EP3833678A1 - Peptides derives d'une beta-defensine 11 aviaire et leurs utilisations - Google Patents

Peptides derives d'une beta-defensine 11 aviaire et leurs utilisations

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Publication number
EP3833678A1
EP3833678A1 EP19758345.3A EP19758345A EP3833678A1 EP 3833678 A1 EP3833678 A1 EP 3833678A1 EP 19758345 A EP19758345 A EP 19758345A EP 3833678 A1 EP3833678 A1 EP 3833678A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
avbdll
seq
peptide
gga
peptide molecule
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP19758345.3A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Nicolas Guyot
Sophie Rehault-Godbert
Anne SILVESTRE
Sascha Trapp
Sophie IOCHMANN
Pascale REVERDIAU
Vincent Aucagne
Agnès Delmas
Céline LANDON
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite de Tours
Institut National de Recherche pour lAgriculture lAlimentation et lEnvironnement
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite de Tours
Institut National de Recherche pour lAgriculture lAlimentation et lEnvironnement
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Universite de Tours, Institut National de Recherche pour lAgriculture lAlimentation et lEnvironnement filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of EP3833678A1 publication Critical patent/EP3833678A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/465—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from birds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates

Definitions

  • the present invention relates to peptides and their uses, in particular in the veterinary and pharmaceutical field.
  • the oviparous egg ensures the autonomous development of the bird embryo outside the mother's body. In chickens, embryonic development takes place in 21 days at a temperature of 37-38 ° C. The egg must therefore naturally contain all the molecules necessary for the growth of this embryo and its protection. To protect itself from microbial contamination, the egg has an important defense system based on the shell (physical barrier), on particular physicochemical properties (alkaline pH and viscosity of the egg white) and on the presence of '' an arsenal of antimicrobial proteins, the best known of which are lysozyme and ovotransferrin.
  • egg white lysozyme is an antimicrobial protein currently used as a food preservative and as an active ingredient in several drugs.
  • AvBDll (formerly Vitellin Membrane Outer rent protein II (or VMO-II) (Kido et al, 1992, Biochem J, 286, 17-22; Xiao et al, 2004, BMC Genomics, 5, 56) is part of the b-defensins avian or gallinacins (Harwig et al, 1994, FEBS Lett, 342, 281-285; Sugiarto et al, 2004, Biochem Biphys Res Commun, 323, 721-727).
  • Defensins are antimicrobial peptides (2-5 kDa) from innate immunity, usually cationic. three-dimensional structure is organized in sheet b and has 3 disulfide bridges.
  • Mammalian defensins are grouped into 3 subfamilies: alpha, beta and theta-defensins (Ganz, 2003, Nat Rev Immunol, 3, 710-720). Membership in these different subfamilies is determined by the three-dimensional structure, the distribution of cysteines and the pairing of the latter in the formation of disulfide bridges.
  • defensins of family b classified into 2 subgroups, are found: ovodefensins (such as galline) and avian b-defensins (AvBD) of which AvBDll is a part (Van Dijk et al, 2008, Vet Immunol Immunopathol, 124, 1-18; Whenham et al, 2015, Biol Reprod, 92, 154).
  • ovodefensins such as galline
  • AvBD avian b-defensins
  • Gallus gallus AvBDll has antimicrobial activities against Gram positive and negative bacteria such as Salmonella enterica serovar Enteritidis, Listeria monocytogenes and Staphyiococcus aureus (Hervé-Gr tonet et al, 2010, Antimicrob Agents Chemother, 54, 4401- 4409).
  • AvBDll has a primary defensin sequence still absent in mammals. Its peptide sequence (82 amino acids, 9.28 kDa) is indeed longer than the other defensins due to the presence of 2 "b-defensin" motifs (ie 6 disulfide bridges).
  • the C-terminal part could include the biologically active part of this b-defensin since it has a sequence identity of 27% with the corresponding region of b - human defensin 3.
  • chicken avian b-defensin 11 initially described as antibacterial also has an antiparasitic, antiviral, anti-invasive and cytotoxic effect.
  • the antibacterial activity of the N-terminal domain was demonstrated for both chicken b-defensin 11 (Gallus gallus) and cane b-defensin 11 (Anas platyrhynchos).
  • a peptide derived from the N-terminal part retains these effects observed on the whole protein while a peptide derived from the C-terminal part has no effect or a much weaker effect.
  • the peptide derived from the N-terminal part is devoid of the cytotoxic effect which has been observed for whole avian b-defensin 11.
  • the present invention relates to a peptide molecule or a composition comprising this peptide molecule for its use as a medicament, the peptide molecule comprising a sequence chosen from the following sequences:
  • the peptide molecule comprising at most 50, 55 or 60 amino acids.
  • the present invention relates to a peptide molecule comprising a sequence chosen from the following sequences:
  • X is not a cysteine and is chosen in particular from the group consisting of Ala, Arg, Asp, Asn, Gin, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr and Val.
  • the peptide molecule comprises a sequence chosen from the following sequences:
  • the peptide molecules comprise three disulfide bridges, in particular between the cysteines: C1-C5, C 2 -C 4 and C 3 -C 6 .
  • the peptide molecule comprises, consists essentially of or consists of one of the following sequences:
  • peptide molecule for its uses can also be chosen from the group consisting of LPRDTSRCVGYHGYCIRSKVCPKPFAAFGTCSWRQKTCCV (SEQ. ID NO 2) LSLPRDTSRCVGYHGYCIRSKVCPKPFAAFGTCSWRQKTCCV (SEQ ID NO 10)
  • the present invention also relates to a peptide molecule as described above for its use as an antibacterial, antiparasitic and / or anti-invasive agent.
  • the peptide molecule for its use as a medicament is intended to be used in combination with another compound of therapeutic interest.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical or veterinary composition comprising a peptide molecule as described above, and optionally another compound of therapeutic interest. It also relates to this pharmaceutical or veterinary composition for its use for the treatment or prevention of a bacterial infection, the treatment or prevention of an infection by a parasite or for the treatment of cancer, in particular for its use to treat or prevent coccidiosis, the parasite being Eimeria.
  • the present invention relates to the use of a peptide molecule as described above as a food preservative or as a food additive.
  • FIG. 1 Protein sequences and isoelectric points of avian b-defensin 11 (AvBDll) from hens and the peptides AvBDll [1-40] and AvBDll [41-82].
  • the protein precursor of AvBDll (Accession NP_001001779) is a protein of 104 amino acids.
  • amino acid sequences of the N-terminal domain (AvBDll [1-40]) and of the C-terminal domain (AvBDll [41-82]), delimited by the exon-exon junction, have different charge properties with theoretical pl values of 9.34 and 6.88, respectively.
  • FIG. 2A Dose effect of chicken AvBDll and the peptides AvBDll [1-40] and AvBDll [41-82] against Salmonella enterica Entendis ATCC 13076 and Listeria monocytogenes EGD. Antibacterial activities are visualized by the formation of an inhibition disc using the radial diffusion technique in agar medium. MSI-94 (antimicrobial peptide derived from magainin) is used as a positive control.
  • Figure 2B Effect of heparin (0, 20, 100 ng / pL) on the antibacterial activity of chicken AvBDll and of the peptides AvBDll [1-40] and AvBDll [41-82], used at 12 mM, against Salmonella enterica Enteritidis ATCC 13076 and Listeria monocytogenes EGD.
  • Figure 3A Observation by scanning electron microscopy of parasites after 1 h of incubation with PBS (control) or 10 ⁇ M of hen AvBDll. The scale bar represents 2 pm.
  • Figure 3B Percentage viability of parasites, after incubation with peptides at different concentrations. The data presented are the means ⁇ SEM of three independent experiments. Nter: AvBDll [1-40]; Cter: AvBDll [41-82]; Nter + Cter: AvBDll [1-40] + AvBDll [41-82].
  • Figure 3C The antiparasitic activity of hen AvBDll at 10 pM is abolished in the presence of heparin at 100 pg / mL.
  • Figure 4A Relative ATP production in uninfected CLEC213 cells or infected cells in response to treatments with different concentrations of chicken AvBDll and the peptides AvBDll [1-40], AvBDll [41-82] or AvBDll [l -40] + AvBDll [41-82], The values of relative ATP production were calculated for the (un) infected cells and treated compared to the values of the average RLU (luminescence signals) obtained for the controls (cells not processed).
  • FIG. 5 Effect of chicken AvBDll and the peptides AvBDll [1-40] and AvBDll [41-82]) on the invasion and viability of NCI-H460 cells (cell line derived from non-human pulmonary carcinoma with small cells).
  • the invasion and viability results were analyzed after 48 hours of incubation. They are expressed as a percentage of invasion or viability of the cells incubated with AvBDll or the peptides, compared to that of the control cells.
  • the results represent the median ⁇ 1st quartile / 3rd quartile of at least 5 independent experiments, each being carried out at least in duplicate.
  • the Kruskal-Wallis and Dunn test was used to compare the results of cells treated with different concentrations of molecules compared to those of control cells.
  • the Mann Whitney test was used to compare the invasion and viability results obtained for the same concentration of molecule tested. * p ⁇ 0.05; ** p ⁇ 0.01; *** p ⁇ 0.0001; **** p ⁇
  • Figure 6 Effect of co-incubation of unfractionated heparin with 6 mM chicken AvBDll or AvBDll peptide [1-40] (N) on the invasion and viability of non-small cell lung tumor cells NCI-H460.
  • the results of invasion (dark color) and MTS test (viability) (light color) were analyzed after 48 hours of incubation. They represent the median ⁇ 1st quartile / 3rd quartile of 3 independent experiments, each being carried out in duplicate.
  • the Kruskal-Wallis and Dunn test was used to compare the results of cells treated with different concentrations of molecules compared to those of control cells.
  • the Mann Whitney test was used to compare the invasion and viability results obtained for the same concentration of molecule tested.
  • peptide oligopeptide
  • polypeptide polypeptide
  • protein protein
  • amino acid refers to the 20 natural standard amino acid residues (G, P, A, V, L, I, M, C, F, Y, W, H, K, R, Q., N, E, D, S and T), to rare natural amino acid residues (e.g. hydroxyproline, hydroxylysine, allohydroxylysine, 6- N-methylysine, N-ethylglycine, N-methylglycine, N-ethylasparagine, allo-isoleucine, N-methylisoleucine, N-methylvaline or aminobutyric acid) and non-natural amino acids (for example norleucine , norvaline and cyclohexyl-alanine).
  • this term refers to the 20 natural standard amino acid residues (G, P, A, V, L, I, M, C, F, Y, W, H, K, R, Q, N, E , D, S and T).
  • substitution designates the replacement of one amino acid residue with another chosen from among 20 natural standard amino acid residues, rare natural amino acid residues and amino acid residues unnatural.
  • substitution refers to the replacement of an amino acid residue with another chosen from among the 20 natural standard amino acid residues (G, P, A, V, L, I, M, C , F, Y, W, H, K, R, Q., N, E, D, S and T).
  • the substitution (s) can be conservative or non-conservative substitutions.
  • substitution refers to a substitution of an amino acid residue by another which has similar chemical or physical properties (size, charge or polarity). Examples of conservative substitutions are presented in the following tables.
  • the peptide may comprise 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 additional amino acids at the N end and / or C-terminal, preferably 1, 2, 3, 4 or 5 additional amino acids, and / or 1, 2 or 3 substitutions, deletions, additions, or a mixture of these.
  • the number of substitutions, additions, deletions or a mixture thereof depends on the length of the sequence. For example, the percentage of substitutions, deletions, additions or a mixture thereof may not exceed 30%, preferably not more than 25%.
  • substitution refers to the exchange of one amino acid with another in a peptide sequence
  • deletion refers to the elimination of a single amino acid from a peptide sequence
  • insertion or “addition” is equivalent and refers to the addition of a single amino acid in a peptide sequence.
  • sequence identity refers to the number (%) of matches (identical amino acid residues) at positions from an alignment of two polypeptide sequences. Sequence identity is determined by comparing the sequences when they are aligned to maximize overlap and identity while minimizing sequence interruptions. In particular, the sequence identity can be determined using any of the many global or local alignment algorithms, depending on the length of the two sequences. Sequences of similar length are preferably aligned using global alignment algorithms (eg Needleman & Wunsch, J. Mol.
  • Biol 48: 443, 1970 which optimally align the sequences over the entire length, while sequences lengths substantially preferably different are aligned using a local alignment algorithm, for example the Smith and Waterman algorithm (Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482, 1981) or the AltschuI algorithm (Altschul and al (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402; Altschul et al (2005) FEBS J. 272: 5101-5109). Alignment for the purpose of determining the percentage of amino acid sequence identity can be carried out by any method known to those skilled in the art, for example using software available on Internet sites such as http: // blast.ncbi.nlm.
  • treatment includes preventive, curative, palliative treatment, as well as the management of subjects (reduction of suffering, improvement of lifespan, slowing down of the progression of the disease, reduction in tumor growth, reduction in tumor size, prevention or reduction of metastases and relapses etc.).
  • terapéuticaally effective amount refers to an amount which results in an improvement in the condition of an organ or subject, or in a decrease in disease, disorder or symptoms of the disease or disorder in question.
  • a "pharmaceutical composition” means a preparation of one or more of the active agents with other optional chemical components such as physiologically suitable carriers and / or excipients.
  • the purpose of a pharmaceutical composition is to facilitate the administration of the active agent to an organism.
  • the compositions of the present invention may be in a form suitable for any route of administration or conventional use.
  • the pharmaceutical composition according to the invention includes the pharmaceutical compositions used in human medicine and the pharmaceutical compositions used in animal medicine, that is to say the veterinary compositions.
  • the pharmaceutical composition further comprises a pharmaceutically acceptable vehicle.
  • the terms “pharmaceutically acceptable carrier” or “pharmaceutically acceptable excipient” or “pharmaceutically acceptable carrier” are interchangeable and include any compounds or combinations of compounds which are known to those skilled in the art as being useful in the formulation of pharmaceutical or veterinary compositions.
  • physiologically acceptable or “pharmaceutically acceptable” means any medium or additive which does not interfere with the effectiveness of the biological activity of the active principle (here, the peptide molecules), and which is not excessively toxic to the patient or subject, at the concentrations to which it is administered and / or which do not produce an adverse reaction when administered to a human or animal.
  • a physiologically acceptable vehicle, carrier or excipient may be suitable for administration to humans and / or animals (particularly mammals).
  • the present application therefore relates to a peptide derived from the N-terminal part of an avian b-defensin 11.
  • This peptide or peptide molecule comprises, consists essentially of or consists of the following consensus sequence:
  • X is any amino acid, different or identical, preferably excluding a cysteine.
  • X can be chosen from the group consisting of Ala, Arg, Asp, Asn, Gin, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr and Val.
  • the peptide or peptide molecule comprises, consists essentially of or consists of the following consensus sequence:
  • X is any amino acid, different or identical, preferably excluding a cysteine.
  • X can be chosen from the group consisting of Ala, Arg, Asp, Asn, Gin, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr and Val.
  • the peptide or peptide molecule can comprise, consist essentially of or consist of the following consensus sequence: XXXDTXXC1XXXXGXC2XXXXXC3PXPFXXFGTC4XXXXXTC5C6X (SEQ ID NO 6) in which X is any amino acid, different or identical, preferably excluding a cysteine.
  • X can be chosen from the group consisting of Ala, Arg, Asp, Asn, Gin, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr and Val.
  • the peptide or peptide molecule comprises, consists essentially of or consists of one of the following sequences:
  • the peptide or peptide molecule can comprise 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 conservative substitutions, these substitutions not relating to cysteines. Preferably, these substitutions do not relate to the amino acid residues defined in the sequences of SEQ ID NOs 4-6.
  • the peptide does not consist of the sequences
  • the peptide or peptide molecule comprises, consists essentially of or consists of one of the following sequences:
  • the peptide or peptide molecule comprises, consists essentially of or consists of one of the following sequences:
  • the peptide or peptide molecule comprises, consists essentially of or consists of one of the following sequences:
  • the peptide or peptide molecule comprises three disulfide bridges formed by the six cysteines Ci, C 2 , C 3 , C 4 , Cs and C 6 of the peptide. More particularly, the disulphide bridges are the following: C 1 -C 5 , C 2 -C 4 and C 3 -C 6 .
  • a Ci-Cs disulfide bridge is meant a disulfide bridge between cysteine Ci and cysteine C 5 , etc.
  • the peptide or peptide molecule according to the present invention can consist of one of the sequences SEQ ID NOs 10-11.
  • the peptide or peptide molecule comprises at most 70, 65, 60, 55, 50 or 45 amino acids.
  • the peptide used according to the invention preferably has a size of between 30 and 100 amino acids, more particularly preferably between 30 and 70 amino acids, and even more particularly preferably between 30 and 60, between 30 and 55 , between 30 and 50 or between 30 and 45 amino acids.
  • the peptide used according to the invention has a size of 30 to 45 amino acids.
  • the peptide molecule can further comprise other peptide sequences, on the N-terminal or C-terminal side.
  • the peptide can also comprise, in N-terminal or C-terminal, a tag (or label) useful for the purification or the immobilization of the peptide.
  • tags are well known to those skilled in the art and include, for example, the tags histidine (Hise), FLAG, HA (epitope derived from the hemagglutinin of the influenza virus), MYC (epitope derived from the human proto oncoprotein MYC ) or GST (glutathione-S-transferase).
  • the peptide can comprise a site for cleavage by a protease or a chemical agent making it possible to remove this tag.
  • the peptide may also include an element facilitating cell penetration of the molecule.
  • this element is a peptide facilitating cell penetration of the molecule (element CPP).
  • CPP a peptide facilitating cell penetration of the molecule
  • the peptide facilitating cell penetration can be chosen by the group consisting of a Tat peptide, an antenapedia or penetatin peptide, and a peptide rich in arginine and lysine, preferably rich in arginine , in particular a peptide comprising at least 9 arginine residues.
  • the peptide bond (s) of the peptide molecule according to the present invention can be modified to make them resistant to proteolysis.
  • all peptide bonds can be replaced.
  • the peptide molecule can comprise either a C terminal carboxylic (-COO) or amidated (-CONH2) end.
  • the peptide can also be optionally modified at its N-terminal end, for example by an acetyl radical.
  • the L and D isomers of amino acids are envisaged.
  • the D isomers are not sensitive to proteases and the present invention also includes molecules comprising D amino acids, in particular molecules comprising only or essentially D amino acids.
  • the amino acids L are preferred.
  • the invention also relates to the salts of said peptide and their uses, preferably of pharmaceutically or veterinary acceptable salts.
  • Salt acceptable on the plan pharmaceutical or veterinary is a salt which does not present any notable toxicity, at the dose where it is used.
  • the salts can be, for example, the salts with acceptable mineral acids such as hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid and phosphoric acid; salts with acceptable organic acids such as acetic acid, citric acid, maleic acid, malic acid, succinic acid, ascorbic acid and tartaric acid; salts with acceptable mineral bases such as sodium, potassium, calcium, magnesium or ammonium salts; or salts with organic bases which have salifiable nitrogen.
  • the salt is an ammonium sulfate. These salts are commonly used and their preparation methods are well known to those skilled in the art.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical or veterinary composition
  • a pharmaceutical or veterinary composition comprising a peptide or a peptide molecule as described above.
  • the pharmaceutical or veterinary composition may comprise a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the present invention also relates to new uses of an avian defensin 11 as described below, in particular as an antiparasitic agent, as an antiviral agent, as an anti-invasive agent and in as a cytotoxic agent.
  • an avian defensin 11 as described below, in particular as an antiparasitic agent, as an antiviral agent, as an anti-invasive agent and in as a cytotoxic agent.
  • AvBDll will be referred here to 11 avian defensins as described below in this section.
  • Avian b defensin 11 can comprise, consist essentially of or consist of one of the sequences as described below:
  • X can be chosen from the group consisting of Ala, Arg, Asp, Asn, Gin, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr and Val.
  • avian b defensin 11 can comprise, consist essentially of or consist of one of the sequences as described below:
  • the peptide or peptide molecule can comprise 1 to 20 conservative substitutions, preferably 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 conservative substitutions, these substitutions not relating to cysteines. Preferably, these substitutions do not relate to the amino acid residues defined in the sequences of SEQ ID NOs 14-19.
  • avian defensin b can have the sequence of a defensin as described in table 4 below or a sequence having at least 70, 75, 80, 85, 90 or 95% identity with one of these, preferably with the mature sequence thereof.
  • b defensin 11 is mature, i.e. without the signal peptide.
  • avian b defensin 11 has a sequence having at least 70, 75, 80, 85, 90 or 95% identity with one of the defensins described in table 4, preferably with the mature sequence thereof. , and includes a sequence chosen from SEQ ID NOs 14-19.
  • avian b defensin 11 comprises, consists essentially of or consists of the sequence SEQ ID NO 1. In another particular embodiment, avian b defensin 11 comprises, consists essentially of or consists of the sequence SEQ ID NO 20.
  • avian b defensin 11 comprises six disulfide bridges formed by the cysteines Ci, C 2 , C 3 , C 4 , Cs, C 6 , C 7 , Cs, Cg, Cio, Cn and C12. More in particular, the disulfide bridges are the following: C 1 -C 5 , C 2 -C 4 , C 3 -C 6 , C 7 -C 11 , Cs-Cio and C 9 - C12.
  • Avian b defensin 11 can include modifications similar to those described above for peptides.
  • the peptide molecules as described above are useful as an antibacterial agent.
  • the present invention relates to peptide molecules as described above for their use for treating or preventing infection by a bacterium, to the use of peptide molecules as described above for the manufacture of a medicament intended treating or preventing infection with a bacterium, and a method of treating infection with a bacterium comprising administering a therapeutically effective amount of peptide molecules.
  • the bacteria can be Gram positive or Gram negative.
  • Gram-positive bacteria can belong to the genus Staphylococcus like 5. aureus, 5. epidermidis, S. saprophiticus, S. lugdunensis, S haemolyticus, S warneri, S schleiferi and 5 intermedius, to the genus Streptococcus like 5.
  • pyogenes 5. agalactiae , S. dysgalactiae, S. bovis, S. anginosus, 5. sanguinis, 5. suis, S. mitis, 5. mutans, S. pneumonia and 5. oralis, to the genus Enterococcus like E. faecium, E.
  • Gram-positive bacteria are bacteria of the Listeriaceae family such as a bacterium of the genus Brochothrix or Listeria typically, chosen from Listeria monocytogenes, Listeria innocua, Listeria ivanovii subsp. ivanovii, Listeria ivanovii subsp. londoniensis, Listeria grayi, Listeria seeligeri and Listeria welshimeri, preferably Listeria monocytogenes.
  • the peptide molecules as described above are useful for the treatment of listeriosis.
  • Gram-negative bacteria can be enterobacteria chosen from bacteria of the genera Escherichia, Shigella, Salmonella, Klebsiella, Enterobacter, Providencia, Morganella, Citrobacter, Hafnia and Yersinia. They can also be chosen from bacteria of the genera Pseudomonas, Acinetobacter, Stenotrophomonas, Burkholderia, and Alcaligenes, in particular Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, Stenotrophomonas maltophilia, Burkholderia cepacia, and Alcaligenes xylosoxydans.
  • Gram negative bacteria can be salmonella.
  • the bacteria can be chosen from 5. Typhi (Eberth bacillus), 5. Paratyphi A, 5. Paratyphi B (Schotmüller's bacillus), 5. Paratyphi C (Hirschfeld bacillus), and 5. Sendai.
  • the bacterium can also be any bacterium of the salmonella family such as Salmonella bongori, Salmonella enterica, Salmonella enterica arizonae, Salmonella enterica diarizonae, Salmonella enterica enterica, Salmonella enterica houtenae, Salmonella enterica indica, Salmonella enterica salamae or Salmonella subterranea.
  • the peptide molecules as described above are useful for the treatment of typhoid fever, paratyphoid fever and salmonellosis.
  • the bacteria can also be Escherichia coli.
  • the peptide molecule can be used alone or in combination with another therapeutic agent, in particular one or more antibiotics.
  • the peptide molecules as described above and / or the AvBD11s as described above are useful as an antiparasitic agent.
  • the present invention relates to peptide molecules and / or AvBDll as described above for their use for treating or preventing infection by a parasite, to the use of peptide molecules and / or AvBDll as described above for the manufacture of a medicament for treating or preventing a parasite infection, and to a method of treating a parasite infection comprising administering a therapeutically effective amount of peptide molecules and / or AvBDll such as described above.
  • the parasite can in particular be Eimeria.
  • This parasite is known to cause coccidiosis, which can cause significant damage in farms. In particular, birds or poultry, rabbits, calves, cats and dogs and goats are concerned.
  • the parasite may belong to the Eimeria tenella, Eimeria acervulina, or Eimeria maxima subclasses.
  • the peptide and / or AvBDll molecules as described above can be used in combination with other therapeutic agents, in particular known treatments or vaccinations against coccidiosis, in particular those caused by Eimeria such as Eimeria tenella, Eimeria acervulina, or Eimeria maxima, for example coccidiosis drugs, prebiotics, probiotics, natural compounds and combinations thereof.
  • the peptide molecules as described above and / or the AvBDlls as described above are useful as an anti-invasive agent.
  • the present invention relates to peptide molecules and / or AvBDll as described above for their use for treating cancer, in particular by an anti-invasive effect, to the use of peptide molecules and / or AvBDll as described above for the manufacture of a medicament intended to treat cancer, in particular by an anti-invasive effect, and to a method of treatment of cancer, in particular by an anti-invasive effect, comprising the administration of an amount effective therapeutic of peptide molecules and / or AvBDll as described above.
  • the peptide and / or AvBDll molecules as described above can be used to prevent or slow down metastases from cancer.
  • AvBDlls as described above are useful as a cytotoxic agent. They are therefore of interest in the treatment of cancer.
  • the cancer can be solid or hematopoietic cancer.
  • the cancer can be sarcoma, carcinoma, or hematopoietic cancer.
  • cancer is cancer associated with an ability to form metastases.
  • the molecule can be used to treat lung, breast, colon, kidney, prostate, cervical cancer and melanoma.
  • AvBDlls as described above are useful as an antiviral agent.
  • the present invention relates to AvBDlls as described above for their use for treating or preventing infection by a virus, to the use of AvBDlls as described above for the manufacture of a medicament intended to treat or prevent virus infection, and a method of treating virus infection, comprising administering a therapeutically effective amount of AvBDlls as described above.
  • the virus is the influenza virus, preferably subtype A, especially the bird flu virus.
  • the virus can be a virus chosen from H1N1, H5N1, H7N3, H7N7, H7N9, H9N2 and H10N8.
  • AvBDlls can be used alone or in combination with other therapeutic agents, especially other antiviral agents.
  • the subject to be treated is an animal.
  • the animal is a farm animal or a pet.
  • the farm animal is a cattle, a sheep, a goat, an equine, a pig or a poultry.
  • poultry can be a hen, a chicken, an ostrich, a duck, a turkey, a quail, a pheasant, a guinea fowl, or a goose.
  • the subject to be treated is a human.
  • a composition according to the invention can be in any form suitable for administration, for example in the form of tablets, tablets, lozenges, dragees, capsules, capsules, pills, aggregates , powder, suspensions, emulsions, syrups, ointments, ampoule of liquid, bottle fitted with a dropper and other similar forms of liquid or powder preparations intended to be taken in small measured units, injectable solutions or suppositories.
  • the molecules or compositions according to the invention can be administered in different ways and in different forms.
  • they can be administered systemically, orally, by inhalation or by injection, such as for example by intravenous, intramuscular, subcutaneous, trans-dermal, intra-arterial, etc. routes, intravenous routes, intramuscular, subcutaneous, oral and inhalation are preferred.
  • the molecules are generally packaged in the form of liquid suspensions, which can be injected using syringes or infusions, for example.
  • the molecules are generally dissolved in saline, physiological, isotonic, buffered solutions, etc., compatible with pharmaceutical use and known to those skilled in the art.
  • the compositions can contain one or more agents, supports or vehicles chosen from dispersants, solubilizers, stabilizers, preservatives, etc.
  • the flow rate and / or the dose of peptide, peptide molecule or AvBDll can be adapted by a person skilled in the art depending on the subject, the pathology concerned, the mode of administration, etc.
  • the molecules are administered in doses which can vary between 1 pg and 1000 mg / kg of body weight, more generally from 10 pg to 100 mg / kg, typically between 1 mg and 20 mg / kg.
  • repeated injections can be given, if necessary.
  • the peptide molecules described above can also be used in fields other than the pharmaceutical or veterinary field, in particular on the basis of their antibacterial, antiparasitic, antiviral, anti-invasive and / or cytotoxic properties against cancer cells.
  • they can be used in the food industry as a preservative or as a food additive to increase the added value of a food ("functional food").
  • the present invention relates to a method of preparing a food composition comprising the addition of a peptide molecule to the food composition.
  • This food composition can have the advantage of improving the well-being of the subject, animal or man, in particular by preventing or reducing bacterial, parasitic, and / or viral infections or by reducing the incidence of cancers.
  • the examples illustrate the present invention and are not intended to limit it.
  • AvBDll is an atypical defensin predicted to have two defensin-like domains. Its abnormally long size (82 amino acids) and the number of cysteines (12) twice as large as most of the defensins encountered in nature initially suggested this two-domain structure.
  • two synthetic peptides (Gga-AvBDll [1-40d and Gga-AvBDll [41-82j) representative of each domain were synthesized (Table 5).
  • the boundary between the 2 areas has been set at the level of exon-exon junction identified on the basis of the data available in Ensembl and NCBI ( Figure 1).
  • the disulfide bridges of each peptide were formed by oxidative folding.
  • the peptide AvBDll [1-40] has the particularity of being amidated at its C-terminal end.
  • the purity and the mass of the peptides were verified by HPLC and mass spectrometry.
  • the structure and pairing of the disulfide bridges have been validated by RM N 3D (unpublished data generated by the Center for Molecular Biophysics: C. Landon, H. Meudal, K. Loth).
  • the antibacterial activity of the peptides Gga-AvBDll [1-40] and Gga-AvBDll [41-82] was tested using the radial diffusion technique against two bacteria responsible for food-borne infections, Listeria monocytogenes (Gram +) and Salmonella enterica Enteritidis (Gram-), previously used to characterize the antibacterial activity of native Gga-AvBDll (Hervé-Gr tonet et al. 2010, supra).
  • the results show that the peptide Gga-AvBDll [1-40] is active against the two bacteria (FIG. 2A) with CM I values similar or lower than MSI-94 (positive control) (Table 6).
  • the peptide Gga-AvBDll [41- 82] does not seem to be active: no activity was detected at the maximum concentration of 30 mM (Figure 2A). The latter also has no effect (inhibitor or potentiator) on Gga-AvBDll [1-40] when the two peptides are used in combination ( Figure 2A, Table 6). These results therefore suggest that it is the N-terminal domain of Gga-AvBDll which carries the antibacterial activity, at least vis-à-vis these two pathogenic bacterial strains. The effect of the peptides was tested in the presence of heparin in order to evaluate the influence of the glycosaminoglycan on the antibacterial activity of the molecules.
  • CM Minimum inhibitory concentrations
  • Gga-AvBDll Gga-AvBDll [1-40], Gga-AvBDll [41-82]
  • the CM I are determined using the agar radial diffusion test.
  • MSI-94 antiimicrobial peptide derived from magainin is used as a positive control.
  • the antiparasitic activity of native Gga-AvBDll and of each synthetic peptide derived from Gga-AvBDll [1-40] and Gga-AvBDll [41-82] was evaluated under acellular conditions, against parasites of Eimeria tenella which express the fluorescence marker YFP.
  • the percentage of parasite viability obtained for each peptide is indicated in FIG. 3.
  • Significant antiparasitic activity is observed for whole Gga-AvBDll and for the peptide Gga-AvBDll [1-40] (at p ⁇ 0.01 and p ⁇ 0.05, respectively), with a dose-dependent effect.
  • Gga-AvBDll exhibits clear antiviral activity at concentrations 3 2.5 iM
  • the anti-invasive effect of the protein at concentrations of 4, 6 and 8 mM is significantly greater than that altering cell viability.
  • incubation of the cells with the peptide Gga-AvBDll [1-40] induces a reduction in the invasion of NCI-H460 cells from 2 mM without modification of the cell viability.
  • the peptide Gga-AvBDll [41-82] has very little effect on the invasion and the viability of NCI-H460 cells.
  • the two peptides were incubated together with the cells, anti-invasive and cytotoxic properties are found, but with less intensity than those observed with the whole Gga-AvBDll protein.
  • Examples 1-5 were carried out with hen AvBD11 and the N- and C-terminal fragments thereof. The inventors then studied the potential of cane AvBDll Anas platyrhynchos (Accession N ° XP_005028303.2). Table 7. Sequences of synthetic peptides derived from cane AvBDll
  • cane AvBDll cane AvBDll
  • the native protein and its derived peptides (Apl-AvBDll [1-40] and Apl-AvBDll [41-82]) were tested on 4 bacteria: two Gram positive bacteria (Listeria monocytogenes and Staphylococcus aureus) and two Gram negative bacteria (Salmonella enterica Enteritidis and Escherichia coli).
  • the antibacterial activities were evaluated by the method of radial agar diffusion (Lehrer method) where the activity is detected by the presence of a halo of inhibition of bacterial growth.
  • the activity of Apl-AvBDll was compared to chicken AvBDll (Gga-AvBDll).
  • the two synthetic domains corresponding to the “beta-defensin” motifs of each molecule were also tested, alone or in combination. All molecules were tested at different concentrations (30; 12; 4.8; 1.92; 0.768 and 0.3072 mM) to determine the minimum inhibitory concentrations (MIC).
  • MIC minimum inhibitory concentrations
  • MSI-94 A broad spectrum antimain microbial peptide derived from magainin, MSI-94, was used as a positive control.
  • the MICs obtained for each molecule are reported in Table 8. The results show that the two native proteins, Apl-AvBDll and Gga-AvBDll, are active against the 4 bacteria tested. The MIC values are less than 0.5 pM for Listeria monocytogenes, Salmonella enterica Enteritidis and E coli.
  • the peptide syntheses on solid support were carried out according to the Fmoc strategy using a Prelude synthesizer (Protein Technologies), on a scale of 25 pmol, on a Tentagel R NH 2 resin.
  • Standard side chain protecting groups were used: Arg (Pbf), Asp (OtBu), Cys (Trt), Glu (OtBu), Gln (Trt), His (Trt), Lys (Boc), Ser (tBu) , Thr (tBu), Trp (Boc) and Tyr (tBu).
  • the resin was treated with a TFA / H 2 0 // Pr 3 SiH / phenol mixture (88: 5: 2: 5) for 2 h, then the peptide was precipitated by dilution ( ⁇ 10) in a 1: 1 ether mixture diethyl / petroleum ether cooled to 0 ° C, collected by centrifugation, then washed three times with diethyl ether and dried under reduced pressure.
  • ESI-HRMS High resolution ESI-MS mass spectrometry analyzes
  • ESI-HRMS Q.-TOF maXis mass spectrometer
  • the multi-loaded envelope was deconvoluted using Bruker Data Analysis 4.1 software.
  • MALDI-TOF analyzes were performed in reflectron mode on an Autoflex instrument (Bruker Daltonics) using a-cyano-4-hydroxycinnamic acid as a matrix.
  • the theoretical and experimental values of [M] or [M + H] + correspond to the monoisotopic species.
  • HPLC analyzes were performed using a Chromolith HR RP-18e column (150 A, 10 x 4.6 mm, flow rate of 3 mL / min) or a Jupiter C4 column (300 ⁇ , 5 pm, 250 x 4.6 mm, flow rate of 1 mL / min).
  • HPLC purifications were performed using a Nucleosil C18 column (300 ⁇ , 5 ⁇ m, 250 x 10 mm, flow rate of 3 mL / min).
  • Solvents A and B were 0.1% TFA in H 2 0 and 0.1% TFA in MeCN, respectively.
  • AvBDll [1-40] (cysteines with their free thiol functions) was synthesized according to the general protocol of Fmoc-SPPS, using a linker of the Rink amide type incorporated in the form of Fmoc-Rink-OH.
  • AvBDll [41-82] was synthesized according to the general protocol of Fmoc-SPPS, using a Wang type linker, incorporated by the coupling of Fmoc- 82 lle- (4-oxymethylphenoxypropionic acid) (Fmoc-lle -mppa-OH).
  • AvBDll [1-40] (cysteines with their free thiol functions) was synthesized according to the general protocol of Fmoc-SPPS, using a linker of the Rink amide type incorporated in the form of Fmoc-Rink-OH.
  • AvBDll [41-82] (cysteines with their free thiol functions) was synthesized according to the general protocol of Fmoc-SPPS, using a Wang resin pre-grafted with a methionine.
  • Antibacterial activities were measured according to the radial diffusion technique described by Lehrer et al (J Immunol Methods, 1991, 137 (2), 167-73) and used previously for the antibacterial characterization of native AvBDll (Hervé-Gr tonet and al 2010).
  • the bacteria are grown in Brain Heart Infusion (Listeria monocytogenes) or Tryptical Soy Broth (Salmonella enterica serovar Enteritidis ATCC 13076, Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus ATCC 29740) media with shaking (180 rpm) at 37 ° C until in the exponential phase, then washed once in cold 10 mM sodium phosphate buffer (pH 7.4) then taken up in a small volume of this same buffer.
  • a volume containing 7.5 x 10 6 CFU (Colony-forming Unit) is introduced into an agar medium poor in nutrients (10 mM sodium phosphate buffer, pH 7.4, containing 0.03% [weight / volume] of TSB, 1% [weight / volume] of agarose of low electro-endosmosis [Sigma-Aldrich, St Quentin Fallavier, France] and 0.02% of Tween-20) maintained in supercooling.
  • This medium, containing the bacteria is then poured into a petri dish to form a uniform layer about 1 mm thick. Thirty-six wells of 2.75 mm in diameter, evenly spaced, are dug in the agar using a cookie cutter.
  • a solution containing the molecules to be tested (AvBDll, AvBDll [1-40], AvBDll [41-82]) at different concentrations (0 - 0.3072 - 0.768 - 1.92 - 4.8 - 12 - 30 ⁇ M in ultrapure water) are added to each well, then the petri dish is incubated for 3 h at 37 ° C. in order to allow the molecules to diffuse / act.
  • the agar containing the bacteria is then covered with a nutrient-rich agar (10 mM sodium phosphate buffer, pH 7.4, containing 6% [weight / volume] of TSB and 1% [weight / volume] of low agarose.
  • MSI-94 a variant of magainin with a broad antimicrobial spectrum, is used as a positive control.
  • the protein AvBDll purified from chicken egg (Gga-AvBDll) and its peptides derived Gga-AvBDll [1-40] and Gga-AvBDll [41-82] (alone or combined) ) have been tested on two different bacterial strains: Salmonella enterica serovar Enteritidis ATCC 13076 (Gram-) and Listeria monocytogenes EGD (Gram +). These two strains were supplied by the International Center for Microbial Resources - Pathogenic Bacteria (INRA, ISP, Nouzilly, France). For each bacterial strain, at least four identical independent measurements of the antibacterial activity were carried out.
  • heparin The effect of heparin on the antibacterial activity of chicken AvBDll and Gga-AvBDll [1-40] and Gga-AvBDll [41-82] derived peptides (alone or in combination) was tested using molecules at a final concentration of 12 mM in the presence of heparin (H3149, Sigma-Aldrich, St Quentin Fallavier, France) at 0, 20 and 100 ng / pL in TBS buffer (50 mM Tris- HCl, 150 mM NaCl, pH 7.4). The samples were analyzed as previously against Listeria monocytogenes and Salmonella enterica Enteritidis.
  • the Et-YFP strain is a recombinant strain, stably expressing the fluorescence marker YFP (Yellow Fluorescent Protein) (Gras et al, 2014, Eukaryot Cell, 13, 884-895).
  • the parasites (5.10 5 ) suspended in 20 ⁇ L of a 10 mM phosphate-buffered saline solution (PBS), pH 7.4 containing Gga-AvBDll, the peptide Gga-AvBDll [1-40], the peptide Gga-AvBDll [41-82] or the 2 peptides in a mixture (final concentration of 0, 1.25, 2.5, 5, 10 ⁇ M) were incubated for 1 h at 41 ° C. (temperature corresponding to the body temperature of the chicken and the hen). At the end of the incubation, the viability of the parasites was evaluated by staining with aqueous Evans blue (vol / vol).
  • PBS phosphate-buffered saline solution
  • the living (green) and dead (red) parasites were counted using a Zeiss Axiovert 200 microscope. The results are expressed as a percentage of viability relative to the parasites incubated in PBS alone. The results represent the average of 2 technical replicates carried out in 3 independent experiments. Competition with heparin was carried out for whole AvBDll (Gga-AvBDll) at 10 pM, in the presence of heparin at 100 pg / ml, under the conditions described above. Two independent experiments with 2 replicates per condition were carried out.
  • the parasites were fixed for 24 h in 4% paraformaldehyde, 1% glutaraldehyde in 0.1 M phosphate buffer (pH 7.2). They were then washed in PBS and post-fixed by incubation with 2% osmium tetroxide for 1 h. The samples were then completely dehydrated in a graduated series of ethanol solutions and dried in hexamethyldisilazane (HMDS, Sigma, St. Louis, MO, USA). The parasites were observed using a Zeiss Ultra plus FEG-SEM scanning electron microscope (Oberkochen, Germany) at the IBiSA Platform for Electronic Microscopy (Institut Rabelais University of Tours, France). Antiviral effect
  • Gga-AvBDll The antiviral activities of Gga-AvBDll, Gga-AvBDll [l-40], Gga-AvBDll [41-82] and Gga-AvBDll [l-40] + Gga-AvBDll [41-82] were tested in a d model avian influenza virus infection using a chicken pulmonary epithelial cell line (CLEC213) (Esnault et al., 2011, Virus Research, 159, 32-42).
  • CLEC213 chicken pulmonary epithelial cell line
  • CLEC213 cells were cultured in DMEM-F12 medium (Dulbecco's modified Eagle medium / Nutrient F-12 Ham) (Gibco) supplemented with 7.5% fetal calf serum (FCS), 100 U / ml of penicillin and 100 pg / ml streptomycin at 41 ° C and 5% C0 2 .
  • FCS fetal calf serum
  • the viral strain A / Mallard / Marquenterre / Z237 / 83 (H1N1-MZ) used for the infection experiments of CLEC213 cells was recovered by reverse genetics and amplified in MDCK cells (Madin Darby canine kidney) as described previously (Munier et al., 2010, J. Virol., 84, 940-952).
  • the titer (PFU / ml) of the viral stock was determined by a standard plaque test in MDCK cells.
  • the magnitude of the cytopathic effect induced by serial dilutions of the H1N1-MZ virus in CLEC213 cells was determined using the ToxGIo TM viral test (Promega), a luminescence test measuring GATR as a surrogate for viability. cell or viral cytopathogenicity (Noah et al., 2007, Antiviral Research, 73, 50-59).
  • CLEC213 cells were seeded in 96-well plates (5 x 10 3 cells per well) and cultured for 16-18 h in complete medium at 41 ° C and 5% C0 2 .
  • the cells were then washed with PBS and infected with 1/2 log dilutions of the viral stock in DMEM-F12 without SVF (8 wells per dilution). Uninfected control cells were coated with DMEM-F12 without SVF (8 wells).
  • the cells were washed, covered with 100 ⁇ l of ATP Detection Reagent (Promega) and incubated for 20 min at room temperature.
  • the luminescence signals (RLU - relative light units) were measured using a GloMax ® -Multi (Promega) detection system and the TCID50 (50% tissue culture infectious dose, i.e.
  • the cells (6 wells per condition) were untreated (controls) or treated with 0.31-5.00 mM Gga-AvBDll, Gga-AvBDll [1-40], Gga-AvBDll [41-82] or Gga -AvBDll [l-40] + Gga-AvBDll [41-82] in DMEM-F12 medium and the values of luminescence were determined at 48 hours post-treatment (hpt).
  • Relative ATP production values were calculated for the (un) infected and treated cells compared to the mean RLU values obtained for the controls (untreated cells).
  • the effects of heparin treatment on the cytotoxic and / or antiviral activities of Gga-AvBDll were evaluated using the protocol described above, with the following modifications: Gga-AvBDll at a final concentration of 0.50 pM or 5.00 pM was co-incubated (15 min at room temperature) with 100 pg / ml (final concentration) of heparin (Sigma) dissolved in sterile water or with an equal volume of water (- heparin ) before being mixed with the H1N1-MZ virus or being added directly to the CLEC213 cells.
  • NCI-H460 HTB-177TM bronchial tumor cells from a pleural effusion of non-small cell lung cancer were used to assess the anti-invasive capabilities of the whole protein Gga-AvBDll and synthetic peptides Gga -AvBDll [1-40] and Gga-AvBDll [41-82j.
  • NCI-H460 cells were cultured in RPMI 1640 medium (Invitrogen, Cergy Pontoise, France) supplemented with 2 mM L-glutamine, 10 mM HEPES, 1 mM sodium pyruvate, 25 mM sodium bicarbonate, 2 mM glucose, 100 units / mL of penicillin, 100 pg / mL of streptomycin and 10% endotoxin-free fetal calf serum (SVF, Lonza, Basel, Switzerland). The culture flasks were placed at 37 ° C. in a humid atmosphere containing 5% of CO 2 . Culture supernatants were tested regularly to detect the presence of mycoplasmas (PlasmoTest mycoplasma detection kit, InvivoGen, Toulouse, France).
  • the inserts were then placed in wells of a 24-well plate containing 700 ⁇ L of RPMI medium containing 10% of FCS used as chemoattractant. The plates were then incubated for 48 hours at 37 ° C. in a humid atmosphere containing 5% of CO 2 . The cells which migrated under the insert and those adhered to the surface of the well were detached using a solution of 0.05% trypsin / 0.02% EDTA and then counted using a hematimeter of Malassez. Two technical replicates were made for cells incubated with the different molecules and 3 replicates for control cells. The results are expressed as a percentage of invasion relative to the cells which have migrated in the absence of a molecule. The results represent the median +/- 1st quartile / 3rd quartile of 5 independent experiments.
  • MTS cell viability test Cell viability was assessed using an MTS test (CelITiter 96 ® Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay, Promega, Charbonippos, France).
  • MTS test carried out in parallel with the invasion test, 10 4 NCI-H460 cells per well were deposited in a 96-well plate and cultured in 100 ⁇ L of medium without serum containing either Gga-AvBDll or the Gga-AvBDll peptide [1-40] or Gga-AvBDll [41-82], or the two peptides combined at a final concentration of 0, 2, 4, 6, 8 pM.
  • the cells were then incubated for 1 hour with the MTS reagent and then the formation of formazan, proportional to the number of viable cells, was quantified by measuring the absorbance at 490 nm, following the instructions of the supplier. The median of the absorbances obtained with the cells alone corresponds to the reference value 100% of cell viability.
  • Five independent experiments with 2 replicates per condition were carried out for the MTS tests carried out in parallel with the invasion.
  • Three independent experiments with 8 replicates per condition were carried out for the MTS tests carried out in parallel with the quantification of cytokines.

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Abstract

La présente invention est relative à des peptides issus d'une β-défensine 11 aviaire et à leurs utilisations, notamment pharmaceutiques et vétérinaires, pour ses propriétés antibactérienne, antiparasitaire et/ou anti-invasive.

Description

PEPTIDES DERIVES D'UNE BETA-DEFENSINE 11 AVIAIRE ET LEURS UTILISATIONS
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention est relative à des peptides et leurs utilisations, notamment dans le domaine vétérinaire et pharmaceutique.
CONTEXTE DE L'INVENTION
L'œuf d'ovipares permet d'assurer le développement autonome de l'embryon d'oiseau à l'extérieur du corps de la mère. Chez la poule, le développement embryonnaire s'effectue en 21 jours à une température de 37-38°C. L'œuf doit donc contenir naturellement toutes les molécules nécessaires à la croissance de cet embryon et à sa protection. Pour se protéger des contaminations microbiennes, l'œuf dispose d'un système de défense important reposant sur la coquille (barrière physique), sur des propriétés physico-chimiques particulières (pH alcalin et viscosité du blanc d'œuf) et sur la présence d'un arsenal de protéines antimicrobiennes dont les plus connues sont le lysozyme et l'ovotransferrine.
Au total, près de 1000 protéines différentes ont été identifiées dans l'œuf depuis une dizaine d'années grâce au séquençage du génome de la poule en 2004 et au développement des techniques de transcri ptomique et de protéomique. Cependant, les fonctions biologiques de ces protéines sont encore inconnues pour la plupart. Or, au regard des nombreuses fonctions physiologiques supposées des protéines et peptides de l'œuf en lien avec le développement, la croissance et la protection d'un embryon (dont le système immunitaire propre est immature), il est très probable que l'œuf soit une source de nombreuses molécules d'intérêt dans les domaines de la santé ou de l'agro-alimentaire. Par exemple, le lysozyme de blanc d'oeuf est une protéine antimicrobienne utilisée actuellement comme conservateur alimentaire et comme principe actif de plusieurs médicaments.
De nouvelles protéines antibactériennes de l'œuf ont été identifiées dont la b- défensine 11 aviaire (AvBDll) (Hervé-Grépinet et al, 2010, Antimicrob Agents Chemother, 54, 4401-4409 ; Guyot et al, 2016, Sci Rep, 6, 27974). AvBDll (anciennement Vitelline Membrane Outer loyer protein II (ou VMO-II) (Kido et al, 1992, Biochem J, 286, 17-22 ; Xiao et al, 2004, BMC Genomics, 5, 56) fait partie des b-défensines aviaires ou gallinacines (Harwig et al, 1994, FEBS Lett, 342, 281-285 ; Sugiarto et al, 2004, Biochem Biphys Res Commun, 323, 721-727). Les défensines sont des peptides antimicrobiens (2-5 kDa) de l'immunité innée, généralement cationique. Leur structure tridimensionnelle est organisée en feuillet b et présente 3 ponts disulfures. Les défensines de mammifères sont regroupées en 3 sous-familles : alpha, bêta et thêta-défensines (Ganz, 2003, Nat Rev Immunol, 3, 710-720). L'appartenance à ces différentes sous-familles est déterminée par la structure tridimensionnelle, la répartition des cystéines et l'appariement de ces dernières dans la formation des ponts disulfure. Chez les oiseaux, seules des défensines de la famille b, classées en 2 sous-groupes, sont retrouvées : les ovodéfensines (comme la galline) et les b-défensines aviaires (AvBD) dont fait partie AvBDll (Van Dijk et al, 2008, Vet Immunol Immunopathol, 124, 1-18 ; Whenham et al, 2015, Biol Reprod, 92, 154).
L' AvBDll de Gallus gallus possède des activités antimicrobiennes envers les bactéries à Gram positif et négatif comme Salmonella enterica sérovar Enteritidis, Listeria monocytogenes et Staphyiococcus aureus (Hervé-Grépinet et al, 2010, Antimicrob Agents Chemother, 54, 4401- 4409). L'AvBDll présente une séquence primaire de défensine encore absente chez les mammifères. Sa séquence peptidique (82 acides aminés, 9,28 kDa) est en effet plus longue que les autres défensines en raison de la présence de 2 motifs « b-défensine » (soit 6 ponts disulfure). Il a été proposé dans Hervé-Grépinet et al, 2010 que la partie C-terminale pourrait inclure la partie biologiquement active de cette b-défensine étant donné que celle-ci présente une identité de séquence de 27% avec la région correspondante de la b-défensine 3 humaine.
Il existe un besoin grandissant d'identifier et développer de nouvelles molécules permettant de traiter des maladies infectieuses (alternatifs aux anti-infectieux conventionnels) et cancéreuses donc utiles dans les domaines de la santé et comme conservateur ou pour augmenter la plus-value d'un aliment (« functional food ») dans le domaine de l'agro-alimentaire, notamment des molécules présentant des effets antibactérien, antiparasitaire, antiviral, anti-invasif et/ou cytotoxique contre les cellules cancéreuses.
RESUME DE L'INVENTION
Dans ce contexte, les inventeurs ont d'une part découvert que la b-défensine 11 aviaire de poule initialement décrite comme antibactérienne présente également un effet antiparasitaire, antiviral, anti-invasif et cytotoxique. D'autre part, ils ont découvert que, parmi les deux domaines de type b-défensine présents dans la b-défensine 11 aviaire, c'est la partie N-terminale qui est responsable des effets antibactériens, antiparasitaires et anti-invasifs observés dans la protéine entière. L'activité antibactérienne du domaine N-terminal a été démontrée aussi bien pour la b-défensine 11 de poule (Gallus gallus) que la b-défensine 11 de cane (Anas platyrhynchos). Ainsi, un peptide dérivé de la partie N-terminale conserve ces effets observés sur la protéine entière alors qu'un peptide dérivé de la partie C-terminale ne présente aucun effet ou un effet beaucoup plus faible. En outre, le peptide dérivé de la partie N-terminale est dénuée de l'effet cytotoxique qui a été observé pour la b-défensine 11 aviaire entière.
Ainsi, la présente invention est relative à une molécule peptidique ou une composition comprenant cette molécule peptidique pour son utilisation comme médicament, la molécule peptique comprenant une séquence choisie parmi les séquences suivantes :
C1XXXXGXC2XXXXXC3PXPFXXFGTC4XXXXXTC5C6 (SEQ ID NO 4) ;
DTXXC1XXXXGXC2XXXXXC3PXPFXXFGTC4XXXXXTC5C6 (SEQ ID NO 5) ; et
XXXDTXXC1XXXXGXC2XXXXXC3PXPFXXFGTC4XXXXXTC5C6X (SEQ ID NO 6) dans lesquelles X est un quelconque acide aminé, différent ou identique, et la molécule peptidique comprenant au plus 70 acides aminés.
Dans un mode de réalisation particulier, la molécule peptidique comprenant au plus 50, 55 ou 60 acides aminés.
Par ailleurs, la présente invention est relative à une molécule peptidique comprenant une séquence choisie parmi les séquences suivantes :
C1XXXXGXC2XXXXXC3PXPFXXFGTC4XXXXXTC5C6 (SEQ ID NO 4) ;
DTXXC1XXXXGXC2XXXXXC3PXPFXXFGTC4XXXXXTC5C6 (SEQ ID NO 5) ; et
XXXDTXXC1XXXXGXC2XXXXXC3PXPFXXFGTC4XXXXXTC5C6X (SEQ ID NO 6) dans lesquelles X est un quelconque acide aminé, différent ou identique, le peptide comprenant au maximum 50, 55 ou 60 acides aminés ; et le peptide ne consistant pas en les séquences
LSLPRDTSRCVGYHGYCIRSKVCPKPFAAFGTCSWRQKTCCV (SEQ ID NO 10)
LSLPRDTSRCVGYHGYCICSKVCPKPFAAFGTCSWRQKTCCV (SEQ ID NO 11). De préférence, X n'est pas une cystéine et est choisi en particulier dans le groupe consistant en Ala, Arg, Asp, Asn, Gin, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr et Val.
Dans un aspect particulier, la molécule peptidique, que ce soit en tant que telle ou pour ses utilisations, comprend une séquence choisie parmi les séquences suivantes :
- CI-[V/L]-[G/A/R/E]-[Y/H]-[H/E]-G-[Y/F/H]-C2-[F/Y/L/I]-[R/Q/H]-[S/L/P]-[K/R]- [S/T/A/V]-C3-P-X-P-F-[A/T/V]-[A/S]-F-G-T-C4-[S/F/Y/A]-[W/Q/E/R]-[R/H/G]- [Q/R/H]-[K/R/E]-T-C5-C6 (SEQ ID NO 7), avec X étant un quelconque acide aminé à l'exclusion d'une cystéine, de préférence choisi dans le groupe consistant en K, P, E, G, D, R, et A ; ou
- D-T-[L/S/Q]-[R/H]-CI-[V/L]-[G/A/R/E]-[Y/H]-[H/E]-G-[Y/F/H]-C2-[F/Y/L/I]-[R/Q/H]- [S/L/P]-[K/R]-[S/T/A/V]-C3-P-X-P-F-[A/T/V]-[A/S]-F-G-T-C4-[S/F/Y/A]-[W/Q/E/R]- [R/H/G]-[Q/R/H]-[K/R/E]-T-C5-C6 (SEQ. ID NO 8), avec X étant un quelconque acide aminé à l'exclusion d'une cystéine, de préférence choisi dans le groupe consistant en K, P, E, G, D, R, et A ; ou
- [L/M]-[P/S]-[K/R/T]-D-T-[L/S/Q]-[R/H]-Ci-[V/L]-[G/A/R/E]-[Y/H]-[H/E]-G-[Y/F/H]- C2-[F/Y/L/I]-[R/Q/H]-[S/L/P]-[K/R]-[S/T/A/V]-C3-P-X-P-F-[A/T/V]-[A/S]-F-G-T-C4- [S/F/Y/A]-[W/Q/E/R]-[R/H/G]-[Q/R/H]-[K/R/E]-T-C5-C6-[V/I/L] (SEQ ID NO 9), avec X étant un quelconque acide aminé à l'exclusion d'une cystéine, de préférence choisi dans le groupe consistant en K, P, E, G, D, R, et A.
De préférence, les molécules peptidiques comprennent trois ponts disulfure, en particulier entre les cystéines: C1-C5, C2-C4 et C3-C6.
Dans un mode de réalisation très particulier, la molécule peptidique, que ce soit en tant que telle ou pour ses utilisations, comprend, consiste essentiellement en ou consiste en l'une des séquences suivantes :
LPRDTSRCVGYHGYCIRSKVCPKPFAAFGTCSWRQKTCCV (SEQ ID NO 2)
CVGYHGYCIRSKVCPKPFAAFGTCSWRQKTCC (SEQ ID NO 12) et
DTSRCVGYHGYCIRSKVCPKPFAAFGTCSWRQKTCC (SEQ ID NO 13).
Par ailleurs, la molécule peptidique pour ses utilisations peut également être choisie dans le groupe consistant en LPRDTSRCVGYHGYCIRSKVCPKPFAAFGTCSWRQKTCCV (SEQ. ID NO 2) LSLPRDTSRCVGYHGYCIRSKVCPKPFAAFGTCSWRQKTCCV (SEQ ID NO 10)
LSLPRDTSRCVGYHGYCICSKVCPKPFAAFGTCSWRQKTCCV (SEQ ID NO 11)
CVGYHGYCIRSKVCPKPFAAFGTCSWRQKTCC (SEQ ID NO 12)
DTSRCVGYHGYCIRSKVCPKPFAAFGTCSWRQKTCC (SEQ ID NO 13),
LPKDTLRCVRYHGFCFQPKACPPPFAAFGTCSQRQKTCCI (SEQ ID NO 21),
DTLRCVRYHGFCFQPKACPPPFAAFGTCSQRQKTCC (SEQ ID NO 23), et
CVRYHGFCFQPKACPPPFAAFGTCSQRQKTCC (SEQ ID NO 24).
La présente invention est également relative à une molécule peptidique telle que décrite ci-dessus pour son utilisation en tant qu'agent antibactérien, antiparasitaire et/ou anti-invasif.
Facultativement, la molécule peptidique pour son utilisation en tant que médicament est destinée à être utilisée en combinaison avec un autre composé d'intérêt thérapeutique.
La présente invention est également relative à une composition pharmaceutique ou vétérinaire comprenant une molécule peptidique telle que décrite ci-dessus, et facultativement un autre composé d'intérêt thérapeutique. Elle est en outre relative à cette composition pharmaceutique ou vétérinaire pour son utilisation pour le traitement ou la prévention d'une infection bactérienne, le traitement ou la prévention d'une infection par un parasite ou pour le traitement d'un cancer, en particulier pour son utilisation pour traiter ou prévenir une coccidiose, le parasite étant Eimeria.
Enfin, la présente invention est relative à l'utilisation d'une molécule peptidique telle que décrite ci-dessus comme conservateur alimentaire ou comme additif alimentaire.
DESCRIPTION DES FIGURES
Figure 1. Séquences protéiques et points iso-électriques de la b-défensine 11 aviaire (AvBDll) de poule et des peptides AvBDll[l-40] et AvBDll[41-82]. Le précurseur protéique d'AvBDll (Accession NP_001001779) est une protéine de 104 acides aminés. L'AvBDll mature est un polypeptide cationique (pl théorique = 8,78) de 82 acides aminés contenant deux motifs de type « beta-défensine » (CX CX CX CX CC et CX CX CX CX CC) codés par deux exons différents. Les séquences en acides aminés du domaine N-terminal (AvBDll[l-40]) et du domaine C-terminal (AvBDll[41-82]), délimitées par la jonction exon-exon, ont différentes propriétés de charge avec des valeurs de pl théoriques de 9,34 et 6,88, respectivement.
Figure 2A. Effet-dose de l'AvBDll de poule et des peptides AvBDll[l-40] et AvBDll[41-82] contre Salmonella enterica Entendis ATCC 13076 et Listeria monocytogenes EGD. Les activités antibactériennes sont visualisées par la formation d'un disque d'inhibition en utilisant la technique de diffusion radiale en milieu gélosé. Le MSI-94 (peptide antimicrobien dérivé de la magainine) est utilisé comme témoin positif.
Figure 2B. Effet de l'héparine (0, 20, 100 ng/pL) sur l'activité antibactérienne de l'AvBDll de poule et des peptides AvBDll[l-40] et AvBDll[41-82], utilisés à 12 mM, contre Salmonella enterica Enteritidis ATCC 13076 et Listeria monocytogenes EGD.
Figure 3. L'AvBDll de poule entière et le peptide AvBDll[l-40] (Nter) induisent la mortalité des parasites Eimeria tenella. Cette activité est abolie en présence d'héparine.
Figure 3A. Observation par microscopie électronique à balayage de parasites après 1 h d'incubation avec du PBS (contrôle) ou 10 pM de l'AvBDll de poule. La barre d'échelle représente 2 pm. Figure 3B. Pourcentage de viabilité des parasites, après incubation avec les peptides à différentes concentrations. Les données présentées sont les moyennes ± SEM de trois expériences indépendantes. Nter : AvBDll[l-40] ; Cter : AvBDll[41-82] ; Nter+Cter : AvBDll[l-40] + AvBDll[41-82]. Figure 3C. L'activité antiparasitaire de l'AvBDll de poule à 10 pM est abolie en présence d'héparine à 100 pg/mL.
Figure 4. L'AvBDll de poule présente une activité antivirale nette à des concentrations provoquant une cytotoxicité légère (2,50 pM) ou importante (5,00 pM). Les activités cytotoxiques et antivirales marquées d'AvBDll de poule sont abolies en présence d'héparine.
Figure 4A : Production d'ATP relative dans les cellules CLEC213 non infectées ou les cellules infectées en réponse aux traitements avec différentes concentrations d'AvBDll de poule et des peptides AvBDll[l-40], AvBDll[41-82] ou AvBDll[l-40] + AvBDll[41-82], Les valeurs de la production d'ATP relative ont été calculées pour les cellules (non) infectées et traitées par rapport aux valeurs des RLU (signaux de luminescence) moyennes obtenues pour les témoins (cellules non traitées). Les données représentent les moyennes ±SEM de 2-3 expériences indépendantes, ns : p > 0,05 ; * : 0,01 < p < 0,05 ; ** : 0,001 < p < 0,01 ; *** : 0,0001 < p < 0,001 ; **** : p < 0,0001. Figure 4B : Production d'ATP relative dans les cellules CLEC213 non infectées (barres rayées) ou infectées (barres pleines) en réponse aux traitements avec 0,00 mM (témoins non traités), 0,50 mM ou 5,00 mM d'AvBDll de poule en l'absence ou en présence d'héparine (100 pg/ml) (- / + héparine). Les données représentent les moyennes ±SEM d'une expérience avec six répétitions par condition.
Figure 5. Effet de l'AvBDll de poule et des peptides AvBDll[l-40] et AvBDll[41-82]) sur l'invasion et la viabilité des cellules NCI-H460 (lignée cellulaire issue d'un carcinome pulmonaire humain non à petites cellules). Les résultats d'invasion et de viabilité ont été analysés après 48 heures d'incubation. Ils sont exprimés par un pourcentage d'invasion ou de viabilité des cellules incubées avec AvBDll ou les peptides, comparé à celui des cellules contrôles. Les résultats représentent la médiane ± 1er quartile/3ème quartile d'au moins 5 expérimentations indépendantes, chacune étant réalisée au moins en double. Le test de Kruskal-Wallis et de Dunn a été utilisé pour comparer les résultats des cellules traitées avec différentes concentrations de molécules par rapport à ceux des cellules contrôles. Le test de Mann Whitney a été utilisé pour comparer les résultats d'invasion et de viabilité obtenus pour une même concentration de molécule testée. * p < 0.05 ; ** p < 0.01 ; *** p < 0.0001 ; **** p < 0.0001.
Figure 6. Effet de la co-incubation de l'héparine non fractionnée avec 6 mM d'AvBDll de poule ou de peptide AvBDll[l-40] (N) sur l'invasion et la viabilité des cellules tumorales pulmonaires non à petites cellules NCI-H460. Les résultats d'invasion (couleur foncée) et de test MTS (viabilité) (couleur pâle) ont été analysés après 48 heures d'incubation. Ils représentent la médiane ± 1er quartile/3ème quartile de 3 expérimentations indépendantes, chacune étant réalisée en double. Le test de Kruskal-Wallis et de Dunn a été utilisé pour comparer les résultats des cellules traitées avec différentes concentration de molécules par rapport à ceux des cellules contrôles. Le test de Mann Whitney a été utilisé pour comparer les résultats d'invasion et de viabilité obtenus pour une même concentration de molécule testée. * p < 0.05 ; ** p < 0.01 ; *** p < 0.0001 ; **** p < 0.0001. DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
Définition
Dans le présent document, les termes « peptide », « oligopeptide », « polypeptide » et « protéine » sont utilisés indifféremment et se réfèrent à une chaîne d'acides aminés reliés par des liaisons peptidiques, quel que soit le nombre de résidus d'acide aminé constituant cette chaîne.
Les séquences peptidiques définies dans le présent document sont représentées avec le symbole en une lettre tel qu'indiqué ci-dessous :
A Ala (alanine)
R Arg (arginine)
N Asn (asparagine)
D Asp (acide aspartique)
C Cys (cystéine)
Q. Gin (glutamine)
E Glu (acide glutamique)
G Gly (glycine)
H His (histidine)
I Ile (isoleucine)
L Leu (leucine)
K Lys (lysine)
M Met (méthionine)
F Phe (phénylalanine)
P Pro (proline)
S Ser (sérine)
T Thr (thréonine)
W Trp (tryptophane)
Y Tyr (tyrosine)
V Val (valine)
Tel qu'utilisé ici, le terme « acide aminé » se réfère aux 20 résidus d'acides aminés standard naturels (G, P, A, V, L, I, M, C, F, Y, W, H, K, R, Q., N, E, D, S et T), aux résidus d'acides aminés naturels rares (par exemple l'hydroxyproline, l'hydroxylysine, l'allohydroxylysine, la 6- N-méthylysine, la N-éthylglycine, la N-méthylglycine, la N-éthylasparagine, l'allo-isoleucine, la N-méthylisoleucine, la N-méthylvaline ou l'acide aminobutyrique) et aux acides aminés non naturels (par exemple norleucine, norvaline et cyclohexyl-alanine). De préférence, ce terme se réfère aux 20 résidus d'acides aminés standard naturels (G, P, A, V, L, I, M, C, F, Y, W, H, K, R, Q, N, E, D, S et T).
Le terme « substitution », tel qu'utilisé ici désigne le remplacement d'un résidu d'acide aminé par un autre choisi parmi les 20 résidus d'acides aminés standard naturels, les résidus d'acides aminés naturels rares et d'acides aminés non naturels. De préférence, le terme « substitution » se réfère au remplacement d'un résidu d'acide aminé par un autre choisi parmi les 20 résidus d'acides aminés standards naturels (G, P, A, V, L, I, M, C, F, Y, W, H, K, R, Q., N, E, D, S et T). La ou les substitutions peuvent être des substitutions conservatives ou non conservatives. Le terme « substitution conservative » tel qu'utilisé dans ce document, se réfère à une substitution d'un résidu d'acide aminé par un autre qui présente des propriétés chimiques ou physiques similaires (taille, charge ou polarité). Des exemples de substitutions conservatives sont présentés dans les tableaux suivants.
Tableau 1
Tableau 2 - Groupes de substitution conservative alternatifs
Tableau 3 - Classification fonctionnelle et physique supplémentaire des acides aminés
«Consiste en» une séquence particulière, sauf indication contraire ou clairement contredite par le contexte, doit être compris comme décrivant un peptide consistant en cette séquence. Par « consiste essentiellement en », on entend que le peptide consiste en cette séquence, mais il peut également comprendre 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 substitutions, additions, délétions ou un mélange de celui-ci, de préférence 1, 2, 3, 4 ou 5 substitutions, additions, délétions ou un mélange de ceux-ci. En particulier, par « essentiellement consistant en », on peut envisager que le peptide puisse comprendre 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 acides aminés supplémentaires au niveau de l'extrémité N et / ou C-terminale, de préférence 1, 2, 3, 4 ou 5 acides aminés supplémentaires, et / ou 1, 2 ou 3 substitutions, délétions, additions, ou un mélange de ceux-ci. De préférence, le nombre de substitutions, d'additions, de délétions ou d'un mélange de celles-ci dépend de la longueur de la séquence. Par exemple, le pourcentage de substitutions, de délétions, d'additions ou d'un mélange de ceux-ci peut ne pas dépasser 30%, de préférence pas plus de 25%. Tel qu'utilisé ici, le terme "substitution" se réfère à l'échange d'un seul acide aminé par un autre dans une séquence peptidique ; le terme "délétion" se réfère à l'élimination d'un seul acide aminé dans une séquence peptidique ; le terme "insertion" ou "addition" est équivalent et se réfère à l'addition d'un seul acide aminé dans une séquence peptidique.
Tel qu'utilisé ici, le terme "identité de séquence" ou "identité" se réfère au nombre (%) d'appariements (résidus d'acides aminés identiques) aux positions provenant d'un alignement de deux séquences polypeptidiques. L'identité de séquence est déterminée en comparant les séquences lorsqu'elles sont alignées de manière à maximiser le chevauchement et l'identité tout en minimisant les interruptions de séquence. En particulier, l'identité de séquence peut être déterminée en utilisant l'un quelconque des nombreux algorithmes d'alignement global ou local, en fonction de la longueur des deux séquences. Des séquences de longueurs similaires sont de préférence alignées en utilisant des algorithmes d'alignement global (e.g. Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol 48:443, 1970) qui alignent les séquences de manière optimale sur toute la longueur, tandis que des séquences de longueurs sensiblement différentes sont de préférence alignées en utilisant un algorithme d'alignement local, par exemple l'algorithme de Smith et Waterman (Smith et Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981) ou l'algorithme d'AltschuI (Altschul et al (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 ; Altschul et al (2005) FEBS J. 272:5101-5109). L'alignement dans le but de déterminer le pourcentage d'identité de séquence d'acides aminés peut être réalisé par toute méthode connue de l'homme du métier, par exemple en utilisant un logiciel disponible sur des sites Internet tels que http: //blast.ncbi.nlm. nih.gov / ou http://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/. L'homme de l'art peut aisément déterminer les paramètres appropriés pour mesurer l'alignement. Aux fins de la présente invention, les valeurs de pourcentage d'identité de séquence d'acides aminés désignent des valeurs générées en utilisant le programme EMBOSS Needle d'alignement de séquences par paires qui crée un alignement global optimal de deux séquences en utilisant l'algorithme de Needleman-Wunsch dans lequel les paramètres sont les paramètres par défaut : Scoring matrix = BLOSUM62, Gap open = 10, Gap extend = 0.5, End gap penalty = false, End gap open = 10 and End gap extend = 0.5.
Dans le contexte de la présente invention, le terme « traitement » ou « traiter » inclut le traitement préventif, curatif, palliatif, ainsi que la prise en charge des sujets (réduction de la souffrance, amélioration de la durée de vie, ralentissement de la progression de la maladie, réduction de la croissance tumorale, diminution de la taille des tumeurs, la prévention ou la diminution des métastases et des rechutes etc.).
L'expression "quantité thérapeutiquement efficace", telle qu'utilisée ici, se réfère à une quantité qui résulte en une amélioration de l'état d'un organe ou d'un sujet, ou en une diminution de la maladie, du trouble ou des symptômes de la maladie ou du trouble en question.
Telle qu'utilisée ici, une "composition pharmaceutique" désigne une préparation d'un ou plusieurs des agents actifs avec d'autres composants chimiques optionnels tels que des supports physiologiquement appropriés et/ou des excipients. Le but d'une composition pharmaceutique est de faciliter l'administration de l'agent actif à un organisme. Les compositions de la présente invention peuvent se présenter sous une forme appropriée pour toute voie d'administration ou d'utilisation conventionnelle. La composition pharmaceutique selon l'invention englobe les compositions pharmaceutiques utilisées en médecine humaine et les compositions pharmaceutiques utilisées en médecine animale, c'est à dire les compositions vétérinaires. Dans un mode de réalisation, la composition pharmaceutique comprend en outre un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
Tels qu'utilisés ici, les termes « support pharmaceutiquement acceptable » ou « excipient pharmaceutiquement acceptable » ou «véhicule pharmaceutiquement acceptable » sont interchangeables et comprennent tous composés ou combinaisons de composés qui sont connus de l'homme de l'art comme étant utiles dans la formulation de compositions pharmaceutiques ou vétérinaires. Dans le contexte de la présente invention, on entend par «physiologiquement acceptable » ou « pharmaceutiquement acceptable », tout milieu ou additif qui n'interfère pas avec l'efficacité de l'activité biologique du principe actif (ici, les molécules peptidiques), et qui n'est pas excessivement toxique pour le patient ou sujet, aux concentrations auxquelles il est administré et/ou qui ne produisent pas de réaction indésirable lorsqu'elles sont administrées à un humain ou à un animal. Un véhicule, un support ou un excipient physiologiquement acceptable peut être approprié à l'administration aux humains et/ou aux animaux (en particulier aux mammifères).
Peptides ou Molécules peptidiques
La présente demande est donc relative à un peptide dérivé de la partie N-terminale d'une b-défensine 11 aviaire. Ce peptide ou molécule peptidique comprend, consiste essentiellement en ou consiste en la séquence consensus suivante :
C1XXXXGXC2XXXXXC3PXPFXXFGTC4XXXXXTC5C6 (SEQ ID NO 4) dans laquelle X est un quelconque acide aminé, différent ou identique, de préférence à l'exclusion d'une cystéine. De préférence, X peut être choisi dans le groupe consistant en Ala, Arg, Asp, Asn, Gin, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr et Val.
Dans un aspect de la demande, le peptide ou molécule peptidique comprend, consiste essentiellement en ou consiste en la séquence consensus suivante :
DTXXC1XXXXGXC2XXXXXC3PXPFXXFGTC4XXXXXTC5C6 (SEQ ID NO 5) dans laquelle X est un quelconque acide aminé, différent ou identique, de préférence à l'exclusion d'une cystéine. De préférence, X peut être choisi dans le groupe consistant en Ala, Arg, Asp, Asn, Gin, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr et Val.
Par exemple, le peptide ou molécule peptidique peut comprendre, consister essentiellement en ou consister en la séquence consensus suivante : XXXDTXXC1XXXXGXC2XXXXXC3PXPFXXFGTC4XXXXXTC5C6X (SEQ ID NO 6) dans laquelle X est un quelconque acide aminé, différent ou identique, de préférence à l'exclusion d'une cystéine. De préférence, X peut être choisi dans le groupe consistant en Ala, Arg, Asp, Asn, Gin, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr et Val.
Dans un aspect particulier de la demande, le peptide ou molécule peptidique comprend, consiste essentiellement en ou consiste en l'une des séquences suivantes :
- CI-[V/L]-[G/A/R/E]-[Y/H]-[H/E]-G-[Y/F/H]-C2-[F/Y/L/I]-[R/Q/H]-[S/L/P]-[K/R]- [S/T/A/V]-C3-P-X-P-F-[A/T/V]-[A/S]-F-G-T-C4-[S/F/Y/A]-[W/Q/E/R]-[R/H/G]-[Q/R/H]- [K/R/EJ-T-C5-C6 (SEQ ID NO 7), avec X étant un quelconque acide aminé à l'exclusion d'une cystéine, de préférence choisi dans le groupe consistant en K, P, E, G, D, R, et A ; ou
- D-T-[L/S/Q]-[R/H]-CI-[V/L] -[G/A/R/E]-[Y/H]-[H/E]-G-[Y/F/H]-C2-[F/Y/L/I]-[R/Q/H]- [S/L/P]-[K/R]-[S/T/A/V]-C3-P-X-P-F-[A/T/V]-[A/S]-F-G-T-C4-[S/F/Y/A]-[W/Q/E/R]- [R/H/G]-[Q/R/H]-[K/R/E]-T-C5-C6 (SEQ ID NO 8), avec X étant un quelconque acide aminé à l'exclusion d'une cystéine, de préférence choisi dans le groupe consistant en K, P, E, G, D, R, et A ; ou
- [L/M]-[P/S]-[K/R/T]-D-T-[L/S/Q]-[R/H]-CI-[V/L]-[G/A/R/E]-[Y/H]-[H/E]-G-[Y/F/H]-C2- [F/Y/L/I]-[R/Q/H]-[S/L/P]-[K/R]-[S/T/A/V]-C3-P-X-P-F-[A/T/V]-[A/S]-F-G-T-C4-[S/F/Y/A]- [W/Q/E/R]-[R/H/G]-[Q/R/H]-[K/R/E]-T-C5-C6-[V/I/L] (SEQ ID NO 9), avec X étant un quelconque acide aminé à l'exclusion d'une cystéine, de préférence choisi dans le groupe consistant en K, P, E, G, D, R, et A.
Facultativement, le peptide ou molécule peptidique peut comprendre 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 substitutions conservatives, ces substitutions ne concernant pas les cystéines. De préférence, ces substitutions ne concernent pas les résidus d'acides aminés définis dans les séquences de SEQ ID NOs 4-6.
Dans un mode de réalisation particulier, le peptide ne consiste pas en les séquences
LSLPRDTSRCVGYHGYCIRSKVCPKPFAAFGTCSWRQKTCCV (SEQ ID NO 10)
LSLPRDTSRCVGYHGYCICSKVCPKPFAAFGTCSWRQKTCCV (SEQ ID NO 11).
Dans un mode de réalisation très particulier, le peptide ou molécule peptidique comprend, consiste essentiellement en ou consiste en l'une des séquences suivantes :
LPRDTSRCVGYHGYCIRSKVCPKPFAAFGTCSWRQKTCCV (SEQ ID NO 2) CVGYHGYCI RSKVCPKPFAAFGTCSWRQKTCC (SEQ I D NO 12)
DTSRCVGYHGYCIRSKVCPKPFAAFGTCSWRQKTCC (SEQ I D NO 13)
LPKDTLRCVRYHGFCFQPKACPPPFAAFGTCSQRQKTCCI (SEQ ID NO 21),
DTLRCVRYHGFCFQPKACPPPFAAFGTCSQRQKTCC (SEQ ID NO 23), et
CVRYHGFCFQPKACPPPFAAFGTCSQRQKTCC (SEQ ID NO 24).
Dans un autre mode de réalisation très particulier, le peptide ou molécule peptidique comprend, consiste essentiellement en ou consiste en l'une des séquences suivantes :
LPRDTSRCVGYHGYCIRSKVCPKPFAAFGTCSWRQKTCCV (SEQ I D NO 2)
CVGYHGYCI RSKVCPKPFAAFGTCSWRQKTCC (SEQ I D NO 12) et
DTSRCVGYHGYCIRSKVCPKPFAAFGTCSWRQKTCC (SEQ I D NO 13).
Dans un autre mode de réalisation très particulier, le peptide ou molécule peptidique comprend, consiste essentiellement en ou consiste en l'une des séquences suivantes :
LPKDTLRCVRYHGFCFQPKACPPPFAAFGTCSQRQKTCCI (SEQ ID NO 21),
DTLRCVRYHGFCFQPKACPPPFAAFGTCSQRQKTCC (SEQ ID NO 23), et
CVRYHGFCFQPKACPPPFAAFGTCSQRQKTCC (SEQ ID NO 24).
Dans un mode de réalisation préféré, le peptide ou molécule peptidique comprend trois ponts disulfures formés par les six cystéines Ci, C2, C3, C4, Cs et C6 du peptide. Plus particulièrement, les ponts disulfures sont les suivants : C1-C5, C2-C4 et C3-C6. Par un pont disulfure Ci-Cs est entendu un pont disulfure entre la cystéine Ci et la cystéine C5, etc. Dans le contexte de ce mode de réalisation, le peptide ou molécule peptidique selon la présente invention peut consister en l'une des séquences SEQ ID NOs 10-11.
De préférence, le peptide ou molécule peptidique comprend au plus 70, 65, 60, 55, 50 ou 45 acides aminés. Le peptide utilisé selon l'invention a de préférence une taille comprise entre 30 et 100 acides aminés, de manière plus particulièrement préférée comprise entre 30 et 70 acides aminés, et de manière encore plus particulièrement préférée comprise entre 30 et 60, entre 30 et 55, entre 30 et 50 ou entre 30 et 45 acides aminés. Selon un mode de réalisation particulier, le peptide utilisé selon l'invention a une taille de 30 à 45 acides aminés.
Facultativement, la molécule peptidique peut comprendre en outre d'autres séquences peptidiques, du côté N-terminal ou C-terminal. Le peptide peut également comprendre, en N-terminal ou C-terminal, un tag (ou étiquette) utile pour la purification ou l'immobilisation du peptide. De tels tags sont bien connus de l'homme du métier et incluent par exemple les tags histidine (Hise), FLAG, HA (épitope dérivé de l'hémagglutinine du virus de la grippe), MYC (épitope dérivé de la proto oncoprotéine humaine MYC) ou GST (glutathion-S-transférase). Optionnellement, le peptide peut comprendre un site de clivage par une protéase ou un agent chimique permettant de supprimer ce tag.
Le peptide peut également comprendre un élément facilitant la pénétration cellulaire de la molécule. En particulier, cet élément est un peptide facilitant la pénétration cellulaire de la molécule (élément CPP). Ces peptides sont bien connus de l'homme du métier (par exemple, Vivès et al, Biochimica et Biophysica Acta, 2008, 1786, 126-138). Par exemple et à titre non limitatif, le peptide facilitant la pénétration cellulaire peut être choisi par le groupe consistant en un peptide de Tat, un peptide d'antennapédia ou pénétratine, et un peptide riche en arginine et en lysine, de préférence riche en arginine, notamment un peptide comprenant au moins 9 résidus d'arginine.
Par ailleurs, les ou des liaisons peptidiques de la molécule peptidique selon la présente invention peuvent être modifiées pour les rendre résistantes à la protéolyse. Par exemple, au moins une liaison peptidique (-CO-NH-) peut être remplacée par une liaison divalente choisie parmi (-CH2-NH-), (-NH-CO-), (-CH2-0-), (-CH2-S-), (-CH2-CH2-), (-CO-CH2-), (-CHOH-CH2-), (- N=N-), et (-CH=CH-). Facultativement, toutes les liaisons peptidiques peuvent être remplacées.
La molécule peptidique peut comprendre soit une extrémité C terminale carboxylique (-COO ) ou amidée (-CONH2). Le peptide peut également être facultativement modifié à son extrémité N-terminale, par exemple par un radical acétyle.
Les isomères L et D des acides aminés sont envisagés. En effet, les isomères D ne sont pas sensibles aux protéases et la présente invention comprend également des molécules comprenant des D acides aminés, notamment des molécules comprenant uniquement ou essentiellement des D acides aminés. Dans un mode particulier, les acides aminés L sont préférés.
L'invention concerne également les sels dudit peptide et leurs utilisations, de préférence de sels acceptables sur le plan pharmaceutique ou vétérinaire. Un sel acceptable sur le plan pharmaceutique ou vétérinaire est un sel qui ne présente pas de toxicité notable, à la dose où il est utilisé. Les sels peuvent être, par exemple, les sels avec des acides minéraux acceptables tels que l'acide chlorhydrique, l'acide bromhydrique, l'acide sulfurique et l'acide phosphorique ; les sels avec des acides organiques acceptables tels que l'acide acétique, l'acide citrique, l'acide maléique, l'acide malique, l'acide succinique, l'acide ascorbique et l'acide tartrique ; les sels avec des bases minérales acceptables tels que les sels de sodium, de potassium, de calcium, de magnésium ou d'ammonium ; ou les sels avec des bases organiques qui ont un azote salifiable. Selon certains modes de réalisation préférés, le sel est un sulfate d'ammonium. Ces sels sont couramment utilisés et leurs méthodes de préparation sont bien connues de l'homme du métier.
La présente invention est également relative à une composition pharmaceutique ou vétérinaire comprenant un peptide ou une molécule peptidique telle que décrit ci-dessus. La composition pharmaceutique ou vétérinaire peut comprendre un support pharmaceutiquement acceptable. b défensine 11 aviaire (AvBDll)
La présente invention est également relative à de nouvelles utilisations d'une b défensine 11 aviaire telles que décrites ci-dessous, en particulier en tant qu'agent antiparasitaire, en tant qu'agent antiviral, en tant qu'agent anti-invasif et en tant qu'agent cytotoxique. Par « AvBDll » il sera fait référence ici aux b défensines 11 aviaires telles que décrites ci-dessous dans cette section.
La b défensine 11 aviaire peut comprendre, consister essentiellement en ou consister en l'une des séquences telles que décrites dessous :
CiXXXXGXCzXXXXXCsPXPFXXFG-n^XXXXXTCsCeXDXTSXXXXC XXXXGHCsVXXXXXCgXXXtQ/ H]XGXCioXXXXWXCnCi2 (SEQ ID NO 14)
DTXXC1XXXXGXC2XXXXXC3PXPFXXFGTC4XXXXXTC5C6XDXTSXXXXC7XXXXG HC8VXXXXXC9XX X[Q/H]XGXCI0XXXXWXCIICI2X[E/D] (SEQ ID NO 15)
XXXDTXXC1XXXXGXC2XXXXXC3PXPFXXFGTC4XXXXXTC5C6XDXTSXXXXC7XXXXGHC8VXXXXX C9XXX[Q/H]XGXCIOXXXXWXCIICI2X[E/D]X (SEQ ID NO 16) dans laquelle X est un quelconque acide aminé, différent ou identique, de préférence à l'exclusion d'une cystéine. De préférence, X peut être choisi dans le groupe consistant en Ala, Arg, Asp, Asn, Gin, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr et Val.
Dans un aspect particulier, la b défensine 11 aviaire peut comprendre, consister essentiellement en ou consister en l'une des séquences telles que décrites dessous :
CI-[V/L]-[G/A/R/E]-[Y/H]-[H/E]-G-[Y/F/H]-C2-[F/Y/L/I]-[R/Q/H]-[S/L/P]-[K/R]-[S/T/A/V]-C3- P-[K/P/E/G/D/R/A]-P-F-[A/T/V]-[A/S]-F-G-T-C4-[S/F/Y/A]-[W/Q/E/R]-[R/H/G]-[Q/R/H]-[K/R/E]-T- C5-C6-[V/I/L]-D-[T/A]-T-S-[S/N/D/T]-[F/Y/L]-[H/Y/R]-[T/I/S/V/N]-C7-[Q/E]-[D/E]-[E/K]-[G/R/E]- G-H-C8-V-[S/P]-[P/T/A]-[K/E/A/Q/P]-[I/V]-[R/K/N/T/S/E]-C9-[L/V]-[Q/E/R]-[E/D/Q/G]-[Q/H]- [V/A/E/L/M]-G-[L/F/P]-Cio-[P/S]-[L/R/H/N/Y]-[R/S/G/K]-[K/R/N/G/E/D]-W-[K/R/N/T]-Cn-Ci2 (SEQ ID NO 17)
D-T-[L/S/Q]-[R/H]-CI-[V/L]-[G/A/R/E]-[Y/H]-[H/E]-G-[Y/F/H]-C2-[F/Y/L/I]-[R/Q/H]-[S/L/P]- [K/R]-[S/T/A/V]-C3-P-[K/P/E/G/D/R/A]-P-F-[A/T/V]-[A/S]-F-G-T-C4-[S/F/Y/A]-[W/Q/E/R]-[R/H/G]- [Q/R/H]-[K/R/E]-T-C5-C6-[V/I/L]-D-[T/A]-T-S-[S/N/D/T]-[F/Y/L]-[H/Y/R]-[T/I/S/V/N]-C7-[Q/E]- [D/E]-[E/K]-[G/R/E]-G-H-C8-V-[S/P]-[P/T/A]-[K/E/A/Q/P]-[I/V]-[R/K/N/T/S/E]-C9-[L/V]-[Q/E/R]- [E/D/Q/G]-[Q/H]-[V/A/E/L/M]-G-[L/F/P]-Cio-[P/S]-[L/R/H/N/Y]-[R/S/G/K]-[K/R/N/G/E/D]-W- [K/R/N/T]-Cn-Ci2-[K/T/S/A]-[E/D] (SEQ ID NO 18)
[L/M]-[P/S]-[K/R/T]-D-T-[L/S/Q]-[R/H]-CI-[V/L]-[G/A/R/E]-[Y/H]-[H/E]-G-[Y/F/H]-C2- [F/Y/L/I]-[R/Q/H]-[S/L/P]-[K/R]-[S/T/A/V]-C3-P-[K/P/E/G/D/R/A]-P-F-[A/T/V]-[A/S]-F-G-T-C4- [S/F/Y/A]-[W/Q/E/R]-[R/H/G]-[Q/R/H]-[K/R/E]-T-C5-C6-[V/I/L]-D-[T/A]-T-S-[S/N/D/T]-[F/Y/L]- [H/Y/R]-[T/I/S/V/N]-C7-[Q/E]-[D/E]-[E/K]-[G/R/E]-G-H-C8-V-[S/P]-[P/T/A]-[K/E/A/Q/P]-[I/V]- [R/K/N/T/S/E]-C9-[L/V]-[Q/E/R]-[E/D/Q/G]-[Q/H]-[V/A/E/L/M]-G-[L/F/P]-CIO-[P/S]- [L/R/H/N/Y]-[R/S/G/K]-[K/R/N/G/E/D]-W-[K/R/N/T]-Cn-Ci2-[K/T/S/A]-[E/D]-[I/T/V/A/L] (SEQ ID NO 19).
Facultativement, le peptide ou molécule peptidique peut comprendre 1 à 20 substitutions conservatives, de préférence 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 substitutions conservatives, ces substitutions ne concernant pas les cystéines. De préférence, ces substitutions ne concernent pas les résidus d'acides aminés définis dans les séquences de SEQ ID NOs 14-19.
Notamment, la b défensine 11 aviaire peut présenter la séquence d'une défensine telle que décrite dans le tableau 4 suivant ou une séquence présentant au moins 70, 75, 80, 85, 90 ou 95% d'identité avec l'une de celles-ci, de préférence avec la séquence mature de celle-ci. Facultativement, la b défensine 11 est mature, c'est-à-dire sans le peptide signal. Facultativement, la b défensine 11 aviaire présente une séquence présentant au moins 70, 75, 80, 85, 90 ou 95% d'identité avec l'une des défensines décrites dans le tableau 4, de préférence avec la séquence mature de celle-ci, et comprend une séquence choisie parmi les SEQ ID NOs 14-19.
Tableau 4 Séquences protéiques de la b -défensine 11 aviaire chez différentes espèces d’oiseau
Dans un mode de réalisation particulier, la b défensine 11 aviaire comprend, consiste essentiellement en ou consiste en la séquence SEQ ID NO 1. Dans un autre mode de réalisation particulier, la b défensine 11 aviaire comprend, consiste essentiellement en ou consiste en la séquence SEQ ID NO 20.
Dans un mode de réalisation préféré, la b défensine 11 aviaire comprend six ponts disulfure formés par les cystéines Ci, C2, C3, C4, Cs, C6, C7, Cs, Cg, Cio, Cn et C12. Plus particulièrement, les ponts disulfure sont les suivants : C1-C5, C2-C4, C3-C6, C7-C11, Cs-Cio et C9- C12.
La b défensine 11 aviaire peut inclure des modifications similaires à celles décrites ci- dessus pour les peptides.
Utilisations
Dans un premier aspect particulier, les molécules peptidiques telles que décrites ci- dessus sont utiles comme agent antibactérien. Ainsi, la présente invention est relative aux molécules peptidiques telles que décrites ci-dessus pour leur utilisation pour traiter ou prévenir une infection par une bactérie, à l'utilisation des molécules peptidiques telles que décrites ci-dessus pour la fabrication d'un médicament destiné à traiter ou prévenir une infection par une bactérie, et à une méthode de traitement d'une infection par une bactérie comprenant l'administration d'une quantité thérapeutique efficace de molécules peptidiques.
La bactérie peut être Gram positif ou Gram négatif.
Les bactéries à Gram positif peuvent appartenir au genre Staphylococcus comme 5. aureus, 5. epidermidis, S. saprophiticus, S. lugdunensis, S haemolyticus, S warneri, S schleiferi et 5 intermedius, au genre Streptococcus comme 5. pyogenes, 5. agalactiae, S. dysgalactiae, S. bovis, S. anginosus, 5. sanguinis, 5. suis, S. mitis, 5. mutans, S. pneumonia et 5. oralis, au genre Enterococcus comme E. faecium, E. faecalis er E. gallinarum, au genre Listeria comme L. monocytogenes et L. ivanovii, au genre Clostridium comme C. perfringens, C. difficile, C. tetani et C. botulinum, au genre Propionibacterium comme P. acnés, P. granulosum, P. avidum er P. propionicus, ou au genre Bacillus comme Bacillus subtilis.
Par exemple, les bactéries à Gram positif sont des bactéries de la famille des Listeriaceae telle qu'une bactérie du genre des Brochothrix ou des Listeria typiquement, choisies parmi Listeria monocytogenes, Listeria innocua, Listeria ivanovii subsp. ivanovii, Listeria ivanovii subsp. londoniensis, Listeria grayi, Listeria seeligeri et Listeria welshimeri, de préférence Listeria monocytogenes. Ainsi, les molécules peptidiques telles que décrites ci- dessus sont utiles pour le traitement de listériose.
Les bactéries à Gram négatif peuvent être des entérobactéries choisies parmi les bactéries des genres Escherichia, Shigella, Salmonella, Klebsiella, Enterobacter, Providencia, Morganella, Citrobacter, Hafnia et Yersinia. Elles peuvent être également choisies parmi les bactéries des genres Pseudomonas, Acinetobacter, Stenotrophomonas, Burkholderia, et Alcaligenes, en particulier Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, Stenotrophomonas maltophilia, Burkholderia cepacia, et Alcaligenes xylosoxydans.
Les bactéries à Gram négatif peuvent être des salmonelles. Par exemple, la bactérie peut être choisie parmi 5. Typhi (bacille d'Eberth), 5. Paratyphi A, 5. Paratyphi B (bacille de Schotmüller), 5. Paratyphi C (bacille d'Hirschfeld), et 5. Sendai. La bactérie peut également être une quelconque bactérie de la famille des salmonelles comme Salmonella bongori, Salmonella enterica, Salmonella enterica arizonae, Salmonella enterica diarizonae, Salmonella enterica enterica, Salmonella enterica houtenae, Salmonella enterica indica, Salmonella enterica salamae ou Salmonella subterranea. Ainsi, les molécules peptidiques telles que décrites ci-dessus sont utiles pour le traitement de la fièvre typhoïde, la fièvre paratyphoïde et la salmonellose.
Les bactéries peuvent également être des Escherichia coli.
La molécule peptidique peut être utilisée seule ou en combinaison avec un autre agent thérapeutique, notamment un ou plusieurs antibiotiques.
Dans un autre aspect particulier, les molécules peptidiques telles que décrites ci- dessus et/ou les AvBDll telles que décrites ci-dessus sont utiles comme agent antiparasitaire. Ainsi, la présente invention est relative aux molécules peptidiques et/ou AvBDll telles que décrites ci-dessus pour leur utilisation pour traiter ou prévenir une infection par un parasite, à l'utilisation des molécules peptidiques et/ou AvBDll telles que décrites ci-dessus pour la fabrication d'un médicament destiné à traiter ou prévenir une infection par un parasite, et à une méthode de traitement d'une infection par un parasite comprenant l'administration d'une quantité thérapeutique efficace de molécules peptidiques et/ou AvBDll telles que décrites ci-dessus.
Le parasite peut en particulier être Eimeria. Ce parasite est connu pour provoquer des coccidioses, pouvant ainsi causer des dégâts importants dans les élevages. En particulier, sont concernés les oiseaux ou volailles, les lapins, les veaux, les chats et chiens et les chèvres. Par exemple, le parasite peut appartenir aux sous-classes Eimeria tenella, Eimeria acervulina, ou Eimeria maxima. Les molécules peptidiques et/ou AvBDll telles que décrites ci-dessus peuvent être utilisées en combinaison avec d'autres agents thérapeutiques, en particulier des traitements ou vaccinations connus contre les coccidioses, notamment celles causées par Eimeria tel que Eimeria tenella, Eimeria acervulina, ou Eimeria maxima, par exemple des médicaments contre la coccidiose, des prébiotiques, des probiotiques, des composés naturels et des combinaisons de ceux-ci.
Dans un aspect particulier supplémentaire, les molécules peptidiques telles que décrites ci-dessus et/ou les AvBDll telles que décrites ci-dessus sont utiles comme agent anti invasif. Ainsi, la présente invention est relative aux molécules peptidiques et/ou AvBDll telles que décrites ci-dessus pour leur utilisation pour traiter un cancer, notamment par un effet anti-invasif, à l'utilisation des molécules peptidiques et/ou AvBDll telles que décrites ci- dessus pour la fabrication d'un médicament destiné à traiter un cancer, notamment par un effet anti-invasif, et à une méthode de traitement d'un cancer, notamment par un effet anti invasif, comprenant l'administration d'une quantité thérapeutique efficace de molécules peptidiques et/ou AvBDll telles que décrites ci-dessus. Les molécules peptidiques et/ou AvBDll telles que décrites ci-dessus peuvent être utilisées pour prévenir ou ralentir les métastases d'un cancer.
Dans un aspect additionnel, les AvBDll telles que décrites ci-dessus sont utiles comme agent cytotoxique. Elles présentent donc un intérêt dans le traitement du cancer. Le cancer peut être un cancer solide ou hématopoïétique. Le cancer peut être un sarcome, un carcinome, ou un cancer hématopoïétique. En particulier, le cancer est un cancer associé à une capacité à former des métastases. Par exemple, la molécule peut être utilisée pour traiter le cancer du poumon, du sein, du colon, du rein, de la prostate, du col de l'utérus et le mélanome.
Enfin, dans un dernier aspect, les AvBDll telles que décrites ci-dessus sont utiles comme agent antiviral. Ainsi, la présente invention est relative aux AvBDll telles que décrites ci-dessus pour leur utilisation pour traiter ou prévenir une infection par un virus, à l'utilisation des AvBDll telles que décrites ci-dessus pour la fabrication d'un médicament destiné à traiter ou prévenir une infection par un virus, et à une méthode de traitement d'une infection par un virus, comprenant l'administration d'une quantité thérapeutique efficace des AvBDll telles que décrites ci-dessus. De préférence, le virus est le virus de la grippe (influenza), de préférence de sous-type A, en particulier le virus de la grippe aviaire. Dans un aspect particulier, le virus peut être un virus choisi parmi H1N1, H5N1, H7N3, H7N7, H7N9, H9N2 et H10N8.
Les AvBDll peuvent être utilisées seules ou en combinaison avec d'autres agents thérapeutiques, en particulier d'autres agents antiviraux.
Dans un mode de réalisation particulier, le sujet à traiter est un animal. De préférence, l'animal est un animal d'élevage ou un animal de compagnie. En particulier, l'animal d'élevage est un bovin, un ovin, un caprin, un équin, un porcin ou une volaille. Par exemple, la volaille peut être une poule, un poulet, une autruche, un canard, une dinde, une caille, un faisan, une pintade, ou une oie.
Dans un autre mode de réalisation particulier, le sujet à traiter est un humain.
La formulation du peptide ou de la molécule peptidique ou d'AvBDll peut varier en fonction de la voie d'administration et du dosage pour lesquels la composition est destinée à être utilisée. La formulation peut notamment être sous forme solide, semi-solide ou liquide. Après formulation avec au moins un véhicule ou excipient physiologiquement acceptable, une composition selon l'invention peut être sous toute forme appropriée pour l'administration, par exemple sous la forme de tablettes, comprimés, pastilles, dragées, capsules, gélules, pilules, granulats, poudre, suspensions, émulsions, sirops, onguents, ampoule de liquide, flacon muni d'un compte-goutte et autres formes analogues de préparations liquides ou en poudres destinées à être prises en unités mesurées de faible quantité, solutions injectables ou suppositoires.
Les molécules ou compositions selon l'invention peuvent être administrées de différentes manières et sous différentes formes. Ainsi, elles peuvent être administrées de manière systémique, par voie orale, par inhalation ou par injection, comme par exemple par voie intraveineuse, intra-musculaire, sous-cutanée, trans-dermique, intra-artérielle, etc., les voies intraveineuse, intra-musculaire, sous-cutanée, orale et par inhalation étant préférées. Pour les injections, les molécules sont généralement conditionnées sous forme de suspensions liquides, qui peuvent être injectées au moyen de seringues ou de perfusions, par exemple. A cet égard, les molécules sont généralement dissoutes dans des solutions salines, physiologiques, isotoniques, tamponnées, etc., compatibles avec un usage pharmaceutique et connues de l'homme du métier. Ainsi, les compositions peuvent contenir un ou plusieurs agents, supports ou véhicules choisis parmi les dispersants, solubilisants, stabilisants, conservateurs, etc.
Il est entendu que le débit et/ou la dose de peptide, molécule peptidique ou AvBDll peuvent être adaptés par l'homme du métier en fonction du sujet, de la pathologie concernée, du mode d'administration, etc. Typiquement, les molécules sont administrées à des doses pouvant varier entre 1 pg et 1000 mg/kg de poids corporel, plus généralement de 10 pg à 100 mg/kg, typiquement entre 1 mg et 20 mg/kg. En outre, des injections répétées peuvent être réalisées, le cas échéant.
Les molécules peptidiques décrites ci-dessus peuvent également être utilisées dans d'autres domaines que le domaine pharmaceutique ou vétérinaire, notamment sur la base de leur propriété antibactérienne, antiparasitaire, antivirale, anti-invasive et/ou cytotoxique contre les cellules cancéreuses. Dans un premier aspect, elles peuvent être utilisées dans le domaine agro-alimentaire comme agent conservateur ou comme additif alimentaire pour augmenter la plus-value d'un aliment (« functional food »). Ainsi, la présente invention est relative à une méthode de préparation d'une composition alimentaire comprenant l'ajout d'une molécule peptidique à la composition alimentaire. Cette composition alimentaire peut présenter l'avantage d'améliorer le bien-être du sujet, animal ou homme, notamment en prévenant ou diminuant les infections bactérienne, parasitaire, et/ou virale ou en diminuant l'incidence des cancers. Les exemples illustrent la présente invention et ne sont pas destinés à limiter celle-ci.
EXEMPLES
Exemple 1 : Design et synthèse des peptides dérivés de GAnBRII
AvBDll est une défensine atypique prédite pour comporter deux domaines de type défensines. Sa taille anormalement longue (82 acides aminés) et le nombre de cystéines (12) deux fois plus important que la plupart des défensines rencontrées dans la nature laissaient initialement présager cette structure à deux domaines. L'analyse structurale par RMN 3D réalisée au Centre de Biophysique Moléculaire (C. Landon, H. Meudal, K. Loth) a permis de le confirmer définitivement. Afin de caractériser l'activité de ces 2 domaines, deux peptides synthétiques (Gga-AvBDll[l-40j et Gga-AvBDll[41-82j) représentatifs de chaque domaine ont été synthétisés (Tableau 5). La limite entre les 2 domaines a été fixée au niveau de la jonction exon-exon identifiée sur la base des données disponibles dans Ensembl et NCBI (Figure 1). Les ponts disulfure de chaque peptide ont été formés par repliement oxydatif. Le peptide AvBDll[l-40] a la particularité d'être amidé à son extrémité C-terminale. La pureté et la masse des peptides ont été vérifiées par HPLC et spectrométrie de masse. La structure et l'appariement des ponts disulfure ont été validés par RM N 3D (données non publiées générées par le Centre de Biophysique Moléculaire : C. Landon, H. Meudal, K. Loth).
Tableau 5. Séquences des peptides synthétiques dérivés d'AvBDll de poule
Exemple 2 : Activités antibactériennes d'AvBDll de poule et des peptides AvBDllfl- 401 et AvBDll[41-82l de poule
L'activité antibactérienne des peptides Gga-AvBDll[l-40] et Gga-AvBDll[41-82] a été testée en utilisant la technique de diffusion radiale contre deux bactéries responsables de toxi- infections alimentaires, Listeria monocytogenes (Gram+) et Salmonella enterica Enteritidis (Gram-), précédemment utilisées pour caractériser l'activité antibactérienne de Gga-AvBDll native (Hervé-Grépinet et al. 2010, supra). Les résultats montrent que le peptide Gga- AvBDll[l-40] est actif contre les deux bactéries (Figure 2A) avec des valeurs de CM I similaires ou inférieures au MSI-94 (témoin positif) (Tableau 6). En revanche, le peptide Gga-AvBDll[41- 82] ne semble pas actif : aucune activité n'a été détectée à la concentration maximale de 30 mM (Figure 2A). Ce dernier n'a également aucun effet (inhibiteur ou potentialisateur) sur Gga- AvBDll[l-40] lorsque les deux peptides sont utilisés en combinaison (Figure 2A, Tableau 6). Ces résultats suggèrent donc que c'est le domaine N-terminal de Gga-AvBDll qui porte l'activité antibactérienne, au moins vis-à-vis de ces deux souches bactériennes pathogènes. L'effet des peptides a été testé en présence d'héparine afin d'évaluer l'influence du glycosaminoglycane sur l'activité antibactérienne des molécules. Les résultats présentés dans la Figure 2B montrent que l'héparine inhibe de façon dose-dépendante l'activité antibactérienne du peptide Gga-AvBDll[l-40], seul ou en combinaison avec Gga-AvBDll[41- 82]. Ces données suggèrent que le site de fixation à l'héparine du peptide Gga-AvBDll[l-40] est vraisemblablement impliqué dans l'activité antibactérienne observée contre Listeria monocytogenes et Salmonella Enteritidis.
Tableau 6. Concentrations minimales inhibitrices (CM!) de différents peptides (Gga- AvBDll, Gga-AvBDll[l-40], Gga-AvBDll[41-82]) contre Salmonella enterica Enteritidis et Listeria monocytogenes. Les CM I sont déterminées en utilisant le test de diffusion radiale en gélose. Le MSI-94 (peptide antimicrobien dérivé de la magainine) est utilisé comme témoin positif.
Exemple 3 : Activités antiparasitaires de Gga-AvBDll et des peptides Gga-AvBDllfl- 401 et Gga-AvBDll[41-82l
L'activité antiparasitaire de Gga-AvBDll native et de chaque peptide synthétique dérivé Gga-AvBDll[l-40] et Gga-AvBDll[41-82] (peptides Nter et Cter, respectivement) a été évaluée en conditions acellulaires, contre des parasites d'Eimeria tenella qui expriment le marqueur de fluorescence YFP. Le pourcentage de viabilité des parasites obtenu pour chaque peptide est indiqué sur la Figure 3. Une activité antiparasitaire significative est observée pour Gga-AvBDll entière et pour le peptide Gga-AvBDll[l-40] (à p <0,01 et p <0,05, respectivement), avec un effet dose-dépendant. Gga-AvBDll entière a montré une activité antiparasitaire plus forte que le peptide Gga-AvBDll[l-40] seul. Le peptide Gga-AvBDll[41- 82] n'a montré aucune activité, sauf à la plus forte dose testée. Aucune synergie ni antagonisme n'a été observé avec l'addition des deux peptides. Lorsque de l'héparine non fractionnée est ajoutée aux parasites incubés avec Gga-AvBDll (Figure 3C), les propriétés antiparasitaires de Gga-AvBDll sont abolies (p = 0.1). Pour élucider la nature de l'activité antiparasitaire de Gga-AvBDll, les parasites ont été étudiés par microscopie électronique à balayage après incubation avec Gga-AvBDll (10 mM) et comparés aux parasites témoins, incubés avec du PBS. Aucun changement morphologique significatif n'a pu être observé.
Exemple 4 : Activités antivirales de Gqa-AvBD11 et des peptides Gqa-AvBD11 H-40l et Gaa-AvBD1 i r41-82l
Gga-AvBDll présente une activité antivirale nette à des concentrations ³ 2,5 iM
Pour tester les effets cytotoxiques et / ou antiviraux d'un traitement des cellules CLEC213 (non) infectées avec Gga-AvBDll, Gga-AvBDll[l-40], Gga-AvBDll[41-82] ou Gga- AvBDll[l-40] + Gga-AvBDll[41-82], nous avons utilisé le test commercial Viral ToxGIo™. Ce test permet un dosage de la production d'ATP cellulaire et repose sur le principe qu'une production d'ATP diminuée est indicative d'effets cytotoxiques, alors qu'une production d'ATP augmentée indique des effets pro-prolifératifs ou anti-apoptotiques (cellules non infectées) ou une réduction de la cytopathogénicité virale (cellules infectées).
Premièrement, les inventeurs ont observé que tous les peptides testés modifiaient considérablement la production d'ATP dans les cellules non infectées (Figure 4A). Le traitement des cellules CLEC213 avec Gga-AvBDll a eu un double effet sur les cellules, avec des concentrations de 0,31-1,25 mM provoquant une augmentation significative de la production d'ATP relative (= effet pro-prolifératif), et des concentrations plus élevées (> 2,50 pM) provoquant une réduction mineure (2,50 pM) ou hautement significative (5,00 pM) de la production d'ATP relative (= effet cytotoxique). Les traitements avec Gga-AvBDll[l-40] et Gga-AvBDll[41-82] ont entraîné une augmentation significative de la production d'ATP relative à presque toutes les concentrations testées (= effet pro-prolifératif ou anti- apoptotique). Cet effet était encore plus important lorsque les cellules ont été traitées avec les deux peptides en combinaison (Gga-AvBDll[l-40j + Gga-AvBDll[41-82j).
Deuxièmement, les inventeurs ont observé des profils d'activité très différents pour Gga-AvBDll et les peptides Gga-AvBDll[l-40], Gga-AvBDll[41-82] ou Gga-AvBDll[l-40] + Gga-AvBDll[41-82] dans les cellules infectées (Figure 4A). Le traitement des cellules CLEC213 infectées avec Gga-AvBDll a entraîné une forte augmentation de la production d'ATP relative à des concentrations de 0,63-5,00 mM (= réduction de la cytopathogénicité virale). Fait important, cet effet a également été observé à des concentrations qui ont provoqué une cytotoxicité mineure (2,50 mM) ou importante (5,00 mM) dans les cellules non infectées, ce qui indique un effet antiviral net à ces concentrations. Pour Gga-AvBDll[l-40] et Gga- AvBDll[41-82] (seul ou en combinaison), les données ne montrent pas un tel effet antiviral dans les cellules infectées et traitées. Le traitement des cellules avec Gga-AvBDll[l-40] a légèrement diminué la production d'ATP à toutes les concentrations testées (non significatif). En revanche, les traitements des cellules infectées avec Gga-AvBDll[41-82] ou Gga- AvBDll[l-40] + Gga-AvBDll[41-82] ont conduit à une augmentation significative dose- dépendante de la production d'ATP relative (= réduction de la cytopathogénicité virale). Cependant, comme des effets similaires ont également été observés dans les cellules non infectées et traitées avec Gga-AvBDll[41-82] ou Gga-AvBDll[l-40] + Gga-AvBDll[41-82], il est très probable que la production d'ATP augmentée dans des cultures cellulaires infectées et traitées ne soit pas due à une véritable activité antivirale, mais plutôt à une activité pro proliférative ou anti-apoptotique.
Les activités cytotoxiques et antivirales de Gga-AvBDll sont abolies en présence d'héparine
Enfin, les inventeurs ont testé si une co-incubation avec l'héparine affecterait les activités cytotoxiques et antivirales de Gga-AvBDll. Fait important, ils ont observé que les effets cytotoxiques et antiviraux d'un traitement avec Gga-AvBDll à une concentration de 5,00 mM sont complètement abolis en présence d'héparine (Figure 4B).
Exemple 5 : Activités cytotoxiques et anti-invasives de Gga-AvBDll et des peptides Gga-AvBDllfl-401 et Gga-AvBDlir41-82l contre une lignée cellulaire tumorale
Afin d'explorer de potentielles activités anti-tumorales de la protéine Gga-AvBDll ou des peptides dérivés Gga-AvBDll[l-40] et Gga-AvBDll[41-82], les effets de différentes concentrations de ces molécules sur la viabilité et l'invasion des cellules tumorales pulmonaires NCI-H460 ont été étudiés (Fig 5. et 6A). Ainsi, dans un modèle d'invasion de type chambre de Boyden, la quantité de cellules NCI-H460 ayant traversé la barrière matricielle constituée par le Matrigel® diminue significativement lorsque 4 mM de Gga-AvBDll sont ajoutés aux cellules en comparaison avec les cellules seules, cet effet pouvant être associé à une diminution de la viabilité cellulaire observée dès 2 mM de Gga-AvBDll. Cependant, l'effet anti-invasif de la protéine à des concentrations de 4, 6 et 8 mM est significativement plus important que celui altérant la viabilité cellulaire. De plus, l'incubation des cellules avec le peptide Gga-AvBDll[l-40] induit une réduction de l'invasion des cellules NCI-H460 dès 2 mM sans modification de la viabilité cellulaire. En revanche, le peptide Gga-AvBDll[41-82] n'a que très peu d'effet sur l'invasion et la viabilité des cellules NCI-H460. Lorsque les deux peptides ont été incubés ensemble avec les cellules, des propriétés anti-invasive et cytotoxique sont retrouvées mais avec une intensité moindre que celles observées avec la protéine Gga- AvBDll entière. De plus, lorsque de l'héparine non fractionnée est ajoutée aux cellules traitées avec Gga-AvBDll ou le peptide Gga-AvBDll[l-40], les propriétés anti-invasives de ces molécules sont abolies (Figure 6). En revanche, l'effet de la protéine AvBDll sur la viabilité cellulaire reste significatif, même s'il est moindre, en présence d'héparine.
CONCLUSIONS
L'ensemble de ces données montrent que la protéine Gga-AvBDll et le peptide Gga- AvBDll[l-40] possèdent différentes activités biologiques potentiellement valorisables. Les propriétés antibactériennes de Gga-AvBDll native sont déjà connues (Hervé-Grépinet et al 2010 ; Guyot et al 2016) ; cependant, les données générées montrent pour la première fois que Gga-AvBDll n'est pas seulement antibactérienne mais qu'elle possède également des activités antiparasitaires (anti-Eimeria) et antivirales (anti-HINl). Les inventeurs ont aussi démontré pour la première fois que cette b défensine aviaire possède un potentiel anticancéreux avec des activités cytotoxiques et anti-invasives observées in vitro vis-à-vis de cellules cancéreuses.
Les travaux réalisés dans le but d'identifier la région active de Gga-AvBDll ont conduit au design et à la synthèse d'un peptide original dérivé de la séquence de Gga-AvBDll (Gga- AvBDll[l-40j), pour lequel les inventeurs ont mis en évidence des propriétés antibactériennes, antiparasitaires et anti-invasives.
Exemple 6 : Activités antibactériennes d’AvBDH de cane (Apl-AvBD11) et des peptides Apl-AvBD11 H-40l et ArI-AnBR11 G41-821
Les exemples 1-5 ont été réalisés avec AvBDll de poule et les fragments N- et C- terminaux de celle-ci. Les inventeurs ont ensuite étudié le potentiel de AvBDll de cane Anas platyrhynchos (Accession N° XP_005028303.2). Tableau 7. Séquences des peptides synthétiques dérivés d'AvBDll de cane
Afin d'évaluer le potentiel antibactérien de l'AvBDll de cane (Apl-AvBDll), la protéine native et ses peptides dérivés (Apl-AvBDll[l-40] et Apl-AvBDll[41-82]) ont été testés sur 4 bactéries : deux bactéries à Gram positif (Listeria monocytogenes et Staphylococcus aureus) et deux bactéries à Gram négatif (Salmonella enterica Enteritidis et Escherichia coli). Les activités antibactériennes ont été évaluées par la méthode de diffusion radiale en gélose (méthode de Lehrer) où l'activité est détectée par la présence d'un halo d'inhibition de la croissance bactérienne. L'activité de Apl-AvBDll a été comparée à AvBDll de poule (Gga- AvBDll). Les deux domaines synthétiques correspondants aux motifs «bêta-défensine» de chaque molécule ont également été testés, seuls ou en combinaison. Toutes les molécules ont été testées à différentes concentrations (30 ; 12 ; 4,8 ; 1,92 ; 0,768 et 0,3072 mM) afin de déterminer les concentrations minimales inhibitrices (CMI). Un peptide antimicrobien à large spectre dérivé de la magainine, le MSI-94, a été utilisé comme contrôle positif. Les CMI obtenues pour chaque molécule sont reportées dans le tableau 8. Les résultats montrent que les deux protéines natives, Apl-AvBDll et Gga-AvBDll, sont actives contre les 4 bactéries testées. Les valeurs de CMI sont inférieures à 0,5 pM pour Listeria monocytogenes, Salmonella enterica Enteritidis et E coli. Une activité antibactérienne plus faible est détectée pour Staphylococcus aureus avec des valeurs de CMI supérieures à 2 pM. L'activité antibactérienne est essentiellement portée par la région N-terminale puisque seuls les peptides Apl-AvBDll[l-40] et Gga-AvBDll[l-40] sont actifs. Le domaine C-terminal (représenté par les peptides Apl-AvBDll[41-82] et Gga-AvBDll[41-82]) ne présentent pas d'activité contre les bactéries à la plus forte concentration testée (30 pM), excepté Apl- AvBDll[41-82] contre Listeria monocytogenes où une activité est détectée à 30 pM. Tableau 8 : Concentrations Minimales Inhibitrices (CM!) en mmol/L de Apl-AvBDll et
Gga-AvBDll et de leurs domaines respectifs
Matériels et Méthodes Préparation des peptides
Les synthèses peptidiques sur support solide (SPPS) ont été réalisées selon la stratégie Fmoc à l'aide d'un synthétiseur Préludé (Protein Technologies), à une échelle de 25 pmol, sur une résine Tentagel R NH2 . Les groupes protecteurs standards de chaîne latérale ont été employés : Arg(Pbf), Asp(OtBu), Cys(Trt), Glu(OtBu), Gln(Trt), His(Trt), Lys(Boc), Ser(tBu), Thr(tBu), Trp(Boc) et Tyr(tBu). Les acides aminés protégés (10 équiv.) ont été couplés à l'aide d'HCTU (9,5 équiv.) en présence de A/,/V-di-isopropyl-ethylamine (DIEA, 20 équiv.) dans la NMP (3 ml) pendant 30 minutes. Cette étape de couplage a été suivie par un traitement par une solution d'anhydride acétique (60 équiv.), DIEA (15,5 équiv.) et HOBt (1,8 équiv.) dans de la NMP (3 ml) pendant 7 minutes. Le groupe Fmoc a ensuite été éliminé par trois traitements successifs avec de la pipéridine à 20% dans de la NMP (3 ml) pendant 3 minutes. Après élongation, la résine a été traitée par un mélange TFA/H20//Pr3SiH/phénol (88:5:2:5) pendant 2 h, puis le peptide a été précipité par dilution (x 10) dans un mélange 1:1 d'éther diéthylique/éther de pétrole refroidi à 0°C, collecté par centrifugation, puis lavé trois fois avec de l'éther diéthylique et séché sous pression réduite.
Les analyses de spectrométrie de masse ESI-MS a basse résolution ont été réalisées sur un spectromètre de masse Quadrupole 6120 (Agilent Technologies), en utilisant le mode positif. L'enveloppe multi-chargée a été déconvoluée à l'aide du logiciel Agilent OpenLAB Data Analysis. Les valeurs théoriques et expérimentales de [M] correspondent à la masse moyenne.
Les analyses de spectrométrie de masse ESI-MS à haute résolution (ESI-HRMS) ont été réalisées sur un spectromètre de masse Q.-TOF maXis (Bruker Daltonics), en utilisant le mode positif. L'enveloppe multi-chargée a été déconvoluée à l'aide du logiciel Bruker Data Analysis 4.1. Les analyses MALDI-TOF ont été réalisées en mode réflectron sur un instrument Autoflex (Bruker Daltonics) en utilisant l'acide a-cyano-4-hydroxycinnamique comme matrice. Les valeurs théoriques et expérimentales de [M] ou [M+H]+ correspondent à l'espèce monoisotopique.
Les analyses HPLC ont été effectuées en utilisant une colonne Chromolith HR RP-18e (150 A, 10 x 4,6 mm, débit de 3 mL/min) ou une colonne Jupiter C4 (300 Â, 5 pm, 250 x 4,6 mm, débit de 1 mL/min). Les purifications HPLC ont été effectuées en utilisant une colonne Nucleosil C18 (300 Â, 5 pm, 250 x 10 mm, débit de 3 mL/min). Les solvants A et B étaient respectivement 0,1% de TFA dans H20 et 0,1% de TFA dans MeCN.
Les quantités de peptides purifiés ont été déterminées par spectrophotométrie UV à l = 280 nm (8t = 5500, 8iyr = 1490 et Eliaison SS— 125 L.M Tcm 1).
Gga-AvBDliri-401 de poule
Séquence : H-1LPRDTSRCVGYHGYCIRSKVCPKPFAAFGTCSWRQKTCC40V-NH2 (SEQ. ID NO : 2)
La forme réduite de AvBDll[l-40] (cystéines avec leurs fonctions thiol libres) a été synthétisée selon le protocole général de Fmoc-SPPS, en utilisant un linker de type Rink amide incorporé sous la forme de Fmoc-Rink-OH.
ESI-HRMS (m/z) : [M] = 4522,18 ([M]théorique pour C HsœNeoOs^ 4522,17).
Analyse HPLC : ÎR = 6,0 min (Chromolith, gradient: 15% B/A pendant 1 min puis 15 45% B/A pendant 7,5 min).
Purification HPLC : ÎR = 8,6 min (gradient: 28-35% B/A pendant 10 min). Rendement: 26 % (6,6 mihoI).
Repliement oxydatif (formation des ponts disulfure): une solution déoxygénée du peptide réduit (2 pmol, 10 mM), de glutathion oxydé (GSSG, 10 équiv.) et de glutathion (GSH, 100 équiv.) a été incubée à 4°C pendant 48 h sous argon dans 200 mL d'un mélange 1 :3 d'isopropanol et d'un tampon aqueux à pH = 8,5 contenant 100 mM de TRIS-HCI et 1 mM d'EDTA. Avant purification par HPLC, 1 mL de TFA est ajouté au mélange réactionnel.
MALDI MS (m/z)\ [M+H]+ = 4517,18 ( [M+H]+ théorique pour Cig HsæNeoOsiSe = 4517,13.
Analyse HPLC : ÎR = 17,7 min (Jupiter C4, gradient: 5-50% B/A pendant 30 min).
Purification HPLC : ÎR = 10,5 min (gradient: 22-37% B/A pendant 15 min).
Rendement : 34 % (0,68 pmol).
Gga-AvBDll[41-82l de poule
La forme réduite de AvBDll[41-82] a été synthétisée selon le protocole général de Fmoc-SPPS, en utilisant un linker de type Wang, incorporé par le couplage de Fmoc-82lle-(acide 4-oxymethylphenoxypropionique) (Fmoc-lle-mppa-OH).
Séquence : H-41DTTSDFHTCQDKGG HCVSPKIRCLEEQLGLCPLKRWTCCKE82l-OH (SEQ ID NO : 3)
ESI-HRMS (m/z) : [M] = 4777,25 ([M] théorique pour C202H325N59O63S6) = 4777,24).
Analyse HPLC : ÎR = 6,8 min (Chromolith, gradient: 15% B/A pendant 1 min puis 15-45% B/A pendant 7,5 min).
Purification HPLC : ÎR = 9,5 min (gradient: 30-37% B/A pendant 10 min).
Rendement : 23 % (5,8 pmol).
Repliement oxydatif (formation des ponts disulfure): une solution déoxygénée du peptide réduit (2 pmol, 10 mM), de glutathion oxydé (GSSG, 10 équiv.) et de glutathion (GSH, 100 équiv.) a été incubée à 4°C pendant 48 h sous argon dans 200 mL d'un tampon aqueux à pH = 8,5 contenant 100 mM de TRIS-HCI et 1 mM d'EDTA. Avant purification par HPLC, 1 mL de TFA est ajouté au mélange réactionnel.
MALDI MS (m/z): [M+H]+ = 4772,25 ( [M+H] ique pour C202H320N59O63S6 = 4772,20).
Analyse HPLC: ÎR = 3.0 min (Chromolith, gradient: 15-40% B/A pendant 5 min).
Purification HPLC : ÎR = 9,2 min (gradient: 22-37% B/A pendant 15 min).
Rendement: 28 % (0,56 pmol). Apl-AvB D 11 f 1-401 de cane
Séquence : H-1LPKDTLRCVRYHGFCFQPKACPPPFAAFGTCSQRQKTCC40I-NH2 (SEQ ID NO : 21)
La forme réduite de AvBDll[l-40] (cystéines avec leurs fonctions thiol libres) a été synthétisée selon le protocole général de Fmoc-SPPS, en utilisant un linker de type Rink amide incorporé sous la forme de Fmoc-Rink-OH.
ESI-MS ( m/z ) : [M]= 4518,7 ([M]théorique pour CzooHsioNssOsc^ 4519,4).
Analyse HPLC : ÎR = 4,39 min (Chromolith, gradient: 5-50 % B/A en 5 min).
Purification HPLC : ÎR = 15,6 min (gradient: 27-32% B/A pendant 30 min).
Rendement: 14 % (1,1 pmol).
Repliement oxydatif (formation des ponts disulfure): une solution déoxygénée du peptide réduit (5,6 pmol, 50 pM), de glutathion oxydé (GSSG, 10 équiv.) et de glutathion (GSH, 100 équiv.) a été incubée à 25°C pendant 24 h sous argon dans 113 mL d'un mélange 1 : 3 d'isopropanol et d'un tampon aqueux à pH = 8,6 contenant 100 mM de TRIS-HCI et 1 mM d'EDTA. Avant purification par HPLC, 1,1 mL de TFA est ajouté au mélange réactionnel. Le milieu réactionnel est concentré sous pression réduite, le volume est réduit à 80 mL.
ESI-HRMS (m/z) [M+H]+ = 4511,14 ([M+H]+ théorique pour C200H304N58O50S6 = 4511,14).
Analyse HPLC : ÎR = 4,53 min (Chromolith, gradient: 10-40% B/A pendant 5 min).
Purification HPLC : ÎR = 14,8 min (gradient: 25-33% B/A pendant 16 min).
Rendement : 17 % (0,97 pmol).
Apl-AvBDll[41-82l de cane
La forme réduite de AvBDll[41-82] (cystéines avec leurs fonctions thiol libres) a été synthétisée selon le protocole général de Fmoc-SPPS, en utilisant une résine Wang pré-greffée par une méthionine.
Séquence : H-41DTTSNLHTCQEEGGHCVPPKIKCLRGQLGLCPRKGWKCCKE82M-OH (SEQ ID NO : 22)
ESI-MS (m/z) : [M] = 4685,6 ([M] théorique pour C196H323N61O58S7) = 4686,5).
Analyse HPLC : ÎR = 3,77 min (Chromolith, gradient: 5-50% B/A pendant 5 min).
Purification HPLC : ÎR = 16,6 min (gradient: 20-30% B/A pendant 30 min).
Rendement : 19 % (6,1 pmol). Repliement oxydatif (formation des ponts disulfure): une solution déoxygénée du peptide réduit (6 pmol, 80 mM), de glutathion oxydé (GSSG, 10 équiv.) et de glutathion (GSH, 100 équiv.) a été incubée à 4°C pendant 48 h sous argon dans 75 mL d'un tampon aqueux à pH = 8,5 contenant 100 mM de TRIS-HCI, 1 mM d'EDTA et 500 mM de Gu-HCI. Avant purification par HPLC, 750 pL de TFA est ajouté au mélange réactionnel.
ESI-MS (m/z)\ [M] = 4680,5 ( [Mjthéorique pour C196H317N61O58S7 = 4680,4).
Analyse HPLC: ÎR = 3,32 min (Chromolith, gradient: 10-40% B/A pendant 5 min).
Purification HPLC : ÎR = 17,5 min (gradient: 15-30% B/A pendant 30 min).
Rendement: 38 % (2,3 pmol).
Effet antibactérien
Les activités antibactériennes ont été mesurées selon la technique de diffusion radiale décrite par Lehrer et al (J Immunol Methods, 1991, 137(2), 167-73) et utilisée précédemment pour la caractérisation antibactérienne de l'AvBDll native (Hervé-Grépinet et al 2010). Les bactéries sont cultivées dans les milieux Brain Heart Infusion (Listeria monocytogenes) ou Tryptical Soy Broth (Salmonella enterica sérovar Enteritidis ATCC 13076, Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus ATCC 29740) sous agitation (180 tr / min) à 37 ° C jusqu'en phase exponentielle, puis lavées une fois dans du tampon phosphate de sodium 10 mM (pH 7,4) froid puis reprises dans un petit volume de ce même tampon. Un volume contenant 7.5 x 106 UFC (Unité Formant Colonie) est introduit dans un milieu gélosé pauvre en nutriment (tampon phosphate de sodium 10 mM, pH 7,4, contenant 0,03% [poids/volume] de TSB, 1% [poids/volume] d'agarose de faible électro-endosmose [Sigma-Aldrich, St Quentin Fallavier, France] et 0,02% de Tween-20) maintenu en surfusion. Ce milieu, contenant les bactéries, est ensuite coulé dans une boîte de Pétri pour former une couche uniforme d'environ 1 mm d'épaisseur. Trente-six puits de 2,75 mm de diamètre, régulièrement espacés, sont creusés dans la gélose à l'aide d'un emporte-pièce. Cinq pL d'une solution contenant les molécules à tester (AvBDll, AvBDll[l-40], AvBDll[41-82]) à différentes concentrations (0 - 0,3072 - 0,768 - 1,92 - 4,8 - 12 - 30 pM dans de l'eau ultrapure) sont ajoutés dans chaque puits, puis la boite de Pétri est incubée pendant 3h à 37°C afin de laisser diffuser/agir les molécules. La gélose contenant les bactéries est ensuite recouverte par une gélose riche en nutriments (tampon phosphate de sodium 10 mM, pH 7,4, contenant 6% [poids/volume] de TSB et 1% [poids/volume] d'agarose de faible électro-endosmose [Sigma-Aldrich, St Quentin Fallavier, France]) et la boite de Pétri est incubée pendant la nuit à 37°C. L'activité antibactérienne est visualisée le lendemain par la présence d'une zone d'inhibition circulaire à l'intérieure de laquelle les bactéries ne se sont pas développées. Pour chaque molécule testée, les diamètres d'inhibition (auxquels les diamètres des puits ont été retranchés) pour chaque point de concentration sont représentés graphiquement en fonction du logarithme décimal des concentrations, soit y = f(x). La concentration minimale inhibitrice (CMI) est déterminée grâce à l'équation de la droite obtenue par régression linéaire des données, soit la valeur de x pour y = 0 dans l'équation y = ax + b. Il s'agit du point situé à l'intersection de la droite avec l'axe des abscisses, indiquant la plus faible concentration de peptide pour laquelle aucune inhibition n'est détectée. Le MSI-94, un variant de magainine affichant un large spectre antimicrobien, est utilisé comme témoin positif.
Dans une première série d'expérience, la protéine AvBDll purifiée à partir de l'œuf de poule (Gga-AvBDll) et ses peptides dérivés Gga-AvBDll[l-40] et Gga-AvBDll[41-82] (seuls ou combinés) ont été testés sur deux souches bactériennes différentes : Salmonella enterica sérovar Enteritidis ATCC 13076 (Gram-) et Listeria monocytogenes EGD (Gram+). Ces deux souches ont été fournies par le Centre International de Ressources Microbiennes - Bactéries Pathogènes (INRA, ISP, Nouzilly, France). Pour chaque souche bactérienne, au minimum quatre mesures indépendantes identiques de l'activité antibactérienne ont été effectuées.
Dans une seconde série d'expérience, la protéine AvBDll purifiée à partir de l'œuf de cane (Apl-AvBDll) et ses peptides dérivés Apl-AvBDll[l-40] et Apl-AvBDll[41-82] (seuls ou combinés) ont été testés sur différentes souches bactériennes et comparés avec les molécules équivalentes de la poule. Quatre souches fournies par le Centre International de Ressources Microbiennes - Bactéries Pathogènes (INRA, ISP, Nouzilly, France) ont été testées : Salmonella enterica sérovar Enteritidis ATCC 13076 (Gram-), Escherichia coli ATCC 25922 (Gram-), Listeria monocytogenes EGD (Gram+) et Staphylococcus aureus ATCC 29740 (Gram+). Pour chaque souche bactérienne, deux mesures indépendantes identiques de l'activité antibactérienne ont été effectuées.
L'effet de l'héparine sur l'activité antibactérienne de l'AvBDll de poule et des peptides dérivés Gga-AvBDll[l-40] et Gga-AvBDll[41-82] (seuls ou combinés) a été testé en utilisant les molécules à une concentration finale de 12 mM en présence d'héparine (H3149, Sigma- Aldrich, St Quentin Fallavier, France) à 0, 20 et 100 ng/pL dans un tampon TBS (50 mM Tris- HCl, 150 mM NaCI, pH 7,4). Les échantillons ont été analysés comme précédemment contre Listeria monocytogenes et Salmonella enterica Enteritidis.
Effet antiparasitaire
Les tests antiparasitaires ont été réalisés contre des parasites d'Eimeria tenella. La souche Et-YFP est une souche recombinante, exprimant de façon stable le marqueur de fluorescence YFP (Yellow Fluorescent Protein) (Gras et al, 2014, Eukaryot Cell, 13, 884-895). Les parasites (5.105) en suspension dans 20 pL d'une solution saline tamponnée au phosphate 10 mM (PBS), pH 7,4 contenant Gga-AvBDll, le peptide Gga-AvBDll[l-40], le peptide Gga- AvBDll[41-82] ou les 2 peptides en mélange (concentration finale de 0, 1.25, 2.5, 5, 10 pM) ont été incubés 1 h à 41°C (température correspondant à la température corporelle du poulet et de la poule). A la fin de l'incubation, la viabilité des parasites a été évaluée par coloration au bleu d'Evans aqueux (vol / vol). Les parasites vivants (verts) et morts (rouges) ont été comptés en utilisant un microscope Zeiss Axiovert 200. Les résultats sont exprimés sous forme de pourcentage de viabilité par rapport aux parasites incubés en PBS seul. Les résultats représentent la moyenne de 2 réplicats techniques réalisés dans 3 expérimentations indépendantes. La compétition avec l'héparine a été réalisée pour l'AvBDll entière (Gga- AvBDll) à 10 pM, en présence d'héparine à 100 pg/mL, dans les conditions décrites précédemment. Deux expérimentations indépendantes avec 2 réplicats par condition ont été réalisées.
Microscopie électronique à balayage
Après incubation avec les peptides, les parasites ont été fixés pendant 24 h dans du paraformaldéhyde à 4%, du glutaraldéhyde à 1% dans du tampon phosphate 0,1 M (pH 7,2). Ils ont ensuite été lavés dans du PBS et post-fixés par incubation avec 2% de tétroxyde d'osmium pendant 1 h. Les échantillons ont ensuite été entièrement déshydratés dans une série graduée de solutions d'éthanol et séchés dans de l'hexaméthyldisilazane (HMDS, Sigma, St-Louis, MO, USA). Les parasites ont été observés au microscope électronique à balayage Zeiss Ultra plus FEG-SEM (Oberkochen, Allemagne) à la Plateforme IBiSA de Microscopie Electronique (Université François Rabelais de Tours, France). Effet antiviral
Les activités antivirales de Gga-AvBDll, Gga-AvBDll[l-40], Gga-AvBDll[41-82] et Gga-AvBDll[l-40] + Gga-AvBDll[41-82] ont été testées dans un modèle d'infection par un virus influenza aviaire utilisant une lignée cellulaire épithéliale pulmonaire de poule (CLEC213) (Esnault et al., 2011, Virus Research, 159, 32-42). Des cellules CLEC213 ont été cultivées dans du milieu DMEM-F12 (Dulbecco's modified Eagle medium/Nutrient F-12 Ham) (Gibco) complété avec 7,5% de sérum de veau fœtal (SVF), 100 U/ml de pénicilline et 100 pg/ml de streptomycine à 41°C et 5% de C02. La souche virale A/Mallard/Marquenterre/Z237/83 (H1N1-MZ) utilisée pour les expériences d'infection des cellules CLEC213 a été récupérée par génétique inverse et amplifiée dans des cellules MDCK (Madin Darby canine kidney) comme décrit précédemment (Munier et al., 2010, J. Virol., 84, 940-952). Le titre (PFU/ml) du stock viral a été déterminé par un test de plaque standard dans des cellules MDCK. L'ampleur de l'effet cytopathique induit par des dilutions en série du virus H1N1-MZ dans les cellules CLEC213 a été déterminée en utilisant le test viral ToxGIo™ (Promega), un test de luminescence mesurant GATR en tant que substitut de la viabilité cellulaire ou de la cytopathogénicité virale (Noah et al., 2007, Antiviral Research, 73, 50-59). A cette fin, les cellules CLEC213 ont été ensemencées dans des plaques à 96 puits (5 x 103 cellules par puits) et cultivées pendant 16-18 h dans un milieu complet à 41°C et 5% de C02. Les cellules ont ensuite été lavées avec du PBS et infectées avec des dilutions de 1/2 log du stock viral dans du DMEM-F12 sans SVF (8 puits par dilution). Les cellules témoins non infectées ont été recouvertes de DMEM-F12 sans SVF (8 puits). A 48 heures post-infection (hpi), les cellules ont été lavées, recouvertes avec 100 pl d'ATP Détection Reagent (Promega) et incubées pendant 20 min à température ambiante. Les signaux de luminescence (RLU - relative light units) ont été mesurés à l'aide d'un système de détection GloMax®-Multi (Promega) et la TCID50 (50% tissue culture infectious dose, c'est à dire la dilution du stock viral à laquelle les RLU ont diminué jusqu'à 50% des valeurs des témoins) a été calculée à partir des valeurs des RLU moyennes en utilisant GraphPad Prism v6.07 (GraphPad Software Inc.). Les mêmes conditions de culture et lecture ont été utilisées pour tester les effets cytotoxiques et / ou antiviraux des traitements des cellules CLEC213 avec Gga-AvBDll et les deux peptides synthétiques Gga- AvBDll[l-40] et Gga-AvBDll[41-82]. Les cellules (6 puits par condition) ont été non traitées (témoins) ou traitées avec 0,31-5,00 mM de Gga-AvBDll, Gga-AvBDll[l-40], Gga-AvBDll[41- 82] ou Gga-AvBDll[l-40] + Gga-AvBDll[41-82] dans du milieu DMEM-F12 et les valeurs de luminescence ont été déterminées à 48 heures post-traitement (hpt). Pour tester les effets antiviraux, Gga-AvBDll, Gga-AvBDll[l-40], Gga-AvBDll[41-82] et Gga-AvBDll[l-40] + Gga- AvBDll[41-82] à 0,31-5,00 mM (concentration finale) ont été mélangés avec 25 x TCID50 de H1N1-MZ (soit environ 5 x 103 PFU) et co-incubés pendant 30 min à température ambiante. Les mélanges, ainsi qu'une préparation de virus non mélangés (témoins non traités), ont été ajoutés sur les cellules CLEC213 (6 puits par condition) et les valeurs de luminescence ont été déterminées à 48 hpi. Les valeurs de la production d'ATP relative ont été calculées pour les cellules (non) infectées et traitées par rapport aux valeurs des RLU moyennes obtenues pour les témoins (cellules non traitées). Les effets du traitement par l'héparine sur les activités cytotoxiques et / ou antivirales de Gga-AvBDll ont été évalués en utilisant le protocole décrit ci-dessus, avec les modifications suivantes: Gga-AvBDll à une concentration finale de 0,50 pM ou 5,00 pM a été co-incubée (15 min à température ambiante) avec 100 pg / ml (concentration finale) de l'héparine (Sigma) dissous dans de l'eau stérile ou avec un volume égal d'eau (- héparine) avant d'être mélangée avec le virus H1N1-MZ ou être ajoutée directement sur les cellules CLEC213.
Effet anticancéreux
Cultures cellulaires. Les cellules tumorales bronchiques NCI-H460 (HTB-177TM), issues d'une effusion pleurale d'un cancer bronchique non à petites cellules ont été utilisées pour évaluer les capacités anti-invasives de la protéine entière Gga-AvBDll et des peptides synthétiques Gga-AvBDll[l-40] et Gga-AvBDll[41-82j. Les cellules NCI-H460 ont été cultivées en milieu RPMI 1640 (Invitrogen, Cergy Pontoise, France) additionné de 2 mM de L- glutamine, 10 mM d'HEPES, 1 mM de pyruvate de sodium, 25 mM de bicarbonate de sodium, 2 mM glucose, 100 unités/mL de pénicilline, 100 pg/mL de streptomycine et 10 % de sérum de veau fœtal dépourvu d'endotoxines (SVF, Lonza, Basel, Switzerland). Les flacons de culture ont été placés à 37°C en atmosphère humide contenant 5% de C02. Les surnageants de culture ont été testés régulièrement afin de détecter la présence de mycoplasmes (PlasmoTest mycoplasma détection kit, InvivoGen, Toulouse, France).
Test d'invasion. Le test utilisé est basé sur le modèle de chambre de Boyden modifiée. Des inserts de culture ayant des pores de 8 pm de diamètre (BD Falcon Cell, BD Biosciences, Le Pont de Claix, France) sont recouverts de 25 pg de Matrigel™ (BD Biosciences) selon les instructions du fournisseur. Les cellules (2.105) en suspension dans 300 pL de milieu RPMI sans SVF et contenant soit Gga-AvBDll, soit le peptide Gga-AvBDll[l-40] ou Gga-AvBDll[41-82] ou soit les deux peptides combinés (concentration finale de 0, 2, 4, 6, 8 mM) ont été déposées dans chacun des inserts. Les inserts ont ensuite été placés dans des puits d'une plaque 24 puits contenant 700 pL de milieu RPMI contenant 10 % de SVF utilisé comme chimioattractant. Les plaques ont alors été incubées 48 heures à 37°C en atmosphère humide contenant 5% de C02. Les cellules ayant migré sous l'insert et celles adhérées à la surface du puits ont été détachées à l'aide d'une solution de 0,05% trypsine/0, 02% EDTA puis dénombrées à l'aide d'un hématimètre de Malassez. Deux réplicats techniques ont été réalisés pour les cellules incubées avec les différentes molécules et 3 réplicats pour les cellules contrôles. Les résultats sont exprimés sous forme de pourcentage d'invasion par rapport aux cellules qui ont migré en l'absence de molécule. Les résultats représentent la médiane +/- 1er quartile/3ème quartile de 5 expérimentations indépendantes.
Test MTS de viabilité cellulaire. La viabilité cellulaire a été évaluée à l'aide d'un test MTS (CelITiter 96® Aqueous One Solution Cell Prolifération Assay, Promega, Charbonnières, France). Pour le test MTS effectué en parallèle du test d'invasion, 104 cellules NCI-H460 par puits ont été déposées dans une plaque 96 puits et cultivées dans 100 pL de milieu sans sérum contenant soit Gga-AvBDll, soit le peptide Gga-AvBDll[l-40] ou Gga-AvBDll[41-82], ou les deux peptides combinés à une concentration finale de 0, 2, 4, 6, 8 pM. Les cellules ont ensuite été incubées pendant 1 heure avec le réactif MTS puis la formation de formazan, proportionnelle au nombre de cellules viables, a été quantifiée par mesure de l'absorbance à 490 nm, en suivant les instructions du fournisseur. La médiane des absorbances obtenues avec les cellules seules correspond à la valeur de référence 100% de viabilité cellulaire. Cinq expérimentations indépendantes avec 2 réplicats par condition ont été réalisées pour les tests MTS réalisés en parallèle de l'invasion. Trois expérimentations indépendantes avec 8 réplicats par condition ont été réalisées pour les tests MTS réalisés en parallèle de la quantification des cytokines.
Test en présence d'héparine. Gga-AvBDll ou le peptide Gga-AvBDll[l-40] à 6 pM ont été préincubés avec de l'héparine à 100 pg/mL pendant 5 minutes avant addition aux cellules. Les tests d'invasion ou de viabilité ont été réalisés selon le protocole décrit précédemment. Trois expérimentations indépendantes avec 2 réplicats par condition ont été réalisées pour chacune des techniques. Analyses statistiques. Les résultats représentent la médiane +/- 1er quartile/3ème quartile. Le test de Kruskal-Wallis et de Dunn a été utilisé pour les comparaisons multiples et le test de Mann Whitney dans le cas de comparaison de 2 groupes. Les tests statistiques ont été réalisés à l'aide du logiciel Graphpad Prism version 6.0 pour Mac. Les différents seuils de significativité des données sont * p < 0.05 ; ** p < 0.01 ; *** p < 0.0001 ; **** p < 0.0001.

Claims

REVENDICATIONS
1- Molécule peptidique pour son utilisation en tant que médicament, la molécule peptique comprenant une séquence choisie parmi les séquences suivantes :
CIXXXXGXC2XXXXXC3PXPFXXFGTC4XXXXXTC5C6 (SEQ I D NO 4) ;
DTXXCIXXXXGXC2XXXXXC3PXPFXXFGTC4XXXXXTC5C6 (SEQ ID NO 5) ; et
XXXDTXXCIXXXXGXC2XXXXXC3PXPFXXFGTC4XXXXXTC5C6X (SEQ ID NO 6)
dans lesquelles X est un quelconque acide aminé, différent ou identique, et la molécule peptidique comprenant au plus 70 acides aminés.
2- Molécule peptidique pour une utilisation selon la revendication 1, dans laquelle la molécule peptidique comprend au plus 50 acides aminés
3- Molécule peptidique pour une utilisation selon l'une quelconque des revendications 1-2, dans laquelle X est choisi dans le groupe consistant en Ala, Arg, Asp, Asn, Gin, Glu, Gly, Elis, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr et Val.
4- Molécule peptidique pour une utilisation selon l'une quelconque des revendications 1-3, comprenant une séquence choisie parmi les séquences suivantes :
- CI-[V/L]-[G/A/R/E]-[Y/H]-[H/E]-G-[Y/F/H]-C2-[F/Y/L/I]-[R/Q/H]-[S/L/P]-[K/R]- [S/T/A/V]-C3-P-X-P-F-[A/T/V]-[A/S]-F-G-T-C4-[S/F/Y/A]-[W/Q/E/R]-[R/H/G]-[Q/R/H]- [K/R/EJ-T-C5-C6 (SEQ ID NO 7), avec X étant un quelconque acide aminé à l'exclusion d'une cystéine, de préférence choisi dans le groupe consistant en K, P, E, G, D, R, et A ; ou
- D-T-[L/S/Q]-[R/H]-CI-[V/L] -[G/A/R/E]-[Y/H]-[H/E]-G-[Y/F/H]-C2-[F/Y/L/I]-[R/Q/H]- [S/L/P]-[K/R]-[S/T/A/V]-C3-P-X-P-F-[A/T/V]-[A/S]-F-G-T-C4-[S/F/Y/A]-[W/Q/E/R]- [R/H/G]-[Q/R/H]-[K/R/E]-T-C5-C6 (SEQ ID NO 8) X étant un quelconque acide aminé à l'exclusion d'une cystéine, de préférence choisi dans le groupe consistant en K, P, E, G, D, R, et A ; ou - [L/M]-[P/S]-[K/R/T]-D-T-[L/S/Q]-[R/H]-Ci-[V/L]-[G/A/R/E]-[Y/H]-[H/E]-G-[Y/F/H]-C2-
[F/Y/L/I]-[R/Q/H]-[S/L/P]-[K/R]-[S/T/A/V]-C3-P-X-P-F-[A/T/V]-[A/S]-F-G-T-C4-[S/F/Y/A]- [W/Q/E/R]-[R/H/G]-[Q/R/H]-[K/R/E]-T-C5-C6-[V/I/L] (SEQ ID NO 9) X étant un quelconque acide aminé à l'exclusion d'une cystéine, de préférence choisi dans le groupe consistant en K, P, E, G, D, R, et A.
5- Molécule peptidique pour une utilisation selon l'une quelconque des revendications 1-4, comprenant trois ponts disulfures, les ponts disulfures étant de préférence les suivants : C1-C5, C2-C4 et C3-C6.
6- Molécule peptidique pour une utilisation selon l'une quelconque des revendications 1-5, comprenant, consistant essentiellement en ou consistant en l'une des séquences suivantes :
LPRDTSRCVGYHGYCIRSKVCPKPFAAFGTCSWRQKTCCV (SEQ I D NO 2)
LSLPRDTSRCVGYHGYCIRSKVCPKPFAAFGTCSWRQKTCCV (SEQ. ID NO 10)
LSLPRDTSRCVGYHGYCICSKVCPKPFAAFGTCSWRQKTCCV (SEQ I D NO 11)
CVGYHGYCI RSKVCPKPFAAFGTCSWRQKTCC (SEQ I D NO 12)
DTSRCVGYHGYCIRSKVCPKPFAAFGTCSWRQKTCC (SEQ I D NO 13),
LPKDTLRCVRYHGFCFQPKACPPPFAAFGTCSQRQKTCCI (SEQ ID NO 21),
DTLRCVRYHGFCFQPKACPPPFAAFGTCSQRQKTCC (SEQ ID NO 23), et
CVRYHGFCFQPKACPPPFAAFGTCSQRQKTCC (SEQ ID NO 24).
7- Molécule peptidique pour une utilisation selon l'une quelconque des revendications 1-6 en tant qu'agent antibactérien, antiparasitaire et/ou anti-invasif.
8- Molécule peptide pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications 1- 7, caractérisée en ce qu'elle est destinée à être utilisée en combinaison avec un autre composé d'intérêt thérapeutique. 9- Molécule peptidique pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications
1-8 , pour traiter ou prévenir une coccidiose, le parasite étant Eimeria.
10- Utilisation d'une molécule peptidique selon l'une quelconque des revendications 1-6 comme conservateur alimentaire.
11- Utilisation d'une molécule peptidique selon l'une quelconque des revendications
1-6 comme additif alimentaire.
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