PT1844144E - Método de mutagénese - Google Patents

Description

ΡΕ1844144 1 DESCRIÇÃO "MÉTODO DE MUTAGÉNESE" A presente invenção refere-se a um método de produção de moléculas de ácido nucleico mutagenizadas. Em particular, a presente invenção refere-se a um método no qual o iniciador utilizado na reacção de mutagénese (o iniciador mutagénico) é, ele próprio, sintetizado a partir de uma molécula de ácido nucleico molde. 0 resultado da reacção de mutagénese é uma molécula de ácido nucleico circular mutagenizado que pode ser e.g., transformado em bactérias sem a necessidade de modificação adicional. Em formas de realização preferidas, o método é aplicado a populações de moléculas, por exemplo na criação de, ou rastreio de populações de moléculas. 0 método pode ser também utilizado de um modo combinatório, em que são utilizados iniciadores mutagénicos múltiplos para mutar moléculas parentais múltiplas.

Um dos passos envolvidos em técnicas de biologia molecular é a introdução de ácido nucleico num vector. Por exemplo, um fragmento de DNA ou população de fragmentos de DNA pode ser digerido e introduzido por ligação num vector. Por exemplo, um fragmento de DNA (ou população de fragmentos) pode ser digerido e removido a partir de um primeiro vector (e. g, um plasmídeo) num segundo vector num 2 ΡΕ1844144 processo conhecido como subclonagem. Deste modo, um primeiro vector é digerido com as mesmas enzimas de restrição como o segundo vector, de modo a produzir extremidades protuberantes complementares para ligação. 0 fragmento de DNA e o segundo vector são então ligados em virtude das suas extremidades protuberantes complementares e o resultado é um vector completado, contendo o fragmento de DNA, que pode replicar numa célula hospedeira (e.g., em bactérias).

Por isso, podem ser produzidas grandes quantidades de DNA para utilização em várias aplicações de biologia molecular. Ou, o vector no qual o DNA foi introduzido pode possuir um objectivo particular (e.g. pode ser um vector de expressão) . Uma vez introduzido nesse vector de expressão, a proteína codificada pelo fragmento de restrição pode ser expresso a partir do vector na célula hospedeira. Uma vez expressa, a proteína resultante pode ser purificada para a sua utilização final. Ou, particularmente quando o método é utilizado para incorporar uma população de fragmentos de DNA num vector de expressão, a proteína expressa pode ser utilizada num rastreio (e.g., por afinidades de ligação a uma molécula alvo). São também conhecidos vários métodos de introdução de mutações no DNA. É conhecido, a partir do trabalho de Barik (Barik, Methods in Molecular Biology Vol. 192: "PCR cloning Protocols, 2a edição pl89 - 196, Eds B-Y Chen e H. W Janes @ Humana Press Inc, Totowa, NJ; Burke e Barik, 3 ΡΕ1844144

Methods In Molecular Biology Vol. 226: PCR Protocols, 2a Edição p 525-531, Eds JMS Bartless e D Stirling @ Humana Press Inc, Totowa, NJ) a utilização de uma abordagem baseada na PCR para introduzir mutações no DNA linear. De acordo com este método, os denominados megainiciadores foram utilizados para introduzir mutações num molde linear numa reacção de PCR. Contudo, esses métodos resultam num produto de DNA de cadeia dupla linear que deve ser ele próprio subclonado num vector apropriado de modo a produzir uma forma replicativa para e.g., aumento de escala, ou para expressão de proteina.

Miyazaki propôs um método envolvendo PCR de um plasmideo inteiro (Miyazaki, Methods In Molecular Biology: Directed Evolution Library Creation: Methods and Protocols. Eds Amold e Georglou, Humana Press Inc. Totowa, NJ; BioTechniques 33: 1033-1038). Neste método, é utilizado um plasmideo de cadeia dupla como o molde numa reacção de PCR e ao qual é adicionado um produto de PCR de cadeia dupla, contendo a mutação a ser introduzida, para iniciação. Contudo, a propriedade de cadeia dupla do iniciador e o molde pode provocar que as cadeias do iniciador e as cadeias do molde de auto-emparelhem em vez de se emparelharem de forma cruzada e por isso é utilizada uma proporção especifica de iniciador para molde para minimizar o auto-emparelhamento. Wang e Malcolm (1999) também revelam um método de mutagénese baseado na PCR de plasmideos (Wang e Malcolm, Biotechniques, vol. 26, no. 4, 1999 páginas 680-684) . 4 ΡΕ1844144

Adicionalmente aos problemas de auto-emparelhamento que resultam de um molde de cadeia dupla, existem outros problemas quando é utilizado um molde de cadeia dupla numa reacção de PCR. Numa reacção exponencial a capacidade para serem introduzidos erros é elevada na medida em que um erro introduzido num ciclo é transportado para cada um dos ciclos posteriores numa base exponencial. Para além disso, quando este molde de PCR é um molde grande, tal como um vector, e.g., um plasmideo, então isto aumenta ainda mais a probabilidade de serem introduzidos erros. É também conhecida a utilização de oligonu-cleótidos sintéticos para mutar DNA (Kunkel et al., (1985) PNAS USA, Vol 82, pp 488-492 ; Sidhu et al., Phage Display for the Selection of Novel Binding Peptides). EP 1108783 também ser refere a um método de mutagénese utilizando oligonucleótidos sintéticos. Contudo, há limitações em relação ao comprimento dos oligonucleótidos que podem ser sintetizados quimicamente. Adicionalmente, para programar o sintetizador, a sequência deve ser conhecida e inserida com antecedência no sintetizador para a sua produção.

Existe por isso uma necessidade para métodos alternativos de mutagénese. Em particular, para métodos que produzem um produto que pode ser transformado directamente em bactérias, pronto para utilização a jusante, como tal em rastreio de expressão (evitando a necessidade para passos 5 ΡΕ1844144 adicionais de digestão e ligação, para introduzir ácido nucleico num vector apropriado). Existe também uma necessidade para métodos de mutagénese rápidos, eficientes e para métodos que são propicios ao aumento de escala, e.g., para utilização na produção de populações para rastreio ou produção de bibliotecas. A presente invenção, num aspecto, refere-se a um método de introdução de uma ou mais mutações numa molécula de ácido nucleico, compreendendo: emparelhar uma forma de cadeia simples de um iniciador mutagénico a uma molécula parental, tendo sido o referido iniciador mutagénico sintetizado de uma molécula de ácido nucleico molde e contendo uma ou mais mutações em relação à referida molécula parental; e sintetizando uma cadeia complementar do referido iniciador mutagénico, de modo a produzir uma molécula de forma circular de ácido nucleico contendo as referidas mutações.

Num aspecto, a presente invenção proporciona um método de introdução de uma ou mais mutações numa molécula de ácido nucleico, compreendendo os passos seguintes: (a) sintetizar um iniciador mutagénico de uma molécula de ácido nucleico molde, em que o referido iniciador mutagénico contém uma ou mais mutações em relação a uma molécula parental; (b) isolar uma forma de cadeia simples do referido iniciador mutagénico; 6 ΡΕ1844144 (c) emparelhar o referido iniciador muta-génico de cadeia simples com uma forma de cadeia simples da referida molécula parental; e (d) sintetizar uma cadeia complementar a partir do referido iniciador mutagénico, de modo a produzir uma molécula de ácido nucleico de forma circular contendo as referidas mutações.

Deste modo, o iniciador mutagénico é sintetizado a partir de uma molécula de ácido nucleico molde utilizando uma enzima adequada, utilizando métodos conhecidos na técnica. É preferido que o referido iniciador mutagénico seja sintetizado utilizando um método à base da reacção da polimerase em cadeia (PCR). A molécula molde e a molécula parental podem ser a mesma, ou podem conter a mesma sequência, que forma a base da sintese do iniciador mutagénico. Assim, em algumas formas de realização, a sequência do molde para a sintese do iniciador mutagénico é igual à encontrada na molécula parental. Nestas formas de realização, as mutações podem ser introduzidas em virtude da introdução de erros durante a sintese do iniciador mutagénico da molécula molde, e.g., por meio de uma polimerase propensa a erros. Deste modo, em algumas formas de realização, o iniciador mutagénico é sintetizado através de um método de sintese no qual os erros são introduzidos quando se sintetiza uma segunda cadeia a partir de uma primeira cadeia, preferencialmente através de métodos de PCR propensa a erros (métodos 7 ΡΕ1844144 adequados são conhecidos do especialista na arte, e.g., Molecular cloning: a Laboratory Manual: 2a edição, Sambrook et al., 1989 Cold Spring Harbour Laboratory Press). Estão disponíveis na arte vários kits para realizar PCR propensa a erros, tais como Diversify (BDBiosciences 63070). Noutra abordagem, a molécula molde pode ser transformada numa estirpe de E. coli (as estirpes adequadas estão disponíveis na arte, e.g., XLl-RED (Stratagene)) que introduz erros na sequência de DNA. Serão conhecidos do especialista na técnica métodos para introduzir erros no iniciador mutagénico quando produzidos a partir do molde. O molde e a molécula parental podem ser moléculas diferentes, i.e., pode conter regiões em que existe uma diferença na sequência entre a molécula parental e a molécula molde, respectivamente. Deste modo, quando o iniciador mutagénico é sintetizado a partir do molde, contém mutações em comparação com a molécula parental (nesta situação, uma reacção que introduz erros, e.g., PCR propensa a erros, não é necessária). O especialista na técnica conhece reagentes e condições de reacção adequados para a síntese do iniciador mutagénico do molde (ver, por exemplo, Molecular cloning: a Laboratory Manual: 2a edição, Sambrook et al., 1989 Cold Spring Harbour Laboratory Press). Quando o iniciador mutagénico é sintetizado utilizando a reacção em cadeia pela polimerase, os iniciadores adequados são seleccionados pelo especialista na técnica, em relação ao molde a ser ΡΕ1844144 utilizado. Os iniciadores utilizados para produzir o iniciador mutagénico são aqui referidos como os iniciadores iniciais. Estes iniciadores iniciais compreendem um iniciador em sentido directo e um iniciador reverso, que se baseiam geralmente nas extremidades da sequência a ser amplificada, i . e ., nas extremidades da sequência que será o iniciador mutagénico. Os iniciadores iniciais são geralmente oligonucleótidos sintéticos, produzidos por quaisquer métodos convencionais utilizando um sintetizador de oligonucleótido. Estes iniciadores iniciais podem ser de qualquer comprimento adequado, por exemplo cerca de 15 até 100 nucleótidos de comprimento, e.g., cerca de 15 até 75 nucleótidos de comprimento, cerca de 15 até 50 nucleótidos de comprimento, geralmente 18 até 25 nucleótidos de comprimento. O especialista na técnica pode escolher ou conceber iniciadores iniciais adequados, dependendo de, e.g., a sequência da molécula molde, o tamanho do iniciador mutagénico resultante e/ou a aplicação do método.

Outra vantagem da presente invenção surge do facto de o iniciador mutagénico ser sintetizado a partir de uma molécula de ácido nucleico molde, de modo a que a sequência do iniciador mutagénico possa ser desconhecida para o utilizador. Por exemplo, quando o iniciador mutagénico é produzido por PCR utilizando iniciadores iniciais dirigidos a uma parte conhecida do molde, a região amplificada por estes iniciadores iniciais pode ser desconhecida. Por isso, em algumas formas de realização, a sequência do iniciador mutagénico é desconhecida antes do 9 ΡΕ1844144 referido emparelhamento. Isto tem aplicação particular quando o método da invenção é aplicado a bibliotecas (discutido mais adiante), mas não está limitado a estes. Existem muitos outros pedidos em que uma sequência particular na subclonagem é desconhecida, mas as fronteiras do vector no qual está contido são conhecidas (um exemplo seria na clonagem por "shotgun"). 0 especialista na técnica pode seleccionar iniciadores iniciais adequados, baseados no seu conhecimento da molécula parental. A molécula definida no passo (b) é por isso um iniciador mutagénico de cadeia simples que foi isolado a partir da sua cadeia complementar. Os termos separados e isolados são utilizados indistintamente em relação ao iniciador mutagénico de cadeia simples. É preferido que esta separação ou isolamento do iniciador mutagénico de cadeia simples da sua cadeia complementar seja realizado utilizando um meio de separação (tais como esferas ou uma coluna de separação) como descrito abaixo. Deste modo pode ser introduzida uma unidade de ligação numa das cadeias do mutagénico iniciador quando é sintetizado, permitindo desse modo que uma das cadeias do iniciador mutagénico a ser isolado do outro e.g., num passo de captura como descrito abaixo. É preferido que o iniciador de cadeia simples definido no passo (b) seja separado através da utilização de um meio de separação. 10 ΡΕ1844144

Por exemplo, o passo de sintetizar o iniciador mutagénico pode introduzir uma unidade de ligação na cadeia positiva ou na cadeia negativa do iniciador mutagénico e a separação do iniciador mutagénico nas suas cadeias positiva e negativa pode ser então realizada através da referida unidade de ligação ligando-se ao seu parceiro de ligação num meio de separação. O meio de separação pode ser qualquer meio em fase sólida adequado, tal como esferas ou uma coluna (e.g., esferas ou coluna à qual se liga o parceiro de ligação).

Mais particularmente, a unidade de ligação pode ser introduzida na cadeia positiva do iniciador mutagénico (e.g., utilizando um iniciador inicial em sentido directo na reacção de mutagénese que incorpora uma unidade de ligação) e a cadeia negativa do iniciador mutagénico pode ser então eluida após a forma de cadeia positiva se ligar ao meio de separação. É preferido que a unidade de ligação seja a biotina e que o referido parceiro de ligação seja a estreptavidina. Outras unidades de ligação adequadas e parceiros de ligação serão bem conhecidos dos especialistas na técnica e incluem fluoresceina e digoxina, e anticorpos (incluindo fragmentos e derivados) e antigénios. O especialista é bem conhecedor de outras unidades de ligação e parceiros de ligação que podem ser utilizados. Por exemplo, adicionalmente à estreptavidina, estão disponíveis outros parceiros de ligação que se ligam à biotina, tais como avidina e neutravidina. O especialista 11 ΡΕ1844144 pode seleccionar unidades de ligação adequadas e parceiros de ligação para utilizar no passo de captura envolvido na separação das cadeias. Adicionalmente à biotina e/ou estreptavidina podem ser utilizados análogos (ver e.g., J Mol Biol (1994) Sep 30: 242 (4): 559-65)). A biotina e a estreptavidina são mais preferidas.

Por exemplo, uma unidade antigénica particular pode ser incorporada numa das cadeias do iniciador mutagénico durante a sua síntese, de um modo semelhante ao descrito para o exemplo da biotina mencionado acima. Depois, uma cadeia pode ser separada da outra utilizando uma coluna contendo anticorpos contra o antigénio.

Outra abordagem é utilizar um sistema de separação que contém proteínas que se ligam a sequências de DNA específicas. Por exemplo, é conhecido na técnica que a metilase HaelII se liga a uma sequência específica de DNA em 5', outro exemplo de proteína que se liga a uma sequência específica de DNA é P2A. Para uma discussão dessa abordagem ver, Bertschinger e Neri "Protein, Engineering, Design and Selection (2004), Volume 17, página 699. 0 parceiro de ligação e a unidade de ligação devem ter afinidade suficiente para suportar o tratamento que é utilizado para a separação das cadeias de DNA. Para a separação da cadeia pode ser utilizado pH elevado ou baixo. Quando é utilizado pH baixo, este é preferencialmente ^ pH 3, mais preferencialmente ^ pH 2, ainda mais 12 ΡΕ1844144 preferencialmente ^ pH 1. 0 ácido clorídrico e o ácido cítrico são os ácidos preferidos. 0 pH elevado é mais preferido. Quando é utilizado pH elevado, este é preferencialmente ^ pH 11, mais preferencialmente á pH 12, ainda mais preferencialmente á pH 13. Agentes alcalinos preferidos incluem hidróxido de sódio, e outros hidróxidos do Grupo I, tais como LiOH ou KOH. Os hidróxidos do Grupo II, para além de Be(OH)2 e Ba(0H)2, também podem ser utilizados. É mais preferido que as cadeias sejam separadas utilizando hidróxido de sódio (e.g., NaOH a 0,1 N, que possui um pH de 13) . Os agentes e condições apropriados podem ser seleccionados pelo especialista na técnica. É mais preferida a utilização de biotina e estreptavidina e/ou seus análogos e o tratamento de separação de cadeia a pH elevado, como definido acima.

Também podem ser utilizados grupos químicos para ligar quimicamente uma das cadeias a um suporte. Por exemplo, é possível que os oligonucleótidos sejam sintetizados de modo a incorporar um grupo químico particular, tal como uma amina ou um grupo tiol. Na verdade, esses oligonucleótidos podem ser adquiridos a partir de fornecedores. Quando esses oligonucleótidos são utilizados como um dos iniciadores iniciais na reacção da invenção, então o grupo químico relevante será incorporado na cadeia relevante do iniciador mutagénico resultante. A separação das cadeias pode então ser realizada acoplando esses agentes químicos (que são agora incorporados na cadeia de DNA) a agentes de ligação a amina ou agentes de 13 ΡΕ1844144 ligação a tiol, a título de exemplo, e estão disponíveis agentes adequados para o especialista na técnica.

Após a forma de cadeia simples do iniciador mutagénico ter sido criada como descrito acima, é então introduzida na molécula parental para realizar o passo de emparelhamento (c) . Deste modo, a forma de cadeia simples do iniciador mutagénico é então adicionada à molécula parental para utilização na reacção de emparelhamento.

No passo (c), o emparelhamento do iniciador mutagénico com a molécula parental pode utilizar quaisquer condições e reagentes adequados, dependendo de, por exemplo, o tamanho do iniciador mutagénico. A selecção de condições apropriadas é compreendida pelo especialista na técnica. A título de exemplo, pode ser utilizada uma proporção molar de 3:1 de iniciador mutagénico para molde. Condições de reacção adequadas são incubação a 90°C durante 2 mins, 50 °C durante 3 mins e 20 °C durante 5 mins. As condições podem ser variadas, se necessário, pelo especialista na técnica. A molécula de ácido nucleico de forma circular que resulta do passo (d) é também referida no caso presente como a "resultado da reacção de mutagénese" (ou, na forma abreviada, como o "resultado"). Preferencialmente, o resultado da reacção é replicativo, significando que na transformação numa célula hospedeira pode replicar para produzir cópias de si próprio. Isto possui a vantagem de o 14 ΡΕ1844144 resultado da reacção de mutagénese poder ser transformado directamente numa célula hospedeira (tal como uma célula hospedeira para o objectivo de expressão da proteina a partir do ácido nucleico), sem a necessidade de manipulações adicionais, e.g., sem a necessidade de excisar a porção relevante do ácido nucleico com enzimas de restrição e ligá-la noutro plasmídeo.

Alternativamente, ou adicionalmente, é preferido que o resultado da reacção de mutagénese seja de cadeia dupla, para permitir a digestão com enzimas de restrição. É mais preferido que a molécula de forma circular (resultado da reacção de mutagénese) seja DNA circular fechado covalentemente, preferencialmente de cadeia dupla.

Como referido, o passo (d) produz um produto de reacção circular a partir da molécula parental. Essa reacção envolve a iniciação da síntese da cadeia complementar a partir do iniciador mutagénico emparelhado, de modo a que a cadeia complementar resultante contenha as mutações do iniciador mutagénico. Em geral, a mistura de reacção irá conter quantidades adequadas das bases nucleotídicas, DNA polimerase, DNA ligase e um tampão apropriado (os exemplos produziram quantidades adequadas). Esta é incubada em condições apropriadas para que a síntese da segunda cadeia seja completa. Esses métodos são conhecidos do especialista na técnica. É preferido que esta reacção seja de um tipo não amplificação (e.g., uma reacção 15 ΡΕ1844144 de tipo não PCR) de modo a que não envolva ciclos sucessivos de amplificação e pode por isso ser descrito como uma reacção linear (i.e., é produzida uma cadeia complementar por cadeia simples de molécula parental). Por exemplo, no método da invenção, a reacção de mutagénese na molécula parental de cadeia simples produz uma segunda cadeia simples que é oposta no sentido da cadeia simples da molécula parental. Deste modo, quando a molécula parental de cadeia simples é uma cadeia positiva, a segunda cadeia sintetizada na reacção de mutagénese será uma cadeia negativa.

Utilizando um molde de cadeia simples e um iniciador de cadeia simples na reacção de mutagénese, são evitados os problemas associados ao auto-emparelhamento. Para além disso, o resultado da reacção de mutagénese é de cadeia dupla e como tal transforma as bactérias mais eficazmente do que uma molécula de cadeia simples. Por isso, quando transformada num hospedeiro bacteriano, a forma de cadeia dupla mutada irá transformar bactérias de preferência no molde de cadeia simples (efectivamente, uma selecção da forma mutada em relação ao molde não mutado). 0 método da invenção compreende os passos listados acima (aqui designado, o termo "compreende" é utilizado no sentido de incluir, i.e., permitir a presença de uma ou mais caracteristicas adicionais, e.g., passos de reacção). Assim, o método da invenção pode incluir passos adicionais, incluindo, mas não limitado aos passos aqui 16 ΡΕ1844144 mencionados noutro local. 0 método da invenção pode, alternativamente, consistir nos passos listados acima, ou aqui mencionados. Os passos da reacção podem ser combinados em vasos de reacção simples, e não é necessário que cada passo seja realizado num vaso separado. Por exemplo, o passo de emparelhamento do iniciador mutagénico com a molécula parental e o passo de sintetizar uma cadeia complementar podem ser realizados num único vaso.

Preferencialmente, a molécula parental de cadeia simples é DNA circular de cadeia simples. Por exemplo, a molécula parental de cadeia simples pode ser DNA circular de cadeia simples que é extraido de partículas fágicas.

Preferencialmente, no método da invenção, antes do referido passo de emparelhamento (c) , existe o passo separado de adicionar a molécula parental de cadeia simples ao iniciador de cadeia simples. Mais preferencialmente, o método compreende ainda o passo de isolar a referida molécula parental de cadeia simples antes do passo (c). A ordem dos passos relacionados com o iniciador mutagénico e a molécula parental, respectivamente, não necessitam de ser consecutivos. Assim, a forma de cadeia simples do iniciador mutagénico pode ser separada antes da forma de cadeia simples da molécula parental ser isolada. Ou, a forma de cadeia simples da molécula parental pode ser isolada antes da forma de cadeia simples do iniciador mutagénico ser separado. Ou, a separação do iniciador 17 ΡΕ1844144 mutagénico de cadeia simples e o isolamento da molécula parental de cadeia simples, respectivamente, pode ser realizado lado a lado, ou simultaneamente. É preferido que o método da invenção compreenda ainda um passo de exclusão de tamanho realizado na referida molécula parental de cadeia simples antes do passo (c). Por exemplo, a molécula parental de cadeia simples é passada através de uma resina porosa, quaisquer fragmentos pequenos ficam presos na resina enquanto que a molécula parental maior passa através dela. Este passo remove fragmentos de DNA lineares curtos (que se pensa serem produtos de degradação que co-purificam com o molde). A remoção destes fragmentos melhora a eficiência de mutagénese evitando eventos de iniciação a partir dos fragmentos curtos que não conduzem à mutagénese. A molécula parental irá conter os elementos de sequência necessários para a utilização a jusante do resultado do método. Vectores adequados, para utilização como a molécula parental, estão disponíveis na técnica ou podem ser construídos por um especialista, utilizando técnicas convencionais. Esses vectores compreendem sequências de regulação apropriadas, incluindo sequências promotoras, sequências de terminação, sequências intensifica-doras, genes marcadores, etc. Os vectores podem ser de qualquer tipo adequado, e.g., plasmideo, fago, fagemideo, etc. Por exemplo, quando o resultado do método se destina a ser utilizado em expressão de proteina (por exemplo, para 18 ΡΕ1844144 rastreio do produto expresso) então a molécula parental irá conter as sequências necessárias para a expressão de proteína numa célula hospedeira. São bem conhecidos na técnica sistemas de expressão adequados, e podem ser utilizadas uma variedade de células hospedeiras. Estas incluem, células de bactérias, leveduras, insectos e de mamíferos (e.g., células HeLa, CHO, ou BHK). As células bacterianas são preferidas, mais preferencialmente E. coli. Estão disponíveis na técnica vectores para cada um destes hospedeiros, ou podem ser construídos através de métodos de rotina. Também podem ser utilizados sistemas de expressão virai, tais como sistemas de baculovírus ou sistemas de expressão virai em plantas. São bem conhecidos na arte, técnicas para a manipulação de DNA (e.g., clonagem, sequenciação, expressão e análise etc.). Outros detalhes de métodos conhecidos podem ser encontrados em, e.g., Molecular clonagem: a laboratory manual: 2a edição, Sambrook et al.r 1989. Cold Spring Harbor Laboratory Press; ou Current Protocols in Molecular Biology, segunda edição, Ausubel et al eds. John Wiley & Sons, 1992. 0 método da invenção compreende ainda o passo de transformar a molécula de ácido nucleico mutagenizado nas células hospedeiras. A transformação pode ser através de qualquer método adequado e estes são conhecidos do especialista. Exemplos incluem o método de choque térmico por calor. É preferido que a referida transformação seja 19 ΡΕ1844144 realizada utilizando electroporação. 0 passo de transformar o produto mutagenizado pode ser realizado directamente após o passo (d) , ou podem existir passos intermédios entre o passo (d) e a transformação numa célula hospedeira. Numa forma de realização preferida discutida abaixo, a transformação numa célula hospedeira é utilizada para seleccionar preferencialmente a cadeia complementar mutada em relação à molécula parental não mutada. 0 método da invenção pode compreender um passo realizado em condições tais que a cadeia complementar contendo as mutações seja preferencialmente seleccionada. Essa selecção preferencial da cadeia complementar pode resultar da digestão preferencial da molécula parental, ou da sobrevivência preferencial da cadeia complementar numa célula hospedeira. A molécula parental pode conter modificações de modo a que a cadeia complementar seja preferencialmente seleccionada. 0 método da invenção pode ainda compreender o passo de introdução das referidas modificações. Nas formas de realização preferidas, as modificações na molécula parental incluem a introdução de dU em vez de dT. Quando o método compreende ainda o passo de introdução dessas mutações, é entendido que isto inclui formas de realização nas quais a molécula parental contém essas modificações inicialmente e são introduzidas outras modificações neste passo e formas de realização nas quais não existem modificações inicialmente e qualquer uma dessas modificações é introduzida por este passo. 20 ΡΕ1844144 A situação em que dU substitui dT pode ser explicada como se segue. A molécula parental é cultivada numa estirpe de E. coli que suporta a introdução de uracilo, e.g., uma estirpe duf ung tal como CJ236 (Kunkel et ai., (1985) PNAS USA, Vol 82, pp 488-492; Sidhu et al., Phage Display for the Selection of Novel Binding Peptides, Methods in Enzymology 2000, Volume 238, página 333-363). De acordo com estes protocolos, a molécula parental é multiplicada em E. coli na forma de fagemideo. O DNA de cadeia simples contendo uracilo é extraído por métodos convencionais (e.g., o kit Qiagen M13 Spin Prep) . Após o emparelhamento do iniciador mutagénico com o DNA de cadeia simples contendo uracilo, a cadeia complementar é sintetizada (é utilizado dT na reacção de síntese em vez de dU) . Isto resulta numa molécula de DNA de heteroduplex, na qual uma cadeia (a cadeia parental) contém dU e não contém as mutações desejadas e a segunda cadeia (a cadeia complementar sintetizada no passo (d) ) contém dT- e não contém as mutações. A molécula resultante é então transformada num hospedeiro de E. coli que não suporta a presença de uracilo, e.g., um hospedeiro dut+ ung+ tal como as JM101. Deste modo, a cadeia complementar contendo a mutação é replicada de preferência na cadeia parental não contendo as mutações (a cadeia parental, contendo dU, é hidrolisada por uracilo-glicosilase no hospedeiro dut+ ung+) .

Outros métodos de selecção incluem a utilização 21 ΡΕ1844144 de metilação. A molécula parental será metilada em quase todas as estirpes de E. coli. No passo (d), pode ser sintetizada uma cadeia complementar in vitro que não é metilada, resultando num heteroduplex compreendendo uma cadeia parental metilada que não contém as mutações e uma cadeia complementar não metilada que contém as mutações. 0 heteroduplex é então digerido com a enzima de restrição Dpnl, que corta DNA de cadeia dupla no sitio 5'-Gm6ATC-3' e é especifico para DNA metilado ou hemimetilado. Deste modo, a cadeia parental é digerida e a cadeia complementar contendo as mutações não é. Podem ser utilizadas enzimas alternativas, e.g., diferentes de Dpnl.

Como outra possibilidade para o método de selecção, pode ser utilizado um gene condicionalmente letal. Um exemplo é codB, também conhecido como o gene de "controlo da morte celular". Este gene pode ser inserido na molécula parental na região que seria substituída após a reacção de mutagénese. a molécula parental seria preparada a partir de uma estirpe de E. coli que não é susceptível a este gene. A reacção de mutagénese iria então substituir o gene ccdB com o gene de interesse. As moléculas parentais não mutadas, que ainda expressam ccdB irão fazer com que os seus hospedeiros de E. coli morram. Assim, as moléculas mutadas que resultam da reacção de mutagénese são seleccionadas.

Podem ser utilizados outros sistemas adequados e enzimas selectivas desde que eles envolvam a quebra 22 ΡΕ1844144 selectiva, da cadeia parental do heteroduplex. Exemplos incluem endonucleases e endoglicosilases.

Deste modo, o método envolve a utilização de uma molécula parental de cadeia simples compreendendo a modificação dos nucleótidos (e.g., dU substitui dT) . A síntese da cadeia complementar iniciada a partir do iniciador mutagénico produz uma cadeia mutada sintetizada de novo que não inclui essas modificações (e.g., utilizando dTTP em vez de dUTP na reacção de síntese). A cadeia mutada não modificada, sintetizada de novo, é preferencialmente seleccionada (e.g., através da transformação da molécula de heteroduplex numa célula hospedeira que suporta a replicação apenas da cadeia mutada, não modificada, sintetizada de novo, ou por digestão da cadeia parental com uma enzima selectiva). A invenção proporciona ainda um método em que a referida selecção preferential é realizada através da transformação da referida molécula de forma circular do passo (d) numa célula hospedeira que é selectiva para a cadeia complementar, não modificada, (a cadeia sintetizada de novo, não modificada, mutada).

Assim, numa forma de realização, a invenção proporciona um método de introdução de uma ou mais mutações numa molécula de ácido nucleico compreendendo os passos seguintes: 23 ΡΕ1844144 (a) sintetizar (preferencialmente por PCR) um iniciador mutagénico de uma molécula de ácido nucleico molde em que o referido iniciador mutagénico contém uma ou mais mutações em relação a uma molécula parental; (b) separar uma forma de cadeia simples do referido iniciador mutagénico; (c) emparelhar o referido iniciador mutagénico de cadeia simples a uma forma de cadeia simples da referida molécula parental, em que a referida molécula parental contém uma ou mais modificações seleccionáveis; (d) sintetizar uma cadeia complementar do referido iniciador mutagénico de modo a produzir uma molécula de ácido nucleico de forma circular que não contém as referidas modificações; (e) realizar um passo de selecção de modo a que a cadeia complementar seja seleccionada de preferência com a molécula parental. 0 método da invenção pode ser aplicado a populações de moléculas. Assim, uma população de moléculas pode ser mutada utilizando o método acima, ou uma população de sequências pode ser inserida num vector apropriado para rastreio (e.g., rastreio de expressão).

Por exemplo, o método pode ser utilizado para criar uma biblioteca de moléculas. Deste modo, podem ser utilizados iniciadores mutagénicos múltiplos para mutar um vector adequado para produzir uma biblioteca de produtos. Também poder ser utilizada mutagénese combinatória 24 ΡΕ1844144 utilizando iniciadores mutagénicos múltiplos e moléculas parentais múltiplas para produzir uma biblioteca com permutações extensa. Por exemplo, moléculas parentais múltiplas com uma variação na primeira posição em que a molécula pode ser utilizada na reacção de mutagénese, juntamente com iniciadores mutagénicos múltiplos que introduzem mutações na segunda posição, criando desse modo uma biblioteca extensa como resultado da combinação ou permutação das variações na primeira e segunda posições. Isto é exemplificado, pelo exemplo 1 e ilustrado esquematicamente na Figura 6. 0 método também pode ser utilizado para facilitar o rastreio de uma população de moléculas. Por exemplo, uma população de mutagénicos iniciadores pode ser derivada de uma população de moléculas molde. Esta população pode ser então introduzida em e.g., um vector comum, tal como um vector de expressão para rastreio. Isto é exemplificado no exemplo 2.

Assim, o método pode ser aplicado a populações de moléculas, e.g., no rastreio de uma população de moléculas ou na subclonagem de uma população de moléculas para criar uma biblioteca. Assim, pode existir uma pluralidade de moléculas de iniciadores mutagénicos, molde e/ou parentais. Essas populações podem ter pelo menos 1000 moléculas de comprimento, mais preferencialmente pelo menos 104, mais preferencialmente pelo menos 105, mais preferencialmente pelo menos 106, mais preferencialmente pelo menos 107, mais 25 ΡΕ1844144 preferencialmente pelo menos 108, mais preferencialmente pelo menos 109, mais preferencialmente pelo menos IO10, mais preferencialmente pelo menos 1011, mais preferencialmente pelo menos 1012, mais preferível pelo menos 1013.

As vantagens associadas com a aplicação do método da invenção às populações, especialmente bibliotecas, são baseadas em parte, no facto de as sequências do iniciador mutagénico não necessitarem de ser conhecidas no inicio do protocolo. 0 conhecimento de uma região ou regiões curtas comuns nas moléculas molde (e.g., uma sequência conhecida que está confinada uma região de variabilidade, ou uma sequência conhecida num vector que contém a molécula molde(s)) permite conceber os iniciadores iniciais. Estes iniciadores iniciais podem por isso ser utilizados para amplificar uma população de moléculas total que possuem regiões variáveis, assim como as regiões comuns às quais os iniciadores iniciais estão dirigidos. De igual modo, pode ser inserida uma população de moléculas numa molécula parental comum (e.g., um vector) para o rastreio, tal como rastreio de expressão, desde que exista uma região de complementaridade entre o iniciador mutagénico e a molécula parental. Esta região de complementaridade pode ser a mesma que, ou parcialmente a mesma que, a região à qual os iniciadores iniciais foram dirigidos na molécula molde.

Assim, no método da invenção, podem existir moldes múltiplos, ou formas múltiplas do molde. Por exemplo, o molde pode ser uma biblioteca de diferentes 26 ΡΕ1844144 moléculas contidas num vector, e.g., um plasmídeo. Assim, iniciadores mutagénicos múltiplos produzidos a partir de uma tal biblioteca podem ser então utilizados para produzir vários produtos mutagenizados de forma circular, porque cada um dos iniciadores mutagénicos múltiplos introduz diferentes mutações na molécula parental quando a cadeia complementar é sintetizada no passo (d) . Quando estes produtos múltiplos são transformados num hospedeiro adequado, e.g., um hospedeiro bacteriano, tal como E. coli, cada colónia resultante contém o produto que resulta de um dos iniciadores mutagénicos múltiplos.

Quando se querem introduzir múltiplos iniciadores mutagénicos diferentes de uma biblioteca, e.g., uma biblioteca de plasmídeos, então os iniciadores iniciais utilizados para sintetizar o iniciador mutagénico são seleccionados de modo a serem complementares a uma região do vector, que é normalmente comum com a biblioteca. Assim, os moldes múltiplos podem compreender uma região de variabilidade e uma região que é comum entre os moldes múltiplos. Por exemplo, a região de variabilidade pode ser uma região randomizada de ácidos nucleicos que é adjacente às regiões que não são randomizadas. Noutro exemplo, a região de variabilidade pode ser produzida através de inserções múltiplas que foram introduzidas em moléculas múltiplas do mesmo vector base. Os iniciadores iniciais são por isso seleccionados para serem complementares a uma região no molde que fica fora da região de variabilidade, e.g., complementar à totalidade ou a parte da região não 27 ΡΕ1844144 randomizada do molde, ou a parte do vector base. Deste modo, podem ser produzidos iniciador mutagénicos múltiplos numa sintese de reacção utilizando os mesmos iniciadores iniciais.

Alternativamente ou adicionalmente, podem existir moléculas parentais múltiplas. Assim, no passo (c), o iniciador mutagénico pode ser emparelhado com moléculas múltiplas parentais diferentes. Quando existem iniciadores mutagénicos múltiplos, como descrito anteriormente, estes podem também ser emparelhados com moléculas parentais múltiplas. Assim, pode resultar um efeito combinatório, no qual os iniciadores mutagénicos múltiplos são emparelhados a moléculas parentais múltiplas com a produção de combinações de iniciadores mutagénicos e moléculas parentais.

Assim, o método da invenção pode incluir moléculas parentais múltiplas e/ou moléculas de iniciador mutagénico múltiplas.

Isto tem a vantagem de poder ser utilizado para grandes repertórios de moléculas parentais e/ou moldes, e.g. para combinar grandes repertórios de moléculas parentais e/ou moldes. Tamanhos de repertórios preferidos são pelo menos 100 moléculas parentais e/ou moldes, mais preferencialmente pelo menos 1000, ainda mais preferencialmente pelo menos 2500. 28 ΡΕ1844144

Utilizando a abordagem combinacional podem ser produzidos grandes repertórios, e.g., após combinação das várias moléculas parentais com os vários iniciadores muta-génicos podem ser pelo menos 1000 produtos resultantes, mais preferencialmente pelo menos 104, mais preferencialmente pelo menos 105, mais preferencialmente pelo menos 106, mais preferencialmente pelo menos 107, mais preferencialmente pelo menos 108, mais preferencialmente pelo menos 109, mais preferencialmente pelo menos IO10, mais preferencialmente pelo menos 1011 , mais preferencialmente pelo menos 1012 , mais preferencialmente pelo menos 1013.

As mutações que podem ser introduzidas através deste método incluem substituições, deleções e adições. As mutações podem ser numa pluralidade de nucleótidos (mas podem também ser apenas num único nucleótido). Por exemplo, uma pluralidade de substituições pode ser produzida na molécula parental pelo iniciador mutagénico, ou vários nucleótidos podem ser eliminados, ou adicionados. Combinações dos diferentes tipos de mutações são também possíveis. Assim, pode existir uma combinação de substituições e deleções, uma combinação de substituições e adições, uma combinação de adições e deleções, ou uma combinação de adições, deleções e substituições.

Existem também regiões múltiplas de mutações, e.g., duas regiões nas quais um ou mais nucleótidos são substituídos, separados por uma região na qual não é produzida alteração pelo iniciador mutagénico (porque na 29 ΡΕ1844144 sua região intersticial, há complementaridade entre o iniciador mutagénico e a molécula parental).

Outras possibilidades incluem: regiões múltiplas, nas quais um ou mais nucleótidos são substituídos, separadas por regiões de complementaridade; regiões múltiplas nas quais são adicionados ou mais nucleótidos, separadas por regiões de complementaridade; regiões múltiplas nas quais são eliminados um ou mais nucleótidos, separadas por regiões de complementaridade. São também possíveis combinações. Assim, podem existir: uma ou mais regiões nas quais os nucleótidos são substituídos e uma ou mais regiões nas quais os nucleótidos são adicionados, separadas por regiões de complementaridade; uma ou mais regiões nas quais os nucleótidos são substituídos e uma ou mais regiões nas quais os nucleótidos são eliminados, separados por regiões de complementaridade; uma ou mais regiões nas quais os nucleótidos são eliminados e uma ou mais regiões nas quais são adicionados nucleótidos, separadas por regiões de complementaridade; e uma ou mais regiões nas quais são substituídos nucleótidos, uma ou mais regiões nas quais são adicionados nucleótidos, e uma ou mais regiões nas quais são eliminados nucleótidos, separadas por regiões de complementaridade. A natureza e o número das mutações são determinados pelo número e pela natureza dos desemparelhamentos, como entre a molécula parental e o iniciador mutagénico. Assim, quando há uma adição de um único nucleótido no 30 ΡΕ1844144 iniciador mutagénico comparado com a molécula parental, então será adicionado um único nucleótido em virtude da reacção de mutagénese. Quando existem regiões dispersas de desemparelhamento no iniciador mutagénico comparado com a molécula parental (e.g., regiões dispersas de adições, deleções e substituições como referido acima), isto resultara em regiões dispersas de mutações correspondentes, como um resultado da reacção de mutagénese. Os iniciadores mutagénicos podem substituir zonas de nucleótidos na molécula parental. Por exemplo, o iniciador mutagénico pode conter uma região de 7 0% de complementaridade com a molécula parental e deste modo, após a reacção de mutagénese, esta região na molécula parental é substituída pela região de 70% de complementaridade do iniciador mutagénico.

De modo a que o iniciador mutagénico possa emparelhar, deve existir um grau de complementaridade entre o iniciador mutagénico e a molécula parental. Existiriam tipicamente regiões mínimas de complementaridade nas extremidades do iniciador mutagénico. Quando o iniciador mutagénico foi produzido por PCR e os iniciadores iniciais (definidos acima) são complementares à molécula parental, estão estes proporcionam uma região mínima de 18 até 25 pares de bases de complementaridade nas extremidades do iniciador mutagénico. O grau de complementaridade sobre a totalidade do iniciador mutagénico é preferencialmente pelo menos 60%, mais preferencialmente pelo menos 70% mais preferencial- 31 ΡΕ1844144 mente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 95%, mais preferencialmente pelo menos 97%, mais preferencialmente pelo menos 98%, mais preferencialmente pelo menos 99 %. A titulo de exemplo, pelo menos 97% de complementaridade corresponde a 20 desemparelhamentos num iniciador mutagénico que tem 830 nucleótidos de comprimento (810 complementares). Pelo menos 60% de complementaridade corresponde a uma região de desemparelhamento no iniciador mutagénico que tem 730 nucleótidos de comprimento e é 70% idêntico à molécula parental num iniciador mutagénico que tem 830 nucleótidos de comprimento (sendo as duas extremidades em qualquer dos lados da "região de 70%" perfeitamente complementar à molécula parental). Exemplos não limitantes dos iniciadores mutagénicos são apresentados nas figuras. O iniciador mutagénico pode ter desde 100 nucleótidos até 4000 nucleótidos de comprimento, preferencialmente 200 até 3000 nucleótidos, mais preferencialmente 300 até 2000 nucleótidos, mais preferencialmente 400 to 1500 nucleótidos, mais preferencialmente 400 até 1000 nucleótidos, ainda mais preferencialmente 400 até 850 nucleótidos de comprimento ou 800 até 1500 nucleótidos de comprimento. O tamanho do iniciador mutagénico pode depender do tamanho da molécula parental. Por exemplo, quando a molécula parental tem 5,5 kb o iniciador mutagénico tem preferencialmente até 1 kb. Assim, o iniciador mutagénico tem preferencialmente cerca de 1/50 até 1/5 do tamanho da 32 ΡΕ1844144 molécula parental, mais preferencialmente 1/25, mais preferencialmente 3/10 o tamanho da molécula parental, com a máxima preferência cerca de 1/5 do tamanho da molécula parental em nucleótidos de comprimento. É preferido que a proporção molar de iniciador mutagénico para molécula parental no passo (c) seja de cerca de 2:1 até 5:1, muito preferencialmente cerca de 3:1.

As aplicações do método da invenção incluem o rastreio ou criação de bibliotecas, em particular bibliotecas de anticorpos. Por exemplo, a molécula parental pode ser um vector para a expressão de anticorpos ou domínios de anticorpo. Tendo introduzido mutações na molécula parental (por exemplo produzindo iniciadores mutagénicos a partir de um molde compreendendo uma biblioteca de domínios de anticorpo), as moléculas parentais mutadas resultantes podem ser expressas num hospedeiro adequado e rastreadas contra um antigénio apropriado (para mais informação, ver Vaughan et al., (1996) Nature Biotechnology, Volume 14, pp 309 até 314; e Edwards et al., (2003). J. Mol. Biol, 334, pp 103-118).

Outros exemplos relacionados com anticorpo incluem a subclonagem dos domínios de anticorpo num plasmídeo aceitador de imunoglobulina, e.g., um plasmídeo aceitador de IgG (tal como um vector de expressão de IgG pEU, ver Persic et al. (1997) Gene 187:9-18. O termo anticorpo descreve uma imunoglobulina e inclui as versões natural e sintética. O termo compreende os polipéptidos que possuem 33 ΡΕ1844144 um domínio de ligação ao anticorpo, que é, ou é substancialmente homólogo a, um domínio de ligação ao anticorpo. Exemplos incluem, Fab (domínios VL, VH, CL e CHI), scFv (domínio VH e domínio VL ligado por um ligante, tal como (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser) 3, e.g., Bird et al (1988),

Science, 242, 423-426, Huston et al. (1988), PNAS USA, 85 pp 5879-5883 Fv (domínios VL e VH de um único anticorpo) , Fd (domínios VH e CHI); dAb (Holt et al (2003), Trends in Biotech. 21 pp484-490) e diacorpos (WO94/13804).

Por isso, em certas formas de realização, a molécula parental, molde ou iniciador mutagénico compreende sequências que codificam um domínio variável de anticorpo. O domínio variável do anticorpo pode ser um domínio VH ou VL. Preferencialmente, a molécula parental compreende um scFv.

Quando um anticorpo, ou domínio de anticorpo é aqui referido no contexto de ácido nucleico como vectores, entende-se que se refere à sequência de ácido nucleicos que codifica esse anticorpo ou domínio. O método pode também ser utilizado para baralhar os domínios de anticorpo para criar repertórios de anticorpo. Por isso, a molécula parental pode conter um domínio de anticorpo VH e a molécula de iniciador mutagénico pode conter um domínio de anticorpo VL, ou a molécula parental pode conter um domínio de anticorpo VL e a molécula de iniciador mutagénico pode conter um domínio de 34 ΡΕ1844144 anticorpo VH. Uma biblioteca de dominios de anticorpo VH pode ser combinada (baralhada) com uma biblioteca de dominios de anticorpo VL, ou vice-versa. Por isso, uma das duas bibliotecas pode ser utilizada como o molde para formar iniciadores mutagénicos múltiplos e a outra biblioteca pode estar presente como uma biblioteca em moléculas parentais múltiplas.

Assim, a invenção proporciona um método no qual a molécula parental contém um dominio de anticorpo VH e um domínio de anticorpo VL e a molécula de iniciador mutagénico contém um domínio de anticorpo VL para mutar o domínio VL da molécula parental. A invenção também proporciona um método no qual a molécula parental contém um domínio de anticorpo VL e em domínio de anticorpo VH e a molécula de iniciador mutagénico contém um domínio de anticorpo VH para mutar o domínio de anticorpo VH na molécula parental. Deste modo, a biblioteca de domínios de anticorpo VH pode ser combinada (baralhada) com uma biblioteca de domínios de anticorpo VL, ou vice-versa.

Pode ser desejado que apenas um dos domínios VL e VH da molécula parental seja mutado, ou pode ser desejável que ambos os domínios VL e VH da molécula parental sejam mutados. São também contemplados sistemas de domínio único, e.g., nos quais as construções contêm um domínio VL (mas não o domínio VH) e que o domínio VL é mutado por um iniciador mutagénico VL, ou e.g., nos quais a construção contém um domínio VH (mas não um domínio VL) e que o 35 ΡΕ1844144 domínio VH é mutado por uma iniciador mutagénico VH. A invenção proporciona todas estas possibilidades.

Assim, a invenção compreende a situação na qual ambos os domínios VH e VL na molécula parental serão mutados através de iniciadores mutagénicos contendo cada um desses domínios. Assim, um iniciador mutagénico VH iria mutar o domínio VH na molécula parental e um iniciador mutagénico VL iria mutar o domínio VL na molécula parental. Um único iniciador mutagénico contendo ambos esses domínios também pode ser utilizado. A invenção proporciona por isso um método, em que o primeiro e segundo iniciadores mutagénicos são utilizados para mutar a molécula parental, contendo o primeiro iniciador mutagénico contendo um domínio de anticorpo VH para mutar o domínio VH na molécula parental e o segundo iniciador mutagénico contendo um domínio de anticorpo VL para mutar o domínio VL na molécula parental. 0 primeiro e segundo iniciadores mutagénicos pode ser utilizado em passos separados de reacções de mutagénese, em cujo caso o primeiro e segundo iniciadores mutagénicos podem fazer parte em reacções separadas de mutagénese por essa ordem (i.e., o primeiro iniciador mutagénico pode ser utilizado numa reacção de mutagénese precedendo ou sucedendo a reacção de mutagénese que envolve o segundo iniciador mutagénico). Outra possibilidade é que os referidos primeiro e segundo iniciadores mutagénicos são utilizados no mesmo passo de reacção de mutagénese. 36 ΡΕ1844144

Os aspectos descritos acima em que o método da invenção é utilizado para combinar (ou baralhar) bibliotecas de domínios VH com bibliotecas de dominios VL no contexto do anticorpo pode ser aplicado a outros sistemas, nos quais é desejado baralhar as combinações de domínios, tais como outras moléculas relacionadas com as imunoglobulinas e para proteínas de multidomínio em geral. Assim, a invenção proporciona um método de combinar uma biblioteca de primeiros dominios com uma biblioteca de segundos dominios, como descrito acima para os aspectos do anticorpo (em que o primeiro domínio é o domínio VH e o segundo dominio é o domínio VL, ou vice-versa).

Em algumas formas de realização preferidas, a molécula parental compreende ácido nucleico que codifica um scFv. A presente invenção também proporciona kits para realizar os métodos acima mencionados. Por exemplo, um tal kit pode compreender iniciadores iniciais adequados para sintetizar a molécula de iniciador de cadeia simples de uma molécula molde, uma molécula parental de cadeia simples e instruções para utilização. A molécula parental pode ser modificada como aqui descrito. Também podem ser incluídos reagentes e tampões adequados, tal como aqueles aqui referidos. Outros componentes de kit como definido em qualquer uma das formas de realização do método da invenção também podem ser incluídos. 37 ΡΕ1844144

Como referido, os métodos e kits da invenção possuem várias aplicações, incluindo os seguintes. Os métodos podem ser utilizados em subclonagem, por exemplo, uma região de ácido nucleico pode ser criada pelo passo (a) e introduzida num vector apropriado pela reacção de mutagénese, evitando a necessidade de digestão e ligação do ácido nucleico. Por exemplo, pode ser clonado um antigénio alvo num vector de expressão. Os métodos podem ser aplicados à criação e rastreio de bibliotecas como mencionado acima. Utilidades mais especificas são delineadas abaixo.

Os métodos aqui descritos podem ser utilizados para converte fragmentos Fv de cadeia simples (scFv) (dominios VH e VL ligados como um péptido único, através de um ligante) nas moléculas IgG. Assim, os dominios VH e VL podem ser introduzidos nos plasmideos aceitadores de IgG_VH e IgG_VL. Utilizando iniciadores iniciais que são denominados oligonucleótidos genéricos, dirigidos a partes não variáveis do vector que contêm o scFv, ou para o ligante entre os dois dominios (e.g., um iniciador inicial que é dirigido à sequência a jusante ou a montante de cada um dos dominios e um segundo iniciador inicial que é dirigido ao ligante entre os dois dominios) . Por exemplo, se forem utilizados os scFvs descritos em Vaughan et al, um dos iniciadores iniciais pode ser dirigido à sequência a montante do dominio VH em pCantabô e o outro para o ligante (i.e., dirigido a parte da sequência que codifica (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser) 3) . 38 ΡΕ1844144

Os métodos da invenção podem também ser utilizado para criar bibliotecas naive (i.e., bibliotecas de dadores humanos não imunizados). Presentemente, estes são criados realizando PCR de regiões de anticorpo naive VH e VL de dadores humanos não imunizados, seguido por digestão de restrição e ligação em plasmideos aceitadores. Utilizando o método da invenção, os iniciadores mutagénicos podem ser separados destes produtos de PCR derivados dos dadores não imunizados. Novamente, a utilização dos métodos acima mencionados remove a necessidade de restrição e ligação. Os iniciadores adeguados podem ser baseados em seguências a cada extremidade da cadeia pesada e cada extremidade da cadeia leve (ver, por exemplo, Vaughan et al., supra).

Aspectos e formas de realização da invenção serão agora ilustrados a titulo de exemplos e com referência às seguintes figuras, nas quais:

Lista de Figuras A Figura 1 apresenta os iniciadores mutagénicos para utilização no método da invenção. Nesse caso, os números são o número aproximado de bases e a região de desemparelhamento está a cinzento. A Figura la apresenta o iniciador mutagénico 1, utilizado no exemplo 1 (recombi-nação VH/VL) . A Figura lb apresenta o iniciador mutagénico 2a, utilizado no exemplo 2 (Ribosome Display subclonagem) 39 ΡΕ1844144 para as variantes VHCDR3. A Figura lc apresenta o iniciador mutagénico 2b, utilizado no exemplo 2 para as variantes VLCDR3. A Figura ld apresenta um iniciador mutagénico para produzir as variantes VH ou VL. A região a cinzento é cerca de 70% idêntica ao molde do exemplo 2. A Figura le apresenta iniciadores mutagénicos para clonagem num plasmideo aceitador de IgG. A Figura lf apresenta iniciadores mutagénicos para clonagem em plasmídeos aceitadores de VH e VL para a criação de bibliotecas naive. A Figura 2 apresenta a posição dos iniciadores iniciais para a sintese do iniciador mutagénico para a utilização nas formas de realização de recombinação Vh/Vl (e.g., exemplo 1) . A e B apresentam os iniciadores em sentido directo e reverso, respectivamente. A Figura 3 apresenta a posição dos iniciadores iniciais para a sintese do iniciador mutagénico para a utilização nos aspectos de apresentação de ribossoma (e.g., exemplo 2) . A e B apresentam os iniciadores em sentido directo e reverso, respectivamente. A Figura 4 apresenta os resultados do processo de mutagénese do exemplo 1. A Figura 5 é uma apresentação esquemática do processo de mutagénese da invenção. Na representação esquemática, o VHCDR3 de um plasmideo contendo scFv, 40 ΡΕ1844144 contendo uma mutação particular no VHCDR3 (apresentado por um asterisco) é amplificado por PCR e separado na forma de cadeia simples em virtude da biotina ser introduzida pelos iniciadores na reacção de PCR. O DNA de cadeia simples é purificado a partir de um plasmideo contendo scFV, que contém uma mutação particular no VLCDR3 (também apresentado por um asterisco). Na reacção de mutagénese entre o produto de PCR de cadeia simples contendo a mutação VHCDR3 e o plasmideo de cadeia simples contendo a mutação VLCDR3 as duas mutações tornam-se combinadas para produzir um plasmideo contendo scFv que contém ambas as mutações. A Figura 6 apresenta uma forma de realização combinatória da invenção. No topo da figura são apresentadas moléculas molde múltiplas que contêm as mutações a, b e c. As regiões destas moléculas contendo as mutações são amplificadas por PCR e separadas em iniciadores de mutagénese múltiplos de cadeia simples utilizando biotina. No fundo da figura são apresentadas moléculas parentais múltiplas que contêm as mutações x, y e z. É produzido DNA de cadeia simples a partir destas moléculas, de modo a resultar em moléculas parentais múltiplas contendo cada uma as mutações x, y ou z. Na reacção de mutagénese, os iniciadores mutagénicos contendo as mutações a, b e c são utilizados para mutar as moléculas parentais múltiplas. Isto resulta na combinação de produtos apresentada no lado direito da figura. 41 ΡΕ1844144 EXEMPLOS :

Exemplo 1: Método de Mutagénese para Recombinar Regiões VH e VL Optimizadas 1. Visão geral do método A recombinação de regiões VH e VL optimizadas demonstrou conduzir a aumentos na potência durante a maturação da afinidade de anticorpo in vitro (Osbourn et al., (1996), Immunotechnology, Vol 2, pp 181-196). Neste exemplo, o método de mutagénese da invenção é utilizado para recombinar uma mistura de variantes em gue o VHCDR3 foi randomizado com outra mistura de variantes em gue o VLCDR3 foi randomizado. Ambas as misturas de variantes contêm a mesma sequência de anticorpo original, excepto para as regiões curtas de randomização no VH e VL CDR3. Após a randomização, as misturas de VH e VL sofreram duas rondas de selecção de apresentação em fago para afinidade melhorada. Os resultados de VH e VL da selecção da ronda dois contendo, cada um, uma estimativa de 105 até 106 sequências variantes diferentes, formam o ponto de partida para o método de recombinação descrito neste exemplo.

No método deste exemplo, a mistura de VH é amplificada por PCR utilizando o oligonucleótido biotini-lado PAMA-IN na extremidade 5' e o oligonucleótido H-LINK na extremidade 3' (ver Figura 2). Após a captura em esferas de estreptavidina, a cadeia não biotinilada é eluida e isto forma o iniciador mutagénico. 42 ΡΕ1844144 A mistura de VL é preparada como plasmídeos de cadeia simples, após resgate de partículas de bacteriófagos a partir da estirpe de E. coli dut~ ung~ CJ236. Colocando o iniciador mutagénico que codifica VH juntamente com os plasmídeos de cadeia simples que representam a mistura VL, a recombinação das regiões VH e VL pode ocorrer. 2. Design de Oligo 0 DNA molde dU-ss isolado a partir de M13 tem cadeia positiva de modo que o iniciador mutagénico é complementar à cadeia positiva (i.e. é cadeia negativa). Através da biotinilação do iniciador em sentido directo, a cadeia negativa pode ser eluída após a captura em estreptavidina. Os oligonucleótidos utilizados são como se segue (5' para 3'):-

Bio-PAMA-IN: biotina-GCGGCCCAGCCGGCCATGG

H-LINK: ACCGCCAGAGCCACCTCCGCC 3. Preparação de Resultados VL como DNA de Plasmideo ds 1. 0 stock de glicerol do repertório VL em pCantabô (Vaughan et al) foi inoculado com 100 yL em 50 mL de 2xTYA num frasco cónico pequeno. 43 ΡΕ1844144 2. A cultura foi cultivada durante 2 horas a 37°C e 300 rpm. 3. As células foram sedimentadas por centrifugação em tubos Falcon de 50 mL a 3200 rpm durante 10 minutos. 4. 0 protocolo do Qiagen HiSpeed Plasmid Midi Kit foi realizado para isolar DNA de plasmídeo ds em 1 mL de água. 5. A concentração de DNA foi monitorizada por espectrometria de UV ou gel de agarose. 4. Preparação de DNA Molde dU-ss O DNA de Plasmideo ds da parte 3 foi então utilizado no seguinte protocolo:

Reagentes:

Midiprep de plasmideo do repertório de VL em pCantabô (Vaughan et al)

Cloranfenicol (CAM) a 10 mg/mL em etanol e armazenar a -20°C

Uridina (Sigma U-6381) a 0,25 mg/mL em água e armazenar a 4°C

Placas 2xTYAG ( + 10 yg/mL CAM) : (TY é como descrito em Sambrook et al, supra mais 100 44 ΡΕ1844144 pg/mL de ampicilina (A) e 2% de glucose (G) cloranfenicol (CAM) é adicionado a 20 pL de stock a 80 pL de etanol e espalhado numa placa).

Preparação de CJ236 competentes com CaCl2 1. 5 mL de meio 2xTY (mais 10 pg/mL CAM) é inoculado com uma colónia isolada de células de E. coli CJ236 (e. g, fornecido por Biorad) . As células foram cultivadas durante a noite a 37°C a 300 rpm. CAM selecciona epissoma F' em CJ236. 2. 500 mL de 2xTY foram inoculados com 5 mL da cultura durante a noite e incubados com agitação a 37 °C. 3. Quando a DO a 600 nm alcançou 0,9 a cultura foi recolhida por centrifugação a 4°C (5 min, 5 000 rpm) . O sobrenadante foi vertido e eliminado e o sedimento celular foi drenado. As células foram ressuspensas suavemente em 100 mL de MgCl2 a 100 mM gelado. 4. As células foram novamente recolhidas por centrifugação (centrifuga a 4°C) e os sedimentos foram drenados. As células foram ressuspensas suavemente em 20 mL de CaCl2 a 100 mM frio até ser obtida uma suspensão macia. Foi adicionado 200 mL de CaCl2 a 100 mM frio e misturado. As células foram colocadas no gelo durante 30-90 mins. 5. As células foram recolhidas por centri- 45 ΡΕ1844144 fugação numa centrífuga fria e os sedimentos foram drenados. As células foram ressuspensos em 20 mL de CaCl2 a 85 mM frio e glicerol a 15%. 6. A suspensão celular foi dividida em fracções imediatamente (as fracções podem ser congeladas em gelo seco/etanol se necessário).

Transformação do molde em CJ236 1. As células CJ236 competentes com CaCl2 de acima foram descongeladas em gelo (e foram mantidas em gelo ao longo do protocolo). 2. Foi adicionado 5 pL de plasmideo pCantabô contendo o repertório de VL da secção 3 a 100 pL de células competentes num tubo de PCR. 3. O seguinte programa foi corrido no bloco da máquina de PCR: 0,1°C durante 30 min 42°C durante 45 s 0,1°C durante 2 min 4. As células foram transferidas para um tubo Falcon de 15 mL em 0,5 mL de 2xTY. 46 ΡΕ1844144 5. As células foram incubadas a 37°C durante 45-60 min com agitação a 200 rpm. 6. Foram plaqueados 0,5 mL de células em placas de 2xTYAG ( + 10 yg/mL CAM) e as placas foram incubadas durante a noite a 37°C.

Recuperação de fagos de CJ236 e preparação de DNA 1. Um tapete que surge do passo 6 acima de transf ormantes de CJ236 foi raspado para 1 mL de 2xTY. Foram inoculados 500 yL em 50 mL de 2xTYGAC (i.e., glucose a 2%, AMP a 100 yg/mL, CAM a 10 yg/mL) e incubado a 37°C e 300 rpm até uma DC>6oo= 0,5 até 1. 2. A densidade celular foi calculada a partir da leitura de DO (ϋΟεοο de l=5xl0s células/mL) e foram adicionados fagos helper de tipo selvagem K07 (Amersham Biosciences M13 K07 Helper phage) para assegurar uma multiplicidade de infecção (MOI) de 10 fagos: 1 célula (o stock de K07 selvagem contém normalmente 1010 fagos em 0,33 yL) . As células foram então incubadas a 37°C (sem agitação) durante 10 minutos para permitir a infecção. 3. Foi transferido 1 mL de cultura para 30 mL de 2xTYAC suplementado com 25 yg/mL KAN (para seleccionar K07) e 0,25 yg/mL de uridina (para permitir a síntese de molde contendo uracilo) . Este foi incubado durante a noite a 37°C a 300 rpm. 47 ΡΕ1844144 4. As células foram centrifugadas durante 10 mins a 15 000 rpm a 2°C num rotor SS-34. 0 sobrenadante foi transferido para um tubo fresco e foi adicionado 1/5 do volume de PEG-NaCl (20% PEG8000, 2,5 M NaCl). Isto foi incubado durante 5 mins à temperatura ambiente e depois centrifugado durante 10 mins a 10 000 rpm a 2 °C no SS-34. 5. Foi produzido um sedimento de fagos branco. 0 sobrenadante foi decantado e o tubo foi invertido sobre papel absorvente para drenar. 0 sedimento do fago foi ressuspenso em 0,5 mL de PBS (as paredes do tubo foram enxaguadas para capturar tantos fagos quanto possível). Os fagos foram transferidos para os tubos eppendorfs e centrifugados durante 5 mins a 15 OOOrpm num tubo de microcentrí fuga para sedimentar a matéria que permanece insolúvel. O sobrenadante foi transferido para um novo eppendorf. 6. O DNA molde dU-ss foi purificado utilizando um kit Qiagen Qiaprep Spin M13 kit, começando com a adição do tampão Qiagen MP (Sidhu et ai, supra) . O DNA foi eluído em 100 yL de Tris-HCl a 10 mM, pH 8,0 e examinado num gel de agarose a 1%. A preparação de DNA ss correu como uma banda distinta a 2,5 kb e foi utilizada na reacção de mutagénese na secção 6. 48 ΡΕ1844144

5. Preparação de Iniciador mutagénico de ssDNA do repertório VH A região que representa o repertório de diferentes sequências VH foi amplificada a partir de pCantab 6 por PCR utilizando os oligonucleótidos bio-PAMA-IN e H-LINK. Podem ser utilizadas condições de PCR convencionais numa série de diluições da midiprep de molde preparada na secção 3.

Abgene (2x) Mastermix 25 pL

Midiprep de molde 1 pL [puro, ΙΟ”1, 10”1 2, 10” 3, ΙΟ”3, ΙΟ”5, IO”6, nenhum]

Bio-PAMA-IN 1 pL H-LINK 1 pL Água 22 pL 5 pL de cada PCR foram separados num gel de agarose a 1% (isto confirmou o tamanho do produto, apresentou o rendimento, etc). 1. Foi colocada num suporte magnético uma coluna microMACS (Miltenyi Biotec: 130-042-701). 1

Foi deixado fluir 250 pL de tampão de 2

ligação a lx (tampão de ligação a 2x: 10 mM Tris pH 3 7,5, 2 M NaCl, 1 mM EDTA, 0,1% Tween 20). 49 ΡΕ1844144 3. Foi misturado 45 pL de reacção de PCR com 105 pL de esferas de estreptavidina microMACS (Miltenyi Biotec: 130-074-101) e 150 pL de tampão de ligação a 2 x e incubado durante dois minutos. 4. Foi aplicado DNA+esferas a uma coluna microMACS e deixado a fluir. 5. A coluna foi lavada com 2x1 mL de tampão de ligação a 1 x. 6. O DNA foi eluido para um eppendorf com 200 pL de NaOH a 0,1 N (preparado de fresco). 7. Ao DNA eluido foi adicionado 20 pL de acetato de sódio pH 5,2, 550 pL de etanol, 1 pL de glicogénio. 8. Isto foi incubado a -70°C durante 30 minutos. 9. Isto foi centrifugado a 13 000 rpm durante 10 minutos para sedimentar o DNA. O sobrenadante foi removido e substituído com 500 pL de etanol a 70%. 10. Isto foi centrifugado a 13 000 rpm durante mais 5 minutos, o sobrenadantes foi removido, 50 ΡΕ1844144 seco ao ar num bloco de aquecimento a 37°C durante 2 minutos. O DNA foi ressuspenso em 50 yL de água. 6. Reacção de mutagénese

Reagentes:

Tampão TM (lOx) : 500 mM Tris-HCl, 100 mM MgCl2, pH 7,5 ATP a 10 mM: (stock a 1 M produzido dissolvendo 0,6052 g em 1 mL de água e ajustando o pH para 7,0 com NaOH a 0,1 M.

Stock diluído 1:100 para produzir ATP a 10 mM - pode ser armazenado a -70°C) DTT a 100 mM: (stock a 1 M produzido dissolvendo 0,1542 g em 1 mL de acetato de sódio a 0,01 M (pH 5,2). Stock diluído 1:10 para produzir DTT a 100 mM - pode ser armazenado a - 20°C).

Enzimas: T4 polinucleótido cinase, T4 DNA ligase e T7 DNA polimerase de New England Biolabs (NEB). 25 mM dNTPs

Qiagen Qiaquick PCR purification kit (Qiagen)

Fosforilação do iniciador mutagénico

Foram adicionados os seguintes a um Eppendorf: iniciador mutagénico ssDNA 1,0 yg (1,0 yg/132 000 daltons =7,6 pmoles) 51 ΡΕ1844144

Tampão TM (lOx) 5,5 pL ATP a 10 mM 5 pL DTT a 100 mM 2,5 pL

Foi adicionada água para um volume total de 53 pL. Foram adicionados 2 pL (20 U) de T4 polinucleótido cinase (10 U/pL) e incubados durante 1 hora a 37°C.

Emparelhamento do iniciador mutagénico com o molde a uma proporção 3:1

Foram adicionados a um eppendorf os seguintes:

Molde dU-ssDNA (da Secção 4) 4,4 pg (4,4 ug/l 750 000 daltons =2,5 pmoles)

iniciador mutagénico fosforilado 1,0 pg (1,0 pg/132000 daltons =7,6 pmoles) Tampão TM (lOx) 25 pL

Foi adicionada água para um volume de 250 pL.

Os 250 pL foram incubadas a 90°C durante 2 mins, 50°C durante 3 mins e 20°C durante 5 mins para emparelhar o iniciador mutagénico com o molde.

Reacção de mutagénese À mistura de emparelhamento °ligo/molde, foram adicionados os seguintes: 52 ΡΕ1844144

10 mM de ATP 10 pL

25 mM de dNTP's 10 pL

100 mM de DTT 15 pL

30 unidades Weiss de T4 DNA ligase (6U/pL)* 5 pL 30 unidades de T7 DNA polimerase (lOU/pL)_3 pL *As unidades marcadas no tubo de enzima não são unidades Weiss - 6U/pL é a concentração correcta de actividade enzimática

As reacções foram incubadas a 20 °C durante 3 horas.

Cada reacção foi purificada por afinidade em 35 pL de água utilizando o Qiagen Qiaquick PCR purification kit. 1 pL de cada reacção foi separada num gel de 1% de agarose e comparada com o resultado para as reacções com e sem (2,5 kb para pCantabô) foi observado na pista 'sem iniciador'. Na pista 'sem iniciador' esta banda de ssDNA foi reduzida na intensidade e substituída por uma ou mais bandas largas que representam cccDNA (DNA circular covalentemente fechado) (>3kb para pCantabô) . 7. Electroporação de E.coli TG1 Células TG1 frescas electrocompetentes (Strata-gene) foram preparadas de acordo com o seguinte protocolo: 1. Um volume apropriado de meio 2TY foi inoculado com uma colónia a partir de uma placa de meio mínimo de TG1. As células foram cultivadas durante a noite a 25°C e 300 rpm. ΡΕ1844144 53 2. 5 frascos contendo 500 mL de 2TY foram, cada um, inoculados com 10 mL (por frasco) da cultura durante a noite. Esta foi cultivada a 25°C 300 -350 rpm até D060o -0,5-0,6) [isto leva cerca de 2-3 horas] 3. 6 x frascos de centrífuga de 500 mL e o rotor Sorvai SLA 3000 foram pré-arrefecidos a 2°C. 4. Uma vez atingida a DO óptima, as células foram arrefecidas durante 30 mins em gelo nos frascos de centrífuga e centrifugadas a 4 000 rpm durante 15 mins a 2°C. 5. O sobrenadante foi decantado e o precipitado ressuspenso num volume pequeno de água MilliQ autoclavada arrefecida em gelo. Isto foi preparado até -300 mL com água e centrifugado a 4 000 rpm durante 15 mins a 2°C. 6. O sobrenadante foi decantado e ressuspenso num volume pequeno da restante água e depois foram adicionados 300 mL e centrifugados como acima. 7. 8 x tubos Falcon de 50 mL foram pré-arrefecidos a -20°C. Uma centrífuga de bancada Sorvall foi pré-arrefecida a 2°C. 54 ΡΕ1844144 8. 0 sobrenadante foi decantado e o precipitado ressuspenso na restante água. 9. Uma vez ressuspenso, isto foi pipetado para os tubos Falcon e foram adicionados 50 mL de água. Isto foi centrifugado a 3 200 rpms durante 10 mins. 10. 0 sobrenadante foi removido e cada precipitado foi ressuspenso numa pequena quantidade de água, as células foram combinadas num tubo Falcon de 50 mL, preparadas até 50 mL com água e centrifugadas como acima. 11. O sobrenadante foi removido e as células ressuspensas no restante volume de água.

Para a electroporação foi utilizada uma série de diluições de células (apenas células) para determinar uma concentração adequada (e.g., diluições de células a 100%, 80%, 60% e 50%). As células apenas de controlo são plaqueadas em 2TYAG como confirmação de que não existem células resistentes a ampicilina na preparação de células competentes.

Os 35 pL totais da reacção de mutagénese terminada foram electroporados directamente em 400 pL de células TG1 electrocompetentes numa única cuvete (Bio-Rad E. coli Pulser cuvete de 0,2 cm de intervalo entre 55 ΡΕ1844144 eléctrodos; Cat N° 165-2086), utilizando as seguintes condições: 2,5 kV de intensidade de campo 200 Ω de resistência 25 yF de capacitância Tempo constante - 4,2 milisegundos

Imediatamente após electroporação, 1 mL de 2TYG foi adicionado à cuvete e as células foram transferidas para um tubo Falcon de 50 mL. A cuvete foi lavada com mais 1 mL de 2TYG para transferir as células do fundo da cuvete (com uma ponta de pipeta de P200 alongada) para o tubo Falcon. Este foi transferido para um incubador a 37°C e -150-250 rpm para permitir que as células recuperem durante 1 hora.

Uma série de diluições de cada biblioteca (cada tubo Falcon) foi plaqueada em placas pequenas de 2xTYAG para estimar o tamanho da biblioteca e as restantes células numa placa grande de 2xTYAG. As restantes células foram centrifugadas (3200rpm 10 mins) e ressuspensas em 1 mL de 2TYG antes de plaqueamento na placa grande. As placas foram incubadas durante a noite a 30°C. A biblioteca foi então raspada a partir da placa grande em 5 mL de 2xTY e depois suplementada com 2,5 mL de glicerol a 50%. A densidade celular foi calculada pelo teste a D06oo (DChoo de 1 = 5xl08 células/mL) de uma diluição 56 ΡΕ1844144 1:100. Para armazenamento, foram guardadas aliquotas múltiplas de cada biblioteca a -70°C, contendo cada aliquota um excesso de 10 vezes de células sobre o tamanho da biblioteca. Uma aliquota única pode ser descongelada e adicionada a 500 mL de cultura para captura da biblioteca como fago, e. g, para selecção de fagos por afinidade de ligação (Hawkins et al (1992) J.Mol.Biol, 226, pp889-896).

Os resultados deste método são os que se seguem, e são também apresentados na Figura 4:

Total de trans fo mentes N° de sequências analisadas % de Eficiência de mutagénese Tamanho da biblioteca de mutantes Biblioteca de recorribinação 1 lxl O10 47 83% (39/47) 8,3xl09 Biblioteca de recorribinação 2 3,9xl09 43 91% (39/43) 3,5xl09 EXEMPLO 2:Subclonagem dos resultados da apresentação em ribossoma

Este exemplo refere-se à subclonagem de produtos resultantes da apresentação em ribossoma. Neste método de subclonagem, o molde foi um scFv, descrito como scFv parental. Os protocolos utilizados são os do Exemplo 1. O passo inicial de PCR que produz o iniciador mutagénico utilizando os iniciadores iniciais é efectuado na biblioteca produtos de RT-PCR), ver Jermutus et al 57 ΡΕ1844144 (2001) PNAS, vol 98, n° 1, 75-80. Os oligonucleótidos utilizados como iniciadores iniciais de PCR são apresentados na Figura 3.

Deste modo, um repertório de diferentes sequências scFv resultantes da apresentação no ribossoma (Jermutus et al P.N.A.S 2001, Volume 98 pág. 75 a 80) foram amplificadas por PCR utilizando um emparelhamento de iniciador directo biotinilado no inicio de VH e o iniciador reverso mycRestore que inicia na marca myc, logo a jusante do final de VL (ver Figura 3) . Dependendo da sequência de aminoácidos no inicio da cadeia pesada, foi utilizado Bio-EVQ ou Bio-QVQ. Foram utilizadas condições convencionais de PCR (ver Exemplo 1 para detalhes).

Os produtos de PCR resultantes foram separados na forma de cadeia simples para formar os iniciadores mutagénicos como descrito no Exemplo 1 e utilizados na reacção de mutagénese. A molécula parental para a reacção de mutagénese foi scFv de cadeia simples em pCantabô (Vaughan et al., (1996) Nature Biotechnology, Volume 14 pág. 309 a 314) . Neste exemplo, apenas uma sequência scFv parental em pCantab 6 foi utilizada. Deste modo, a molécula parental simples é mutagenizada através de múltiplos iniciadores mutagénicos para subclonar os resultados múltiplos a partir da apresentação ao ribossoma no plasmideo parental. 58 ΡΕ1844144 A preparação de uma molécula parental de cadeia simples, os protocolos para a reacção de mutagénese e para a transformação de células são como no Exemplo 1.

Os resultados da reacção de mutagéneses apresentaram >10000 transformantes após electroporação. Em contraste, o controlo sem iniciador mutagénico e sem enzima produziu - 10 transformantes.

Os resultados do exemplo acima foram os seguintes :

Iniciador Tamanho do iniciador mutagénico Complementaridade na extremidade 5' Não coincidência Complementaridade na extremidade 5' Eficiência n 2a 830 bases 320 bases 20 bases 490 bases 75% 20 2b 830 bases 700 bases 20 bases 110 bases 90% 21

Os iniciadores mutagénicos referidos acima são apresentados nas Figuras. Em comparação, quando os oligonu-cleótidos sintéticos são utilizados em mutagénese (tipicamente, 18 bases complementares ao lado de um desemparelha-mento de 18 bases) a média da eficiência da mutagénese é de 64% (n=350).

Exemplo 3: Procedimento de Exclusão de Tamanho A eficiência da mutagénese foi ainda melhorada efectuando um passo de exclusão de tamanho numa molécula parental de cadeia simples do Exemplo 2, antes da reacção 59 ΡΕ1844144 de mutagénese. Isto resultou numa melhoria de l,5x na eficiência de mutagénese (medida pela análise de sequência, contando o número de sequências mutadas com sucesso) .

Lisboa, 2 de Junho de 2010

Claims (44)

1. ΡΕ1844144 1 REIVINDICAÇÕES 1. Método de introduzir uma ou mais mutações numa molécula de ácido nucleico, compreendendo os seguintes passos: (a) sintetizar um iniciador mutagénico a partir de uma molécula de ácido nucleico molde, em que o referido iniciador mutagénico contém uma ou mais mutações relativamente a uma molécula parental; (b) isolar uma forma de cadeia simples do referido iniciador mutagénico (c) emparelhar o referido iniciador mutagénico de cadeia simples com uma forma de cadeia simples da referida molécula parental e (d) sintetizar uma cadeia complementara partir do referido iniciador mutagénico de modo a produzir uma molécula de ácido nucleico de forma circular contendo as referidas mutações.
2. 2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que antes do referido passo de emparelhamento (c), o iniciador de cadeia simples é misturado com a molécula parental de cadeia simples. 2 ΡΕ1844144
3. 3. Método da reivindicação 1, em que o iniciador de cadeia simples do passo (b) é isolado por utilização de um meio de separação.
4. 4. Método de acordo com a reivindicação 2, compreendendo ainda o passo de isolar a referida molécula parental de cadeia simples antes do passo (c).
5. 5. Método de acordo com a reivindicação 4, compreendendo ainda um passo de exclusão de tamanho efectuada na referida molécula parental de cadeia simples antes do passo (c).
6. 6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a referida molécula parental de cadeia simples é DNA circular de cadeia simples.
7. 7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a molécula parental é um vector de expressão ou vector de apresentação em fagos.
8. 8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a referida molécula de forma circular é DNA circular covalentemente fechado.
9. 9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, compreendendo ainda o passo de 3 ΡΕ1844144 transformar a molécula de ácido nucleico mutagenizada em células hospedeiras.
10. 10. Método de acordo com a reivindicação 9, em que a referida transformação é efectuada utilizando electroporação.
11. 11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, compreendendo um passo efectuado sob condições tais que a cadeia complementar contendo as mutações são preferencialmente seleccionadas.
12. 12. Método da reivindicação 11, em que a referida selecção preferencial de uma cadeia complementar resulta da digestão preferencial da molécula parental.
13. 13. Método da reivindicação 11, em que a molécula parental contém modificações tais que a cadeia complementar é preferencialmente seleccionada.
14. 14. Método da reivindicação 13, compreendendo ainda o passo de introduzir as referidas modificações.
15. 15. Método da reivindicação 13 ou reivindicação 14, em que a modificação é a introdução de dU em vez de dT.
16. 16. Método da reivindicação 13 ou reivindicação 14, em que a modificação é metilação ou a introdução de um gene condicionalmente letal. 4 ΡΕ1844144
17. 17. Método de qualquer uma das reivindicações 11 a 16 em que a referida selecção preferencial é efectuada por transformação da referida molécula de forma circular do passo (d) numa célula hospedeira que é selectiva para a cadeia complementar, não modificada.
18. 18. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o referido iniciador mutagénico é sintetizado por um método com base em PCR.
19. 19. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o referido iniciador mutagénico é sintetizado por um método de sintese em que os erros são introduzidos quando se sintetiza uma segunda cadeia a partir de uma primeira cadeia.
20. 20. Método de acordo com a reivindicação 19, em que o referido método é PCR com tendência a erro.
21. 21. Método de acordo com a reivindicação 19 ou reivindicação 20, em que a sequência do molde para a sintese do iniciador mutagénico é a mesma encontrada na molécula parental.
22. 22. Método de acordo com a reivindicação 3, em que o passo de sintetizar o referido iniciador mutagénico introduz uma unidade de ligação na cadeia positiva ou cadeia negativa do iniciador mutagénico e a referida 5 ΡΕ1844144 separação é efectuada através da ligação da referida unidade de ligação ao seu parceiro de ligação no referido meio de separação.
23. 23. Método de acordo com a reivindicação 22, em que a referida unidade de ligação é introduzida na cadeia positiva do iniciador mutagénico e a cadeia negativa do iniciador mutagénico é eluida a partir do referido meio de separação.
24. 24. Método de acordo com a reivindicação 22 ou reivindicação 23, em que a referida unidade de ligação é biotina e o referido parceiro da ligação é a estrepta-vidina.
25. 25. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a referida mutação(ões) inclui substituições.
26. 26. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a referida mutação(ões) inclui deleções.
27. 27. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a referida mutação (ões) inclui adições.
28. 28. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que as referidas mutações são mutações numa pluralidade de nucleótidos. 6 ΡΕ1844144
29. 29. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o referido iniciador mutagénico possui pelo menos 80% de complementaridade com a molécula parental.
30. 30. Método de acordo com a reivindicação 29, em que o referido iniciador mutagénico possui pelo menos 90% de complementaridade com a molécula parental.
31. 31. Método de acordo com a reivindicação 30, em que o referido iniciador mutagénico possui pelo menos 95% de complementaridade com a molécula parental.
32. 32. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o referido iniciador mutagénico é de 100 nucleótidos a 4000 nucleótidos de tamanho.
33. 33. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a proporção molar de iniciador mutagénico para a molécula parental no passo (c) é cerca de 3:1.
34. 34. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que existem múltiplas moléculas parentais e/ou múltiplas moléculas de iniciador mutagénico. 7 ΡΕ1844144
35. 35. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a molécula parental, molde ou iniciador mutaqénico contém um dominio variável de anticorpo.
36. 36. Método de acordo com a reivindicação 35, em que o referido dominio variável de anticorpo é dominio VL de anticorpo.
37. 37. Método de acordo com a reivindicação 35 em que o referido dominio variável de anticorpo é um dominio VH de anticorpo.
38. 38. Método de acordo com a reivindicação 35, em que a molécula parental contém um dominio VH de anticorpo e um dominio VL de anticorpo e a molécula de iniciador mutagénico contém um dominio VL de anticorpo para mutar o dominio VL da molécula parental.
39. 39. Método da reivindicação 35, em que a molécula parental contém um dominio VL de anticorpo e um dominio VH de anticorpo e a molécula de iniciador mutagénico contém um dominio VH de anticorpo para mutar o dominio VH de anticorpo numa molécula parental.
40. 40. Método da reivindicação 38 ou reivindicação 39, em que o primeiro e segundo iniciador mutagénico são utilizados para mutar a molécula parental, o primeiro iniciador mutagénico contendo um dominio VH de anticorpo ΡΕ1844144 para mutar o domínio VH numa molécula parental e o segundo iniciador mutagénico contendo o domínio VL de anticorpo para mutar o domínio VL na molécula parental.
41. 41. Método da reivindicação 40, em que o referido primeiro e segundo iniciador mutagénico são utilizados em passos separados de reacções de mutagénese.
42. 42. Método da reivindicação 41, em que o referido primeiro e segundo iniciador mutagénico são utilizados no mesmo passo de reacção de mutagénese.
43. 43. Método da reivindicação 38 ou reivindicação 39, em que um único iniciador mutagénico contendo ambos os domínios VH e VL é utilizado para mutar os domínios VH e VL numa molécula parental.
44. 44. Método de acordo com qualquer das reivindicações 34 a 43, em que a molécula parental compreende o ácido nucleico que codifica um scFv. Lisboa, 2 de Junho de 2010