ES2199155T3 - Procedimiento y formulacion para la marcacion fotocroma y/o el aseguramiento de la autenticidad de objetos. - Google Patents

Abstract

Procedimiento para el aseguramiento de la autenticidad de un objeto por aplicación de una tinta fotocroma sobre el objeto, en el que se utiliza una tinta fotocroma que contiene por lo menos una variante de bacteriorrodopsina como porción fotocroma, que al irradiarse con luz en la región visible de longitudes de onda experimenta una modificación reversible, detectable visualmente, del estado, que se puede usar como característica de baja seguridad en el caso de una comprobación de la autenticidad, y que adicionalmente a la característica de baja seguridad presenta una o varias características de alta seguridad no detectables visualmente y comprobables solamente con una tecnología analítica instrumental.

Description

Procedimiento y formulación para la marcación fotocroma y/o el aseguramiento de la autenticidad de objetos.

El invento se refiere a un procedimiento para el aseguramiento de la autenticidad de un objeto por aplicación de una tinta fotocroma sobre el objeto.

Las aplicaciones técnicas de seguridad, destinadas a asegurar la autenticidad de documentos u objetos, abarcan el empleo de características apropiadas de aseguramiento o apropiadas marcaciones de autentificación. La utilización de materiales fotocromos para aplicaciones técnicas de seguridad se describió p.ej. en el documento de patente de los EE.UU. US 4.927.180. La característica de identificación fotocroma se hace visible en los ejemplos conocidos mediante el empleo de luz UV (ultravioleta). Como tal, la característica de identificación utilizada, sin embargo, no se puede reconocer o sólo se puede reconocer de mala manera, por lo que existe el peligro de que el usuario no observe la falta de la característica de identificación. Para los ojos del perito de autenticidad, a causa de la utilización de luz UV, se necesita una protección apropiada. La utilización de luz UV para la identificación de la característica de seguridad se puede considerar por lo tanto como desventajosa. Un estado de la técnica similar se expone en el documento US 5.807.625. De nuevo, pasa a emplearse en este caso luz UV para la visualización de la característica de seguridad.

Los materiales fotocromos orgánicos, que se divulgan en los documentos mencionados, presentan un típico número de ciclos de conmutación de 10^{4} - 10^{5}. Con ello se limita el número de los posibles procesos de comprobación para la identificación de la característica de seguridad. Por lo tanto, un empleo para procedimientos de ensayo automáticos, tales como p.ej. en máquinas de cajeros automáticos o disposiciones para controlar el acceso, no es posible o sólo es posible condicionadamente para las mencionadas características de seguridad.

Es deseable además poder identificar una tanda determinada de una formulación de marcación y p.ej. de esta manera, poder comprobar el respectivo origen en el caso de una pérdida o de una sustracción ilegítima de las formulaciones preparadas para finalidades de seguridad. Las características de seguridad divulgadas en los mencionados documentos correspondientes al estado de la técnica no son utilizables para tales aplicaciones.

Los convencionales materiales fotocromos tienen además la desventaja de que uno de sus dos estados de maniobra no presenta ninguna coloración previa apreciable.

Una misión del invento es poner a disposición una característica de aseguramiento detectable, en la que tanto el proceso de blanqueo como también el proceso de extinción se puedan llevar a cabo con una luz situada en la región visible de longitudes de onda. De tal manera se podría inducir un cambio de color con fuentes luminosas, p.ej. diodos luminiscentes, baratas y disponibles en todos los sitios. Incluso con una luz de lámpara sencilla una comprobación sería entonces posible y detectable a simple vista. Además, tendría que pretenderse poner a disposición una característica de seguridad que tenga un número de ciclos de maniobra que esté situado por encima de 10^{4} - 10^{5}.

Una misión adicional es poner a disposición un gran número de materiales fotocromos similares estructuralmente entre ellos, que se diferencien en su coloración y/o en su cambio de color.

Mientras que las características de seguridad conocidas en el estado de la técnica se pueden definir como características de baja seguridad para su comprobación a causa del pequeño esfuerzo técnico, una misión adicional consiste en poner a disposición adicionalmente características de alta seguridad, cuya comprobación sea técnicamente exigente y por consiguiente imposible para un lego en la materia.

El empleo de moléculas de ácidos nucleicos, en particular moléculas de ADN, que pueden ser detectadas por apropiadas reacciones de amplificación, tales como p.ej. la reacción de PCR (reacción en cadena de polimerasa) mediante cebadores específicos, como característica de alta seguridad invisible, se divulga en el documento de solicitud de patente internacional WO 9806084.

De acuerdo con el presente invento se ha conseguido encontrar un material, a saber la bacteriorrodopsina (BR), en la que una característica de baja seguridad, tal como p.ej. la fotocromía, se puede combinar con una característica de alta seguridad, que permite p.ej. la identificación de tandas individuales y utilizar este material para la marcación y respectivamente autentificación de objetos.

Un procedimiento conforme al invento para el aseguramiento de la autenticidad de objetos mediante utilización de una tinta que contiene bacteriorrodopsina se presenta en la reivindicación 1, exponiéndose perfeccionamientos preferidos acerca de éste en las reivindicaciones subordinadas.

Los problemas planteados por las misiones antes mencionadas se resuelven conforme al invento mediante un procedimiento para el aseguramiento de la autenticidad de un objeto por aplicación de una tinta fotocroma sobre el objeto, utilizándose una tinta fotocroma, que contiene por lo menos una variante de bacteriorrodopsina como porción fotocroma, que, al efectuar una irradiación con luz en la región visible de las longitudes de onda, experimenta una modificación reversible de estado, en particular una modificación del color, detectable visualmente, utilizable como característica de baja seguridad en el caso de una comprobación de la autenticidad, y que adicionalmente a la característica de baja seguridad presenta una o varias características de alta seguridad no detectables visualmente, que es o son detectables solamente con tecnología analítica instrumental.

Es objeto del presente invento por consiguiente la utilización de una tinta fotocroma en un procedimiento para el aseguramiento de la autenticidad de un objeto. La tinta, que se ha de utilizar conforme al invento, contiene como porción fotocroma por lo menos una variante de bacteriorrodopsina. Tal variante de BR proporciona tanto una característica de baja seguridad detectable visualmente, para la finalidad de una comprobación de la autenticidad, como también inherentemente una característica adicional de alta seguridad, que es detectable solamente mediante una tecnología analítica instrumental.

Por fotocromía se entiende una modificación reversible del estado (en particular una modificación del color) de una sustancia, provocada por luz, en la que se modifica el color (el espectro de absorción) de las sustancias de partida. La retrorreacción se puede provocar entonces por ejemplo por luz de otra longitud de onda o por calor. Mediante la utilización conforme al invento de una variante de bacteriorrodopsina como porción fotocroma, que al irradiar con luz en la región visible de las longitudes de onda experimenta una modificación del estado, no se necesita conforme al invento una irradiación con luz UV. De esta manera, se pueden eliminar las desventajas vinculadas con el uso de luz UV, en particular los requisitos y las medidas protectoras de aparatos que se vinculan con ello.

Las variantes de bacteriorrodopsina utilizadas conforme al invento son preferiblemente aquéllas en las que están coloreados ambos estados de maniobra, de modo especialmente preferido todos los estados de maniobra.

En un aspecto, el invento abarca por lo tanto un procedimiento para el aseguramiento de la autenticidad de objetos, en el que se aplica sobre el objeto una formulación fotocroma en forma de una tinta que contiene bacteriorrodopsina y/o una variante de bacteriorrodopsina como porción fotocroma, realizándose que la irradiación de esta formulación fotocroma con luz situada en la región visible de las longitudes de onda conduce a una modificación del estado, en particular a una modificación del color, que es detectable con el fin de efectuar una comprobación de la autenticidad. La modificación detectable del estado, en particular la modificación del color, es preferiblemente reversible, teniendo las variantes de bacteriorrodopsina utilizadas conforme al invento, en particular, un número de ciclos de maniobra (es decir una modificación del color con finalidades de comprobación) > 10^{5}, más preferiblemente > 10^{6} y de modo especialmente preferido > 10^{7}. Con ello es posible una comprobación repetida de la seguridad del objeto asegurado en cuanto a su autenticidad con ayuda de la característica de baja seguridad, dentro del marco de las medidas rutinarias. Cuando la modificación del estado se hace irreversible, p.ej. por destrucción de la parte activa fotocroma de la bacteriorrodopsina, la marcación de baja seguridad se puede desvalorizar o invalidar.

La comprobación de la autenticidad se efectúa preferiblemente por irradiación de la tinta fotocroma con luz visible, con el fin de blanquear a la bacteriorrodopsina, realizándose que la tinta fotocroma es irradiada seguidamente con luz de una segunda región de longitudes de onda, a fin de devolver a la bacteriorrodopsina por medios fotoquímicos al estado de partida, o tiene lugar una relajación térmica en el estado no blanqueado. La modificación de las propiedades ópticas durante el proceso de blanqueo y/o de extinción se puede observar a simple vista o con un aparato óptico de medición.

Como característica de baja seguridad se designa una característica, cuya ausencia o cuya falta puede ser comprobada por personas legas en la materia sin medios auxiliares técnicos de una manera sencilla o con un pequeño gasto técnico.

Como característica de alta seguridad se designa por el contrario una característica con la que no es posible la comprobación de su presencia o de su ausencia para un lego en la materia, y que usualmente se puede comprobar solamente por especialistas con un alto esfuerzo técnico.

Las características de baja seguridad son por lo tanto características, cuyo análisis consume pocos medios financieros (en el margen de peniques alemanes) y que puede ser llevado a cabo por cualquier persona, mientras que las características de alta seguridad son las características cuyo análisis puede necesitar varios cientos de marcos alemanes (DM) y que se llevan a cabo en laboratorios por especialistas. Las características de baja seguridad ofrecen protección contra técnicas de falsificación por "todo el mundo" puesto que la fotocromía no es reproducible con técnicas conocidas. Las características de alta seguridad abarcan la individualización de los colores de seguridad individuales para aplicaciones o usuarios hasta llegar al nivel de la codificación de las tandas.

Por ejemplo, la fotocromía de las variantes de bacteriorrodopsina, es decir la modificación del color fácilmente comprobable por un observador en el caso de irradiación con luz visible, constituye una característica de baja seguridad. Otras características de baja seguridad detectables visualmente son, por ejemplo, diferentes coloraciones iniciales de las tintas fotocromas que contienen bacteriorrodopsina, diferentes foto-ciclos y/o un comportamiento cinético modificado.

Al contrario que las medidas de baja seguridad, que son apreciables visualmente de una manera sencilla por todo el mundo, las características de alta seguridad se pueden comprobar solamente con ayuda de aparatos analíticos técnicamente costosos, es decir mediante una tecnología analítica instrumental. Para la comprobación de características de alta seguridad se necesitan por lo tanto medios auxiliares técnicos. Así, por ejemplo, la sustitución de aminoácidos en la secuencia de una bacteriorrodopsina para formar variantes cuya masa, diferente de la del tipo salvaje, se puede detectar mediante espectrometría de masas. Existe sin embargo también la posibilidad, por acoplamiento de átomos y/o moléculas, de formar variantes de bacteriorrodopsina que se pueden detectar por ejemplo a causa de su diferente masa, de su modelo de fragmentación o de otras propiedades diferentes, por ejemplo a través de una ESR o NMR.

Mediante una sustitución de aminoácidos se pueden poner a disposición en particular las siguientes características de alta seguridad. En el caso de una detección por cromatografía de líquido y espectrometría de masas o por espectrometría de masas (p.ej. con ESI) se pueden medir una modificación de la masa molecular y/o una modificación característica del modelo de fragmentación en la espectrometría de masas. Por detección con HPLC y detección por absorción o fluorescencia se pueden detectar modificaciones características de desdoblamientos de péptidos, por ejemplo una supresión o adición de un sitio de corte, con lo que se aumenta o disminuye el número de los fragmentos. Con estos métodos se puede comprobar también una modificación del número de los aminoácidos aromáticos. La fijación de anticuerpos monoclonales específicos a la secuencia de bacteriorrodopsina, o a segmentos de ella, se puede comprobar mediante un ELISA o procedimiento similar.

Ejemplos de características de alta seguridad, que se obtienen por acoplamiento, son marcas de espín, que se pueden detectar mediante una ESR, así como modificaciones que se pueden introducir mediante reactivos para la modificación de proteínas, marcados con isótopos estables (p.ej. ^{13}C, ^{15}N).

La tinta fotocroma utilizada conforme al invento confiere entonces al objeto que se ha de asegurar tanto una característica de baja seguridad, tal como p.ej. la fotocromía, como también una característica de alta seguridad, tal como p.ej. la información de la secuencia de la bacteriorrodopsina utilizada, que permite p.ej. la identificación de tandas individuales.

Mediante el procedimiento conforme al invento se obtiene por consiguiente un doble aseguramiento de los objetos caracterizados. Mientras que las características de baja seguridad son fáciles de reconocer y por consiguiente se pueden comprobar y compulsar sin necesidad de más medidas y con rapidez, en el caso de las características de alta seguridad se trata de características de seguridad ocultas, que solamente se pueden comprobar mediante una tecnología analítica costosa y no pueden ser reconocidas posiblemente de ninguna manera por un imitador o falsificador potencial. Un imitador potencial no sabe tampoco en primer término si tiene que estar contenida o no una determinada característica, puesto que hay toda una serie de características de alta seguridad que se pueden combinar con una bacteriorrodopsina.

Este aseguramiento adicional hace posible una alta protección frente a una imitación y posibilita al mismo tiempo una codificación de los objetos, por ejemplo hasta llegar a una codificación de los fabricantes o las tandas. Mediante la utilización de una variante de bacteriorrodopsina, la característica de baja seguridad y la característica de alta seguridad son además vinculadas una con otra de una manera inseparable, puesto que son puestas a disposición por la misma molécula.

La comprobación de los objetos marcados de acuerdo con al invento se puede llevar a cabo de diferentes maneras. Para una comprobación rutinaria, como se puede llevar a cabo por ejemplo en cada entrada de billetes de banco a un banco o a una institución de crédito, se puede comprobar por ejemplo con medios sencillos solamente en cuanto a la característica de baja seguridad. También es posible comprobar paralelamente dos o más características de baja seguridad. Para una investigación más detallada se pueden comprobar entonces una o varias características de alta seguridad de la (o las) variante(s) de bacteriorrodopsina. La presencia de por lo menos dos características de alta seguridad se puede obtener mediante la utilización de dos diferentes variantes de bacteriorrodopsina o mediante la utilización de una variante de bacteriorrodopsina modificada doblemente. Además, también es posible la comprobación combinada de características de baja seguridad y de alta seguridad.

La bacteriorrodopsina es una proteína membranal de bacterias halófilas. A partir de microorganismos del género Halobacterium se puede obtener la proteína bacteriorrodopsina en grandes cantidades. La bacteriorrodopsina del tipo salvaje es bien conocida por un experto en la especialidad en lo referente a sus propiedades fotoquímicas y físicas fundamentales como material fotocromo el cual, activado por luz, recorre una secuencia cíclica de estados intermedios. Para la modelación de las propiedades fotocromas se utiliza en este caso un foto-ciclo muy simplificado, que contiene solamente dos estados, que son designados como estado B y estado M. Por irradiacion con la longitud de onda de 568 nm el estado B de color púrpura se transforma en el estado M de color amarillo, que a su vez es transformado de retorno en el estado B por absorción de luz con la longitud de onda de 412 nm. Un material con bacteriorrodopsina se puede blanquear también con una luz verde-amarilla, desapareciendo la coloración de púrpura y apareciendo la coloración amarilla. Se puede esperar entonces hasta que se establezca de nuevo la coloración de púrpura por relajación térmica, o se utiliza una luz de color azul, a fin de convertir el material de bacteriorrodopsina por vía fotoquímica de nuevo en el estado B. Un compendio de las mencionadas propiedades de la bacteriorrodopsina se encuentran en las citas de N. N. Vsevolodov, Biomolecular Electronics: An Introduction vía Photosensitive Proteins [Electrónica biomolecular: una introducción por la vía de proteínas fotosensibles], Birkhäuser, Boston, 1998 y en la de D. Oesterhelt, C. Bräuchle, N. Hampp, Bacteriorhodopsin: A Biological Material for Information Processing [Bacteriorrodopsina: un material biológico para el tratamiento de la información] Quarterly Review of Biophysics [Revisión Trimestral de Biofísica], 24 (1991) 425 - 478.

Por un experto en la especialidad es conocido que existe toda una serie de variantes de la bacteriorrodopsina, que ciertamente presentan la misma coloración inicial que el tipo salvaje, pero se diferencian en parte considerablemente en cuanto a la cinética de su foto-ciclo. Un ejemplo preferido es la variante BR-D96N. Sus propiedades se describen en diferentes publicaciones, p.ej. en la de A. Miller, D. Oesterhelt, Kinetic Optimization of Bacteriorhodopsin by Aspartic Acid 96 as an Internal Proton Donor [Optimización cinética de la bacteriorrodopsina por ácido aspártico 96 como donante interno de protones], Biochim. Biophys. Acta 1020 (1990) 57-64.

Conforme al invento se utiliza de modo preferido una bacteriorrodopsina que ventajosamente se puede blanquear con luz visible.

Se ha manifestado como ventajosa una región de longitudes de onda de 500 a 600 nm. La devolución de la bacteriorrodopsina al estado de partida se puede conseguir entonces por relajación térmica o por irradiación con luz de una segunda región de longitudes de onda. Para esta segunda región de longitudes de onda se utilizan ventajosamente longitudes de onda en el intervalo de 400 a 450 nm.

El blanqueo visible de la bacteriorrodopsina mediando irradiación se puede detectar con tanta más facilidad cuanto más alta sea la duración de la vida del estado N. Típicamente se consigue un blanqueo de aproximadamente 90% del material con bacteriorrodopsina con potencias luminosas menores que 100 mW/cm^{2} a 532 nm.

Hasta ahora no se han descrito en la bibliografía formulaciones, tales como p.ej. barnices, tintas o tintas de imprenta, para la aplicación mediante una técnica de impresión y/o la aplicación en el sector de la técnica de seguridad, que contengan bacteriorrodopsina como componente fotocromo. En comparación con los materiales fotocromos convencionales mencionados, la bacteriorrodopsina suministra las siguientes ventajas:

1.

Para el cambio de color se puede emplear luz de una longitud de onda visible.

2.

Ambos estados de maniobra presentan una coloración propia detectable.

3.

Por aplicación de métodos de tecnología genética se pueden producir variantes funcionales de bacteriorrodopsina mediante intercambio de aminoácidos. Las variantes de bacteriorrodopsina así obtenidas se diferencian en su cinética (BR-D96N) y/o en su absorción inicial y en su foto-ciclo (BR-D85N) con respecto de la bacteriorrodopsina de tipo salvaje.

4.

El número de los posibles ciclos de maniobra está situado más alto que 10^{5}.

En los microorganismos del género Halobacterium la bacteriorrodopsina se presenta en la denominada forma de membrana de color púrpura. La preparación y el aislamiento de la bacteriorrodopsina en la forma de membrana de color púrpura es bien conocida a escala técnica (compárese p.ej. el documento de patente europea EP 0.406.850 B1).

La bacteriorrodopsina se encuentra en el tipo salvaje en forma de una parte bidimensional de la membrana celular, que consta exclusivamente de bacteriorrodopsina y de lípidos. Esta parte se denomina membrana de color púrpura. En esta forma, la bacteriorrodopsina es especialmente estable termodinámicamente, para una proteína incluso extraordinariamente estable. Ésta es una condición previa para un gran número de aplicaciones técnicas y se emplea también en el sector de las formulaciones conformes al invento, en donde se emplea bacteriorrodopsina como pigmento. Por lo tanto, de acuerdo con el invento, una BR y/o una variante de BR se emplea de modo especialmente preferido en la forma de membrana de color púrpura.

Como bacteriorrodopsina se puede utilizar el tipo salvaje, de modo preferido conforme al invento la tinta fotocroma contiene sin embargo por lo menos una variante de bacteriorrodopsina como porción fotocroma. Una variante de bacteriorrodopsina se diferencia del tipo salvaje mediante por lo menos una modificación. De modo preferido, la variante de bacteriorrodopsina se selecciona entre variantes funcionales, variantes secuenciales, variantes por derivatización, variantes por cromóforos, variantes por isótopos y/o variantes por marcas de espín.

Las variantes secuenciales de bacteriorrodopsina, que también pueden ser variantes funcionales de bacteriorrodopsina, se pueden expresar en el seno de Halobacterium salinarum. En tal caso, la bacteriorrodopsina se incorpora en la membrana celular, que seguidamente se puede aislar. En algunos casos, el material obtenido no es bidimensionalmente cristalino, pero la bacteriorrodopsina está unida a membranas.

En la producción de variantes de bacteriorrodopsina por intercambio deliberado de aminoácidos individuales, se pueden producir variantes de secuencias por intercambio de aminoácidos en las regiones que carecen de importancia para la función fotocroma. Un intercambio de aminoácidos se puede llevar a cabo por mutagénesis dirigida a un cierto sitio del gen que codifica la bacteriorrodopsina.

Con ello se presenta sin embargo el alumbramiento de una característica de alta seguridad, puesto que el intercambio deliberado de aminoácidos en la molécula de bacteriorrodopsina se puede utilizar para finalidades de identificación y con ello se convierte en la característica de seguridad. En el caso de intercambio, p.ej. de solamente cuatro posiciones de aminoácidos con los 20 aminoácidos biógenos se pueden producir 4^{20} \approx 10^{12} materiales de bacteriorrodopsina diferenciables.

Con ello es posible, sin gran esfuerzo técnico, producir un enorme número de moléculas de bacteriorrodosipna, que abarcan materiales de bacteriorrodosipna funcionalmente idénticos como fotocromos, pero que se diferencian unos de otros de manera inequívoca, concretamente en su secuencia de aminoácidos.

La característica adicional de alta seguridad no se puede reconocer sin una costosa y complicada tecnología analítica. Se describen en el estado de la técnica diferentes procedimientos, con los cuales se puede detectar todavía de manera confiable la composición de materiales de bacteriorrodopsina con las mencionadas modificaciones. Antes de todo, se han de mencionar aquí la espectrometría de masas MS (compárese K. L. Schey, D. I. Papac, D. R. Knapp y R. K. Crouch, Matrix-Assisted Laser Desorption Mass Spectrometry of Rhodopsin and Bacteriorhopsin [Espectrometría de masas con desorción de láser asistida por matriz de rodopsina y bacteriorrodopsina], Biophys., J. 63 (1992), 1240 - 1243, P. Hufnagel, U. Schweiger, C. Eckerskorn y D. Oesterhelt, Electrospray lonization Mass Spectrometry of Genetically and Chemically modified Bacterriorhodopsins [Espectrometría de masas con ionización con proyección de electrones (ESI) de una bacteriorrodopsina modificada genética y químicamente], Anal. Biochem. 243 (1996) Nº 1, 46 -54, L. E. Ball, J. E. Jr. Oatis, K. Dharmasiri, M. Busman, J. Wang, L. B. Cowden, A. Galijatovic, N. Chen, R. K. Crouch y D. R. Knapp, Mass Spectrometric Analysis of Integral Membrane Proteins: Application to Complete mapping of Bacteriorhodopsin and Rhodopsin [Análisis por espectrometría de masas de proteínas membranales integrales: Aplicación al cartografiado completo de bacteriorrodopsinas y de rodopsina], Protein Sci. 7 (1998) Nº 3, 758 - 764).

Los preferidos materiales de bacteriorrodopsina combinan una característica de baja seguridad, a saber la fotocromía, que es fácil de detectar por vía óptica, con una característica de alta seguridad, p.ej. una variación de secuencia en la secuencia de aminoácidos de la bacteriorrodopsina propiamente dicha.

Entre las características de baja seguridad, abarcadas por el invento, se cuentan:

1.

diferentes coloraciones iniciales de los materiales con bacteriorrodopsina,

2.

diferentes foto-ciclos,

3.

comportamiento cinético modificado.

La característica de baja seguridad conforme al invento se puede conseguir preferiblemente mediando empleo de variantes funcionales de bacteriorrodopsina, pero también mediante otras variantes de bacteriorrodopsina, tales como por ejemplo variantes por derivatización de bacteriorrodopsina y/o variantes por cromóforos de bacteriorrodopsina.

Por el concepto de variantes funcionales de bacteriorrodopsina se han de entender en particular las variantes que se diferencian en cuando a su espectro de absorción y/o su foto-ciclo con respecto del tipo salvaje de bacteriorrodopsina.

Una variante funcional conocida es p.ej. la variante D96N, en la que el ácido aspártico situado en la posición 96 se ha intercambiado por asparagina. Esta variante funcional de bacteriorrodopsina, y algunas otras, se describen en las citas de: "H. Otto, T. Marti, M. Holz, T. Mogi, M. Lindau, H. G. Khorana y M. P. Heyn, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86 (1989), páginas 9228-9232" y "T. E. Thorgeirsson, S. J. Milder, L. J. W. Miercke, M. C. Betlach, R. F. Shand, R. M. Stroud y D. S. Kliger, Biochemistry 30 (1991), páginas 9133-9142".

Por el concepto de variantes por derivatización de bacteriorrodopsina se deben entender en particular las variantes de bacteriorrodopsina que se diferencian del tipo salvaje por el acoplamiento covalente de moléculas. Tales moléculas pueden tener por ejemplo la misión de aumentar el peso molecular de una bacteriorrodopsina a fin de poder identificar en la espectrometría de masas una molécula de este tipo, o pueden ser una molécula coloreada, para modificar de esta manera el espectro de absorción de la bacteriorrodopsina, o puede ser una molécula fluorescente, para poder observar de esta manera una fluorescencia acoplada a la bacteriorrodopsina. Asimismo, el material de bacteriorrodopsina puede también estar acoplado covalentemente a un polímero. La reacción de acoplamiento se puede llevar a cabo p.ej. de acuerdo con Chignell & Chignell, Biophys. Biochem. Res. Commun. 62 (1975), páginas 136-143, y de acuerdo con Renthal y colaboradores, Biochemistry 22 (1983), páginas 5-12.

La sensación cromática inicial del material de bacteriorrodopsina o de la tinta fotocroma así como la sensación cromática del estado blanqueado, se pueden influenciar mediante acoplamiento covalente de colorantes apropiados a las moléculas de bacteriorrodopsina y/o por sencilla adición de colorantes o pigmentos pasivos. La sensación visual de las mezclas cromáticas resultantes se puede visualizar de modo intuitivo y claro en el diagrama CIE. Un experto en la especialidad puede determinar el efecto cromático con métodos conocidos de este tipo.

Se pueden acoplar a la bacteriorrodopsina moléculas enlazadoras, que permitan acoplar a ésta a su vez otros compuestos. Las moléculas, que pueden ser acopladas para las misiones conformes al invento, sirven para aumentar el peso molecular de la bacteriorrodopsina con el fin de poder identificar en la espectrometría de masas una molécula de este tipo.

Por el concepto de variantes por cromóforos de bacteriorrodopsina se deben entender en particular variantes de bacteriorrodopsina que se diferencian del tipo salvaje por la eliminación o por el intercambio del grupo cromóforo de retinilideno por otra molécula, en particular por la denominada molécula análoga a retinal. La molécula análoga a retinal puede estar enlazada covalentemente a la bacteriorrodopsina a través de lisina-216.

Por consiguiente, son posibles variantes adicionales para la producción de variantes de bacteriorrodopsina por reemplazo del grupo cromóforo de retinilideno. En este caso, se consigue una modificación de las propiedades fotofísicas, pudiendo pasar a emplearse preferiblemente dihidro-retinal o 4-ceto-retinal.

Por el concepto de variantes por isótopos de bacteriorrodopsina se deben entender en particular aquellas variantes de bacteriorrodopsina en las que algunos, o la totalidad, de los aminoácidos están marcados parcial o totalmente con ^{13}C o ^{15}N. Esto se puede conseguir mediante el recurso de que se añaden algunos aminoácidos marcados al medio de crecimiento o se emplea una peptona que es marcada como un conjunto. Mediante una NMR (resonancia magnética nuclear) de alta resolución se pueden identificar los compuestos así marcados.

Por el concepto de variantes por marcas de espín de bacteriorrodopsina se deben entender en particular las variantes de bacteriorrodopsina que contienen una marca de espín enlazada covalentemente a la molécula de bacteriorrodopsina. Esto se puede conseguir p.ej. acoplando un derivado de TEMPO (2,2,6,6-tetrametil-piperidin -N-oxilo) o DOXYL (4,4-dimetil-oxazolidin-N-oxilo) o PROXYL (2,2,5,5-tetrametilpirrolidin -N-oxilo) al material de bacteriorrodopsina. Mediante una ESR (resonancia de espín eléctrico) se pueden comprobar la presencia y el tipo de la marca de espín.

Por variantes secuenciales de bacteriorrodopsina se deben entender en particular las variantes de bacteriorrodopsina que se diferencian del tipo salvaje por la pérdida o el intercambio o la adición de uno o varios aminoácidos, que sin embargo no conducen a un influenciamiento esencial sobre el foto-ciclo. Las variantes secuenciales de bacteriorrodopsina son p.ej. D36C o variantes en las que al extremo terminal de N o al extremo terminal de C se le unen aminoácidos.

Las combinaciones de las modificaciones de las variantes antes mencionadas conducen a nuevas variantes preferidas, con lo cual es posible un número enorme de diferentes formulaciones con bacteriorrodopsina. Con ello se obtiene una característica de alta seguridad, puesto que el esfuerzo para el análisis se hace muy alto y al mismo tiempo cada tanda individual puede ser identificada inequívocamente a causa de la gran multiplicidad.

La variante de bacteriorrodopsina se selecciona de modo preferido entre D36X, D96X y D85X, en donde X representa uno de los aminoácidos presentes en la naturaleza. De modo especialmente preferido, la variante de BR se selecciona entre D36C, D96N y D85N.

De modo especialmente preferido, se utilizan mutantes que presentan una sensibilidad aumentada a la luz, y en particular materiales como los que se emplean también para la holografía.

La formulación con bacteriorrodopsina puede contener además, junto a una bacteriorrodopsina, un pigmento no fotocromo habitual y/o un fluorocromo y/o un pigmento enlazado covalentemente a bacteriorrodopsina y/u otro pigmento fotocromo. Mediante la mezcla con bacteriorrodopsina, el pigmento no fotocromo o fluorocromo puede estar albergado dentro de la marcación de seguridad. En el caso de una forma de ejecución de este tipo, puede ser conveniente además utilizar luz UV de modo adicional a la luz visible.

Por lo demás, se pueden acoplar moléculas fluorescentes o fosforescentes a las moléculas de bacteriorrodopsina, con lo cual su emisión constituye una característica adicional. Por el elección apropiada de la situación de la emisión se puede conseguir una represión de la fluorescencia, cuando el material con bacteriorrodopsina se encuentra en el estado no blanqueado. Esto se consigue cuando la situación de la absorción inicial de una bacteriorrodopsina y la emisión del material fluorescente o fosforescente se solapan en gran manera. En este caso el material con bacteriorrodopsina absorbe los fotones emitidos y a simple vista no se puede percibir entonces ninguna fluorescencia. La fluorescencia es visible entonces solamente cuando el material con bacteriorrodopsina ha sido blanqueado fotoquímicamente.

La comprobación de la composición del material con bacteriorrodopsina aplicado se puede llevar a cabo p.ej. determinando total o parcialmente mediante secuenciación microanalítica la secuencia de aminoácidos del material con bacteriorrodopsina, o midiendo con un anticuerpo específico la reacción mediante procedimientos inmunológicos.

Los materiales con bacteriorrodopsina, que abarcan características de alta seguridad, contienen preferiblemente variantes de bacteriorrodopsina

1.

con secuencias de aminoácidos modificadas deliberadamente, realizándose que la modificación de las secuencias no influye sobre las propiedades fotofísicas,

2.

con moléculas acopladas covalentemente y

3.

con aminoácidos, que están marcados con ^{13}C y/o ^{15}N y/u otros isótopos.

Se prefieren especialmente combinaciones a base de dos o más de los anteriores tipos de variantes de bacteriorrodopsina.

De modo especialmente preferido, en el procedimiento conforme al invento se utiliza por lo menos una variante de bacteriorrodopsina con las siguientes características:

a) la zona necesaria para la formación de la forma de membrana de color púrpura de la proteína está inalterada con respecto al tipo salvaje de la bacteriorrodopsina, y

b) en bucles y/o en el extremo terminal de C y/o en el extremo terminal de N de la cadena de polipéptidos está presente por lo menos un intercambio de aminoácidos con respecto al tipo salvaje de la bacteriorrodopsina, que comprende deleciones (supresiones), adiciones, inserciones y/o sustituciones, realizándose que estos intercambios de aminoácidos no conducen a ninguna modificación de las propiedades fotocromas de la bacteriorrodopsina que son determinadas por la región fotocroma.

Tales bacteriorrodopsinas están inalteradas en la zona necesaria para la formación de la forma de membrana de color púrpura de la proteína en comparación con el tipo salvaje de bacteriorrodopsina. Resulta suficiente para las finalidades de este invento también cuando la bacteriorrodopsina, a pesar de ligeras modificaciones en esta zona, sea capaz además de la formación de una membrana de color púrpura.

Las modificaciones conformes al invento en la secuencia de aminoácidos abarcan intercambios de aminoácidos, tales como p.ej. deleción (supresión), inserción, sustitución y/o adición a cualesquiera posiciones arbitrarias dentro de la cadena total del polipéptido. Son especialmente preferidas las adiciones de aminoácidos en los extremos terminales de N y/o de C y/o en los bucles de la cadena de polipéptido, que están situados en particular fuera de la membrana. Las modificaciones llevadas a cabo conforme al invento para la codificación de la característica de alta seguridad no se llevan a cabo por consiguiente de modo preferido en la zona de la bacteriorrodopsina, que influye sobre las propiedades fotocromas. El intercambio de aminoácidos en los bucles y/o en el extremo terminal de C y/o en el extremo terminal de N de la cadena de polipéptido no conduce en el caso de una apropiada modificación a ninguna modificación de las propiedades fotocromas de la bacteriorrodopsina de partida. En este lugar, se debe establecer y retener que como bacteriorrodopsina de partida se pueden utilizar tanto una bacteriorrodopsina del tipo salvaje como también una bacteriorrodopsina ya modificada, en particular BR-D96N.

Los intercambios de aminoácidos, que se pueden emplear para el análisis, producen preferiblemente unas modificaciones en la masa de la molécula de bacteriorrodopsina de por lo menos un Dalton, de modo todavía más preferido de por lo menos 10 Dalton y del modo más preferido de más que 100 Dalton. Para el análisis se emplean aparatos y procedimientos de ionización del estado de la técnica, tales como p.ej. FTMS (espectrómetro de masas con transformada de Fourier) y/o TOF (espectrómetro de masas con tiempo de vuelo) y/o MALDI (ionización con desorción de láser asistida por matriz) y/o ESI (ionización por proyección eléctrica).

La adición o inserción de aminoácidos puede abarcar en particular hasta 1.000 aminoácidos adicionales, de modo preferido hasta 100 aminoácidos, de modo especialmente preferido hasta 50 aminoácidos, y por lo menos un aminoácido, del modo más preferido de 3 a 20 aminoácidos. Una adición de por lo menos 6 radicales de histidina en el extremo terminal de C se puede utilizar para detectar la presencia de la variante de bacteriorrodopsina a través de la fijación de metales mediante XRF o TXRF (fluorometría por rayos X).

La deleción o sustitución se refiere en particular a 1 hasta 10 y de modo especialmente preferido a 1 hasta 4 aminoácidos.

Como variante de sustitución Se emplea preferiblemente la variante de bacteriorrodopsina cuyo radical de ácido aspártico en posición 36 ha sido reemplazado por un radical de cisteína (BR variante D36C).

Los pesos moleculares de las variantes secuenciales de aminoácidos de las moléculas de bacteriorrodopsina se pueden determinar mediante espectrometría de masas con ESI o MALDI-TOF. Después de cálculo de retorno de los espectros de masas, se obtienen las masas moleculares de las sustancias investigadas con una resolución de hasta un número de masa. En el caso de la modificación de la secuencia de aminoácidos, p.ej. también por deleción o inserción, se llega a modificaciones comparativamente grandes del número de masa, que analíticamente son bien detectables. Incluso cuando se reemplazan solamente unos pocos aminoácidos por otros aminoácidos, son suficientes analíticamente las resultantes modificaciones de masas.

Preferiblemente, se utiliza una variante de bacteriorrodopsina, en la que junto al extremo terminal de C se ha añadido por lo menos un aminoácido. Además, se prefiere utilizar variantes de bacteriorrodopsina que contienen por lo menos una cisteína. En otra forma de realización preferida adicional, se emplea por lo menos una variante de bacteriorrodopsina, que posee un foto-ciclo distinto del tipo salvaje y/o un color inicial distinto del tipo salvaje.

Del modo más preferido, se emplean variantes de bacteriorrodopsina que tienen una adaptación disminuida a la luz y a la oscuridad. La bacteriorrodopsina, que tiene su absorción máxima a 570 nm (estado B), se relaja en la oscuridad lentamente, con un tiempo de semivida de aproximadamente 10 a 20 minutos, parcialmente en un estado con máxima absorción a 548 nm, el denominado estado D. En el caso del tipo salvaje de bacteriorrodopsina se ajusta en la oscuridad un equilibrio de aproximadamente 50:50 entre el estado B y el estado D. El estado B tiene una configuración "todo trans", y el estado D tiene una configuración 13-cis, del retinal. Bajo iluminación, la bacteriorrodopsina se transforma primeramente en un 100% en el estado B, desde donde comienza el foto-ciclo, en cuyo transcurso aparece la deseada modificación intensa del color (desplazamiento de la absorción hacia 412 nm).

Si, a continuación, una tinta fotocroma que contiene bacteriorrodopsina conforme al invento, o el objeto marcado con ella, se ha conservado en la oscuridad durante un período de tiempo prolongado, entonces la bacteriorrodopsina se ha convertido a su denominado estado adaptado a la oscuridad. Seguidamente, si la superficie que se ha de comprobar es irradiada por primera vez con luz, con el fin de blanquear a la bacteriorrodopsina, entonces ésta parece presentar una sensibilidad disminuida a la luz o una velocidad reducida de blanqueo. Esto es causado por el hecho de que se consume una parte de la luz irradiada, a fin de transformar la bacteriorrodopsina desde el estado D al estado B. Si el blanqueo, una vez producido, se invierte de nuevo, p.ej. con luz de color azul, se restablece el estado inicial de color lila, entonces en el caso de iluminaciones ulteriores que siguen inmediatamente después, el material muestra la deseada alta sensibilidad a la luz. Es deseable, sin embargo, que las propiedades fotocromas aparezcan ya en el primer ciclo, también después de un almacenamiento en la oscuridad. Por lo tanto, las variantes de bacteriorrodopsina con una adaptación disminuida o totalmente ausente a la luz y a la oscuridad, son materiales preferidos para las utilizaciones conformes al invento.

Las variantes de bacteriorrodopsina, que tienen una adaptación disminuida o ausente a la luz y a la oscuridad, se pueden obtener mediante la utilización de compuestos análogos a retinal o mediante variantes de bacteriorrodopsina con una secuencia modificada de aminoácidos. Ejemplos especialmente apropiados son bacteriorrodopsinas con un cromóforo modificado químicamente, tal como por ejemplo 13-desmetil-11,14-epoxi-bacteriorrodopsina (M. Muradin-Szweykowska y colaboradores, Rec.: J.R. Neth. Chem. Soc. 102 (1983); 42-46). Otras variantes preferidas son bacteriorrodopsinas que contienen un retinal sustituido en posición 13, en particular un retinal, que en posición 13 lleva un átomo de H, un grupo etilo o un grupo propilo (W. Gaertner y colaboradores, Biochemistry 27 (1988), 3497-3502). Mutantes con Arg-82, Asp-85 y Asp-212 con una adaptación disminuida a la luz, que se utilizan aquí asimismo de modo preferido, se describen p.ej. en la cita de M.P. Krebs y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993), 1987-1991. Otras mutantes preferidas son Y185F (P. Rath y colaboradores, Biochemistry 32 (1993), 2272-2281) así como las mutantes descritas en la cita de S.P. Balashow y colaboradores, Biochemistry 32 (1993), 10331, 10343, así como en la cita de K. Ihara y colaboradores, Biophys. J. 67 (1994), 1187, 1191, en particular Arg-82-Ala así como Met-145. Generalmente son preferidas las variantes, que también en la oscuridad permanecen en el estado B y no se convierten en el estado D.

Las moléculas acopladas covalentemente a moléculas de bacteriorrodopsina ofrecen una opción adicional de características de alta seguridad. Mediante el acoplamiento de moléculas se hace posible una dimensión adicional del análisis, por ejemplo a través de la detección de determinadas propiedades de las moléculas acopladas o a través de su masa. Las moléculas acopladas pueden ser p.ej. biotina y/o avidina y/o digoxigenina. Además, se pueden acoplar moléculas que se pueden detectar por separado mediante espectrometría de masas. El acoplamiento de moléculas de marcas de espín tales como p.ej. TEMPO, DOXYL o PROXYL se puede determinar en un análisis por ESR, que también se puede llevar a cabo con limitaciones mediante empleo de un material sólido. Los aminoácidos marcados con los isótopos estables ^{13}C y ^{15}N se pueden detectar mediante un análisis por NMR. (M. Engelhard, B. Hess, G. Metz, W. Kreutz, F. Siebert, J. Soppa y D. Oesterhelt, High resolution carbon-13-solid state NMR of Bacteriorhodopsin: assignment of specific aspartic acids and structural implications of single site mutations [NMR en estado sólido con carbono 13 con alta resolución de bacteriorrodopsina: asignación de específicos ácidos aspárticos e implicaciones estructurales de mutaciones de un solo sitio], Eur. Biophys. J. 18 (1990), 17-24).

Características de alta seguridad para la comprobación de la autenticidad se pueden obtener sorprendentemente también mediante utilización de moléculas poliméricas, cuya secuencia de monómeros es conocida y que están acopladas eventualmente a moléculas de bacteriorrodopsina. Como moléculas poliméricas se pueden emplear en tal caso p.ej. oligopéptidos, polipéptidos, proteínas, ácidos nucleicos, ácidos nucleicos peptídicos (APN's) o también polímeros sintéticos, no presentes en la naturaleza. Los polipéptidos y las proteínas pueden contener en tal caso porciones que no sean de proteínas, los ácidos nucleicos pueden contener porciones que no sean de ácidos nucleicos. Las porciones que no son de proteínas y las porciones que no son de ácidos nucleicos pueden abarcar p.ej. porciones de glicósidos, biotina y/o digoxigenina y/o avidina.

También es posible añadir a la tinta, de un modo adicional a la BR, uno o varios polímeros adicionales, que como constituyentes portadores de información suministran otras características de alta seguridad o que p.ej. sirven solamente para el ajuste de la viscosidad u otras propiedades mecánicas de la marcación.

Las moléculas poliméricas acopladas a bacteriorrodopsina como característica de alta seguridad, tales como p.ej. moléculas de ADN y/o ARN y/o APN y/o híbridos a base de las especies de moléculas mencionadas, se pueden detectar p.ej. mediante apropiadas reacciones de amplificación, tales como la reacción de PCR mediante cebadores específicos. La detección puede abarcar en este caso el análisis de tamaños por electroforesis en gel pero también la determinación directa de las secuencias de bases de ácidos nucleicos. Los polipéptidos se pueden analizar y detectar de una manera similar mediante determinación microanalítica de las secuencias. Por causa de las posibilidades, que ofrece la síntesis orgánica de ácidos nucleicos y de polipéptidos, pueden pasar a emplearse también secuencias que no se presentan en la naturaleza.

La combinación de características de baja seguridad y de características de alta seguridad ofrece interesantes ventajas. Una combinación de este tipo se puede obtener por ejemplo mediante el recurso de que la propiedad fotocroma de la bacteriorrodopsina se combina como característica de baja seguridad con una de las características de alta seguridad antes mencionadas. Es especialmente ventajoso utilizar para ello una bacteriorrodopsina en común con una molécula polimérica. La bacteriorrodopsina o una variante de bacteriorrodopsina se puede utilizar también por sí misma como molécula polimérica analizable. A pesar de la enorme variabilidad, las características de seguridad están vinculadas inseparablemente unas con otras. Junto a ello, es posible utilizar, adicionalmente a la bacteriorrodopsina como material fotocromo, polímeros diferentes de ésta acoplados a la BR y/o en forma libre.

El procedimiento conforme al invento para el aseguramiento de la autenticidad de objetos comprende la aplicación de una formulación fotocroma en forma de una tinta o tinta de imprenta sobre el respectivo objeto. La formulación fotocroma conforme al invento contiene también, junto a bacteriorrodopsina en la forma de tipo salvaje y/o por lo menos una variante de bacteriorrodopsina como porción fotocroma, eventualmente apropiadas sustancias auxiliares y/o apropiados materiales de matriz.

Las sustancias auxiliares se emplean para el proceso de aplicación: Con el fin de evitar la formación de una espuma y con el fin de mejorar las propiedades de uso y/o para la estabilidad: Para la microencapsulación de los materiales de formulación y para el apantallamiento de rayos UV y/o para el mejoramiento de la sensación óptica visual: Para influir sobre el espectro de absorción, p.ej. en los estados blanqueado y sin blanquear del material con bacteriorrodopsina. Ejemplos de tales materiales auxiliares son colorantes o pigmentos pasivos que se añaden sencillamente a la tinta a fin de conseguir una deseada coloración inicial o final. De este modo, se pueden formar también colores mixtos y/o se puede desplazar el espectro.

Materiales de matriz apropiados se emplean para la fijación del material de la formulación mediante inclusión física y/o acoplamiento covalente al material de matriz y/o mediante reticulación posterior del material de la formulación o del material de la matriz mediante métodos químicos o fotoquímicos. La reticulación puede abarcar en tal caso un tratamiento con glutaraldehído, con transglutaminasa, polimerización (por radicales) y/o una reticulación fotoquímica.

La aplicación de la formulación fotocroma conforme al invento se puede efectuar mediante procedimientos tecnológicos de impresión conocidos, tales como p.ej. impresión por transferencia (offset), por serigrafía, por chorros de tinta o por tampones, por aplicación mecánica mediante brochas, mediante proyección, inmersión o electroforesis. El material de bacteriorrodopsina conforme al invento se puede consolidar por subsiguiente desecación y el material de matriz sintético o biológico se puede hacer insoluble mediante un tratamiento posterior. Se puede aplicar la formulación propiamente dicha o un substrato auxiliar, sobre el que se ha aplicado la formulación. La formulación de bacteriorrodopsina puede presentarse en una forma microencapsulada. Las formulaciones cromáticas microencapsuladas son especialmente apropiadas para procedimientos de impresión.

En una forma de realización especialmente preferida del procedimiento conforme al invento para la marcación de un objeto mediando utilización de la tinta fotocroma, se aplica la tinta fotocroma sobre el objeto, a continuación se consolida por desecación y se fija mediante un material de matriz, pudiéndose llevar a cabo por iluminación un cambio de color de la formulación fotocroma. La energía mínima de luz necesaria para el cambio de color se puede ajustar de modo preferido a través del valor del pH de la formulación fotocroma.

Además, es preferido aplicar sobre un objeto que se ha de marcar dos superficies A y B, que en particular se delimitan una a otra, realizándose que la primera superficie A está marcada con la tinta que contiene una variante de bacteriorrodopsina y el segundo compartimiento B es provisto de un colorante no fotocromo, cuya remisión espectral no se diferencia en el estado no iluminado con respecto de la del primer compartimiento, pero que después de la iluminación muestra una remisión diferente con respecto de la del primer compartimiento. Además también es posible aplicar sobre el objeto que se ha de marcar dos superficies A y B en particular colindantes, realizándose que el primer compartimiento es marcado con una formulación fotocroma que contiene una primera bacteriorrodopsina, y que el segundo compartimiento es provisto de una segunda formulación fotocroma, cuya sensibilidad a la luz se diferencia de la del primero, de manera tal que el segundo compartimiento en el estado no iluminado no se diferencia en su remisión espectral de la del primer compartimiento, pero que después de la iluminación muestra una remisión distinta con respecto a la del primer compartimiento. La segunda formulación fotocroma contiene preferiblemente el tipo salvaje de bacteriorrodopsina y/o una variante de bacteriorrodopsina, que es diferente de la variante de BR utilizada en la primera formulación, y que sirve en particular como color de referencia.

Un objeto adicional del invento es una tinta fotocroma, que contiene por lo menos una variante de bacteriorrodopsina, preferiblemente por lo menos dos variantes de bacteriorrodopsina. Las variantes preferidas de bacteriorropsina son como antes se ha descrito, siendo una tinta fotocroma de este tipo apropiada en particular para la marcación de objetos con el fin de asegurar la autenticidad.

La tinta conforme al invento se puede utilizar en combinación con colorantes habituales conocidos por un experto en la especialidad, tales como por ejemplo un fluorocromo, pigmentos y/o otros pigmentos fotocromos en combinación. La tinta que contiene materiales de bacteriorrodopsina de acuerdo con el invento se puede utilizar igual que las tintas habituales, y aparte de para asegurar la autenticidad de objetos se puede emplear p.ej. también para la decoración y para otros efectos especiales.

Por el concepto de tinta se entiende aquí también cualquier líquido para escribir o líquido para imprimir coloreado y eventualmente un medio de aplicación pulverizado. Por el concepto de tinta entran en consideración también tintas de imprenta y otras composiciones cromáticas, que se pueden emplear para imprimir objetos o que encuentran utilización general en la producción de impresiones. En el caso de utilizar los materiales con bacteriorrodopsina como tinta se pueden utilizar como disolventes agua u otros disolventes tales como p.ej. los constituidos a base de un alcohol. De modo preferido, la tinta abarca por lo menos dos variantes de BR. Mediante la utilización de por lo menos dos variantes de bacteriorrodopsina, o de una variante de bacteriorrodopsina que tiene por lo menos dos modificaciones, se establecen efectos ventajosos para un análisis, por el hecho de que el análisis se puede realizar bidimensionalmente. Junto a la forma preferida de membrana de color púrpura de la bacteriorrodopsina, la tinta conforme al invento puede contener adicionalmente una bacteriorrodopsina en una forma solubilizada.

La bacteriorrodopsina en forma solubilizada se puede obtener expresando el gen de bacteriorrodopsina en un hospedante, tal como p.ej. en E. coli y reconstituyéndolo con retinaldehído añadido. Una posibilidad adicional consiste en que la bacteriorrodopsina como membrana de color púrpura se obtiene por eliminación de los lípidos. Para ello, por ejemplo una suspensión de membrana de color púrpura (densidad óptica OD_{570} < 5) se mezcla en agua o en un tampón con 1% de Triton-X 100 y se somete continuamente durante 1 h a la acción de ultrasonidos de una microsonda de un aparato sonificador. El material sobrenadante, obtenido después de haber separado por centrifugación, contiene bacteriorrodopsina en forma solubilizada.

Una formulación fotocroma que contiene BR se puede aplicar a cualquier objeto arbitrario. Objetos de interés especial son p.ej. documentos, documentos de valor, billetes de banco, obras artísticas, documentos de acreditación, prendas de vestir, vehículos automóviles, marcas de comprobación, sellos de calidad, etc..

Una forma adicional de realización del invento es por consiguiente un objeto provisto de una marcación, que contiene por lo menos una variante de bacteriorrodopsina. Esta marcación se produce preferiblemente con el procedimiento conforme al invento. La marcación contiene preferiblemente una tinta fotocroma, como antes se ha descrito.

Tal como ya se ha señalado antes, el tipo salvaje de bacteriorrodopsina tiene una pequeña sensibilidad frente a la luz, por lo que con fuentes luminosas intensas normales, por ejemplo la luz del sol, no es prácticamente posible llevar a cabo un blanqueo bien detectable a simple vista. Esta pequeña sensibilidad a la luz resulta de un pequeño tiempo de vida del estado M.

No obstante, el tiempo de vida del estado M del tipo salvaje de la bacteriorrodopsina se puede prolongar mediante medidas apropiadas. Un objeto adicional del invento es por lo tanto un procedimiento para el aseguramiento de la autenticidad de un objeto por aplicación de una tinta fotocroma sobre el objeto, utilizándose una tinta fotocroma, que contiene el tipo salvaje de bacteriorrodopsina como porción fotocroma, que en el caso de irradiación con luz situada en la región visible de longitudes de onda experimenta una modificación reversible y detectable visualmente del estado, que se puede usar como característica de baja seguridad en el caso de una comprobación de la autenticidad y que además contiene una sustancia auxiliar, que fija agua y/o que reduce la disponibilidad de protones. Mediante sustancias auxiliares, que aumentan la baja sensibilidad a la luz del tipo salvaje de la bacteriorrodopsina, se puede emplear el tipo salvaje de bacteriorrodopsina también en procedimientos para el aseguramiento de la autenticidad. Tales sustancias auxiliares, que se utilizan como adición a la tinta, sirven para aumentar el tiempo de vida del estado M del tipo salvaje de la bacteriorrodopsina. El tiempo de vida del estado M del tipo salvaje de bacteriorrodopsina aumenta en el caso de una eliminación casi total del agua. Las sustancias auxiliares tienen por consiguiente en lo esencial la finalidad de fijar agua o de reducir la disponibilidad de protones. Sustancias auxiliares apropiadas son por ejemplo compuestos, que contienen grupos amino primarios o secundarios. De modo especialmente preferido, como sustancias auxiliares se emplean arginina o guanidinio x HCl. Estas sustancias auxiliares se pueden utilizar también en el caso de variantes de bacteriorrodopsina para aumentar la sensibilidad a la luz.

En el procedimiento conforme al invento para el aseguramiento de la autenticidad de un objeto, la tinta fotocroma utilizada contiene por consiguiente de modo preferido una variante de BR o una mutante de BR, sirviendo la mutación para su uso como información acerca de una característica de alta seguridad y/o para aumentar la sensibilidad de la luz. De modo especialmente preferido, se utilizan variantes que contienen por lo menos dos modificaciones, a saber una modificación para el aumento de la sensibilidad a la luz de la bacteriorrodopsina y/u otra modificación que se puede detectar con procedimientos conocidos como característica de alta seguridad.

La utilización de la bacteriorrodopsina del tipo salvaje a solas es apropiada sólo condicionalmente a causa de la pequeña sensibilidad a la luz (la bacteriorrodopsina del tipo salvaje en el caso de las intensidades de iluminación usuales no modifica su color en una medida reconocible), y a causa de la disponibilidad general de la bacteriorrodopsina de tipo salvaje, presenta solamente un interés relativamente escaso para un aseguramiento de la autenticidad. Mediante la utilización de una combinación del tipo salvaje de bacteriorrodopsina y de una de las adiciones antes descritas con el fin de aumentar la sensibilidad a la luz, se pueden descubrir y alumbrar sin embargo interesantes aplicaciones. En una forma de realización preferida adicional, se utilizan las adiciones antes descritas para aumentar la sensibilidad a la luz, u otras adiciones, por ejemplo para ajustar la coloración inicial, marcaciones, etc., juntamente con una o varias variantes de bacteriorrodopsina o mutantes de bacteriorrodopsina.

El invento se explica con mayor detalle mediante los siguientes Ejemplos en conexión con las Figuras 1 y 2.

La Figura 1 muestra la evolución de un procedimiento para la comprobación de la autenticidad.

La Figura 2 muestra un proceso de copia mediando utilización de una característica de seguridad.

Ejemplo 1 Comprobación de una característica de baja seguridad.

Son fáciles de comprobar por los usuarios las propiedades fotocromas de una bacteriorrodopsina o de variantes de BR (Figura 1). Una característica 2 aplicada sobre un documento 1, tal como por ejemplo un billete de banco, un documento de valor, una obra de arte u otro objeto valioso, producida a partir de una formulación, que contiene la variante D96N de la bacteriorrodopsina, se puede comprobar p.ej. mediante el recurso de que en el caso de irradiación con luz 3 de un diodo luminiscente con un máximo de emisión en la región de color verde o amarillo, modifica su color desde púrpura hacia amarillo. Esto se puede reconocer con especial facilidad en 4, cuando no se irradia la superficie total. Sin hacer nada más, después de algunos segundos hasta algunos minutos, dependiendo de la formulación utilizada, se forma de retorno el color púrpura y se restablece el estado inicial. Alternativamente, por irradiación con luz 5 de un diodo luminiscente con un máximo de emisión en la región del azul, se puede restablecer inmediatamente el color púrpura. El esfuerzo técnico para la comprobación es mínimo. El usuario puede vigilar a simple vista la modificación del color, el proceso de medición se puede llevar a cabo sin embargo también mecánicamente.

Ejemplo 2 Protección contra la copia

Un documento 1, que contiene una característica 2 conforme al invento, en el que se emplean combinadas una determinada cantidad de un material con bacteriorrodopsina sensible a la luz, p.ej. la forma del tipo salvaje de la bacteriorrodopsina, y otra determinada cantidad de un material con bacteriorrodopsina que tiene una sensibilidad más alta a la luz, p.ej. la variante D96N de bacteriorrodopsina, presenta en el estado no iluminado una superficie uniforme con igual coloración (Figura 2). En lugar del material de bacteriorrodopsina insensible se puede utilizar también un colorante apropiado con igual coloración. Si este documento se reproduce con ayuda de una fotocopiadora 3, entonces, por iluminación con luz durante el proceso de copia, el material con bacteriorrodopsina sensible a la luz es blanqueado con mayor intensidad que el material circundante con menor sensibilidad a la luz. Por lo tanto la copia 4 tendrá una característica de baja seguridad 5, en la que la característica conserva duraderamente su coloración diferente. En este fenómeno la copia se puede reconocer inequívocamente como copia.

Ejemplo 3 Tratamiento posterior, sustancias auxiliares y procedimiento de aplicación a) Por reticulación posterior

Un substrato con una capa fotocroma secada, que constaba del material de matriz y de la bacteriorrodopsina, se cubrió durante 15 minutos con una solución al 40% de glutarodialdehído. Después de ello, la solución de glutarodialdehído se eliminó por lavado con agua. La capa fotocroma se había hecho insoluble en agua por el tratamiento.

b) Por medios fotoquímicos

10 mg de la membrana de color púrpura (BR-D96N) se distribuyeron finamente en 4 ml de una tinta que se endurece por luz UV (IFS3000, de la entidad Schmitt). Después de la aplicación de la mezcla mediante una rasqueta se efectuó el endurecimiento durante una noche bajo luz UV.

c) Aplicación Por serigrafía

El principio de la serigrafía es el calco, de modo similar a una técnica de impresión con plantilla. La forma o plancha de impresión consta de una tela de tamiz que está provista de una capa de barrera impermeable al color. El motivo de impresión permanece abierto. La impresión se efectúa mediante la retirada con una rasqueta del tamiz lleno de tinta. La tinta se transfiere en tal caso al substrato situado debajo. Para la producción de una tinta de serigrafía se incorporaron por agitación durante una noche, en una solución de PVA al 7,2% (Mowiol Tipo 56-98), 100 mg/ml de un pigmento (tipo salvaje de bacteriorrodopsina). En el caso de coincidencia de las propiedades reológicas con una muestra patrón, la muestra obtenida podría ser impresa con una máquina de serigrafía habitual.

Impresión offset

En 5 ml de una tinta sin pigmento (de la entidad Schmitt, IUF01) se incorporó con agitación a 50ºC 1 g de la membrana de color púrpura (BR-D96N). La mezcla así obtenida se podía imprimir mediante una técnica de offset corriente.

d) Protección mecánica Estratificación

La mezcla fotocroma aplicada sobre un substrato, que contenía bacteriorrodopsina, se incorporó por estratificación con un aparato estratificador en caliente (GPM, Mylam 9) con una bolsa de láminas del tipo GHQ-120TR a una temperatura de 90-140ºC.

e) Sustancias auxiliares Evitación de la formación de espuma

Se disolvió un PVA (poli(alcohol vinílico)) (del tipo Mowiol 56-98, 68 mg/ml) a 50ºC en agua. A esta mezcla se le añadió la membrana de color púrpura en forma secada por congelación (liofilizada), de manera tal que se obtuvo una concentración de 11 mg/ml. En esta mezcla se introdujo por agitación inferior 1-octanol (1% (v/v = volumen/volumen)) a la temperatura ambiente. La mezcla así obtenida tenía propiedades mejoradas al aplicar una impresión en lo que se refiere a la formación de burbujas y ampollas.

Apantallamiento frente a la radiación de UV

Para la protección del pigmento fotocromo, la mezcla se reunió con uno de los siguientes agentes absorbentes de UV, o con un derivado de ellos, en una concentración de 1 - 30%, preferiblemente de 3 - 10% p/p (peso/peso): benzofenona, hidroxi-naftoquinona, fenil-benzoxazol, un éster de ácido cinámico, sulfonamida, un éster de ácido amino-benzoico.

Ejemplo 4

Se trata de un documento de uso corriente, tal como p.ej. un billete de banco, que está provisto de una marcación de seguridad que contiene bacteriorrodopsina. Al iluminarlo, la marcación de seguridad modifica su color de violeta a amarillo. Después de un breve período de tiempo (aproximadamente 30 - 60 s) y/o al iluminarlo con luz de la región azul de longitudes de onda, se forma de nuevo el color originalmente violeta. Un documento de uso corriente de este tipo sería asegurado contra una reproducción no permitida o contra una falsificación.

Ejemplo 5

Igual que en el Ejemplo 4, pero mediando iluminación con luz de la región azul de longitudes de onda se efectúa un cambio de color de amarillo a violeta. Después de la iluminación, se forma de nuevo el color original mediante la luz del medio ambiente.

Ejemplo 6

Se trata de un documento, tal como p.ej. un contrato, que está provisto de una barra de color violeta. Esta barra es producida mediante impresión en dos veces con dos plantillas, que se comportan como un positivo y un negativo. Mediante la utilización de estas dos plantillas es posible utilizar dos formulaciones cromáticas, que se diferencian en su sensibilidad a la luz. Al iluminarla con luz blanca la capa sensible a la luz se colorea de violeta a amarillo, mientras que la otra capa no cambia de color o cambia de color sólo muy débilmente. En tal caso resulta un contraste de colores. Por consiguiente, es posible resaltar, a partir de la superficie antes homogénea una palabra (p.ej. un original) o cualquier otra sucesión de signos y/o pictogramas.

Ejemplo 7

Igual que en el Ejemplo 6, pero se imprime sobre papel normal o papel fotográfico, que después de ello se puede incorporar por estratificación. Fijado a un material de marca (prendas de vestir tales como p.ej. Jeans u otras) o como acompañamiento a un artículo de marca, entonces se puede asegurar la autenticidad de éste y por consiguiente se puede prevenir una piratería de productos.

Ejemplo 8

Con el fin de proteger a un documento con respecto de la reproducción indeseada por copia, se produce igual que en el Ejemplo 6 con dos plantillas una superficie que aparece como homogénea. Una parte de la superficie homogénea realiza al copiarla un cambio de color, por lo que la copia es caracterizada por una superficie heterogénea.

Claims (23)

1. Procedimiento para el aseguramiento de la autenticidad de un objeto por aplicación de una tinta fotocroma sobre el objeto, en el que se utiliza una tinta fotocroma que contiene por lo menos una variante de bacteriorrodopsina como porción fotocroma, que al irradiarse con luz en la región visible de longitudes de onda experimenta una modificación reversible, detectable visualmente, del estado, que se puede usar como característica de baja seguridad en el caso de una comprobación de la autenticidad, y que adicionalmente a la característica de baja seguridad presenta una o varias características de alta seguridad no detectables visualmente y comprobables solamente con una tecnología analítica instrumental.

2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque la variante de bacteriorrodopsina se selecciona entre variantes funcionales, variantes secuenciales, variantes por derivatización, variantes por cromóforos, variantes por isótopos y/o variantes por marcas de espín.

3. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque se utiliza una variante de bacteriorrodopsina con las siguientes características:

a)

la zona necesaria para estructuración de la forma de membrana de color púrpura de la proteína está inalterada con respecto al tipo salvaje de la bacteriorrodopsina,

b)

en bucles y/o en el extremo terminal de C y/o en el extremo terminal de N de la cadena de polipéptido está presente por lo menos un intercambio de aminoácidos con respecto al tipo salvaje de bacteriorrodopsina, que abarca deleciones (supresiones), adiciones, inserciones y/o sustituciones, realizándose que estos intercambios de aminoácidos no conducen a una modificación de las propiedades fotocromas de la bacteriorrodopsina, determinadas por la zona fotocroma.

4. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3, caracterizado porque se utiliza una variante de bacteriorrodopsina, en la que al extremo terminal de C se le ha añadido por lo menos un aminoácido.

5. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3 ó 4, caracterizado porque la variante de bacteriorrodopsina contiene por lo menos una cisteína.

6. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la variante de bacteriorrodopsina utilizada posee un foto-ciclo distinto del que tiene el tipo salvaje y/o un color inicial diferente del que tiene el tipo salvaje.

7. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque se utiliza una variante de BR seleccionada entre D36C, D96N y D85N.

8. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la tinta fotocroma abarca otra molécula polimérica.

9. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque se utiliza una variante de bacteriorrodopsina, en la que una molécula polimérica está acoplada a una bacteriorrodopsina.

10. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9, caracterizado porque la molécula polimérica es un polipéptido, que eventualmente tiene porciones que no son péptidos.

11. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9, caracterizado porque la molécula polimérica abarca ácidos nucleicos y/o derivados de estos, que eventualmente tienen porciones que no son ácidos nucleicos.

12. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 11, caracterizado porque los ácidos nucleicos y/o sus derivados, acoplados a la bacteriorrodopsina, son detectados mediante apropiadas reacciones de amplificación.

13. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 12, caracterizado porque se determina la secuencia de los productos de la amplificación.

14. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la formulación fotocroma abarca por lo menos dos variantes de bacteriorrodopsina y/o una variante de bacteriorrodopsina con por lo menos dos modificaciones.

15. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque además se emplean sustancias auxiliares

a)

para la evitación de la formación de espuma y para el mejoramiento de las propiedades de mojadura y/o

b)

para la microencapsulación de los materiales de la tinta y para el apantallamiento de radiaciones de UV con el fin de aumentar la estabilidad y/o

c)

para influir sobre el espectro de absorción del material de bacteriorrodopsina con el fin de mejorar la sensación óptica visual.

16. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque además se emplean materiales de matriz para la fijación del material fotocromo por

a)

inclusión física y/o

b)

acoplamiento covalente al material de matriz y/o

c)

reticulación.

17. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 16, caracterizado porque la variante de bacteriorrodopsina se distribuye finamente en una tinta endurecible mediante luz UV y la reticulación se efectúa por irradiación con luz UV.

18. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque se aplica sobre el objeto la formulación fotocroma propiamente dicha o un substrato auxiliar sobre el que se ha aplicado la tinta.

19. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque sobre el objeto que se ha de marcar se aplican dos superficies A y B en particular colindantes, siendo marcada la primera superficie A con la formulación fotocroma que contiene bacteriorrodopsina y siendo provisto el segundo compartimiento B con un colorante no fotocromo, cuya remisión espectral no se diferencia en el estado no iluminado de la del primer compartimiento, pero muestra después de la iluminación una remisión diferente con respecto a la del primer compartimiento.

20. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, en el que sobre el objeto que se ha de marcar se aplican dos superficies A y B en particular colindantes, siendo marcado el primer compartimiento con una primera formulación fotocroma que contiene bacteriorrodopsina, y siendo provisto el segundo compartimiento de una segunda formulación fotocroma, cuya sensibilidad a la luz se diferencia de la que tiene el primero, de manera tal que el segundo compartimiento en el estado no iluminado no se diferencia del primer compartimiento en cuanto a su remisión espectral, pero después de la iluminación muestra una remisión distinta con respecto a la del primer compartimiento.

21. Tinta fotocroma, caracterizada porque contiene por lo menos una variante de

\hbox{bacteriorrodopsina.}

22. Objeto, marcado conforme a un procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 20.

23. Procedimiento para el aseguramiento de la autenticidad de un objeto por aplicación de una tinta fotocroma sobre el objeto, utilizándose una tinta fotocroma que contiene el tipo salvaje de bacteriorrodopsina como porción fotocroma, que al iluminarse con luz en la región visible de longitudes de onda experimenta una modificación reversible, detectable visualmente, de estado, utilizable como característica de baja seguridad en una comprobación de la autenticidad y que además contiene una sustancia auxiliar que fija agua y/o reduce la disponibilidad de protones.