FR3112557A1 - Combinaison de souches de lactobacilles et son utilisation en sante animale - Google Patents

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Universite Lille 2 Droit et Sante
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Abstract

La présente invention concerne un mélange de microorganismes comprenant une souche de Lactobacillus reuteri et une souche de Lactobacillus salivarius, son utilisation pour préparer un additif ou produit alimentaire à visée animale et pour prévenir ou traiter l’entérite nécrotique.

Description

COMBINAISON DE SOUCHES DE LACTOBACILLES ET SON UTILISATION EN SANTE ANIMALE
DOMAINE DE L’INVENTION
La présente invention décrit une combinaison de lactobacilles (ou bactéries lactiques), à savoir une souche deLactobacillus reuteriet une souche deLactobacillus salivarius, et son utilisation pour la prévention et/ou le traitement de l’entérite nécrotique chez l’animal, en particulier le poulet.
ETAT ANTERIEUR DE LA TECHNIQUE
En 2017, la production mondiale de viande a augmenté de 1,25% pour atteindre 323 Millions de tonnes (Mt) et elle devrait progresser encore de près de 15% à l’horizon 2027 (Organisation de Coopération et de Développement Economiques (OCDE) /Food and Agriculture Organization(FAO), 2018). La croissance de la demande en produits carnés est principalement due à la croissance démographique, à l’urbanisation et à la hausse des revenus dans les pays en développement.
La production de viande de volailles représente la principale filière dans l’industrie des produits carnés.
Par « volailles », on désigne les oiseaux domestiques appartenant aux gallinacés ou encore aux palmipèdes qui sont élevés pour leur chair, leurs œufs et leurs plumes. Le terme « volailles » couvre un large éventail d’oiseaux, allant des races de poules indigènes et commerciales aux canards de Barbarie, canards colverts, dindes, pintades, oies, cailles, pigeons, autruches ou faisans. La viande de volailles la plus consommée est la viande de poulet.
La viande de volailles est principalement produite dans le cadre d’élevages intensifs à grande échelle. L’industrie mondiale de la volaille est devenue un secteur générant des profits importants dont le succès est intimement lié à la santé des animaux et plus précisément à leur tractus gastro-intestinal sain, qui assure l’absorption efficace des aliments donnés aux volailles.
En effet, les maladies aviaires, c’est-à-dire qui touchent les oiseaux, peuvent générer des pertes financières importantes, en raison du taux de mortalité élevé et de la faible efficacité alimentaire. Ces infections peuvent être d’origines bactérienne, fongique, virale ou parasitaire. Ainsi, les infections bactériennes les plus courantes chez les oiseaux sont les infections dues àEscherichia coli,Salmonella spp,Clostridium perfringens,Pasteurella multocida, Staphylococcus aureus, Mycobacterium avium, Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma synoviae, Mycoplasma meleagridis, Mycoplasma iowae, Clostridium sordelliiou encoreClostridium septicum. Celles-ci sont à l’origine de différentes maladies telles que la maladie respiratoire chronique de la volaille, le choléra aviaire, la dermatite gangréneuse, l’entérite nécrotique ou la tuberculose aviaire.
Parmi les agents les plus importants des maladies entériques chez les volailles, on retrouveEscherichia coliet les bactéries du genreClostridium.
Les bactéries du genreClostridium(ou clostridies) sont des bacilles anaérobies à Gram-positif, productrices d’endospores. Elles sont ubiquistes, c’est-à-dire qu’elles se retrouvent dans l’environnement et dans le tractus gastro-intestinal des animaux. A noter que ces bactéries sont, pour la plupart, non pathogènes. Beaucoup de ces bactéries sont largement utilisées dans les fermentations industrielles, par exemple dans la synthèse de composés chimiques tels que l’acétate, le butyrate, le lactate, l’éthanol, le dioxyde de carbone ou les solvants.
Néanmoins, certaines bactéries du genreClostridium(C.) sont connues pour leur pouvoir pathogène. Il s’agit notamment deC. botulinum, C. tetani, C. difficile, C. perfringens, C. novyi, etC. septicum. Les clostridies provoquent plusieurs atteintes parmi lesquelles l’entérite ulcéreuse causée parC. colinumou encore l’entérite nécrotique causée parC. perfringens.
L’entérite nécrotique ou entérite nécrosante est une maladie affectant les élevages dans toutes les régions avicoles du monde. Cette pathologie est plus fréquente chez les poulets de chair, mais les poules pondeuses et les dindes peuvent également être touchées.
La capacité deC. perfringensà provoquer cette pathologie dépend de la production de certaines toxines extracellulaires et enzymes à l’origine d’une dégradation des cellules intestinales, telles que les lécithinases ou les toxines nécrosantes.
A titre d’exemple,C. perfringensproduit et sécrète de l’alpha-toxine (α-toxine), une lécithinase à l’origine d’une hémolyse et d’une nécrose tissulaire, ou encore de la β-toxine (ouNecrotic enteritis toxin B-likeou NetB) à l’origine de la formation d’endospores dans la membrane des cellules intestinales.
La bactérieC. perfringensest présente naturellement dans l’intestin. En tant que bactérie opportuniste, elle a besoin que l’équilibre intestinal soit compromis pour coloniser, proliférer et exprimer ses toxines, et ainsi provoquer l’entérite nécrotique. Des études ont notamment démontré que la simple infection parC. perfringensn’est pas seule suffisante pour induire la pathologie. Le déclenchement de l’entérite nécrotique nécessite la présence de conditions appelée facteurs de prédisposition comme la coccidiose, une maladie causée par le parasiteEimeria spp, l’alimentation ou encore l’immunosuppression ou le stress des animaux.
L’entérite nécrotique affecte négativement le taux de conversion des aliments chez les animaux d’élevage, c’est-à-dire que les animaux doivent consommer plus d’aliments pour avoir le même gain de poids. Ce type d’entérite nécrotique est problématique car il a un impact négatif sur la productivité et la rentabilité ayant pour résultat des animaux de taille et de poids réduits.
Les signes les plus fréquents permettant de repérer l’entérite nécrotique sont l’apparition d’une somnolence des animaux, un manque de tonus et d’appétit, des diarrhées, une déshydratation ou encore une inappétence. Les poulets meurent généralement en 1 à 2 heures après l’apparition des symptômes. Les taux de mortalité associés à l’entérite nécrotique sont généralement compris entre 2 et 10% mais peuvent parfois atteindre 50%. L’affection est caractérisée par l’augmentation soudaine de la mortalité des cheptels, les oiseaux mourant généralement sans signes avant-coureurs.
L’entérite nécrotique est donc responsable chaque année de pertes économiques colossales dans le monde, évaluées à plus de 6 milliards de dollars en 2015. Ces pertes sont dues aux coûts des mesures de contrôle de la maladie et à la diminution de la production en termes de poids et de mortalité des animaux dans les élevages.
C’est pourquoi des stratégies de prévention et/ou de traitement de l’entérite nécrotique chez les animaux d’élevage sont nécessaires.
Une des manières de lutter contre l’entérite nécrotique est la prévention car comme mentionné précédemment, après l’infection, le développement de la maladie est très rapide et la mortalité élevée.
L’administration d’antibiotiques à faible concentration, c’est-à-dire l’administration de promoteurs de croissance (ou AGP pourAntibiotics Growth Promoters) comme l’avoparcine, la bacitracine et la virginiamycine, est très efficace dans la prévention et le contrôle de l’entérite nécrotique. Ces AGP favorisent la croissance des animaux et améliorent l’efficacité de la conversion alimentaire. Il est à noter que ces composés sont également utilisés en médecine humaine, à des concentrations supérieures.
Toutefois, l’utilisation abusive de ces antibiotiques, notamment en médecine humaine et vétérinaire, a provoqué une pression sélective qui a accéléré l’évolution et la propagation des bactéries résistantes. En conséquence, leur usage a été interdit comme AGP et conservé au seul titre de la médecine humaine, notamment en Europe.
Après les restrictions sur l’usage des AGP, des alternatives ont été développées pour prévenir et/ou traiter l’entérite nécrotique comme l’utilisation de toxoïdes de NetB, ou la vaccination avecEimeria, un parasite unicellulaire, afin de réduire la prévalence de la coccidiose connue pour être un facteur de prédisposition important de l’entérite nécrotique.
Il subsiste toutefois un besoin évident de mettre au point des alternatives pour surmonter l’augmentation du taux de mortalité et de morbidité liée à l’interdiction des antibiotiques dans l’alimentation animale, présentant des performances similaires à celles obtenues avec les antibiotiques dans la prévention et/ou le traitement de l’entérite nécrotique.
En raison de leurs propriétés, les bactéries lactiques sont largement utilisées dans l’industrie agroalimentaire comme conservateur biologique des aliments ou dans les élevages industriels pour la prévention des maladies infectieuses et zoonotiques. Ces bactéries sont aussi utilisées pour améliorer la performance des élevages d’animaux grâce à la production d’enzymes digestives, d’acides gras volatiles et/ou de vitamines, qui participent à l’augmentation de la digestibilité des nutriments et à l’amélioration du taux de conversion des aliments. Ces bactéries lactiques sont notamment retrouvées sous la dénomination de probiotiques.
Ainsi, une alternative à l’utilisation des antibiotiques ou AGP consiste à donner aux animaux des additifs ou produits alimentaires, en particulier des probiotiques.
De manière générale, les probiotiques sont définis comme des microorganismes vivants qui confèrent un bénéfice pour la santé de l’hôte, lorsqu’ils sont consommés à des concentrations suffisantes. Ils peuvent interagir avec l’hôte pour améliorer l’immunité, l’homéostasie intestinale, stimuler le métabolisme ou encore réduire le risque d’infection par des agents pathogènes opportunistes.
Certaines bactéries probiotiques interfèrent avec, voire annihilent la pathogénicité des agents microbiens causant des pathologies, par exemple en éliminant ou en inhibant la croissance des bactéries pathogènes dans la lumière intestinale. Certaines produisent des substances antibactériennes capables d’entrer en compétition avec les pathogènes pour les nutriments, les facteurs de croissance et les sites de fixation à l’épithélium intestinal. Elles peuvent également exercer des fonctions immunologiques en modulant la réponse immunitaire de l’hôte lui permettant ainsi de mieux faire face aux infections.
La plupart des probiotiques bactériens appartiennent aux bactéries lactiques. Une des caractéristiques principales de ce groupe de bactéries est leur capacité à produire de l’acide lactique, d’une manière souche-dépendante, par fermentation homo ou hétéro-fermentaire du glucose.
Les bactéries lactiques font partie du phylum desFirmicutes, de la classe desBacilliet de l’ordre desLactobacillales. Le taxon appelé bactéries lactiques regroupe des coques, des bacilles ou coccobacilles à Gram-positif, non sporulées, anaérobies ou aérobies facultatifs ayant un pourcentage de G+C inférieur à 50%. Ces bactéries sont acidophiles avec un pH optimal de croissance compris entre 3,5 et 6,5. La plupart des souches présentent des exigences nutritionnelles et nécessitent des milieux riches pour se développer. Ce groupe inclut 10 genres dont les plus connus sontLactobacillus, Pediococcus, Lactococcus, Enterococcus, Streptococcus, LeuconostocetCarnobacterium.
Au sein des bactéries lactiques, le genre le plus représenté est celui deLactobacillus(Lb.) avec plus de 253 espèces décrites à ce jour (http://www.bacterio.net/lactobacillus.html).
Les lactobacilles sont largement utilisés dans l’élaboration des probiotiques, notamment en raison de leur capacité à survivre aux conditions extrêmes retrouvées dans le tractus gastro-intestinal, d’une bonne aptitude à adhérer aux cellules intestinales permettant d’accroitre la rétention des probiotiques dans l’intestin, de propriétés d’élimination ou d’inhibition de la croissance des bactéries pathogènes dans la lumière intestinale.
Le document EP 2 287 286 décrit notamment que des isolats deLactobacillus(Lb. sakeiouLb. reuteri) possèdent des propriétés anti-inflammatoires et probiotiques.
Le document CN 105861399 décrit également l’utilisation d’une souche spécifique deLb. plantarumpour prévenir l’entérite nécrotique chez le poulet d’élevage par inhibition de la croissance deC. perfringens.
Toutefois, il existe un besoin évident de développer de nouvelles solutions efficaces en vue de lutter contreC. perfringensresponsable de l’entérite nécrotique du poulet de chair, pour des raisons sanitaires et économiques.
Définitions
Les définitions ci-dessous correspondent au sens généralement utilisé dans le contexte de l’invention et sont à prendre en compte, à moins qu’une autre définition ne soit explicitement indiquée.
Les termes « environ » ou « approximativement », utilisés en référence à une valeur mesurable telle qu’une quantité, une durée, et autres valeurs analogues, doivent être compris comme englobant des incertitudes de mesure de ± 20% ou de ± 10%, préférentiellement de ± 5%, encore plus préférablement de ± 1%, et de manière particulièrement préférée de ± 0,1% de la valeur spécifiée.
Intervalles: tout au long de la présente description, les différentes caractéristiques de l’invention peuvent être présentées sous forme d’intervalle de valeurs. Il doit être compris que la description de valeurs sous forme d’intervalle a uniquement pour finalité de rendre la lecture plus simple et ne doit pas être interprétée comme une limitation rigide de la portée de l’invention. En conséquence, la description d’un intervalle de valeurs devrait être considérée comme divulguant spécifiquement tous les intervalles intermédiaires possibles ainsi que chacune des valeurs au sein de cet intervalle. Par exemple, la description d’un intervalle allant de 1 à 6 devrait être considérée comme décrivant spécifiquement chacun des intervalles qu’il comprend, tels que les intervalles allant de 1 à 3, de 1 à 4, de 1 à 5, de 2 à 4, de 2 à 6, de 3 à 6, etc., ainsi que chacune des valeurs dans cet intervalle, par exemple, 1 ; 2 ; 2,7 ; 3 ; 4 ; 5 ; 5,3 et 6. Cette définition vaut indépendamment de la portée de l’intervalle.
Le terme « isolé » doit être compris dans le contexte de l’invention comme synonyme de retiré ou extrait de son environnement ou état naturel. Par exemple, une souche de bactérie ou un peptide isolé est une souche de bactérie ou un peptide extrait de l’environnement naturel dans lequel on le trouve habituellement, qu’il s’agisse d’une plante ou d’un animal vivant par exemple. Ainsi, une souche de bactérie ou un peptide naturellement présent dans un animal vivant n’est pas une souche de bactérie ou un peptide isolé au sens de l’invention, tandis que la même souche de bactérie ou peptide, partiellement ou complètement séparé des autres éléments présents dans son contexte naturel, est quant à lui « isolé » au sens de l’invention. Une souche de bactérie ou un peptide isolé peut exister sous une forme substantiellement purifiée, ou peut exister dans un environnement non natif tel que, par exemple, une cellule hôte.
De façon surprenante, le Demandeur a identifié une nouvelle combinaison spécifique de bactéries lactiques, utile pour lutter contre l’entérite nécrotique, en particulier chez les animaux d’élevage tels que le poulet.
Ainsi et selon un premier aspect, la présente invention concerne un mélange de microorganismes comprenant une souche deLactobacillus reuteriet une souche deLactobacillus salivarius.
Au sens de l’invention, par « mélange », on désigne l’association d’au moins 2 espèces différentes de microorganismes, avantageusement d’au moins 2 souches de bactéries distinctes, encore plus avantageusement d’au moins 2 souches de bactéries lactiques (lactobacilles ouLactobacillus) distinctes.
Ainsi, un mélange de microorganismes selon l’invention peut comprendre une ou plusieurs souches deLb. reuteriet une ou plusieurs souches deLb. salivarius, et éventuellement d’autres microorganismes, notamment d’autres bactéries.
Selon un autre aspect, la présente invention concerne un mélange de bactéries lactiques constitué d’au moins une souche deLb. reuteriet d’au moins une souche deLb. salivarius. Selon un mode de réalisation particulier, le mélange de bactéries lactiques est constitué d’une souche deLb. reuteriet d’au moins une souche deLb. salivarius, possiblement de deux souches deLb. salivarius. Selon un autre mode de réalisation, le mélange de bactéries lactiques est constitué d’une souche deLb. reuteriet d’une souche deLb. salivarius.
Comme démontré dans la présente demande, le mélange spécifique selon l’invention est capable de réduire ou d’inhiber la croissance et/ou l’activité de la bactérieC. perfringens.
Au sens de l’invention, par « croissance de la bactérieC. perfringens», on désigne un ensemble de mécanismes conduisant à une augmentation de la biomasse sèche en bactéries. Il s’agit de la croissance de la cellule bactérienne en taille, masse et/ou volume mais également de la croissance d’une population par division cellulaire.
Au sens de l’invention, par « activité de la bactérieC. perfringens», on désigne l’activité pathogène ou encore toxinogène de cette bactérie. Il s’agit notamment de la production ou sécrétion de toxines, telles que NetB et α-toxine, ou d’enzymes. Il peut également s’agir de la capacité deC. perfringensà adhérer au tractus gastro-intestinal voire de le coloniser.
Avantageusement, le mélange selon l’invention permet une réduction voire une inhibition de la production et/ou de la sécrétion des toxines NetB et α-toxine.
Selon un mode de réalisation particulier, le mélange selon l’invention comprend la souche deLb. reuteridéposée à la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15) sous le numéro I-5500 en date du 04 mars 2020.
Selon un autre mode de réalisation particulier, le mélange selon l’invention comprend la souche deLb. salivariusdéposée à la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15) sous le numéro I-5501 en date du 04 mars 2020 et/ou la souche deLb. salivariusdéposée à la CNCM sous le numéro I-5502 en date du 04 mars 2020.
Ainsi et selon différents modes de réalisation, le mélange selon l’invention comprend ou est constitué de :
- la souche deLb. reuteridéposée à la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15) sous le numéro I-5500 en date du 04 mars 2020 et la souche deLb. salivariusdéposée à la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15) sous le numéro I-5501 en date du 04 mars 2020 ; ou

- la souche deLb. reuteridéposée à la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15) sous le numéro I-5500 en date du 04 mars 2020 et la souche deLb. salivariusdéposée à la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15) sous le numéro I-5502 en date du 04 mars 2020 ; ou

- la souche deLb. reuteridéposée à la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15) sous le numéro I-5500 en date du 04 mars 2020, la souche deLb. salivariusdéposée à la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15) sous le numéro I-5501 en date du 04 mars 2020 et la souche deLb. salivariusdéposée à la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15) sous le numéro I-5502 en date du 04 mars 2020.
Selon un mode de réalisation particulier, le mélange contient d’autres microorganismes, avantageusement d’autres probiotiques. De manière préférée, le mélange contient d’autres microorganismes choisis parmi : des bactéries du genreLactobacillus, des bactéries du genreBifidobacterium, des bactéries du genreStreptococcus, des bactéries du genreEnterococcus, des bactéries du genrePediococcus, des bactéries du genreBacillus, des levures, et leurs combinaisons.
De manière préférée, la bactérieLactobacillusest choisie dans le groupe constitué de:Lb acidophilus,Lb. lactis,Lb. helveticus,Lb. brevis,Lb. casei,Lb. plantarum,Lb. salivarius, avantageusement une autre souche deLb salivarius,Lb. reuteri, avantageusement une autre souche deLb reuteri,Lb. bifidus,Lb. bulgaricus,Lb. caucasicus,Lb. rhamnosus,Lb. gasseri,Lb. sakei, Lb. fermentum, et leurs combinaisons.
De manière préférée, la bactérieBifidobacteriumest choisie dans le groupe constitué de:B. bifidum,B. longum,B. infantis,B. breve,B. adolescentis,B. animalis,B. lactis, et leurs combinaisons.
De manière préférée, la bactérieStreptococcusest choisie dans le groupe constitué de:S. thermophilus,S. lactis,S. cremoris,S. diacetylcatis, et leurs combinaisons.
De manière préférée, la bactérieEnterococcusest choisie dans le groupe constitué de:E. faecium,E. faecalis, et leurs combinaisons
De manière préférée, la bactériePediococcusestP. acidilactici.
De manière préférée, la bactérieBacillusest choisie dans le groupe constitué de :B. subtilis, B. velezensis, B. licheniformis, B. coagulans, B. pumilus, et leurs combinaisons.
De manière préférée, la levure est choisie dans le groupe constitué de:Candida Kefyr,Saccharomyces florentinus,Saccharomyces cerevisiae,Saccharomyces cerevisiae var. boulardii, et leurs combinaisons.
Selon un autre aspect, la présente invention concerne une composition comprenant un mélange de microorganismes tel que défini ci-dessus.
En outre, la composition selon l’invention peut comprendre les adjuvants ou excipients habituels utilisés dans le domaine considéré, tels que des épaississants ou gélifiants hydrophiles ou lipophiles, des appétents, des additifs hydrophiles ou lipophiles, des conservateurs, des antioxydants, des diluants, des vitamines, des minéraux, des agents de suspension, des dérivés cellulosiques, des absorbants, des agents cryoprotecteurs ou encore des colorants.
Bien entendu, l'homme du métier veillera à choisir ce ou ces éventuels adjuvants ou excipients, et à ajuster leur quantité, de manière telle que les propriétés avantageuses de la composition selon l'invention ne soient pas, ou substantiellement pas, altérées par l'adjonction envisagée.
Selon un mode de réalisation, la composition selon l’invention comprend des substances nutritives utilisables comme support et/ou des substances prébiotiques avantageusement choisies parmi les fructo-oligosaccharides, les inulines, les isomalto-oligosaccharides, le lactitol, le lactosaccharose, la lactulose, les pyrodextrines, les oligosaccharides de soja, les transgalacto-oligosaccharides, les xylo-oligosaccharides, les vitamines, en particulier la vitamine E.
Selon un autre mode de réalisation, la composition selon l’invention comprend au moins un composé choisi dans le groupe suivant : les zéolithes, le carbonate de calcium, le sulfate de calcium, le carbonate de magnésium, le talc, le tréhalose, le chitosane, la gomme laque, l'albumine, l’amidon, la poudre de lait écrémé, le lactosérum, la poudre de petit lait, les maltodextrines, le lactose, l’inuline, les dextroses, les celluloses, les argiles dont le sépiolite, des dérives de levures et céréales, les huiles végétales ou un solvant choisi parmi l'eau ou une solution physiologique.
Selon un mode de réalisation particulier, la composition selon l’invention comprend un matériau de revêtement avantageusement choisi parmi les maltodextrines, la farine de graines de guar, la gomme arabique, les alginates, l'amidon modifié et les dérivés d'amidon, les dextrines, les dérivés de cellulose tels que l’ester de cellulose et l’éther de cellulose, les protéines telles que la gélatine, l’albumine, la caséine, le gluten, la gomme arabique, la gomme adragante, les lipides tels que les cires, la paraffine, l’acide stéarique, les mono- et diglycérides.
Le mélange ou la composition selon l’invention peut se présenter sous la forme d’une poudre, d’une capsule, d’un spray, d’une solution, d’une émulsion, d’une suspension ou d’une dispersion.
Avantageusement, le mélange ou la composition selon l’invention est sous forme sèche ou liquide, notamment sous forme lyophilisée, séchée, pressée, liquide ou surgelée, avantageusement sous forme lyophilisée.
Selon un mode de réalisation préféré, le mélange ou la composition selon l’invention est destiné à être administré par voie orale. Pour cela, le mélange ou la composition peut se présenter sous différentes formes galéniques adaptées, par exemple sous forme d’un lyophilisat à verser et solubiliser dans l’eau de boisson, d’un liquide à verser sur la nourriture ou dans l’eau de boisson, de comprimés, d’une poudre conditionnée en gélules ou toute autre forme appropriée. Avantageusement, il s’agit d’une poudre ou lyophilisat à verser et solubiliser dans l’eau de boisson des animaux.
Selon un mode de réalisation particulier, le mélange ou la composition selon l’invention contient les lactobacilles selon l’invention à une concentration finale comprise entre 105et 109CFU (Colony Forming Unitou unité formant une colonie)/mL du mélange ou de la composition selon l’invention, avantageusement comprise entre 106et 108CFU/mL, par exemple à une concentration finale de 107CFU/mL.
Cette concentration peut s’entendre comme la concentration de chaque microorganisme, avantageusement bactérie, encore plus avantageusement lactobacille, présent dans le mélange ou la composition, avantageusement dans l’eau de boisson des animaux. De manière privilégiée, il s’agit de la concentration de l’ensemble des microorganismes, avantageusement bactéries, encore plus avantageusement lactobacilles, présents dans le mélange ou la composition. Ainsi et à titre d’exemple, pour une concentration finale de lactobacilles de 107CFU/mL, un mélange selon l’invention pourra comprendre ou être constitué d’une souche deLb. reuteriet d’une souche deLb. salivariusà une concentration de 0,5x107CFU/mL chacune.
Selon un autre aspect, l’invention concerne l’utilisation d’un mélange ou d’une composition selon l’invention comme additif ou produit alimentaire à visée animale.
Au sens de l’invention, par « additif ou produit alimentaire », on désigne une composition dont le but est de compléter le régime alimentaire traditionnel et comprenant des nutriments ou d’autres substances ayant un effet nutritionnel ou physiologique. Comme déjà dit, il peut s’agir d’un additif à l’eau de boisson ou à des aliments tels que, par exemple, des céréales et/ou légumineuses comme le soja. De manière convenue, le terme « boisson » est utilisé pour les produits ingérés se présentant sous forme liquide et le terme « aliment » pour ceux se présentant sous forme solide.
Le mélange ou la composition selon l’invention peut être ajouté à la boisson ou aux aliments de manière extemporanée, ou peut être introduit notamment dans les aliments au moment de leur fabrication, par exemple par mixage ou enrobage.
Selon un mode de réalisation particulier, le mélange ou la composition selon l’invention est ajoutés à la boisson ou aux aliments de sorte que les lactobacilles représentent de 108à 1014CFU/kg de la boisson ou de l’aliment, avantageusement de 1010à 1012CFU/kg.
Selon un autre aspect, l’invention concerne l’utilisation d’un mélange ou d’une composition tels que décrits ci-dessus, ainsi que des boissons et aliments les contenant, pour lutter contre l’entérite nécrotique chez l’animal, à savoir pour prévenir et/ou traiter cette pathologie.
De manière connue et comme décrit dans les exemples, l’efficacité sur l’entérite nécrotique peut être évaluée par détermination d’un score de lésions au niveau des intestins des animaux :
- le score 0 correspond à un intestin sain ;
- le score 1 correspond à un intestin fin et friable ;
- le score 2 correspond à intestin mince et friable avec l’apparition de taches de nécrose de taille réduite ; et
- le score 3 correspond à un intestin montrant de grandes lésions visibles à travers la paroi extérieure du tractus intestinal.
La prévention et/ou le traitement de l’entérite nécrotique peut également s’évaluer par le suivi du poids des animaux. Comme mentionné précédemment, les lésions intestinales diminuent la conversion des aliments ce qui induit une perte de poids des animaux.
Selon un mode de réalisation préféré, l’animal visé par la présente invention est une volaille, avantageusement un poulet, de préférence un poulet à chair (ou poulet d’élevage).
Comme déjà dit et de manière préférée, le mélange ou la composition selon l’invention, éventuellement intégré à la boisson ou aux aliments, est administré ou ingéré par voie orale.
La prise peut être systématique pour tous les animaux dès la naissance ou peut être décidée à l’apparition de symptômes voire de morts dans l’élevage. De manière avantageuse, le traitement est réalisé à titre préventif, c’est-à-dire avant l’apparition de tout symptôme, dès la naissance des animaux ou après quelques jours. Encore plus avantageusement, le traitement se poursuit jusqu’à la mort des animaux, qui intervient généralement à 40 jours pour les volailles.
Par ailleurs, la prise peut avoir lieu une fois par jour, voire à toutes les prises de boisson ou d’aliments, ou peut-être espacée de plusieurs jours. Avantageusement, la prise est quotidienne.
Une posologie privilégiée correspond à une administration quotidienne, sous forme d’un complément alimentaire à une concentration de 107CFU/mL (équivalent 107CFU/g), tout au long de la vie de l’animal.
EXEMPLES DE REALISATION DE L’INVENTION
La manière dont l’invention peut être réalisée et les avantages qui en découlent ressortiront mieux des exemples de réalisation qui suivent, donnés à titre indicatif et non limitatif, à l’appui de la figure annexée.
La représente l’efficacité du mélange bactérien selon l’invention en termes de poids des poulets. Les lettres (a, b, c) indiquent des différences statistiques significatives.
La représente l’efficacité du mélange bactérien selon l’invention en termes de score de lésion des poulets. Les lettres (a, b, c) indiquent des différences statistiques significatives.
Mise en évidence de l’effet du mélange bactérien selon l’invention sur l’entérite nécrotique
Les expériences ont été réalisées à l’aide de la souche deLb. reuteridéposée auprès de la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15) sous le numéro I-5500 en date du 04 mars 2020 et de la souche deLb. salivariusdéposée à la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15) sous le numéro I-5501 en date du 04 mars 2020.
La souche deC. perfringensmise en œuvre dans l’exemple est une souche deC. perfringensisolée de poulet atteint d’entérite nécrotique.
1/ Matériel et méthodes :
La capacité de la combinaison deLb. reuterietLb. salivariusselon l’invention à prévenir l’entérite nécrotique a été évaluéein vivosur du poulet de chair provenant d’un croisement des lignées Cobb 500 (femelle) et Hubbard M99 (mâle).
Les expériencesin vivose sont déroulées pendant 17 jours sur 150 poulets (30 par condition expérimentale). L’essai a débuté le jour de l'éclosion. Durant les essais, les lactobacilles ont été administrés seuls (Lb. reuteri,Lb. salivarius) ou en combinaison (Lb. reuteri + Lb. salivarius), par gavage une fois par jour, aux jours 1 et 2, puis du jour 10 au jour 13.
1-1/ Environnement des poulets et régime alimentaire
Les poulets ont été élevés dans des cages donnant une surface moyenne de 432 cm2par poulet. Les cages ont été placées à plusieurs niveaux dans une salle climatisée maintenue à une température ambiante tout au long de l'étude, et habilitée pour des essais avec un risque biologique de niveau 2. L'éclairage a été fourni 24/24 heures pendant toute la durée de l'étude. Les oiseaux ont reçu de l’eau et de la nourrituread-libitum, c’est-à-dire qu’ils ont été nourris à satiété.
L’alimentation des 9 premiers jours est à base de maïs et de soja. Après le jour 10, le régime de croissance inclut du blé (Tableaux 1 et 2). Les deux régimes sont administrés sous forme de purée.
Le tableau 1 représente la composition des régimes par ingrédients (g/100g)
Régime de démarrage
(0-9 jours)		 Régime de croissance
(10-17 jours)
Maïs 60,83 34,87
Farine de soja (48%) 33,91 28,14
Blé - 20,00
Grains séchés de distillation - 10,00
Mélange de graisses végétales 1,17 3,06
Pierre calcaire 1,47 1,45
Phosphate monocalcique 1,54 1,44
NaCl 0,44 0,28
L-Lysine HCl 0,15 0,26
DL-Metionine 0,21 0,21
L-Thréonine 0,06 0,08
Vitamine premix 0,18 0,18
Minéral premix 0,05 0,05
Le tableau 2 représente la composition approximative des régimes (g/100g)
Régime de démarrage
(0-9 jours)		 Régime de croissance
(10-17 jours)
Matière sèche 87,98 88,93
Protéines 22,00 22,00
Matière grasse 3,63 5,87
Fibre 2,17 2,89
Cendre 5,45 5,54
Lysine 1,3 1,3
Calcium 0,88 0,88
Phosphore 0,70 0,71
Valeur énergétique métabolisable apparente (Kcal/kg) 3 000,00 3 000,00
1-2/ Vaccination
A l’exception du groupe non-challengé (n’ayant pas reçu d’administration deC. perfringens), les poulets ont été vaccinés au jour 1 avec « Advent@9X ». Ce vaccin contient des oocystes vivants d’Eimeria acervulina,E. maximaetE. tenell, la gentamicine et l’amphotéricine B comme conservateurs. L’objectif est d’aider à prévenir la coccidiose aviaire générée par ces pathogènes. Au 9emejour, les poulets ont été vaccinés d’une manière intraoculaire contre la bursite infectieuse aviaire par l’Intervet, Bursal Vac-G603 qui est un vaccin contenant des virus vivants atténués.
1-3/ Traitement des différents lots
Cinq traitements différents ont été testés. Chaque traitement a été répété six fois et chaque réplica contient 5 poulets.
Ces traitements sont récapitulés ci-dessous :
- T- : Groupe témoin non supplémenté en lactobacilles et non challengé avecC. perfringens;
- T+ : Groupe témoin positif, non supplémenté en lactobacilles et challengé avecC. perfringens;
-Lb. reuteri: supplémenté enLb. reuteriet challengé avecC. perfringens;
-Lb. salivarius: supplémenté enLb. salivariuset challengé avecC. perfringens;
-Lb. reuteri+Lb. salivarius: supplémenté par un mélange deLb. reuterietLb. salivariuset challengé avecC. perfringens.
1-4/ Administration de C. perfringens
La souche deC. perfringenssauvage a été cultivée dans du bouillon thioglycollate pendant une nuit à 37ºC.C. perfringensa ensuite été administré à une concentration de 107CFU/mL en dose de gavage oral de 3 mL administrée dans du thioglycollate stérile, à l’aide d’une seringue de 20 mL et d’une aiguille de dosage 20 jauge, du 14emeau 16emejours d’âge. Après l’administration, les oiseaux ont été immobilisés à la main pendant 5 à 10s pour confirmer la délivrance de la dose appropriée et l'absence de stress.
1-5/ Administration des bactéries lactiques
Les souches de bactéries lactiques ont été cultivées dans bouillon MRS (de Man-Rogosa-Sharpe) à 37°C pendant une nuit. Aux 1eret 2emejours d’âge, 250 à 500 µL de suspension deLactobacillusà 107CFU/mL (seules ou concentration finale du mélange des 2 souchesLb reuterietLb salivarius, c’est-à-dire à 0,5x107CFU/mL chacune concernant le mélange) ont été administrés par voie orale aux oiseaux. Pour les 10emeà 13emejours d’âge, la posologie est augmentée à 1 mL, tout en maintenant la concentration à 107CFU/mL. Les groupes témoins (T- et T+) ont reçu le même volume de solution de PBS stérile. Les oiseaux témoins négatifs ont été traités en premier afin de réduire le risque de contamination croisée.
1-6/ Mesures effectuées sur les oiseaux
L'étude s’est terminée le 17eme jour. Les performances des oiseaux ont été mesurées aux 0, 10eme, 14eme et 17eme jours de la période expérimentale en enregistrant le poids des oiseaux (en g) ( ) et la consommation d'aliments pour chaque cage. À la fin de l'essai, tous les oiseaux ont été euthanasiés par asphyxie au CO2. Les lésions d'entérite nécrotique ont été recherchées dans les intestins et analysées comme décrit par Prescott et al. (1978, Can. Vet. J. 19, 181-183) ( ).
Le protocole expérimental est récapitulé dans le tableau 3 ci-dessous. X correspond au jour d’administration d’un produit.
Jour d’essai 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
Lactobacillus X X X X X X
C. perfringens X X X
Mesures X X X
1-7/ Analyse statistique
Les comparaisons statistiques entre les différents résultats obtenus ont été effectuées par analyse de la variance ANOVA à l’aide du logiciel Statgraphics® Centurion XVI.
2/ Résultats :
Les résultats sont présentés dans le tableau 4 ci-dessous.
Score de lésion à 17 jours Poids à 17 jours
Contrôle négatif (T-) 0,88c 765,00a
Contrôle positif (T+) 1,67ab 699,58c
Lb. reuteri 1,29bc 709,79bc
Lb. salivarius 1,50ab 707,50bc
Lb. reuteri+Lb. salivarius 1,00c 753,13ab
Les lettres en index (a, b, c) indiquent des différences statistiques significatives. Les groupes qui possèdent la même lettre ne diffèrent pas significativement.
Les résultats de la montrent que les poulets du groupe traité avec Lb. reuteri ou Lb. salivarius présentent une augmentation non significative de leur poids (709,79g et 707,50g, respectivement) par rapport au groupe contrôle positif (T+). Cette augmentation ne permet pas de retrouver un poids des poulets semblable à celui du groupe contrôle négatif (T-).
Au contraire, les poulets du groupe traité avec le mélange deLb. reuterietLb. salivariusprésentent des poids similaires (753,13g) à ceux du groupe de poulets non challengés (765g), qui sont significativement différents du groupe infecté (699,58g).
Concernant les lésions intestinales causées par l’administration de C. perfringens ( ), il ressort des données que l’administration de Lb. reuteri ou de Lb. salivarius seule aux groupes de poulets challengés ne diminue pas significativement le score de lésions par rapport au groupe T+.
Une diminution significative des lésions intestinales est obtenue sur les poulets du groupe traité avec le mélange deLb. reuterietLb. salivariusqui présentent un score de lésions (1,00) similaire à celui du groupe de poulets T- non challengés (0,88) et significativement différent de celui du groupe infecté T+ (1,67).
En conclusion, ces donnéesin vivomontrent que la supplémentation enLb. reuterietLb. salivariuscombinées produit un effet de protection contre l’entérite nécrotique chez le poulet.

Claims (11)

  1. Mélange de microorganismes comprenant une souche deLactobacillus reuteriet une souche deLactobacillus salivarius.
  2. Mélange selon la revendication 1 caractérisé en ce qu’il est constitué d’une souche deLb . reuteriet d’au moins une souche deLb . salivarius, avantageusement d’une souche deLb . reuteriet d’une souche deLb . salivarius.
  3. Mélange selon l’une des revendications 1 à 2, caractérisé en ce que les souches présentent une activité inhibitrice sur la croissance et/ou l’activité deClostridium perfringens.
  4. Mélange selon l’une des revendication 1 à 3, caractérisé en ce que la souche deLb . reuteriest la souche déposée à la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15) sous le numéro I-5500 en date du 04 mars 2020.
  5. Mélange selon l’une des revendication 1 à 4, caractérisé en ce que la souche deLb . salivariusest la souche déposée à la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15) sous le numéro I-5501 en date du 04 mars 2020 ou la souche déposée à la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15) sous le numéro I-5502 en date du 04 mars 2020.
  6. Composition comprenant un mélange selon l’une des revendications 1 à 5.
  7. Mélange selon l’une des revendications 1 à 5 ou composition selon la revendication 6 se présentant sous forme lyophilisée.
  8. Produit alimentaire comprenant le mélange selon l’une des revendications 1 à 5 ou 7, ou la composition selon l’une des revendications 6 à 7.
  9. Mélange selon l’une des revendications 1 à 5 ou 7, ou composition selon l’une des revendications 6 à 7, pour utilisation dans la prévention et/ou le traitement de l’entérite nécrotique chez l’animal.
  10. Mélange ou composition pour son utilisation selon la revendication 9, caractérisée en ce que le mélange ou la composition est sous une forme adaptée à l’administration par voie orale.
  11. Mélange ou composition pour son utilisation selon la revendication 9 ou 10, caractérisée en ce que l’animal est une volaille, avantageusement un poulet, encore plus avantageusement un poulet à chair.
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