR3, las dos mutaciones se combinan para producir un plásmido que contiene scFv con ambas mutaciones.

La Figura 6 muestra una realización combinatoria de la invención. En la parte superior de la figura se muestran múltiples moléculas plantilla que contienen las mutaciones a, b y c. Las regiones de dichas moléculas que contienen las mutaciones son amplificadas mediante PCR en múltiples cebadores de mutagénesis de cadena sencilla usando biotina. En la parte inferior de la figura se muestran múltiples moléculas de partida que contienen las mutaciones x, y y z. A partir de esta moléculas se produce ADN de cadena sencilla, de tal modo que se producen múltiples moléculas de partida que contienen las mutaciones x, y ó z. En la reacción de mutagénesis, los cebadores mutagénicos que contienen las mutaciones a, b y c se usan para mutar las múltiples moléculas de partida. Esto da como resultado la combinación de productos mostrada en la parte derecha de la figura.

Ejemplos Ejemplo 1 Método de mutagénesis para Recombinar Regiones V_{H} y V_{L} Optimizadas 1. Visión general del método

Se ha demostrado que la recombinación de regiones V_{H} y V_{L} optimizadas conduce a un aumento de la potencia durante la maduración por afinidad de anticuerpos in vitro (Osbourn y col. (1996), Immunotechnology, volumen 2, páginas 181-196). En este ejemplo, el método de mutagénesis de la invención se usa para recombinar un grupo de variantes en el que se aleatorizado V_{H}CDR3 con otro grupo de variantes en el que se ha aleatorizado V_{L}CDR3. Ambos grupos de variantes contienen la misma secuencia de anticuerpos original, excepto por las regiones cortas aleatorias en el CDR3 de V_{H} y V_{L}. Tras la aleatorización, los conjuntos V_{H} y V_{L} han sido sometidos cada uno a dos rondas de selección de panel de fagos para mejora de afinidad. Los productos V_{H} y V_{L} de la ronda dos de selección, que contienen cada uno una estimación de 10^{5} a 10^{6} secuencias variantes diferentes, forman el punto de partida para el método de recombinación descrito en este ejemplo.

En el método de este ejemplo, el grupo V_{H} es amplificado mediante PCR usando el oligonucleótido biotinilado PAMA-IN en el extremo 5' y el oligonucleótido H-LINK en el extremo 3' (véase la Figura 2). Tras la captura de partículas de estreptavidina, la cadena no biotinilada es eluída y esto forma el cebador mutagénico.

El grupo V_{L} se prepara como plásmidos de cadena sencilla, tras el rescate de partículas de bacteriófago procedentes de la cepa dut-ung- de E. coli CJ236. Juntando el cebador mutagénico que codifica V_{H} y los plásmidos de cadena sencilla que representan el conjunto V_{L}, se puede producir la recombinación de regiones V_{H} y V_{L}.

2. Oligo Diseño

La plantilla de ADN dU-ss aislada a partir de M13 es de cadena-positiva de tal modo que el cebador es complementario a la cadena-positiva (es decir, es cadena-negativa). Biotinilando el cebador directo, la cadena negativa puede ser eluída tras la captura de estreptavidina. Los oligonucleótidos usados son los siguientes (de 5' a 3'):

: Bio-PAMA-IN: biotina-GCGGCCCAGCCGGCCATGG

: H-LINK: ACCGCCAGAGCCACCTCCGCC

3. Preparación de Productos V_{L} como ADN de Plásmido ds

1.: La reserva de glicerol del repertorio de V_{L} en pCantab6 (Vaughan y col.) fue inoculada 100 \muL en 50 mL 2xTYA en un matraz cónico pequeño.

2.: El cultivo se preparó durante 2 horas a 37ºC y 300 rpm.

3.: Las células fueron peletizadas mediante centrifugación en tubos Falcon de 50 mL a 3200 rpm durante 10 minutos.

4.: Se llevó a cabo el protocolo Qiagen HiSpeed Plasmid Midi Kit para aislar ADN de plásmido ds en 1 mL de agua.

5.: La concentración de ADN se comprobó mediante espectrometría UV o gel de agarosa.

4. Preparación de Plantilla de ADN dU-ss

El ADN de Plásmido ds de la parte 3 se preparó a continuación mediante el siguiente protocolo:

Reactivos:

: Plasmid Midiprep de repertorio de V_{L} en pCantab6 (Vaughan y col.)

: Cloramfenicol (CAM) a 10 mg/mL en etanol y almacenado a -20ºC

: Uridina (Sigma U-6381) a 0,25 mg/mL en agua y almacenado a 4ºC

: 2xTYAG (+10 \mug/mL CAM) placas: (TY es tal como se describe en Sambrook y col., ver más arriba, más 100 \mug/mL de ampicilina (A) y un 2% de glucosa (G), se añade cloramfenicol (CAM) a 20 \muL a 80 \muL de etanol y se esparce por la placa).

Preparación de CaCl_{2} competente CJ236:

1.: Se inocularon 5 mL de medio 2xTY (más 10 \mug/mL de CAM) con una única colonia de células de E. coli CJ236 (por ejemplo, suministradas por Biorad). Las células fueron cultivadas una noche a 37ºC y a 300 rpm. El CAM selecciona el episoma F' de las CJ236.

2.: Se inocularon 500 mL de 2xTY con 5 mL del cultivo de una noche y se incubaron con agitación a 37ºC.

3.: Cuando la DO a 600 nm alcanzó un valor de 0,9 se recolectó el cultivo mediante centrifugación a 4ºC (5 minutos, 5000 rpm). Se retiró el sobrenadante y se drenó la partícula de células. Las células fueron resuspendidas con cuidado en 100 mL de MgCl_{2} 100 mM enfriado en hielo.

4.: Las células volvieron a ser recolectadas mediante centrifugación (centrífuga a 4ºC) y las partículas drenadas. Las células fueron resuspendidas con cuidado en 20 mL de CaCl_{2} 100 mM frío hasta que se obtiene una suspensión suave. Se añaden 200 mL de CaCl_{2} 100 mM frío y se mezcla. Las células fueron colocadas en hielo durante 30-90 minutos.

5.: Las células fueron recolectadas mediante centrifugación en una centrífuga fría y las partículas fueron drenadas. Las células fueron resuspendidas en 20 mL de CaCl_{2} 85 mM frío y un 15% de glicerol.

6.: Inmediatamente se tomaron alícuotas de la suspensión celular (las alícuotas pueden congelarse en hielo/etanol si es necesario).

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Transformación de la plantilla en CJ236:

1.: Las células competentes CJ236 CaCl_{2} anteriores fueron congeladas en hielo (y mantenidas en hielo durante todo el protocolo).

2.: Se añadieron 5 \muL de plásmido pCantab6 que contiene el repertorio VL de la sección 3 a 100 \muL de células competentes en un tubo de PCR.

3.: Se ejecutó el siguiente programa en el bloque de la máquina de PCR:

: 0,1ºC durante 30 minutos

: 42ºC durante 45 s

: 0,1ºC durante 2 minutos

4.: Las células fueron transferidas a un tubo Falcon de 15 mL en 0,5 mL de 2xTY.

5.: Las células fueron incubadas a 37ºC durante 45-60 minutos con agitación a 200 rpm.

6.: Se dispusieron 0,5 mL de células sobre placas 2xTYAG (+10 \mug/mL de CAM) y las placas fueron incubadas o/n a 37ºC.

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Rescate de fago de CJ236 y preparación de ADN:

1.: Se rascó la pelusa que surgió de la etapa 6 anterior de transformantes de CJ236 y se llevó a un 1 mL de 2xTY. Se inocularon 500 \muL en 50 mL de 2xTYGAC (es decir, un 2% de glucosa, 100 \mug/mL de AMP, 10 \mug/mL de CAM) y se incubó a 37ºC y 300 rpm hasta una DO_{600} = 0,5-1.

2.: Se calculó la densidad celular a partir de la lectura de DO (DO_{600} de 1= 5x10^{8} células/mL) y se añadieron fagos colaboradores KO7 naturales (fago colaborador M13 KO7 de Amersham Biosciences) para asegurar una multiplicidad de infección (MOI) de 10 fagos: 1 célula (wt KO7 normalmente contiene 10^{10} fagos en 0,33 \muL). A continuación las células fueron incubadas a 37ºC (sin agitación) durante 10 minutos para permitir la infección.

3.: Se transfirió 1 mL de cultivo a 30 mL de 2xTYAC suplementado con 25 \mug/mL de KAN (para seleccionar KO7) y 0,25 \mug/mL de uridina (para permitir la síntesis de plantilla que contiene uracilo). Se incubó durante una noche a 37ºC y 300 rpm.

4.: Las células fueron centrifugadas durante 10 minutos a 15000 rpm y 2ºC en un rotor SS-34. El sobrenadante fue transferido a un tubo nuevo y se añadió un volumen 1/5 de PEG-NaCl (20% de PEG^{8000}, NaCl 2,5 M). Se incubó durante 5 minutos a temperatura ambiente y a continuación se centrifugó durante 10 minutos a 10000 rpm y 2ºC en el SS-34.

5.: Se produjo una pequeña partícula de fago blanco. Se decantó el sobrenadante y se invirtió el tubo sobre el tejido a drenar. La partícula de fago fue resuspendida en 0,5 mL de PBS (las paredes del tubo fueron enjuagadas para captura tanto fago como fuera posible). El fago fue transferido a tubos eppendorf y se centrifugó durante 5 minutos a 15000 rpm en una microcentrífuga hasta obtener la materia insoluble restante. El sobrenadante fue transferido a un nuevo eppendorf.

6.: La plantilla de ADN dU-ss fue purificada usando un kit Qiagen Qiaprep Spin M13, empezando por la adición del tampón Qiagen MP (Sidhu y col., ver arriba). El ADN se eluyó en 100 \muL de Tris-HCl 10 mM, pH 8,0 y se examinó en un gel de agarosa al 1%. La preparación del ADN ss apareció como una banda distinta a 2,5 kb y se usó en la reacción de mutagénesis de la sección 6.

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5. Preparación de Cebador Mutagénico de ADN ss a partir de Repertorio de V_{H}

La región que representa el repertorio de secuencias VH diferentes fue amplificada a partir de pCantab6 mediante PCR usando los oligonucleótidos bio-PAMA-IN y H-LINK. Se pueden usar condiciones PCR estándar en una serie de diluciones de la plantilla midiprep preparada en la sección 3.

1

Se analizan 5 \muL de cada PCR en un gel de agarosa al 1% (esto confirmó el tamaño del producto, mostró el rendimiento, etc.).

1.: Se colocó una columna microMACS (Miltenyi Biotec: 130-042-701) en un sistema magnético.

2.: Se dejó que pasaran a su través 250 \muL de 1x tampón de unión (2x tampón de unión: Tris 10 mM, pH 7,5, NaCl 2 M, EDTA 1 mM, Tween 20 al 0,1%).

3.: Se mezclaron 45 \muL de reacción PCR con 105 \muL de perlas de estreptavidina microMACS (Miltenyi Biotec: 130-074-101) y 150 \muL 2x tampón de unión, y se incubaron durante dos minutos.

4.: Se aplicó ADN+perlas a una columna microMACS y se dejó que pasara a su través.

5.: La columna fue lavada con 2x1 mL de 1 x tampón de unión.

6.: Se eluyó ADN en un tubo eppendorf con 200 \muL de NaOH 0,1 N (recién preparado).

7.: Al ADN eluido se añadieron 20 \muL de acetato sódico, pH 5,2, 550 \muL de etanol, 1 \muL de glicógeno.

8.: Se incubó a -70ºC durante 30 minutos.

9.: Se centrifugó a 13000 rpm durante 10 minutos hasta peletizar el ADN. Se eliminó el sobrenadante y se reemplazó con 500 \muL de etanol al 70%.

10.: Se centrifugó a 13000 rpm durante otros 5 minutos, se retiró el sobrenadante, se secó al aire en un bloque de calor a 37ºC durante 2 minutos. Se resuspendió el ADN en 50 \muL de agua.

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6. Reacción de Mutagénesis Reactivos:

: Tampón TM (10x): Tris-HCl 500 mM, MgCl2 100 mM, pH 7,5.

: ATP 10 mM: (reserva 1M preparada disolviendo 0,6052 g en 1 mL de agua y ajustando el pH hasta 7,0 con NaOH 0,1M. Reserva diluida 1:100 para preparar ATP 10 mM, se puede almacenar a -70ºC).

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: DTT 100 mM: (reserva 1M preparada disolviendo 0,1542 g en 1 mL de acetato sódico 0,01 M (pH 5,2). Reserva diluida 1:10 para preparar DTT 100 mM, se puede almacenar a -20ºC).

: Enzimas: T4 polinucleótido quinasa, T4 ADN ligasa y T7 ADN polimerasa de New England Biolabs (NEB).

: dNTPs 25 mM.

: Kit de purificación PCR Qiagen Qiaquick (Qiagen).

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Fosforilación del cebador mutagénico

Se añadió lo siguiente a un tubo Eppendorf:

2

Se añadió agua a un volumen total de 53 \muL. Se añadieron 2 \muL (20U) de T4 polinucleótido quinasa (10 U/\muL) y se incubaron durante 1 hora a 37ºC.

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Maduración del cebador mutagénico con la plantilla en una relación de 3:1

Se añadió lo siguiente a un tubo Eppendorf:

: Plantilla de dU-ADNss (de la Sección 4), 4,4 \mug (4,4 \mug/1.750.000 daltons = 2,5 pmoles)

: Cebador mutagénico fosforilado, 1,0 \mug (1,0 \mug/132.000 daltons = 7,6 pmoles)

: Tampón TM (10x), 25 \muL

Se añadió agua hasta un volumen de 250 \muL.

Se incubaron los 250 \muL a 90ºC durante 2 minutos, a 50ºC durante 3 minutos y a 20ºC durante 5 minutos para madurar el cebador mutagénico a la plantilla.

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Reacción de mutagénesis

3

Las reacciones fueron incubadas a 20ºC durante 3 horas.

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Cada reacción fue purificada por afinidad con 35 \muL de agua usando el kit de purificación Qiagen Qiaquick PCR. Se analizó 1 \muL de cada reacción sobre gel de agarosa al 1% y se comparó con el producto de las reacciones con y sin cebadores mutagénicos. Se observó una banda de ADNss intensa (2,5 kb para pCantab6) en la calle "sin cebador". En la calle "con cebador" esta banda de ADNss se redujo en intensidad y fue sustituida por una o más bandas de mayor tamaño que representan ADNccc (ADN circular cerrado covalentemente) (>3 kb para pCantab6).

7. Electroporación en TG1's de E. coli

Se prepararon células TG1 electrocompetentes frescas (Stratagene) de acuerdo al siguiente protocolo:

1.: Se inoculó un volumen apropiado de medio 2TY con una colonia procedente de una placa de TG1 en medio mínimo. Las células fueron cultivadas durante una noche a 25ºC y a 300 rpm.

2.: Se inocularon 5 matraces que contenían 500 mL cada uno de 2TY con 10 mL (por matraz) del cultivo de una noche. Esto se cultivó a 25ºC y a 300-350 rpm hasta alcanzar una DO_{600} de 0,5-0,6 [en realidad esto lleva aproximadamente 2-3 horas].

3.: Se pre-enfriaron a 2ºC 6 x 500 mL botellas de centrífuga y el rotor Sorval SLA 3000.

4.: Una vez alcanzada la DO óptima, las células fueron enfriadas durante 30 minutos en hielo en las botellas de centrífuga y se giraron a 4.000 rpm durante 15 minutos a 2ºC.

5.: Se retiró el sobrenadante y se resuspendió la partícula en un pequeño volumen de agua Milli-Q autoclavaza enfriada con hielo. Se completó hasta aproximadamente 300 mL con agua y se giró a 4.000 rpm durante 15 minutos a 2ºC.

6.: Se retiró el sobrenadante y se resuspendió en un volumen pequeño del agua restante y a continuación se añadieron 300 mL de agua y se giró como se ha indicado anteriormente.

7.: Se pre-enfriaron 8 x 50 mL tubos Falcon a -20ºC. Se pre-enfrió una centrífuga de sobremesa Sorvall hasta 2ºC.

8.: Se retiró el sobrenadante y se resuspendió la partícula en el agua restante.

9.: Una vez resuspendida, se pipeteó a los tubos Falcon y se añadió agua hasta 50 mL. Se giró a 3.200 rpm durante 10 minutos.

10.: El sobrenadante se retiró y se resuspendió cada partícula en una pequeña cantidad de agua, las células fueron combinadas en un único tubo Falcon de 50 mL, se llevó hasta 50 mL con agua y se giró como se ha indicado antes.

11.: Se retiró el sobrenadante y las células se resuspendieron en el volumen restante de agua.

Para la electroporación se usó una serie de diluciones de células (únicamente células) para determinar una concentración adecuada (por ejemplo, diluciones de células a 100%, 80%, 60% y 50%). El único control de células se pone en 2TYAG como confirmación de que no hay células resistentes a ampicilina en la preparación de células competentes.

Se electroporó el total de 35 \muL de reacción de mutagénesis completada directamente en 400 \muL de células TG1 electrocompetentes en una única cubeta (cubeta Bio-Rad E. Coli Pulser, hueco de electrodo 0,2 cm; Nº de catálogo 165-2086), usando los siguientes parámetros:

Fuerza de campo 2,5 kV

Resistencia 200 \Omega

Capacitancia 25 \muF

Constante de tiempo 4,2 milisegundos

Inmediatamente después de la electroporación, se añadió 1 mL de 2TYG a la cubeta y las células fueron transferidas a un tubo Falcon de 50 mL. La cubeta se enjuagó con 1 mL adicional de 2TYG para transferir las células del fondo de la cubeta (con una punta de pipeta P200 alargada) al tubo Falcon. Esto se transfirió a un incubador a 37ºC y a 150-250 rpm para permitir que las células se recuperaran durante 1 hora.

Se llevó a placa una serie de dilución de cada biblioteca (de cada tubo Falcon) sobre placas pequeñas de 2xTYAG para estimar el tamaño de la biblioteca y las células restantes en la placa grande de 2xTYAG. Las células restantes fueron giradas (3200 rpm durante 10 minutos) y resuspendidas en 1 mL de 2TYG antes de ser llevadas a la placa grande. Las placas fueron incubadas durante una noche a 30ºC.

A continuación la biblioteca fue raspada de la placa grande en 5 mL de 2xTY y suplementada a continuación con 2,5 mL de glicerol al 50%. Se calculó la densidad celular a través de la DO^{600} (DO^{600} de 1 = 5x10^{8} células/mL) de una dilución 1:100. Para el almacenamiento, múltiples alícuotas de cada biblioteca fueron almacenadas a -70ºC, cada una de ellas con un exceso de células 10 a 1 sobre el tamaño de la biblioteca. Entonces se puede congelar una única alícuota y añadirse a 500 mL de cultivo para el rescate de la biblioteca como fago, por ejemplo para selección de fago mediante unión por afinidad (Hawkins y col. (1992) J. Mol. Biol., 226, páginas 889-896).

Los resultados de este método son los mostrados a continuación, y también se muestran en la Figura 4:

4

Ejemplo 2 Subclonación de productos de panel de ribosoma

Este ejemplo se refiere a la subclonación de productos del panel de ribosoma. En este método de subclonación, la plantilla fue un scFv, descrito como scFv de partida. Los protocolos usados son los del Ejemplo 1.

La etapa de PCR inicial que produce el cebador mutagénico usando los cebadores iniciales se lleva a cabo sobre los productos de una biblioteca de panel de ribosoma (es decir, productos RT-PCR), véase Jermutus y col. (2001) PNAS, volumen 98, Nº 1, 75-80. Los oligonucleótidos usados como cebadores de PCR iniciales se muestran en la Figura 3.

Por tanto, se amplificó mediante PCR un repertorio de diferentes secuencias scFv a partir de productos de panel de ribosoma (Jermutus y col., P.N.A.S. 2001, volumen 98, páginas 75 a 80) usando un cebador directo biotinilado madurado al principio del V_{H} y el cebador inverso mycRestore que ceba en la etiqueta myc, justo por debajo del extremo del V_{L} (véase la Figura 3).

Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del comienzo de la cadena pesada, se usó tanto Bio-EVQ como Bio-QVQ. Se usaron condiciones estándar de PCR (véase el Ejemplo 1 para más detalles).

Los productos PCR resultantes fueron separados en su forma de cadena sencilla para formar los cebadores mutagénicos tal como se ha descrito en el Ejemplo 1, y se usaron en la reacción de mutagénesis.

La molécula de partida para la reacción de mutagénesis era scFv de cadena sencilla en pCantab6 (Vaughan y col. (1996) Nature Biotechnology, Volumen 14, páginas 309 a 314). En este ejemplo, sólo se usó una secuencia scFv de partida de pCantab6. De este modo, la molécula de partida sencilla es mutagenizada mediante múltiples cebadores mutagénicos para subclonar así los múltiples productos del panel de ribosomas en el plásmido de partida.

La preparación de la molécula de partida de cadena sencilla, los protocolos para la reacción de mutagénesis y para la transformación de las células son como se ha descrito en el Ejemplo 1.

Los productos de las reacciones de mutagénesis resultaron en >10.000 transformantes tras la electroporación. Por el contrario, el control sin cebador mutagénico y sin enzima produjo menos de 10 transformantes.

Los resultados del ejemplo anterior son los siguientes:

5

Los anteriores cebadores mutagénicos se muestran en las Figuras. A modo de comparación, cuando se usan oligonucleótidos sintéticos en la mutagénesis (normalmente, 18 bases complementarias a cada lado de una diferencia de 18 bases) la eficacia de la mutagénesis es del 64% (n = 350 secuencias).

Ejemplo 3 Procedimiento de Exclusión por Tamaño

La eficacia de mutagénesis fue mejorada llevando a cabo una etapa de exclusión por tamaño sobre la molécula de partida de cadena sencilla del Ejemplo 2, antes de la reacción de mutagénesis. Esto dio como resultado una mejora de aproximadamente 1,5x en la mutagénesis (medida mediante análisis de secuencias, contando el número de secuencias mutadas con éxito).

Claims

1. Un método para introducir una o más mutaciones en una molécula de ácido nucleico, que comprende las siguientes etapas:

(a): sintetizar un cebador mutagénico a partir de una molécula plantilla de ácido nucleico, en donde dicho cebador mutagénico contiene una o más mutaciones respecto a una molécula de partida;

(b): aislar una forma de cadena sencilla de dicho cebador mutagénico;

(c): madurar dicho cebador mutagénico de cadena sencilla a una forma de cadena sencilla de dicha molécula de partida; y

(d): sintetizar una cadena complementaria a partir de dicho cebador mutagénico para producir una molécula de ácido nucleico de forma circular que contenga dichas mutaciones.

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2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que antes de dicha etapa de maduración (c), el cebador de cadena sencilla es mezclado con la molécula de partida de cadena sencilla.

3. El método de la reivindicación 1, en el que el cebador de cadena sencilla de la etapa (b) es aislado mediante el uso de un medio separativo.

4. El método de acuerdo con la reivindicación 2, que además comprende la etapa de aislar dicha molécula de partida de cadena sencilla antes de la etapa (c).

5. El método de acuerdo con la reivindicación 4, que además comprende una etapa de exclusión por tamaño llevada a cabo sobre dicha molécula de partida de cadena sencilla antes de la etapa (c).

6. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicha molécula de partida es ADN circular de cadena sencilla.

7. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la molécula de partida es un vector de expresión o un vector de panel de fago.

8. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicha molécula de forma circular es ADN circular cerrado covalentemente.

9. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que además comprende la etapa de transformar la molécula de ácido nucleico mutagenizado en células hospedantes.

10. El método de acuerdo con la reivindicación 9, en el que dicha transformación se lleva a cabo usando electroporación.

11. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende una etapa llevada a cabo en las condiciones que permiten seleccionar preferentemente la cadena complementaria que contiene las mutaciones.

12. El método de la reivindicación 11, en el que dicha selección preferente de la cadena complementaria es el resultado de la digestión preferente de la molécula de partida.

13. El método de la reivindicación 11, en el que la molécula de partida contiene modificaciones de tal modo que la cadena complementaria se seleccione preferentemente.

14. El método de la reivindicación 13, que además comprende la etapa de introducir dichas modificaciones.

15. El método de la reivindicación 13 ó de la reivindicación 14, en el que la modificación es la introducción de dU en lugar de dT.

16. El método de la reivindicación 13 ó de la reivindicación 14, en el que la modificación es la metilación o la introducción de un gen condicionalmente letal.

17. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 16, en el que dicha selección preferente se lleva a cabo transformando dicha molécula de forma circular de la etapa (d) en una célula hospedante que sea selectiva para la cadena complementaria, no modificada.

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18. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho cebador mutagénico se sintetiza mediante un método basado en PCR.

19. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho cebador mutagénico se sintetiza mediante un método de síntesis en el que se introducen errores cuando se sintetiza una segunda cadena a partir de una primera cadena.

20. El método de acuerdo con la reivindicación 19, en el que dicho método es PCR propensa al error.

21. El método de acuerdo con la reivindicación 19 ó con la reivindicación 20, en el que la secuencia de la plantilla para la síntesis del cebador mutagénico es la misma obtenida en la molécula de partida.

22. El método de acuerdo con la reivindicación 3, en el que la etapa de síntesis de dicho cebador mutagénico introduce un resto de unión bien en la cadena positiva o bien en la cadena negativa del cebador mutagénico, y dicha preparación se lleva a cabo a través de la unión de dicho resto de unión con su pareja de unión en dicho medio separativo.

23. El método de acuerdo con la reivindicación 22, en el que dicho resto de unión se introduce en la cadena positiva del cebador mutagénico y la cadena negativa del cebador mutagénico se eluye de dicho medio separativo.

24. El método de acuerdo con la reivindicación 22 ó con la reivindicación 23, en el que dicho resto de unión es biotina y dicha pareja de unión es estreptavidina.

25. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicha(s) mutación(es) incluye sustituciones.

26. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicha(s) mutación(es) incluye eliminaciones.

27. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicha(s) mutación(es) incluye adiciones.

28. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dichas mutaciones son mutaciones en una pluralidad de nucleótidos.

29. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho cebador mutagénico tiene al menos un 80% de complementariedad con la molécula de partida.

30. El método de acuerdo con la reivindicación 29, en el que dicho cebador mutagénico tiene al menos un 90% de complementariedad con la molécula de partida.

31. El método de acuerdo con la reivindicación 30, en el que dicho cebador mutagénico tiene al menos un 95% de complementariedad con la molécula de partida.

32. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho cebador mutagénico tiene un tamaño entre 100 nucleótidos y 4.000 nucleótidos.

33. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la relación molar de cebador mutagénico a molécula de partida en la etapa (c) es aproximadamente 3:1.

34. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que existen múltiples moléculas de partida y/o múltiples moléculas de cebador mutagénico.

35. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la molécula de partida, la plantilla o el cebador mutagénico contienen un dominio variable de anticuerpo.

36. El método de acuerdo con la reivindicación 35, en el que dicho dominio variable de anticuerpo es un dominio de anticuerpo V_{L}.

37. El método de acuerdo con la reivindicación 35, en el que dicho dominio variable de anticuerpo es un dominio de anticuerpo V_{H}.

38. El método de acuerdo con la reivindicación 35, en el que la molécula de partida contiene un dominio de anticuerpo V_{H} y un dominio de anticuerpo V_{L} y la molécula de cebador mutagénico contiene un dominio de anticuerpo V_{L} para mutar el dominio V_{L} de la molécula de partida.

\newpage

39. El método de la reivindicación 35, en el que la molécula de partida contiene un dominio de anticuerpo V_{L} y un dominio de anticuerpo V_{H} y la molécula de cebador mutagénico contiene un dominio de anticuerpo V_{H} para mutar el dominio de anticuerpo V_{H} sobre la molécula de partida.

40. El método de la reivindicación 38 ó de la reivindicación 39, en el que se usan un primer cebador mutagénico y un segundo cebador mutagénico para mutar la molécula de partida, conteniendo el primer cebador mutagénico un dominio de anticuerpo V_{H} para mutar el dominio V_{H} en la molécula de partida, y conteniendo el segundo cebador mutagénico un dominio de anticuerpo V_{H} para mutar el dominio V_{L} en la molécula de partida.

41. El método de la reivindicación 40, en el que dicho primer cebador mutagénico y dicho segundo cebador mutagénico se usan en etapas de reacción de mutagénesis separadas.

42. El método de la reivindicación 41, en el que dicho primer cebador mutagénico y dicho segundo cebador mutagénico se usan en la misma etapa de reacción de mutagénesis.

43. El método de la reivindicación 38 ó de la reivindicación 39, en el que se usa un único cebado mutagénico que contiene ambos dominios, V_{H} y V_{L}, para mutar los dominios V_{H} y V_{L} en la molécula de partida.

44. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 34 a 43, en el que la molécula de partida comprende ácido nucleico que codifica un scFv.