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<smallcaps/>? ? ?christensenellacées? ? ? ? ?bacterie de la famille desdans la prevention et/ou le traitement de maladies inflammatoires chroniques et/ou de maladies gastro-intestinales inflammatoires et/ou de cancers

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EP3937958A1
EP3937958A1 EP20716170.4A EP20716170A EP3937958A1 EP 3937958 A1 EP3937958 A1 EP 3937958A1 EP 20716170 A EP20716170 A EP 20716170A EP 3937958 A1 EP3937958 A1 EP 3937958A1
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EP
European Patent Office
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christensenella
bacterium
composition
bacteria
use according
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Application number
EP20716170.4A
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German (de)
English (en)
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Georges Rawadi
Sandrine Paule CLAUS
Laure RINALDI
Frédéric Elustondo
Marion Sophie Madeleine SOTO
Katy Nicole LECORF
Camille Muriel Dominique Mathilde KROPP
Philippe Langella
Rebeca MARTIN ROSIQUE
Patrizia Brigidi
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Institut National de Recherche pour lAgriculture lAlimentation et lEnvironnement
Ysopia Biosciences SA
Universita di Bologna
Original Assignee
Institut National de Recherche pour lAgriculture lAlimentation et lEnvironnement
Ysopia Biosciences SA
Universita di Bologna
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Publication date
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Priority claimed from FR1908384A external-priority patent/FR3099054A1/fr
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Definitions

  • the invention relates to the prevention and treatment of chronic inflammatory diseases, inflammatory gastrointestinal diseases and / or cancers with specific bacteria of the intestinal microbiota and compositions containing them.
  • Inflammation is the body's normal defense process in the face of attack. It makes it possible to fight and eliminate the foreign agent (s) at the origin of the said aggression.
  • This inflammation known as acute, is reversible and has only a limited duration ranging from a few minutes to a few days. However, in some cases, the inflammatory process goes wrong and the inflammation becomes chronic. Instead of contributing to the body's defense, the actors involved in the inflammatory process become dangerous and lead to an often serious and disabling pathological condition.
  • Chronic inflammatory diseases are therefore diseases whose physiopathology is directly linked to inflammation, said inflammation being of autoimmune and / or auto-inflammatory origin.
  • All organs can be affected by chronic inflammation, such as for example the digestive system (Crohn's disease, ulcerative colitis, autoimmune gastritis, etc.), the liver (hepatitis, NAFLD, non-alcoholic steatohepatitis, etc.). ), pancreas (pancreatitis), lungs (asthma), skin (atopic dermatitis such as psoriasis), nervous system (multiple sclerosis), joints (polyarthritis).
  • chronic inflammation is also present in other situations where other mechanisms are involved, such as cancer in particular.
  • Chronic inflammation and in particular chronic inflammatory diseases, affect a large portion of the population, in varying proportions depending on the pathology concerned.
  • the consequences for health are major, because these diseases, although they develop slowly, are disabling, painful and associated with a high risk of early mortality.
  • - purine metabolism modulators which are immunomodulators, such as methotrexate and azathioprine,
  • - biological drugs such as anti-TNF- ⁇ , antagonists of IL1 and IL6 receptors, or even
  • applications WO2018 / 162738 and WO2018 / 162726 teach that the use of particular bacteria of the Christensenellaceae family, belonging to species defined as being specifically distant from those of the Christensenella genus and in particular of the Christensenella minuta and Christensenella species timonensis, make it possible to fight in particular against overweight and obesity, by intervening for example on the presence of visceral fat and on intestinal permeability.
  • Akkermansia muciniphila belonging to the Verrucomicrobiaceae family and to the Akkermansia genus, is a bacterium identified for the first time in 2004 and which represents approximately 1 to 3% by number of the total of the bacterial genera of the intestinal microbiota of healthy adults. health (Derrien et al., 2004, 54: 1469-1476; Derrien et al. Applied Environmental Microbiology 2008, 74, 1646-1648).
  • Akkermansia muciniphila The population in number of Akkermansia muciniphila has already been reported to be reduced in stool samples from obese individuals and patients with inflammatory gastrointestinal disease (Png, et al. Gastroenterol. 2010; 105 : 2420-2428). Akkermansia muciniphila is associated with a healthier metabolic state and better clinical outcomes after calorie restriction intervention in overweight or even obese adults.
  • bacteria of the genus Christensenella and in particular the species Christensenella minuta, Christensenella massiliensis and Christensenella timonensis, when they are administered to humans or animals, are capable of 'act on the markers of inflammation at the origin of inflammatory diseases, in particular inflammatory gastrointestinal diseases and chronic inflammatory diseases; and cancers.
  • the inventors unexpectedly determined synergistic anti-inflammatory properties resulting from the use of a bacterium of the genus Christensenella in association with a bacterium of the genus Akkermansia, in particular Akkermansia muciniphila, a well-known new generation probiotic (NGP) from the Verrucomicrobiaceae family.
  • NTP new generation probiotic
  • the invention relates to a bacterium of the genus Christensenella, for its use in the prevention and / or treatment of chronic inflammatory diseases and / or inflammatory gastrointestinal diseases and / or cancers in human or animal.
  • such a bacterium when it is administered to a human being or an animal exhibiting chronic inflammation, is capable of acting on molecules produced in excess during chronic inflammation such as kynurenine, interleukin 6, interleukin 8, TNFalpha, interleukin lb, lipocalins or fecal calprotectin, and / or by stimulating the production of the anti-inflammatory cytokine interleukin 10.
  • a subject of the invention is also compositions comprising at least one bacterium of the genus Christensenella, alone or in combination with at least one additional bacterium, preferably at least one additional bacterium of the genus Akkermansia, for its use in prevention and / or the treatment of chronic inflammatory diseases and / or inflammatory gastrointestinal diseases and / or cancers in humans or animals.
  • composition comprising, in a physiologically acceptable medium, at least one of these bacteria (at least one bacterium of the genus Christensenella alone or in combination with at least one additional bacterium of the genus Akkermansia) and / or their supernatant, is also referred to per se.
  • Figure 1 shows the production of interleukin-8 (IL-8) (in pg / mL) (ordinate) in HT-29 cells stimulated by TNF-a in the presence of strains of Christensenella minuta, Christensenella timonensis , Akkermansia municiphila, Christensenella minuta + Akkermansia municiphila and Christensenella timonensis + Akkermansia municiphila (abscissa).
  • IL-8 interleukin-8
  • FIG. 2 represents the secretion of IL-8 by the intestinal cells of the HT29 line after co-incubation in the presence of supernatants of strains of Christensenella minuta ('DSMZ: DSM22607) and stimulation by TNF-a.
  • Dunn's nonparametric statistical test * p ⁇ 0.05; ** p ⁇ 0.01; *** p ⁇ 0.001.
  • FIG. 3 represents the measurement of the transepithelial resistance on intestinal cells of the Caco-2 line after co-incubation in the presence of Christensenella minuta bacteria (DSMZ: DSM22607) and after stimulation with TNF- a.
  • DSMZ Christensenella minuta bacteria
  • TNF- a Tumor Necrosis Factor alpha. Means of 3 experiments repeated in triplicate.
  • Figure 4 shows the effects of Christensenella minuta (DSM 22607) on an inflammation model induced by DNBS.
  • DSM 22607 Monitoring of the weight loss of the treated groups from the day of the injection (D0).
  • B Significant decrease in macroscopic scores indicating a reduction in the severity of inflammation following DSM 22607 and 5ASA treatments.
  • C myeloperoxidase activity
  • IL-10 interleukin-10
  • D Nonparametric ANOVA followed by Dunn's statistical test: * p ⁇ 0.05; ** p ⁇ 0.01; *** p ⁇ 0.001.
  • DNBS Dinitrobenzene sulfonic acid.
  • Figure 5 demonstrates the generalization of the anti-inflammatory effects of the species of Christensenella minuta on a model of inflammation induced by DNBS.
  • A Reduction in macroscopic scores indicating a reduction in the severity of inflammation following treatments with different species of Christensenella minuta.
  • B Immunomodulatory effects of different species of Christensenella minuta through the decrease in myeloperoxidase activity (C). Nonparametric ANOVA followed by Dunn's statistical test: * p ⁇ 0.05; ** p ⁇ 0.01; *** p ⁇ 0.001.
  • DNBS Dinitrobenzene sulfonic acid.
  • FIG. 6 represents the effect of the supernatants of the strains of Christensenella minuta (DSMZ: DSM22607, C. minuta 1 and C. minuta 2) on the proliferation of HT-29 cells (adenocarcinoma of the colon).
  • RLU Relative Luminescence Unit.
  • bacteria also means the term “bacterial strains”.
  • a bacterial strain being to be understood as being a bacterium of a given strain belonging to a particular species, for example the species Christensenella minuta. Mention may be made, for example, of the bacterial strain or bacterium Christensenella minuta DSM22607.
  • the two terms can be used interchangeably to designate a bacterium (s) in the context of the invention.
  • hypoproduction of interleukin 6 within the meaning of the invention, is meant an excessive production of interleukin 6 relative to the production in a healthy person or animal without inflammation.
  • hypoproduction of interleukin 8 within the meaning of the invention, is meant an excessive production of interleukin 8 relative to the production in a healthy person or animal without inflammation.
  • under-production of interleukin 10 within the meaning of the invention, is meant an insufficient production of interleukin 10 relative to the production in a healthy person or animal without inflammation.
  • chronic inflammatory disease within the meaning of the invention, is meant in particular any chronic disease whose pathophysiology, slow and progressive, is directly related to inflammation of autoimmune and / or auto. inflammatory.
  • inflammatory gastrointestinal disease within the meaning of the invention is understood to mean in particular an inflammatory bowel disease, more particularly an inflammatory bowel disease of the colon.
  • Said colonic inflammatory bowel disease can, in particular, be selected from the group consisting of Crohn's disease (CD), ulcerative colitis (UC) and pouchitis, in particular CD and UC.
  • CD and UC are two diseases characterized by inflammation of the lining of part of the digestive tract, linked to an overactive digestive immune system.
  • prevent or “prevention” within the meaning of the invention, is meant the reduction to a lesser degree of the risk or the probability of occurrence of a given phenomenon, that is to say, in in the context of the present invention, chronic inflammation, gastrointestinal inflammation and pathologies arising therefrom such as cancer, in particular intestinal inflammation.
  • treating or “treatment” within the meaning of the invention, is meant a decrease in the progression of the disease, a stabilization, a reversal or regression, or even an interruption or inhibition of the progression of an inflammatory disease. chronic, inflammatory gastrointestinal disease, cancer. In the context of the invention, these The terms also apply to one or more symptoms of said diseases of the present invention.
  • non-deficient in Christensenella in the intestinal microbiota, within the meaning of the present invention, is meant a human being or an animal whose bacteria of the genus Christensenella in his intestinal microbiota represents at least 0.01% by number. of the total of the bacterial genera detected in its intestinal microbiota, in particular at least 0.1%, and preferably at least 0.5%. Collected in the stool, the abundance of Christensenella can for example be measured by a quantitative sequencing assay, fluorescent in situ hybridization (FISH), qPCR (quantitative PCR) or by metagenome analyzes (relative quantification) , well known to those skilled in the art.
  • FISH fluorescent in situ hybridization
  • qPCR quantitative PCR
  • metagenome analyzes quantitative quantification
  • physiologically acceptable medium within the meaning of the invention is meant a medium which is compatible with the organism of the individual to which said composition is to be administered. It can be, for example, a non-toxic solvent such as water. In particular, said medium is compatible with oral administration.
  • microbiota is meant all the microorganisms that have colonized an individual and with which he cohabits: bacteria for the most part, but also viruses, fungi, yeasts and protozoa.
  • the composition of the microbiota differs according to the colonized surfaces: we thus distinguish the cutaneous microbiota, the vaginal microbiota, the urinary microbiota, the respiratory microbiota, the ENT microbiota (otorhinolaryngology) and the intestinal microbiota, formerly called the intestinal flora, by far the most important with its 100,000 billion germs.
  • intestinal microbiota is meant all the microorganisms, in particular bacteria, which inhabit the intestine of a given individual.
  • body mass index is meant, according to an official definition of the World Health Organization (WHO), the indicator of the health risks associated with excessive weight and weight. insufficient. BMI is calculated by dividing an individual's weight (in kilograms) by their height (in meters) squared. A BMI value is associated with a specific body size according to the classification given by the WHO (https://www.who.int/features/factfiles/obesitv/facts/en/).
  • an effective amount refers to an amount of an active ingredient which is effective to relieve or to some extent reduce one or more of the symptoms of the disease in the need for treatment, or to delay the onset of clinical markers or symptoms of a disease which need prevention, when the compound is administered.
  • the amount refers to an amount of the active ingredient which exhibits effects such as (i) reversing the rate of progression of a disease, (ii) inhibiting the progression of the disease to some extent, and / or, (iii) relieve to some extent (or, preferably, by eliminating) one or more symptoms associated with the disease.
  • the effectiveness of the amount can be determined empirically by testing the relevant compounds in known in vivo and in vitro model systems for a disease requiring treatment.
  • the subject of the invention is therefore the use in the prevention and / or treatment of chronic inflammatory diseases and / or inflammatory gastrointestinal diseases and / or cancers, in particular cancers of an inflammatory nature, in 'human being or animal, of at least one bacterium of the Christensenellaceae family, preferably of the genus Christensenella or of a composition comprising at least one such bacterium and / or a culture supernatant of at least said bacterium of the genus Christensenella.
  • the bacteria can be any bacterial strain of one of the species of the genus Christensenella.
  • said composition further comprising an additional bacterium of the Verrucomicrobiaceae family and / or a culture supernatant of said additional bacterium, in particular said bacterium is of the Akkermansia genus, more particularly of the Akkermansia muciniphila species.
  • the invention therefore relates to a bacterium of the Christensenellaceae family, in particular of the genus Christensenella for its use in the prevention and / or treatment of inflammatory diseases, preferably of chronic inflammatory diseases and / or of inflammatory gastrointestinal diseases. and / or cancer in humans or animals, in particular in people or animals with an inflammatory disease or cancer with a hyperproduction of interleukin 6 and / or a hyperproduction of interleukin 8 and / or a underproduction of interleukin 10.
  • bacteria of the genus Christensenella when administered to a human being or an animal exhibiting chronic inflammation, gastrointestinal inflammation or cancer, are capable of acting on the molecules produced in excess in chronic inflammation, gastrointestinal inflammation or cancer, in particular on interleukin 6, interleukin 8 and kynurenine, but also on the TNFalpha, interleukin lb, lipocalins or fecal calprotectin.
  • the inventors have discovered that bacteria of the genus Christensenella have the unexpected ability to reduce in vitro and in vivo inflammation and cell proliferation, in particular gastrointestinal inflammation and more particularly chronic inflammation of the intestine.
  • the bacteria according to the present invention are capable of significantly reducing the production of pro-inflammatory molecules, such as interleukin 6 (IL-6) and interleukin 8 (IL-8).
  • the bacteria or bacteria useful according to the invention are administered to humans or animals in an amount effective for an action on at least one of these markers of inflammation, that is that is to say to decrease the production of at least one of these molecules in the body.
  • the bacteria or bacteria can be administered at a rate of 10 7 to 10 11 colony forming units (CFU) per day, regardless of the weight of the person or the animal, preferably a dose of 10 9 to 10 12 CFU per day is administered, more preferably a dose equal to 10 9 CFU.
  • the dose comprises at least one bacterium chosen from Christensenella timonensis, Christensenella minuta, Christensenella massiliensis and / or their mixtures.
  • it is a single dose, that is to say administered all at once or a dose before each meal, ie three times a day.
  • the bacterium of the Christensenellaceae family in particular of the genus Christensenella is useful in the treatment of at least one chronic inflammatory disease chosen from chronic inflammatory diseases of the intestine, chronic inflammatory diseases of the liver, chronic inflammatory diseases of the pancreas, polyarthritis, atopic dermatitis, neuro-inflammatory diseases, chronic obstructive pulmonary disease.
  • it has an effect in the prevention and / or treatment of at least one disease selected from Crohn's disease, ulcerative colitis, pouchitis, ulcerative colitis, celiac disease, autoimmune gastritis, hepatitis, nonalcoholic steatohepatitis, primary sclerosing cholangitis, pancreatitis, rheumatoid arthritis, psoriatic arthritis, psoriasis, l 'eczema.
  • at least one disease selected from Crohn's disease, ulcerative colitis, pouchitis, ulcerative colitis, celiac disease, autoimmune gastritis, hepatitis, nonalcoholic steatohepatitis, primary sclerosing cholangitis, pancreatitis, rheumatoid arthritis, psoriatic arthritis, psoriasis, l 'eczema.
  • the bacterium of the Christensenellaceae family in particular of the genus Christensenella, is useful in the treatment of at least one inflammatory gastrointestinal disease such as an inflammatory bowel disease, more particularly an inflammatory bowel disease of the colon.
  • inflammatory bowel disease such as an inflammatory bowel disease, more particularly an inflammatory bowel disease of the colon.
  • the term “disease” is understood to mean a disease or a pathology.
  • Said colonic inflammatory bowel disease can in particular be selected from the group consisting of Crohn's disease, ulcerative colitis and pouchitis, in particular from the group consisting of Crohn's disease and ulcerative colitis. hemorrhagic.
  • the bacterium of the Christensenellaceae family in particular of the Christensenella genus is useful in the treatment of a proliferative disease chosen from lymphomas, glioblastomas, myelomas, leukemias, colorectal cancers, cancers of the breast, prostate, ovary, uterus, pancreas, lungs, liver, gallbladder, and kidneys.
  • a proliferative disease chosen from lymphomas, glioblastomas, myelomas, leukemias, colorectal cancers, cancers of the breast, prostate, ovary, uterus, pancreas, lungs, liver, gallbladder, and kidneys.
  • the bacteria or bacteria useful according to the invention are bacteria of the genus Christensenella. It may in particular be Christensenella massiliensis, Christensenella timonensis, Christensenella intestinihominis, and / or Christensenella minuta. According to a particularly suitable variant, it is Christensenella minuta.
  • the bacteria or bacteria useful according to the invention are preferably administered in a composition.
  • Said composition comprising, in a physiologically acceptable medium, at least the useful bacterium (s) and / or their supernatant.
  • the invention also relates to a composition
  • a composition comprising at least one bacterium of the genus Christensenella in the prevention and / or treatment of chronic inflammatory diseases and / or inflammatory gastrointestinal diseases and / or cancers, in humans or animals, preferably in people or animals with hyperproduction of interleukin 6.
  • the invention makes it possible to provide an effective amount of bacteria of the Christensenellaceae family, such as Christensenella massiliensis, Christensenella timonensis, Christensenella intestinihominis and / or Christensenella minuta, for use in the treatment:
  • - diseases associated with increased interleukin 6 such as inflammatory disorder, allergic disorder, autoimmune disorder, transplant rejection disorder, atherosclerosis, osteoporosis, neuropathic pain, sepsis , Castleman's disease, a fibrotic condition, rheumatoid arthritis, juvenile rheumatoid arthritis, psoriatic arthritis, osteoarthritis, refractory rheumatoid arthritis, chronic non-rheumatoid arthritis or ankylosing spondylitis,
  • interleukin 8 diseases associated with an increase in interleukin 8 such as atopic dermatitis, osteoarthritis, rheumatoid arthritis, inflammatory bowel disease, Crohn's disease, ulcerative colitis, stroke, septic shock, endotoxic shock, psoriasis, Gram-negative sepsis, toxic shock syndrome, renal reperfusion injury, glomerulonephritis, thrombosis, graft versus host reaction, allograft rejection, malaria, restenosis, angiogenesis, atherosclerosis, osteoporosis, gingivitis and unwanted release of hematopoietic stem cells, diseases caused by respiratory viruses, herpes virus and hepatitis viruses, meningitis, herpetic encephalitis, CNS vasculitis, traumatic brain injury, CNS tumors, subarachnoid hemorrhage, post-surgical trauma, cystic fibrosis, pruritus, interstitial pneumonia, hypersensitivity, crystalline arthritis, Lyme
  • interleukin 10 diseases associated with a decrease in interleukin 10 or which can be treated by increasing interleukin 10 such as autoimmune diseases, rejection of organ and bone marrow transplants, graft versus host disease , parasitic infections, granulomas, Crohn's disease, colitis, pancreatitis, inflammatory lung disease, inflammatory eye disease, atopic dermatitis and rhinitis.
  • the invention relates to a composition for its use in the treatment and / or prevention of chronic inflammatory diseases and / or inflammatory gastrointestinal diseases and / or cancers in a human being or a patient. animal, said composition comprising, in a physiologically acceptable medium (i) at least bacteria of the genus Christensenella, and / or (ii) a culture supernatant of at least one bacterium of the genus Christensenella.
  • the present invention also relates to a composition for its use in the treatment and / or prevention of an inflammatory gastrointestinal disease in an individual, said composition comprising, in a physiologically acceptable medium
  • At least one bacterial strain chosen from the group consisting of Christensenella timonensis, Christensenella minuta and / or mixtures thereof,
  • the present composition can be administered to a human being suffering from chronic inflammatory diseases and / or inflammatory gastrointestinal diseases and / or cancers, said human being having an index of body mass (BMI) less than 25, in particular said composition is administered to a human being suffering from inflammatory gastrointestinal diseases.
  • BMI less than 25 denotes a BMI strictly less than 25, more particularly a BMI less than or equal to 24.9.
  • said human being may in particular have a BMI of less than 25 and greater than or equal to 18.5.
  • said composition according to the invention is characterized in that the bacterium of the genus Christensenella is chosen from Christensenella massiliensis, Christensenella timonensis and / or Christensenella minuta and / or Christensenella intestinihominis and / or their mixtures.
  • the composition can be used in an individual who is not deficient in Christensenella in the intestinal microbiota, in particular in a human being or an animal whose genus Christensenella represents at least 0.01. % in number of the total of the bacterial genera of its intestinal microbiota.
  • the bacteria or bacteria are present in an effective amount in the composition allowing an effect on chronic inflammatory diseases and / or inflammatory gastrointestinal diseases and / or cancers from which the persons or animals treated are affected.
  • person is meant an individual, in particular a human being or an animal.
  • the composition useful according to any one of the preceding embodiments comprises 10 6 to 10 12 colony-forming units (CFU) of bacteria of the genus Christensenella per daily dose to be administered of said composition.
  • CFU colony-forming units
  • this corresponds to a daily dose of bacteria to be administered, whatever the weight of the person or the animal.
  • this dose is administered all at once.
  • the useful composition comprises 10 7 to 10 11 CFU of bacteria from genus Christensenella per daily dose to be administered, preferably 10 9 CFU.
  • said bacteria present in the composition may be of the same species, of a mixture of species or of a mixture of bacterial strains.
  • the composition useful according to the invention can be in liquid form.
  • bacteria of the Christensenellaceae family in particular of the Christensenella genus and / or a culture medium for said bacteria which makes it possible to preserve them, such as, for example, preferably the anaerobic Columbia agar medium enriched with sheep blood, or a medium equivalent that does not contain any derivative of animal origin.
  • culture medium means the culture supernatant in which the bacteria or the bacterial strains have resided during their culture, or extracellular medium.
  • the composition useful according to the invention may be in solid form.
  • the bacteria can be present in lyophilized form, and can also include excipients such as, for example, microcrystalline cellulose, lactose, sucrose, fructose, levulose, starches, stachyose, raffinose, amylum , calcium lactate, magnesium sulfate, sodium citrate, calcium stearate, polyvinylpyrrolidone, maltodextrin, galactooligosaccharides, fructooligosaccharides, pectins, beta-glucans, lactoglobulins, isomaltooligosaccharides, polydextroses, sorbitol and / or glycerol.
  • excipients such as, for example, microcrystalline cellulose, lactose, sucrose, fructose, levulose, starches, stachyose, raffinose, amylum , calcium lactate, magnesium
  • compositions useful according to the invention may be in the form of powder, microencapsulated powder, gelatin capsule, capsule, tablet, lozenge, granules, emulsion, suspension, suppository, a food product, beverage, pharmaceutical, nutraceutical, food additive, dietary supplement or dairy product.
  • they may be in a gastro-resistant form, such as a coated tablet containing microencapsulated bacteria.
  • Said composition can thus be provided with a coating resistant to gastric juice, in order to ensure that the bacteria of the invention included in said composition can pass through the damaged stomach. The release of the bacteria (s) can thus occur for the first time in the upper intestinal tract.
  • composition according to the invention can be included in a food supplement.
  • a food supplement for administration by the oral may be present in capsules, hard capsules, soft capsules, tablets, sugar-coated tablets, pills, pastes, lozenges, gums, drinkable solutions or emulsions, syrup or gel.
  • a food supplement according to the present invention can further comprise a sweetener, a stabilizer, an antioxidant, an additive, a flavoring agent and / or a colorant.
  • the formulation thereof is carried out by means of the usual processes for producing sugar-coated tablets, hard capsules, gels, controlled release hydrogels, emulsions, tablets or capsules.
  • a composition according to the present invention can also be in the form of a nutritional composition.
  • a nutritional composition according to the present invention is in the form of a yogurt, a cereal bar, a breakfast cereal, a dessert, a frozen food, a soup, a pet food, a liquid suspension. , a powder, a tablet, a gum or a candy.
  • a composition according to the present invention can further comprise at least one ingredient chosen from: antioxidants, fish oils, DHA, EPA, vitamins, minerals, phytonutrients, a protein, a lipid, probiotics and combinations of these.
  • the bacteria according to the invention alone or included in the composition according to any one of the preceding embodiments can be used alive, semi-active, inactivated, or dead, preferably in a living form. Bacteria in semi-active, inactivated or dead form can be, for example, by irradiation, thermal inactivation or lyophilization, in particular by heat, exposure to an appropriate pH, UV, gamma rays, X rays or to high pressure.
  • the term “semi-active” thus designates a bacterium with low physiological activity, the capacity of which to proliferate is reduced, temporarily or permanently.
  • the term “inactivated” designates a bacterium which is no longer able, temporarily or permanently, to proliferate.
  • the term “dead” designates a bacterium which is no longer able, definitively, to proliferate. Dead or inactivated bacteria can have cell membranes intact or ruptured. Thus the term “inactivated” also designates the extracts and lysates of bacteria obtained.
  • a bacterium according to the invention alone or in the composition according to the invention can be used in whole form, that is to say essentially in its native form, or in the form of extracts or lysates comprising fractions and / or metabolites of this microorganism.
  • a lysate can denote the whole of the lysate obtained by lysis or only a fraction of the latter and can be prepared according to one of the conventional methods well known to those skilled in the art such as for example a thermal shock, by ultrasound, a osmotic shock, or under mechanical stress, such as by centrifugation. They can be all alive, all semi-active, all inactivated or all dead. In particular, it can be a mixture of living, semi-active, inactivated and dead bacteria.
  • At least some of the bacteria are alive, in particular at least 50% (by number), even more preferably at least 90% (by number).
  • the bacteria present in the composition useful according to the invention are for at least 50% living bacteria (in number), preferably for at least 90% of living bacteria (in number) , even more preferably all alive.
  • the storage conditions according to the invention are provided for liquid formulations in the form of a frozen product maintained at -20 ° C in a sealed bag.
  • the storage conditions according to the invention comprise a capsule or a coating hermetic to light and to oxygen maintained at an ambient temperature of between 15 ° C and 40 ° C and a humidity of between 3% and 70%.
  • a composition according to any one of the preceding embodiments is provided for the digestive tract, in particular the intestine. Consequently, the bacteria useful according to the invention, and in particular the compositions including it, can be administered orally, topically, inhaled or rectally, preferably rectally or intrarectally.
  • rectal or intrarectal administration is carried out in the form of a suppository, an enema or a foam.
  • the inventors have also determined, surprisingly, the ability of strains of Christensenella to increase the anti-inflammatory properties of a strain of Akkermonsio, and in particular of the strain Akkermansia muciniphila.
  • the inventors have demonstrated the existence of a synergistic effect of a combination of a strain of Christensenella (or of a culture supernatant of such a strain) and of a strain of Akkermansia (or of a culture supernatant of such a strain) on the prevention and / or treatment of gastrointestinal inflammation, and in particular the synergistic effect of a combination of a strain of Christensenella minuta and / or Christensenella timonensis (or culture supernatants of such strains) and a strain of Akkermansia muciniphila (or a supernatant thereof) on the prevention and / or treatment of gastrointestinal inflammation.
  • composition can further comprise:
  • the additional bacterium of the Verrucomicrobiaceae family is a bacterium of the genus Akkermansia, more particularly of the species Akkermansia muciniphila.
  • bacterium of the species “Akkermansia muciniphila” is meant within the meaning of the invention also the bacterium called “Akkermansia municiphila”.
  • the bacterium and the additional bacterium as mentioned above are, independently of one another, in a living, semi-active, inactivated and / or dead form, and are in particular in a living form.
  • a composition according to the invention is suitable for the administration of a daily dose representing from 10 7 to 10 11 colony forming units (CFU), preferably a daily dose equivalent to 10 9 UFC, of a bacterium of the Verrucomicrobiaceae family, in particular of the Akkermansia genus, more particularly of an Akkermansia muciniphila bacterium.
  • CFU colony forming units
  • a composition according to the invention can in particular comprise a content of between 0.1 and 99% by weight, in particular from 10 to 90% by weight, in particular from 25 to 70% by weight and more particularly from 30 to 50% by weight, relative to the total weight of the composition.
  • a composition according to any one of the aforementioned embodiments can comprise a content of between 0.1 and 99% by weight, in particular 10 to 90%, in particular 25 to 70% by weight, more particularly from 30 to 50% by weight of supernatant relative to the total weight of the composition.
  • compositions useful according to the invention in addition to the bacteria useful according to the invention, can comprise at least one probiotic, and / or at least one prebiotic.
  • compositions useful according to the invention in addition to the bacteria useful according to the invention can comprise other compounds, such as: - at least one probiotic, and / or
  • At least one bacterium producing lactic acid which makes it possible to create an anaerobic environment favorable to Christensenellaceae, such as at least one bacterium chosen from bacteria of the genus Lactobacillus spp., Bifidobacterium spp., Streptococcus spp. and / or at least one other organism promoting the anaerobic conditions necessary for the survival of Christensenellaceae, such as at least one yeast chosen from Saccharomyces spp. or microorganisms of the Methanobacteriaceae family and / or
  • At least one bacterium associated with the ecosystem of Christensenellaceae because they facilitate their survival in the intestine such as at least one bacterium chosen from bacteria of the phylum Firmicutes, Bacteroidetes, Actinobacteria, Tenericutes, and Verrucomicrobia, and / or
  • At least one bacterium chosen from bacteria of the order Clostridales, Verrucomicrobiales, Aeromonadales, Alteromonadales, ML615J-28, RF32, YS2, from the Clostridiaceae family, Lachnospiraceae, Ruminococcaceae, Bacteroidaceae, Enterococcaceae , Rikenéllaceae, Dehalobacteriaceae, Veillonellaceae and / or
  • Faecalibacterium chosen from bacteria of the genus Faecalibacterium, Akkermansia, Eubacterium and Oscillospira such as for example Faecalibacterium prausnitzii, Akkermansia muciniphila, Eubacterium halii, Oscillospira guilliermondii., and / or
  • At least one prebiotic such as for example at least one prebiotic chosen from galactooligosaccharides, fructooligosaccharides, inulins, arabinoxylans, beta-glucans, lactoglobulins and / or beta-caseins, and / or
  • At least one polyphenol such as for example at least one polyphenol chosen from quercetin, kaempferol, resveratrol, flavones (such as luteolin), flavan-3-ols (such as catechins), flavanones (such as narinenin) ), isoflavones, anthocyanidins, proanthocyanidins, and / or
  • non-steroidal anti-inflammatory drugs antibodies directed against pro-inflammatory targets (anti-TNFalpha), antirheumatic drugs, analgesics, antimicrobials, corticosteroids, anabolic steroids, antidiabetics, thyroid agents, antidiarrhoeals, cough suppressants, antiemetics, antiulcers, laxatives, anticoagulants, erythropoietin, immunoglobulins, immunosuppressants, growth hormones, hormonal drugs, estrogen receptor modulators, alkylating agents, antimetabolites, mitotic inhibitors, radiopharmaceuticals, anti-depressants, antipsychotics, anxiolytics, hypnotics, sympathomimetics, stimulants, donepezil, tacrine, asthma drugs, beta-agonists, inhaled steroids, leukotriene inhibitors, cromoglycates or cromoglycidic acids, epinephrine, alpha dornase
  • anti-TNFalpha pro-inflammatory targets
  • the present invention relates to a composition
  • a composition comprising, in a physiologically acceptable medium:
  • (I) (a) at least one bacterium selected from the group consisting of Christensenella timonensis, Christensenella minuta, Christensenella massiliensis, Christensenella intestinihominis, and / or mixtures thereof;
  • the present invention relates to a method for reducing and / or preventing inflammation in an individual in need thereof, comprising the administration of an effective amount of a bacterium of the Christensenellaceae family to said individual, in particular a bacterium of the species Christensenella.
  • the invention also relates to a method for reducing the level of IL-6 and / or stabilizing the level of IL-6 and / or preventing an increase in the level of IL-6 in an individual in need thereof, comprising administering an effective amount of a bacterium of the Christensenellaceae family to said individual, in particular a bacterium of the species Christensenella.
  • said individual exhibiting high serum levels of IL-6 before treatment.
  • said elevated serum IL-6 levels are greater than 5 pg / ml, greater than 10 pg / ml, greater than 20 pg / ml, greater than 30 pg / ml, greater than 40 pg / ml, greater than 50 pg / ml, greater than 70 pg / ml, greater than 90 pg / ml or greater than 100 pg / ml.
  • the invention also relates to a method for reducing the level of IL-8 and / or stabilizing the level of IL-8 and / or preventing an increase in the level of IL-8 in an individual in need thereof, comprising administering an effective amount of a bacterium of the Christensenellaceae family to said individual, in particular a bacterium of the species
  • said individual exhibiting high serum IL-8 levels before the treatment.
  • said elevated serum IL-8 levels are greater than 5 pg / ml, greater than 10 pg / ml, greater than 20 pg / ml, greater than 30 pg / ml, greater than 40 pg / ml, greater than 50 pg / ml, greater than 70 pg / ml, greater than 90 pg / ml or greater than 100 pg / ml.
  • the invention also relates to a method for increasing the level of IL-10 and / or stabilizing the level of IL-10 and / or preventing a decrease in the level of IL-10 in an individual in need thereof, comprising administering an effective amount of a bacterium of the Christensenellaceae family to said individual, in particular a bacterium of the species
  • said individual exhibiting low serum IL-10 levels before treatment.
  • said low serum IL-10 levels are less than 15 pg / ml, less than 10 pg / ml or less than 5 pg / ml.
  • the invention relates to a method for reducing the level of kynurenine and / or stabilizing the level of kynurenine and / or preventing an increase in the level of kynurenine in an individual in need thereof, comprising the administration of a effective amount of a bacterium of the Christensenellaceae family to said individual, in particular a bacterium of the Christensenella species.
  • said individual exhibiting high levels of fecal kynurenin before the treatment.
  • the invention also relates to a method of treating and / or preventing cancer associated with inflammation in an individual in need thereof, comprising administering an effective amount of the Christensenellaceae bacteria to said individual.
  • the method according to the present invention makes it possible to reduce the level of at least one of the markers of inflammation mentioned above in said individual, said marker being preferably reduced in serum, blood or stool.
  • the present methods are implemented in an individual suffering from one or more diseases described above in the description. Said individual preferably being a human being.
  • the Christensenella bacterium comprises a 16S ribosomal RNA gene exhibiting a sequence identity of at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80% or, preferably at least 90% with a 16S ribosomal RNA gene from Christensenella minuta, Christensenella massiliensis, or Christensenella timonensis, more preferably at least 97% sequence identity with a sequence selected from SEQ ID NO : 1, 2, B, 4, 5 or 6.
  • SEQ ID NO: 1 is a sequence of the 16S ribosomal RNA gene of the bacterium Christensenella minuta DSM 22607, which has been isolated from a human fecal sample.
  • the C. minuta 16S rRNA sequence is identified by the Genbank accession number AB490809.
  • SEQ ID NO: 2 is a part of the 16S ribosomal RNA gene sequence from the bacterium Christensenella minuta DSM 22607. Additional 16S sequences for bacteria of the genus Christensenella are provided such as SEQ ID NOS: 3-6 (OTU numbers 701845, 177179, 1146771, and 361793 in the Greengenes database, respectively).
  • each sequence with respect to SEQ ID NO: 1 is as follows: SEQ ID NO: 3, 93% identity with SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 4, 95% identity with SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 5, 97% identity with SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 6, 95% identity with SEQ ID NO: 1.
  • said methods comprise the administration of at least one bacterium or composition according to the present invention characterized by any one of the any embodiments described above, such as mixing or not the bacteria, the amount administered, the amount of viable bacteria, the additional components, for example active pharmaceutical ingredients, prebiotics or probiotics, vitamins, minerals, nutritional agents, other microorganisms, the particular formulation of said composition, for example powder, capsule, etc.
  • the present methods include oral, inhaled, topical, rectal or intrarectal administration in a sufficient amount.
  • Example 2 Christensenella massiliensis.
  • Christensenella massiliensis can be cultivated according to the operating protocol described below.
  • Christensenella timonensis can be cultivated according to the same operating protocol as that described in Example 2 for Christensenella massiliensis.
  • Example 4 Specific strains according to the invention
  • Example 5 Useful composition based on supernatants
  • composition useful according to the invention is a composition comprising between 0.1 and 95% of culture supernatant of the strains Christensenella minuta DSM 22607, Christensenella timonensis DSM 102800 and Akkermansia municiphila DSM 22959.
  • Example 6 Useful composition according to the invention in liquid form
  • composition useful according to the invention in liquid form is a composition comprising Christensenella minuta 10 9 CFU / ml in the anaerobic RCM culture medium described above modified to contain no product of animal origin and enriched in 5% glycerol. .
  • Example 6 The composition of Example 6 is obtained from an RCB (“research cell bank”) prepared on the basis of Christensenella minuta 10 10 CFU / mL then stored frozen at -20 ° C in an airtight sachet. with oxygen.
  • RCB search cell bank
  • the frozen composition must be warmed to room temperature until it returns to liquid form before use.
  • Example 7 Useful composition according to the invention in solid form
  • composition useful according to the invention in lyophilized form can be obtained by lyophilization of the composition of Example 6 in the frozen state.
  • kynurenine The objective of this study is to demonstrate the anti-inflammatory effect in vitro of christensenella bacteria according to the invention. The demonstration of this effect was carried out on kynurenine, a known marker of inflammation. Human faeces were collected and cultured in a fermenter. The abundance of Christensenella spp. was correlated with the abundance of kynurenine present in the fermenter.
  • - Faeces samples were diluted 1/5 (w / v) in phosphate buffered saline (IM) (PBS), pH 7.4.
  • IM phosphate buffered saline
  • PBS phosphate buffered saline
  • the basic nutrient medium was prepared from 2g / L of soybean tryptone broth, 2g / L of yeast extract, 0.1g / L of NaCl, 0.04g / L of K2HPO4 , 0.01g / L of MgS0 3 .7H 2 0, 0.01g / L of CaCl 2 .6H 2 0, 2g / L NaHCOs, 0.5g / L of L-cystine HCl, 2m L / L of tween 80, 10pL / L of vitamin Kl, 0.05g / L of heme, 0.05g / L of bile salts, 4ml / L of resazarin (pH7)
  • the 20mL biofermenters contained 18mL of basic nutrient medium autoclaved (121 ° C for 15 minutes) and poured aseptically into sterile biofermenters. This system was left to stand overnight with oxygen-free nitrogen bubbling through the medium at a rate of 2 mL / min.
  • the pH was maintained between 6.7 and 6.9 using HCl or NaOH (0.5M).
  • the temperature of each biofermenter was controlled at 37 ° C and the contents of the vessel homogenized with a magnetic mixer
  • predigested proteins (0.35g) was added to the containers before inoculation with 2mL of fecal inocula at T0.
  • the predigested proteins were obtained according to the gastrointestinal digestion protocol adapted from that of Versantvoort et al (2005). - the samples were collected before fermentation (T0) and after 48 hours of fermentation (T48), and frozen at -80 ° C until analyzes.
  • the mixture was mixed and filtered through a 5-kDa cutoff filter to remove macromolecules.
  • the metabolites were detected by capillary electrophoresis-time-of-flight mass spectrometry (CE-TOFMS) analyzes.
  • Relative peak area (peak area of a metabolite) / (peak area of internal standard x amount of sample).
  • the DNA contained in the samples was extracted using the NucleoSpin ® 96 Soil kit from Macherey-Nagel according to the manufacturer's instructions.
  • the library was then sequenced using 2 x 150 bp paired-end sequencing on an Illumina HiSeq platform.
  • the objective of this study is to demonstrate the anti-inflammatory effect in vitro of bacteria according to Example 4.
  • the demonstration was carried out on one of the markers of inflammation: interleukin 8 (IL-8 ).
  • HT-29 human colon epithelial cells (LGC-Standars) were grown in Dulbecco's Modified Eagle's Minimum Essential Medium (DMEM) (Sigma-Aldrich) supplemented with 10% (w / v) heat-activated fetal bovine serum (FBS) (GibcoBRL, Eragny, France) and penicillin G / streptomycin (5000 lU / mL, 5000 pg / ml) (Sigma-Aldrich). Cell cultures were incubated in 25 cm 2 tissue culture flasks (Nunc, Roskilde, Denmark) at 37 in a 5% (v / v) CO2 atmosphere until confluence.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Minimum Essential Medium
  • FBS heat-activated fetal bovine serum
  • penicillin G / streptomycin 5000 lU / mL, 5000 pg / ml
  • 50,000 HeLa or HT-29 cells per well were seeded in 24-well culture plates (Nunc). Twenty-four hours before the bacterial contact, the culture medium was replaced with a medium containing 5% FBS. The experiments were conducted on day 7 after seeding, while the cells were confluent (l 83xl0 6 cells / well). Twenty-four hours before the bacterial co-culture (day 6), the culture medium was replaced with a medium containing 5% heat inactivated FBS and 1% glutamine. On the day of co-culture, 10% bacterial supernatant was added to DMEM in a total volume of 500 ⁇ l. The cells were stimulated
  • Figure 1 represents the production of IL-8 in HT-29 cells stimulated by TNF -a in the presence of Christensenella minuta, Christensenella timonensis, Akkermansia muciniphila, Christensenella minuta + Akkermansia muciniphila and CChristensenella timonensis + Akkermansia muciniphila + Akkermansia muciniphila + Akkermansia muciniphila + Akkermansia muciniphila.
  • the results are expressed in IL-8 (pg / mL) and were normalized using as reference value IL-8 produced after co-incubation with PBS as negative control. Results were analyzed using a Kruskal Wallis test followed by Dunns multiple comparison test (* p ⁇ 0.05; ** p ⁇ 0.01).
  • the reference strain Akkermansia muciniphila DSM 22959 is well known for its immunomodulatory properties and more particularly for its anti-inflammatory effects (Derrien M, Belzer C, de Vos WM. Microb Pathog. 2017 May; 106: 171-181. doi: 10.1016 / j. micpath.2016.02.005. Epub 2016 Feb 11). To determine whether the strains of C.
  • Christensenella minuta DSM 22607 and Christensenella timonensis DSM 102800 are capable of modulating the immune response, the inventors tested in vitro the immunomodulatory properties of the supernatants of the strains in a model based on the ability to block the production of IL -8 (a pro-inflammatory cytokine) induced by TNF- ⁇ stimulation in colon epithelial cells HT-29.
  • IL -8 a pro-inflammatory cytokine
  • Christensenella minuta DSM 22607 and Christensenella timonensis DSM 102800 increase the anti-inflammatory properties of Akkermansia muciniphila DSMZ 22959 in vitro.
  • the objective of this study is to demonstrate the anti-inflammatory effect in vitro of bacteria according to the invention.
  • the demonstration was carried out on one of the markers of inflammation: interleukin-8.
  • DMEM Glutamax + 10% FCS is then removed to be replaced by medium with 5% FCS (JO).
  • D + 1 the middle is removed.
  • Two media DMEM Glutamax + 5% FCS +/- TNF-a are prepared. 450 ⁇ L / well of one of the two media are then added and then 50 ⁇ L of the supernatants to be tested. After 6 hours of co-incubation, the supernatants are collected and stored at -80 ° C.
  • ELISA assays of the chemokine IL-8 are then carried out (ELISA MAX Deluxe set Human IL-8 from Biolegend).
  • FIG. 2 represents the assay of the IL-8 chemokine secreted by HT-29 cells (colon adenocarcinomas) in an inflammatory state induced by TNF- ⁇ .
  • Different bacterial supernatants C. minuta 1, C minuta 2, C. minuta B, C. minuta 4 and DSMZ, corresponding to the strain DSM22607 belonging to bacteria of the species Christensenella minuta were tested in order to evaluate their capacity immunomodulatory.
  • the bacterial culture medium (GAM) represents the control making it possible to assess the effects of the supernatants. The experiment was carried out four times in triplicate.
  • FIG. 3 represents the measurement of the trans-epithelial electrical resistance taken on Caco-2 epithelial cells. The latter by differentiating establish junctions between them (called tight junctions) to maintain the integrity of this barrier created by the cells, mimicking the intestinal barrier present in our digestive tract.
  • cytokine TNF -a Tumor Necrosis Factor
  • DMEM + TNF control group - at The "DMEM -" control group represents the wells where only the cell culture medium was present, without TNF -a or bacteria.
  • Trans-epithelial electrical resistance is a method for quantifying the integrity of the barrier of epithelial tissue by measuring the electrical resistance across it.
  • TEER measurements are performed by placing electrodes at both poles of a layer of epithelial cells that have been cultured on a semi-permeable membrane. The electrodes apply an alternating current allowing the measurement of the electrical resistance through the layer of epithelial cells. [0146]
  • the TEER ratio is obtained by the following calculation:
  • the TEER is measured using an automatic device (REMS). The values are saved and represent our starting value (T0). The cells are then co-incubated in the presence of bacteria (MOI 1/40) for 3 hours, the time that the latter adhere to the cells. Then the cells are challenged with TNF- ⁇ inducing a disruption of the epithelial cell layer and in particular at the tight junctions. 24 hours (T24) after adding the bacteria, the TEER is measured again.
  • MERS automatic device
  • This figure shows us that the Christensenella minuta bacteria influence the integrity of the intestinal barrier by improving transepithelial resistance, indicating a potential effect on tight junction proteins and a decrease in intestinal permeability.
  • the Christensenella minuta bacteria therefore make it possible to restore the resistance of the epithelial membrane.
  • the objective of this study is to demonstrate the anti-inflammatory effect in vivo on mice, of bacteria according to the invention.
  • the demonstration was carried out on major markers of inflammation, two cytokines: IL6 (interleukin 6) and TNF-a (tumor necrosis factor-alpha).
  • IL6 interleukin 6
  • TNF-a tumor necrosis factor-alpha
  • mice Four week old male C57BL / 6 mice were purchased from Charles River (St Germain sur l'ArbresIe, France).
  • mice had a period of acclimatization of one week on the diet based on a standard diet (“chow diet (SafeA04)”) before starting the study.
  • Plasma levels of cytokines IL-6 and TNF were determined using ELISA assay kit "Invitrogen ® Luminex ® Magnetic Mouse Cytokine 10-Plex” and according to the manufacturer's instructions. The measurements were carried out by VEBIO (Arcueil, France).
  • force-feeding of all groups begins, as well as weight monitoring.
  • the control mice ctlr-vehicle and DNBS-vehicle
  • the DNBS-Christensenella minuta (C. minuta) mice are force-fed with 150 ⁇ L of C.
  • DNBS dinitrobenzensulfate
  • the latter is injected directly into the colon of the mouse through a probe introduced into the rectum.
  • DNBS is dissolved in 30% ethanol, weakening the intestinal barrier to facilitate entry of DNBS into the tissue, thus triggering the immune system and therefore inflammation.
  • the gavages continue during this period, and those of the 5-ASA group begin on the day of this injection at 150 ⁇ L (5-ASA solution prepared every morning, at 2 mg / mouse resuspended in PBS). Euthanasia takes place 3 days after the injection. The so-called “recovery” period is therefore short, but necessary to be able to observe differences with the DNBS control group.
  • FIG. 4 represents the various parameters evaluated during a test on an inflammatory model induced by DNBS.
  • the macroscopic scores indicate the level of severity of the disease, indicate that following treatments with DSM 22607, a significant decrease in the score was observed, as well as with the pharmacological agent anti-. inflammatory, 5-ASA (5-aminosalicylic acid used as a comparative positive control).
  • FIGS. 4C and 4D show us the immunomodulatory potential of DSM 22607, in particular by reducing the presence of neutrophils in the colon, evaluated by following the activity of myeloperoxidase.
  • the increase of interleukin-10 in the spleen shows us the anti-inflammatory effects associated with Christensenella minuta.
  • mice Three days after the injection, the animals are euthanized. The change in the weight of the mice is measured by taking the weight of the mice daily. During the sacrifice, the colon is opened and cleaned in order to achieve the macroscopic score. The latter is based on the presence of blood in the tissue (hyperemia), the presence of ulcer, intestinal transit (for example if the mouse was constipated) and the thickening of the colon induced by DNBS.
  • MPO myeloperoxidase
  • the spleen is also recovered during sacrifice (peripheral lymphoid organ) and the cells of the innate and adaptive immune response are stimulated in order to assay the secreted cytokines such as IL-10, anti-inflammatory cytokines.
  • cytokines such as IL-10, anti-inflammatory cytokines.
  • FIG. 5 represents the effects of other strains of Christensenella minuta during a repetition of the experiment presented in FIG. 4.
  • the experimental design and the methods remain similar.
  • This experiment teaches us that all the strains of Christensenella minuta tested have the same efficacy in reducing the macroscopic scores following intrarectal injection of DNBS. Likewise, all the strains tested show an anti-inflammatory effect which results in a reduction in the activity of MPO.
  • the HT-29 cells were inoculated at a density of 10,000 cells / well in a total volume of 100 ⁇ l in a 96-well plate. After 24 h of incubation, the culture medium was removed from the adherent cells and new medium supplemented with 10% of Christensenella minuta stationary phase supernatant was added (DSMZ, C. minuta 1 and C. minuta 2 and in control GAM (bacterial culture medium)). Each condition was made in 4 replicates. The cells were incubated for an additional 48h or 72h.
  • Cell proliferation was determined by the use of the CelITiter-GIo 2.0 assay kit (Promega). The measurements were carried out according to the manufacturer's instructions. Briefly, the plates were removed from the incubator and allowed to equilibrate at room temperature for 30 min and an equal volume of CelITiter-GIo 2.0 reagent was added. directly to the wells (100 mI). The plates were stirred at 300 rpm for 2 min using a rotary shaker, then incubated at room temperature for 10 min. The reaction mixture was then transferred to a white-walled 96-well plate and the luminescent signal was measured using a microplate reader (FLUOstar Omega, BMG Labtech).
  • a microplate reader FLUOstar Omega, BMG Labtech
  • FIG. 6 represents the influence of strains of Christensenella minuta on the proliferation of tumor cells.
  • the inventors observed the influence of strains of Christensenella minuta on the proliferation of tumor cells, we analyzed the effect of these supernatants by treatment of a human colon adenocarcinoma cell line, the HT-29 line. .
  • the effect of the supernatants of Christensenella minuta on the proliferation of HT-29 cells was evaluated after 48 and 72 h.
  • Akt inhibitor VIII is used as a control for blocking cell proliferation.

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Abstract

L'invention concerne une bactérie de la famille des Christensenellacées, en particulier du genre Christensenella, ou d'une composition en contenant pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement de maladies inflammatoires chroniques et/ou de cancers chez l'être humain ou l'animal.

Description

BACTERIE DE LA FAMILLE DES CHRISTENSENELLACÉES DANS LA PREVENTION ET/OU LE TRAITEMENT DE MALADIES INFLAMMATOIRES CHRONIQUES ET/OU DE MALADIES
GASTRO-INTESTINALES INFLAMMATOIRES ET/OU DE CANCERS
[0001] L'invention concerne la prévention et le traitement des maladies inflammatoires chroniques, des maladies gastro-intestinales inflammatoires et/ou des cancers avec des bactéries spécifiques du microbiote intestinal et des compositions les contenants.
[0002] L'inflammation est le processus normal de défense de l'organisme face à une agression. Elle permet de lutter et d'éliminer le ou les agents étrangers à l'origine de ladite agression. Cette inflammation, dite aiguë, est réversible et n'a qu'une durée limitée allant de quelques minutes à quelques jours. Toutefois, dans certains cas, le processus inflammatoire se dérègle et l'inflammation devient chronique. Au lieu de contribuer à la défense de l'organisme, les acteurs impliqués dans le processus inflammatoire deviennent dangereux et entraînent un état pathologique souvent grave et invalidant. Les maladies inflammatoires chroniques sont donc des maladies dont la physiopathologie est directement liée à une inflammation, ladite inflammation étant d'origine auto-immune et/ou auto-inflammatoire.
[0003] Tous les organes peuvent être concernés par une inflammation chronique, comme par exemple le système digestif (maladie de Crohn, colite ulcéreuse, gastrite auto-immune, etc.), le foie (hépatite, NAFLD, stéatohépatite non alcoolique, etc.), le pancréas (pancréatite), les poumons (asthme), la peau (dermatite atopique comme le psoriasis), le système nerveux (scléroses en plaques), les articulations (polyarthrites). Par ailleurs, l'inflammation chronique est également présente dans d'autres situations où d'autres mécanismes sont en cause comme en particulier les cancers.
[0004] L'inflammation chronique, et en particulier les maladies chroniques inflammatoires, touchent une large portion de la population, dans des proportions variées en fonction de la pathologie concernée. Les conséquences pour la santé sont majeures, car ces maladies, bien qu'à évolution lente, sont invalidantes, douloureuses et associées à un risque élevé de mortalité précoce.
[0005] Actuellement, les traitements proposés pour ces maladies sont des anti inflammatoires, des immunomodulateurs et/ou immunosuppresseurs. On peut citer par exemple : - les médicaments anti-inflammatoires non stéroïdiens tels que l'ibuprofen, le naproxen et l'aspirine qui sont dédiés à un usage de courte durée et qui sont inadaptés aux douleurs chroniques,
- les modulateurs du métabolisme des purines qui sont des immunomodulateurs, tels que le methotrexate et l'azathioprine,
- des médicaments biologiques tels que des anti-TNF-a, des antagonistes des récepteurs à l'ILl et l'IL6, ou encore
- la sulfasalazine.
[0006] Tous ces médicaments ont des taux de réponses très variables du fait de la dégradation des molécules lorsqu'elles sont administrées et présentent des effets secondaires importants. De plus, les immunomodulateurs entravent la réponse immunitaire normale et saine face aux pathogènes, si bien que les patients traités sont susceptibles aux infections. Le méthotrexate quant à lui est spécifiquement connu pour ses effets indésirables sur la production de sperme et par conséquent sur la fertilité. Ainsi, la plupart de ces maladies inflammatoires restent sans traitement ou sans traitement adéquat.
[0007] Par conséquent, l'étude et la recherche de nouvelles stratégies de traitement anti inflammatoire constituent un sujet majeur en médecine et en recherche biomédicale, en particulier le développement d'un traitement efficace des maladies chroniques inflammatoires, des maladies gastro-intestinales et des maladies induites par une inflammation chronique, qui soit facile à administrer et qui ne présente pas d'effets secondaires.
[0008] C'est l'objectif de la présente invention, qui, pour y répondre, vise l'utilisation de bactéries particulières du microbiote intestinal humain, à savoir des bactéries de la famille des Christensenellacées, préférentiellement du genre Christensenella. Ces bactéries peuvent être éventuellement combinées à d'autres bactéries et notamment des bactéries de l'espèce Akkermansia muciniphila.
[0009] Des bactéries de la famille des Christensenellacées, notamment du genre Christensenella, ont déjà été étudiées et décrites. C'est le cas en particulier de Christensenella minuta, Christensenella massiliensis et Christensenella timonensis. Christensenella minuta en particulier a été décrite pour la première fois en 2012. En 2014, une étude a montré qu'il s'agissait du taxon le plus héritable dans une cohorte de jumeaux britanniques et que leur présence est associée à un indice de masse corporel faible. Cette corrélation entre Christensenella minuta et l'indice de masse corporel faible a ensuite été observée dans une dizaine d'études parues depuis 2014 dans des populations géographiquement diverses.
[0010] Il a été décrit dans la demande WO2016/156527 l'intérêt de rétablir une population minimale en Christensenella chez des individus présentant une maladie inflammatoire intestinale liée à une déficience en Christensenella dans le microbiote intestinal. Toutefois, aucune des bactéries précitées n'a démontré de lien direct avec ces pathologies chez l'homme.
[0011] Par ailleurs, les demandes WO2018/162738 et WO2018/162726 enseignent que l'utilisation de bactéries particulières de la famille Christensenellacées, appartenant à des espèces définies comme étant spécifiquement éloignées de celles du genre Christensenella et notamment des espèces Christensenella minuta et Christensenella timonensis, permettent de lutter notamment contre le surpoids et l'obésité, en intervenant par exemple sur la présence de gras viscéral et sur la perméabilité intestinale.
[0012] Akkermansia muciniphila, appartenant à la famille Verrucomicrobiaceae et au genre Akkermansia, est une bactérie identifiée pour la première fois en 2004 et qui représente environ 1 à 3 % en nombre sur le total des genres bactériens du microbiote intestinal d'adultes en bonne santé (Derrien et al., 2004, 54: 1469- 1476; Derrien et al. Applied Environmental Microbiology 2008, 74, 1646-1648).
[0013] La population en nombre d 'Akkermansia muciniphila a déjà été rapportée comme étant réduite dans les échantillons de selles d'individus obèses et de patients atteints d'une maladie gastro-intestinale inflammatoire (Png, et al. Gastroenterol. 2010;105: 2420-2428). Akkermansia muciniphila est associé à un état métabolique plus sain et à de meilleurs résultats cliniques après une intervention de restriction calorique chez les adultes en surpoids voire obèses.
[0014] De façon surprenante, et selon l'invention, les bactéries du genre Christensenella, et notamment les espèces Christensenella minuta, Christensenella massiliensis et Christensenella timonensis, lorsqu'elles sont administrées à l'homme ou à l'animal, sont capables d'agir sur les marqueurs de l'inflammation à l'origine des maladies inflammatoires, en particulier des maladies gastro-intestinales inflammatoires et maladies chroniques inflammatoires ; et des cancers. En outre, les inventeurs, inopinément ont déterminé des propriétés anti-inflammatoires synergiques issues de la mise en oeuvre d'une bactérie du genre Christensenella en association avec une bactérie du genre Akkermansia, en particulier Akkermansia muciniphila, un probiotique de nouvelle génération (NGP) bien connu issu de la famille Verrucomicrobiaceae.
[0015] C'est pourquoi, l'invention a pour objet une bactérie du genre Christensenella, pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement de maladies inflammatoires chroniques et/ou des maladies gastro-intestinales inflammatoires et/ou de cancers chez l'être humain ou l'animal.
[0016] Avantageusement, une telle bactérie, lorsqu'elle est administrée à un être humain ou un animal présentant une inflammation chronique, est capable d'agir sur les molécules produites en excès lors d'une inflammation chronique comme la kynurenine, l'interleukine 6, l'interleukine 8, le TNFalpha, l'interleukine lb, les lipocalines ou la calprotectine fécale, et/ou en stimulant la production de la cytokine anti-inflammatoire interleukine 10.
[0017] L'invention a également pour objet les compositions comprenant au moins une bactérie du genre Christensenella, seule ou en association avec au moins une bactérie additionnelle, préférentiellement au moins une bactérie additionnelle du genre Akkermansia, pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement de maladies inflammatoires chroniques et/ou des maladies gastro-intestinales inflammatoires et/ou de cancers chez l'être humain ou l'animal.
[0018] Une telle composition comprenant, dans un milieu physiologiquement acceptable, au moins l'une de ces bactéries (au moins une bactérie du genre Christensenella seule ou en association avec au moins une bactérie additionnelle du genre Akkermansia ) et/ou leur surnageant, est également visée per se.
[0019] D'autres caractéristiques et avantages ressortiront de la description détaillée et des figures de l'invention qui va suivre.
[0020] BREVE DESCRIPTION DES DESSINS
[0021] La Figure 1 représente la production d'interleukine-8 (IL-8) (en pg/mL) (ordonnée) dans des cellules HT-29 stimulées par du TNF-a en présence de souches de Christensenella minuta, Christensenella timonensis, Akkermansia municiphila, Christensenella minuta + Akkermansia municiphila et Christensenella timonensis + Akkermansia municiphila (abscisse).
[0022] La Figure 2 représente la sécrétion de l'IL-8 par les cellules intestinales de la lignée HT29 après co-incubation en présence de surnageants de souches de Christensenella minuta ('DSMZ: DSM22607) et stimulation par le TNF- a. Test statistique non paramétrique de Dunn: *p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001. IL-8 : Interleukine 8; TNF- a : Tumor Necrosis Factor alpha. Moyennes de 4 expériences répétées en triplicats.
[0023] La Figure 3 représente la mesure de la résistance trans-épithéliale sur des cellules intestinales de la lignée Caco-2 après co-incubation en présence bactéries Christensenella minuta (DSMZ: DSM22607) et après stimulation par le TNF- a. Test statistique non paramétrique de Dunn: *p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001. IL-8 : Interleukine 8; TNF-a : Tumor Necrosis Factor alpha. Moyennes de 3 expériences répétées en triplicats.
[0024] La Figure 4 représente les effets de Christensenella minuta (DSM 22607) sur un modèle d'inflammation induit par le DNBS. (A) Suivi de la perte de poids des groupes traités à partir du jour de l'injection (J0). (B) Diminution significative des scores macroscopiques indiquant une réduction de la sévérité de l'inflammation suite aux traitements DSM 22607 et 5ASA. Effets immunomodulateurs de DSM22607 à travers la diminution de l'activité de la myélopéroxydase (C) et de l'augmentation de l'interleukine-10 (IL-10), une cytokine anti inflammatoire, dans la rate (D). ANOVA non paramétrique suivie par un test statistique de Dunn : *p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001. DNBS : Dinitrobenzene sulfonic acid.
[0025] La Figure 5 démontre la généralisation des effets anti-inflammatoires des espèces de Christensenella minuta sur un modèle d'inflammation induite par le DNBS. (A) Réduction des scores macroscopiques indiquant une réduction de la sévérité de l'inflammation suite aux traitements avec différentes espèces de Christensenella minuta. (B) Effets immunomodulateurs de différentes espèces de Christensenella minuta à travers la diminution de l'activité de la myélopéroxydase (C). ANOVA non paramétrique suivie par un test statistique de Dunn : *p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001. DNBS : Dinitrobenzene sulfonic acid.
[0026] La Figure 6 représente l'effet des surnageants des souches de Christensenella minuta (DSMZ : DSM22607, C. minuta 1 et C. minuta 2) sur la prolifération des cellules HT-29 (adénocarcinome du colon). RLU : Relative Luminescence Unit (Unité de Luminescence Relative). Test de Dunnett où le groupe contrôle est le groupe GAM (qui représente le milieu de culture Gifu Anaérobie Broth). Code : *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001.
[0027] DEFINITIONS
[0028] Par « bactéries » au sens de l'invention, on entend également le terme « souches bactériennes ». Une souche bactérienne étant à comprendre comme étant une bactérie d'une souche donnée appartenant à une espèce particulière, par exemple l'espèce Christensenella minuta. On peut citer par exemple la souche bactérienne ou bactérie Christensenella minuta DSM22607. Ainsi, les deux termes peuvent être indifféremment employés pour désigner une (des) bactérie(s) dans le contexte de l'invention.
[0029] Par « hyperproduction d'interleukine 6 » au sens de l'invention, on entend une production excessive d'interleukine 6 par rapport à la production chez une personne ou un animal sain sans inflammation.
[0030] Par « hyperproduction d'interleukine 8 » au sens de l'invention, on entend une production excessive d'interleukine 8 par rapport à la production chez une personne ou un animal sain sans inflammation.
[0031] Par « sous-production d'interleukine 10 » au sens de l'invention, on entend une production insuffisante d'interleukine 10 par rapport à la production chez une personne ou un animal sain sans inflammation.
[0032] Par « maladie chronique inflammatoire » au sens de l'invention, on entend en particulier toute maladie chronique dont la physiopathologie, à évolution lente et progressive, est en lien direct avec une inflammation d'origine auto-immune et/ou auto inflammatoire.
[0033] Par « maladie gastro-intestinale inflammatoire » au sens de l'invention, on entend en particulier, une affection intestinale inflammatoire, plus particulièrement une affection intestinale inflammatoire colique. Ladite affection intestinale inflammatoire colique peut, en particulier, être choisie dans le groupe constitué de la maladie de Crohn (MC), la recto-colite hémorragique (RCH) et la pochite, en particulier la MC et la RCH. La MC et la RCH sont deux maladies qui se caractérisent par l'inflammation de la paroi d'une partie du tube digestif, liée à une hyperactivité du système immunitaire digestif.
[0034] Par « prévenir » ou « prévention » au sens de l'invention, on entend la réduction à un degré moindre du risque ou de la probabilité d'occurrence d'un phénomène donné, c'est-à- dire, dans le contexte de la présente invention, une inflammation chronique, une inflammation gastro-intestinale et les pathologies en découlant tel un cancer, en particulier une inflammation intestinale.
[0035] Par « traiter » ou « traitement » au sens de l'invention, on entend une diminution de la progression de la maladie, une stabilisation, une inversion ou régression, voire une interruption ou inhibition de la progression d'une maladie inflammatoire chronique, d'une maladie gastro-intestinale inflammatoire, d'un cancer. Dans le contexte de l'invention, ces termes s'appliquent également sur un ou plusieurs symptômes desdites maladies de la présente invention.
[0036] Par « non-déficient en Christensenella » dans le microbiote intestinal, au sens de la présente invention, on entend un être humain ou un animal dont les bactéries du genre Christensenella dans son microbiote intestinal représente au moins 0,01% en nombre du total des genres bactériens décelés dans son microbiote intestinal, en particulier au moins 0,1%, et préférentiellement au moins 0,5%. Recueilli dans les selles, l'abondance en Christensenella peut par exemple être mesurée par un test de séquençage quantitatif, de l'hybridation fluorescente in situ (FISH), de la qPCR (PCR quantitative) ou par des analyses du métagénome (quantification relative), bien connus de l'homme du métier.
[0037] Par « milieu physiologiquement acceptable » au sens de l'invention on entend un milieu qui est compatible avec l'organisme de l'individu auquel ladite composition doit être administrée. Il peut s'agir, par exemple, d'un solvant non toxique tel que l'eau. En particulier, ledit milieu est compatible avec une administration orale.
[0038] Par « microbiote », on entend l'ensemble des micro-organismes ayant colonisé un individu et avec lesquels il cohabite : des bactéries pour l'essentiel, mais également des virus, des champignons, des levures et des protozoaires. La composition du microbiote diffère selon les surfaces colonisées : on distingue ainsi le microbiote cutané, le microbiote vaginal, le microbiote urinaire, le microbiote respiratoire, le microbiote ORL (otorhinolaryngologie) et le microbiote intestinal, autrefois appelé flore intestinale, de loin le plus important avec ses 100 000 milliards de germes. Ainsi, on entend par « microbiote intestinal » l'ensemble des micro organismes, notamment des bactéries, qui peuplent l'intestin d'un individu donné.
[0039] Par « Indice de masse corporel » (IMC), on désigne, selon une définition officielle de l'Organisme Mondiale de la Santé (OMS), l'indicateur des risques pour la santé associée à un poids excessif et à un poids insuffisant. L'IMC se calcule en divisant le poids de l'individu (en kilogrammes) par sa taille (en mètres) élevée au carré. Une valeur d'IMC est associée à une corpulence spécifique selon la classification donnée par l'OMS (https://www.who.int/features/factfiles/obesitv/facts/fr/).
[0040] Par « quantité effective », « quantité effective à », « quantité de X efficace pour » et autres, se réfèrent à une quantité d'un ingrédient actif qui est efficace pour soulager ou réduire dans une certaine mesure un ou plusieurs des symptômes de la maladie dans la nécessité d'un traitement, ou pour retarder l'apparition de marqueurs cliniques ou de symptômes d'une maladie qui ont besoin de prévention, lorsque le composé est administré. Ainsi, la quantité se réfère à une quantité de l'ingrédient actif qui présente des effets tels que (i) inverser le rythme de progression d'une maladie, (ii) inhiber dans une certaine mesure l'évolution de la maladie, et/ou, (iii) soulager dans une certaine mesure (ou, de préférence, en éliminant) un ou plusieurs symptômes associés à la maladie. L'efficacité de la quantité peut être déterminée empiriquement en expérimentant les composés concernés dans des systèmes modèles in vivo et in vitro connus pour une maladie nécessitant traitement.
[0041] DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
[0042] L'invention a donc pour objet l'utilisation dans la prévention et/ou le traitement de maladies inflammatoires chroniques et/ou de maladies gastro-intestinales inflammatoires et/ou de cancers, en particulier de cancers à caractère inflammatoire, chez l'être humain ou l'animal, d'au moins une bactérie de la famille des Christensenellacées, préférentiellement du genre Christensenella ou d'une composition comprenant au moins un telle bactérie et/ou un surnageant de culture d'au moins ladite bactérie du genre Christensenella. La bactérie peut être toute souche bactérienne d'une des espèces du genre Christensenella. Préférentiellement, ladite composition comprenant en outre une bactérie additionnelle de la famille Verrucomicrobiaceae et/ou un surnageant de culture de ladite bactérie additionnelle, en particulier ladite bactérie est du genre Akkermansia, plus particulièrement de l'espèce Akkermansia muciniphila.
[0043] Bactéries selon l'invention.
[0044] L'invention vise donc une bactérie de la famille des Christensenellacées, en particulier du genre Christensenella pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement de maladies inflammatoires, préférentiellement de maladies inflammatoires chroniques et/ou de maladies gastro-intestinales inflammatoires et/ou de cancers chez l'être humain ou l'animal, en particulier chez des personnes ou des animaux présentant une maladie inflammatoire ou un cancer avec une hyperproduction d'interleukine 6 et/ou une hyperproduction d'interleukine 8 et/ou une sous-production d'interleukine 10.
[0045] Selon l'invention, les bactéries du genre Christensenella, lorsqu'elles sont administrées à un être humain ou un animal présentant une inflammation chronique, une inflammation gastro-intestinale ou un cancer, sont capables d'agir sur les molécules produites en excès lors d'une inflammation chronique, d' une inflammation gastro-intestinale ou d'un cancer, en particulier sur l'interleukine 6, l'interleukine 8 et la kynurenine, mais également sur le TNFalpha, l'interleukine lb, les lipocalines ou la calprotectine fécale. Ainsi, les inventeurs ont découvert que les bactéries du genre Christensenella possèdent la capacité inattendue de réduire in vitro et in vivo l'inflammation et la prolifération cellulaire, en particulier l'inflammation gastro-intestinale et plus particulièrement l'inflammation chronique de l'intestin. Plus particulièrement les bactéries selon la présente invention sont capables de réduire significativement la production de molécules pro-inflammatoires, telles que l'interleukine 6 (IL-6) et l'interleukine 8 (IL-8).
[0046] En effet, dans les maladies inflammatoires et cancers qui présentent une augmentation de l'un de ces marqueurs tels que l'interleukine 6, l'interleukine 8, la kynurénine, le TNFalpha, l'interleukine lb, la lipocaline ou la calprotectine, leur diminution est le signe de la réduction de la voie de signal pro-inflammatoire, c'est-à-dire que les cellules immunitaires à l'origine de cette production sont moins stimulées. Dès lors, la réaction immunitaire excessive en cause de l'inflammation est ralentie et le système retourne progressivement à la norme.
[0047] Selon un mode de réalisation, la ou les bactéries utiles selon l'invention sont administrées à des êtres humains ou des animaux dans une quantité efficace pour une action sur au moins un de ces marqueurs de l'inflammation, c'est-à-dire pour diminuer la production d'au moins une de ces molécules dans l'organisme. Selon un mode de réalisation adapté, la ou les bactéries peuvent être administrées à raison d'une dose de 107 à 1011 unités formant des colonies (CFU) par jour, quel que soit le poids de la personne ou de l'animal, préférentiellement une dose de 109 à 1012 CFU par jour est administré, plus préférentiellement une dose égale à 109 CFU. En particulier, la dose comprend au moins une bactérie choisie parmi Christensenella timonensis, Christensenella minuta, Christensenella massiliensis et/ou leurs mélanges. Préférentiellement il s'agit d'une dose unique, c'est-à-dire administrée en une seule fois ou une dose avant chaque repas soit trois fois par jour.
[0048] Préférentiellement, la bactérie de la famille des Christensenellacées, en particulier du genre Christensenella est utile dans le traitement d'au moins une maladie inflammatoire chronique choisie parmi les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin, les maladies inflammatoires chroniques du foie, les maladies inflammatoires chroniques du pancréas, les polyarthrites, les dermatites atopiques, les maladies neuro-inflammatoires, de la bronchopneumopathie chronique obstructive. En particulier, elle présente un effet dans la prévention et/ou le traitement d'au moins une maladie choisie parmi la maladie de Crohn, la recto-colite hémorragique, la pochite, la colite ulcéreuse, la maladie cœliaque, la gastrite auto-immune, les hépatites, la stéatohépatite non alcoolique, la cholangite sclérosante primitive, la pancréatite, la polyarthrite rhumatoïde, la polyarthrite psoriatique, le psoriasis, l'eczema.
[0049] En outre, la bactérie de la famille des Christensenellacées, en particulier du genre Christensenella est utile dans le traitement d'au moins une maladie gastro-intestinale inflammatoire tel qu'une affection intestinale inflammatoire, plus particulièrement une affection intestinale inflammatoire colique. Par « affection » on entend au sens de l'invention une maladie, une pathologie. Ladite affection intestinale inflammatoire colique peut, en particulier, être choisie dans le groupe constitué de la maladie de Crohn, de la recto-colite hémorragique et de la pochite, en particulier dans le groupe constitué de la maladie de Crohn et de la recto-colite hémorragique.
[0050] En outre, la bactérie de la famille des Christensenellacées, en particulier du genre Christensenella est utile dans le traitement d'une maladie proliférative choisie parmi les lymphomes, les glioblastomes, les myélomes, les leucémies, les cancers colorectaux, les cancers du sein, de la prostate, de l'ovaire, de l'utérus, du pancréas, des poumons, du foie, de la vésicule biliaire et des reins.
[0051] La ou les bactéries utiles selon l'invention sont des bactéries du genre Christensenella. Il peut s'agir en particulier de Christensenella massiliensis, Christensenella timonensis, Christensenella intestinihominis, et/ou Christensenella minuta. Selon une variante particulièrement adaptée, il s'agit de Christensenella minuta.
[0052] Ces bactéries peuvent être isolées à partir de selles humaines par exemple selon les protocoles publiés par Morotomi et al. 2012 {Morotomi, M., Nagai, F. & Watanabe, Y. Description of Christensenella minuta gen. nov., sp. nov., isolated from human faeces, which forms a distinct branch in the order Clostridiales, and proposai of Christensenellaceae fam. nov. INTERNATIONAL JOURNAL OF SYSTEMATIC AND EVOLUTIONARY MICROBIOLOGY 62, 144-149 (2012)) et NDongo et al. 2016 (Ndongo, S., Dubourg, G., Khelaifia, S., Fournier, P. E. & Raoult, D. Christensenella timonensis, a new bacterial species isolated from the human gut. New Microbes and New Infections 13, 32-33 (2016)). Ces documents décrivent également les méthodes de culture des bactéries utiles selon l'invention. [0053] Eventuellement, lesdites bactéries sont disponibles et accessibles dans la collection des microorganismes et cultures cellulaires allemande GmbH, en particulier sous les numéros de dépôt DSM 22607, DSM 102344, DSM 102800.
[0054] Composition selon l'invention.
[0055] La ou les bactéries utiles selon l'invention, pour leur utilisation précédemment décrite, sont préférentiellement administrées dans une composition. Ladite composition comprenant, dans un milieu physiologiquement acceptable, au moins la ou les bactérie(s) utile(s) et/ou leur surnageant.
[0056] Ainsi, l'invention a également pour objet une composition comprenant au moins une bactérie du genre Christensenella dans la prévention et/ou le traitement de maladies inflammatoires chroniques et/ou de maladies gastro-intestinales inflammatoires et/ou de cancers, chez l'être humain ou l'animal, préférentiellement chez des personnes ou des animaux présentant une hyperproduction d'interleukine 6.
[0057] En particulier, l'invention permet de fournir une quantité efficace de bactéries de la famille des Christensenellacées, telles que Christensenella massiliensis, Christensenella timonensis, Christensenella intestinihominis et/ou Christensenella minuta, pour une utilisation dans le traitement :
- des maladies associées à une augmentation de l'interleukine 6 telles qu'un trouble inflammatoire, un trouble allergique, un trouble auto-immun, un trouble de rejet de greffe, l'athérosclérose, l'ostéoporose, une douleur neuropathique, une septicémie, la maladie de Castleman, un état fibrotique, l'arthrite rhumatoïde, l'arthrite rhumatoïde juvénile, l'arthrite psoriasique, l'arthrose, l'arthrite rhumatoïde réfractaire, l'arthrite non rhumatoïde chronique ou la spondylarthrite ankylosante,
- des maladies associées à une augmentation de l'interleukine 8 telles que la dermatite atopique, l'arthrose, la polyarthrite rhumatoïde, les maladies inflammatoires de l'intestin, la maladie de Crohn, la colite ulcéreuse, l'accident vasculaire cérébral, le choc septique, le choc endotoxique, le psoriasis, la septicémie à Gram négatif, le syndrome de choc toxique, les lésions de reperfusion rénale, la glomérulonéphrite, la thrombose, la réaction du greffon contre l'hôte, rejets d'allogreffes, paludisme, resténose, angiogenèse, athérosclérose, ostéoporose, gingivite et libération indésirable de cellules souches hématopoïétiques, maladies causées par des virus respiratoires, le virus de l'herpès et des virus de l'hépatite, méningite, encéphalite herpétique, vascularite du SNC, lésions cérébrales traumatiques, tumeurs du SNC, hémorragie sous-arachnoïdienne, traumatisme post-chirurgical, mucoviscidose, prurit, pneumonie interstitielle, hypersensibilité, arthrite cristalline, arthrite de Lyme, fibrodysplasie ossifiante progressive, pancréatite aiguë et chronique, entérocolite nécrosante, sinusite chronique, uvéite, polymyosite, vascularite, acné, ulcères gastriques et duodénaux, maladie cœliaque, lupus, et/ou
- des maladies associées à une baisse de l'interleukine 10 ou pouvant être traitées en augmentant l'interleukine 10 telles que les maladies auto-immunes, le rejet de greffes d'organes et de moelle osseuse, la maladie du greffon contre l'hôte, les infections parasitaires, les granulomes, la maladie de Crohn, la colite, la pancréatite, les maladies inflammatoires des poumons, les maladies inflammatoires des yeux, la dermatite atopique et la rhinite.
[0058] Selon un mode de réalisation, l'invention concerne une composition pour son utilisation dans le traitement et/ou la prévention de maladies inflammatoires chroniques et/ou de maladie gastro-intestinales inflammatoires et/ou de cancers chez un être humain ou un animal, ladite composition comprenant, dans un milieu physiologiquement acceptable (i) au moins bactérie du genre Christensenella, et/ou (ii) un surnageant de culture d'au moins une bactérie du genre Christensenella.
[0059] La présente invention concerne également une composition pour son utilisation dans le traitement et/ou la prévention d'une maladie gastro-intestinale inflammatoire chez un individu, ladite composition comprenant, dans un milieu physiologiquement acceptable
(i) au moins une souche bactérienne choisie dans le groupe constitué de Christensenella timonensis, Christensenella minuta et/ou leurs mélanges,
et/ou
(ii) un surnageant de culture d'au moins l'une quelconque de ces souches bactériennes et/ou leurs mélanges.
[0060] Selon l'un des quelconques modes de réalisation précédents, la présente composition peut être administrée à un être humain souffrant de maladies inflammatoires chroniques et/ou de maladies gastro-intestinales inflammatoires et/ou de cancers, ledit être humain possédant un indice de masse corporel (IMC) inférieur à 25, en particulier ladite composition est administrée à un être humain souffrant de maladies gastro-intestinales inflammatoires. [0061] Par « IMC inférieur à 25 », on désigne un IMC strictement inférieur à 25, plus particulièrement un IMC inférieur ou égale à 24,9. Selon l'un quelconque de ces modes de réalisation, ledit être humain peut en particulier posséder un IMC inférieur à 25 et supérieur ou égal à 18,5.
[0062] Préférentiellement, ladite composition selon l'invention est caractérisée en ce que la bactérie du genre Christensenella est choisie parmi Christensenella massiliensis, Christensenella timonensis et/ou Christensenella minuta et/ou Christensenella intestinihominis et/ou leurs mélanges. Il peut s'agir en particulier d'un mélange de Christensenella massiliensis et Christensenella timonensis ou Christensenella massiliensis et Christensenella minuta ou Christensenella massiliensis et Christensenella intestinihominis ou Christensenella timonensis et Christensenella minuta ou Christensenella timonensis et Christensenella intestinihominis ou Christensenella minuta et Christensenella intestinihominis ou Christensenella massiliensis, Christensenella timonensis et Christensenella minuta ou Christensenella massiliensis, Christensenella timonensis et Christensenella intestinihominis ou Christensenella timonensis et Christensenella minuta et Christensenella intestinihominis ou Christensenella massiliensis, Christensenella minuta et Christensenella intestinihominis ou Christensenella massiliensis, Christensenella timonensis et Christensenella minuta et Christensenella intestinihominis.
[0063] Selon l'un quelconques des modes de réalisation précédents, la composition peut être utilisée chez un individu non déficient en Christensenella dans le microbiote intestinal, en particulier chez un être humain ou un animal dont le genre Christensenella représente au moins 0,01 % en nombre du total des genres bactériens de son microbiote intestinal.
[0064] La ou les bactéries sont présentes dans une quantité efficace dans la composition permettant un effet sur les maladies chroniques inflammatoires et/ou les maladies gastro intestinales inflammatoires et/ou les cancers dont sont atteints les personnes ou les animaux traités. Par « personne », on entend un individu en particulier un être humain ou un animal.
[0065] Préférentiellement, la composition utile selon l'un des quelconques modes de réalisation précédent comprend 106 à 1012 unités formant des colonies (CFU) de bactéries du genre Christensenella par dose quotidienne à administrer de ladite composition. Préférentiellement cela correspond à une dose quotidienne de bactéries à administrer, quel que soit le poids de la personne ou de l'animal. De façon préférée, cette dose est administrée en une seule fois. En particulier la composition utile comprend 107 à 1011 CFU de bactéries du genre Christensenella par dose quotidienne à administrer, de préférence 109 CFU. En particulier lesdites bactéries présentes dans la composition peuvent être d'une même espèce, d'un mélange d'espèces ou d'un mélange de souches bactériennes. La composition utile selon l'invention peut être sous forme liquide. Elle peut notamment comprendre des bactéries de la famille des Christensenellacées, en particulier du genre Christensenella et/ou un milieu de culture desdites bactéries qui permet de les conserver, comme par exemple préférentiellement le milieu Columbia agar anaérobique enrichi en sang de mouton, ou un milieu équivalent ne contenant pas de produit dérivé d'origine animale. Par « milieu de culture » on entend au sens de la présente invention, le surnageant de culture dans lequel les bactéries ou les souches bactériennes ont séjourné lors de leur culture, ou milieu extracellulaire.
[0066] Selon une variante, la composition utile selon l'invention peut se présenter sous forme solide. Dans ce cas les bactéries peuvent être présentes sous forme lyophilisée, et peuvent comprendre également des excipients tels que par exemple la cellulose microcrystalline, le lactose, le saccharose, le fructose, le lévulose, les amidons, le stachyose, le raffinose, l'amylum, le lactate de calcium, le sulfate de magnésium, le citrate de sodium, le calcium stéarate, la polyvinylpyrrolidone, la maltodextrine, les galactooligosaccharides, les fructooligosaccharides, les pectines, les béta-glucans, les lactoglobulines, les isomaltooligosaccharides, les polydextroses, le sorbitol et/ou le glycérol.
[0067] Les compositions utiles selon l'invention peuvent se présenter sous forme de poudre, de poudre microencapsulée, de gélule, de capsule, de comprimé, de pastille, de granulés, d'émulsion, de suspension, de suppositoire, d'un produit alimentaire, d'une boisson, d'un produit pharmaceutique, d'un nutraceutique, d'un additif alimentaire, d'un complément alimentaire ou d'un produit laitier.
[0068] Selon un mode de réalisation particulièrement adapté, elles peuvent se présenter sous une forme gastro-résistante, telles qu'un comprimé enrobé contenant des bactéries microencapsulées. Ladite composition peut ainsi être pourvue d'un enrobage résistant au suc gastrique, afin d'assurer que la bactérie de l'invention comprise dans ladite composition puisse traverser l'estomac endommagé. La libération de(s) la bactérie(s) peut ainsi se produire pour la première fois dans le tractus intestinal supérieur.
[0069] Plus particulièrement, la composition selon l'invention peut être comprise dans un complément alimentaire. Un complément alimentaire pour une administration par la voie orale peut être présent dans des capsules, des gélules, des capsules molles, des comprimés, des comprimés dragéifiés, des pilules, des pâtes, des pastilles, des gommes, des solutions ou émulsions buvables, un sirop ou un gel.
[0070] Un complément alimentaire selon la présente invention peut comprendre en outre un édulcorant, un stabilisant, un antioxydant, un additif, un agent aromatisant et/ou un colorant. La formulation de celui-ci est effectuée au moyen des procédés usuels pour produire des comprimés dragéifiés, des gélules, des gels, des hydrogels pour libération contrôlée, des émulsions, des comprimés ou des capsules.
[0071] Une composition selon la présente invention peut également être sous la forme d'une composition nutritionnelle. Une telle composition nutritionnelle selon la présente invention est sous la forme d'un yogourt, une barre de céréale, des céréales pour le petit-déjeuner, un dessert, un aliment congelé, une soupe, un aliment pour animaux de compagnie, une suspension liquide, une poudre, un comprimé, une gomme ou un bonbon.
[0072] Une composition selon la présente invention peut comprendre en outre au moins un ingrédient choisi parmi : des antioxydants, des huiles de poisson, DHA, EPA, des vitamines, des minéraux, des phytonutriments, une protéine, un lipide, des probiotiques et des combinaisons de ceux-ci. Les bactéries selon l'invention seules ou comprises dans la composition selon l'un quelconque des modes de réalisation précédents peuvent être utilisées vivantes, semi-actives, inactivées, ou mortes, préférentiellement sous une forme vivante. Les bactéries sous forme semi-actives, inactivées, ou mortes peuvent l'être par exemple par irradiation, inactivation thermique ou lyophilisation, en particulier par la chaleur, l'exposition à un pH approprié, aux UV, aux rayons gamma, aux rayons X ou à la mise sous haute pression. Le terme " semi-active " désigne ainsi une bactérie à faible activité physiologique dont la capacité à proliférer est réduite, temporairement ou définitivement. Le terme « inactivé » désigne une bactérie qui n'est plus capable, temporairement ou définitivement, de proliférer. Le terme « morte » désigne une bactérie qui n'est plus capable, définitivement, de proliférer. Les bactéries mortes ou inactivées peuvent avoir les membranes cellulaires intactes ou rompues. Ainsi le terme « inactivé » désigne également les extraits et lysats de bactéries obtenues.
[0073] Une bactérie selon l'invention seules ou dans la composition selon l'invention peut être mise en oeuvre sous forme entière, c'est-à-dire pour l'essentiel dans sa forme native, ou sous forme d'extraits ou de lysats comprenant des fractions et/ou des métabolites de ce microorganisme. Un tel lysat peut désigner l'intégralité du lysat obtenu par lyse ou seulement une fraction de celle-ci et peut être préparé selon une des méthodes classiques bien connues de l'homme du métier telles que par exemple un choc thermique, par ultrasons, un choc osmotique, ou sous contrainte mécanique, telle que par centrifugation. Elles peuvent être toutes vivantes, toutes semi-actives, toutes inactivées ou toutes mortes. En particulier, il peut s'agir d'un mélange de bactéries vivantes, semi-actives, inactivées et mortes.
[0074] Préférentiellement, au moins une partie des bactéries sont vivantes, en particulier au moins 50% (en nombre), encore plus préférentiellement au moins 90% (en nombre).
[0075] Ainsi, selon un mode de réalisation adapté, les bactéries présentes dans la composition utile selon l'invention sont pour au moins 50% des bactéries vivantes (en nombre), préférentiellement pour au moins 90% des bactéries vivantes (en nombre), encore plus préférentiellement toutes vivantes.
[0076] Les conditions de conservation selon l'invention se présentent pour des formulations liquides sous la forme d'un produit congelé maintenu à -20°C dans un sachet hermétique. Pour les formulations solides, les conditions de conservation selon l'invention comprennent une capsule ou un enrobage hermétique à la lumière et à l'oxygène maintenu à une température ambiante comprise entre 15°C et 40°C et un taux d'humidité compris entre 3% et 70%.
[0077] Une composition selon l'un quelconque des modes de réalisation précédents est prévue pour le tube digestif, en particulier l'intestin. Par conséquent, les bactéries utiles selon l'invention, et en particulier les compositions l'incluant, peuvent être administrées par voie orale, topique, inhalée ou rectale, préférentiellement rectale ou intrarectale.
[0078] En particulier, une administration rectale ou intrarectale est conduite sous la forme d'un suppositoire, un lavement ou une mousse.
[0079] Les inventeurs ont également déterminé, de manière surprenante, la capacité de souches de Christensenella à augmenter les propriétés anti-inflammatoires d'une souche d 'Akkermonsio, et en particulier de la souche Akkermansia muciniphila. Ainsi, les inventeurs ont mis en évidence l'existence d'un effet synergique d'une association d'une souche de Christensenella (ou d'un surnageant de culture d'une telle souche) et d'une souche d 'Akkermansia (ou d'un surnageant de culture d'une telle souche) sur la prévention et/ou le traitement d'une inflammation gastro-intestinale, et en particulier l'effet synergique d'une association d'une souche de Christensenella minuta et/ou de Christensenella timonensis (ou de surnageants de culture de telles souches) et d'une souche d'Akkermansia muciniphila (ou d'un surnageant de cette souche) sur la prévention et/ou le traitement d'une inflammation gastro-intestinale.
[0080] Ainsi, selon l'un quelconque des modes de réalisation précédent, la composition peut comprendre en outre :
(i) au moins une bactérie additionnelle de la famille Verrucomicrobiaceae ; et/ou
(ii) un surnageant de culture de ladite bactérie additionnelle.
[0081] Préférentiellement, la bactérie additionnelle de la famille Verrucomicrobiaceae est une bactérie du genre Akkermansia, plus particulièrement de l'espèce Akkermansia muciniphila. Par bactérie de l'espèce « Akkermansia muciniphila » on entend au sens de l'invention également la bactérie dénommé « Akkermansia municiphila ».
[0082] Selon un mode de réalisation, la bactérie et la bactérie additionnelle telles que mentionnées ci-dessus sont, indépendamment l'une de l'autre, sous une forme vivante, semi- active, inactivée et/ou morte, et sont en particulier sous une forme vivante.
[0083] Dans certains modes de réalisation, une composition selon l'invention est adaptée pour l'administration d'une dose journalière représentant de 107 à I011 unités formant des colonies (UFC), de préférence une dose journalière équivalente à 109 UFC, d'une bactérie de la famille Verrucomicrobiaceae, en particulier du genre Akkermansia, plus particulièrement d'une bactérie Akkermansia muciniphila.
[0084] Dans le cas de la mise en œuvre d'un surnageant de culture de l'une quelconque des bactéries susmentionnées, une composition selon l'invention peut notamment en comprendre une teneur comprise entre 0,1 et 99 % en poids, notamment de 10 à 90 % en poids, en particulier de 25 à 70 % en poids et plus particulièrement de 30 à 50 % en poids, par rapport au poids total de la composition.
[0085] Ainsi, une composition selon l'un quelconque des modes de réalisation susmentionnés peut comprendre une teneur comprise entre 0,1 et 99 % en poids, notamment de 10 à 90 %, en particulier de 25 à 70 % en poids, plus particulièrement de 30 à 50 % en poids, de surnageant par rapport au poids total de la composition.
[0086] Les compositions utiles selon l'invention, en plus des bactéries utiles selon l'invention peuvent comprendre au moins un probiotique, et/ou au moins un prébiotique.
[0087] Les compositions utiles selon l'invention, en plus des bactéries utiles selon l'invention peuvent comprendre d'autres composés, tels que : - au moins un probiotique, et/ou
- au moins une bactérie produisant de l'acide lactique qui permet de créer un environnement anaérobique favorable aux Christensenellacées telle qu'au moins une bactérie choisie parmi les bactéries du genre Lactobacillus spp., Bifidobacterium spp., Streptococcus spp. et/ou au moins un autre organisme favorisant les conditions anaérobiques nécessaires à la survie des Christensenellacées telle qu'au moins une levure choisie parmi des Saccharomyces spp. ou des micro-organismes de la famille des Methanobacteriaceae et/ou
- au moins une bactérie associée à l'écosystème des Christensenellacées car elles facilitent leur survie dans l'intestin telle qu'au moins une bactérie choisie parmi les bactéries du phylum Firmicutes, Bacteroidetes, Actinobacteria, Tenericutes, et Verrucomicrobia, et/ou
- au moins une bactérie choisie parmi les bactéries de l'ordre des Clostridales, des Verrucomicrobiales, des Aeromonadales, des Alteromonadales , ML615J-28, RF32, YS2, de la famille des Clostridiacées, des Lachnospiracées, des Ruminococcacées, des Bacteroidacées, des Enterococcacées, des Rikenéllacées, des Dehalobactériacées, des Veillonellacées et/ou
- au moins une bactérie choisie parmi les bactéries du genre Faecalibacterium, Akkermansia, Eubacterium et Oscillospira telle que par exemple Faecalibacterium prausnitzii, Akkermansia muciniphila, Eubacterium halii, Oscillospira guilliermondii., et/ou
- au moins un prébiotique tel que par exemple au moins un prébiotique choisi parmi les galactooligosaccharides, les fructooligosaccharides, les inulines, les arabinoxylans, les béta- glucanes, les lactoglobulines et/ou les béta-caséines, et/ou
- au moins un polyphénol tel que par exemple au moins un polyphénol choisi parmi la quercetin, le kaempferol, le resvératrol, les flavones (comme la lutéoline), les flavan-3-ols (comme les catéchines), les flavanones (comme la narinénine), les isoflavones, les anthocyanidines, les proanthocyanidines, et/ou
- au moins un minéral et/ou au moins une vitamine et/ou au moins un agent nutritionnel, et/ou
- au moins un principe actif pharmaceutique préférentiellement choisi parmi les anti inflammatoires non stéroïdien, les anticorps dirigés contre des cibles pro-inflammatoires (anti-TNFalpha), les antirhumatismaux, les analgésiques, les antimicrobiens, les corticostéroïdes, les anaboliques stéroïdiens, les antidiabétiques, les agents thyroïdiens, les antidiarrhéiques, les antitussifs, les antiémétiques, les anti ulcères, les laxatifs, les anticoagulants, l'érythropoïétine, les immunoglobulines, les immunosuppresseurs, les hormones de croissance, les médicaments hormonaux, les modulateurs des récepteurs aux œstrogènes, les agents alkylant, les antimétabolites, les inhibiteurs mitotiques, les radiopharmaceutiques, les anti-dépresseurs, les antipsychotiques, les anxiolytiques, les hypnotiques, les sympathomimétiques, les stimulants, le donepezil, la tacrine, les médicaments pour l'asthme, les bêta-agonistes, les stéroïdes inhalés, les inhibiteurs de leucotriène, les cromoglycates ou acides cromoglycidiques, l'épinéphrine, la dornase alpha, les cytokines, les antagonistes de cytokines.
[0088] Selon un dernier objet, la présente invention concerne une composition comprenant, dans un milieu physiologiquement acceptable :
(I) (a) au moins une bactérie choisie dans le groupe constitué de Christensenella timonensis, Christensenella minuta, Christensenella massiliensis, Christensenella intestinihominis, et/ou leurs mélanges ;
et/ou
(b) au moins un surnageant de culture d'au moins une bactérie choisie dans le groupe constitué de Christensenella timonensis, Christensenella minuta, Christensenella
massiliensis, Christensenella intestinihominis, et/ou leurs mélanges;
et
(II) (a) au moins une bactérie additionnelle du genre Akkermansia, plus particulièrement de l'espèce Akkermansia muciniphila ;
et/ou
(b) au moins un surnageant de culture d'au moins une bactérie additionnelle du genre Akkermansia, plus particulièrement de l'espèce Akkermansia muciniphila.
[0089] Méthode de prévention et/ou traitement.
[0090] Selon un autre aspect, la présente invention se rapporte à une méthode pour réduire et/ou prévenir l'inflammation chez un individu en ayant besoin, comprenant l'administration d'une quantité effective d'une bactérie de la famille Christensenellacées audit individu, en particulier une bactérie de l'espèce Christensenella.
[0091] L'invention concerne également une méthode pour réduire le niveau d'IL-6 et/ou stabiliser le niveau d'IL-6 et/ou prévenir une augmentation du niveau d'IL-6 chez un individu en ayant besoin, comprenant l'administration d'une quantité effective d'une bactérie de la famille Christensenellacées audit individu, en particulier une bactérie de l'espèce Christensenella. Préférentiellement, ledit individu présentant des taux sériques élevés d'IL-6 avant le traitement. En particulier, lesdits taux sériques élevés d'IL-6 sont supérieurs à 5 pg/ml, supérieur à 10 pg/ml, supérieur à 20 pg/ml, supérieurà 30 pg/ml, supérieur à 40 pg/ml, supérieur à 50 pg/ml, supérieur à 70 pg/ml, supérieur à 90 pg/ml ou supérieur à 100 pg/ml.
[0092] L'invention concerne également une méthode pour réduire le niveau d'IL-8 et/ou stabiliser le niveau d'IL-8 et/ou prévenir une augmentation du niveau d'IL-8 chez un individu en ayant besoin, comprenant l'administration d'une quantité effective d'une bactérie de la famille Christensenellacées audit individu, en particulier une bactérie de l'espèce
Christensenella. Préférentiellement, ledit individu présentant des taux sériques élevés d'IL-8 avant le traitement. En particulier, lesdits taux sériques élevés d'IL-8 sont supérieurs à 5 pg/ml, supérieur à 10 pg/ml, supérieur à 20 pg/ml, supérieurà 30 pg/ml, supérieur à 40 pg/ml, supérieur à 50 pg/ml, supérieur à 70 pg/ml, supérieur à 90 pg/ml ou supérieur à 100 pg/ml.
[0093] L'invention concerne également une méthode pour augmenter le niveau d'IL-10 et/ou stabiliser le niveau d'IL-10 et/ou prévenir une diminution du niveau d'IL-10 chez un individu en ayant besoin, comprenant l'administration d'une quantité effective d'une bactérie de la famille Christensenellacées audit individu, en particulier une bactérie de l'espèce
Christensenella. Préférentiellement, ledit individu présentant des taux sériques faibles d'IL-10 avant le traitement. En particulier, lesdits taux sériques faibles d'IL-10 sont inférieurs à 15 pg/ml, inférieur à 10 pg/ml ou inférieur à 5 pg/ml.
[0094] En outre, l'invention concerne une méthode pour réduire le niveau de kynurenine et/ou stabiliser le niveau de kynurenine et/ou prévenir une augmentation du niveau de kynurenine chez un individu en ayant besoin, comprenant l'administration d'une quantité effective d'une bactérie de la famille Christensenellacées audit individu, en particulier une bactérie de l'espèce Christensenella. Préférentiellement, ledit individu présentant des taux élevés de kynurénine fécale avant le traitement.
[0095] L'invention concerne également une méthode de traitement et/ou de prévention d'un cancer associé à une inflammation chez un individu en ayant besoin, comprenant l'administration d'une quantité effective de la bactérie Christensenellacées audit individu.
[0096] La méthode selon la présente invention permet de réduire le niveau d'au moins un des marqueurs de l'inflammation cité ci-avant chez ledit individu, ledit marqueur étant préférentiellement réduit dans le sérum, le sang ou les selles. [0097] Préférentiellement, les présentes méthodes sont mises en oeuvre chez un individu souffrant d'une ou plusieurs maladies précédemment décrites dans la description. Ledit individu étant préférentiellement un être humain.
[0098] Préférentiellement, la bactérie Christensenella comprend un gène d'ARN ribosomique 16S présentant une identité de séquence d'au moins 50%, d'au moins 60%, d'au moins 70%, d'au moins 80% ou, de préférence, d'au moins 90% avec un gène d'ARN ribosomique 16S de Christensenella minuta, Christensenella massiliensis, ou Christensenella timonensis, plus préférablement encore, au moins 97 % d'identité de séquence avec une séquence choisie parmi les SEQ ID NO : 1, 2, B, 4, 5 ou 6.
[0099] La SEQ ID NO: 1 est une séquence du gène d'ARN ribosomal 16S de la bactérie Christensenella minuta DSM 22607, qui a été isolée à partir d'un échantillon fécal humain. La séquence d'ARNr 16S de C. minuta est identifiée par le numéro d'accès Genbank AB490809. La SEQ ID NO: 2 est une partie de la séquence du gène d'ARN ribosomal 16S de la bactérie Christensenella minuta DSM 22607. Des séquences 16S supplémentaires pour les bactéries du genre de Christensenella sont fournies telles que les SEQ ID NOS: 3-6 (numéros OTU 701845, 177179, 1146771, et 361793 dans la base de données Greengenes, respectivement). L'identité de chaque séquence par rapport à SEQ ID NO: 1 est la suivante: SEQ ID NO: 3, 93% d'identité avec SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 4, 95% d'identité avec SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 5, 97% d'identité avec SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 6, 95% d'identité avec SEQ ID NO: 1.
[0100] En particulier, lesdites méthodes comprennent l'administration d'au moins une bactérie ou composition selon la présente invention caractérisé par l'un des quelconques mode de réalisation décrits précédemment, tel que le mélange ou non des bactéries, la quantité administrée, la quantité de bactéries viables, les composants supplémentaires, par exemple des principes actifs pharmaceutiques, des prébiotiques ou probiotiques, des vitamines, minéraux, agents nutritionnels, autres micro-organismes, la formulation particulière de ladite composition, par exemple, poudre, gélule etc.
[0101] Bien entendu, les présentes méthodes comprennent l'administration orale, inhalée, topique, rectale ou intrarectale d'une quantité suffisante.
[0102] L'invention est à présent illustrée par des exemples de bactéries utiles selon l'invention, de procédés de cultures de ces bactéries, des exemples de compositions les contenant et des résultats d'essais démontrant l'efficacité de l'invention qui sont présentés à titre d'illustration uniquement.
[0103] EXEMPLES
[0104] Exemple 1 : Christensenella minuta.
Christensenella minuta peut-être cultivée selon le protocole opératoire décrit en suivant.
1/ Dissoudre un milieu RCM ("Reinforced Clostridial Medium" milieu clostridiale renforcé) déshydraté dans de l'eau distillée
2/ Ajouter 0,5 mL/L de solution de résazurine-Na (0,1% p/v)
3/Porter à ébullition et refroidir à température ambiante tout en injectant un mélange gazeux à 80% de N2 et à 20% de CO2
4/Etaler le milieu sous la même atmosphère gazeuse dans des tubes de type Hungate anoxiques ou dans des flacons de sérum puis autoclaver
5/Avant utilisation, ajoutez 1,0 g de carbonate de sodium par litre à partir d'une solution mère anoxique stérile préparée avec un mélange gazeux à 80% de N2 et à 20% de CO2 6/ Vérifier le pH du milieu après autoclavage et ajuster le pH entre 7,3 et 7,5, en utilisant une solution mère anoxique stérile de bicarbonate de sodium (5% p / v) préparée dans une atmosphère gazeuse à 80% de N2 et à 20% de CO2.
[0105] Exemple 2 : Christensenella massiliensis.
Christensenella massiliensis peut-être cultivée selon le protocole opératoire décrit en suivant.
[0106] 1/Préparer un milieu carboxyméthylcellulose (N2 / CO2) en suivant les instructions suivantes fournies par DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen).
[0107] [Tableau 1]
[0108] 2/Dissoudre les différents constituants listés dans le tableau ci-dessus, sauf la cystéine, les carbohydrates et le carbonate.
B/Faire bouillir le milieu pendant 1 min, puis le laisser refroidir à la température ambiante sous une atmosphère gazeuse à 80% de ISh et à 20% de CO2.
4/ Ajouter 0,5 g/L de L-cystéine-HCI x H2O et le verser sous la même atmosphère gazeuse dans des tubes de type Hungate (pour les souches exigeant des particules de viande, introduire celles-ci en premier dans le tube, utiliser 1 partie de particules de viande pour 4 ou 5 parties de liquide).
5/ Autoclavage à 121°C pendant 20 min.
6/ Après autoclavage, ajouter le glucose, le cellobiose, le maltose et l'amidon provenant de solutions mères anoxiques stériles préparées à 100% de gaz N2 et de carbonate à partir d'une solution mère anoxique stérile préparée sous des mélanges gazeux à 80% de N2 et 20% de C02.
7/ Ajuster le pH du milieu à 7, si nécessaire.
Préparation du Filtrat de viande :
[0109] [Tableau 21
[0110] Utiliser du bœuf maigre ou de la viande de cheval.
Enlever la graisse et le tissu conjonctif avant de hacher.
Mélanger la viande, l'eau et NaOH, puis faire bouillir pendant 15 min sous agitation.
Laisser refroidir à la température ambiante, retirer la graisse de la surface et filtrer, en retenant les particules de viande et le filtrat.
Ajouter au filtrat de l'eau jusqu'à un volume final de 1000,0 ml.
Les bactéries doivent être cultivées en condition anaérobie à 37°C. [0111] Exemple 3 : Christensenella timonensis
Christensenella timonensis peut-être cultivée selon le même protocole opératoire que celui décrit à l'exemple 2 pour Christensenella massiliensis.
[0112] Exemple 4 : Souches particulière selon l'invention
Toutes les souches décrites ci-après ont été obtenues auprès de la collection allemande DSMZ (Institut Leibnitz DSMZ). Christensenella minuta DSM 22607, Christensenella timonensis DSM 102800 et Akkermansia municiphila DSM 22959 ont été cultivées à 37°C dans un milieu YBHI [milieu de perfusion cerveau-coeur complété avec 0.5 % d'extrait de levure (Difco)] additionné de cellobiose (1 mg/ml ; Sigma), de maltose (1 mg/ml ; Sigma), de cystéine (0,5 mg/ml ; Sigma) et de mucine (1 mg/ml ; Sigma) dans une chambre anaérobie remplie avec N = 85%, C02 =10% et H = 5%.
[0113] Exemple 5 : Composition utile sur la base de surnageants
Un exemple de composition utile selon l'invention est une composition comprenant entre 0,1 et 95% de surnageant de culture des souches Christensenella minuta DSM 22607, Christensenella timonensis DSM 102800 et Akkermansia municiphila DSM 22959.
[0114] Exemple 6 : Composition utile selon l'invention sous forme liquide
Un exemple de composition utile selon l'invention sous forme liquide est une composition comprenant Christensenella minuta 109 CFU/mL dans le milieu de culture RCM anaérobie décrit ci-dessus modifié pour ne contenir aucun produit d'origine animale et enrichi en glycérol 5%.
La composition de l'exemple 6 est obtenue à partir d'une RCB (« research cell bank » banque de cellules de recherche) préparée à base de Christensenella minuta 1010 CFU/mL puis conservée congelée à -20°C dans un sachet hermétique à l'oxygène.
La composition congelée doit être réchauffée à température ambiante jusqu'à retrouver une forme liquide avant utilisation.
[0115] Exemple 7 : Composition utile selon l'invention sous forme solide
[0116] Un exemple de composition utile selon l'invention sous forme lyophilisée peut être obtenu par lyophilisation de la composition de l'exemple 6 à l'état congelé.
[0117] RESULTATS D'ESSAIS DEMONTRANT L'EFFET DE L'INVENTION
[0118] 1. Démonstration de l'effet anti-inflammatoire de bactéries christensenella in vitro
(kynurénine). [0119] L'objectif de cette étude est de démontrer l'effet anti-inflammatoire in vitro de bactéries christensenella selon l'invention. La démonstration de cet effet a été réalisée sur la kynurénine, un marqueur connu de l'inflammation. Des feces humaines ont été prélevées et cultivées dans un fermenteur. L'abondance de Christensenella spp. a été corrélée avec l'abondance de kynurénine présente dans le fermenteur.
[0120] Le protocole opératoire de l'étude est décrit en suivant.
1/ Protocole de fermentation à partir de fèces d'origine humaine contenant du Christensenella spp. :
- Les donneurs ne devaient pas avoir pris d'antibiotiques durant les six mois précédents l'expérience et n'avoir aucun historique de désordres gastro-intestinaux. Les donneurs étaient âgés entre 18 et 60 ans.
- La collecte des échantillons frais de leur fèces est obtenue dans des contenants stériles en plastique, conservés dans des flacons anaérobies contenant un sachet de 2,51 d'AnaeroGen™ d'Oxoid™ (O2 <0.1%; CO2: 7-15%). Ces échantillons ont été apportés au laboratoire dans les deux heures après leur production.
- Les échantillons de fèces ont été dilués au 1/5 (poids/volumes) dans une solution saline tamponnée au phosphate (IM) (PBS), pH 7,4. La suspension a été homogénéisée dans un stomacher pendant 120 secondes.
- Milieu nutritif de base: le milieu nutritif de base a été préparé à partir de 2g/L de bouillon de tryptone de soja, 2g/L d'extrait de levure, 0,lg/L de NaCI, 0,04g/L de K2HPO4, 0,01g/L de MgS03.7H20, 0,01g/L de CaCI2.6H20, 2g/L NaHCOs, 0,5g/L de L-cystine HCl, 2m L/L de tween 80, 10pL/L de vitamine Kl, 0,05g/L d'hème, 0,05g/L de sels biliaires, 4ml/L de résazarin (pH7)
- Fermentation en biofermenteur : Les biofermenteurs de 20mL de contenance contenaient 18mL de milieu nutritif de base autoclavé (121°C pendant 15 minutes) et versé aseptiquement dans les biofermenteurs stériles. Ce système a été laissé au repos toute la nuit avec un bullage d'azote sans oxygène à travers le milieu à un taux de 2mL/min. Le pH était maintenu entre 6,7 et 6,9 en utilisant du HCl ou NaOH (0,5M). La température de chaque biofermenteur était contrôlée à 37°C et le contenu du récipient homogénéisé avec un mélangeur magnétique
- un mélange de protéines prédigérées (0,35g) a été ajouté dans les récipients avant l'inoculation avec 2mL d'inocula fécal à T0. Les protéines prédigérées ont été obtenues selon le protocole de digestion gastro-intestinale adapté de celui de Versantvoort et al (2005). - les échantillons ont été collectés avant la fermentation (T0) et après 48 heures de fermentation (T48), et congelés à -80°C jusqu'aux analyses.
2/ Quantification de la kynurenine
- 50 mί d'échantillons collectés et conservés à -80°C ont été mélangés avec 20 mί d'eau Milli- Q contenant des standards internes.
- Le mélange a été mélangé et filtré à travers un filtre de seuil 5-kDa pour retirer les macromolécules.
- Les métabolites ont été détectés par analyses en électrophorèse capillaire- spectrométrie de masse à temps de vol (CE-TOFMS). La limite de détection des pics a été déterminée sur la base du ratio signal/bruit, S/N=3.
Aire relative du pic = (aire du pic d'un métabolite)/(aire du pic du standard interne x quantité d'échantillon).
3/ Quantification de Christensenella spp.
- L'ADN contenu dans les échantillons a été extrait en utilisant le kit NucleoSpin®96 Soil de Macherey-Nagel selon les instructions du fabricant.
- L'ADN extrait total a ensuite été fragmenté aléatoirement en fragments de 350 bp puis utilisé pour construire une librairie en utilisant le kit NEBNext Ultra II par New England Biolabs selon les instructions du fabricant.
- La librairie a ensuite été séquencée en utilisant du séquençage paired-end de 2 x 150 bp sur une plateforme Illumina HiSeq.
- L'abondance des bactéries a été mesurée en créant un catalogue d'espèces métagénomiques (MGS) à partir d'un catalogue de référence contenant 22M de gènes. Ces MGS ont ensuite été associées à un niveau taxonomique adapté. Dans le cas des christensenella, celles-ci ont été détectées au niveau du genre et sont donc référencées dans cette expérience par Christensenella spp.
[0121] La quantité relative de kynurénine (par rapport à la quantité totale mesurée) et l'abondance relative de Christensenella spp. (par rapport à la quantité totale mesurée) ont été analysées et corrélées, obtenant une régression linéaire de R=-0,44 (n=18). Les résultats sont présentés dans le Tableau 3.
[0122] [Tableau 3]
[0123] 2. Démonstration de l'effet anti-inflammatoire de bactéries christensenella in vitro (IL-8)
[0124] L'objectif de cette étude est de démontrer l'effet anti-inflammatoire in vitro de bactéries selon l'exemple 4. La démonstration a été réalisée sur un des marqueurs de l'inflammation : l'interleukine 8 (IL-8).
[0125] L'étude est réalisée sur des cellules HT-29 obtenues comme suit :
Des cellules épithéliales du colon humain HT-29 (ATCC HTB-38) (LGC-Standars) ont été cultivées dans un milieu minimum essentiel de Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) (Sigma- Aldrich) complété avec 10% (p/v) de sérum fœtal bovin (FBS) thermo-activé (GibcoBRL, Eragny, France) et de pénicilline G/ streptomycine (5000 lU/mL, 5000 pg/ml) (Sigma-Aldrich). Les cultures de cellules ont été incubées dans des flacons de culture tissulaire de 25 cm2 (Nunc, Roskilde, Danemark) à 37 dans une atmosphère de CO2 à 5% (v/v) jusqu'à confluence.
[0126] Le protocole opératoire de l'étude est décrit en suivant.
[0127] Les cultures simples et les co-cultures composées des combinaisons entre les souches énumérées sont préparées au temps 0. A 24h, les échantillons bactériens sont centrifugés pendant 10 minutes à 6000 tr/min. Les surnageants ainsi obtenus sont conservés à -80°C afin de poursuivre l'analyse des propriétés immunomodulatrices in vitro.
[0128] Des tests anti-inflammatoires ont été effectués selon la procédure décrite par Kechaou et al., 2012 (Kechaou N et al. : Appl Environ Microbiol 2012, 79:1491-1499).
Spécifiquement, 50000 cellules HeLa ou HT-29 par puits ont été semées dans des plaques de culture de 24 puits (Nunc). Vingt-quatre heures avant la mise en contact bactérienne, le milieu de culture a été remplacé par un milieu contenant 5 % de FBS. Les expériences ont été entreprises le 7e jour après l'ensemencement, alors que les cellules étaient à la confluence (l,83xl06 cellules/puits). Vingt-quatre heures avant la co-culture bactérienne (jour 6), le milieu de culture a été remplacé par un milieu contenant 5% de FBS inactivé à la chaleur et 1% de glutamine. Le jour de la co-culture, 10 % de surnageant bactérien ont été ajoutés au DMEM dans un volume total de 500 pl. Les cellules ont été stimulées
simultanément avec du TNF-a humain (5 ng/ml ; Peprotech, NJ) pendant 6 h à 37°C dans 10% de CO2. Tous les échantillons ont été analysés en trois exemplaires. Après la co incubation, les surnageants cellulaires ont été prélevés et stockés à -80 °C jusqu'à ce que l'ELISA (Biolegend, San Diego, CA) effectue une analyse plus poussée des concentrations d'interleukine-8 (IL-8). Les expériences ont été faites au moins en trois exemplaires.
[0129] La Figure 1 représente la production d'IL-8 dans des cellules HT-29 stimulées par du TNF -a en présence de Christensenella minuta, Christensenella timonensis, Akkermansia muciniphila, Christensenella minuta + Akkermansia muciniphila et CChristensenella timonensis + Akkermansia muciniphila. Les résultats sont exprimés en IL-8 (pg/mL) et ont été normalisés en utilisant comme valeur de référence l'IL-8 produit après la co-incubation avec le PBS comme témoin négatif. Les résultats ont été analysés à l'aide d'un test de Kruskal Wallis suivi d'un test de comparaison multiple de Dunns (*p< 0,05 ; **p<0,01).
[0130] Le logiciel GraphPad (GraphPad Sofware, La Jolla, CA, USA) a été utilisé pour l'analyse statistique. Les résultats sont présentés sous forme de boîte à moustaches (min à max). Des comparaisons ont été réalisées avec le test non paramétrique de Kruskal-Wallis suivi d'une comparaison multiple de Dunn. Une valeur p inférieure à 0,05 a été jugée significative.
[0131] Les résultats sont décrits ci-après :
[0132] La souche de référence Akkermansia muciniphila DSM 22959 est bien connue pour ses propriétés immunomodulatrices et plus particulièrement pour ses effets anti-inflammatoires (Derrien M, Belzer C, de Vos WM. Microb Pathog. 2017 May; 106:171-181. doi: 10.1016/j. micpath.2016.02.005. Epub 2016 Feb 11). Pour déterminer si les souches de C Christensenella minuta DSM 22607 et Christensenella timonensis DSM 102800 sont capables de moduler la réponse immunitaire, les inventeurs ont testé in vitro les propriétés immunomodulatrices des surnageants des souches dans un modèle basé sur la capacité à bloquer la production de IL-8 (une cytokine pro-inflammatoire) induite par stimulation TNF-a dans des cellules épithéliales du colon HT-29.
[0133] Ainsi, les inventeurs ont observé que les deux souches sont capables de bloquer la production d'IL-8 de la même manière que notre témoin positif (Akkermansia muciniphila DSMZ 22959) (Figure 1).
[0134] Christensenella minuta DSM 22607 et Christensenella timonensis DSM 102800 augmentent les propriétés anti-inflammatoires d 'Akkermansia muciniphila DSMZ 22959 in vitro.
[0135] Afin de tester si les membres de Christensenella étaient capables d'augmenter les propriétés anti-inflammatoires d'autres membres du microbiote intestinal, des co-cultures avec Akkermansia muciniphila ont été réalisées. Comme le montre également la Figure 1, Christensenella minuta DSM 22607 et Christensenella timonensis DSM 102800 ont pu augmenter les propriétés anti-inflammatoires d 'Akkermansia muciniphila DSMZ 22959 d'une manière statistiquement significative.
[0136] 3. Démonstration de l'effet anti-inflammatoire de bactéries christensenella in vitro (IL-8).
[0137] L'objectif de cette étude est de démontrer l'effet anti-inflammatoire in vitro de bactéries selon l'invention. La démonstration a été réalisée sur un des marqueurs de l'inflammation : l'interleukine-8.
[0138] Le protocole opératoire de l'étude est décrit en suivant.
[0139] Lorsque les cellules HT-29 sont à confluence (environ 7 jours après ensemencement), le milieu complet (DMEM Glutamax + 10% SVF) est alors retiré pour être remplacé par du milieu à 5% de SVF (JO). A J+l, le milieu est enlevé. Deux milieux (DMEM Glutamax + 5% SVF +/- TNF-a) sont préparés. On ajoute alors 450pL/puits d'un des deux milieux puis 50pL des surnageants à tester. Après 6 heures de co-incubation, les surnageants sont récupérés et stockés à -80°C. Des dosages par ELISA de la chimiokine IL-8 sont alors réalisés (ELISA MAX Deluxe set Human IL-8 de Biolegend).
[0140] La Figure 2 représente le dosage de la chimiokine IL-8 sécrétée par les cellules HT-29 (adénocarcinomes du côlon) dans un état inflammatoire induit par le TNF-a. Différents surnageants de bactéries (C. minuta 1, C minuta 2, C. minuta B, C. minuta 4 et DSMZ, correspondant à la souche DSM22607) appartenant aux bactéries de l'espèce Christensenella minuta ont été testés afin d'évaluer leur capacité immunomodulatrice. Le milieu de culture bactérien (GAM) représente le contrôle permettant d'apprécier les effets des surnageants. L'expérience a été réalisée quatre fois en triplicat.
[0141] Toutes les souches de Christensenella minuta testées ont un effet immunomodulateur anti-inflammatoire (diminution de plus de 50% du niveau d'IL-8 sécrétée), ce qui permet de confirmer le potentiel anti-inflammatoire de Christensenella.
[0142] 4. Démonstration de l'effet de bactéries christensenella sur la perméabilité de la membrane épithéliale intestinale.
[0143] La Figure 3 représente la mesure de la résistance électrique trans-épithéliale prise sur cellules épithéliales Caco-2. Ces dernières en se différenciant établissent des jonctions entre elles (appelée les jonctions serrées) permettant de maintenir l'intégrité de cette barrière créée par les cellules, mimant la barrière intestinale présente dans notre tube digestif.
[0144] L'ajout de la cytokine TNF -a (Tumor Necrosis Factor) perturbe ces jonctions serrées, et alors augmente la perméabilité membranaire, favorisant par exemple des maladies inflammatoires ou infectieuses et diminuant ainsi le ratio TEER (groupe contrôle DMEM + TNF -a). Le groupe contrôle "DMEM -" représente les puits où seulement le milieu de culture cellulaire était présent, sans TNF -a ni bactérie.
[0145] La résistance électrique trans-épithéliale (TEER) est une méthode permettant de quantifier l'intégrité de la barrière d'un tissu épithélial en mesurant la résistance électrique à travers celui-ci. Les mesures TEER sont réalisées en plaçant des électrodes aux deux pôles d'une couche de cellules épithéliales ayant été cultivées sur une membrane semi-perméable. Les électrodes appliquent un courant alternatif permettant la mesure de la résistance électrique à travers la couche de cellules épithéliales. [0146] Le ratio TEER est obtenu par le calcul suivant :
TEER traitement t24
Ratio TEER : /TE ER traitement tO
TEER témoin t24
! TEER témoin tO
[0147] 7 jours après ensemencement de cellules Caco-2 (cellules épithéliales intestinales) dans des plaques Transwell, la TEER est mesurée à l'aide d'un automate (REMS). Les valeurs sont enregistrées et représentent notre valeur de départ (T0). Les cellules sont alors co- incubées en présence de bactéries (MOI 1/40) pendant 3 heures, le temps que celles-ci adhèrent aux cellules. Puis les cellules sont challengées avec du TNF-a induisant une perturbation de la couche de cellules épithéliales et notamment au niveau des jonctions serrées. 24h (T24) après l'ajout des bactéries, la TEER est de nouveau mesurée.
[0148] Cette figure nous montre que les bactéries Christensenella minuta influent sur l'intégrité de la barrière intestinale en améliorant la résistance trans-épithéliale, indiquant un potentiel effet sur les protéines de jonctions serrées et une diminution de la perméabilité intestinale. Les bactéries Christensenella minuta permettent donc de restaurer la résistance de la membrane épithéliale.
[0149] 5. Démonstration de l'effet anti-inflammatoire de bactéries christensenella in vivo
[0150] L'objectif de cette étude est de démontrer l'effet anti-inflammatoire in vivo sur souris, de bactéries selon l'invention. La démonstration a été réalisée sur des marqueurs majeurs de l'inflammation, deux cytokines : IL6 (interleukine 6) et TNF-a (facteur de nécrose tumorale- alpha). L'étude a été réalisée en aveugle : les expérimentateurs ne connaissaient pas les traitements afin que leurs connaissances antérieures n'influencent en aucun cas le résultat de l'étude.
[0151] Le protocole opératoire est décrit en suivant.
- Des souris mâles C57BL/6 âgées de quatre semaines ont été achetées auprès de Charles River (St Germain sur l'ArbresIe, France).
- Les souris ont eu une période d'acclimatation d'une semaine sur le régime à base d'une alimentation standard (« chow diet (SafeA04) ») avant de commencer l'étude.
- Le premier jour (D0), les animaux ont été soumis à un régime riche en graisses (« Research Diet D12451 » 45% kcal) et répartis aléatoirement en 2 groupes (n = 5 par groupe), chacun recevant soit une solution de 150 pL de Christensenella minuta (109 UFC/mL), soit une solution de contrôle constituée du milieu de culture utilisé pour la croissance des bactéries pendant 12 semaines. Les animaux ont eu à disposition de la nourriture et de l'eau à volonté pendant toute la durée de l'étude et ont été maintenus dans une pièce à température (22,0 ± 2,0 ° C) et humidité (40-50%) contrôlés et sur un cycle de 12h de lumière (8h-20h)/ 12h d'obscurité.
- À la fin de l'expérimentation (D85), des derniers échantillons de sang ont été prélevés sur les animaux anesthésiés (par un mélange de kétamine/xylazine 80/10 mg / kg). Les échantillons de sang ont été recueillis dans des tubes à centrifuger préremplis avec du sulfate d'héparine (200 Ul / mL de sang). Le plasma a été séparé par centrifugation (3500 tr / min, 15 min, 4 ° C), collecté puis conservé à -80 ° C jusqu'à l'analyse.
- Les taux plasmatiques de cytokines IL6 et TNFa ont été déterminés à l'aide du kit de dosage ELISA « Invitrogen® Luminex® Cytokine Mouse Magnetic 10-Plex » et conformément aux instructions du fabricant. Les mesures ont été effectuées par VEBIO (Arcueil, France).
[0152] Les résultats (présentés dans le Tableau 4) de dosage des cytokines pro inflammatoires TNFa et IL6 après 85 jours de régime riche en graisse à 45% (cal) montrent qu'une bactérie de la famille des Christensenellacées limite fortement l'inflammation.
[0153] 6. Démonstration de l'effet anti-inflammatoire de bactéries christensenella in vivo
[0154] Dès leur arrivée, les animaux sont mis en cage (n=5 par cage) et démarre une période d'acclimatation afin de permettre aux souris de se remettre du transport et en diminuant le stress en s'habituant à ce nouvel environnement. Après une semaine, les gavages de tous les groupes (excepté le groupe contrôle 5-ASA, contrôle pharmacologique anti-inflammatoire) commencent, ainsi que le suivi du poids. Les souris contrôles (ctlr-vehicle et DNBS-vehicle) sont gavées avec 150pL de PBS/16%de glycérol. Les souris DNBS- Christensenella minuta (C. minuta) sont gavées avec 150pL de C. minuta DSM 22607 à 1010 CFU/mL resuspendues dans du PBS/16% glycérol. Après deux semaines, l'inflammation est induite via un produit chimique, appelé le DNBS (dinitrobenzensulfate). Ce dernier est injecté directement dans le côlon de la souris par une sonde introduite au niveau du rectum. Le DNBS est dissout dans de l'éthanol à 30%, permettant de fragiliser la barrière intestinale pour faciliter l'entrée du DNBS dans le tissu, déclenchant ainsi le système immunitaire et donc l'inflammation. Les gavages continuent durant cette période, et ceux du groupe 5-ASA commencent le jour de cette injection à 150pL (solution de 5-ASA préparée tous les matins, à 2mg/souris resuspendue dans du PBS). L'euthanasie a lieu 3 jours après l'injection. La période dite de « recovery » est donc courte, mais nécessaire pour pouvoir observer des différences avec le groupe contrôle DNBS.
[0155] La Figure 4 représente les différents paramètres évalués lors d'un essai sur un modèle inflammatoire induit par le DNBS.
[0156] En Figure 4A, le suivi de la perte de poids a été observé à partir du jour de l'injection, et donc la période de récupération (Jl, J2 et J3) qui suit. Les inventeurs ont ainsi observé un effet sur la récupération qui semble être plus rapide après l'administration du traitement.
[0157] Sur la figure 4B, les scores macroscopiques nous indiquent le niveau de sévérité de la maladie, indiquent que suite aux traitements avec DSM 22607, une diminution significative du score a été observée, de même qu'avec l'agent pharmacologique anti-inflammatoire, le 5- ASA (Acide 5-aminosalicylique utilisé comme comparatif contrôle positif).
[0158] Les figures 4C et 4D nous montrent le potentiel immunomodulateur de DSM 22607, notamment en diminuant la présence de neutrophiles dans le côlon, évalué en suivant l'activité de la myélopéroxydase. De plus, l'augmentation de l'interleukine-10 dans la rate (figure 4D) nous montre les effets anti-inflammatoires associés à Christensenella minuta. [0159] 7. Démonstration de l'effet anti-inflammatoire de bactéries christensenella in vivo
[0160] Trois jours après l'injection, les animaux sont euthanasiés. La variation de poids des souris est mesurée en prenant le poids des souris tous les jours. Lors du sacrifice, le côlon est ouvert et nettoyé afin réaliser le score macroscopique. Ce dernier est basé sur la présence de sang dans le tissu (hyperhémie), la présence d'ulcère, le transit intestinal (par exemple si la souris était constipée) et l'épaississement du côlon induit par le DNBS.
[0161] Un morceau de côlon est également récupéré afin de doser l'activité de la myélopéroxydase (MPO). Cette enzyme est présente dans les neutrophiles, marqueurs de l'inflammation. Elle participe également à la production d'espèces réactives de l'oxygène (ROS). Lors de ce test, après avoir pesé le côlon pour normaliser les résultats en fonction de la taille de l'échantillon, une réaction colorimétrique a lieu permettant de doser l'activité de cette enzyme.
[0162] La rate est également récupérée lors du sacrifice (organe lymphoïde périphérique) et les cellules de la réponse immunitaire innée et adaptatives sont stimulées afin de doser les cytokines sécrétées telles que l'IL-10, cytokines anti-inflammatoires.
[0163] La figure 5 représente les effets d'autres souches de Christensenella minuta lors d'une répétition de l'expérience présentée en Figure 4. Le design expérimental et les méthodes restent similaires. Cette expérience nous apprend que toutes les souches de Christensenella minuta testées ont la même efficacité quant à la réduction des scores macroscopiques suite à l'injection intra-rectale de DNBS. De même, toutes les souches testées montrent un effet anti-inflammatoire qui se traduit par une réduction de l'activité de la MPO.
[0164] 8. Démonstration de l'effet anti-prolifératif de bactéries christensenella
[0165] Les cellules HT-29 ont été ensemencées à une densité de 10000 cellules/ puits dans un volume total de 100 pl en plaque 96-puits. Après 24h d'incubation, le milieu de culture a été retiré des cellules adhérentes et du nouveau milieu supplémenté avec 10% de surnageant en phase stationnaire de Christensenella minuta a été ajouté (DSMZ, C. minuta 1 et C. minuta 2 et en contrôle GAM (milieu de culture bactérien)). Chaque condition a été faite en 4 réplicats. Les cellules ont été incubées pendant 48h ou 72h supplémentaires.
[0166] La prolifération cellulaire a été déterminée par l'utilisation du kit CelITiter-GIo 2.0 assay (Promega). Les mesures ont été réalisées selon les instructions du fabricant. Brièvement, les plaques ont été retirées de l'incubateur et laissées s'équilibrer à température ambiante pendant 30 min et un volume égal de réactif CelITiter-GIo 2.0 a été ajouté directement aux puits (100 mI). Les plaques ont été mises sous agitation à 300 tr / min pendant 2 min en utilisant un agitateur rotatif, puis incubées à température ambiante pendant 10 min. Le mélange réactionnel a ensuite été transféré dans une plaque à 96 puits à paroi blanche et le signal luminescent a été mesuré à l'aide d'un lecteur de microplaques (FLUOstar Oméga, BMG Labtech).
[0167] La Figure 6 représente l'influence de souches de Christensenella minuta sur la prolifération de cellules tumorales.
[0168] Les inventeurs ont observé l'influence de souches de Christensenella minuta sur la prolifération de cellules tumorales, nous avons analysé l'effet de ces surnageants par traitement d'une lignée cellulaire humaine d'adénocarcinome du côlon, la lignée HT-29. L'effet des surnageants de Christensenella minuta sur la prolifération des cellules HT-29 a été évalué après 48 et 72h. Les surnageants des souches DSM22607 (DSMZ), C. minuta 1 et C. minuta 2 réduisent significativement la prolifération des cellules traitées pendant 48h et 72h, par rapport au contrôle "GAM", correspondant aux cellules traitées avec le milieu de culture bactérien (Test statistique = Dunnett où le groupe contrôle est le GAM ; ****GAM vs DSMZ p<0.0001, *GAM vs C. minuta 1 p=0.0140, **GAM vs C. minuta 2 p = 0.0027 à 48h and ****p<0.0001 à 72h). L'inhibiteur VIII d'Akt est utilisé comme contrôle du blocage de la prolifération cellulaire.
[0169] Cette expérience permet de conclure que les surnageants des différentes souches de Christensenella minuta testés induisent une diminution de la prolifération de la lignée tumorale HT-29, et donc un rôle de ces souches dans l'inhibition du développement tumoral.

Claims

REVENDICATIONS
[Revendication 1] Bactérie du genre Christensenella pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement de maladies inflammatoires chroniques et/ou maladies gastro-intestinales inflammatoires et/ou de cancers chez l'être humain ou l'animal.
[Revendication 2] Bactérie du genre Christensenella pour son utilisation selon la revendication 1, chez des patients ou des animaux présentant une hyperproduction d'interleukine 6 et/ou d'interleukine 8 et/ou une sous-production d'interleukine 10.
[Revendication 3] Bactérie du genre Christensenella pour son utilisation selon l'une des précédentes revendications, dans le traitement d'au moins une maladie choisie parmi les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin, les maladies inflammatoires chroniques du foie, les maladies inflammatoires chroniques du pancréas, les polyarthrites, les dermatites atopiques, les maladies neuro-inflammatoires, de la bronchopneumopathie chronique obstructive et les affections intestinales inflammatoires.
[Revendication 4] Bactérie du genre Christensenella pour son utilisation selon la précédente revendication, dans le traitement d'au moins une maladie choisie parmi la maladie de Crohn, la recto-colite hémorragique, la pochite, la colite ulcéreuse, la maladie coeliaque, la gastrite auto-immune, les hépatites, la stéatohépatite non alcoolique, la cholangite sclérosante primitive, la pancréatite, la polyarthrite rhumatoïde, la polyarthrite psoriatique, le psoriasis et l'eczéma.
[Revendication 5] Bactérie du genre Christensenella pour son utilisation selon l'une des revendications 1 ou 2, pour une utilisation dans le traitement des lymphomes, les glioblastomes, les myélomes, les leucémies, les cancers colorectaux, les cancers du sein, les cancers de la prostate, les cancers de l'ovaire, les cancers de l'utérus, les cancers du pancréas, les cancers des poumons, les cancers du foie, les cancers de la vésicule biliaire et les cancers des reins.
[Revendication 6] Bactérie du genre Christensenella pour son utilisation selon l'une des précédentes revendications, caractérisée en ce que ladite bactérie est choisie parmi Christensenella massiliensis, Christensenella timonensis, Christensenella intestinihominis, et Christensenella minuta.
[Revendication 7] Composition comprenant au moins une bactérie du genre Christensenella selon l'une des précédentes revendications dans un milieu physiologiquement acceptable et/ou un surnageant de culture d'au moins une souche bactérienne du genre Christensenella pour une utilisation, dans la prévention et/ou le traitement de maladies inflammatoires chroniques et/ou de maladies gastro-intestinales inflammatoires et/ou de cancers.
[Revendication 8] Composition pour son utilisation selon la revendication 7, dans laquelle ladite bactérie du genre Christensenella et ledit surnageant de culture peuvent comprendre ou être dérivés de la même ou de différentes souches ou espèces de Christensenella
[Revendication 9] Composition pour son utilisation selon l'une des revendications 7 ou 8, ladite composition est administrée à l'être humain possédant un indice de masse corporel inférieur à 25.
[Revendication 10] Composition pour son utilisation selon l'une des revendications 7 ou 9, caractérisée en ce que ladite bactérie est choisie parmi Christensenella massiliensis, Christensenella timonensis et Christensenella minuta et/ou leurs mélanges.
[Revendication 11] Composition pour son utilisation selon l'une des revendications 7 à 10, caractérisée en ce que les bactéries présentes sont pour au moins 50% des bactéries vivantes (en nombre).
[Revendication 12] Composition pour son utilisation selon l'une des revendications 7 à 11, caractérisée en ce que les bactéries présentes sont pour au moins 90% des bactéries vivantes (en nombre).
[Revendication 13] Composition pour son utilisation selon l'une des revendications 7 à 12, comprenant en outre :
(i) au moins une bactérie additionnelle de la famille Verrucomicrobiaceae ; et/ou
(ii) un surnageant de culture de ladite bactérie additionnelle.
[Revendication 14] Composition pour son utilisation selon la revendication 13, dans laquelle la souche bactérienne additionnelle est une bactérie du genre Akkermansia, plus particulièrement de l'espèce Akkermansia muciniphila.
[Revendication 15] Composition pour son utilisation selon l'une des revendications 7 à 14, caractérisée en ce qu'elle se présente sous forme liquide ou sous forme solide.
[Revendication 16] Composition pour son utilisation selon la revendication 15, caractérisée en ce que la composition sous forme solide comprend lesdites bactéries sous forme lyophilisée.
[Revendication 17] Composition pour son utilisation selon l'une des revendications 7 à 16, dans laquelle la composition est administrée par voie orale, rectale, inhalée ou topique.
[Revendication 18] Composition pour son utilisation selon l'une des revendications 7 à 17, caractérisée en ce qu'elle se présente sous forme de poudre, de poudre
microencapsulée, de gélule, de capsule, de comprimé, de pastille, de granulés, d'émulsion, de suspension, de suppositoire, d'un produit alimentaire, d'une boisson, d'un produit pharmaceutique, d'un nutraceutique, d'un additif alimentaire, d'un complément alimentaire ou d'un produit laitier.
[Revendication 19] Composition pour son utilisation selon l'une des revendications 7 à 18, caractérisée en ce qu'elle se présente sous une forme gastro-résistante.
[Revendication 20] Composition pour son utilisation selon l'une des revendications 7 à 19, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un probiotique et/ou au moins un prébiotique.
[Revendication 21] Composition pour son utilisation selon l'une des revendications 7 à 20, caractérisée en ce qu'elle comprend également :
- au moins un probiotique, et/ou
- au moins une bactérie produisant de l'acide lactique et/ou au moins un autre organisme favorisant les conditions anaérobiques nécessaires à la survie des Christensenellacées, et/ou
- au moins une bactérie associée à l'écosystème des Christensenellacées, et/ou
- au moins une bactérie choisie parmi les bactéries du genre Faecalibacterium,
Akkermansia, Eubacterium et Oscillospira, et/ou
- au moins un prébiotique, et/ou
- au moins un polyphénol, et/ou
- au moins un minéral et/ou au moins une vitamine et/ou au moins un agent nutritionnel, et/ou
- au moins un principe actif pharmaceutique préférentiellement choisi parmi les anti inflammatoires non stéroïdien, les anticorps dirigés contre des cibles pro-inflammatoires (anti-TNFalpha, anti-IL-6, anti-IL-8), les antirhumatismaux, les analgésiques, les
antimicrobiens, les corticostéroïdes, les anaboliques stéroïdiens, les antidiabétiques, les agents thyroïdiens, les antidiarrhéiques, les antitussifs, les antiémétiques, les anti ulcères, les laxatifs, les anticoagulants, l'érythropoïétine, les immunoglobulines, les immunosuppresseurs, les hormones de croissance, les médicaments hormonaux, les modulateurs des récepteurs aux œstrogènes, les agents alkylant, les antimétabolites, les inhibiteurs mitotiques, les radiopharmaceutiques, les anti-dépresseurs, les
antipsychotiques, les anxiolytiques, les hypnotiques, les sympathomimétiques, les stimulants, le donepezil, la tacrine, les médicaments pour l'asthme, les bêta-agonistes, les stéroïdes inhalés, les inhibiteurs de leucotriène, les cromoglycates ou acides
cromoglycidiques, l'épinéphrine, la dornase alpha, les cytokines, les antagonistes de cytokines, les agonistes d'interleukine 10.
[Revendication 22] Composition comprenant, dans un milieu physiologiquement acceptable :
(I) (a) au moins une souche bactérienne choisie dans le groupe constitué de
Christensenella timonensis, Christensenella minuta et/ou leurs mélanges ;
et/ou
(b) au moins un surnageant de culture d'au moins une souche bactérienne choisie dans le groupe constitué de Christensenella timonensis, Christensenella minuta et/ou leurs mélanges ;
et
(II) (a) au moins une souche bactérienne additionnelle du genre Akkermansia, plus particulièrement de l'espèce Akkermansia muciniphila ;
et/ou
(b) au moins un surnageant de culture d'au moins une souche bactérienne additionnelle du genre Akkermansia, plus particulièrement de l'espèce Akkermansia muciniphila.
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