EP4181938A1 - Combinaison de souches de lactobacilles et son utilisation en sante animale - Google Patents

Combinaison de souches de lactobacilles et son utilisation en sante animale

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EP4181938A1
EP4181938A1 EP21755531.7A EP21755531A EP4181938A1 EP 4181938 A1 EP4181938 A1 EP 4181938A1 EP 21755531 A EP21755531 A EP 21755531A EP 4181938 A1 EP4181938 A1 EP 4181938A1
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EP
European Patent Office
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strain
mixture
microorganisms
salivarius
reuteri
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Pending
Application number
EP21755531.7A
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German (de)
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Nuria VIECO SAIZ
Ruth RASPOET
Eric Auclair
Djamel Drider
Frédérique GANCEL
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Lesaffre et Cie SA
Universite Lille 2 Droit et Sante
Original Assignee
Lesaffre et Cie SA
Universite Lille 2 Droit et Sante
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Lesaffre et Cie SA, Universite Lille 2 Droit et Sante filed Critical Lesaffre et Cie SA
Publication of EP4181938A1 publication Critical patent/EP4181938A1/fr
Pending legal-status Critical Current

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    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/225—Lactobacillus

Definitions

  • poultry we mean domestic birds belonging to the gallinaceans or even to the palmipeds which are bred for their meat, their eggs and their feathers.
  • the term “poultry” covers a wide range of birds, ranging from native and commercial chicken breeds to Muscovy ducks, mallards, turkeys, guinea fowl, geese, quails, pigeons, ostriches or pheasants. The most consumed poultry meat is chicken meat.
  • C. perfringens produces and secretes alpha-toxin (a-toxin), a lecithinase causing hemolysis and tissue necrosis, or even b-toxin (or Necrotic enteritis toxin B-like or NetB) causing the formation of endospores in the membrane of intestinal cells.
  • a-toxin alpha-toxin
  • b-toxin or Necrotic enteritis toxin B-like or NetB
  • lactic acid bacteria are widely used in the food industry as a biological food preservative or in factory farming for the prevention of infectious and zoonotic diseases. These bacteria are also used to improve the performance of animal husbandry through the production of digestive enzymes, volatile fatty acids and/or vitamins, which contribute to increasing the digestibility of nutrients and improving feed conversion rate. These lactic acid bacteria are notably found under the name of probiotics.
  • Lactic acid bacteria belong to the phylum Firmicutes, class Bacilli and order Lactobacillales.
  • the taxon called lactic acid bacteria includes cocci, Gram-positive bacilli or coccobacilli, non spondees, anaerobes or facultative aerobes with a G+C percentage of less than 50%. These bacteria are acidophilic with an optimum growth pH between 3.5 and 6.5. Most strains have nutritional requirements and require rich media to grow. This group includes 10 genera, the best known of which are Lactobacillus, Pediococcus, Lactococcus, Enterococcus, Streptococcus, Leuconostoc and Carnobacterium.
  • CN 105861399 also describes the use of a specific strain of Lb. plantarum to prevent necrotic enteritis in broiler chickens by inhibiting the growth of C. perfringens.
  • Document WO2006/133472 describes a complex mixture of 5 microorganisms inhibiting C. perfringens, consisting of E. faecium DSM 16211, L. reuteri DSM 16350, L. salivarius DSM 16351, P. acidilactici DSM 16210 and B. animalis DSM 16284. This document specifies that these specific strains of L. reuteri and L. salivarius are more effective in inhibiting E. coli than C. perfringens.
  • Document WO2016/170280 recommends the use of Bacteroides thetaiotaomicron, optionally combined with L. reuteri and/or L. salivarius, in particular to treat enteritis.
  • KLOSE et al. (Veterinary Microbiology, 2010, 144 (3-4): 515-21) have evaluated the antagonistic activity of various intestinal bacteria, including L. reuteri and L. salivarius, against C. perfringens and report a large heterogeneity between species.
  • the present invention relates to a mixture of microorganisms comprising a strain of Lactobacillus reuteri and a strain of Lactobacillus salivarius.
  • mixture is meant the association of at least 2 different species of microorganisms, advantageously of at least 2 distinct strains of bacteria, even more advantageously of at least 2 strains of lactic acid bacteria (lactobacilli or Lactobacillus ) distinct.
  • a mixture of microorganisms according to the invention may comprise one or more strains of Lb. reuteri and one or more strains of Lb. salivarius, and possibly other microorganisms, including other bacteria.
  • the specific mixture according to the invention is capable of reducing or inhibiting the growth and/or the activity of the bacterium C. perfringens.
  • growth of the bacterium C. perfringens is meant a set of mechanisms leading to an increase in the dry biomass of bacteria. It is the growth of the bacterial cell in size, mass and/or volume but also the growth of a population by cell division.
  • C. perfringens the pathogenic or even toxigenic activity of this bacterium. These include the production or secretion of toxins, such as NetB and a-toxin, or enzymes. It may also be the ability of C. perfringens to adhere to the gastrointestinal tract or even colonize it.
  • the mixture according to the invention allows a reduction or even an inhibition of the production and/or of the secretion of the toxins NetB and ⁇ -toxin.
  • the mixture according to the invention comprises or consists of:
  • the Bifidobacterium bacterium is chosen from the group consisting of: B. bifidum, B. longum, B. infantis, B.breve, B. adolescentis, B. animalis, B. lactis, and combinations thereof.
  • the Enterococcus bacterium is chosen from the group consisting of: E.faecium, E.faecalis, and their combinations
  • the Pediococcus bacterium is P. acidilactici.
  • the yeast is chosen from the group consisting of: Candida Kefyr, Saccharomyces florentinus, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces cerevisiae var. boulardii, and combinations thereof.
  • the present invention relates to a composition
  • a composition comprising a mixture of microorganisms as defined above.
  • composition according to the invention may comprise the usual adjuvants or excipients used in the field considered, such as hydrophilic or lipophilic thickeners or gelling agents, palatables, hydrophilic or lipophilic additives, preservatives, antioxidants, diluents, vitamins, minerals, suspending agents, cellulosic derivatives, absorbents, cryoprotective agents or dyes.
  • adjuvants or excipients used in the field considered, such as hydrophilic or lipophilic thickeners or gelling agents, palatables, hydrophilic or lipophilic additives, preservatives, antioxidants, diluents, vitamins, minerals, suspending agents, cellulosic derivatives, absorbents, cryoprotective agents or dyes.
  • the composition according to the invention comprises at least one compound chosen from the following group: zeolites, calcium carbonate, calcium sulphate, magnesium carbonate, talc, trehalose, chitosan , shellac, albumin, starch, skimmed milk powder, whey, whey powder, maltodextrins, lactose, inulin, dextroses, celluloses, clays including sepiolite, derivatives of yeasts and cereals, vegetable oils or a solvent chosen from water or a physiological solution.
  • zeolites calcium carbonate, calcium sulphate, magnesium carbonate, talc, trehalose, chitosan , shellac, albumin, starch, skimmed milk powder, whey, whey powder, maltodextrins, lactose, inulin, dextroses, celluloses, clays including sepiolite, derivatives of yeasts and cereals, vegetable oils or a solvent chosen from water or
  • the mixture or the composition according to the invention is in dry or liquid form, in particular in freeze-dried, dried, pressed, liquid or frozen form, advantageously in freeze-dried form.
  • the mixture or composition according to the invention is intended to be administered orally.
  • the mixture or the composition may be in various suitable galenic forms, for example in the form of a lyophilisate to be poured and dissolved in drinking water, of a liquid to be poured over food or in water. drink, tablets, powder packaged in capsules or any other suitable form.
  • it is a powder or lyophilisate to be poured and dissolved in the drinking water of the animals.
  • the mixture or the composition according to the invention is added to the beverage or to the food so that the lactobacilli represent from 10 8 to 10 14 CFU/kg of the beverage or of the food, advantageously 10 10 to 10 12 CFU/kg.
  • - score 3 corresponds to an intestine showing large lesions visible through the outer wall of the intestinal tract.
  • the intake can be systematic for all animals from birth or can be decided upon the appearance of symptoms or even death in the farm.
  • the treatment is carried out as a preventive measure, that is to say before the appearance of any symptoms, as soon as the animals are born or after a few days. Even more advantageously, the treatment continues until the death of the animals, which generally occurs at 40 days for poultry.
  • the intake can take place once a day, or even at every drink intake or of food, or perhaps separated by several days.
  • it is taken daily.
  • a preferred dosage corresponds to daily administration, in the form of a food supplement at a concentration of 10 7 CFU/mL (equivalent to 10 7 CFU/g), throughout the life of the animal.
  • the strain of C. perfringens used in the example is a strain of C. perfringens isolated from a chicken suffering from necrotic enteritis.
  • the in vivo experiments took place for 17 days on 150 chickens (30 per experimental condition). The trial started on hatch day. During the tests, the lactobacilli were administered alone ⁇ Lb. reuteri, Lb. salivarius) or in combination ⁇ Lb. reuteri + Lb. salivarius), by gavage once a day, on days 1 and 2, then on day 10 to day 13.
  • Table 2 represents the approximate composition of diets (g/100g) 1-2/ Vaccination
  • the chickens of the group treated with the mixture of Lb. reuteri and Lb. salivarius have similar weights (753.13g) to those of the group of non-challenged chickens (765g), which are significantly different from the infected group (699.58g).
  • a significant decrease in intestinal lesions is obtained on the chickens of the group treated with the Lb mixture. reuteri and Lb. salivarius which present a score of lesions (1.00) similar to that of the group of non-challenged T- chickens (0.88) and significantly different from that of the infected T+ group (1.67).

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Abstract

La présente invention concerne un mélange de microorganismes comprenant une souche de Lactobacillus reuteri et une souche de Lactobacillus salivarius, son utilisation pour préparer un additif ou produit alimentaire à visée animale et pour prévenir ou traiter l'entérite nécrotique.

Description

COMBINAISON DE SOUCHES DE LACTOBACILLES ET SON UTILISATION EN SANTE ANIMALE
DOMAINE DE L’INVENTION
La présente invention décrit une combinaison de lactobacilles (ou bactéries lactiques), à savoir une souche de Lactobacillus reuteri et une souche de Lactobacillus salivarius, et son utilisation pour la prévention et/ou le traitement de l’entérite nécrotique chez l’animal, en particulier le poulet.
ETAT ANTERIEUR DE LA TECHNIQUE
En 2017, la production mondiale de viande a augmenté de 1,25% pour atteindre 323 Millions de tonnes (Mt) et elle devrait progresser encore de près de 15% à l’horizon 2027 (Organisation de Coopération et de Développement Economiques (OCDE) / Food and Agriculture Organization (FAO), 2018). La croissance de la demande en produits camés est principalement due à la croissance démographique, à l’urbanisation et à la hausse des revenus dans les pays en développement.
La production de viande de volailles représente la principale filière dans l’industrie des produits camés.
Par « volailles », on désigne les oiseaux domestiques appartenant aux gallinacés ou encore aux palmipèdes qui sont élevés pour leur chair, leurs œufs et leurs plumes. Le terme « volailles » couvre un large éventail d’oiseaux, allant des races de poules indigènes et commerciales aux canards de Barbarie, canards colverts, dindes, pintades, oies, cailles, pigeons, autruches ou faisans. La viande de volailles la plus consommée est la viande de poulet.
La viande de volailles est principalement produite dans le cadre d’élevages intensifs à grande échelle. L’industrie mondiale de la volaille est devenue un secteur générant des profits importants dont le succès est intimement lié à la santé des animaux et plus précisément à leur tractus gastro intestinal sain, qui assure l’absorption efficace des aliments donnés aux volailles.
En effet, les maladies aviaires, c’est-à-dire qui touchent les oiseaux, peuvent générer des pertes financières importantes, en raison du taux de mortalité élevé et de la faible efficacité alimentaire. Ces infections peuvent être d’origines bactérienne, fongique, virale ou parasitaire. Ainsi, les infections bactériennes les plus courantes chez les oiseaux sont les infections dues à Escherichia coli, Salmonella spp, Clostridium perfringens, Pasteurella multocida, Staphylococcus aureus, Mycobacterium avium, Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma synoviae, Mycoplasma meleagridis, Mycoplasma iowae, Clostridium sordellii ou encore Clostridium septicum. Celles-ci sont à l’origine de différentes maladies telles que la maladie respiratoire chronique de la volaille, le choléra aviaire, la dermatite gangréneuse, l’entérite nécrotique ou la tuberculose aviaire.
Parmi les agents les plus importants des maladies entériques chez les volailles, on retrouve Escherichia coli et les bactéries du genre Clostridium.
Les bactéries du genre Clostridium (ou clostridies) sont des bacilles anaérobies à Gram-positif, productrices d’endospores. Elles sont ubiquistes, c’est-à-dire qu’elles se retrouvent dans l’environnement et dans le tractus gastro-intestinal des animaux. A noter que ces bactéries sont, pour la plupart, non pathogènes. Beaucoup de ces bactéries sont largement utilisées dans les fermentations industrielles, par exemple dans la synthèse de composés chimiques tels que l’acétate, le butyrate, le lactate, l’éthanol, le dioxyde de carbone ou les solvants.
Néanmoins, certaines bactéries du genre Clostridium (C.) sont connues pour leur pouvoir pathogène. Il s’agit notamment de C. botulinum, C. tetani, C. difficile, C. perfringens, C. novyi, et C. septicum. Les clostridies provoquent plusieurs atteintes parmi lesquelles l’entérite ulcéreuse causée par C. colinum ou encore l’entérite nécrotique causée par C. perfringens.
L’entérite nécrotique ou entérite nécrosante est une maladie affectant les élevages dans toutes les régions avicoles du monde. Cette pathologie est plus fréquente chez les poulets de chair, mais les poules pondeuses et les dindes peuvent également être touchées.
La capacité de C. perfringens à provoquer cette pathologie dépend de la production de certaines toxines extracellulaires et enzymes à l’origine d’une dégradation des cellules intestinales, telles que les lécithinases ou les toxines nécrosantes.
A titre d’exemple, C. perfringens produit et sécrète de l’alpha-toxine (a-toxine), une lécithinase à l’origine d’une hémolyse et d’une nécrose tissulaire, ou encore de la b-toxine (ou Necrotic enteritis toxin B-like ou NetB) à l’origine de la formation d’endospores dans la membrane des cellules intestinales.
La bactérie C. perfringens est présente naturellement dans l’intestin. En tant que bactérie opportuniste, elle a besoin que l’équilibre intestinal soit compromis pour coloniser, proliférer et exprimer ses toxines, et ainsi provoquer l’entérite nécrotique. Des études ont notamment démontré que la simple infection par C. perfringens n’est pas seule suffisante pour induire la pathologie. Le déclenchement de l’entérite nécrotique nécessite la présence de conditions appelée facteurs de prédisposition comme la coccidiose, une maladie causée par le parasite Eimeria spp, l’alimentation ou encore l’immunosuppression ou le stress des animaux.
L’entérite nécrotique affecte négativement le taux de conversion des aliments chez les animaux d’élevage, c’est-à-dire que les animaux doivent consommer plus d’aliments pour avoir le même gain de poids. Ce type d’entérite nécrotique est problématique car il a un impact négatif sur la productivité et la rentabilité ayant pour résultat des animaux de taille et de poids réduits.
Les signes les plus fréquents permettant de repérer l’entérite nécrotique sont l’apparition d’une somnolence des animaux, un manque de tonus et d’appétit, des diarrhées, une déshydratation ou encore une inappétence. Les poulets meurent généralement en 1 à 2 heures après l’apparition des symptômes. Les taux de mortalité associés à l’entérite nécrotique sont généralement compris entre 2 et 10% mais peuvent parfois atteindre 50%. L’affection est caractérisée par l’augmentation soudaine de la mortalité des cheptels, les oiseaux mourant généralement sans signes avant- coureurs.
L’entérite nécrotique est donc responsable chaque année de pertes économiques colossales dans le monde, évaluées à plus de 6 milliards de dollars en 2015. Ces pertes sont dues aux coûts des mesures de contrôle de la maladie et à la diminution de la production en termes de poids et de mortalité des animaux dans les élevages.
C’est pourquoi des stratégies de prévention et/ou de traitement de l’entérite nécrotique chez les animaux d’élevage sont nécessaires.
Une des manières de lutter contre l’entérite nécrotique est la prévention car comme mentionné précédemment, après l’infection, le développement de la maladie est très rapide et la mortalité élevée.
L’administration d’antibiotiques à faible concentration, c’est-à-dire l’administration de promoteurs de croissance (ou AGP pour Antibiotics Growth Promoters ) comme l’avoparcine, la bacitracine et la virginiamycine, est très efficace dans la prévention et le contrôle de l’entérite nécrotique. Ces AGP favorisent la croissance des animaux et améliorent l’efficacité de la conversion alimentaire. Il est à noter que ces composés sont également utilisés en médecine humaine, à des concentrations supérieures.
Toutefois, l’utilisation abusive de ces antibiotiques, notamment en médecine humaine et vétérinaire, a provoqué une pression sélective qui a accéléré l’évolution et la propagation des bactéries résistantes. En conséquence, leur usage a été interdit comme AGP et conservé au seul titre de la médecine humaine, notamment en Europe.
Après les restrictions sur l’usage des AGP, des alternatives ont été développées pour prévenir et/ou traiter l’entérite nécrotique comme l’utilisation de toxoïdes de NetB, ou la vaccination avec Eimeria, un parasite unicellulaire, afin de réduire la prévalence de la coccidiose connue pour être un facteur de prédisposition important de l’entérite nécrotique.
Il subsiste toutefois un besoin évident de mettre au point des alternatives pour surmonter l’augmentation du taux de mortalité et de morbidité liée à l’interdiction des antibiotiques dans l’alimentation animale, présentant des performances similaires à celles obtenues avec les antibiotiques dans la prévention et/ou le traitement de l’entérite nécrotique.
En raison de leurs propriétés, les bactéries lactiques sont largement utilisées dans l’industrie agroalimentaire comme conservateur biologique des aliments ou dans les élevages industriels pour la prévention des maladies infectieuses et zoonotiques. Ces bactéries sont aussi utilisées pour améliorer la performance des élevages d’animaux grâce à la production d’enzymes digestives, d’acides gras volatiles et/ou de vitamines, qui participent à l’augmentation de la digestibilité des nutriments et à l’amélioration du taux de conversion des aliments. Ces bactéries lactiques sont notamment retrouvées sous la dénomination de probiotiques.
Ainsi, une alternative à l’utilisation des antibiotiques ou AGP consiste à donner aux animaux des additifs ou produits alimentaires, en particulier des probiotiques.
De manière générale, les probiotiques sont définis comme des microorganismes vivants qui confèrent un bénéfice pour la santé de l’hôte, lorsqu’ils sont consommés à des concentrations suffisantes. Ils peuvent interagir avec l’hôte pour améliorer l’immunité, l’homéostasie intestinale, stimuler le métabolisme ou encore réduire le risque d’infection par des agents pathogènes opportunistes.
Certaines bactéries probiotiques interfèrent avec, voire annihilent la pathogénicité des agents microbiens causant des pathologies, par exemple en éliminant ou en inhibant la croissance des bactéries pathogènes dans la lumière intestinale. Certaines produisent des substances antibactériennes capables d’entrer en compétition avec les pathogènes pour les nutriments, les facteurs de croissance et les sites de fixation à l’épithélium intestinal. Elles peuvent également exercer des fonctions immunologiques en modulant la réponse immunitaire de l’hôte lui permettant ainsi de mieux faire face aux infections.
La plupart des probiotiques bactériens appartiennent aux bactéries lactiques. Une des caractéristiques principales de ce groupe de bactéries est leur capacité à produire de l’acide lactique, d’une manière souche-dépendante, par fermentation homo ou hétéro-fermentaire du glucose.
Les bactéries lactiques font partie du phylum des Firmicutes, de la classe des Bacilli et de l’ordre des Lactobacillales . Le taxon appelé bactéries lactiques regroupe des coques, des bacilles ou coccobacilles à Gram-positif, non spondées, anaérobies ou aérobies facultatifs ayant un pourcentage de G+C inférieur à 50%. Ces bactéries sont acidophiles avec un pH optimal de croissance compris entre 3,5 et 6,5. La plupart des souches présentent des exigences nutritionnelles et nécessitent des milieux riches pour se développer. Ce groupe inclut 10 genres dont les plus connus sont Lactobacillus, Pediococcus, Lactococcus, Enterococcus, Streptococcus, Leuconostoc et Carnobacterium.
Au sein des bactéries lactiques, le genre le plus représenté est celui de Lactobacillus ( Lb .) avec plus de 253 espèces décrites à ce jour (http://www.bacterio.net/lactobacillus.html).
Les lactobacilles sont largement utilisés dans l’élaboration des probiotiques, notamment en raison de leur capacité à survivre aux conditions extrêmes retrouvées dans le tractus gastro-intestinal, d’une bonne aptitude à adhérer aux cellules intestinales permettant d’accroître la rétention des probiotiques dans l’intestin, de propriétés d’élimination ou d’inhibition de la croissance des bactéries pathogènes dans la lumière intestinale.
Le document EP 2287 286 décrit notamment que des isolats de Lactobacillus {Lb. sakei ou Lb. reuteri ) possèdent des propriétés anti-inflammatoires et probiotiques.
Le document CN 105861399 décrit également l’utilisation d’une souche spécifique de Lb. plantarum pour prévenir l’entérite nécrotique chez le poulet d’élevage par inhibition de la croissance de C. perfringens.
Le document WO2006/133472 décrit un mélange complexe de 5 microorganismes inhibant C. perfringens, constitué de E. faecium DSM 16211, L. reuteri DSM 16350, L. salivarius DSM 16351, P. acidilactici DSM 16210 et B. animalis DSM 16284. Ce document précise que ces souches spécifiques de L. reuteri et L. salivarius sont plus efficaces pour inhiber E. coli que C. perfringens. Le document W02016/170280 préconise Lutilisation de Bacteroides thetaiotaomicron, éventuellement combinée à L. reuteri et/ou L. salivarius, pour traiter notamment l’entérite. KLOSE et al. (Veterinary Microbiology, 2010, 144 (3-4) : 515-21) ont évalué l’activité antagoniste de différentes bactéries intestinales, dont L. reuteri et L. salivarius, vis-à-vis de C. perfringens et rapporte une grande hétérogénéité entre les espèces.
REN et al. (Microorganisms, 2019, 7(12) : 684) ont rapporté un effet synergique entre probiotique (L. agilis ou L. salivarius ) et phytobiotique sur le microbiote intestinal de jeunes poulets d’élevage.
Toutefois, il existe un besoin évident de développer de nouvelles solutions efficaces, de formule simple et contenant un minimum d’actifs, en vue de lutter contre C. perfringens responsable de l’entérite nécrotique du poulet de chair, pour des raisons sanitaires et économiques.
EXPOSE DE L’INVENTION
Définitions
Les définitions ci-dessous correspondent au sens généralement utilisé dans le contexte de l’invention et sont à prendre en compte, à moins qu’une autre définition ne soit explicitement indiquée.
Au sens de l’invention, les articles « un » et « une » sont utilisés pour se référer à une ou à plusieurs (par exemple à au moins une) unités de l’objet grammatical de l’article. A titre d’exemple, « un élément » désigne au moins un élément, c’est-à-dire un élément ou plus.
Les termes « environ » ou « approximativement », utilisés en référence à une valeur mesurable telle qu’une quantité, une durée, et autres valeurs analogues, doivent être compris comme englobant des incertitudes de mesure de ± 20% ou de ± 10%, préférentiellement de ± 5%, encore plus préférablement de ± 1%, et de manière particulièrement préférée de ± 0,1% de la valeur spécifiée.
Intervalles: tout au long de la présente description, les différentes caractéristiques de l’invention peuvent être présentées sous forme d’intervalle de valeurs. Il doit être compris que la description de valeurs sous forme d’intervalle a uniquement pour finalité de rendre la lecture plus simple et ne doit pas être interprétée comme une limitation rigide de la portée de l’invention. En conséquence, la description d’un intervalle de valeurs devrait être considérée comme divulguant spécifiquement tous les intervalles intermédiaires possibles ainsi que chacune des valeurs au sein de cet intervalle. Par exemple, la description d’un intervalle allant de 1 à 6 devrait être considérée comme décrivant spécifiquement chacun des intervalles qu’il comprend, tels que les intervalles allant de 1 à 3, de 1 à 4, de 1 à 5, de 2 à 4, de 2 à 6, de 3 à 6, etc., ainsi que chacune des valeurs dans cet intervalle, par exemple, 1 ; 2 ; 2,7 ; 3 ; 4 ; 5 ; 5,3 et 6. Cette définition vaut indépendamment de la portée de l’intervalle.
Le terme « isolé » doit être compris dans le contexte de l’invention comme synonyme de retiré ou extrait de son environnement ou état naturel. Par exemple, une souche de bactérie ou un peptide isolé est une souche de bactérie ou un peptide extrait de l’environnement naturel dans lequel on le trouve habituellement, qu’il s’agisse d’une plante ou d’un animal vivant par exemple. Ainsi, une souche de bactérie ou un peptide naturellement présent dans un animal vivant n’est pas une souche de bactérie ou un peptide isolé au sens de l’invention, tandis que la même souche de bactérie ou peptide, partiellement ou complètement séparé des autres éléments présents dans son contexte naturel, est quant à lui « isolé » au sens de l’invention. Une souche de bactérie ou un peptide isolé peut exister sous une forme substantiellement purifiée, ou peut exister dans un environnement non natif tel que, par exemple, une cellule hôte.
De façon surprenante, le Demandeur a identifié une nouvelle combinaison spécifique de bactéries lactiques, utile pour lutter contre l’entérite nécrotique, en particulier chez les animaux d’élevage tels que le poulet.
Ainsi et selon un premier aspect, la présente invention concerne un mélange de microorganismes comprenant une souche de Lactobacillus reuteri et une souche de Lactobacillus salivarius.
Au sens de l’invention, par « mélange », on désigne l’association d’au moins 2 espèces différentes de microorganismes, avantageusement d’au moins 2 souches de bactéries distinctes, encore plus avantageusement d’au moins 2 souches de bactéries lactiques (lactobacilles ou Lactobacillus ) distinctes.
Ainsi, un mélange de microorganismes selon l’invention peut comprendre une ou plusieurs souches de Lb. reuteri et une ou plusieurs souches de Lb. salivarius, et éventuellement d’autres microorganismes, notamment d’autres bactéries.
Selon un autre aspect, la présente invention concerne un mélange de bactéries lactiques constitué d’au moins une souche de Lb. reuteri et d’au moins une souche de Lb. salivarius. Selon un mode de réalisation particulier, le mélange de bactéries lactiques est constitué d’une souche de Lb. reuteri et d’au moins une souche de Lb. salivarius, possiblement de deux souches de Lb. salivarius. Selon un autre mode de réalisation, le mélange de bactéries lactiques est constitué d’une souche de Lb. reuteri et d’une souche de Lb. salivarius.
Comme démontré dans la présente demande, le mélange spécifique selon l’invention est capable de réduire ou d’inhiber la croissance et/ou l’activité de la bactérie C. perfringens.
Au sens de l’invention, par « croissance de la bactérie C. perfringens », on désigne un ensemble de mécanismes conduisant à une augmentation de la biomasse sèche en bactéries. Il s’agit de la croissance de la cellule bactérienne en taille, masse et/ou volume mais également de la croissance d’une population par division cellulaire.
Au sens de l’invention, par « activité de la bactérie C. perfringens », on désigne l’activité pathogène ou encore toxinogène de cette bactérie. Il s’agit notamment de la production ou sécrétion de toxines, telles que NetB et a-toxine, ou d’enzymes. Il peut également s’agir de la capacité de C. perfringens à adhérer au tractus gastro-intestinal voire de le coloniser.
Avantageusement, le mélange selon l’invention permet une réduction voire une inhibition de la production et/ou de la sécrétion des toxines NetB et a-toxine.
Selon un mode de réalisation particulier, le mélange selon l’invention comprend la souche de Lb. reuteri déposée à la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15) sous le numéro 1-5500 en date du 04 mars 2020.
Selon un autre mode de réalisation particulier, le mélange selon l’invention comprend la souche de Lb. salivarius déposée à la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15) sous le numéro 1-5501 en date du 04 mars 2020 et/ou la souche de Lb. salivarius déposée à la CNCM sous le numéro 1-5502 en date du 04 mars 2020.
Selon un mode de réalisation spécifique, le mélange de microorganismes selon l’invention comprend ou est constitué de :
- une souche de Lactobacillus reuteri et une souche de Lactobacillus salivarius. ladite souche de Lb. reuteri étant la souche déposée à la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15) sous le numéro 1-5500 en date du 04 mars 2020 ; ou
- une souche de Lactobacillus reuteri et une souche de Lactobacillus salivarius, ladite souche de Lb. salivarius étant la souche déposée à la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15) sous le numéro 1-5501 en date du 04 mars 2020 et/ou la souche déposée à la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15) sous le numéro 1-5502 en date du 04 mars 2020 ; ou
- la souche de Lb. reuteri déposée à la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15) sous le numéro 1-5500 en date du 04 mars 2020 et la souche de Lb. salivarius déposée à la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15) sous le numéro 1-5501 en date du 04 mars 2020 et/ou la souche de Lb. salivarius déposée à la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15) sous le numéro 1-5502 en date du 04 mars 2020.
Selon différents modes de réalisation, le mélange selon l’invention comprend ou est constitué de :
- la souche de Lb. reuteri déposée à la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15) sous le numéro 1-5500 en date du 04 mars 2020 et la souche de Lb. salivarius déposée à la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15) sous le numéro 1-5501 en date du 04 mars 2020 ; ou
- la souche de Lb. reuteri déposée à la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15) sous le numéro 1-5500 en date du 04 mars 2020 et la souche de Lb. salivarius déposée à la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15) sous le numéro 1-5502 en date du 04 mars 2020 ; ou
- la souche de Lb. reuteri déposée à la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15) sous le numéro 1-5500 en date du 04 mars 2020, la souche de Lb. salivarius déposée à la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15) sous le numéro 1-5501 en date du 04 mars 2020 et la souche de Lb. salivarius déposée à la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15) sous le numéro 1-5502 en date du 04 mars 2020.
Selon un mode de réalisation particulier, le mélange contient d’autres microorganismes, avantageusement d’autres probiotiques. De manière préférée, le mélange contient d’autres microorganismes choisis parmi : des bactéries du genre Lactobacillus, des bactéries du genre Bifidobacterium, des bactéries du genre Streptococcus, des bactéries du genre Enterococcus, des bactéries du genre Pediococcus, des bactéries du genre Bacillus, des levures, et leurs combinaisons.
De manière préférée, la bactérie Lactobacillus est choisie dans le groupe constitué de: Lb acidophilus, Lb. lactis, Lb. helveticus, Lb. brevis, Lb. casei, Lb. plantarum, Lb. salivarius, avantageusement une autre souche de Lb salivarius, Lb. reuteri, avantageusement une autre souche de Lb reuteri, Lb. bifidus, Lb. bulgaricus, Lb. caucasicus, Lb. rhamnosus, Lb. gasseri, Lb. sakei, Lb. fermentum, et leurs combinaisons.
De manière préférée, la bactérie Bifidobacterium est choisie dans le groupe constitué de: B. bifidum, B. longum, B. infantis, B. brève, B. adolescentis, B. animalis, B. lactis, et leurs combinaisons.
De manière préférée, la bactérie Streptococcus est choisie dans le groupe constitué de: S. thermophilus, S. lactis, S. cremoris, S. diacetylcatis, et leurs combinaisons.
De manière préférée, la bactérie Enterococcus est choisie dans le groupe constitué de: E.faecium, E.faecalis, et leurs combinaisons
De manière préférée, la bactérie Pediococcus est P. acidilactici .
De manière préférée, la bactérie Bacillus est choisie dans le groupe constitué de : B. subtilis, B. velezensis, B. licheniformis, B. coagulans, B. pumilus, et leurs combinaisons.
De manière préférée, la levure est choisie dans le groupe constitué de: Candida Kefyr, Saccharomyces florentinus, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces cerevisiae var. boulardii, et leurs combinaisons.
Selon un autre aspect, la présente invention concerne une composition comprenant un mélange de microorganismes tel que défini ci-dessus.
En outre, la composition selon l’invention peut comprendre les adjuvants ou excipients habituels utilisés dans le domaine considéré, tels que des épaississants ou gélifiants hydrophiles ou lipophiles, des appétents, des additifs hydrophiles ou lipophiles, des conservateurs, des antioxydants, des diluants, des vitamines, des minéraux, des agents de suspension, des dérivés cellulosiques, des absorbants, des agents cryoprotecteurs ou encore des colorants.
Bien entendu, l'homme du métier veillera à choisir ce ou ces éventuels adjuvants ou excipients, et à ajuster leur quantité, de manière telle que les propriétés avantageuses de la composition selon l'invention ne soient pas, ou substantiellement pas, altérées par l'adjonction envisagée.
Selon un mode de réalisation, la composition selon l’invention comprend des substances nutritives utilisables comme support et/ou des substances prébiotiques avantageusement choisies parmi les fructo-oligosaccharides, les inulines, les isomalto-oligosaccharides, le lactitol, le lactosaccharose, la lactulose, les pyrodextrines, les oligosaccharides de soja, les transgalacto-oligosaccharides, les xylo-oligosaccharides, les vitamines, en particulier la vitamine E.
Selon un autre mode de réalisation, la composition selon l’invention comprend au moins un composé choisi dans le groupe suivant : les zéolithes, le carbonate de calcium, le sulfate de calcium, le carbonate de magnésium, le talc, le tréhalose, le chitosane, la gomme laque, l'albumine, l’amidon, la poudre de lait écrémé, le lactosérum, la poudre de petit lait, les maltodextrines, le lactose, l’inuline, les dextroses, les celluloses, les argiles dont le sépiolite, des dérives de levures et céréales, les huiles végétales ou un solvant choisi parmi l'eau ou une solution physiologique.
Selon un mode de réalisation particulier, la composition selon l’invention comprend un matériau de revêtement avantageusement choisi parmi les maltodextrines, la farine de graines de guar, la gomme arabique, les alginates, l'amidon modifié et les dérivés d'amidon, les dextrines, les dérivés de cellulose tels que l’ester de cellulose et l’éther de cellulose, les protéines telles que la gélatine, l’albumine, la caséine, le gluten, la gomme arabique, la gomme adragante, les lipides tels que les cires, la paraffine, l’acide stéarique, les mono- et diglycérides.
Le mélange ou la composition selon l’invention peut se présenter sous la forme d’une poudre, d’une capsule, d’un spray, d’une solution, d’une émulsion, d’une suspension ou d’une dispersion.
Avantageusement, le mélange ou la composition selon l’invention est sous forme sèche ou liquide, notamment sous forme lyophilisée, séchée, pressée, liquide ou surgelée, avantageusement sous forme lyophilisée.
Selon un mode de réalisation préféré, le mélange ou la composition selon l’invention est destiné à être administré par voie orale. Pour cela, le mélange ou la composition peut se présenter sous différentes formes galéniques adaptées, par exemple sous forme d’un lyophilisât à verser et solubiliser dans l’eau de boisson, d’un liquide à verser sur la nourriture ou dans l’eau de boisson, de comprimés, d’une poudre conditionnée en gélules ou toute autre forme appropriée. Avantageusement, il s’agit d’une poudre ou lyophilisât à verser et solubiliser dans l’eau de boisson des animaux.
Selon un mode de réalisation particulier, le mélange ou la composition selon l’invention contient les lactobacilles selon l’invention à une concentration finale comprise entre 105 et 109 CFU (' Colony Forming Unit ou unité formant une colonie)/mL du mélange ou de la composition selon l’invention, avantageusement comprise entre 106 et 108 CFU/mL, par exemple à une concentration finale de 107 CFU/mL.
Cette concentration peut s’entendre comme la concentration de chaque microorganisme, avantageusement bactérie, encore plus avantageusement lactobacille, présent dans le mélange ou la composition, avantageusement dans l’eau de boisson des animaux. De manière privilégiée, il s’agit de la concentration de l’ensemble des microorganismes, avantageusement bactéries, encore plus avantageusement lactobacilles, présents dans le mélange ou la composition. Ainsi et à titre d’exemple, pour une concentration finale de lactobacilles de 107 CFU/mL, un mélange selon l’invention pourra comprendre ou être constitué d’une souche de Lb. reuteri et d’une souche de Lb. salivarius à une concentration de 0,5x107 CFU/mL chacune.
Selon un autre aspect, l’invention concerne l’utilisation d’un mélange ou d’une composition selon l’invention comme additif ou produit alimentaire à visée animale.
Au sens de l’invention, par « additif ou produit alimentaire », on désigne une composition dont le but est de compléter le régime alimentaire traditionnel et comprenant des nutriments ou d’autres substances ayant un effet nutritionnel ou physiologique. Comme déjà dit, il peut s’agir d’un additif à l’eau de boisson ou à des aliments tels que, par exemple, des céréales et/ou légumineuses comme le soja. De manière convenue, le terme « boisson » est utilisé pour les produits ingérés se présentant sous forme liquide et le terme « aliment » pour ceux se présentant sous forme solide.
Le mélange ou la composition selon l’invention peut être ajouté à la boisson ou aux aliments de manière extemporanée, ou peut être introduit notamment dans les aliments au moment de leur fabrication, par exemple par mixage ou enrobage.
Selon un mode de réalisation particulier, le mélange ou la composition selon l’invention est ajoutés à la boisson ou aux aliments de sorte que les lactobacilles représentent de 108 à 1014 CFU/kg de la boisson ou de l’aliment, avantageusement de 1010 à 1012 CFU/kg.
Selon un autre aspect, l’invention concerne l’utilisation d’un mélange ou d’une composition tels que décrits ci-dessus, ainsi que des boissons et aliments les contenant, pour lutter contre l’entérite nécrotique chez l’animal, à savoir pour prévenir et/ou traiter cette pathologie.
De manière connue et comme décrit dans les exemples, l’efficacité sur l’entérite nécrotique peut être évaluée par détermination d’un score de lésions au niveau des intestins des animaux :
- le score 0 correspond à un intestin sain ;
- le score 1 correspond à un intestin fin et friable ;
- le score 2 correspond à intestin mince et friable avec l’apparition de taches de nécrose de taille réduite ; et
- le score 3 correspond à un intestin montrant de grandes lésions visibles à travers la paroi extérieure du tractus intestinal.
La prévention et/ou le traitement de l’entérite nécrotique peut également s’évaluer par le suivi du poids des animaux. Comme mentionné précédemment, les lésions intestinales diminuent la conversion des aliments ce qui induit une perte de poids des animaux.
Selon un mode de réalisation préféré, l’animal visé par la présente invention est une volaille, avantageusement un poulet, de préférence un poulet à chair (ou poulet d’élevage).
Comme déjà dit et de manière préférée, le mélange ou la composition selon l’invention, éventuellement intégré à la boisson ou aux aliments, est administré ou ingéré par voie orale.
La prise peut être systématique pour tous les animaux dès la naissance ou peut être décidée à l’apparition de symptômes voire de morts dans l’élevage. De manière avantageuse, le traitement est réalisé à titre préventif, c’est-à-dire avant l’apparition de tout symptôme, dès la naissance des animaux ou après quelques jours. Encore plus avantageusement, le traitement se poursuit jusqu’à la mort des animaux, qui intervient généralement à 40 jours pour les volailles.
Par ailleurs, la prise peut avoir lieu une fois par jour, voire à toutes les prises de boisson ou d’aliments, ou peut-être espacée de plusieurs jours. Avantageusement, la prise est quotidienne.
Une posologie privilégiée correspond à une administration quotidienne, sous forme d’un complément alimentaire à une concentration de 107 CFU/mL (équivalent 107 CFU/g), tout au long de la vie de l’animal.
Selon un autre aspect, l’invention concerne des souches de lactobacilles d’intérêt en raison de leur activité inhibitrice sur la croissance et/ou l’activité de Clostridium perfringens listées ci-dessous : la souche Lb. reuteri déposée à la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15) sous le numéro 1-5500 en date du 04 mars 2020 ; la souche Lb. salivarius déposée à la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15) sous le numéro 1-5501 en date du 04 mars 2020 ; la souche Lb. salivarius déposée à la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15) sous le numéro 1-5502 en date du 04 mars 2020.
EXEMPLES DE REALISATION DE L’INVENTION
La manière dont l’invention peut être réalisée et les avantages qui en découlent ressortiront mieux des exemples de réalisation qui suivent, donnés à titre indicatif et non limitatif, à l’appui de la figure annexée.
La figure 1 représente l’efficacité du mélange bactérien selon l’invention en termes de poids des poulets. Les lettres (a, b, c) indiquent des différences statistiques significatives.
La figure 2 représente l’efficacité du mélange bactérien selon l’invention en termes de score de lésion des poulets. Les lettres (a, b, c) indiquent des différences statistiques significatives.
Mise en évidence de l’effet du mélanee bactérien selon l’invention sur l’entérite nécrotiaue
Les expériences ont été réalisées à l’aide de la souche de Lb. reuteri déposée auprès de la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15) sous le numéro 1-5500 en date du 04 mars 2020 et de la souche de Lb. salivarius déposée à la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15) sous le numéro 1-5501 en date du 04 mars 2020.
La souche de C. perfringens mise en œuvre dans l’exemple est une souche de C. perfringens isolée de poulet atteint d’entérite nécrotique.
1/ Matériel et méthodes :
La capacité de la combinaison de Lb. reuteri et Lb. salivarius selon l’invention à prévenir l’entérite nécrotique a été évaluée in vivo sur du poulet de chair provenant d’un croisement des lignées Cobb 500 (femelle) et Hubbard M99 (mâle).
Les expériences in vivo se sont déroulées pendant 17 jours sur 150 poulets (30 par condition expérimentale). L’essai a débuté le jour de l'éclosion. Durant les essais, les lactobacilles ont été administrés seuls {Lb. reuteri, Lb. salivarius ) ou en combinaison {Lb. reuteri + Lb. salivarius ), par gavage une fois par jour, aux jours 1 et 2, puis du jour 10 au jour 13.
1-1/ Environnement des poulets et régime alimentaire
Les poulets ont été élevés dans des cages donnant une surface moyenne de 432 cm2 par poulet. Les cages ont été placées à plusieurs niveaux dans une salle climatisée maintenue à une température ambiante tout au long de l'étude, et habilitée pour des essais avec un risque biologique de niveau 2. L'éclairage a été fourni 24/24 heures pendant toute la durée de l'étude. Les oiseaux ont reçu de l’eau et de la nourriture ad-libitum, c’est-à-dire qu’ils ont été nourris à satiété.
L’alimentation des 9 premiers jours est à base de maïs et de soja. Après le jour 10, le régime de croissance inclut du blé (Tableaux 1 et 2). Les deux régimes sont administrés sous forme de purée.
Le tableau 1 représente la composition des régimes par ingrédients (g/ 100g)
Le tableau 2 représente la composition approximative des régimes (g/ 100g) 1-2/ Vaccination
A l’exception du groupe non-challengé (n’ayant pas reçu d’administration de C. perfringens ), les poulets ont été vaccinés au jour 1 avec « Advent@9X ». Ce vaccin contient des oocystes vivants d'Eiineria acervulina, E. maxima et E. tenell, la gentamicine et l’amphotéricine B comme conservateurs. L’objectif est d’aider à prévenir la coccidiose aviaire générée par ces pathogènes. Au 9eme jour, les poulets ont été vaccinés d’une manière intraoculaire contre la bursite infectieuse aviaire par l’Intervet, Bursal Vac-G603 qui est un vaccin contenant des virus vivants atténués.
1-3/ Traitement des différents lots Cinq traitements différents ont été testés. Chaque traitement a été répété six fois et chaque réplica contient 5 poulets.
Ces traitements sont récapitulés ci-dessous :
- T- : Groupe témoin non supplémenté en lactobacilles et non challengé avec C. perfringens ;
- T+ : Groupe témoin positif, non supplémenté en lactobacilles et challengé avec C. perfringens ;
- Lb. reuteri : supplémenté en Lb. reuteri et challengé avec C. perfringens,
- Lb. salivarius : supplémenté en Lb. salivarius et challengé avec C. perfringens,
- Lb. reuteri + Lb. salivarius : supplémenté par un mélange de Lb. reuteri et Lb. salivarius et challengé avec C. perfringens.
1-4/ Administration de C. perfringens
La souche de C. perfringens sauvage a été cultivée dans du bouillon thioglycollate pendant une nuit à 37°C. C. perfringens a ensuite été administré à une concentration de 107 CFU/mL en dose de gavage oral de 3 mL administrée dans du thioglycollate stérile, à l’aide d’une seringue de 20 mL et d’une aiguille de dosage 20 jauge, du 14eme au 16eme jours d’âge. Après l’administration, les oiseaux ont été immobilisés à la main pendant 5 à 10s pour confirmer la délivrance de la dose appropriée et l'absence de stress.
1-5/ Administration des bactéries lactiques
Les souches de bactéries lactiques ont été cultivées dans bouillon MRS (de Man-Rogosa-Sharpe) à 37°C pendant une nuit. Aux 1er et 2eme jours d’âge, 250 à 500 pL de suspension de Lactobacillus à 107 CFU/mL (seules ou concentration finale du mélange des 2 souches Lb reuteri et Lb salivarius, c’est-à-dire à 0,5x107 CFU/mL chacune concernant le mélange) ont été administrés par voie orale aux oiseaux. Pour les 10eme à 13eme jours d’âge, la posologie est augmentée à 1 mL, tout en maintenant la concentration à 107 CFU/mL. Les groupes témoins (T- et T+) ont reçu le même volume de solution de PBS stérile. Les oiseaux témoins négatifs ont été traités en premier afin de réduire le risque de contamination croisée.
1-6/ Mesures effectuées sur les oiseaux
L'étude s’est terminée le 17eme jour. Les performances des oiseaux ont été mesurées aux 0, 10eme, 14eme et 17eme jours de la période expérimentale en enregistrant le poids des oiseaux (en g) (Figure 1) et la consommation d'aliments pour chaque cage. À la fin de l'essai, tous les oiseaux ont été euthanasiés par asphyxie au CO2. Les lésions d'entérite nécrotique ont été recherchées dans les intestins et analysées comme décrit par Prescott et al. (1978, Can. Vet. J. 19, 181-183) (Figure 2). Le protocole expérimental est récapitulé dans le tableau 3 ci-dessous. X correspond au jour d’administration d’un produit.
1-7/ Analyse statistique
Les comparaisons statistiques entre les différents résultats obtenus ont été effectuées par analyse de la variance ANOVA à l’aide du logiciel Statgraphics® Centurion XVI.
2/ Résultats :
Les résultats sont présentés dans le tableau 4 ci-dessous.
Les lettres en index (a, b, c) indiquent des différences statistiques significatives. Les groupes qui possèdent la même lettre ne diffèrent pas significativement.
Les résultats de la Figure 1 montrent que les poulets du groupe traité avec Lb. reuteri ou Lb. salivarius présentent une augmentation non significative de leur poids (709,79g et 707,50g, respectivement) par rapport au groupe contrôle positif (T+). Cette augmentation ne permet pas de retrouver un poids des poulets semblable à celui du groupe contrôle négatif (T-).
Au contraire, les poulets du groupe traité avec le mélange de Lb. reuteri et Lb. salivarius présentent des poids similaires (753,13g) à ceux du groupe de poulets non challengés (765g), qui sont significativement différents du groupe infecté (699,58g).
Concernant les lésions intestinales causées par l’administration de C. perfringens (Figure 2), il ressort des données que l’administration de Lb. reuteri ou de Lb. salivarius seule aux groupes de poulets challengés ne diminue pas signifîcativement le score de lésions par rapport au groupe T+.
Une diminution significative des lésions intestinales est obtenue sur les poulets du groupe traité avec le mélange de Lb. reuteri et Lb. salivarius qui présentent un score de lésions (1,00) similaire à celui du groupe de poulets T- non challengés (0,88) et signifîcativement différent de celui du groupe infecté T+ (1,67).
En conclusion, ces données in vivo montrent que la supplémentation en Lb. reuteri et Lb. salivarius combinées produit un effet de protection contre l’entérite nécrotique chez le poulet.

Claims

REVENDICATIONS
1/ Mélange de microorganismes comprenant une souche de Lactobacillus reuteri et une souche de Lactobacillus salivarius.
2/ Mélange selon la revendication 1 caractérisé en ce qu’il est constitué d’une souche de Lb. reuteri et d’au moins une souche de Lb. salivarius, avantageusement d’une souche de Lb. reuteri et d’une souche de Lb. salivarius.
3/ Mélange selon l’une des revendications 1 à 2, caractérisé en ce que les souches présentent une activité inhibitrice sur la croissance et/ou l’activité de Clostridium perfringens.
4/ Mélange selon l’une des revendication 1 à 3, caractérisé en ce que la souche de Lb. reuteri est la souche déposée à la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15) sous le numéro 1-5500 en date du 04 mars 2020.
5/ Mélange selon l’une des revendication 1 à 4, caractérisé en ce que la souche de Lb. salivarius est la souche déposée à la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15) sous le numéro 1-5501 en date du 04 mars 2020 ou la souche déposée à la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15) sous le numéro 1-5502 en date du 04 mars 2020.
6/ Composition comprenant un mélange selon l’une des revendications 1 à 5.
7/ Mélange selon l’une des revendications 1 à 5 ou composition selon la revendication 6 se présentant sous forme lyophilisée.
8/ Utilisation d’un mélange selon l’une des revendications 1 à 5 ou 7, ou d’une composition selon l’une des revendications 6 à 7, comme additif ou produit alimentaire à visée animale.
9/ Mélange selon l’une des revendications 1 à 5 ou 7, ou composition selon l’une des revendications 6 à 7, pour utilisation dans la prévention et/ou le traitement de l’entérite nécrotique chez l’animal. 10/ Mélange ou composition pour son utilisation selon la revendication 9, caractérisée en ce que le mélange ou la composition est administré par voie orale.
11/ Mélange ou composition pour son utilisation selon la revendication 9 ou 10, caractérisée en ce que l’animal est une volaille, avantageusement un poulet, encore plus avantageusement un poulet à chair.
12/ Souche correspondant à : la souche déposée à la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15) sous le numéro 1-5500 en date du 04 mars 2020 ; ou la souche déposée à la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15) sous le numéro 1-5501 en date du 04 mars 2020 ; ou - la souche déposée à la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes,
Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15) sous le numéro 1-5502 en date du 04 mars 2020.
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