ES2198486T3

ES2198486T3 - Transferencia de electrones mediada por acido nucleico.

Info

Publication number: ES2198486T3
Application number: ES96919290T
Authority: ES
Inventors: Thomas J. Meade; Jon F. Kayyem; Scott E. Fraser
Original assignee: California Institute of Technology CalTech
Current assignee: California Institute of Technology CalTech
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-07
Publication date: 2004-02-01
Anticipated expiration: 2016-06-07
Also published as: EP1340764A2; EP1340764A3; ATE238337T1; US6291188B1; US6265155B1; EP0871642B1; US20020034759A1; WO1996040712A1; US7033760B2; US6177250B1; US5770369A; PT871642E; AU6166296A; DE69627703T2; US5824473A; DE69627703D1; DK0871642T3; EP0871642A1

Abstract

LA PRESENTE INVENCION PROPONE LA MODIFICACION COVALENTE SELECTIVA DE ACIDOS NUCLEICOS CON FRACCIONES REDOX ACTIVAS TALES COMO COMPLEJOS DE TRANSICION. FRACCIONES DONADORAS DE ELECTRONES Y ACEPTORAS DE ELECTRONES SE UNEN COVALENTEMENTE AL ESQUELETO RIBOSA-FOSFATO DE UN ACIDO NUCLEICO EN POSICIONES PREDETERMINADAS. LOS COMPLEJOS RESULTANTES REPRESENTAN UNA SERIE DE NUEVOS DERIVADOS QUE SON PLANTILLAS BIMOLECULARES CAPACES DE TRANSFERIR ELECTRONES A GRAN DISTANCIA Y CON VELOCIDADES EXTREMADAMENTE ALTAS. ESTOS COMPLEJOS POSEEN PROPIEDADES ESTRUCTURALES UNICAS QUE HACEN POSIBLE EL USO DE UNA CLASE COMPLETAMENTE NUEVA DE BIOCONDUCTORES Y SONDAS FOTOACTIVAS.

Description

Transferencia de electrones mediada por ácido nucleico.

Campo de la invención

La presente invención se dirige la transferencia de electrones a través de ácidos nucleicos. Más concretamente, la invención se dirige a mejoras en la odificación de ácidos nucleicos selectiva para un sitio con grupos de transferencia de electrones.

Antecedentes de la invención

La detección de secuencias de ácidos nucleicos específicas es una herramienta importante para la investigación en biología molecular y medicina de diagnóstico. Los ensayos con sondas de genes actualmente tienen un papel en la identificación de organismos infecciosos tales como bacterias y virus, en comprobar la expresión de genes normales, y en la identificación de genes mutantes tales como oncogenes, en tipificar tejidos según su compatibilidad antes del transplantes de tejidos, en emparejar muestras de tejidos y sangre en medicina forense, y para explorar la homología entre genes de especies diferentes.

Idealmente, un ensayo con sondas de genes debería ser sensible, específico, y fácilmente automatizable (para una revisión, consultar Nickerson, Current Opinion in Biotechnology 4:48-51 (1993)). El requerimiento de sensibilidad (es decir, límites de detección bajos) ha sido mitigado en gran medida por el desarrollo de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y otras tecnologías de amplificación que permiten a los investigadores amplificar exponencialmente una secuencia específica de ácido nucleico antes de su análisis (para una revisión, consultar Abramson et al., Current Opinion in Biotechnology 4:41-47 (1993)).

Por contra, la especificidad permanece como un problema en muchos ensayos con sondas de genes actualmente disponibles. El grado de complementariedad molecular entre la sonda y la diana define la especificidad de la interacción. Las variaciones en las concentraciones de sondas, de dianas, y de sales en le medio de hibridación, en la temperatura de reacción, y en la longitud de la sonda podrían alterar o influenciar la especificidad de la interacción sonda/diana.

Podría ser posible, en algunas circunstancias limitadas, distinguir dianas con complementariedad perfecta de dianas con emparejamientos erróneos, aunque esto es algo generalmente muy difícil usando la tecnología tradicional, puesto que pequeñas variaciones en las condiciones de la reacción alterarán la hibridación. Las nuevas técnicas experimentales para la detección de emparejamientos erróneos incluyen los ensayos de ligación con ADN en los que emparejamientos erróneos únicos impiden la ligación, y los ensayos de digestión con sonda, en los que los emparejamientos erróneos crean sitios para el corte de la sonda.

Finalmente, la automatización de los ensayos con sondas de genes permanece como un área en la que fallan las tecnologías actuales. Tales ensayos generalmente se basan en la hibridación de una sonda marcada a una secuencia diana, seguida por la separación de la sonda libre no hibridada. Esta separación se consigue generalmente mediante electroforesis en gel o captura en fase sólida, y lavado del ADN diana, y es generalmente bastante difícil de automatizar fácilmente.

La naturaleza costosa en tiempo de estos pasos de separación ha conducido a dos líneas de desarrollo distintas. Una implica el desarrollo de técnicas electroforéticas y otras técnicas de separación de alta velocidad y de alto rendimiento. La otra implica el desarrollo de ensayos con sondas de genes homogéneos y sin separación.

Por ejemplo, Gen-Probe, Inc. (San Diego, CA) ha desarrollado un ensayo de protección homogéneo en el que las sondas hibridadas se protegen de la hidrólisis con bases, y son, por tanto, capaces de la subsiguiente quimioluminiscencia (Okwumabua et al., Res. Microbiol. 143:183 (1992)). Desafortunadamente, el que este ensayo se base en un sustrato de quimioluminiscencia conocido por su elevada emisión de fondo de fotones sugiere que este ensayo no tendrá una especificidad elevada. La solicitud de la EPO con número 86116652.8 (EP-A-229.943) describe un intento de usar la transferencia de energía no radiante, desde una sonda donante a una sonda aceptora, como un esquema de detección homogéneo. No obstante, la transferencia de energía de fluorescencia está muy influenciada por ambas, la topología y topografía de la sonda, y la propia diana de ADN es capaz de atenuar la energía significativamente, resultando en una variabilidad considerable. Por tanto, hay necesidad de sondas de ADN que sean específicas, capaces de detectar emparejamientos erróneos, y que se puedan incorporar en un sistema automatizado para la identificación de secuencias.

Tal como se ha esbozado más arriba, la biología molecular depende bastante intensamente de oligonucleótidos modificados o marcados para los ensayos con sonda de genes (Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach. Eds. Gait et al., IRL Press, Oxford, R.U., 1984; Oligonucleotide and Analogues: A Practical Approach. Ed. F. Eckstein, Oxford University Press, 1991). A resultas de esto, actualmente existen varias técnicas para la síntesis de moléculas de ácidos nucleicos adaptadas. Puesto que los ácidos nucleicos no contienen de forma natural grupos funcionales a los que pudieran unirse covalente y fácilmente las moléculas de interés, se han desarrollado procedimientos que permiten la modificación química en uno cualquiera de los fosfatos terminales o en las bases heterocíclicas (Dreyes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:968 (1985)).

Por ejemplo, pueden prepararse análogos de los desoxirribo-y ribonucleósidos que contienen grupos amino en la posición 2' ó 3' del azúcar usando técnicas químicas establecidas. (Ver Imazawa et al., J. Org. Chem. 44:2039 (1979); Imazawa et al., J. Org. Chem. 43(15):3044 (1978); Verheyden et al., J. Org. Chem. 36(2):250 (1971); Hobbs et al., J. Org. Chem. 42(4):714 (1977)). Además, los oligonucleótidos podrían sintetizarse con enlaces fosfoamidas 2'-5' ó 3'-5' (Beaucage et al., Tetrahedron 49(10):1925 (1992); Letsinger, J. Org. Chem. 35:3800 (1970); Sawai, Chem. Lett. 805 (19845); Oligonucleotide and Analogues: A Practical Approach. Ed. F. Eckstein, Oxford University Press, 1991).

La modificación de ácidos nucleicos de ha realizado por dos razones: para crear marcadores de ADN no radiactivos que sirvieran como sondas, y para usar ADN modificado químicamente para obtener cortes específicos para un sitio.

Con este fin, el ADN podría marcarse para servir como una sonda alterando un nucleótido que entonces sirve como un análogo de remplazo en la resíntesis de la marca durante la traducción del ADN de doble hebra. Los nucleótidos alterados químicamente podrían proporcionar a continuación sitios reactivos para el anclaje de marcas inmunológicas u otras marcas tales como la biotina (Gilliam et al., Anal. Biochem. 157:199 (1986)). Otro ejemplo usa derivados de rutenio que se intercalan en el ADN para producir fotoluminiscencia en condiciones definidas (Friedman et al., J. Am. Chem. Soc. 112:4960 (1990)).

En la segunda categoría, hay un cierto número de ejemplos de compuestos unidos covalentemente al ADN que causan subsiguientemente el corte de la cadena de ADN. Por ejemplo, la 1,10-fenantrolina se ha acoplado a oligotimidilato de cadena única a través de un engarce, lo que resulta en el corte de oligonucleótidos poli-dA en presencia de Cu^{2+} y ácido 3-mercaptopropiónico (Francois et al., Biochemistry 27:2272 (1988)). Se han realizado experimentos similares para EDTA^{1}-Fe(II), tanto para ADN de doble hebra (Boutorin et al., FEBS Lett. 172:43-46 (1986) como ADN triple (Strobel et al., Science 249:73 (1990)), porfirina-Fe(III) (LeDoan et al., Biochemistry 25:6736-6739 (1986)), y 1,10-fenantronina-Cu(I) (Chen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:7147 (1985)), lo que resulta todo en el corte de la cadena de ADN en presencia de un agente reductor en soluciones aireadas. Un ejemplo similar usando porfirinas resultó en el corte de la hebra de ADN, y la oxidación de bases o el entrecruzamiento del ADN en condiciones muy específicas (LeDoan et al., Nucleic Acids Res. 15:8643 (1987)).

Otro trabajo se ha concentrado en la modificación química de bases heterocíclicas. Por ejemplo, el anclaje de un complejo de coordinación inorgánico, Fe-EDTA, a una base interna modificada resultó en la rotura del ADN después de su hibridación en presencia de dioxígeno (Dreyer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:968 (1985)), Se ha acoplado exitosamente un compuesto de rutenio a una base interna en un octámero de ADN, con retención tanto de las capacidades de hibridación del ADN como de las propiedades espectroscópicas de la marca de rutenio (Telser et al., J. Am. Chem. Soc. 111:7221 (1989)). Otros experimentos han añadido exitosamente dos marcas espectroscópicas separadas a una única molécula de ADN de doble hebra (Telser et al., J. Am. Chem. Soc. 111:7226 (1989)).

El estudio de las reacciones de transferencia de electrones en proteínas y ADN también se ha explorado en búsqueda de sistemas que sean capaces de transferir electrones a larga distancia.

Con este fin, se ha mostrado que la transferencia intramolecular de electrones en complejos proteína-proteína, tales como los hallados en proteínas fotosintéticas y proteínas en la vía respiratoria, tiene lugar a lo largo de distancias apreciables en el interior de proteínas, a velocidades biológicamente significativas (ver Bowler et al., Progress in Inorganic Chemistry: Bioinorganic Chemistry, Vol. 38, Ed. Stephen J. Lippard (1990)). Además, se ha conseguido la modificación selectiva de metaloenzimas con metales de transición, y se han desarrollado técnicas para monitorizar la transferencia de electrones en estos sistemas. Por ejemplo, se han modificado proteínas de transferencia de electrones, tales como el citocromo c, con rutenio a través de su anclaje sobre varias histidinas, y se ha medido la velocidad de transferencia de electrones desde el Fe^{2+} del hemo hasta el Ru^{3+} unido. Los resultados sugieren que podrían existir vías ``tunel'' de transferencia de electrones (Baum, Chemical & Engineering News, 22 de febrero, 1993, páginas 2023; ver también Chang et al., J. Am. Chem. Soc. 113:7056 (1991)). En un trabajo relacionado, el aislamiento normal de la proteína, que protege los centros redox de un enzima o proteína de reacciones indiscriminadas con el solvente externo, se ``soldó'' para transformar estos sistemas de aislantes eléctricos en conductores eléctricos (Heller, Acc. Chem. Res. 23:128 (1990)).

Hay unos pocos informes de transferencia fotoinducida de electrones en una matriz de ADN. En estos sistemas, los donantes y aceptores de electrones no están unidos covalentemente al ADN, sino asociados aleatoriamente con el ADN, haciendo por tanto difícil la elucidación explícita y el control del sistema donante-aceptor. Por ejemplo, la intensa fluorescencia de ciertas sales diazoaromáticas cuaternarias es atenuada a partir de su intercalación en el ADN, o a partir de su exposición a mononucleótidos individuales, presentando por tanto procesos de donación de electrones dentro del mismo ADN (Brun et al., J. Am. Chem. Soc. 113:8153 (1991)).

Otro ejemplo de la dificultad de determinar los mecanismos de transferencia de electrones se halla en el trabajo realizado con algunos compuestos fotoexcitables de rutenio. El trabajo temprano sugiere que ciertos compuestos de rutenio o se intercalan aleatoriamente entre las bases de nucleótidos, o se unen a la superficie de la hélice (Purugganan et al., Science 241:1645 (1988)). Una referencia reciente indica que ciertos compuestos de rutenio no se intercalan en el ADN (Satyanarayana et al., Biochemistry 31(39):9319 (1992)); en cambio, se unen no covalentemente a la superficie de la hélice de ADN.

En estos trabajos pioneros, se añadieron varios compuestos aceptores de electrones, tales como compuestos de cobalto, cromo o rodio, a ciertos compuestos donantes de electrones de rutenio asociado con ADN (Puragganan et al., Science 241:1645 (1988); Orellana et al., Photochem. Photobiol. 499:54 (1991); Brun et al., J. Am. Chem. Soc. 113:8153 (1991); Davis, Chem.-Biol. Interactions 62:45 (1987); Tomalia et al., Acc. Chem. Res. 24:332 (1991)). A partir de la adición de estos diversos compuestos aceptores de electrones, los cuales se unen aleatoriamente de forma no covalente a la hélice, se detectó la atenuación del estado fotoexcitado a través de la transferencia de electrones. La velocidad de atenuación dependía de ambos, el donante y aceptor de electrones individual, así como de sus concentraciones, revelando por tanto que el proceso era bimolecular.

En un conjunto de experimentos, los autores postulan que el donante unido a la superficie más móvil promueve la transferencia de electrones con mayor eficienciaque las especies intercaladas, y sugiere que el esqueleto de azúcares-fosfatos del ADN, y posiblemente el medio solvente que rodea el ADN, juegan un papel importante en el transporte del electrón (Purugganan et al., Science 241:1645 (1988)). En otro trabajo, los autores recalcan la dependencia de la velocidad de la movilidad del donante y aceptor, y de sus concentraciones locales, y asignan que el papel del ADN es principalmente facilitar un incremento en la concentración local sobre la hélice de las especies donante y aceptora (Orellana et al., ver más arriba).

En otro experimento, se informó de un donante de electrones intercalado aleatoriamente en la pila de bases del ADN, mientras que el aceptor estaba aleatoriamente asociado con la superficie del ADN. La velocidad de la atenuación de la transferencia de electrones indicó un estrecho contacto del donante y aceptor, y el sistema exhibió también una potenciación de la velocidad de transferencia de electrones con la adición de sal al medio (Fromherz et al., J. Am. Chem. Soc. 108:5361 (1986)).

En todos estos experimentos, la velocidad de transferencia de electrones para donantes y aceptores unidos no covalentemente es varios órdenes de magnitud inferior a la observada en solución libre.

Un estímulo importante para el desarrollo de sistemas de transferencia de electrones a larga distancia es la creación de sistemas sintéticos recolectores de luz. El trabajo hasta la fecha sugiere que un sistema artificial recolector de luz contiene un complejo de transferencia de energía, un complejo de migración de energía, un complejo de transferencia de electrones, y un complejo migrador de electrones (para una revisión tópica de este área, consultar Chemical & Engineering News, 15 de marzo de 1993, páginas 38-48). Se han probado dos tipos de moléculas: a) moléculas orgánicas largas, tales como hidrocarburos con especies de transferencia de electrones unidas covalentemente, o ADN, con especies de transferencia de electrones intercaladas, parcialmente intercaladas, o asociadas con la hélice, y b) polímeros sintéticos.

Las moléculas orgánicas largas, aunque son bastante rígidas, están influenciadas por un cierto número de factores, los cuales dificultan su desarrollo. Estos factores incluyen la polaridad y composición del solvente, la orientación de los grupos donante y aceptores, y el carácter químico del enlace covalente o de la asociación de la especie transferidora de electrones a la molécula.

La creación de sistemas de transferencia de electrones ha sido difícil debido a que los polímeros disponibles son demasiado flexibles, de forma que ocurren varios modos de transferencia. Los polímeros que son suficientemente rígidos a menudo interfieren significativamente con los mecanismos de transferencia de electrones o son bastante difíciles de sintetizar.

Por tanto, el desarrollo de un sistema de transferencia de electrones que sea suficientemente rígido, que tenga especies transferidoras de electrones unidas covalentemente a intervalos definidos, sea fácil de sintetizar, y no interfiera apreciablemente con el mecanismo de transferencia de electrones, sería útil en el desarrollo de sistemas artificiales recolectores de luz.

En conclusión, la distribución aleatoria y la movilidad de los pares donante y aceptor de electrones, junto con distancias potenciales cortas entre el donante y el aceptor, la asociación suelta y presumiblemente reversible de los donantes y aceptores, la dependencia descrita del solvente, y los amplias vías electrónicas putativas, y la alteración del esqueleto del ADN por parte de los compuestos intercalados, que hacen imposible el emparejamiento normal de bases, todos sirven como limitaciones acusadas de la transferencia de electrones a larga distancia en una matriz de ADN. Por tanto, es deseable un procedimiento para la producción de anclajes covalentes, rígidos, de donantes y aceptores de electrones, para proporcionar las mínimas perturbaciones del esqueleto del ácido nucleico y la retención de su capacidad para emparejar bases con normalidad. La presente invención sirve para proporcionar un sistema tal, el cual permite el desarrollo de nuevos bioconductores y sondas de diagnóstico.

Resumen de la invención

La presente invención proporciona medios para la modificación de ácidos nucleicos en sitios específicos con grupos activos redox, tales como complejos de metales de transición. Un grupo donante de electrones y un grupo aceptor de electrones se unen covalentemente en posiciones predeterminadas. Los complejos resultantes representan una serie de nuevos derivados que son plantillas bimoleculares capaces de transferir electrones a lo largo de distancias muy grandes con velocidades extremadamente elevadas. Estos complejos poseen características estructurales únicas que permiten el uso de una clase enteramente nueva de bioconductores y sondas de diagnóstico.

De acuerdo con esto, es un objeto de la invención proporcionar ácidos nucleicos con especies transferidoras de electrones unidas covalentemente a una base terminal del ácido nucleico. Es además otro objeto proporcionar ácidos nucleicos con especies orgánicas transferidoras de electrones unidas covalentemente.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 ilustra todas las posibles orientaciones de los grupos donante de electrones (EDM, electron donor moieties) y aceptor de electrones (EAM, electron acceptor moieties) sobre un ácido nucleico de hebra única.

La Figura 2 ilustra las posibles orientaciones de grupos de transferencia de electrones EDM y EAM sobre dos ácidos nucleicos de hebra única adyacentes. Estas orientaciones se aplicarán también cuando las dos sondas están separadas por un secuencia intermedia.

La Figura 3 ilustra una serie de precursores nucleósidos, modificados con amino, antes de su incorporación en un oligonucleótido.

Las Figuras 4A y 4B ilustran el esqueleto de grupos transferidores de electrones. La Figura 4A ilustra la fórmula general de un clase representativa de donantes y aceptores de electrones. La Figura 4B ilustra un ejemplo específico de un grupo transferidor de electrones de rutenio usando bisbipiridina e imidazol como ligandos.

La Figura 5 es un esquema que muestra metales de transición unidos al esqueleto de ribosa-fosfato en una variedad de posiciones. M es un metal de transición. M_{1} está unido a través de una amina sobre el carbono 2' de la ribosa; un electrón debe viajar a través de 4 enlaces \sigma para entrar en los orbitales pi (``la vía pi'') de las bases apiladas. M_{2} y M_{3} están unidos a través de enlaces del tipo fosforamido, los electrones deben viajar respectivamente a través de 7 enlaces \sigma para entrar la vía pi. M_{4} está unido a través de una amina sobre el carbono 3' de la ribosa, y un electrón viaja a través de 5 enlaces \sigma.

Las Figuras 6A, 6B y 6C ilustran el anclaje de un nucleósido 2'-amino-modificado con vidrio de poro controlado (CPG) y la formación de un ácido nucleico de hebra única con la elongación y unión de complejos de metales de transición como las especies transferidoras de electrones ejemplificadas. Las condiciones experimentales ser esbozan en el EJEMPLO 9. La Figura 6A ilustra la formación de 2'-amino-2'-desoxiuridina derivada con vidrio de poro controlado (CPG). Se ilustra la uridina modificada 2'-amino, aunque podría usarse cualquier base. Tal como se sabe en la técnica, los nucleósidos fosforamiditos se añaden a los nucleósidos derivados, después de retirar el grupo protector DMT, tal como se ilustra de forma general en la Figura 6B, usando la secuencia UCTCCTACAC como un ejemplo. La adición 5' terminal de una fosforamidito 2'-amino-desoxiuridina, con un grupo protector DTM, resulta en un ácido nucleico de hebra única que contiene 3' y 5' un nucleósido 2'-amino modificado. La Figura 6C ilustra la adición de las especies transferidoras de electrones, ejemplificadas por dos complejos de metal de transición de rutenio,

\hbox{im(bpy) _{2} Ru}

y Ru(II)(NH_{3})_{4}py.

La Figura 7 ilustra la adición de grupos transferidores de electrones, ejemplificados por un complejo de metal de transición, al extremo C-terminal de PNA. La Figura 9 un 4-aminometilpiridina al extremo C-terminal, para formar un ligando que podría unir el metal al nitrógeno del anillo de piridina.

Las Figuras 8A y 8B ilustran la unión de ácidos nucleicos amino-modificados de la invención a los electrodos. (A) ilustra el anclaje a electrodos de carbón vidriado. R es el oligonucleótido, y GCE es el electrodo de carbón vitrificado. (B) ilustra el anclaje de los ácidos nucleicos amino-modificados de la invención a superficies oxidadas usando reacciones con silano.

Descripción detallada

A menos que se indique lo contrario, el término ``ácido nucleico'' u ``oligonucleótido'', o los equivalentes gramaticales de los mismos, significan al menos dos nucleótidos unidos juntos covalentemente. Un ácido nucleico de la presente invención generalmente contiene enlaces fosfodiéster, aunque en algunos casos, tal como se ha esbozado más arriba, se incluyen análogos de un ácido nucleico que podrían tener esqueletos alterados, comprendiendo, por ejemplo, uniones fosforamidas (Beaucage et al., Tetrahedron 49(10):1925 (1993) y referencias en ésta; Letsinger, J. Org. Chem. 35:3800 (1970); Sprinzl et al., Eur. J. Biochem. 81:579 (1977); Letsinger et al., Nucl. Acids Res. 14:3487 (1986); Sawai et al., Chem. Lett. 805 (1984); Letsinger et al., J. Am. Chem. Soc. 110:4470 (1988); y Pauwels et al., Chemica Scripta 26:141 (1986)), fosforotioatos, fosforoditioatos, O-metil-fosforamiditos (ver Eckstein, Oligonucleotide and Analogues: A Practical Approach, Oxford University Press), y esqueletos y uniones péptido-ácido nucleico (ver Egholm, J. Am. Chem. Soc. 114:1895 (1992); Meier et al., Chem. Int. Ed. Engl. 31:1008 (1992); Nielsen, Nature 365:566 (1993); Carisson et al., Nature 380:207 (1996)). Estas modificaciones del esqueleto ribosa-fosfato podrían hacerse para facilitar la adición de grupos transferidores de electrones, o para incrementar la estabilidad y vida media de tales moléculas en entornos fisiológicos.

Son particularmente preferidos los péptidos-ácido nucleico (PNA). Este esqueleto es sustancialmente no iónico en condiciones neutras, en contraste con el esqueleto fosfodiéster altamente cargado de los ácidos nucleicos que ocurren de forma natural. Esto resulta en dos ventajas. Primero, este esqueleto presenta cinéticas de hibridación mejoradas. Los PNA tienen grandes cambios en la temperatura de fusión (Tm) para pares de bases emparejados erróneamente respecto los emparejados perfectamente. El ADN y ARN presentan típicamente una caída de 2-4ºC en la Tm para un emparejamiento erróneo interno. Con el esqueleto no iónico del PNA, la caída es cercana a 7-9ºC. Esto permite una mejor detección de emparejamientos erróneos. De forma similar, debido a su naturaleza no iónica, la hibridación de las bases unidas a estos esqueletos es relativamente insensible a la concentración de sal. Estos es particularmente ventajoso en los sistemas de la presente invención, puesto que una solución de hibridación con sales reducidas tiene un corriente de Faraday inferior que una solución salina fisiológica (en el rango de 150 mM).

Los ácidos nucleicos podrían ser de hebra única o de doble hebra, según se especifique, o contener porciones de secuencias de doble hebra y de hebra única. El ácido nucleico podría ser de ADN, tanto genómico como cADN, ARN, o un híbrido, en donde el ácido nucleico contiene cualquier combinación de desoxirribo-y ribonucleótidos, y cualquier combinación de bases, incluyendo uracilo, adenina, timina, citosina, guanina, inosina, xantina e hipoxantina, etc. En el caso de un ``ácido nucleico intermediario'', el término se refiere a uno o más nucleósidos. Tal como se usa en ésta, el término ``nucleósido'' incluye los nucleótidos.

Los términos ``grupo donantes de electrones'', ``grupo aceptor de electrones'', y ``grupos transferidores de electrones'', o los equivalentes gramaticales de los mismos, se refieren a moléculas capaces de transferir electrones en ciertas condiciones. Debe entenderse que las capacidades donante y aceptora de electrones son relativas, esto es, una molécula que puede perder un electrón bajo ciertas condiciones experimentales será capaz de aceptar un electrón bajo condiciones experimentales diferentes. Debe comprenderse que el número de grupos donantes de electrón y grupos aceptores de electrón es muy elevado, y que alguien especialista en el tema de compuestos transferidores de electrones será capaz de utilizar un cierto número de compuestos en la presente invención. Los grupos transferidores de electrones incluyen, pero no se limitan a, complejos de metales de transición, grupos orgánicos transferidores de electrones, y electrodos.

En una realización preferida, los grupos de transferencia de electrones son complejos de metales de transición. Los metales de transición son aquéllos cuyos átomos tienen una capa d de electrones incompleta. Los metales de transición apropiados para su uso en la invención incluyen, pero no se limitan a, el cadmio (Cd), magnesio (Mg), cobre (Cu), cobalto (Co), paladio (Pd), zinc (Zn), hierro (Fe), rutenio (Ru), rodio (Ro), osmio (Os), renio (Re), platino (Pt), escandio (Sc), titanio (Ti), vanadio (Va), cromo (Cr), manganeso (Mn), níquel (Ni), molibdeno (Mo), tecnecio (Tc), tungsteno (W), e iridio (Ir). Esto es, se prefieren, la primera serie de metales de transición, los metales del platino (Ru, Rh, Pd, Os, Ir y Pt), junto con el Re, W, Mo, y Tc. Son particularmente preferidos el rutenio, renio, osmio, platino y hierro.

Los metales de transición se complejan con una variedad de ligandos para formar complejos de metales de transición apropiados, tal como es bien conocido en la técnica. Los ligandos apropiados incluyen, pero no se limitan a, -NH_{2}; piridina; pirazina; isonicotinamida; imidazol; bipiridina y derivados sustituidos de la bipiridina; fenantrolinas, particularmente la 1,10-fenantrolina (abreviada como phen) y los derivados sustituidos de fenantrolinas tales como la 4,7-dimetilfenantrolina; dipirofenazina; 1,4,5,8,9,12-hexaazatrifenileno (abreviado hat); 9,10-fenantrenequinona diimina; 1,4,5,8-tetraazafenanteneo (abreviado tap); 1,4,8,11-tetra-azaciclotetradecano; diaminopiridina (abreviada damp); porfirinas y derivados sustituidos de la familia porfirina. En la Figura 4A se muestra una fórmula general que es representativa de una clase de donantes y aceptores que podrían emplearse. Los grupos R^{1}, R^{1}, R^{3}, R^{4} y R^{5} podrían ser cualquier ligando de coordinación que es capaz de unirse covalentemente al metal escogido, y podría incluir cualquier de los ligandos anteriores. En la Figura 4B se muestra la estructura de una especie transferidora de electrones de rutenio usando bisbipiridina e imidazol como ligandos. Los ejemplos de complejos transferidores de electrones útiles incluyen, pero no se limitan a, aquéllos mostrados en la TABLA 1.

TABLA 1

\dotable{\tabskip\tabcolsep\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 Donantes \+ \+ Aceptores\cr 
Ru(bpy) _{2} im-NH-U
\+ \+
Ru(NH _{3})_{5} -NH-U\cr 
Ru(bpy) _{2} im-NH-U
\+ \+
Ru(NH _{3})_{4} py-NH-U\cr 
Ru(bpy) _{2} im-NH-U
\+ \+
Ru(NH _{3})_{4} im-NH-U\cr 
\+
tran-Ru(cyclam)py\+\cr}

en donde,

Ru = rutenio,

bpy = bisbipiridina,

im = imidazol,

py = piridina,

cyclam = 1,4,8,11-tetra-azaciclotetradecano

Otros grupos apropiados incluyen la,

bis(fenantrolina)(dipirofenazina)Ru(II) (abreviada [Ru(phen)_{2}dppz]^{2+});

bis(9,10-fentrenequinona diimina)(fenantrolina)Rh(III) (abreviada [Rh(phi)_{2}phen]^{3+});

tris(fenantrolina)Ru(II) (abreviada [Ru(o-phen)_{3}]^{2+}];

Co(phen)_{3}^{3+};

Co(bpy)_{3}^{3+};

Rh(phen)_{3}^{3+};

Cr(phen)_{3}^{3+};

Ru(bpy)_{2}(dppz)^{3+}; y

Ru(bpy)_{3}^{2+};

Además de los complejos de metales de transición, otros donantes y aceptores orgánicos de electrones podrían unirse covalentemente al ácido nucleico para su uso en la invención. Estas moléculas orgánicas incluyen, pero no se limitan a, la riboflavina, los colorantes de xanteno, los colorantes de azina, el naranja de acridina, el dicloruro de N,N-dimetil-2,7-diazapirenio (DAP^{2+}), el metilviologen, el bromuro de etidio, quinonas tales como el dicloruro de N,N'-dimetilantra(2,1,9,-def:6,5,1,0-d'e'f')diisoquinolina (ADIQ^{2+}); las porfirinas ([tetracloruro de mesotetraquis(N-metil-x-piridinio)porfirina]; el hidrocloruro de azul B de varlamina; el verde de Bindschedler; el 2,6-dicloroindofenol, el 2,6-dibromofenolindofenol; el azul crest brillante (cloruro de 3-amino-9-dimetil-amino-10-metilfenoxiazina); azul de metileno; azul A del Nilo (sulfato de aminoaftodietilaminofenoxazina); índigo-ácido 5,5',7,7'-tetrasulfónico; índigo-ácido 5,5',7-trisulfónico; fenosafranina; índigo-ácido 5-monosulfónico; safranina T; cloruro de bis(dimetilglioximato)-hierro(II); escarlata de indulina; rojo neutro; y derivados sustituidos de estos compuestos.

En una realización, los donantes y aceptores de electrones son proteínas redox tal como se conoce en la técnica. No obstante, en muchas realizaciones no se prefieren las proteína redox.

En una realización particularmente preferida, un grupo transferidor de electrones comprende un soporte sólido, tal como un electrodo al que se ha unido el ácido nucleico, covalentemente o de otro modo. Esto es, el electrodo sirve como ambos donante y aceptor de electrones, y se describe con mayor detalle más abajo. Las técnicas usadas en esta realización son análogas al empalme de proteínas a un electrodo, excepto que se usan los ácidos nucleicos de la presente invención en vez de una proteína redox (ver, por ejemplo, Gregg et al., J. Phys. Chem. 95:5970 (1991); Heller et al., Sensors and Actuators R. 13-14:180 (1993); y Pishko et al., Anal. Chem. 63:2268 (1991)).

La unión al electrodo se utiliza para iniciar una vía de transferencia de electrones a través de un potencial aplicado, y para procedimientos electrónicos de monitorización de la transferencia de electrones.

En una realización preferida, el transporte de electrones entre el electrodo y el ácido nucleico puede ser indirecto, utilizando mediadores del transporte de electrones, que están libres en la solución o embebidos en un gel o polímero, para proporcionar un tipo de acoplamiento electrónico entre el electrodo y los ácidos nucleicos. En una realización preferida, los ácidos nucleicos modificados con un grupo transferidor de electrones de la invención se unen a través de una matriz tal. La unión a la matriz tiene varias ventajas para su uso en un sensor de gen de ácido nucleico. Debido a la naturaleza tridimensional del polímero, pueden anclarse un número elevado de sondas de ácido nucleico modificadas a un área pequeña del electrodo. Usando un ``hidrogel'' altamente poroso, las velocidades de hibridación de ácido nucleico pueden ser bastante elevadas, igualando prácticamente las del ácido nucleico en solución.

Por ejemplo, los polímeros con moléculas redox covalentemente unidas se comportan como mediadores altamente efectivos de la transferencia de electrones. Los polímeros de siloxano y óxido de etileno, modificados con moléculas de ferroceno, demostraron la transferencia de electrones entre enzimas y un electrodo; por ejemplo, se ha observado que los polímeros flexibles de siloxano y óxido de etileno unidos covalentemente al ferroceno o Os(bpy)_{2} son polímeros redox altamente efectivos para mediar la transferencia de electrones desde varios enzimas a un electrodo (ver Boguslavsky et al., Solid State Ionics V. 60, p. 189 (1993)). De forma similar, se ha preparado un cemento epoxi conductor redox (ver Hellar et al., J. Phys. Chem. 95:5970 (1991)). También se han preparado geles redox entrecruzados, para aplicaciones de biosensores amperométricos, con oxidasa de glucosa conectada eléctricamente a electrodos, de forma que se observó que los electrones fluían desde el enzima, a través del polímero, hacia el electrodo (ver Hellar, A. et al., Anal. Chem. 62:258 (1990)).

En esta realización, se prefiere que un polímero redox, tal como un complejo de poli-(vinilpiridina) con Os(bby)_{2}Cl, esté entrecruzado con un epóxido, tal como un diepóxido, para formar un cemento epóxido conductor redox, el cual es capaz de unirse fuertemente a electrodos hechos de material conductor, tal como oro, carbón vidriado, grafito, y otros materiales conductores. Esta unión fuerte se incluye en la definición de ``covalentemente unido'' para los propósitos de esta realización. El polímero entrecruzado de epóxido se hace reaccionar entonces con, por ejemplo, una amina expuesta, tal como la amina de un ácido nucleico amino-modificado descrito más arriba, uniendo covalentemente el ácido nucleico al complejo, formando un ``hidrogel redox'' sobre la superficie del electrodo.

De una forma análoga, el ADN modificado químicamente puede sustituir al enzima redox o mediador con el resultado de que se observan procesos de transferencia de electrones desde un grupo ADN-modificado con un metal de transición, a través de un polímero conductor redox acoplado, hasta un electrodo.

Los mediadores apropiados incluyen hidroquinonas/quinonas de ferroceno/ferricinio solubles en agua, componentes de sales orgánicas reducibles y oxidables, cobaltocenos, los hexa-y octacianuros de molibdeno, tungsteno y hierro. Además, se usan los macrociclos y ligandos quelantes de metales de transición como el cobalto, rutenio y níquel, incluyendo la Co(etilenediamina)_{3} y la Ru(etilenediamina)_{3}, y los complejos de trisbipiridil y hexamina de metales de transición tales como el Co, Ru, Fe y Os (ver Alyanasundaram, más arriba).

En una realización preferida, el transporte de electrones entre el electrodo y el ácido nucleico puede dirigirse a través de un enlace covalente. Una ventaja de estos sistemas es que puede influenciarse la orientación de la sonda de ADN para reducir cualquier torsión hacia atrás desde la sonda hacia el electrodo. También, un control más preciso del potencial aplicado y de la corriente medida está asociado con enlaces covalentes más cortos con respecto a geles y polímeros.

En una realización preferida, los enlaces covalentes deben ser altamente conductores, tales como en un polímero redox (Hellar, A., Acc. Chem. Res. Vol. 23, p. 128, 1990). Alternativamente, si son pobremente conductores, la longitud del enlace debe mantenerse corta. En consecuencia, una realización preferida tiene un electrón que atraviesa no más de aproximadamente cinco enlaces \sigma, siendo especialmente preferida cuando atraviesa no más de tres. Las barras de pasta de carbón y de carbón vitrificado se han mostrado fiables y efectivas como electrodos en una variedad de sensores químicos, incluyendo biosensores sensibles basados en el enzima oxidasa de glucosa, y podrían usarse en la presente invención. Además, se ha observado que los polímeros flexibles de oxido de etileno y siloxano unidos covalentemente a moléculas de ferroceno o Os(bpy)_{2} sin polímeros redox altamente efectivos para mediar la transferencia de electrones desde varios enzimas hacia un electrodo. Los ácidos nucleicos modificados de amino-ribosa se unen a los electrodos de carbón mediante variaciones de estas técnicas de la literatura. Finalmente, los ácidos nucleicos se unen más directamente a los electrodos de carbón oxidados mediante residuos de guanosina, usando la química conocida de la carbodiimida y de la N-hidroxisuccinimida.

En una realización preferida, se usan electrodos de carbón vitrificado (GCE). En esta realización, se usan grupos amina, tal como se ha esbozado más arriba, sobre el carbón 2' ó 3' del anillo de ribosa para el anclaje. La reacción progresa a través de la oxidación de un grupo amina hasta un radical catiónico, el cual forma un enlace covalente y químicamente estable entre la amina y el borde del plano de la superficie del GCE (ver Deinhammer, R. et al., Langmuir 10:1306 (1994)). Esta estrategia sintética ha sido caracterizada en detalle usando espectroscopia de X-rayos foto-electrón y voltimetría cíclica. El rendimiento usando esta química puede ser bastante elevado, aproximadamente 1 \times 10^{10} moléculas/cm^{2}. El compuesto de amina forma un enlace estable con la superficie de carbón, y los efectos estéricos influencian la eficiencia de unión. La reactividad de las aminas primarias es sustancialmente mayor que la de las aminas secundarias; la unión de aminas terciarias no se ha observado en absoluto.

En la Figura 8A se ilustra el procedimiento desarrollado por Deinhammer, R. et al., para preparar los GCE para el tratamiento electroquímico en solución que contiene aminas, empleando los oligonucleótidos amino-modificados (grupo amino primario) descritos antes.

Además, el ADN se ha inmovilizado sobre GCE usando una carodimida soluble en agua (Mikkelsen et al., Electroanalysis 4:929 (1992)).

En una realización preferida, los ácidos nucleicos de la invención se unen a electrodos de oro. Hay varios procedimientos disponibles para la unión covalente de especies redox activas a superficies de oro, y se han observado reacciones de transferencia de electrones con estos materiales. Se prepararan hidroxitioles (OH(CH_{2})_{x}SH) de diferentes longitudes mediante variación de procedimientos de la literatura (ver Miller, C. et al., J. Phys. Chem. 95:877 (1991) y Chidsey, C.E.D. Science V. 251, p. 919 (1991)). El EJEMPLO 8 esboza la preparación de hidroxitioles que se unen a electrodos de oro.

En la técnica se conocen procedimientos alternativos para la preparación de hidroxitioles. Los electrodos o superficies de Au se preparan mediante procedimientos de la literatura, y los hidroxitioles modificados se adsorben sobre el Au.

En una realización adicional, los ácidos nucleicos modificados de la invención se unen covalentemente a superficies oxidadas en película fina. Se han descrito que una variedad de compuestos pueden unirse covalentemente (en forma de monocapas) a electrodos de película fina de SnO_{2}, TiO_{2}, RuO_{2} y Pt. (ver Lenhard, J. y Murray, R. J. Electroanal. Chem. 78:195 (1977)). Se ha observado la electroquímica reversible de los complejos unidos a superficie, tales como la 3,5-dinitrobenzamida. Los complejos descritos se unen al electrodo a través de un anclaje con enlace amida. Empleando estos procedimientos de la literatura, pueden prepararse derivados análogos, usando oligonucleótidos amino-modificados descritos en este trabajo, y se representan esquemáticamente en la Figura 8B.

En consecuencia, usando los procedimientos anteriores, los oligonucleótidos podrían unirse a un soporte sólido de tal forma que el electrodo sirve como uno u otro, o como grupo donante de electrones, o como grupo aceptor de electrones.

Por tanto, pueden hacerse todas las combinaciones de donantes y aceptores de electrones: dos complejos de metal de transición; dos especies orgánicas transferidoras de electrones; un metal de transición, un grupo orgánico; un metal de transición y un electrodo; y un grupo orgánico y un electrodo. La elección de las especies transferidoras de electrones dependerá en parte del procedimiento de inicio y detección requerido, tal como se describe con mayor detalle más abajo.

El término ``secuencia diana'', o los equivalentes gramaticales del mismo, se refieren a una secuencia de ácido nucleico sobre una hebra única de ácido nucleico. La secuencia diana podría ser una porción de un gen, una secuencia reguladora, ADN genómico, cADN, mARN, u otros. Podría ser de cualquier longitud, entendiéndose que secuencias más largas son más específicas. Tal como se esboza más detalladamente más abajo, las sondas se construyen para hibridarse a secuencias dianas para determinar la presencia o ausencia de la secuencia diana en la muestra. Hablando generalmente, este término será comprendido por los especialistas en la técnica.

Las sondas de la invención se diseñaron para que fueran complementarias con la secuencia diana, de tal forma que ocurran la hibridación de la secuencia diana y de las sondas de la presente invención. Tal como se ha esbozado más arriba, esta complementariedad no tiene porque ser perfecta; podría haber cualquier número de emparejamientos erróneos, los cuales interferirían con la hibridación entre la secuencia diana y los ácidos nucleicos de hebra única de la presente invención. No obstante, si el número de mutaciones es tal grande que no puede ocurrir la hibridación incluso bajo las condiciones de hibridación menos exigentes, la secuencia no es una secuencia diana complementaria.

Podrían usarse una variedad de condiciones de hibridación en la presente invención. Tal como es bien conocido en la técnica, exigencia ``elevada'' se refiere usualmente a condiciones tales como 0,1XSSC a 65ºC, las condiciones de exigencia reducida incluyen 2-5XSSC a 25-50ºC. Las condiciones de hibridación podrían variar también cuando se usa un esqueleto no iónico, tal como el PNA, como es bien sabido en la técnica.

Los términos ``primer dominio diana'' y ``segundo dominio diana'', o los equivalentes gramaticales en ésta, se refieren a dos porciones de una secuencia diana dentro de un ácido nucleico que está bajo examen. El primer dominio diana podrían estar directamente adyacente al segundo dominio diana, o los dominios diana primero y segundo podrían estar separados por un dominio diana intermediario. Los términos ``primero'' y ``segundo'' no se pretende que confieran una orientación a las secuencias con respecto la orientación 5'-3' de secuencia diana. Por ejemplo, asumiendo una orientación 5'-3' de la secuencia diana complementaria, el primer dominio diana podría ubicarse o 5' respecto el segundo dominio, o 3' respecto el segundo dominio.

La presente invención se dirige, en parte, a la modificación selectiva para un sitio de ácidos nucleicos con grupos redox activos, tales como complejos de metal de transición, para la preparación de una nueva serie de biomateriales capaces de transferir electrones a grandes distancias a través de la matriz de ácido nucleico. La presente invención proporciona medios para la colocación precisa de los grupos donante y aceptor de electrones, en sitios predeterminados, sobre un ácido nucleico de hebra única o doble hebra. En general, la transferencia de electrones entre grupos donante y aceptor de electrones en un ácido nucleico de doble hélice no ocurre a una velocidad apreciable a menos que exista el emparejamiento de bases de nucleótidos en la secuencia entre el donante y el aceptor de electrones en la estructura de doble hélice.

Esta diferencia en la velocidad de transferencia de electrones forma la base de una utilidad de la presente invención para su uso como sonda. En el sistema de la presente invención, cuando los grupos transferidores de electrones están unidos covalentemente al esqueleto del ácido nucleico, los electrones putativamente viajan a través de los orbitales \pi de los pares de bases apilados de la doble hebra del ácido nucleico. La velocidad de transferencia de electrones depende de varios factores, incluyendo la distancia entre el par donante-aceptor de electrones, la energía libre (\DeltaG) de la reacción, la energía de reorganización (\lambda), la contribución del medio interpuesto, la orientación y el acoplamiento electrónico del par donante y aceptor, y los puentes de hidrógeno entre las bases.

La contribución del medio interpuesto depende, en parte, del número de enlaces sigma (\sigma) que debe atravesar el electrón, desde el donante de electrones, para alcanzar la pila de bases, o para salir de la pila para alcanzar el aceptor de electrones. Tal como se muestra en la Figura 5, cuando el metal está unido al esqueleto de ribosa-fosfato a través de un grupo amida sobre el carbono 2' de la ribosa, un electrón debe viajar a través de cuatro enlaces \sigma para alcanzar la pila: el enlace metal a nitrógeno, el enlace nitrógeno a carbono 2', y desde el carbono 2' hasta la base, o viceversa, dependiendo de la dirección del flujo de electrones. Puesto que la base del nucleótido está conjugada en cierto grado, puede considerarse que la base está en el borde de la ``vía \pi'', esto es, los orbitales \pi conjugados de la pila de pares de bases. Cuando el metal se une al esqueleto de ribosa-fosfato a través del carbono 3' de la ribosa, un electrón debe atravesar 5 enlaces \sigma. Cuando el metal se une a través de enlaces del tipo fosforamida, un electrón debe atravesar 7 enlaces \sigma. En las realizaciones preferidas, las composiciones de la invención se diseñan de tal forma que los grupos transferidores de electrones están tan cerca de la ``vía \pi'' como es posible sin alterar significativamente la estructura secundaria y terciaria de la doble hélice del ácido nucleico, particularmente el emparejamiento de bases de Watson-Crick.

El efecto de los puentes de hidrógeno entre bases sobre la velocidad de transferencia de electrones es una dependencia de la secuencia de ácido nucleico concreta, puesto que los pares A-T contienen un puente de hidrógeno menos que los pares C-G. No obstante, esta dependencia de la secuencia es enmascarada por la determinación de que hay una diferencia medible entre la velocidad de transferencia de electrones dentro de una matriz de pares de bases de ADN, y la velocidad a través del esqueleto de ribosa-fosfato, el solvente, y otros túneles de electrones. Esta diferencia de velocidad se cree que es al menos de varios órdenes de magnitud, y podría ser tan alta como cuatro órdenes de magnitud mayor a través de las bases de nucleótidos apiladas en comparación con otras vías de transferencia de electrones. Por tanto, puede determinarse la presencia de ácidos nucleicos de doble hebra, por ejemplo, en los ensayos con sondas de genes, comparando la velocidad de transferencia de electrones de la sonda sin hibridar con la velocidades de las sondas hidridadas.

En una realización, la presente invención proporciona nuevas sondas de genes, las cuales son útiles en biología molecular y en la medicina de diagnóstico. En esta realización, se sintetizan ácidos nucleicos de hebra únicaque tienen una secuencia predeterminada se unen covalentemente a grupos donantes de electrón y aceptores de electrón. La secuencia se selecciona en base a una secuencia diana conocida, de tal forma que si ocurre la hibridación con una secuencia diana complementaria en la región entre el donante de electrones y el aceptor de electrones, la transferencia de electrones progresa a una velocidad apreciable y detectable. Por tanto, la presente invención tiene un amplio uso general, como una nueva forma de sonda de genes marcada. Además, puesto que la transferencia de electrones en sonda no hibridadas es inapreciable, las sondas de la presente invención permiten la detección de secuencias diana sin la supresión de la sonda no hibridada. Por tanto, la presente invención esta preparada de forma única para ensayos automatizados con sondas de genes o para ensayos de campo.

En una realización preferida, las sondas pueden usarse en diagnóstico genético. Por ejemplo, pueden prepararse sondas usando las técnicas descritas en ésta para detectar secuencias diana tales como los genes para el cáncer de colon sin poliposis, el gen BRCA1 del cáncer de mama, el P53, el cual es un gen asociado con una variedad de cánceres, el gen Apo E4, que indica un mayor riesgo de padecer la enfermedad de Alzheimer, permitiendo un examen presintomático fácil de pacientes, mutaciones en el gen de la fibrosis cística, o cualquiera de los otros bien conocidos en la técnica.

En un ejemplo adicional, la detección bacteriana o viral se realiza usando los complejos de la invención. En esta realización, las sondas se diseñan para detectar secuencias diana procedentes de una diversidad de bacterias y virus. Por ejemplo, las técnicas actuales de examen de la sangre se basan en la detección de anticuerpos anti-HIV. Los procedimientos descritos en ésta permiten el examen directo de muestras clínicas para detectar secuencias de ácido nucleico del HIV, particularmente secuencias altamente conservadas del HIV. Además, esto permite la monitorización directa de virus circulantes en un paciente como un procedimiento mejorado de verificar la eficacia de las terapias anti-virales. Similarmente, los virus asociados con la leucemia, HTLV-I y HTLV-II, podrían detectarse de esta forma. También podrían detectarse las infecciones bacterianas tales como la tuberculosis.

En una realización preferida, los ácidos nucleicos de la invención encuentran un uso como sondas de bacterias tóxicas en el examen de muestras de agua y alimentos. Por ejemplo, podrían tratarse la muestras para lisar las bacterias y liberar su ácido nucleico, y a continuación podrían evaluarse sondas diseñadas para reconocer cepas bacterianas, incluyendo, pero no limitándose a, cepas patógenas como la Salmonella, Campylobacter, Vibrio cholera, cepas enterotóxicas de E. coli, y la bacteria de la enfermedad del legionario. De igual forma, las estrategias de biocuración podrían evaluarse usando las composiciones de la invención.

En una realización ulterior, las sondas se usan en la ``impresión de huella del ADN'' para emparejar ADN de la escena de un crimen con muestras tomadas de víctimas y sospechosos.

La presente invención también encuentra un uso como una metodología única para la detección de mutaciones en secuencias diana de ácido nucleico. Como resultado, si un ácido nucleico de hebra única que contiene grupos transferidores de electrones se hibrida con una secuencia diana con una mutación, la perturbación resultante del emparejamiento de bases de los nucleósidos afectará de forma medible la velocidad de transferencia de electrones. Este es el caso si la mutación es una sustitución, inserción o supresión. Alternativamente, podrían usarse dos ácido nucleico de hebra única, cada uno con una especie transferidora de electrones unida covalentemente, que se hibridan de forma adyacente a una secuencia diana. En consecuencia, la presente invención proporciona medios para la detección de mutaciones en secuencias diana.

Por tanto, la presente invención proporciona sondas extremadamente específicas y sensibles, las cuales podrían, en algunas realizaciones, detectar secuencias diana sin retirar las sondas no hibridadas. Esto será útil en la generación de ensayos automatizados con sondas de genes.

En una realización alternativa, los ácidos nucleicos de doble hebra tienen unidos covalentemente grupos donantes de electrones y aceptores de electrones sobre hebras opuestas. Tales ácidos nucleicos son útiles para detectar laamplificación exitosa de genes en reacciones en cadena de la polimerasa (PCR), permitiendo por tanto que las reacciones de la PCR exitosas sean una indicación de la presencia o ausencia de una secuencia diana. La PCR podría usarse de esta manera en diversas formas. Por ejemplo, si uno de los dos cebadores de la PCR contiene un donante de electrones unido de forma terminal en 5', y el otro contiene un aceptor de electrones electrones unido de forma terminal en 5', varias rondas de PCR generarán fragmentos de doble hebra doblemente marcados (ocasionalmente conocidos como ``amplicones''). Después de la fotoinducción apropiada, la detección de transferencia de electrones proporciona una indicación de la amplificación exitosa de la secuencia diana en comparación con cuando no ocurre la amplificación. Una ventaja particular de la presente invención es que no es necesaria la separación de los cebadores de hebra única del ADN de doble hebra amplificado, tal como se esbozó más arriba para las secuencias sonda que contienen grupos transferidores de electrones. Alternativamente, la detección de un secuencia diana a través de la PCR se realiza uniendo un especie con un grupo transferidor de electrones a uno o ambos cebadores. La otra especie con un grupo transferidor de electrones se une a nucleósidos individuales del conjunto de la reacción de la PCR, tal como se describe en ésta. La incorporación de nucleósidos que contienen el grupo transferidor de electrones al ácido nucleico durante la reacción de la PCR resulta en ambas especies transferidoras de electrones unidas a la misma hebra o a hebras opuestas, o a ambas. Permitiendo que el ácido nucleico sintetizado de nuevo permanezca en un forma híbrida permite la detección del alargamiento exitoso a través de la transferencia de electrones, y, por tanto, la detección de una secuencia diana. De esta forma, la presente invención se usa para la detección mediante PCR de secuencias diana.

En otra realización la presente invención proporciona ácido nucleico de doble hebra con grupos donante de electrones y aceptor de electrones unidos covalentemente para servir como bioconductores o ``empalme molecular''. El transporte de electrones podría ocurrir a lo largo de distancias de hasta y en exceso de los 28 \times 10^{-10} m (28 Angstroms) por par de donante y aceptor de electrones. Además, la velocidad de transferencia de electrones es muy rápida, aunque depende de la distancia entre los grupos donante y aceptor de electrones. Modificando el ácido nucleico en intervalos regulares con grupos donante de electrones y/o aceptores de electrones, podría ser posible transportar electrones a lo largo de grandes distancias, creando así bioconductores. Estos bioconductores son útiles en un gran número de aplicaciones, incluyendo aplicaciones tradicionales para conductores, tales como mediadores de reacciones y procesos electroquímicos.

Además, estos bioconductores podrían ser útiles como sondas para reacciones de fotosíntesis, así como en la construcción de sistemas artificiales recolectores de luz. Los modelos actuales para el componente de transferencia de electrones de un sistema artificial recolector de luz tienen varios problemas, tal como se esbozó más arriba, incluyendo una dependencia de la polaridad y composición del solvente, y una ausencia de suficiente rigidez sin síntesis ardua. Por tanto, la presente invención es útil como ambos, una forma novedosa de bioconductor, así como una nueva sonda de genes.

La presente invención proporciona ácidos nucleicos con grupos transferidores de electrones unidos covalentemente. Los grupos transferidores de electrones podrían unirse al ácido nucleico en una diversidad de posiciones.

En una realización, los grupos donante y aceptor de electrones se añaden a los extremos 3' y/o 5' del ácido nucleico, sobre uno de los dos, el esqueleto de azúcares-fosfato o sobre una base terminal. En realizaciones alternativas, los grupos donante y aceptor de electrones se añaden al esqueleto de uno o más nucleósidos internos, esto es, cualquier nucleósido que no es el nucleósido 3' ó 5'. En una realización ulterior, los grupos donante y aceptor de electrones se añaden al esqueleto de ambos, los nucleósidos internos y terminales.

En una realización preferida, los grupos transferidores de electrones se añaden al esqueleto de ribosa-fosfato en un cierto número de posiciones. Tal como se muestra en la Figura 5, son posibles varias posiciones, siendo particularmente preferida la unión a una ribosa de un esqueleto ribosa-fosfato. En consecuencia, en la Figura 5, el sitio más preferido para la unión de un grupo transferidor de electrones es M_{1}, seguido por M_{4}, M_{2} y M_{3}, en ese orden. En una realización preferida, los grupos transferidores de electrones se unen a las posiciones 2' ó 3' de la ribosa, siendo la 2' particularmente preferida.

En una realización preferida, los grupos transferidores de electrones no se intercalan, y están unidos de forma que no se intercalen. Por tanto, mientras que es posible utilizar un ``engarce'', tal como dobles enlaces alternados, para unir el grupo transferidor de electrones al ácido nucleico, el engarce es preferiblemente no más largo que el equivalente a uno o dos nucleósidos de longitud, o no es significativamente flexible para permitir la intercalación. Preferiblemente, si se usan engarces, estos se unen a través de la ribosa del esqueleto del ácido nucleico.

En una realización, los grupos transferidores de electrones se unen a las bases de los nucleósidos terminales. Así, cuando la secuencia diana a detectar tiene n nucleósidos de longitud, puede prepararse una sonda que tiene un nucleósido terminal extra en uno o ambos extremos de ácido nucleico (n+1 ó n+2), el cual se usa para unir covalentemente los grupos transferidores de electrones, pero que no participa en la hibridación de pares de bases. Este nucleósido terminal extra es importante puesto que se espera que la unión de grupos transferidores de electrones a una base de un nucleósido interno perturbe el emparejamiento de bases de Watson-Crick. Esto es, la base usada para la unión covalente debería estar fuera de la región usada para identificar la secuencia diana. Adicionalmente, se prefiere que, a partir de la hibridación de la sonda, el nucleósido terminal que contiene el grupo transferidor de electrones unido covalentemente a la base sea directamente adyacente a los nucleósidos de los pares de bases de Watson-Crick; esto es, el grupo transferidor de electrones debería ser tan cercano como fuera posible a los orbitales \pi apilados de las bases, de tal forma que un electrón viaje a través de un mínimo de enlaces \sigma para alcanzar la ``vía \pi'', o alternativamente, puede ponerse en contacto electrónicamente con la vía \pi.

En una realización, un ácido nucleico de hebra única se marca con un grupo transferidor de electrones a través de las bases terminales en ambos extremos. Las realizaciones alternativas utilizan una base terminal y un anclaje ribosa-fosfato 5' ó 3' tal como se ha descrito más arriba. En otras realizaciones, se proporcionan composiciones que comprenden un primer ácido nucleico de hebra única que contiene un donante de electrones covalentemente unido a una base terminal, y un segundo ácido nucleico de hebra única que contiene un aceptor de electrones covalentemente unido en una posición como se ha descrito más arriba, esto es, en una posición 5', 3' o interna; alternativamente, el donante de electrones y el aceptor de electrones podrían intercambiarse. Una realización particularmente preferida utiliza un electrodo como uno de los grupos transferidores de electrones, estando el otro grupo transferidor de electrones unido a una base terminal, preferiblemente sobre la misma hebra.

La presente invención proporciona además procedimientos para la adición específica en un sitio de grupos transferidores de electrones a ácidos nucleicos. Tal como se ha esbozado más arriba, los grupos transferidores de electrones podrían añadirse en la posición 2' ó 3' de una ribosa del esqueleto de ribosa-fosfato, a un base terminal en 3' ó 5', o a un nucleósido interno usando enlaces péptido-ácido nucleico, enlaces fosforamidatos, enlaces fosforotioatos, enlaces fosforoditioatos, o enlaces O-metil fosforamidatos.

Los cálculos de mecanismos moleculares indican que las perturbaciones debidas a la modificación en la ribosa de los nucleósidos terminales del ácido nucleico son mínimas, y que los emparejamientos de bases de Watson-Crick no se alteran (datos no publicados usando Biograf de Molecular Simulations Inc., San Diego, CA).

Para las uniones a la ribosa, una realización preferida utiliza nucleósidos modificados para unir el grupo transferidor de electrones. Preferiblemente se usan nucleósido amino-modificados y nucleósidos. En una realización alternativa, se usan nucleósidos tio-modificados para anclar los grupos transferidores de electrones de esta invención.

Los nucleósidos modificados se usan a continuación para añadir específicamente en un sitio un grupo transferidor de electrones de metal de transición, en uno cualquier de los extremos 3' ó 5' del ácido nucleico, o a cualquier nucleósido interno. O la posición 2' o la 3' de la ribosa podrían alterarse para la unión en el extremo 3'; para la unión a una ribosa interna o al extremo 5' se prefiere la posición 2'. Así pues, por ejemplo, la posición 2' de la ribosa del desoxirribo-o ribonucleósido se modifica antes de la adición de las especies transferidoras de electrones, dejando la posición 3' de la ribosa sin modificar para uniones subsiguientes a la cadena si fueran necesarias. En una realización preferida, se añade un grupo amino al carbono 2' ó 3' del azúcar usando técnicas químicas establecidas (Imazawa et al., J. Org. Chem. 44:2039 (1979); Hobbs et al., J. Org. Chem. 42(4):714 (1977); Verheyden et al., J. Org. Chem. 36(2):250 (1971)).

Los nucleósidos amino-modificados preparados tal como se ha descrito más arriba se convierten en la forma trifosfato de nucleótido modificado en 2' ó 3' usando procedimientos bioquímicos estándares (Fraser et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 4:2671 (1973)).

Los nucleósidos modificados para la unión de grupos transferidores de electrones a las bases, se preparan tal como se ha esbozado en Telser, ver más arriba. Estos nucleósidos modificados se incorporan a continuación en uno de los extremos 3' ó 5' tal como se ha esbozado más arriba.

Una vez se han preparado, protegido, y activado los nucleósidos modificados, éstos podrían incorporarse de varias formas en un oligonucleótido en crecimiento mediante técnicas sintéticas estándar (Gait, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford, R.U., 1984; Eckstein). En una realización, uno o más nucleósidos modificados se incorporan en una cadena de oligonucleótido en crecimiento usando técnicas estándares de biología molecular tales como con el uso de la polimerasa I del ADN, la polimerasa del ADN de T4, la polimerasa del ADN de T7, la polimerasa Taq del ADN, la transcriptasa inversa, y las polimerasas del ARN. Para la incorporación de un nucleósido modificado en 3' a un ácido nucleico, podría usarse la desoxinucleotidil-transferasa terminal (Ratliff, Terminal deoxynucleotidyltransferase. En ``The Enzymes'', Vol 14A, Ed. P.D. Boyer, pp. 105-118, Academic Press, San Diego, CA, 1981). Alternativa, y preferiblemente, el amino-nucleósido se convierte a la forma fosforamidito o H-fosfonato, las cuales se usan a continuación en síntesis de oligonucleótidos en fase sólida o en solución. De esta forma el nucleósido modificado, bien para la unión a la ribosa (es decir, nucleósidos amino-o tiol-modificados) o a la base, se incorpora en el oligonucleótido en una de ambas, una posición interna o en el extremo 5'. Esto se realiza generalmente protegiendo la posición 5' de la ribosa con 4',4-dimetilxitritil (DMT) seguida por reacción con 2-cianoetoxi-bis-diisopropilaminofosfina, en presencia de diisopropilamonio tetrazólido, para rendir el fosforamidito, tal como es conocido en la técnica; aunque podrían usarse otras técnicas, como será apreciado por aquéllos especialistas en la técnica. Ver Gait, mas arriba; Caruthers, Science 230:281 (1985).

Para la unión de un grupo transferidor de electrones al extremo 3', un procedimiento preferido utiliza el anclaje del nucleósido modificado a vidrio de poro controlado (CPG) u otros soportes poliméricos. En esta realización, el nucleósido modificado se protege en el extremo 5' con DMT, y a continuación se hace reaccionar con anhídrido succínico con activación. El compuesto succinilo resultante se une al CPG u otros soportes poliméricos como se conoce en la técnica. Se añaden otros fosforamiditos de nucleósidos, bien modificados o no, al extremo 5' después de su desprotección.

En otra realización, el grupo o grupos transferidores de electrones se añaden a la mitad del ácido nucleico, es decir, a un nucleósido interno. Esto podría conseguirse de tres formas.

En una realización preferida, un nucleósido modificado se incorpora en el extremo 5' tal como se ha descrito más arriba. En esta realización, la síntesis del oligonucleótido simplemente extiende el extremo 5' desde el nucleósido modificado usando técnicas estándares. Esto resulta en un oligonucleótido amino-modificado internamente.

En una realización, los nucleósidos se modifican para contener una amina aromática capaz de unir un grupo transferidor de electrones en una de las posiciones 2' ó 3' de la ribosa. Por ejemplo, uno de los nitrógenos del imidazol puede unirse en la posición 2' ó 3' de la ribosa, y de este modo usarse para unir el grupo transferidor de electrones, tal como un complejo de metal de transición. Esto podría reducir efectivamente el número de enlaces \sigma que debe viajar un electrón para alcanzar la ``vía pi'' puesto que el imidazol ofrece sustancialmente menos resistencia a la transferencia de un electrón en comparación con un enlace \sigma. En una realización preferida, el imidazol se une a la posición 2' de la ribosa. En una realización alternativa, el imidazol se une a la posición 3'. El nucleósido modificado con imidazol podría incorporarse en un oligonucleótido tal como se esboza en ésta para los nucleósidos modificados con amino.

En una realización alternativa, los grupos transferidores de electrones se añaden al esqueleto en un sitio distinto de la ribosa, resultando en un anclaje interno. Por ejemplo, pueden usarse enlaces fosforamida en vez de fosfodiéster como el sitio para la modificación con metal de transición. Estos metales de transición sirven como donantes y aceptores para reacciones de transferencia de electrones. Aunque las desviaciones estructurales de los enlaces fosfodiéster nativos ocurren y se han estudiado usando CD y RMN (Heller, Acc. Chem. Res. 23:128 (1990); Schuhmann et al., J. Am. Chem. Soc. 113:1394 (1991)), se ha descrito que el enlace fosforamidito entre nucleótidos se une a polinucleótidos complementarios y que es estable (Beaucage et al., ver más arriba, y referencias en ella; Letsinger, ver más arriba; Sawai, ver más arriba; Jager, Biochemistry 27:7237 (1988)). En esta realización, se crean dímeros de nucleótidos con enlaces fosforamida en una de las posiciones 2'-5' o 3'-5'. Una realización preferida utiliza la posición 3'-5' para el enlace fosforamida, de tal forma que la alteración estructural del par de bases de Watson-Crick subsiguiente está minimizada. Estas unidades de dímeros se incorporan en una cadena oligonucleotídica en crecimiento, como más arriba, a intervalos definidos, tal como se esboza más abajo.

Por tanto, la presente invención proporciona procedimientos para preparar un ácido nucleico con grupos transferidores de electrones covalentemente unidos. En una realización preferida, el procedimiento es para preparar un ácido nucleico con un grupo transferidor de electrones unido en el extremo 3' de dicho ácido nucleico. El procedimiento comprende unir un nucleósido modificado en 2' a vidrio de poro controlado, y añadir nucleósidos fosforamiditos al extremo 5' del nucleósido modificado para formar un ácido nucleico. A continuación, el ácido nucleico se corta opcionalmente del CPG usando procedimientos conocidos. El ácido nucleico podría hibridarse con su complemento, si se precisa, para proteger las bases de su modificación, y el grupo transferidor de electrones de añade al nucleósido modificado con 2'-amino.

En una realización preferida, se proporcionan los procedimientos para preparar un ácido nucleico con un grupo transferidor de electrones unido en el extremo 5'. El procedimiento comprende unir un nucleósido a vidrio de poro controlado, y añadir nucleósidos fosforamiditos al extremo 5' del nucleósido para formar un ácido nucleico. Se añade al extremo 5' un nucleósido modificado en 2' o 3' con amino, y el ácido nucleico se corta opcionalmente del CPG. El ácido nucleico podría hibridarse con su complemento, si se precisa, y el grupo transferidor de electrones de añade al nucleósido modificado con 2'-amino o 3'-amino.

En una realización preferida, se proporciona un procedimiento para preparar un ácido nucleico de hebra única con grupos transferidores de electrones unidos a ambos, los extremos 3' y 5'. El procedimiento comprende unir un nucleósido modificado a vidrio con poro controlado. El nucleósido modificado podría estar modificado con modificado para su unión a través de la ribosa tal como se describe en ésta, o modificado en la base. Los nucleósidos fosforamiditos adicionales se añaden al extremo 5' del nucleósido modificado para formar un ácido nucleico. Se añade un nucleósido fosforamidito modificado extra al extremo 5' del ácido nucleico, el cual, a continuación, se separa opcionalmente del vidrio de poro controlado, y podría hibridarse con su complemento. Se añade un grupo donante de electrones a un nucleósido modificado y se añade un grupo aceptor de electrones a otro nucleósido modificado.

El corte del CPG podría ocurrir bien antes de la modificación con metal de transición o después.

Debería entenderse que es importante que el emparejamiento de bases no se perturbe significativamente con objeto de permitir la hibridación, buenas velocidades de transferencia de electrones, y la detección de emparejamiento erróneos. Así pues, por ejemplo, los grupos de metal de transición, cuando se unen a los ácidos nucleicos de la invención, no se intercalan, es decir, no se insertan y apilan entre los pares de bases de la doble hebra del ácido nucleico. La intercalación de los metales de transición con los ligandos que los acompañan alteran el emparejamiento de bases, e impide por tanto la transferencia de electrones y la identificación de emparejamientos erróneos. De forma similar, con la excepción de las bases terminales, tal como se ha esbozado más arriba, el anclaje de complejos de metales de transición en las bases de nucleósidos (Telser et al., ver más arriba) también altera el emparejamiento de bases e impide la identificación de emparejamientos erróneos.

Debería notarse que, cuando se usan las técnicas anteriores para la modificación de residuos internos, es posible crear un ácido nucleico que tiene un especie transferidora de electrones en el nucleósidos próximo al último en el extremo 3', eliminando así la necesidad de los pasos extra requeridos para producir el nucleósido marcado de forma terminal en 3'.

En una realización ulterior para la modificación de residuos internos, se generan trifosfatos de nucleósidos modificados en 2' ó 3' usando las técnicas descritas más arriba para la modificación de nucleósidos 3'. Los nucleósidos modificados se insertan internamente en el ácido nucleico usando técnicas estándares de biología molecular para el marcaje de ADN y ARN. Los enzimas usados para dicho marcaje incluyen las polimerasas del ADN, tales como la polimerasa I, la polimerasa de ADN de T4, la polimerasa de ADN de T7, la polimerasa Taq de ADN, la transcriptasa inversa, y polimerasas de ARN tales como la polimerasa de ARN de E. coli o las polimerasas de ARN procedentes de los fagos SP6, T7 ó T3 (Short Protocols in Molecular Biology. 1992, Ed. Ausubel et al., pp. 3.11-3.30).

Tal como se describe más arriba, el grupo transferidor de electrones, preferiblemente un complejo de metal de transición, podría unirse a cualquiera de las cinco bases (adenina, timina, uracilo, citosina, guanina, y otras bases que no ocurren de forma natural, tales como inosina, xantina, e hipoxantina, entre otras). Esto se hace usando técnicas bien conocidas; ver Telser et al., J. Am. Chem. Soc. 111:7226-7232 (1989); Telser et al., J. Am. Chem. Soc. 111:7221-7226 (1989). Tal como se ha esbozado en ésta, estos nucleósidos modificados de forma terminal podrían unirse al ácido nucleico enzimáticamente como se conoce en la técnica, usando polimerasas de ADN; alternativamente, los nucleósidos modificados podrían incorporarse en una cadena oligonucleotídica en crecimiento usando la tradicional química del fosforamidito durante la síntesis del oligonucleótido, tal como se esboza en ésta.

La amina expuesta u otro ligando en la posición 2' o 3' de la ribosa, los enlaces fosforamida, o los otros enlaces útiles en la presente invención, son fácilmente modificados con una variedad de grupos transferidores de electrones, y particularmente con complejos de metales de transición, con técnicas fácilmente conocidas en la técnica (ver por ejemplo, Millet et al., en Metals in Biological Systems, Eds. Sigel et al., Vol. 27, pp. 223-264, Marcell Dekker Inc., Nueva York, 1991, Durham et al., en ACS Advances in Chemistry Series, Eds. Johnson et al., Vol. 226, pp. 180-193, American Chemical Society, Washington D.C.; y Meade et al., J. Am. Chem. Soc. 111:4353 (1989)). Generalmente, estas técnicas implican poner en contacto un complejo de metal de transición parcialmente quelado con el grupo amino del nucleósido modificado.

Las especies transferidoras de electrones se añaden también al grupo funcional de los nucleósidos modificados, tales como un grupo amino, usando técnicas conocidas en la técnica.

Cuando se usan péptidos-ácidos nucleicos (PNA), el anclaje de los grupos transferidores de electrones procede como sigue. Al grupo amino en el extremo N-terminal del PNA se le unirá un metal de transición parcialmente quelado o un grupo orgánico transferidor de electrones de forma similar a la ribosa modificada con amino. La adición al extremo carboxi-terminal puede proceder de diferentes formas, una de las cuales se ilustra en la Figura 7. Adicionalmente, para PNA de hebra única, podría unirse un grupo transferidor de electrones al extremo N-terminal, y el otro grupo transferidor de electrones se une a la base terminal en el extremo carboxi-terminal. Alternativamente, ambos grupos de transferencia se unen a las bases terminales. Podrían hacerse combinaciones similares para dos ácidos nucleicos de hebra única, conteniendo cada uno un grupo transferidor de electrones.

Además, la presente invención proporciona un procedimiento novedoso para la adición específica en un sitio del esqueleto ribosa-fosfato de un ácido nucleico de grupos donante de electrones y aceptor de electrones, a un nucleósido previamente modificado.

En una realización, los grupos donante de electrones y aceptor de electrones se unen al nucleósido modificado mediante procedimientos que utilizan un único paso de hibridación protectora. En esta realización, el ácido nucleico de hebra única modificado se hibrida con una secuencia complementaria no modificada. Esto bloquea los sitios sobre las bases heterocíclicas que son susceptibles de ser atacados por las especies de transferencia de electrones de metales de transición.

Cuando las bases terminales se han marcado con especies transferidoras de electrones, la secuencia complementaria no se extiende hasta la base a marcar. Esto es, se escoge una secuencia complementaria de n nucleósidos de longitud para la hibridación con una secuencia de sonda de n+1 o n+2, de tal forma que la base terminal no está protegida. Por tanto, la base desprotegida está expuesta al grupo transferidor de electrones, de tal forma que el grupo se une a la base.

Después de la adición exitosa del complejo de metal deseado, el dúplex de ácido nucleico modificado se separa en hebras sencillas usando técnicas bien conocidas en la técnica.

En una realización preferida, se preparan ácidos nucleicos de hebra única que contienen un grupo donante de electrones y un grupo aceptor de electrones. Los grupos donante de electrones y aceptor de electrones podrían unirse en cualquiera de los extremos 5' ó 3' del ácido nucleico de hebra única. Alternativamente, los grupos transferidores de electrones podrían unirse a los nucleósidos internos, o uno a un nucleósido interno y el otro a un nucleósido terminal. Debería entenderse que la orientación de las especies transferidoras de electrones con respecto a la orientación 5'-3' del ácido nucleico no es determinante. Por tanto, tal como se esquematiza en la Figura 1, podría utilizarse cualquier combinación de nucleósidos internos y externos en esta realización.

En una realización alternativa preferida, se usan ácidos nucleicos de hebra única con al menos un grupo donante de electrones y al menos un grupo aceptor de electrones para detectar mutaciones en una secuencia diana complementaria. Una mutación, tanto si es una sustitución, inserción o supresión de un nucleósido o nucleósidos, resulta en el incorrecto emparejamiento de bases en una hélice doble de ácido nucleico hibridado. En consecuencia, si la vía de un electrón desde un grupo donante de electrones hasta un grupo aceptor de electrones abarca la región en donde se halla el emparejamiento erróneo, se eliminará o reducirá la transferencia del electrón de forma que se observará un cambio en la velocidad relativa. Por tanto, en esta realización, el grupo donante de electrones se une al ácido nucleico en una posición 5' respecto de la mutación, y el grupo aceptor de electrones se une en una posición 3', o viceversa.

En esta realización es también posible usar una marca adicional sobre el ácido nucleico de hebra única modificado para detectar la hibridación cuando hay uno o más emparejamientos erróneos. Si el ácido nucleico complementario contiene una mutación, la transferencia de electrones se reduce o elimina. Para actual como un control, el ácido nucleico de hebra única modificado podría marcarse radiactiva o fluorescentemente, de tal forma que pudiera detectarse la hibridación con la secuencia diana, de acuerdo con técnicas tradicionales de la biología molecular. Esto permite la determinación de que la secuencia diana existe, pero contiene una sustitución, inserción, o supresión de uno o más nucleósidos. Alternativamente, los ácido nucleico de hebra única, con al menos un grupo donante de electrones y un grupo aceptor de electrones, que se hibridan con regiones que se emparejan exactamente pueden usarse como un control de la presencia de la secuencia diana.

Debe entenderse que la velocidad de transferencia del electrón a través de un hélice de un ácido nucleico de doble hebra depende de la distancia entre nucleósidos entre los grupos donante de electrones y aceptor de electrones. Longitudes mayores tendrán velocidades más lentas, y la consideración de las velocidades será un parámetro en el diseño de sondas y bioconductores. Así pues, mientras que es posible medir velocidades para distancias en exceso de los 100 nucleósidos, una realización preferida tiene el grupo donante de electrones y el grupo aceptor de electrones separados por al menos 3 y no más de 100 nucleósidos. Más preferiblemente, los grupos están separados por de 8 a 64 nucleósidos, siendo 15 la distancia más preferida.

Además, debería notarse que ciertas distancia podrían permitir la utilización de sistemas de detección diferentes. Por ejemplo, la sensibilidad de algunos sistemas de detección podría permitir la detección de velocidades extremadamente elevadas; es decir, los grupos transferidores de electrones podrían estar juntos más cerca.

Otros sistemas de detección podrían requerir velocidades ligeramente más lentas, y, por tanto, permitir que los grupos transferidores de electrones estuvieran más separados.

En una realización alternativa, un ácido nucleico de hebra única se modifica con más de un grupo donante de electrones o aceptor de electrones. Por ejemplo, para incrementar la señal obtenida a partir de estas sondas, o disminuir la sensibilidad de detector requerida, podrían usarse múltiples conjuntos de pares donante de electrones-aceptor de electrones.

Tal como se ha esbozado más arriba, en algunas realizaciones se añaden diferentes grupos transferidores de electrones a un ácido nucleico de hebra única. Por ejemplo, cuando deben añadirse un grupo donante de electrones y un grupo aceptor de electrones, o varios donantes de electrones o aceptores de electrones, la síntesis del ácido nucleico de hebra única procede en varios pasos. Primero se construyen las secuencias de ácido nucleico, conteniendo cada una de ellas una única especie transferidora de electrones, es decir, o un único grupo transferidor de electrones o varias de la mismos grupos de transferencia, usando la técnicas esbozadas más arriba. A continuación, estas secuencias parciales de ácido nucleico se ligan juntas usando técnicas comunes en el campo, tales como la hibridación de los ácido nucleico parciales modificados individuales a una única hebra complementaria, seguida por ligación con una ligasa comercialmente disponible.

Alternativamente, podría construirse el ácido nucleico de hebra única incorporando un nucleósido modificado con amino en dos posiciones usando las técnicas anteriores. A resulta de la síntesis, uno de los nucleósidos amino-modificados tiene temporalmente un grupo protector sobre la amina, tal como el DMT. A partir de la hibridación con la hebra complementaria no modificada, la amina desprotegida se expone al primer grupo transferidor de electrones, es decir, bien a un donante o a un aceptor, resultando en el anclaje covalente. El grupo protector del nucleósido amino-modificado protegido se retira entonces, y el híbrido se pone en contacto con la segunda especie transferidora de electrones, y se separan las hebras, resultando en un hebra única que está marcada con ambos, el donante y el aceptor. La hebra única que contiene el grupo transferidor de electrones apropiado se purifica a continuación usando técnicas tradicionales.

En una realización preferida, se preparan ácidos nucleicos de hebra única que contienen un grupo donante de electrones o un grupo aceptor de electrones. Los grupos donante de electrones o aceptor de electrones se unen en uno cualquiera de los extremos 5' ó 3' del ácido nucleico de hebra única. Alternativamente, el grupo donante de electrones se une a un nucleósido interno.

Debe entenderse que podrían unirse diferentes especies de grupos donante de electrones y aceptor de electrones a un ácido nucleico de hebra única. Por tanto, podría añadirse más de un tipo de grupo donante de electrones o grupo aceptor de electrones a cualquier ácido nucleico de hebra única.

En una realización preferida, se prepara un primer ácido nucleico de hebra única con uno o más grupos donantes de electrones unidos. Un segundo ácido nucleico de hebra única tiene uno o más grupos aceptores de electrones unidos. En esta realización, los ácido nucleico de hebra única se preparan para su uso como sondas de una secuencia diana complementaria. En una realización, la secuencia diana complementaria se construye hasta un primer dominio diana y un segundo dominio diana, en donde las secuencias primera y segunda están directamente adyacentes la una con la otra. En esta realización, el primer ácido nucleico de hebra única, que contiene sólo grupos donantes de electrones o grupos aceptores de electrones pero no ambos, se hibrida con el primer dominio diana, y el segundo ácido nucleico de hebra única, que sólo contiene la especies transferidora de electrones correspondiente, se une al segundo dominio diana. La orientación relativa de las especies transferidoras de electrones no es importante, tal como se esquematiza en la Figura 2, y se pretende que la presente invención incluya todas las orientaciones posibles.

En el diseño de sonda formadas por dos ácido nucleico de hebra única que se hibridan a secuencias diana primera y segunda adyacentes, deberían considerarse varios factores. Estos factores incluyen la distancia entre el grupo donante de electrones y el grupo aceptor de electrones en la forma hibridada, y la longitud de las sondas de hebra única individuales. Por ejemplo, podría ser deseable sintetizar sólo sondas marcadas de forma terminal en 5'. En este caso, el ácido nucleico de hebra única que se hibrida con la primera secuencia podría ser relativamente corto, de tal forma que pudiera conseguirse la distancia deseable entre las sondas. Por ejemplo, si la distancia óptima entre los grupos transferidores de electrones es de 15 nucleósidos, la primera sonda podría tener 15 nucleósidos de longitud.

En un aspecto de esta realización, los dos ácidos nucleicos de hebra única que se han hibridado con los dominios primero y segundo adyacentes se ligan juntos antes de la reacción de transferencia de electrones. Esto podría realizarse usando técnicas estándares de biología molecular utilizando una ligasa de ADN, tal como la ligasa de ADN de T4.

En una realización alternativa, la secuencia diana complementaria tendrá un primer dominio diana, un dominio diana interpuesto, y un segundo dominio diana. En esta realización, el primer ácido nucleico de hebra única modificado, que contiene sólo grupos donantes de electrones o grupos aceptores de electrones, pero no ambos, se hibrida con el primer dominio diana, y el segundo ácido nucleico modificado de hebra única, que contiene sólo las especies transferidoras de electrones correspondientes, se une al segundo dominio diana. Cuando un ácido nucleico de hebra única interpuesto se hibrida con la secuencia diana interpuesta, la transferencia entre el donante de electrones y el aceptor de electrones es posible. La secuencia interpuesta podría tener cualquier longitud, y podría comprender un único nucleósido. No obstante, su longitud debería tomar en consideración las distancias deseables entre los grupos donante de electrones y aceptor de electrones sobre los ácido nucleico modificados primero y segundo. Las secuencia interpuestas con longitudes superiores a 14 son deseables, puesto que, si se usan secuencias más largas, es más probable que la secuencia interpuesta permanezca hibridada para formar un ácido nucleico de doble hebra. La presencia o ausencia de una secuencia interpuesta puede usarse para detectar inserciones o supresiones.

En un aspecto de esta realización, el primer ácido nucleico de hebra única hibridado con el primer dominio diana, el ácido nucleico interpuesto hibridado con el dominiointerpuesto, y el segundo ácido nucleico de hebra única hibridado con el segundo dominio diana, podrían ligarse juntos antes de la reacción de transferencia de electrones. Esto podría realizarse usando técnicas estándares en biología molecular. Por ejemplo, cuando los ácido nucleico son de ADN, puede usarse una ligasa de ADN, tal como la ligasa de ADN de T4.

El ácido nucleico de hebra única diana complementario de la presente invención podría adoptar muchas formas. Por ejemplo, la secuencia de ácido nucleico de hebra única diana complementaria podría estar contenida en una secuencia de ácido nucleico mayor, es decir, todo o parte de un gen o mARN, un fragmento de restricción de un plásmido o ADN genómico, entre otros. Alguien formado en el campo de la biología molecular comprenderá como construir sondas útiles para una diversidad de secuencias dianas usando la presente invención.

En una realización, dos ácidos nucleicos de hebra única con grupos transferidores de electrones covalentemente unidos tiene secuencias complementarias, de forma que pueden hibridarse juntos para formar un bioconductor. En esta realización, el dúplex hibridado es capaz de transferir al menos un electrón desde el grupo donante de electrones hasta el grupo aceptor de electrones. En una realización preferida, los ácidos nucleicos de hebra única individuales están alineados de forma que tienen extremos romos; en realizaciones alternativas, los ácidos nucleicos están alineados de forma tal que la hélice doble tiene extremos adhesivos. En cualquier realización se prefiere que halla un emparejamiento bases de la doble hélice ininterrumpido entre el grupo donante de electrones y el grupo aceptor de electrones, de tal forma que los electrones viajen a través de la pila de pares de bases.

En una realización de bioconductor, el ácido nucleico de hebra doble tiene un ácido nucleico de hebra única que porta todos los grupos transferidores de electrones.

En otra realización, los grupos transferidores de electrones podrían estar sobre una de las dos hebras, y en cualquier orientación. Por ejemplo, una hebra podría portar sólo donantes de electrones, y la otro sólo aceptores de electrones, o ambas hebras podrían portar ambos.

En una realización, el ácido nucleico de doble hebra podría tener diferentes grupos transferidores de electrones covalentemente unidos en una orientación fijada, para facilitar la transferencia de electrones a largas distancias. Este tipo de sistema saca partido del hecho de que las especies transferidoras de electrones pueden actuar como ambos, donantes de electrones y aceptores de electrones, dependiendo de su estado oxidativo. De este modo, un grupo donante de electrones, después de la pérdida de un electrón, podría actuar como un aceptor de electrones, y viceversa. Así pues, los grupos transferidores de electrones podrían orientarse secuencialmente sobre cualquiera de las hebras del ácido nucleico de doble hebra, de tal forma que podría conseguirse la transferencia direccional de un electrón a lo largo de distancias muy largas. Por ejemplo, un ácido nucleico de doble hebra podría contener un único grupo donante de electrones en un extremo y grupos aceptor de electrones, de la misma o diferente composición, a lo largo de la molécula. De esta manera podría conseguirse un efecto de cascada de la transferencia de electrones, el cual podría resultar en rangos de transferencia de electrones extremadamente largos. Esto podría conseguirse, por ejemplo, incorporando complejos de metales de transición que poseen un rango en potenciales de oxidación debido a sustituciones del ligando realizada en el centro metálico.

La elección de los pares donante de electrones y aceptor de electrones específicos estará influenciada por el tipo de medición de la transferencia de electrones usada; para una revisión, consultar Winkler et al., Chem. Rev. 92:369-379 (1992). Cuando puede prepararse un estado excitado de vida larga en uno de los sitios redox, puede medirse la medición directa de la velocidad de transferencia de electrones después de la fotoinducción, usando, por ejemplo, el procedimiento de extinción del destello de Chang et al., J. Am. Chem. Soc. 113:7057 (1991). En esta realización preferida, el sitio redox excitado, siendo tanto un aceptor y donante mejor que las especies en el estado basal, puede transferir electrones a o desde el par redox. Una ventaja de este procedimiento es que podrían medirse dos velocidades de transferencia de electrones: las velocidades de transferencia de electrones fotoinducidas y las reacciones de recombinación electrón-hueco térmicas. De este modo podrían velocidades diferenciales para los ácido nucleico hibridados con complementariedad perfecta y ácido nucleico con emparejamientos erróneos.

En realizaciones alternativas, ningún sitio redox tiene un estado de excitación de vida larga, y la medición de la transferencia del electrón depende de la generación biomolecular de un intermediario cinético. Para una revisión, ver Winkler et al., más arriba. Este intermediario se relaja a continuación al producto termodinámico a través de la transferencia intramolecular usando un atenuador (quencher), tal como se observa más abajo:

D-A + hv -> D-A^{-}

D-A^{-} + Q -> D-A^{+} + Q^{-}

D-A^{+} -> D^{+}-A

D^{+}-A + Q^{-} -> D-A + Q

El límite superior de velocidades de transferencia de electrones intramoleculares medibles usando este procedimiento es de aproximadamente 10^{4} por segundo.

Realizaciones alternativas usan la generación con pulso radiolítico de radicales oxidantes y reductores, los cuales inyectan electrones en un donante o retiran electrones desde un donante, tal como se revisó en Winkler et al., ver más arriba.

Tal como se apreciará en la técnica, hay una diversidad de vías para iniciar y detectar la transferencia de electrones.

La transferencia de electrones puede iniciarse y detectarse usando una amplia variedad de procedimientos, incluyendo, pero no limitándose a, procedimientos eléctricos, electroquímicos, de radiación electromagnética (óptica), y químicos. Es posible preparar una variedad de composiciones utilizando diferentes grupos transferidores de electrones dependiendo del procedimiento deseado de inicio de la transferencia de electrones y de detección de la transferencia. La TABLA 2 ilustra una variedad de combinaciones preferidas para la iniciación y detección de la transferencia de electrones en los complejos de la invención.

TABLA 2

Iniciación	Detección	Descripción
luz	luz	absorbancia, fluorescencia, fosforescencia, índice de refracción,
		resonancia plasmón de superficie, resonancia de espín electrónico.
luz	corriente	amperimetría, voltimetría, capacitancia, impedancia, detección
		opto-electrónica, foto-amperimetría
luz más iniciación	luz	absorbancia, fluorescencia, fosforescencia, índice de refracción,
electrónica		resonancia plasmón de superficie, resonancia de espín electrónico.
luz más iniciación	corriente	amperimetría, voltimetría, capacitancia, impedancia, detección opto-electrónica,
electrónica		foto-amperimetría, detección amperimétrica, voltimetría cíclica.
iniciación	corriente	amperimetría, voltimetría, capacitancia, impedancia, detección
electrónica		amperimétrica, voltimetría cíclica.
iniciación	luz	quimioluminiscencia, electroquimioluminscencia,
electrónica		electroluminiscencia.

Por ``luz'' en ésta se quiere indicar radiación electromagnética, prefiriéndose luz en el rango UV, visible e infrarrojo, y siendo UV e infrarrojo los más preferidos.

En una realización preferida, la iniciación de la transferencia de electrones es a través de la fotoactivación (``entrada de luz'') directa o indirecta. Simplemente, la radiación electromagnética de longitud de onda apropiada incide sobre la molécula redox en un extremo del ADN, causando la excitación de un electrón del grupo donante, el cual decae inmediatamente o se implica en la transferencia de electrones intramolecular. La eficiencia con la cual se induce la transferencia de electrones depende del acoplamiento electrónico entre el donante y el aceptor de electrones, y, por tanto, depende de si el ácido nucleico es de hebra única o doble. Además, la eficiencia de la transferencia de electrones depende del coeficiente de extinción del donante de electrones a la longitud de onda usada (mayor es mejor) y del tiempo de vida del estado excitado del donante de electrones (más duración es mejor). Por tanto, los complejos donantes preferidos incluyen el naranja de acridina, el dicloruro de N,N'-dimetil-2,7-diazapirenium (DAP^{2+}), el metilviologen, el bromuro de etidio, quinonas tales como el dicloruro de N,N'-dimetilantra(2,1,9-def:6,5,10-d'e'f')diisoquinolina (ADIQ^{2+}); porfirinas (tetracloruro de [meso-tetraquis(N-metil-x-piridinio)porfirina]). Los donantes y aceptores de metales de transición incluyen los complejos de rutenio, renio y osmio (el más preferido), en donde al menos uno de los ligandos es un cromóforo.

La fotoactivación también puede usarse para excitar ``mediadores'' que transfieren energía al grupo donante de electrones sobre el AND a través de un proceso intermolecular. Tales mediadores incluyen complejos solubles en agua y estables de los metales de transición, incluyendo los haluros de molibdeno y tungsteno, los complejos trisbipiridil de renio, osmio y rutenio. Además, otros ejemplos incluyen complejos de bipiridil y piridil tales como el Re(bpy)(CO)_{3}X, en donde X es un haluro y Re(py)_{4}O_{2}. Otros ejemplos incluyen dímeros de metales de transición tales como

\hbox{[Re _{2} Cl _{8} ] ^{2-} }

y [Pt_{2}(P_{2}O_{5}H_{2})_{4}]^{4-}. La trisbipiridina de rutenio (Ru^{2+}(bpy)_{3}) es el más preferido.

En la realización preferida, la transferencia de electrones ocurre después de fotoinducción con un láser. En esta realización, los grupos donante de electrones podrían, después de donar un electrón, servir como aceptores de electrones bajo ciertas circunstancias. Similarmente, los grupos aceptor de electrones podrían servir como donante de electrones bajo ciertas condiciones.

Una realización preferida utiliza la activación electrónica, siendo la preferida con voltaje. Se aplica un potencial a una muestra que contiene sondas de ácido nucleico modificado, bien a través de un enlace directo del ácido nucleico modificado a un electrodo, o usando mediadores del transporte de electrones. La unión directa puede implicar un polímero redox activo para transferir los electrones desde (y hacia, si se usa el electrodo también para la detección) el electrodo. Tales polímeros de esbozan más abajo. Alternativamente, la conexión directa puede implicar un enlace relativamente pobre conductor, a condición de que el enlace se mantenga razonablemente corto (menos de seis enlaces sigma). Los enlaces preferidos tendrán tres o menos enlaces sigma de longitud para permitir la transferencia eficiente de electrones desde el electrodo, tal como se esboza más arriba.

La iniciación indirecta de la transferencia de electrones implica mediadores de la transferencia de electrones, o donante de electrones y aceptor de electrones difusionalmente eficientes, tales como el ferroceno/ferricinio soluble en agua, hidroquinonas/quinonas, componentes de sales orgánicos reducibles y oxidables, cobaltocenos, los hexa-y octacianuros de molibdeno, tungsteno y hierro. Además, otros ejemplos incluyen macrociclos y ligandos quelantes de metales de transición tales como el cobalto, rutenio y níquel, incluyendo el Co(etilenediamina)_{3} y Ru(etilenediamina)_{3}, y los complejos de trisbipiridil y hexamina de metales de transición tales como el Co, Ru, Fe, y Os. Ver K. Alyanasundaram, Coord. Chem. Rev. V. 46, p. 159, 1982. Finalmente, las moléculas orgánicas tales como la 4,4-bipiridina y la 4-mercaptopiridina son ejemplos en los que el ferroceno es el más preferido.

El control preciso y las variaciones en el potencial aplicado pueden realizarse a través de un potenciostato y de un sistema de tres electrodos (uno de referencia, uno para la muestra, y un contra-electrodo). Esto permite igualar el potencial aplicado al pico de potencial de transferencia de electrones del sistema, el cual depende en parte de la elección de aceptores de electrones unidos al ácido nucleico. Las fuerzas directoras se consiguen usando complejos de bisbipiridil de metales de transición, por ejemplo, complejos de bisbipiridil de rutenio y renio, tales como el

\hbox{(Ru(bpy) _{2} im-)}

, como aceptores de electrones.

Alternativamente, podría usarse la iniciación electroquímica de la transferencia de electrones. Los estados redox de los grupos donantes de electrones y aceptores de electrones unidos al ácido nucleico pueden ser cambiados electroquímicamente usando oxidantes y reductores químicos solubles en agua, con o sin activación eléctrica o fotoactivación. Tales compuestos incluyen numerosos derivados conocidos en la técnica (T. Kuwana, Electrochemical Studies of Biological Systems, Ed. D. T. Sawyer, ACS Symp. Series, #38 (1977)), e incluyen los complejos hexaciano del hierro, la amalgama de zinc-mercurio, y los complejos trisfenantrolina de rutenio y hierro.

La transferencia de electrones a través del ácido nucleico puede detectarse en una diversidad de formas. Podrían usarse una variedad de procedimientos de detección, incluyendo, pero no limitándose a, la detección óptica, que incluye la fluorescencia, fosforescencia, y el índice de refracción; y la detección electrónica, incluyendo, pero no limitándose a, amperimetría, voltimetría, capacitancia, e impedancia. Estos procedimientos incluyen procedimientos dependientes del tiempo o de la frecuencia basados en corrientes AC o DC, procedimientos pulsados, técnicas de fijación, técnicas de filtrado (paso alto, paso bajo, paso de banda) y resueltas en el tiempo, incluyendo la fluorescencia resuelta en el tiempo. En algunas realizaciones, todo lo que se requiere es la detección de la transferencia de electrones; en otras, podría determinarse la velocidad de transferencia de electrones.

En una realización, la transferencia eficiente de electrones desde un extremo de un ácido nucleico de doble hélice al otro resulta en cambios esteriotipados en el estado redox de ambos, el donante de electrones y el aceptor de electrones. Con muchos grupos transferidores de electrones incluyendo los complejos de rutenio que contienen bipiridina, piridina y anillos imidazol, estos cambios en el estado redox están asociados con cambios en las propiedades espectrales (``luces fuera''). Se observan diferencias significativas en la absorbancia entre los estados reducidos y oxidados de estas moléculas. Estas diferencias pueden monitorizarse usando un espectrofotómetro o un sencillo aparato con tubo fotomultiplicador.

En esta realización, los posibles donantes y aceptores de electrones incluyen todos los derivados listados más arriba para la fotoactivación o iniciación. Los donantes y aceptores de electrones preferidos tienen cambios espectrales característicamente grandes a partir de la oxidación y reducción (grandes ``deltas'' en los coeficientes de extinción), resultando en la monitorización altamente sensible de la transferencia de electrones. Tales ejemplos incluyen el Ru(NH_{3})_{4} py y Ru(bpy)_{2}im como ejemplos preferidos. Debería entenderse que sólo el donante o aceptor que se está monitorizando mediante absorbancia tiene que tener características espectrales ideales. Esto es, el aceptor de electrones puede ser ópticamente invisible si sólo se monitoriza el donante de electrones para cambios en la absorbancia.

En una realización preferida, la transferencia de electrones se detecta fluorométricamente. Numerosos complejos de metales de transición, incluyendo aquéllos de rutenio, tienen propiedades fluorescentes características. Por tanto, el cambio en el estado redox de los donantes de electrones y aceptores de electrones unidos al ácido nucleico puede monitorizarse con mucha sensibilidad usando la fluorescencia. La altamente eficiente transferencia de electrones a través del ácido nucleico de doble hebra puede, por ejemplo, resultar en la producción de

\hbox{Ru(4,7-bifenil _{2} -fenantrolina) _{3}  ^{2+} }

en un extremo de una sonda de ácido nucleico cuando se excita el grupo transferidor de electrones del otro extremo. La producción de este compuesto puede medirse fácilmente usando técnicas estándares de ensayo de fluorescencia. Por ejemplo, la fluorescencia inducida por láser puede registrarse en un fluorímetro de celda única estándar, un fluorímetro ``en línea'' con flujo a través (tales como los unidos a un sistema de cromatografía), o en un ``lector de placas'' de múltiples muestras similar a los comercializados para inmunoensayos de 96 pocillos.

Alternativamente, la fluorescencia puede medirse usando sensores de fibra óptica con sondas de ácido nucleico en solución o unidas a la fibra óptica. La fluorescencia se monitoriza usando un tubo fotomultiplicador, u otro instrumento detector de luz unido a la fibra óptica. La ventaja de este sistema es que pueden ensayarse volúmenes de muestra extremadamente pequeños.

Además, los detectores de barrido de fluorescencia, tales como el FluorImager vendido por Molecular Dynamics, son idealmente apropiados para monitorizar la fluorescencia de moléculas de ácido nucleico modificado ordenados sobre superficies sólidas. La ventaja de este sistema es el gran número de sondas transferidoras de electrones que pueden barrerse de una vez usando chips recubiertos con miles de distintas sondas de ácido nucleico.

Muchos complejos de metales de transición muestran fluorescencia con grandes desplazamientos de Stokes. Los ejemplos apropiados incluyen los complejos de bis-y trisfenantrolina y los complejos de bis-y trisbipiridil de metales de transición tales como el rutenio (ver Juris, A., Balzani, V., et al., Coord. Chem. Rev. V. 84, p. 85-277, 1988). Los ejemplos preferidos muestran una fluorescencia eficiente (rendimiento cuántico razonablemente elevado) así como energía de reorganización bajas. Estos incluyen la Ru(4,7-bifenil_{2}-fenantrolina)_{3}^{2+} y la Ru(4,4'-bifenil-2,2'-

\hbox{bipiridina) _{3}  ^{2+} .}

Alternativamente, puede medirse una reducción en la fluorescencia asociada con la hibridación usando estos sistemas. Un molécula ``donante'' transferidora de electrones que fluoresce fácilmente cuando está sobre un ácido nucleico de hebra única (con un ``aceptor'' en el otro extremo), experimentará una reducción en la intensidad de fluorescencia cuando un ácido nucleico complementario se une a la sonda, permitiendo la transferencia eficiente del electrón del estado excitado. Esta disminución en la fluorescencia puede monitorizarse fácilmente como un indicador de la presencia de una secuencia diana usando los mismos procedimientos que más arriba.

En una realización ulterior, se usa la electroquimioluminiscencia como la base de la detección de la transferencia de electrones. Con algunos grupos transferidores de electrones tales como el Ru^{2+}(bpy)_{3}, la luminiscencia directa acompaña el decaimiento del estado excitado. Los cambios en esta propiedad están asociados con la hibridación de ácidos nucleicos y pueden monitorizarse con una disposición de un sencillo tubo fotomultiplicador (ver Blackburn, G. F., Clin. Chem. 37:1534-1539 (1991); y Juris et al., ver más arriba.

En una realización preferida se usa la detección electrónica, incluyendo la amperimetría, voltimetría, capacitancia e impedancia. Las técnicas apropiadas incluyen, pero no se limitan a, la electrogravimetría; la coulometría (incluyendo la coulometría de potencial controlado y la coulometría de corriente constante); la voltimetría (voltimetría cíclica, la voltimetría de pulso (voltimetría de pulso normal, voltimetría de pulso rectangular, voltimetría de pulso diferencial, voltimetría de onda rectangular de Osteryoung, y técnicas de pulso coulostático); el análisis de despojamiento (stripping) (análisis de despojamiento anódico, análisis de despojamiento catódico, voltimetría de despojamiento de onda rectangular); las mediciones de conductancia (conductancia electrolítica, análisis directo); los análisis electroquímicos dependientes del tiempo (cronoamperimetría, cronopotenciometría, cronopotenciometría y amperimetría cíclicas, polarigrafía de AC, cronogalvametría, y cronocoulometría); la medición de la impedancia de AC, la medición de la capacitancia; y la fotoelectroquímica.

En una realización preferida, la monitorización de la transferencia de electrones a través de ácido nucleico es mediante detección amperimétrica, bien directamente usando un electrodo unido covalentemente, o indirectamente usando ``mediadores'' del transporte de electrones para enviar electrones desde el ácido nucleico hacia un electrodo. Los modos de anclar los ácidos nucleicos a los electrodos y los posibles mediadores se describen más abajo. En detector amperométrico se parecería a los numerosos biosensores basados en enzimas actualmente usados, por ejemplo, para monitorizar la glucosa en sangre. Este procedimiento de detección implica aplicar un potencial (en comparación con un electrodo de referencia separado) entre el electrodo conjugado con el ácido nucleico y un (contra-) electrodo auxiliar, en la muestra que contiene genes diana de interés. Se induce en la muestra la transferencia de electrones con distintas eficiencias en presencia o ausencia del ácido nucleico diana; es decir, la sonda de hebra única presenta una velocidad diferente de la sonda hibridada con la secuencia diana. Las diferentes eficiencias de la transferencia de electrones resultan en la generación de diferentes corrientes en el electrodo.

El aparato para medir la transferencia de electrones amperimétricamente implica la detección sensible de corriente (nanoamperios a picoamperios), e incluye un medio de controlar el potencial del voltaje, usando un potenciostato. Este voltaje se optimiza con referencia al potencial del complejo donante de electrones sobre el ácido nucleico. Los posibles complejos donantes de electrones incluyen los previamente mencionados, siendo los complejos de rutenio los preferidos, y siendo los complejos de renio los más preferidos.

En una realización preferida, se utilizan modos alternativos de detección de la transferencia de electrones. Por ejemplo, mediciones potenciométricas (o voltimétricas) que implican procesos no-faradaicos (sin flujo neto de corriente) y se usan tradicionalmente en detectores de pH y otros iones. Se usan sensores similares para monitorizar la transferencia de electrones a través de ácido nucleico. Además, podrían usarse otras propiedades de aislantes (tales como la resistencia) y de conductores (tales como conductividad, impedancia y capacitancia) para monitorizar la transferencia de electrones a través del ácido nucleico. Finalmente, cualquier sistema que genera una corriente (tal como la transferencia de electrones) también genera un pequeño campo magnético, el cual podría monitorizarse en algunas realizaciones.

Debería entenderse que un beneficio de las elevadas velocidades de transferencia de electrones observadas en las composiciones de la invención, es que la resolución temporal puede mejorar enormemente los resultados de señal-ruido de los monitores basados en la absorbancia, fluorescencia y la corriente eléctrica. Las velocidades rápidas de transferencia de electrones de la presente invención resultan en ambos, señales elevadas y retrasos estereotipados entre la iniciación y la conclusión de la transferencia de electrones. Amplificando señales con retrasos particulares, tal como a través del uso de la iniciación pulsada de la transferencia de electrones y de amplificadores de detección fijados, podrían conseguirse mejoras de entre dos y cuatro órdenes de magnitud en la relación señal-ruido.

En una realización preferida, el ADN se modifica mediante la adición de grupos donante de electrones y aceptor de electrones. En una realización alternativa se modifica ARN. En una realización ulterior, un ácido nucleico de doble hebra para usar como bioconductor contendrá algunos nucleósidos de desoxirribosa, algunos nucleósidos de ribosa, y una mezcla de bases de adenosina, timidina, citosina, guanina y uracilo.

De acuerdo con un aspecto ulterior de la presente invención, las formulaciones preferidas para donantes y aceptores poseerán un metal de transición covalentemente anclado a una serie de ligandos, y anclado covalentemente además a un grupo amino como parte del anillo de ribosa (posición 2' ó 3'), o a un átomo de nitrógeno o de azufre como parte de un dímero de nucleósido enlazado por un enlace peptídico, enlace fosforamidato, enlace fosforaotioato, enlace fosforoditioato, o enlace O-metil-fosforamidato.

En una realización preferida, un oligonucleótido que contiene al menos un grupo transferidor de electrones se ancla a un electrodo, el cual sirve también como grupo transferidor de electrones, formando de este modo un ácido nucleico de hebra única con ambos, un grupo donante de electrones y un grupo aceptor de electrones unidos de la forma esbozada más arriba. Preferiblemente, el ácido nucleico de hebra única que contiene un grupo transferidor de electrones se une covalentemente, o de tal forma que permite la transferencia de electrones desde el electrodo hasta el ácido nucleico de hebra única con objeto de permitir la transferencia de electrones entre el donante de electrones y el aceptor. Preferiblemente, el grupo transferidor de electrones que no es electrodo se une en o cerca del extremo del oligonucleótido, de tal forma que la secuencia de la sonda a hibridarse con la secuencia diana está entre el donante y el aceptor. El electrodo podría sumergirse en una muestra conteniendo la secuencia diana, de tal forma que la secuencia diana se hibrida con la sonda, y puede detectarse una transferencia de electrones usando las técnicas esbozadas más arriba.

En una realización adicional, se utilizan dos ácidos nucleicos como sonda como se ha descrito previamente. Por ejemplo, uno ácido nucleico está unido covalentemente a un electrodo sólido, el cual sirve como un grupo transferidor de electrones, y el otro con un grupo transferidor de electrones unido covalentemente está libremente en solución. A partir de la hibridación con la secuencia diana, los dos ácidos nucleicos se alinean de tal forma que ocurre la transferencia de electrones entre el grupo transferidor de electrones del ácido nucleico hibridado y el electrodo. La transferencia de electrones se detecta tal como se esbozó más arriba, usando técnicas bien conocidas en la técnica.

Los siguientes ejemplos sirven para describir más detalladamente la manera de usar la invención descrita más arriba, así como para detallar los mejores modos contemplados de realizar varios aspectos de la invención. Se comprenderá que estos ejemplos en modo alguno sirven para limitar el verdadero ámbito de esta invención, sino que se presentan con propósitos ilustrativos.

Ejemplos

Las unidades de monómeros amino-modificados se preparan mediante una variación de procedimientos publicados, y se incorporan en el oligonucleótido en crecimiento mediante técnicas sintéticas estándares. El procedimiento es aplicable a ambos, derivados de ADN y ARN.

Ejemplo 1 Síntesis de un dúplex de oligonucleótido con grupos transferidores de electrones en los extremos 5'

En este ejemplo se produjo un ácido nucleico de doble hebra de ocho nucleótidos, teniendo cada hebra sencilla un único grupo transferidor de electrones covalentemente anclado al nucleótido de uridina terminal en 5', en el carbón 2' del azúcar de ribosa.

Paso 1

Síntesis de 5'-di(p-metoxifenil)metil éter-2'-(trifluoroacetamido)-2'-desoxiuridina

La 2'-(trifluoroacetamido)-2'-desoxiuridina (2,0 g, 5,9 mmoles), preparada mediante una modificación menor de los procedimientos publicados (Imazawa, más arriba), se disolvió repetidamente en un mínimo de CH_{3}CN muy seco y se evaporó con rotación hasta su sequedad, y a continuación se transfirió a una línea de vacío con atmósfera inerte y se secó aún más durante un período de 1 jora. El procedimiento siguiente para la síntesis del material se adaptó de Gait (más arriba): bajo presión positiva de argón, se disolvió el material en piridina recién seca y destilada, y con agitación, se añadieron a la mezcla de reacción 0,05 equivalentes (en peso) de 4-dimetilaminopiridina (DMAP), 1,5 equivalentes de trietilamina (TEA), y 1,2 equivalentes de cloruro de 4,4'-dimetoxitritilo (DMTr-Cl). El progreso de la reacción se monitorizó mediante TLC en gel de sílice (98:2 cloruro de metilo:metanol, fase móvil). Transcurridos 30 minutos, se añadieron 0,5 equivalentes adicionales de cada uno de DMTr-Cl y TEA, y se dejó progresar la reacción durante tres horas adicionales. A esta mezcla de reacción se le añadió un volumen igual de agua y se extrajo la solución varias veces con dietiléter. Las capas de éter se evaporaron con rotación hasta su sequedad, se redisolvieron en una cantidad mínima de cloruro de metilo, y se purificaron mediante cromatografía flash (99:1 cloruro de metilo:metanol, fase móvil), para obtener el producto 5'-di(p-metoxifenil)metil éter-2'-(trifluoroacetamido)-2'-desoxiuridina.

Paso 2

5'-2'-aminouridina-GCTACGA y 5'-2'-aminouridina-CGTAGCA

La 5'-di(p-metoxifenil)metil éter-2'-(trifluoroacetamido)-2'-desoxiuridina se secó bajo presión reducida (vidrio) y se disolvió en CH_{3}CN recién secado y destilado, y se colocó en un vial cónico especialmente construido, y se colocó sobre un sintetizador de ADN ABI. El programa para la preparación de oligonucleótido estándares (es decir, no modificados) se alteró durante la adición de la base final (amino-modificada) hasta un tiempo de acoplamiento de 15-30 minutos. El oligonucleótido se separó de la columna mediante procedimientos estándares y se purificó mediante HPLC con fase reversa sobre C-18. De esta manera se prepararon los 5'-2'-aminouridina-GCTACGA y 5'-2'-aminouridina-CGTAGCA. Además, se prepararon hebras complementarias de ambos productos para su uso en la síntesis de grupos de transferencia de electrones de más abajo.

Paso 3

5'-2'-rutenio bisbipridinaimidazol-aminouridina-GCTACGA

La 5'-2'-aminouridina-GCTACGA producida en el paso previo se asoció con la hebra complementaria no modificada usando técnicas estándares. Todas las manipulaciones del dúplex asociado, antes de la adición del complejo de metal de transición se realizaron a 4ºC. Con objeto de asegurar que el ADN permanecía asociado durante la modificación, las reacciones se realizaron en sal 1 M. El dúplex de ADN modificado con amino en 5' se disolvió en HEPES 0,2 M, NaCl 0,8 M, pH 6,8, y se evacuó repetidamente sobre una línea Schlenk. El carbonato de rutenio bisbipiridina previamente preparado se disolvió en el tampón anterior y se suprimió el oxígeno mediante evacuación repetida y purgando con argón a través de una línea Schlenk. El complejo de rutenio se transfirió a una solución de ADN a través de canulación (argón/vacío) y se dejó progresar la reacción bajo presión positiva de argón, con agitación, durante 24 horas. A esta reacción se le añadieron 50 equivalentes de imidazol en el frasco de reacción, y se dejó progresar la reacción durante 24 horas adicionales. Se retiró la mezcla de reacción de la línea de vacío y se aplicó sobre una columna de filtración en gel PD-10, y se eluyó con agua para retirar el exceso de complejo de rutenio. El volumen de las fracciones recolectadas se redujo hasta sequedad a través de un speed-vac, y el sólido se disolvió en acetato de trimetilamonio 0,1 M (TEAC), pH 6,0. El dúplex de ADN se calentó hasta 60ºC durante 15 minutos con formamida al 50% para desnaturalizar el dúplex. El ADN de hebra única se purificó usando HPLC con fase inversa, con una columna C-18, equipada con un detector de matriz de diodos, y empleando un gradiente desde el 3% hasta el 35% de acetonitrilo en TEAC 0,1 M, pH 6,0.

Paso 4

5'-2'-rutenio tetraminapiridina aminouridina-CGTAGCA

La 5'-2'-aminouridina-CGTAGCA (0,3 \muM) se disolvió en tampón HEPES 0,2 M, NaCl 0,8 M, pH 6,8, y se desgasó en la línea de vacío. A un frasco de forma cónica, de 10 ml, equipado con una barra de agitación y un septo se le añadió cloruro de Ru(III) tetraaminopiridina en forma de papilla (10 \muM), en el mismo tampón. En un frasco separado, se preparó amalgama de Zn/Hg y se secó bajo presión reducida, y se transfirió la solución de rutenio(III) (a través de canulación) a la amalgama Zn/Hg. La formación inmediata de una solución amarilla clara (\lambda_{max} = 406 nm) indico que se había conseguido la forma reducida del rutenio, y se dejó progresar la reacción durante 30 minutos. Esta solución se transfirió al frasco que contenía el ADN modificado con amino, y se dejó progresar la reacción a temperatura ambiente durante 24 horas bajo argón. Se retiró la mezcla de reacción de la línea de vacío y se añadió a la solución un exceso de 50 veces de cobalto-EDTA (Kirschner, Inorganic Synthesis (1957), pp. 186). La solución se aplicó sobre una columna de filtración en gel Sephadex® G-25 para retirar el exceso de complejo de rutenio y se purificó aún más mediante HPLC de fase inversa tal como se describe más arriba. Los dos nucleótidos modificados con rutenio se asociaron mediante técnicas estándares y se caracterizaron (ver EJEMPLO 5).

Ejemplo 2 Síntesis de dúplexes de ADN largos con grupos transferidores de electrones en los extremos 5'

En este ejemplo se usan una técnica de amplificación in vitro del ADN, la PCR (revisada en Abramson et al., Curr. Op. in Biotech. 4:41-47 (1993)), para generar ADN dúplex modificada mediante la polimerización de nucleótidos a partir de hebras cebadoras modificadas (Saiki et al., Science 239:487 (1988)). Se sintetizan dos oligonucleótidos de 18 bases de longitud, y no complementarios entre ellos, con modificación con amino en la posición 2'-ribosa de los nucleótidos 5', como en el EJEMPLO 1.

Se sintetizan químicamente una serie de oligonucleótidos de longitudes crecientes, empezando con 40 bases, usando química estándar. Cada una de las plantillas de la PCR comparte una secuencia 5' idéntica a un 18-mero modificado. El extremo 3' del oligonucleótido plantilla comparte una secuencia complementaria a otro 18-mero.

La PCR genera rápidamente DNA dúplex modificados mediante la catálisis de la síntesis 5'-3' del ADN a partir de cada uno de los 18-meros modificados, usando la hebra no modificada como plantilla. Se mezclan cien nanomoles de cada uno de los 18-meros modificados en 1 ml de una solución acuosa que contiene 2000 unidades de polimerasa Taq, trifosfatos de desoxirribonucleósidos a 0,2 M cada uno, KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM, pH 8,8, MgCl_{2} 1,5 mM, ditiotreitol 3 mM, y 0,1 mg/ml de albúmina de suero bovino. Se añade a la mezcla un femtomol de la hebra plantilla e 40 bases de longitud. Se calienta la muestra a 94ºC durante un minuto para su desnaturalización, dos minutos a 55ºC para su asociación, y tres minutos a 72ºC para su extensión. Este ciclo se repitió 30 veces usando un ciclador térmico automatizado.

Las secuencias plantilla amplificadas con complejos de metal de transición en ambos extremos 5' se purificaron mediante electroforesis en gel de agarosa, y se usarondirectamente en aplicaciones de transferencia de electrones.

Ejemplo 3 Síntesis de grupos de transferencia de electrones covalentemente unidos a enlaces internucleótidos del DNA dúplex

En este ejemplo, se emplean esqueletos alternativos a los enlaces fosfodiéster de los oligonucleótidos. Los grupos funcionales incorporados en estos enlaces internucleótidos sirven como el sitio de unión covalente de los grupos transferidores de electrones. Estos enlaces internucleótidos alternativos incluyen, pero no se limitan a, enlaces peptídicos, enlaces fosforamidatos, enlaces fosforotioatos, enlaces fosforoditioatos, y enlaces O-metilfosforamidatos.

La preparación de péptido ácido nucleico (PNA) sigue los procedimientos de la literatura (ver Engholm, más arriba), con la síntesis de éster de pentafluorofenil protegido con Boc de la base escogida (timidina). El PNA resultante podría prepararse empleando la estrategia de fase sólida de Merrifield (Merrifield, Science 232:341 (1986)), usando un protocolo de acoplamiento único con 0,1 M del monómero de timinil en 30% (v/v) de DMF en CH_{2}Cl_{2}. El progreso de la reacción se sigue mediante análisis cuantitativo con ninhidrina (Sarin, Anal. Biochem. 117:147 (1981)). El PNA resultante podría modificarse con un complejo de metal de transición apropiado tal como se esboza en el EJEMPLO 1.

La síntesis de los enlaces internucleótidos fosforamidatos (Beaucage, más arriba; Letsinger, más arriba; Sawai, más arriba) y N-alquilfosforamidatos (Jager, más arriba) sigue los procedimientos estándares de la literatura, con sólo una ligera modificación (los procedimientos se detienen después de la adición de una única base al soporte sólido, y entonces se separan para obtener un fosforamidato de dinucleótidos). Un ejemplo típico es la preparación del feniléster de 5'O-isobutiloxi-carboniltimidil-(3'-5')-5'-amino-5'-desoxitimidina (Letsinger, J. Org. Chem., más arriba). Las unidades de dímeros se sustituyen por oligonucleótidos estándares a intervalos escogidos durante la preparación del ADN usando técnicas automatizadas establecidas. La modificación con metal de transición de los enlaces modificados tiene lugar como se describe en el EJEMPLO 1.

La síntesis de enlaces fosforotioato y fosforoditioato (Eckstein, mas arriba, y referencias citadas en ella) está bien documentada. Un protocolo publicado utiliza un sintetizador de ADN de Applie Biosystems usando un ciclo de \beta-cianoetilfosforamidito modificado que se protege después de la sulfurización con disulfuro de tetraetiltiuramo (TETD) (Lyerm J. Org. Chem. 55:4693 (1990)). Los análogos de fosforotioato y fosforoditioato se preparan como dímeros y se separan del soporte sólido y se purifican mediante HPLC (fase móvil: acetonitrilo/acetato de trietilamonio).

Ejemplo 4 Síntesis de dos oligonucleótido cada uno con un grupo transferidor de electrones en el extremo 5'

En este ejemplo, se preparan dos oligonucleótidos que se hibridan con una única secuencia diana, sin secuencias interpuestas. Un oligonucleótido tiene un grupo donante de electrones covalentemente unido en el extremo 5', y el otro tienen un grupo aceptor de electrones covalentemente unido en el extremo 5'. En este ejemplo, las especies transferidoras de electrones se unen a través de un nucleótido de uridina, pero un especialista en la técnica comprenderá que los procedimientos actuales pueden usarse para modificar cualquiera de los nucleótidos. Además, alguien formado en la técnica reconocerá que el procedimiento no se limita a la generación de 8-meros, sino que es útil en la generación de sondas de oligonucleótidos de diferentes longitudes.

El procedimiento es exactamente como en el EJEMPLO 1, excepto que los 8-meros generados no son complementarios entre ellos, y en cambio son complementarios a una secuencia diana de 16 nucleótidos. Por tanto, el paso final de asociación del paso 4 del EJEMPLO 1 no se realiza. En cambio, los dos oligonucleótidos modificados se asocian con la secuencia diana, y el complejo resultante se caracteriza como en el EJEMPLO 8.

Ejemplo 5 Caracterización de los ácidos nucleicos modificados Digestión enzimática

Los oligonucleótidos modificados del EJEMPLO 1 se sometieron a digestión enzimática usando protocolos establecidos, y se convirtieron en sus nucleósidos constituyentes mediante reacción secuencial con fosfodiesterasa y fosfatasa alcalina. Por comparación con estándares de los perfiles de HPLC obtenidos experimentalmente y de los espectros de UV-visible de los oligonucleótidos digeridos (incluyendo el 2'-aminouridina y 2'-aminoadenina), se confirmó la presencia de la base modificada con amino con el tiempo de retención y el espectro UV-visible característicos. Se llevó a cabo un procedimiento idéntico con el ADN dúplex modificado con metal de transición, y las asignaciones de los nucleósidos constituyentes demostró la modificación de un único sitio en el sitio predicho.

Oligonucleótidos modificados con amino marcados fluorescentes

Se ha demostrado que el fluorocromo isotiocianato de fluoresceína (FITC) es específico para el marcaje de aminas primarias sobre oligonucleótidos modificados, mientras que no se une a aminas o amidas presentes sobre bases de nucleótidos (Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, 5ª edición, (1992)). Esta reacción se llevó a cabo usando el amino-oligonucleótido sintetizado tal como se describió en el EJEMPLO 1, y sobre una secuencia de bases idéntica sin que el grupo 2'-amino-ribosa estuviera presente. Se obtuvieron Las mediciones espectroscópicas de fluorescencia a partir de ambos oligonucleótidos y los resultados confirman la presencia de la amina sobre el anillo de ribosa 5'-terminal.

Curvas de fusión termodinámicas del ADN dúplex modificado

Una técnica bien establecida para medir los parámetros termodinámicos del ADN dúplex es la adquisición de curvas de fusión del ADN. Se midieron una serie de curvas de fusión como una función de la concentración del ADN dúplex modificado mediante UV-visible con temperatura controlada (Hewlett-Packard), usando técnicas bien conocidas en la técnica. Estos resultados confirman que había tenido lugar la hibridación de ADN amino-modificado y del modificado con metal de transición. Además, los resultados indican que el ADN modificado forma un dúplex estable comparable de la estabilidad de los oligonucleótidos no modificados estándares.

Espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) bidimensional

Los oligonucleótidos modificados con amino sintetizados como parte de este trabajo se prepararon en cantidades suficientes (6 micromoles) para permitir la asignación de los espectros de RMN de protón ^{1}H usando un espectrómetro de RMN Varian de 600 MHz.

Medición de la velocidad de transferencia de electrones

Una excelente revisión de las técnicas de medición se halla en Winkler et al., Chem. Rev. 92:369-379 (1992). El donante es Ru(bpy)_{2}(NHuridina)im, E^{0} 1 V, y el aceptor es Ru(NH_{3})_{4} py(NHuridina)im, E^{0} 330 mV. Los oligonucleótidos modificados con metal de transición y purificados (U_{NH}Ru(bpy)2im GCATCGA y U_{NH}Ru(NH3)4(py)im CGATGCA) se asociaron calentando una mezcla equimolar de los oligonucleótidos (30 \muM: 60 nmoles de ADN en 2 ml de tampón) en pH 6,8 (NaPi 100 mM, NaCl 900 mM) hasta 60ºC durante 10 minutos y enfriando lentamente hasta temperatura ambiente a lo largo de un período de 4 horas. La solución se transfirió a un cubeta con atmósfera inerte equipada con adaptadores para la unión de una línea de vacío y una varilla de agitación magnética. Se desgasó la solución varias veces y los aparatos sellados se rellenaron repetidamente con gas Ar.

Se insertó la totalidad del aparato en un soporte de cubetas como parte del montaje, usando un láser XeCl excímero de colorante bombeado, y los datos se adquirieron a lo largo de varias longitudes de onda, incluyendo 360, 410, 460 y 480 nm. La velocidad de transferencia de electrones fotoinducidos es de 1,6 \times 10^{6} s^{-1} a lo largo de una distancia de 28 Angstroms.

Ejemplo 6 Síntesis de un ácido nucleico de hebra única marcado con dos grupos transferidores de electrones

Este ejemplo usa el procedimiento básico descrito más arriba para generar dos oligonucleótidos modificados cada uno con un grupo transferidor de electrones unido. La ligación de las dos hebras modificadas entre ellas produce un ácido nucleico doblemente marcado con cualquiera de cuatro configuraciones: extremos 5' y 3' marcados, extremo 5' marcado y nucleótido interno marcado, extremo 3' marcado y nucleótido interno marcado, y marcas dobles en nucleótidos internos. Específicamente, se describe la síntesis de un oligonucleótido de 24 bases de longitud con un grupo donante transferidor de electrones en el extremo 5' y un grupo transferidor de electrones interno.

Se sintetizaron quinientos nanomoles de cada uno de dos oligonucleótidos de 12 bases de longitud, tal como se detalla más arriba, marcados en 5' con rutenio(II) bisbipiridina imizadol en un oligonucleótido ``D'', y con rutenio(III) tetraamina piridina sobre un segundo oligonucleótido ``A''.

Mediante técnicas sintéticas estándares se produjo un oligonucleótido sin modificar, de 24 bases de longitud, y complementario con la yuxtaposición del oligonucleótido ``D'' seguido en la dirección 5' a 3' por el oligonucleótido ``A''. Se añadieron quinientos nanomoles de esta plantilla de hibridación a una mezcla de oligonucleótidos ``A'' y ``D'' en 5 ml de una solución acuosa que contenía Tris-Cl 500 mM, pH 7,5, MgCl_{2} 50 mM, ditiotreitol 50 mM, y 5 mg/ml de gelatina. Para promover la máxima hibridación de oligonucleótidos marcados con la hebra complementaria, la mezcla se incubó a 60ºC durante 10 minutos, a continuación se enfrío lentamente a una velocidad de aproximadamente 10ºC por hora, hasta una temperatura final de 12ºC. La ligación enzimática de las dos hebras marcadas se consigue con ligasa de ADN de T4 a 12ºC para prevenir la ligación y oligomerización del ADN duplexado con otros dúplexes (ligación de extremos romos). Alternativamente, puede usarse la ligasa de ADN de E. coli puesto que no cataliza la ligación de extremos romos.

Se añaden cien unidades Weiss de ligasa de ADN de T4 al ADN asociado y se añade trifosfato de adenosina hasta una concentración final de 0,5 mM. La reacción que cataliza la formación de un enlace fosfodiéster entre el fosfato 5' terminal del oligonucleótido ``A'' y el grupo hidroxilo 3' terminal del oligonucleótido ``D'' se deja progresar durante 18 horas a 12ºC. La reacción se termina mediante inactivación por calor del enzima, a 75ºC durante 10 minutos. El oligonucleótido doblemente marcado se separa de los oligonucleótidos marcados de forma única, y del oligonucleótido sin marcar complementario mediante HPLC en presencia de urea, como en los ejemplos anteriores. El oligonucleótido doblemente marcado de este ejemplo es idealmente apropiado para su uso como una sonda de genes fotoactiva, tal como se detalla más abajo.

Ejemplo 7 Uso de un oligonucleótido doblemente modificado con grupo transferidor de electrones como una sonda fotoactiva para la detección de secuencias de ácidos nucleicos homólogas

Este ejemplo utiliza el oligonucleótido de 24-meros del EJEMPLO 6 en un ensayo de sonda de genes de tipo único, en el que no se requiere la retirada de la sonda no marcada antes de la detección de la señal. En el procedimiento de ensayo, se amplifica una región del gen gag del virus del tipo I de la inmunodeficiencia humana (HIV-I) mediante la reacción en cadena de la polimerasa (Saiki et al., Science 239:487-491 (1988)). Esta región del HIV-I está altamente conservada entre aislados clínicos.

El ADN diana amplificado, respecto controles que carecen del ADN de HIV-I, se añade a un solución de hibridación de 6XSSC (NaCl 0,9 M, citrato sódico 0,09 M, pH 7,2) conteniendo 50 nanomoles de la sonda de 24-meros doblemente marcada del EJEMPLO 6. Se deja progresar la hibridación a 60ºC durante 10 minutos con agitación moderada. La detección de transferencia de electrones a continuación de la excitación con láser se realiza como en el EJEMPLO 5. Las muestras control que carecen de la sonda hibridada muestran velocidades de transferencia de electrones despreciables. Las sondas hibridadas con la secuencia gag muestran un transferencia de electrones eficiente y rápida a través de la doble hélice de ADN, proporcionando un ensayo de detección del HIV-I altamente específico, homogéneo, y automatizable.

Un ensayo con sondas de genes homogéneo similar implica el uso de dos sondas, una un donante de electrones y la otra un aceptor de electrones, las cuales se hibridan con la región gag del HIV-I en una configuración tándem, una sonda colindante con la otra. En este ensayo, el acoplamiento electrónico entre los dos grupos transferidores de electrones depende enteramente de la hibridación con el ADN diana. Si es apropiada, la transferencia de electrones desde una sonda a la otra es mejorada por la ligación de los extremos yuxtapuestos usando la ligada de ADN de T4 como en el EJEMPLO 6.

Ejemplo 8 Preparación de un hidroxitiol para el anclaje a un electrodo de oro

OH(CH_{2})OH se adquirió a Aldrich, y la forma monoacetato se preparó mezclando el material en forma de papilla con CH_{2}Cl_{2} seco, se añadieron 0,5 equivalentes de dimetilaminopiridina junto con 1,4 equivalentes de trietilamina y 1 equivalente de anhídrido acético. Se dejó progresar la reacción durante 2 horas y se purificó mediante cromatografía flash (80:20 hexano:dietiléter).

El compuesto monoacetato se convirtió al monosilato-monoacetato usando p-TOSCl mediante procedimientos de la literatura, y a continuación se trató con trifenil-metil-mercaptano. Para suprimir el monoacetato, se disolvió el producto en MeOH (1 mmol, 9 ml), se enfrió a 0ºC, y se añadió una solución acuosa de NaOH (1 mmol, en 2 ml de agua). Se dejó subir la temperatura hasta temperatura ambiente lentamente, y se siguió la reacción mediante TLC (5% MeOH/CH_{2}Cl_{2}). Cuando se hubo eliminado el éster, se re-enfrió la mezcla a 0ºC, y se acidificó con KHSO_{4} hasta pH 5-6 usando papel de p}H. Se evaporó el MeOH, y se extrajo el residuo con CH_{2}Cl_{2} (200 ml), se secó (Na_{2}SO_{4}), se evaporó, y se comprobó vía TLC. El material se ``fosforamiditó'' mediante procedimientos estándares. Este material se insertó en el sintetizador de ADN y se produjo un oligonucleótido modificado. El oligonucleótido fosforamiditado se modificó con complejo de rutenio añadiéndole Ru(bpy)_{2}CO_{3}, seguido por imidazol, para rendir Ru(bpy)_{2}im-oligonucleótido. El grupo protector trietilo se retiró disolviendo el nucleótido en 200 \mul de tampón de acetato de trietilamonio 0,1 M (TEEA), pH 7,5, se añadieron 30 \mul de solución de nitrato de plata 1 M, y se agitó la mezcla con formación de vórtice, y se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se añadieron 50 \mul de ditiotreitol 1 M (DTT), se agitó la mezcla con formación de vórtice, y se incubó durante 15 minutos, momento en el que se microcentrifugó durante 15 minutos para suprimir el precipitado de Ag+DTT. Se recolectó el sobrenadante y el precipitado se lavó con 100 \mul de tampón TEAA, y se juntaron las soluciones. El oligonucleótido resultante se unió entonces a la superficie de oro mediante técnicas estándares.

Ejemplo 9 Síntesis de un ácido nucleico de hebra única que contiene ambos, un grupo aceptor de electrones y un grupo donante de electrones

Con objeto de evaluar la naturaleza dependiente del camino del proceso de transferencia de electrones a través de ADN dúplex, se preparó un oligonucleótido con un donante de electrones en el extremo 3' y un aceptor de electrones en el extremo 50. Este oligonucleótido modificado de forma múltiple se preparó sintetizando un derivado con una amina en la posición 2' de la ribosa terminal en ambos extremos.

Síntesis de oligonucleótidos bis-3',5',2'-desoxiuridina

Se preparó un fosforamidito de 2'-amino-2'-desoxiuridina (U_{NH2}) protegido con DMT-2'-N-trifluoroacetilo, tal como se ha descrito antes, y se hizo reaccionar con anhídrido succínico. Este material se hizo reaccionar con p-nitrofenol para producir el precursor para el anclaje a la resina de vidrio de poro controlada (GPC) como en la Figura 6A. Los oligonucleótidos modificados se ensamblaron mediante técnicas estándares automatizadas de síntesis de ADN en fase sólida, y el oligonucleótido bis-3',5',2'-desoxiuridina se aisló y caracterizó mediante espectrometría de masas y análisis de digestión con HPLC. Además, los oligómeros de aminoribosa y sus complementos se hicieron reaccionar con FITC bajo condiciones que favorecen el marcaje de aminas primarias. Tal como se esperaba, sólo se marcó el sitio 2'-amino-2'-desoxirribosa, verificándose la presencia de un amina primaria sobre el ADN. Como en el ejemplo, se preparó una secuencia de 11 pares de bases (calculado para U_{NH2}CTCCTACACU_{NH2} 3229, hallado 3229,1), y el mapa de digestión subsiguiente fue consistente con la estructura propuesta. La modificación con metal del oligonucleótido modificado con bis-amino se realizó de forma similar. Los nuevos oligonucleótidos modificados con metal se caracterizaron mediante marcaje fluorescente, digestión enzimática, y estudios de temperatura de fusión del dúplex. Los experimentos de desnaturalización y asociación térmica muestran temperaturas de fusión similares para ambos, los oligómeros de rutenio y amino-ribosa. Además, el ADN dúplex modificado con amino se ha caracterizado mediante RMN 2D. Estos datos confirman que los donantes y aceptores están unidos covalentemente a la posición 2'-amino-desoxirribosa, e indican que la estructura del ADN no está perturbada por la presencia de los complejos de rutenio.

Claims

1. Composición que comprende:

: a) un mediador del transporte de electrones;

: b) un primer ácido nucleico de cadena sencillaunido covalentemente a un primer grupo de transferencia de electrones, primer grupo de transferencia de electrones que es un electrodo; y

: c) un segundo ácido nucleico de cadena sencilla unido covalentemente a un segundo grupo de transferencia de electrones.

2. Composición de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho electrodo es un electrodo de superficie oxidado de película delgada.

3. Composición de acuerdo con la reivindicación 2, en donde dicho electrodo de película delgada se selecciona de entre el grupo que consiste en SnO_{2}, TiO_{2}, RuO_{2} y Pt.

4. Composición de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho electrodo es un electrodo de oro.

5. Composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicho segundo grupo de transferencia de electrones es un complejo de metal de transición.

6. Composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicho segundo grupo de transferencia de electrones es un grupo orgánico de transferencia de electrones.

7. Composición de acuerdo con la reivindicación 6, en donde dicho grupo orgánico de transferencia de electrones es el azul de metileno.

8. Composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde dicho segundo ácido nucleico está unido covalentemente a múltiples grupos de transferencia de electrones.

9. Composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde dicho mediador del transporte de electrones es un complejo trisbipiridil o hexamina de un metal de transición.

10. Composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde dicho mediador del transporte de electrones es el ferroceno.

11. Procedimiento para detectar una secuencia diana en un ácido nucleico, que comprende:

: a) proporcionar un complejo de hibridación que comprende:

: 1) un primer ácido nucleico de cadena sencilla unido covalentemente a un primer grupo de transferencia de electrones, primer grupo de transferencia de electrones que es un electrodo; y

: 2) un segundo ácido nucleico de cadena sencilla unido covalentemente a un segundo grupo de transferencia de electrones.

: b) detectar la transferencia de electrones entre los grupos transferencia usando corriente alterna (CA),

en donde la presencia de transferencia de electrones es una indicación de la presencia de dicha secuencia diana.

12. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 11, en donde la secuencia diana comprende un primer dominio de marca, al que se hibrida el primer ácido nucleico de cadena sencilla, y un segundo dominio de marca, al que se hibrida el segundo ácido nucleico de cadena sencilla.

13. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 11, en donde el primer y segundo ácido nucleico de cadena sencilla se hibridan entre ellos.

14. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, en donde dicho electrodo es un electrodo de superficie oxidada de película fina.

15. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 14, en donde dicho electrodo de película delgada se selecciona de entre el grupo que consiste en SnO_{2}, TiO_{2}, RuO_{2} y Pt.

16. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, en donde dicho electrodo es un electrodo de oro.

17. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 16, en donde dicho segundo grupo de transferencia de electrones es un complejo de metal de transición.

18. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 16, en donde dicho segundo grupo de transferencia de electrones es un grupo orgánico de transferencia de electrones.

19. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 18, en donde dicho grupo orgánico de transferencia de electrones es el azul de metileno.

20. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 19, en donde dicho segundo ácido nucleico está unido covalentemente a múltiples grupos de transferencia de electrones.

21. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 20, que emplea un mediador del transporte de electrones.

22. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 21, en donde dicho mediador del transporte de electrones es un complejo trisbipiridil o hexamina de un metal de transición.

23. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 21, en donde dicho mediador de la transferencia de electrones es el ferroceno.