FR3084887A1 - Peptides derives d'une beta-defensine 11 aviaire et leurs utilisations - Google Patents

Abstract

La présente invention est relative à des peptides issus d'une β-défensine 11 aviaire et à leurs utilisations, notamment pharmaceutiques et vétérinaires, pour ses propriétés antibactérienne, antiparasitaire et/ou anti-invasive.

Description

DOMAINE DE L'INVENTION

La présente invention est relative à des peptides et leurs utilisations, notamment dans le domaine vétérinaire et pharmaceutique.

CONTEXTE DE L'INVENTION

L'œuf d'ovipares permet d'assurer le développement autonome de l'embryon d'oiseau à l'extérieur du corps de la mère. Chez la poule, le développement embryonnaire s'effectue en 21 jours à une température de 37-38°C. L'oeuf doit donc contenir naturellement toutes les molécules nécessaires à la croissance de cet embryon et à sa protection. Pour se protéger des contaminations microbiennes, l'oeuf dispose d'un système de défense important reposant sur la coquille (barrière physique), sur des propriétés physico-chimiques particulières (pH alcalin et viscosité du blanc d'oeuf) et sur la présence d'un arsenal de protéines antimicrobiennes dont les plus connues sont le lysozyme et l'ovotransferrine.

Au total, près de 1000 protéines différentes ont été identifiées dans l'oeuf depuis une dizaine d'années grâce au séquençage du génome de la poule en 2004 et au développement des techniques de transcriptomique et de protéomique. Compte-tenu de la diversité de ces protéines et de leurs rôles dans la croissance et la protection de l'embryon, l'oeuf est considéré comme une source importante de molécules potentiellement valorisables dans le domaine de la santé et de l'agro-alimentaire. Cependant, les fonctions biologiques de ces protéines sont encore inconnues pour la plupart. Or, au regard des nombreuses fonctions physiologiques supposées des protéines et peptides de l'œuf en lien avec le développement, la croissance et la protection d'un embryon (dont le système immunitaire propre est immature), il est très probable que l'œuf est une source de nombreuses molécules d'intérêt dans les domaines de la santé ou de l'agro-alimentaire. Par exemple, le lysozyme de blanc d'oeuf est une protéine antimicrobienne utilisée actuellement comme conservateur alimentaire et comme principe actif de plusieurs médicaments.

De nouvelles protéines antibactériennes de l'œuf ont été identifiées dont la βdéfensine 11 aviaire (AvBDll) (Hervé-Grépinet et al, 2010, Antimicrob Agents Chemother, 54, 4401-4409 ; Guyot et al, 2016, Sci Rep, 6, 27974). AvBDll (anciennement Vitelline Membrane Outer layer protein II (ou VMO-II) (Kido et al, 1992, Biochem J, 286, 17-22 ; Xiao et al, 2004, BMC Genomics, 5,56) fait partie des β-défensines aviaires ou gallinacines (Harwig et al, 1994, FEBS Lett,

342, 281-285 ; Sugiarto et al, 2004, Biochem Biphys Res Commun, 323, 721-727). Les défensines sont des peptides antimicrobiens (2-5 kDa) de l'immunité innée, généralement cationique. Leur structure tridimensionnelle est organisée en feuillets β et présente 3 ponts disulfures. Les défensines de mammifères sont regroupées en 3 sous-familles : alpha, bêta et thêta-défensines (Ganz, 2003, Nat Rev Immunol, 3, 710-720). L'appartenance à ces différentes sous-familles est déterminée par la structure tridimensionnelle, la répartition des cystéines et l'appariement de ces dernières dans la formation des ponts disulfure. Chez les oiseaux, seules des défensines de la famille β, classées en 2 sous-groupes, sont retrouvées : les ovodéfensines (comme la galline) et les β-défensines aviaires (AvBD) dont fait partie AvBDll (Van Dijk et al, 2008, Vet Immunol Immunopathol, 124, 1-18 ; Whenham et al, 2015, Biol Reprod, 92,154).

L'AvBDll de Gallus gallus possède des activités antimicrobiennes envers les bactéries à Gram positif et négatif comme Salmonella enterica sérovar Enteritidis, Listeria monocytogenes et Staphylococcus aureus (Hervé-Grépinet et al, 2010, Antimicrob Agents Chemother, 54, 44014409). L'AvBDll présente une séquence primaire de défensine encore absente chez les mammifères. Sa séquence peptidique (82 acides aminés, 9,28 kDa) est en effet plus longue que les autres défensines en raison de la présence de 2 motifs « β-défensine » (soit 6 ponts disulfure). Il a été proposé dans Hervé-Grépinet et al, 2010 que la partie C-terminale pourrait inclure la partie biologiquement active de cette β-défensine étant donné que celle-ci présente une identité de séquence de 27% avec la région correspondante de la β-défensine 3 humaine.

Il existe un besoin grandissant d'identifier et développer de nouvelles molécules permettant de traiter des maladies infectieuses (alternatifs aux anti-infectieux conventionnels) et cancéreuses donc utiles dans les domaines de la santé et comme conservateur ou pour augmenter la plus-value d'un aliment («functional food») dans le domaine de l'agro-alimentaire, notamment des molécules présentant des effets antibactérien, antiparasitaire, antiviral, anti-invasif et/ou cytotoxique contre les cellules cancéreuses.

RESUME DE L'INVENTION

Dans ce contexte, les inventeurs ont d'une part découvert que la β-défensine 11 aviaire initialement décrite comme antibactérienne présente également un effet antiparasitaire, antiviral, anti-invasif et cytotoxique. D'autre part, ils ont découvert que, parmi les deux domaines de type β-défensine présents dans la β-défensine 11 aviaire, c'est la partie N-terminale qui est responsable des effets antibactériens, antiparasitaires et anti-invasifs observés dans la protéine entière. Ainsi, un peptide dérivé de la partie N-terminale conserve ces effets observés sur la protéine entière alors qu'un peptide dérivé de la partie C-terminale ne présente aucun effet ou un effet beaucoup plus faible. En outre, le peptide dérivé de la partie N-terminale est dénuée de l'effet cytotoxique qui a été observée pour la β-défensine 11 aviaire entière.

Ainsi, la présente invention est relative à une molécule peptidique comprenant une séquence choisie parmi les séquences suivantes :

CiXXXXGXC₂XXXXXC₃PXPFXXFGTC4XXXXXTC₅C6 (SEQ ID NO 4) ;

DTXXC1XXXXGXC₂XXXXXC3PXPFXXFGTC₄XXXXXTC₅C6 (SEQ ID NO 5) ; et

XXXDTXXC1XXXXGXC₂XXXXXC3PXPFXXFGTC₄XXXXXTC₅C₆X (SEQ ID NO 6) dans lesquelles X est un quelconque acide aminé, différent ou identique, le peptide comprenant au maximum 70 acides aminés ; et le peptide ne consistant pas en les séquences

LSLPRDTSRCVGYHGYCIRSKVCPKPFAAFGTCSWRQKTCCV (SEQ ID NO 10) LSLPRDTSRCVGYHGYCICSKVCPKPFAAFGTCSWRQKTCCV (SEQ ID NO 11).

De préférence, X n'est pas une cystéine et est choisi en particulier dans le groupe consistant en Ala, Arg, Asp, Asn, Gin, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr et Val.

Dans un aspect particulier, la molécule peptidique comprend une séquence choisie parmi les séquences suivantes :

- Ci-[V/L]-[G/A/R/E]-[Y/H]-[H/E]-G-[Y/F/H]-C₂-[F/Y/L/I]-[R/Q/H]-[S/L/P]-[K/R]- [S/T/A/V]-C₃-P-X-P-F-[A/T/V]-[A/S]-F-G-T-C₄-[S/F/Y/A]-[W/Q/E/R]-[R/H/G]-[Q/R/H][K/R/E]-T-Cs-C6 (SEQ ID NO 7), avec X étant un quelconque acide aminé à l'exclusion d'une cystéine, de préférence choisi dans le groupe consistant en K, P, E, G, D, R, et A ; ou

- D-T-[L/S/Q]-[R/H]-Ci-[V/L]-[G/A/R/E]-[Y/H]-[H/E]-G-[Y/F/H]-C₂-[F/Y/L/I]-[R/Q/H]- [S/L/P]-[K/R]-[S/T/A/V]-C3-P-X-P-F-[A/T/V]-[A/S]-F-G-T-C₄-[S/F/Y/A]-[W/Q/E/R][R/H/G]-[Q/R/H]-[K/R/E]-T-C5-C6 (SEQ ID NO 8), avec X étant un quelconque acide aminé à l'exclusion d'une cystéine, de préférence choisi dans le groupe consistant en K, P, E, G, D, R, et A ; ou

- [L/M]-[P/S]-[K/R/T]-D-T-[L/S/Q]-[R/H]-C1-[V/L]-[G/A/R/E]-[Y/H]-[H/E]-G-[Y/F/H]-C₂[F/Y/L/I]-[R/Q/H]-[S/L/P]-[K/R]-[S/T/A/V]-C₃-P-X-P-F-[A/T/V]-[A/S]-F-G-T-C₄-[S/F/Y/A][W/Q/E/R]-[R/H/G]-[Q/R/H]-[K/R/E]-T-C₅-C₆-[V/I/L] (SEQ ID NO 9), avec X étant un quelconque acide aminé à l'exclusion d'une cystéine, de préférence choisi dans le groupe consistant en K, P, E, G, D, R, et A.

De préférence, les molécules peptidiques comprennent trois ponts disulfure, en particulier entre les cystéines: C1-C5, C2-C4 et C3-C6.

Dans un mode de réalisation très particulier, la molécule peptidique comprend, consiste essentiellement en ou consiste en l'une des séquences suivantes :

LPRDTSRCVGYHGYCIRSKVCPKPFAAFGTCSWRQKTCCV (SEQ ID NO 2)

CVGYHGYCIRSKVCPKPFAAFGTCSWRQKTCC (SEQ ID NO 12) et DTSRCVGYHGYCIRSKVCPKPFAAFGTCSWRQKTCC (SEQ ID NO 13).

La présente invention est également relative à une molécule peptidique telle que décrite ci-dessus ou un peptide consistant en la séquence SEQ ID NO 10 ou 11 pour son utilisation en tant que médicament, en particulier en tant qu'agent antibactérien, antiparasitaire et/ou anti-invasif.

La présente invention est également relative à une composition pharmaceutique ou vétérinaire comprenant une molécule peptidique telle que décrite ci-dessus, et facultativement un autre composé d'intérêt thérapeutique. Elle est en outre relative à cette composition pharmaceutique ou vétérinaire pour son utilisation pour le traitement ou la prévention d'une infection bactérienne, le traitement ou la prévention d'une infection par un parasite ou pour le traitement d'un cancer, en particulier pour son utilisation pour traiter ou prévenir une coccidiose, le parasite étant Eimeria.

Enfin, la présente invention est relative à l'utilisation d'une molécule peptidique telle que décrite ci-dessus ou d'un peptide consistant en la séquence SEQ ID NO 10 ou 11 comme conservateur alimentaire ou comme additif alimentaire.

DESCRIPTION DES FIGURES

Figure 1. Séquences protéiques et points iso-électriques de la β-défensine 11 aviaire (AvBDll) de poule et des peptides AvBDll[l-40] et AvBDll[41-82], Le précurseur protéique d'AvBDll (Accession NP_001001779) est une protéine de 104 acides aminés. L'AvBDll mature est un polypeptide cationique (pl théorique = 8,78) de 82 acides aminés contenant deux motifs de type « beta-défensine » (CX6CX5CX9CX6CC et CX6CX6CX7CX6CC) codés par deux exons différents. Les séquences en acides aminés du domaine N-terminal (AvBDll[l40]) et du domaine C-terminal (AvBDll[41-82]), délimitées par la jonction exon-exon, ont différentes propriétés de charge avec des valeurs de pl théoriques de 9,34 et 6,88, respectivement.

Figure 2A. Effet-dose des peptides AvBDll, AvBDll[l-40] et AvBDll[41-82] contre Salmonella enterica Enteridis ATCC 13076 et Listeria monocytogenes EGD. Les activités antibactériennes sont visualisées par la formation d'un disque d'inhibition en utilisant la technique de diffusion radiale en milieu gélosé. Le MSI-94 (peptide antimicrobien dérivé de la magainine) est utilisé comme témoin positif.

Figure 2B. Effet de l'héparine (0, 20, 100 ng/pL) sur l'activité antibactérienne des peptides AvBDll, AvBDll[l-40] et AvBDll[41-82], utilisés à 12 pM, contre Salmonella enterica Enteritidis ATCC 13076 et Listeria monocytogenes EGD.

Figure 3. L'AvBDll entière et le peptide AvBDll[l-40] (Nter) induisent la mortalité des parasites Eimeria tenella. Cette activité est abolie en présence d'héparine.

Figure 3A. Observation par microscopie électronique à balayage de parasites après 1 h d'incubation avec du PBS (contrôle) ou 10 pM de ΓAvBDll. La barre d'échelle représente 2 pm. Figure 3B. Pourcentage de viabilité des parasites, après incubation avec les peptides à différentes concentrations. Les données présentées sont les moyennes ± SEM de trois expériences indépendantes. Nter : AvBDll[l-40] ; Cter : AvBDll[41-82] ; Nter+Cter : AvBDll[l-40] + AvBDll[41-82], Figure 3C. L'activité antiparasitaire de l'AvBDll à 10 pM est abolie en présence d'héparine à 100 pg/mL.

Figure 4. AvBDll présente une activité antivirale nette à des concentrations provoquant une cytotoxicité légère (2,50 pM) ou importante (5,00 pM). Les activités cytotoxiques et antivirales marquées d'AvBDll sont abolies en présence d'héparine.

Figure 4A : Production d'ATP relative dans les cellules CLEC213 non infectées ou les cellules infectées en réponse aux traitements avec différentes concentrations d'AvBDll, AvBDll[l-40], AvBDll[41-82] ou AvBDll[l-40] + AvBDll[41-82], Les valeurs de la production d'ATP relative ont été calculées pour les cellules (non) infectées et traitées par rapport aux valeurs des RLU (signaux de luminescence) moyennes obtenues pour les témoins (cellules non traitées). Les données représentent les moyennes et ±SEM de 2-3 expériences indépendantes, ns : p > 0,05 ; * : 0,01 < p < 0,05 ; ** : 0,001 < p < 0,01 ; *** : 0,0001 < p < 0,001 ; **** : p < 0,0001. Figure 4B : Production d'ATP relative dans les cellules CLEC213 non infectées (barres rayées) ou infectées (barres pleines) en réponse aux traitements avec 0,00 μΜ (témoins non traités), 0,50 pM ou 5,00 pM d'AvBDll en l'absence ou en présence d'héparine (100 pg/ml) (/ + héparine). Les données représentent les moyennes et ±SEM d'une expérience avec six répétitions par condition.

Figure 5. Effet de l'AvBDll et des peptides AvBDll[l-40] et AvBDll[41-82]) sur l'invasion et la viabilité des cellules NCI-H460 (lignée cellulaire issue d'un carcinome pulmonaire humain non à petites cellules). Les résultats d'invasion et de viabilité ont été analysés après 48 heures d'incubation. Ils sont exprimés par un pourcentage d'invasion ou de viabilité des cellules incubées avec AvBDll ou les peptides, comparé à celui des cellules contrôles. Les résultats représentent la médiane ± 1er quartile/3ème quartile d'au moins 5 expérimentations indépendantes, chacune étant réalisée au moins en double. Le test de Kruskal-Wallis et de Dunn a été utilisé pour comparer les résultats des cellules traitées avec différentes concentrations de molécules par rapport à ceux des cellules contrôles. Le test de Mann Whitney a été utilisé pour comparer les résultats d'invasion et de viabilité obtenus pour une même concentration de molécule testée. * p < 0.05 ; ** p < 0.01 ; *** p < 0.0001 ; **** p < 0.0001.

Figure 6. Effet de la co-incubation de l'héparine non fractionnée avec 6 μΜ d'AvBDll ou de peptide AvBDll[l-40] (N) sur l'invasion et la viabilité des cellules tumorales pulmonaires non à petites cellules NCI-H460. Les résultats d'invasion (couleur foncée) et de test MTS (viabilité) (couleur pâle) ont été analysés après 48 heures d'incubation. Ils représentent la médiane ± 1er quartile/3ème quartile de 3 expérimentations indépendantes, chacune étant réalisée en double. Le test de Kruskal-Wallis et de Dunn a été utilisé pour comparer les résultats des cellules traitées avec différentes concentration de molécules par rapport à ceux des cellules contrôles. Le test de Mann Whitney a été utilisé pour comparer les résultats d'invasion et de viabilité obtenus pour une même concentration de molécule testée. * p < 0.05 ; ** p < 0.01 ; *** p < 0.0001 ; **** p < 0.0001.

DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION

Définition

Dans le présent document, les termes « peptide », « oligopeptide », « polypeptide » et « protéine » sont utilisés indifféremment et se réfèrent à une chaîne d'acides aminés reliés par des liaisons peptidiques, quel que soit le nombre de résidus d'acide aminé constituant cette chaîne.

Les séquences peptidiques définies dans le présent document sont représentées avec le symbole en une lettre tel qu'indiqué ci-dessous :

A	Ala	(alanine)
R	Arg	(arginine)
N	Asn	(asparagine)
D	Asp	(acide aspartique)
C	Cys	(cystéine)
Q	Gin	(glutamine)
E	Glu	(acide glutamique)
G	Gly	(glycine)
H	His	(histidine)
1	Ile	(isoleucine)
L	Leu	(leucine)
K	Lys	(lysine)
M	Met	(méthionine)
F	Phe	(phénylalanine)
P	Pro	(proline)
S	Ser	(sérine)
T	Thr	(thréonine)
W	Trp	(tryptophane)
Y	Tyr	(tyrosine)
V	Val	(valine)

Tel qu'utilisé ici, le terme « acide aminé » se réfère aux 20 résidus d'acides aminés standard naturels (G, P, A, V, L, I, M, C, F, Y, W, H, K, R, Q, N, E, D, S et T), aux résidus d'acides aminés naturels rares (par exemple l'hydroxyproline, l'hydroxylysine, l'allohydroxylysine, la 68

N-méthylysine, la N-éthylglycine, la N-méthylglycine, la N-éthylasparagine, l'allo-isoleucine, la N-méthylisoleucine, la N-méthylvaline, la ou l'acide aminobutyrique) et aux acides aminés non naturels (par exemple norleucine, norvaline et cyclohexyl-alanine). De préférence, ce terme se réfère aux 20 résidus d'acides aminés standard naturels (G, P, A, V, L, I, M, C, F, Y, W, H, K, 5 R, Q, N, E, D, S et T).

Le terme « substitution », tel qu'utilisé ici désigne le remplacement d'un résidu d'acide aminé par un autre choisi parmi les 20 résidus d'acides aminés standard naturels, les résidus d'acides aminés naturels rares et d'acides aminés non naturels. De préférence, le terme « substitution » se réfère au remplacement d'un résidu d'acide aminé par un autre choisi 10 parmi les 20 résidus d'acides aminés standards naturels (G, P, A, V, L, I, M, C, F, Y, W, H, K, R, Q, N, E, D, S et T). La ou les substitutions peuvent être des substitutions conservatives ou non conservatives. Le terme « substitution conservative » tel qu'utilisé dans ce document, se réfère à une substitution d'un résidu d'acide aminé par un autre qui présente des propriétés chimiques ou physiques similaires (taille, charge ou polarité). Des exemples de substitutions 15 conservatives sont présentés dans les tableaux suivants.

Tableau 1

Groupes d'acides aminés	Résidus d'acides aminés
Acide	D et E
Basique	K, R, et H
Hydrophile non chargé	S, T, N, et Q
Aliphatique non chargé	G, A, V, L, et 1
Non polaire, non chargé	C, M, et P
Aromatiques	F, Y, et W

Tableau 2 - Groupes de substitution conservative alternatifs

1	Alanine (A)	Sérine (S)	Thréonine (T)
2	Acide Aspartique (D)	Acide Glutamique (E)
3	Asparagine (N)	Glutamine (Q)
4	Arginine (R)	Lysine (K)
5	Isoleucine (1)	Leucine (L)	Méthionine (M)
6	Phénylalanine (F)	Tyrosine (Y)	Tryptophane (W)

Tableau 3 - Classification fonctionnelle et physique supplémentaire des acides aminés

Résidus avec un groupe alcool	S et T
Résidus aliphatiques	1, L, V, et M
Résidus avec un cycle aromatique	F, H, W, et Y
Résidus hydrophobes	A, C, F, G, H, 1, L, M, R, T, V, W, et Y

Résidus chargés négativement	D et E
Résidus chargés positivement	K, R et H
Résidus polaires	C, D, E, H, K, N, Q, R, S, et T
Petits résidus	A, C, D, G, N, P, S, T, et V
Très petits résidus	A, G, et S
Résidus Flexibles	E, Q, T, K, S, G, P, D, E, et R

«Consiste en» en une séquence particulière, sauf indication contraire ou clairement contredite par le contexte, doit être compris comme décrivant un peptide consistant en cette séquence. Par « consiste essentiellement en », on entend que le peptide consiste en cette séquence, mais il peut également comprendre 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 substitutions, additions, délétions ou un mélange de celui-ci, de préférence 1, 2, 3, 4 ou 5 substitutions, additions, délétions ou un mélange de ceux-ci. En particulier, par « essentiellement consistant en », on peut envisager que le peptide puisse comprendre 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 acides aminés supplémentaires au niveau de l'extrémité N et / ou C-terminale, de préférence 1, 2, 3, 4 ou 5 acides aminés supplémentaires, et / ou 1, 2 ou 3 substitutions, délétions, additions, ou un mélange de ceux-ci. De préférence, le nombre de substitutions, d'additions, de délétions ou d'un mélange de celles-ci dépend de la longueur de la séquence. Par exemple, le pourcentage de substitutions, de délétions, d'additions ou d'un mélange de ceux-ci peut ne pas dépasser 30%, de préférence pas plus de 25%. Tel qu'utilisé ici, le terme substitution se réfère à l'échange d'un seul acide aminé par un autre dans une séquence peptidique ; le terme délétion se réfère à l'élimination d'un seul acide aminé dans une séquence peptidique ; le terme insertion ou addition est équivalent et se réfère à l'addition d'un seul acide aminé dans une séquence peptidique.

Tel qu'utilisé ici, le terme identité de séquence ou identité se réfère au nombre (%) d'appariements (résidus d'acides aminés identiques) aux positions provenant d'un alignement de deux séquences polypeptidiques. L'identité de séquence est déterminée en comparant les séquences lorsqu'elles sont alignées de manière à maximiser le chevauchement et l'identité tout en minimisant les interruptions de séquence. En particulier, l'identité de séquence peut être déterminée en utilisant l'un quelconque des nombreux algorithmes d'alignement global ou local, en fonction de la longueur des deux séquences. Des séquences de longueurs similaires sont de préférence alignées en utilisant des algorithmes d'alignement global (e.g. Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol 48:443, 1970) qui alignent les séquences de manière optimale sur toute la longueur, tandis que des séquences de longueurs sensiblement différentes sont de préférence alignées en utilisant un algorithme d'alignement local, par exemple l'algorithme de Smith et Waterman (Smith et Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981) ou l'algorithme d'AltschuI (Altschul et al (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 ; Altschul et al (2005) FEBS J. 272:5101-5109). L'alignement dans le but de déterminer le pourcentage d'identité de séquence d'acides aminés peut être réalisé par toute méthode connue de l'homme du métier, par exemple en utilisant un logiciel disponible sur des sites Internet tels que http: //blast.ncbi.nlm. nih.gov / ou http://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/. L'homme de l'art peut aisément déterminer les paramètres appropriés pour mesurer l'alignement. Aux fins de la présente invention, les valeurs de pourcentage d'identité de séquence d'acides aminés désignent des valeurs générées en utilisant le programme EMBOSS Needle d'alignement de séquences par paires qui crée un alignement global optimal de deux séquences en utilisant l'algorithme de Needleman-Wunsch dans lequel les paramètres sont les paramètres par défaut : Scoring matrix = BLOSUM62, Gap open = 10, Gap extend = 0.5, End gap penalty = false, End gap open = 10 and End gap extend = 0.5.

Dans le contexte de la présente invention, le terme « traitement » ou « traiter » inclut le traitement préventif, curatif, palliatif, ainsi que la prise en charge des sujets (réduction de la souffrance, amélioration de la durée de vie, ralentissement de la progression de la maladie, réduction de la croissance tumorale, diminution de la taille des tumeurs, la prévention ou la diminution des métastases et des rechutes etc.).

L'expression quantité thérapeutiquement efficace, telle qu'utilisée ici, se réfère à une quantité qui résulte en une amélioration de l'état d'un organe ou d'un sujet, ou en une diminution de la maladie, du trouble ou des symptômes de la maladie ou du trouble en question.

Telle qu'utilisée ici, une composition pharmaceutique désigne une préparation d'un ou plusieurs des agents actifs avec d'autres composants chimiques optionnels tels que des supports physiologiquement appropriés et/ou des excipients. Le but d'une composition pharmaceutique est de faciliter l'administration de l'agent actif à un organisme. Les compositions de la présente invention peuvent se présenter sous une forme appropriée pour toute voie d'administration ou d'utilisation conventionnelle. La composition pharmaceutique selon l'invention englobe les compositions pharmaceutiques utilisées en médecine humaine et les compositions pharmaceutiques utilisées en médecine animale, c'est à dire les compositions vétérinaires. Dans un mode de réalisation, la composition pharmaceutique comprend en outre un véhicule pharmaceutiquement acceptable.

Tels qu'utilisés ici, les termes « support pharmaceutiquement acceptable » ou « excipient pharmaceutiquement acceptable » ou «véhicule pharmaceutiquement acceptable » sont interchangeables et comprennent tous composés ou combinaisons de composés qui sont connus de l'homme de l'art comme étant utiles dans la formulation de compositions pharmaceutiques ou vétérinaires. Dans le contexte de la présente invention, on entend par «physiologiquement acceptable » ou « pharmaceutiquement acceptable », tout milieu ou additif qui n'interfère pas avec l'efficacité de l'activité biologique du principe actif (ici, les bactéries probiotiques), et qui n'est pas excessivement toxique pour le patient ou sujet, aux concentrations auxquelles il est administré et/ou qui ne produisent pas de réaction indésirable lorsqu'elles sont administrées à un humain ou à un animal. Un véhicule, un support ou un excipient physiologiquement acceptable peut être approprié à l'administration aux humains et/ou aux animaux (en particulier aux mammifères).

Peptides ou Molécules peptidiques

La présente demande est donc relative à un peptide dérivé de la partie N-terminale d'une β-défensine 11 aviaire. Ce peptide ou molécule peptidique comprend, consiste essentiellement en ou consiste en la séquence consensus suivante :

CiXXXXGXC₂XXXXXC₃PXPFXXFGTC₄XXXXXTC₅C₆ (SEQ ID NO 4) dans laquelle X est un quelconque acide aminé,, différent ou identique, de préférence à l'exclusion d'une cystéine. De préférence, X peut être choisi dans le groupe consistant en Ala, Arg, Asp, Asn, Gin, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr et Val.

Dans un aspect de la demande, le peptide ou molécule peptidique comprend, consiste essentiellement en ou consiste en la séquence consensus suivante :

DTXXCiXXXXGXC₂XXXXXC₃PXPFXXFGTC₄XXXXXTC₅C₆ (SEQ ID NO 5) dans laquelle X est un quelconque acide aminé, différent ou identique, de préférence à l'exclusion d'une cystéine. De préférence, X peut être choisi dans le groupe consistant en Ala, Arg, Asp, Asn, Gin, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr et Val.

Par exemple, le peptide ou molécule peptidique peut comprendre, consister essentiellement en ou consister en la séquence consensus suivante :

XXXDTXXCiXXXXGXC₂XXXXXC₃PXPFXXFGTC₄XXXXXTC₅C₆X (SEQ ID NO 6) dans laquelle X est un quelconque acide aminé, différent ou identique, de préférence à l'exclusion d'une cystéine. De préférence, X peut être choisi dans le groupe consistant en Ala, Arg, Asp, Asn, Gin, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr et Val.

Dans un aspect particulier de la demande, le peptide ou molécule peptidique comprend, consiste essentiellement en ou consiste en l'une des séquences suivantes :

- Ci-[V/L]-[G/A/R/E]-[Y/H]-[H/E]-G-[Y/F/H]-C₂-[F/Y/L/I]-[R/Q/H]-[S/L/P]-[K/R][S/T/A/V]-C3-P-X-P-F-[A/T/V]-[A/S]-F-G-T-C₄-[S/F/Y/A]-[W/Q/E/R]-[R/H/G]-[Q/R/H][K/R/E]-T-Cs-C6 (SEQ ID NO 7), avec X étant un quelconque acide aminé à l'exclusion d'une cystéine, de préférence choisi dans le groupe consistant en K, P, E, G, D, R, et A ; ou

- D-T-[L/S/Q]-[R/H]-Ci-[V/L]-[G/A/R/E]-[Y/H]-[H/E]-G-[Y/F/H]-C₂-[F/Y/L/I]-[R/Q/H][S/L/P]-[K/R]-[S/T/A/V]-C₃-P-X-P-F-[A/T/V]-[A/S]-F-G-T-C₄-[S/F/Y/A]-[W/Q/E/R][R/H/G]-[Q/R/H]-[K/R/E]-T-C5-C6 (SEQ ID NO 8), avec X étant un quelconque acide aminé à l'exclusion d'une cystéine, de préférence choisi dans le groupe consistant en K, P, E, G, D, R, et A ; ou

- [L/M]-[P/S]-[K/R/T]-D-T-[L/S/Q]-[R/H]-Ci-[V/L]-[G/A/R/E]-[Y/H]-[H/E]-G-[Y/F/H]-C₂[F/Y/L/I]-[R/Q/H]-[S/L/P]-[K/R]-[S/T/A/V]-C₃-P-X-P-F-[A/T/V]-[A/S]-F-G-T-C₄-[S/F/Y/A][W/Q/E/R]-[R/H/G]-[Q/R/H]-[K/R/E]-T-C₅-C₆-[V/I/L] (SEQ ID NO 9), avec X étant un quelconque acide aminé à l'exclusion d'une cystéine, de préférence choisi dans le groupe consistant en K, P, E, G, D, R, et A.

Facultativement, le peptide ou molécule peptidique peut comprendre 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 substitutions conservatives, ces substitutions ne concernant pas les cystéines. De préférence, ces substitutions ne concernent pas les résidus d'acides aminés définis dans les séquences de SEQ ID NOs 4-6.

Dans un mode de réalisation particulier, le peptide ne consiste pas en les séquences

LSLPRDTSRCVGYHGYCIRSKVCPKPFAAFGTCSWRQKTCCV (SEQ ID NO 10)

LSLPRDTSRCVGYHGYCICSKVCPKPFAAFGTCSWRQKTCCV (SEQ ID NO 11).

Dans un mode de réalisation très particulier, le peptide ou molécule peptidique comprend, consiste essentiellement en ou consiste en l'une des séquences suivantes :

LPRDTSRCVGYHGYCIRSKVCPKPFAAFGTCSWRQKTCCV (SEQ ID NO 2)

CVGYHGYCIRSKVCPKPFAAFGTCSWRQKTCC (SEQ ID NO 12) et

DTSRCVGYHGYCIRSKVCPKPFAAFGTCSWRQKTCC (SEQ ID NO 13).

Dans un mode de réalisation préféré, le peptide ou molécule peptidique comprend trois ponts disulfures formées par les six cystéines Ci, C2, C3, C4, C5 et Ce du peptide. Plus particulièrement, les ponts disulfures sont les suivants : C1-C5, C2-C4 et C3-C6. Par un pont disulfure Ci-Csest entendu un pont disulfure entre la cystéine Ci et la cystéine C5. Etc... Dans le contexte de ce mode de réalisation, le peptide ou molécule peptidique selon la présente invention peut consister en l'une des séquences SEQ ID NOs 10-11.

De préférence, le peptide ou molécule peptidique comprend au plus 70, 65, 60, 55, ou 50 acides aminés. Le peptide utilisé selon l'invention a de préférence une taille comprise entre 30 et 100 acides aminés, de manière plus particulièrement préférée comprise entre 30 et 70 acides aminés, et de manière encore plus particulièrement préférée comprise entre 30 et 60 acides aminés. Selon un mode de réalisation particulier, le peptide utilisé selon l'invention a une taille de 30 à 45 acides aminés.

Facultativement, la molécule peptidique peut comprendre en outre d'autres séquences peptidiques, du côté N-terminal ou C-terminal.

Le peptide peut également comprendre, en N-terminal ou C-terminal, un tag (ou étiquette) utile pour la purification ou l'immobilisation du peptide. De tels tags sont bien connus de l'homme du métier et incluent par exemple les tags histidine (Hise), FLAG, HA (épitope dérivé de l'hémagglutinine du virus de la grippe), MYC (épitope dérivé de la protooncoprotéine humaine MYC) ou GST (glutathion-S-transférase). Optionnellement, le peptide peut comprendre un site de clivage par une protéase ou un agent chimique permettant de supprimer ce tag.

Le peptide peut également comprendre un élément facilitant la pénétration cellulaire de la molécule. En particulier, cet élément est un peptide facilitant la pénétration cellulaire de la molécule (élément CPP). Ces peptides sont bien connus de l'homme du métier (par exemple, Vivès et al, Biochimica et Biophysica Acta, 2008, 1786, 126-138). Par exemple et à titre non limitatif, le peptide facilitant la pénétration cellulaire peut être choisi par le groupe consistant en un peptide de Tat, un peptide d'antennapédia ou pénétratine, et un peptide riche en arginine et en lysine, de préférence riche en arginine, notamment un peptide comprenant au moins 9 résidus d'arginine.

Par ailleurs, les ou des liaisons peptidiques de la molécule peptidique selon la présente invention peuvent être modifiées pour les rendre résistantes à la protéolyse. Par exemple, au moins une liaison peptidique (-CO-NH-) peut être remplacée par une liaison divalente choisie parmi (-CH2-NH-), (-NH-CO-), (-CH2-O-), (-CH2-S-), (-CH2-CH2-), (-CO-CH2-), (-CHOH-CH2-), (N=N-), et (-CH=CH-). Facultativement, toutes les liaisons peptidiques peuvent être remplacées.

La molécule peptidique peut comprendre soit une extrémité C terminale carboxylique (-COOj ou amidée (-CONH2). Le peptide peut également être facultativement modifié à son extrémité N-terminale, par exemple par un radical acétyle.

Les isomères L et D des acides aminés sont envisagés. En effet, les isomères D ne sont pas sensibles aux protéases et la présente invention comprend également des molécules comprenant des D acides aminés, notamment des molécules comprenant uniquement ou essentiellement des D acides aminés. Dans un mode particulier, les acides aminés L sont préférés.

L'invention concerne également les sels dudit peptide et leurs utilisations, de préférence de sels acceptables sur le plan pharmaceutique ou vétérinaire. Un sel acceptable sur le plan pharmaceutique ou vétérinaire est un sel qui ne présente pas de toxicité notable, à la dose où il est utilisé. Les sels peuvent être, par exemple, les sels avec des acides minéraux acceptables tels que l'acide chlorhydrique, l'acide bromhydrique, l'acide sulfurique et l'acide phosphorique ; les sels avec des acides organiques acceptables tels que l'acide acétique, l'acide citrique, l'acide maléique, l'acide malique, l'acide succinique, l'acide ascorbique et l'acide tartrique ; les sels avec des bases minérales acceptables tels que les sels de sodium, de potassium, de calcium, de magnésium ou d'ammonium ; ou les sels avec des bases organiques qui ont un azote salifiable. Selon certains modes de réalisation préférés, le sel est un sulfate d'ammonium. Ces sels sont couramment utilisés et leurs méthodes de préparation sont bien connues de l'homme du métier.

La présente invention est également relative à une composition pharmaceutique ou vétérinaire comprenant un peptide ou une molécule peptidique telle que décrit ci-dessus. La composition pharmaceutique ou vétérinaire peut comprendre un support pharmaceutiquement acceptable.

β défensine 11 aviaire (AvBDll)

La présente invention est également relative à de nouvelles utilisations d'une β défensine 11 aviaire telles que décrites ci-dessous, en particulier en tant qu'agent antiparasitaire, en tant qu'agent antiviral, en tant qu'agent anti-invasif et en tant qu'agent cytotoxique. Par « AvBDll » il sera fait référence ici aux β défensines 11 aviaires telles que décrites ci-dessous dans cette section.

La β défensine 11 aviaire peut comprendre, consister essentiellement en ou consister en l'une des séquences telles que décrites dessous :

C1XXXXGXC₂XXXXXC₃PXPFXXFGTC4XXXXXTC₅C₆XDXTSXXXXC7XXXXGHC8VXXXXXC9XXX[Q/

H]XGXCioXXXXWXCnCi2 (SEQ ID NO 14)

DTXXC1XXXXGXC₂XXXXXC3PXPFXXFGTC4XXXXXTC₅C₆XDXTSXXXXC7XXXXGHC8VXXXXXC9XX

X[Q/H]XGXCioXXXXWXChCi₂X[E/D] (SEQID NO 15)

XXXDTXXC1XXXXGXC₂XXXXXC3PXPFXXFGTC₄XXXXXTC₅C₆XDXTSXXXXC7XXXXGHC8VXXXXX

C9XXX[Q/H]XGXCioXXXXWXCiiCi₂X[E/D]X (SEQ ID NO 16) dans laquelle X est un quelconque acide aminé, différent ou identique, de préférence à l'exclusion d'une cystéine. De préférence, X peut être choisi dans le groupe consistant en Ala, Arg, Asp, Asn, Gin, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr et Val.

Dans un aspect particulier, la β défensine 11 aviaire peut comprendre, consister essentiellement en ou consister en l'une des séquences telles que décrites dessous :

Ci-[V/L]-[G/A/R/E]-[Y/H]-[H/E]-G-[Y/F/H]-C₂-[F/Y/L/I]-[R/Q/H]-[S/L/P]-[K/R]-[S/T/A/V]-C₃P-[K/P/E/G/D/R/A]-P-F-[A/T/V]-[A/S]-F-G-T-C₄-[S/F/Y/A]-[W/Q/E/R]-[R/H/G]-[Q/R/H]-[K/R/E]-TC₅-C₆-[V/I/L]-D-[T/A]-TS-[S/N/D/T]-[F/Y/L]-[H/Y/R]-[T/I/S/V/N]-C₇-[Q/E]-[D/E]-[E/K]-[G/R/E]GHC8V-[S/P]-[P/T/A]-[K/E/A/Q/P]-[I/V]-[R/K/N/T/S/E]-C9-[L/V]-[Q/E/R]-[E/D/Q/G]-[Q/H][V/A/E/L/M]-G-[L/F/P]-C1O-[P/S]-[L/R/H/N/Y]-[R/S/G/K]-[K/R/N/G/E/D]-W-[K/R/N/T]-C11C12 (SEQID NO 17)

D-T-[L/S/Q]-[R/H]-C1-[V/L]-[G/A/R/E]-[Y/H]-[H/E]-G-[Y/F/H]-C₂-[F/Y/L/I]-[R/Q/H]-[S/L/P][K/R]-[S/T/A/V]-C₃-P-[K/P/E/G/D/R/A]-P-F-[A/T/V]-[A/S]-F-G-T-C₄-[S/F/Y/A]-[W/Q/E/R]-[R/H/G]16 [Q/R/H]-[K/R/E]-T-C₅-C6-[V/I/L]-D-[T/A]-TS-[S/N/D/T]-[F/Y/L]-[H/Y/R]-[T/I/S/V/N]-C₇-[Q/E][D/E]-[E/K]-[G/R/E]-GHC₈V-[S/P]-[P/T/A]-[K/E/A/Q/P]-[I/V]-[R/K/N/T/S/E]-C9-[L/V]-[Q/E/R][E/D/Q/G]-[Q/H]-[V/A/E/L/M]-G-[L/F/P]-Cio-[P/S]-[L/R/H/N/Y]-[R/S/G/K]-[K/R/N/G/E/D]-W[K/R/N/T]-CnCi2-[K/T/S/A]-[E/D] (SEQ ID NO 18) [L/M]-[P/S]-[K/R/T]-D-T-[L/S/Q]-[R/H]-C1-[V/L]-[G/A/R/E]-[Y/H]-[H/E]-G-[Y/F/H]-C₂[F/Y/L/I]-[R/Q/H]-[S/L/P]-[K/R]-[S/T/A/V]-C₃-P-[K/P/E/G/D/R/A]-P-F-[A/T/V]-[A/S]-F-G-T-C₄[S/F/Y/A]-[W/Q/E/R]-[R/H/G]-[Q/R/H]-[K/R/E]-T-C₅-C₆-[V/I/L]-D-[T/A]-TS-[S/N/D/T]-[F/Y/L][H/Y/R]-[T/I/S/V/N]-C₇-[Q/E]-[D/E]-[E/K]-[G/R/E]-GHC₈V-[S/P]-[P/T/A]-[K/E/A/Q/P]-[I/V][R/K/N/T/S/E]-C9-[L/V]-[Q/E/R]-[E/D/Q/G]-[Q/H]-[V/A/E/L/M]-G-[L/F/P]-Cio-[P/S][L/R/H/N/Y]-[R/S/G/K]-[K/R/N/G/E/D]-W-[K/R/N/T]-C11C12-[K/T/S/A]-[E/D]-[I/T/V/A/L] (SEQ ID NO 19).

Facultativement, le peptide ou molécule peptidique peut comprendre 1 à 20 substitutions conservatives, de préférence 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 substitutions conservatives, ces substitutions ne concernant pas les cystéines. De préférence, ces substitutions ne concernent pas les résidus d'acides aminés définis dans les séquences de SEQ ID NOs 14-18.

Notamment, la β défensine 11 aviaire peut présenter la séquence d'une défensine telle que décrite dans le tableau 4 suivant ou une séquence présentant au moins 70, 75, 80, 85, 90 ou 95% d'identité avec l'une de celles-ci, de préférence avec la séquence mature de celle-ci. Facultativement, la β défensine 11 est mature, c'est-à-dire sans le peptide signal. Facultativement, la β défensine 11 aviaire présente une séquence présentant au moins 70, 75, 80, 85, 90 ou 95% d'identité avec l'une des défensines décrites dans le tableau 4, de préférence avec la séquence mature de celle-ci, et comprend une séquence choisie parmi les SEQ ID NOs 14-19.

Tableau 4 - Séquences protéiques de la β-défensine 11 aviaire chez différentes espèces d’oiseau

RGANISME (genre

»Anas P_C«O5Û28333.1 ga ! nach-ll-fike >02 p.a^Mchc-sj >Anser >XP_O13O39SS1.1 PREDICTED: gal inacn-ll-lite [Anser cygnoides domestic®] >Chrysdophus >AJW76441.i beta-defensin 11 [Chrysolophus pictws] >^nà >XP_O15715135.1 PREDICTED: gal.....nadrUl [Cotumix japonica] •Meleagris >tr G1NN39|G1NN39_MELGA Uncharacterized protein OS=Me. eagris gallopavo PE=4SV=1 >Mesitomis —_Û1C19ECTE.1 PREDICTED gai Ale™ ur œlod >PterocIes >XP_0iCO72920.1 PREDICTED; gal inaon-ll-lite [Pterocles gutwra is] <dumba —.0053.3595.1 ga I nadn-ll [Co urba ivia] ?Tauraco >XP_O099SCO32.1 PREDICTED; gal.inadr-il-like [Tauraco erythro opbus]:

>Opisthocomus >XP_00994C&38.1 PREDICTED: gal inacn-ll-fc [ûplsthocombs hoarn]

-PMcopterus >K3C.5CO27.1 C-a! i-c r-_:l [P^encopte^s ruber ruber] >Podiceps >K FZ49S95.1 Gal inacin-11 [Podiceps ori status]

Æurypyga >XP_01C444917.1 PREDICTED: gal¹ iraon-ll-life [Eurypyga he ias' .Phaethon =0.38012.! C-a! hecr-11, partie : [Fheet™ tep:uri<

>Gawa >KFV52629.1 Gal inarn-Tl. partia [Gavia stel ata' >Aptenodytes —.OOS2S7227.1 PREDICTED gai i-sc π-.l [Aptenodites Writer ] >Pygosceli5 >XP_C09317974.1 PREDICTED; gal inann-ll-like [Pygosce.is ade iae’ .Fulmar® —JK9355429.1 PREDICTED gai hscr-21-Te [M'ncer® glee si s]

>Pelecanus >X P_œ94SS150.1 PREDICTED: gai macn-ll-like [Pelecanus crispus] >Cafldri₅ >- tyû— 03374 1 PREDICTED gal hecr-21 iCeiidris oug^:.,'

>Colius >XP_Ü1C-2O31B7.1 PREDICTED; gal.inaon-ll-lfte [Colitis stratus]

>Tyto >XP_00997C192.1 PREDICTED: gallinaon-ll-lite [Tyto alba]

4-eptoeonMie 1 PREDICTED gal Kec r-U-:fre ^Laptcscm® disco cr] >Apaloderma >KFP913S6.1 Ga linadn-ll, partial [Apa oderma wttatum' .Buceros :4PCTS533.1 Gel irec n-1. partie [Bucercs mroce^ s’ivestris] »Pitoides >XP_009936052.1 PREDICTED: gai inadn-ll-like [Picoides pubescens] >Faico »%005Z36-2C.l PREDICTED gai Heer-41^e co peregrnusj

>Gamilax >AJW76456.1 beta-defensin 11 [Garrulax canorus] atrichia —.«549545C.1 PREDICTED gal hecr-l-ii- [Zorotrcnie aibico HÏ .Serinus >XP_009094361.1 PREDICTED; gal.inadn-ll-like FSennus canaria] .lepidcthri. -_0-_S5Kî.l >Manaais >KFW77291.L Ga.'hnacin-ll [Manacus ‘.Ttel inus] ^Pseudopodes —_CQ5=28*41.1 PREDICTED gai hecr-ll-UXe [Pseudopodes hi ml ici >Parus >XP_M5476117.1 PREDICTED: gal inacm-ll-lite [Parus major' «yenistes >X?_0237SC1511 ga Lnach-ll-like Aristes csetu e®] »Lwichura >XP_0214d572D.l ga Γ-nacin-l 1-like [lonchura striata domestica]

>Conras >.X'P 008629245.1 PREDICTED: gal.inacm-11 [Conus brachyThyndhos] .Stumus ».P_014-48056 1 PREDICTED gai i.necn-21-Ί^ [StuT® νιι ger-s] >Firedula >XP_CO5O444E9.1 PREDICTED: gal inadn-ll-like [Fxedula albicolls]

Dans un mode de réalisation particulier, la β défensine 11 aviaire comprend, consiste essentiellement en ou consiste en la séquence SEQ ID NO 1.

Dans un mode de réalisation préféré, la β défensine 11 aviaire comprend six ponts disulfure formés par les cystéines Ci, C2, C3, C4, C5, Ce, C7, Cs, C9, Cio, Cn et C12. Plus particulièrement, les ponts disulfure sont les suivants : C1-C5, C2-C4, C3-C6, C7-C11, Cs-Cio et C9C12.

La β défensine 11 aviaire peut inclure des modifications similaires à celles décrites cidessus pour les peptides.

Utilisations

Dans un premier aspect particulier, les molécules peptidiques telles que décrites cidessus sont utiles comme agent antibactérien. Ainsi, la présente invention est relative aux molécules peptidiques telles que décrites ci-dessus pour leur utilisation pour traiter ou prévenir une infection par une bactérie, à l'utilisation des molécules peptidiques telles que décrites ci-dessus pour la fabrication d'un médicament destiné à traiter ou prévenir une infection par une bactérie, et à une méthode de traitement d'une infection par une bactérie comprenant l'administration d'une quantité thérapeutique efficace de molécules peptidiques.

La bactérie peut être Gram positif ou Gram négatif.

Les bactéries à Gram positif peuvent appartenir au genre Staphylococcus comme S. aureus, S. epidermidis, S. saprophiticus, S. lugdunensis, S haemolyticus, S warneri, S schleiferi et S intermedius, au genre Streptococcus comme S. pyogenes, S. agalactiae, S. dysgalactiae, S. bovis, S. anginosus, S. sanguinis, S. suis, S. mitis, S. mutons, S. pneumonia et S. oralis, au genre Enterococcus comme E. faecium, E. faecalis er E. gallinarum, au genre Listeria comme L. monocytogenes et L. ivanovii, au genre Clostridium comme C. perfringens, C. difficile, C. tetoni et C. botulinum, au genre Propionibacterium comme P. acnés, P. granulosum, P. avidum er P. propionicus, ou au genre Bacillus comme Bacillus subtilis.

Par exemple, les bactéries à Gram positif sont des bactéries de la famille des Listerioceoe telle qu'une bactérie du genre des Brochothrix ou des Listeria typiquement, choisies parmi Listeria monocytogenes, Listeria innocua, Listeria ivanovii subsp. ivanovii, Listeria ivanovii subsp. londoniensis, Listeria grayi, Listeria seeligeri et Listeria welshimeri, de préférence Listeria monocytogenes. Ainsi, les molécules peptidiques telles que décrites cidessus sont utiles pour le traitement de listériose.

Les bactéries à Gram négatif peuvent être des entérobactéries choisies parmi les bactéries des genres Escherichia, Shigella, Salmonella, Klebsiella, Enterobacter, Providencia, Morganella, Citrobacter, Hafnia et Yersinia. Elles peuvent être également choisies parmi les bactéries des genres Pseudomonas, Acinetobacter, Stenotrophomonas, Burkholderia, et Alcaligenes, en particulier Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, Stenotrophomonas maltophilia, Burkholderia cepacia, et Alcaligenes xylosoxydans.

Les bactéries à Gram négatif peuvent être des salmonelles. Par exemple, la bactérie peut être choisie parmi S. Typhi (bacille d'Eberth), S. Paratyphi A, S. Paratyphi B (bacille de Schotmüller), S. Paratyphi C (bacille d'Hirschfeld), et S. Sendai. La bactérie peut également être une quelconque bactérie de la famille des salmonelles comme Salmonella bongori, Salmonella enterica, Salmonella enterica arizonae, Salmonella enterica diarizonae, Salmonella enterica enterica, Salmonella enterica houtenae, Salmonella enterica indica, Salmonella enterica salamae ou Salmonella subterranea. Ainsi, les molécules peptidiques telles que décrites ci-dessus sont utiles pour le traitement de la fièvre typhoïde, la fièvre paratyphoïde et la salmonellose.

Les bactéries peuvent également être des Escherichia coli.

La molécule peptidique peut être utilisée seule ou en combinaison avec un autre agent thérapeutique, notamment un ou plusieurs antibiotiques.

Dans un autre aspect particulier, les molécules peptidiques telles que décrites cidessus et/ou les AvBDll telles que décrites ci-dessus sont utiles comme agent antiparasitaire. Ainsi, la présente invention est relative aux molécules peptidiques et/ou AvBDll telles que décrites ci-dessus pour leur utilisation pour traiter ou prévenir une infection par un parasite, à l'utilisation des molécules peptidiques et/ou AvBDll telles que décrites ci-dessus pour la fabrication d'un médicament destiné à traiter ou prévenir une infection par un parasite, et à une méthode de traitement d'une infection par un parasite comprenant l'administration d'une quantité thérapeutique efficace de molécules peptidiques et/ou AvBDll telles que décrites ci-dessus.

Le parasite peut en particulier être Eimeria. Ce parasite est connu pour provoquer des coccidioses, pouvant ainsi causer des dégâts importants dans les élevages. En particulier, sont concernés les oiseaux ou volailles, les lapins, les veaux, les chats et chiens et les chèvres. Par exemple, le parasite peut appartenir aux sous-classes Eimeria tenella, Eimeria acervulina, ou Eimeria maxima.

Les molécules peptidiques et/ou AvBDll telles que décrites ci-dessus peuvent être utilisées en combinaison avec d'autres agents thérapeutiques, en particulier des traitements ou vaccinations connus contre les coccidioses, notamment celles causées par Eimeria tel que Eimeria tenella, Eimeria acervulina, ou Eimeria maxima, par exemple des médicaments contre la coccidiose, des pébiotiques, des probiotiques, des composés naturels et des combinaisons de ceux-ci.

Dans un aspect particulier supplémentaire, les molécules peptidiques telles que décrites ci-dessus et/ou les AvBDll telles que décrites ci-dessus sont utiles comme agent antiinvasif. Ainsi, la présente invention est relative aux molécules peptidiques et/ou AvBDll telles que décrites ci-dessus pour leur utilisation pour traiter un cancer, notamment par un effet anti-invasif, à l'utilisation des molécules peptidiques et/ou AvBDll telles que décrites cidessus pour la fabrication d'un médicament destiné à traiter un cancer, notamment par un effet anti-invasif, et à une méthode de traitement d'un cancer, notamment par un effet antiinvasif, comprenant l'administration d'une quantité thérapeutique efficace de molécules peptidiques et/ou AvBDll telles que décrites ci-dessus. Les molécules peptidiques et/ou AvBDll telles que décrites ci-dessus peuvent être utilisées pour prévenir ou ralentir les métastases d'un cancer.

Dans un aspect additionnel, les AvBDll telles que décrites ci-dessus sont utiles comme agent cytotoxique. Elles présentent donc un intérêt dans le traitement du cancer. Le cancer peut être un cancer solide ou hématopoïétique. Le cancer peut être un sarcome, un carcinome, ou un cancer hématopoïétique. En particulier, le cancer est un cancer associé à une capacité à former des métastases. Par exemple, la molécule peut être utilisée pour traiter le cancer du poumon, du sein, du colon, du rein, de la prostate, du col de l'utérus et le mélanome.

Enfin, dans un dernier aspect, les AvBDll telles que décrites ci-dessus sont utiles comme agent antiviral. Ainsi, la présente invention est relative aux AvBDll telles que décrites ci-dessus pour leur utilisation pour traiter ou prévenir une infection par un virus, à l'utilisation AvBDll telles que décrites ci-dessus pour la fabrication d'un médicament destiné à traiter ou prévenir une infection par un virus, et à une méthode de traitement d'une infection par un virus, comprenant l'administration d'une quantité thérapeutique efficace de AvBDll telles que décrites ci-dessus. De préférence, le virus est le virus de la grippe (influenza), de préférence de sous-type A, en particulier le virus de la grippe aviaire. Dans un aspect particulier, le virus peut être un virus choisi parmi H1N1, H5N1, H7N3, H7N7, H7N9, H9N2 et H10N8.

Les AvBDll peuvent être utilisés seules ou en combinaison avec d'autres agents thérapeutiques, en particulier d'autres agents antiviraux.

Dans un mode de réalisation particulier, le sujet à traiter est un animal. De préférence, l'animal est un animal d'élevage ou un animal de compagnie. En particulier, l'animal d'élevage est un bovin, un ovin, un caprin, un équin, un porcin ou une volaille. Par exemple, la volaille peut être une poule, un poulet, une autruche, un canard, une dinde, une caille, un faisan, une pintade, ou une oie.

Dans un autre mode de réalisation particulier, le sujet à traiter est un humain.

La formulation du peptide ou de la molécule peptidique ou d'AvBDll peut varier en fonction de la voie d'administration et du dosage pour lesquels la composition est destinée à être utilisée. La formulation peut notamment être sous forme solide, semi-solide ou liquide. Après formulation avec au moins un véhicule ou excipient physiologiquement acceptable, une composition selon l'invention peut être sous toute forme appropriée pour l'administration, par exemple sous la forme de tablettes, comprimés, pastilles, dragées, capsules, gélules, pilules, granulats, poudre, suspensions, émulsions, sirops, onguents, ampoule de liquide, flacon muni d'un compte-goutte et autres formes analogues de préparations liquides ou en poudres destinées à être prises en unités mesurées de faible quantité, solutions injectables ou suppositoires.

Les molécules ou compositions selon l'invention peuvent être administrées de différentes manières et sous différentes formes. Ainsi, elles peuvent être administrées de manière systémique, par voie orale, par inhalation ou par injection, comme par exemple par voie intraveineuse, intra-musculaire, sous-cutanée, trans-dermique, intra-artérielle, etc., les voies intraveineuse, intra-musculaire, sous-cutanée, orale et par inhalation étant préférées.

Pour les injections, les molécules sont généralement conditionnées sous forme de suspensions liquides, qui peuvent être injectées au moyen de seringues ou de perfusions, par exemple. A cet égard, les molécules sont généralement dissoutes dans des solutions salines, physiologiques, isotoniques, tamponnées, etc., compatibles avec un usage pharmaceutique et connues de l'homme du métier. Ainsi, les compositions peuvent contenir un ou plusieurs agents, supports ou véhicules choisis parmi les dispersants, solubilisants, stabilisants, conservateurs, etc.

Il est entendu que le débit et/ou la dose de peptide, molécule peptidique ou AvBDll peuvent être adaptés par l'homme du métier en fonction du sujet, de la pathologie concernée, du mode d'administration, etc. Typiquement, les molécules sont administrées à des doses pouvant varier entre 1 pg et 1000 mg/kg de poids corporel, plus généralement de 10 pg à 100 mg/kg, typiquement entre 1 mg et 20 mg/kg. En outre, des injections répétées peuvent être réalisées, le cas échéant.

Les molécules peptidiques décrites ci-dessus peuvent également être utilisées dans d'autres domaines que le domaine pharmaceutique ou vétérinaire, notamment sur la base de leur propriété antibactérienne, antiparasitaire, antivirale, anti-invasive et/ou cytotoxique contre les cellules cancéreuses. Dans un premier aspect, elles peuvent être utilisées dans le domaine agro-alimentaire comme agent conservateur ou comme additif alimentaire pour augmenter la plus-value d'un aliment (« functional food »). Ainsi, la présente invention est relative à une méthode de préparation d'une composition alimentaire comprenant l'ajout d'une molécule peptidique à la composition alimentaire. Cette composition alimentaire peut présenter l'avantage d'améliorer le bien-être du sujet, animal ou homme, notamment en prévenant ou diminuant les infections bactérienne, parasitaire, et/ou virale ou en diminuant l'incidence de cancer.Les exemples illustrent la présente invention et ne sont pas destinés à limiter celle-ci.

EXEMPLES

Exemple 1 : Design et synthèse des peptides dérivés de l'AvBDll

AvBDll est une défensine atypique prédite pour comporter deux domaines de type défensines. Sa taille anormalement longue (82 acides aminés) et le nombre de cystéines (12) deux fois plus important que la plupart des défensines rencontrées dans la nature laissaient initialement présager cette structure à deux domaines. L'analyse structurale par RMN 3D réalisée au Centre de Biophysique Moléculaire (C. Landon, H. Meudal, K. Loth) a permis de le confirmer définitivement. Afin de caractériser l'activité de ces 2 domaines, deux peptides synthétiques (AvBDll[l-40] et AvBDll[41-82]) représentatifs de chaque domaine ont été synthétisés (Tableau 5). La limite entre les 2 domaines a été fixée au niveau de la jonction exon-exon identifiée sur la base des données disponibles dans Ensembl et NCBI (Figure 1). Les ponts disulfure de chaque peptide ont été formés par repliement oxydatif. Le peptide AvBDll[l-40] a la particularité d'être amidé à son extrémité C-terminale. La pureté et la masse des peptides ont été vérifiées par HPLC et spectrométrie de masse. La structure et l'appariement des ponts disulfure ont été validés par RMN 3D (données non publiées générées par le Centre de Biophysique Moléculaire : C. Landon, H. Meudal, K. Loth).

Tableau 5. Séquences des peptides synthétiques dérivés d'AvBDll

Nom	Séquence	SEQ ID NO	pi théorique
AvBDll native [1-82]	LPRDTSRCVGYHGYCIRSKVCPKPFAAFGTCSWRQKTC CVDTTS D F HTCQD KG G H CVS P Kl RCLE EQLG LC P LKR WTCCKEI	1	8,78
AvBDll[l-40]	LPRDTSRCVGYHGYCIRSKVCPKPFAAFGTCSWRQKTC CV	2	9,34
AvBDll[41-82]	DTTSDFHTCQDKGGHCVSPKIRCLEEQLGLCPLKRWT CCKEI	3	6,88

Exemple 2 : Activités antibactériennes d'AvBDll et des peptides AvBDll[l-40] et AvBDll[41-82]

L'activité antibactérienne des peptides AvBDll[l-40] et AvBDll[41-82] a été testée en utilisant la technique de diffusion radiale contre deux bactéries responsables de toxiinfections alimentaires, Listeria monocytogenes (Gram+) et Salmonella enterica Enteritidis (Gram-), précédemment utilisées pour caractériser l'activité antibactérienne de l'AvBDll native (Hervé-Grépinet et al. 2010, supra). Les résultats montrent que le peptide AvBDll[l40] est actif contre les deux bactéries (Figure 2A) avec des valeurs de CMI similaires ou inférieures au MSI-94 (témoin positif) (Tableau 6). En revanche, le peptide AvBDll[41-82] ne semble pas actif: aucune activité n'a été détectée à la concentration maximale de 30 μΜ (Figure 2A). Ce dernier n'a également aucun effet (inhibiteur ou potentialisateur) sur AvBDll[l-40] lorsque les deux peptides sont utilisés en combinaison (Figure 2A, Tableau 6).

Ces résultats suggèrent donc que c'est le domaine N-terminal de l'AvBDll qui porte l'activité antibactérienne, au moins vis-à-vis de ces deux souches bactériennes pathogènes.

L'effet des peptides a été testé en présence d'héparine afin d'évaluer l'influence du glycosaminoglycane sur l'activité antibactérienne des molécules. Les résultats présentés dans la Figure 2B montrent que l'héparine inhibe de façon dose-dépendante l'activité antibactérienne du peptide AvBDll[l-40], seul ou en combinaison avec AvBDll[41-82], Ces données suggèrent que le site de fixation à l'héparine du peptide AvBDll[l-40] est vraisemblablement impliqué dans l'activité antibactérienne observée contre Listeria monocytogenes et Salmonella Enteritidis.

Tableau 6. Concentrations minimales inhibitrices (CMI) de différents peptides (AvBDll, AvBDll[l-40], AvBDll[41-82]) contre Salmonella enterica Enteritidis et Listeria monocytogene. Les CMI sont déterminées en utilisant le test de diffusion radiale en gélose. Le MSI-94 (peptide antimicrobien dérivé de la magainine) est utilisé comme témoin positif.

Souche bactérienne	Concentration Minimale Inhibitrice en μΜ (moyenne ± écart-type)
AvBD11 native	AvBD11[1-40]	AvBD11 [41-82]	AvBD11[1-40] + AvBD11 [41-82]	MSI-94
Salmonella enterica (sérovar Enteritidis) ATCC 13076 (n=4)	0,31 ±0,10	0,15 ±0,05	>30	0,16 ±0,06	0,24 ± 0,05
Listeria monocytogenes EGD (n=5)	0,14 ±0,04	0,21 ± 0,07	>30	0,22 ± 0,06	0,34 ± 0,04

Exemple 3 : Activités antiparasitaires d'AvBDll et des peptides AvBDll[l-40] et AvBDll[41-82]

L'activité antiparasitaire de l'AvBDll native et de chaque peptide synthétique dérivé AvBDll[l-40] et AvBDll[41-82] (peptides Nter et Cter, respectivement) a été évaluée en conditions acellulaires, contre des parasites d'Eimeria tenella qui expriment le marqueur de fluorescence YFP. Le pourcentage de viabilité des parasites obtenu pour chaque peptide est indiqué sur la Figure 3. Une activité antiparasitaire significative est observée pour l'AvBDll entière et pour le peptide AvBDll[l-40] (à p <0,01 et p <0,05, respectivement), avec un effet dose-dépendant. L'AvBDll entière a montré une activité antiparasitaire plus forte que le peptide AvBDll[l-40] seul. Le peptide AvBDll[41-82] n'a montré aucune activité, sauf à la plus forte dose testée. Aucune synergie ni antagonisme n'a été observé avec l'addition des deux peptides. Lorsque de l'héparine non fractionnée est ajoutée aux parasites incubés avec l'AvBDll (Figure 3C), les propriétés antiparasitaires de l'AvBDll sont abolies (p = 0.1). Pour élucider la nature de l'activité antiparasitaire de l'AvBDll, les parasites ont été étudiés par microscopie électronique à balayage après incubation avec l'AvBDll (10 pM) et comparés aux parasites témoins, incubés avec du PBS. Aucun changement morphologique significatif n'a pu être observé.

Exemple 4: Activités antivirales d’AvBDH et des peptides ΑνΒΡ11Γ1-401 et AvBD11141-821

AvBDll présente une activité antivirale nette à des concentrations > 2,5 pM

Pour tester les effets cytotoxiques et / ou antiviraux d'un traitement des cellules CLEC213 (non) infectées avec AvBDll, AvBDll[l-40], AvBDll[41-82] ou AvBDll[l-40] + AvBDll[41-82], nous avons utilisé le test commercial Viral ToxGIo™. Ce test permet un dosage de la production d'ATP cellulaire et repose sur le principe qu'une production d'ATP diminuée est indicative d'effets cytotoxiques, alors qu'une production d'ATP augmentée indique des effets pro-prolifératifs ou anti-apoptotiques (cellules non infectées) ou une réduction de la cytopathogénicité virale (cellules infectées).

Premièrement, les inventeurs ont observé que tous les peptides testés modifiaient considérablement la production d'ATP dans les cellules non infectées (Figure 4A). Le traitement des cellules CLEC213 avec AvBDll a eu un double effet sur les cellules, avec des concentrations de 0,31-1,25 pM provoquant une augmentation significative de la production d'ATP relative (= effet pro-prolifératif), et des concentrations plus élevées (> 2,50 pM) provoquant une réduction mineure (2,50 pM) ou hautement significative (5,00 pM) de la production d'ATP relative (= effet cytotoxique). Les traitements avec AvBDll [1-40] et AvBDll [41-82] ont entraîné une augmentation significative de la production d'ATP relative à presque toutes les concentrations testées (= effet pro-prolifératif ou anti-apoptotique). Cet effet était encore plus important lorsque les cellules ont été traitées avec les deux peptides en combinaison (AvBDll [1-40] + AvBDll [41-82]).

Deuxièmement, les inventeurs ont observé des profils d'activité très différents pour AvBDll et les peptides AvBDll [1-40], AvBDll[41-82] ou AvBDll[l-40] + AvBDll[41-82] dans les cellules infectées (Figure 4A). Le traitement des cellules CLEC213 infectées avec

AvBDll a entraîné une forte augmentation de la production d'ATP relative à des concentrations de 0,63-5,00 pM (= réduction de la cytopathogénicité virale). Fait important, cet effet a également été observé à des concentrations qui ont provoqué une cytotoxicité mineure (2,50 pM) ou importante (5,00 pM) dans les cellules non infectées, ce qui indique un effet antiviral net à ces concentrations. Pour AvBDll [1-40] et AvBDll [41-82] (seul ou en combinaison), les données ne montrent pas un tel effet antiviral dans les cellules infectées et traitées. Le traitement des cellules avec AvBDll [1-40] a légèrement diminué la production d'ATP à toutes les concentrations testées (non significatif). En revanche, les traitements des cellules infectées avec AvBDll [41-82] ou AvBDll [1-40] + AvBDll [41-82] ont conduit à une augmentation significative dose-dépendante de la production d'ATP relative (= réduction de la cytopathogénicité virale). Cependant, comme des effets similaires ont également été observés dans les cellules non infectées et traitées avec AvBDll [41-82] ou AvBDll [1-40] + AvBDll [41-82], il est très probable que la production d'ATP augmentée dans des cultures cellulaires infectées et traitées ne soit pas due à une véritable activité antivirale, mais plutôt à une activité pro-proliférative ou anti-apoptotique.

Les activités cytotoxiques et antivirales d'AvBDll sont abolies en présence d'héparine

Enfin, les inventeurs ont testé si une co-incubation avec l'héparine affecterait les activités cytotoxiques et antivirales d'AvBDll. Fait important, ils ont observé que les effets cytotoxiques et antiviraux d'un traitement avec AvBDll à une concentration de 5,00 pM sont complètement abolis en présence d'héparine (Figure 4B).

Exemple 5 : Activités cytotoxiques et anti-invasives d'AvBDll et des peptides AvBDll[l-40] et AvBDll[41-82] contre une lignée cellulaire tumorale

Afin d'explorer de potentielles activités anti-tumorales de la protéine AvBDll ou des peptides dérivés AvBDll[l-40] et AvBDll[41-82], les effets de différentes concentrations de ces molécules sur la viabilité et l'invasion des cellules tumorales pulmonaires NCI-H460 ont été étudiés (Fig 5. et 6A). Ainsi, dans un modèle d'invasion de type chambre de Boyden, la quantité de cellules NCI-H460 ayant traversé la barrière matricielle constituée par le Matrigel® diminue significativement lorsque 4 pM d'AvBDll sont ajoutés aux cellules en comparaison avec les cellules seules, cet effet pouvant être associé à une diminution de la viabilité cellulaire observée dès 2 pM d'AvBDll. Cependant, l'effet anti-invasif de la protéine à des concentrations de 4, 6 et 8 pM est significativement plus important que celui altérant la viabilité cellulaire. De plus, l'incubation des cellules avec le peptide AvBDll[l-40] induit une réduction de l'invasion des cellules NCI-H460 dès 2 μΜ sans modification de la viabilité cellulaire. En revanche, le peptide AvBDll[41-82] n'a que très peu d'effet sur l'invasion et la viabilité des cellules NCI-H460. Lorsque les deux peptides ont été incubés ensemble avec les cellules, des propriétés anti-invasive et cytotoxique sont retrouvées mais avec une intensité moindre que celles observées avec la protéine AvBDll entière. De plus, lorsque de l'héparine non fractionnée est ajoutée aux cellules traitées avec l'AvBDll ou le peptide AvBDll[l-40], les propriétés anti-invasives de ces molécules sont abolies (Figure 6). En revanche, l'effet de la protéine AvBDll sur la viabilité cellulaire reste significatif, même s'il est moindre, en présence d'héparine.

CONCLUSIONS

L'ensemble de ces données montrent que la protéine AvBDll et le peptide AvBDll[l40] possèdent différentes activités biologiques potentiellement valorisables. Les propriétés antibactériennes de l'AvBDll native sont déjà connues (Hervé-Grépinet et al 2010 ; Guyot et al 2016) ; cependant, les données générées montrent pour la première fois que l'AvBDll n'est pas seulement antibactérienne mais qu'elle possède également des activités antiparasitaires (anti-Eimeria) et antivirales (anti-HIN 1). Les inventeurs ont aussi démontré pour la première fois que cette β défensine aviaire possède un potentiel anticancéreux avec des activités cytotoxiques et anti-invasives observées in vitro vis-à-vis de cellules cancéreuses.

Les travaux réalisés dans le but d'identifier la région active de l'AvBDll ont conduit au design et à la synthèse d'un peptide original dérivé de la séquence de l'AvBDll (AvBDll[l40]), pour lequel les inventeurs ont mis en évidence des propriétés antibactériennes, antiparasitaires et anti-invasives.

Matériels et Méthodes

Préparation des peptides

Les synthèses peptidiques sur support solide (SPPS) ont été réalisées selon la stratégie Fmoc à l'aide d'un synthétiseur Prelude (Protein Technologies), à une échelle de 25 pmol, sur une résine Tentagel R NH₂. Les groupes protecteurs standards de chaîne latérale ont été employés : Arg(Pbf), Asp(OtBu), Cys(Trt), Glu(OtBu), Gln(Trt), His(Trt), Lys(Boc), Ser(tBu),

Thr(tBu), Trp(Boc) et Tyr(tBu). Les acides aminés protégés (10 équiv.) ont été couplés à l'aide d'HCTU (9,5 équiv.) en présence de A/,A/-di-isopropyl-ethylamine (DIEA, 20 équiv.) dans la NMP (3 ml) pendant 30 minutes. Cette étape de couplage a été suivie par un traitement par une solution d'anhydride acétique (60 équiv.), DIEA (15,5 équiv.) et HOBt (1,8 équiv.) dans de la NMP (3 ml) pendant 7 minutes. Le groupe Fmoc a ensuite été éliminé par trois traitements successifs avec de la pipéridine à 20% dans de la NMP (3 ml) pendant 3 minutes. Après élongation, la résine a été traitée par un mélange TFA/H2O//Pr3SiH/phénol (88:5:2:5) pendant 2 h, puis le peptide a été précipité par dilution (x 10) dans un mélange 1:1 d'éther diéthylique/éther de pétrole refroidi à 0°C, collecté par centrifugation, puis lavé trois fois avec de l'éther diéthylique et séché sous pression réduite.

Les analyses de spectrométrie de masse ESI-MS à haute résolution ont été réalisées sur un spectromètre de masse Q-TOF maXis (Bruker Daltonics), en utilisant le mode positif. L'enveloppe multi-chargée a été déconvoluée à l'aide du logiciel Bruker Data Analysis 4.1. Les analyses MALDI-TOF ont été réalisées en mode réflectron sur un instrument Autoflex (Bruker Daltonics) en utilisant l'acide a-cyano-4-hydroxycinnamique comme matrice. Les valeurs théoriques et expérimentales de [M] ou [M+H]⁺ correspondent à l'espèce monoisotopique. Les analyses LC / HRMS ont été effectuées sur un système HPLC couplé au spectromètre de masse maXis et équipé d'une colonne Aeris WidePore XB-C18 (200 Â, 3,6 pm, 2,1 x 150 mm, débit de 0,5 mL/min, 40 ° C. Les solvants A et B étaient respectivement 0,1% d'acide formique dans Η₂Ο et 0,08% d'acide formique dans MeCN. Gradient: 3% B pendant 0,6 min puis 3 à 50% B pendant 10,8 min.

Les analyses HPLC ont été effectuées en utilisant une colonne Chromolith HR RP-18e (150 Â, 10 x 4,6 mm, débit de 3 mL/min) ou une colonne Jupiter C4 (300 Â, 5 pm, 250 x 4,6 mm, débit de 1 mL/min). Les purifications HPLC ont été effectuées en utilisant une colonne Nucleosil C18 (300 Â, 5 pm, 250 x 10 mm, débit de 3 mL/min). Les solvants A et B étaient respectivement 0,1% de TFA dans H₂O et 0,1% de TFA dans MeCN.

Les quantités de peptides purifiés ont été déterminées par spectrophotométrie UV à λ = 280 nm (ετ_Γρ = 5500, ετ_γΓ = 1490 et εΐίβίεοη SS — 125 L.M hcm¹).

AvBDll[l-40l

Séquence : H-¹LPRDTSRCVGYHGYCIRSKVCPKPFAAFGTCSWRQKTCC⁴⁰V-NH₂

La forme réduite de AvBDll[l-40] (cystéines avec leurs fonctions thiol libres) a été synthétisée selon le protocole général de Fmoc-SPPS, en utilisant un linker de type Rink amide incorporé sous la forme de Fmoc-Rink-OH.

ESI-HRMS (m/z) : [M] = 4522,18 ([M]_théorique pour Ci97H₃o9N₆o0₅iS6 = 4522,17).

Analyse HPLC : îr = 6,0 min (Chromolith, gradient: 15% B/A pendant 1 min puis 15

45% B/A pendant 7,5 min).

Purification HPLC : îr = 8,6 min (gradient: 28-35% B/A pendant 10 min).

Rendement: 26 % (6,6 pmol).

Repliement oxydatif (formation des ponts disulfure): une solution déoxygénée du peptide réduit (2 pmol, 10 pM), de glutathion oxydé (GSSG, 10 équiv.) et de glutathion (GSH, 100 équiv.) a été incubée à 4°C pendant 48 h sous argon dans 200 mL d'un mélange 1:3 d'isopropanol et d'un tampon aqueux à pH = 8,5 contenant 100 mM de TRIS-HCI et 1 mM d'EDTA. Avant purification par HPLC, 1 mL de TFA est ajouté au mélange réactionnel.

MALDI MS (m/z): [M+H]⁺ = 4517,18 ([M+H]⁺ _théorique pour Ci97H₃o3N6o0₅iS₆ = 4517,13.

Analyse HPLC : îr = 17,7 min (Jupiter C4, gradient: 5-50% B/A pendant 30 min).

Purification HPLC : îr = 10,5 min (gradient: 22-37% B/A pendant 15 min).

Rendement : 34 % (0,68 pmol).

AvBDll[41-82]

La forme réduite de AvBDll[41-82] a été synthétisée selon le protocole général de Fmoc-SPPS, en utilisant un linker de type Wang, incorporé par le couplage de Fmoc-⁸²lle-(acide 4-oxymethylphenoxypropionique) (Fmoc-lle-mppa-OH).

Séquence : H-⁴¹DTTSDFHTCQDKGG HCVSPKIRCLEEQLGLCPLKRWTCCKE⁸²I-OH

ESI-HRMS (m/z) : [M] = 4777,25 ([M] théorique pour C202H325N59O63S6) = 4777,24).

Analyse HPLC : îr = 6,8 min (Chromolith, gradient: 15% B/A pendant 1 min puis 15-45% B/A pendant 7,5 min).

Purification HPLC : îr = 9,5 min (gradient: 30-37% B/A pendant 10 min).

Rendement : 23 % (5,8 pmol).

Repliement oxydatif (formation des ponts disulfure): une solution déoxygénée du peptide réduit (2 pmol, 10 μΜ), de glutathion oxydé (GSSG, 10 équiv.) et de glutathion (GSH, 100 équiv.) a été incubée à 4°C pendant 48 h sous argon dans 200 mL d'un tampon aqueux à pH = 8,5 contenant 100 mM de TRIS-HCI et 1 mM d'EDTA. Avant purification par HPLC, 1 mL de TFA est ajouté au mélange réactionnel.

MALDI MS (m/z): [M+H]⁺ = 4772,25 ([M+H]⁺ _théorique pour CzozHszoNsgOesSe = 4772,20).

Analyse HPLC: îr = 3.0 min (Chromolith, gradient: 15-40% B/A pendant 5 min).

Purification HPLC : îr = 9,2 min (gradient: 22-37% B/A pendant 15 min).

Rendement: 28 % (0,56 pmol).

Effet antibactérien

Deux souches bactériennes différentes (une Gram-ι- et une Gram-) ont été utilisées pour tester l'activité antibactérienne : Salmonella enterica sérovar Enteritidis ATCC 13076 et Listeria monocytogenes EGD. Ces deux souches ont été fournies par le Centre International de Ressources Microbiennes - Bactéries Pathogènes (INRA, ISP, Nouzilly, France). Les activités antibactériennes ont été mesurées selon la technique de diffusion radiale décrite par Lehrer et al (J Immunol Methods, 1991, 137(2), 167-73) et utilisée précédemment pour la caractérisation antibactérienne de l'AvBDll native (Hervé-Grépinet et al 2010). Listeria monocytogenes et Salmonella enterica Enteritidis sont cultivées respectivement dans les milieux Brain Heart Infusion (BHI) et Tryptical Soy Broth (TSB) sous agitation (180 tr / min) à 37 ° C jusqu'en phase exponentielle, puis lavées une fois dans du tampon phosphate de sodium 10 mM (pH 7,4) froid puis reprises dans un petit volume de ce même tampon. Un volume contenant 7.5 x 10⁶ UFC (Unité Formant Colonie) est introduit dans un milieu gélosé pauvre en nutriment (tampon phosphate de sodium 10 mM, pH 7,4, contenant 0,03% [poids/volume] de TSB, 1% [poids/volume] d'agarose de faible électro-endosmose [SigmaAldrich, St Quentin Fallavier, France] et 0,02% de Tween-20) maintenu en surfusion. Ce milieu, contenant les bactéries, est ensuite coulé dans une boîte de Pétri pour former une couche uniforme d'environ 1 mm d'épaisseur. Trente-six puits de 2,75 mm de diamètre, régulièrement espacés, sont creusés dans la gélose à l'aide d'un emporte-pièce. Cinq μί d'une solution contenant l'AvBDll, les peptides AvBDll[l-40] et AvBDll[41-82] (seuls ou combinés) à différentes concentrations (0 - 0,3072 - 0,768 - 1,92 - 4,8 - 12 - 30 μΜ dans de l'eau ultrapure) sont ajoutés dans chaque puits puis la boite de Petri est incubée pendant 3h à 37°C afin de laisser diffuser/agir les peptides. La gélose contenant les bactéries est ensuite recouverte par une gélose riche en nutriments (tampon phosphate de sodium 10 mM, pH 7,4, contenant 6% [poids/volume] de TSB et 1% [poids/volume] d'agarose de faible électroendosmose [Sigma-Aldrich, St Quentin Fallavier, France]) et la boite de Petri est incubée pendant la nuit à 37°C. L'activité antibactérienne est visualisée le lendemain par la présence d'une zone d'inhibition circulaire à l'intérieure de laquelle les bactéries ne se sont pas développées. Pour chaque molécule testée, les diamètres d'inhibition (auxquels les diamètres des puits ont été retranchés) pour chaque point de concentration sont représentés graphiquement en fonction du logarithme décimal des concentrations, soit y = f(x). La concentration minimale inhibitrice (CMI) est déterminée grâce à l'équation de la droite obtenue par régression linéaire des données, soit la valeur de x pour y = 0 dans l'équation y = ax + b. Il s'agit du point situé à l'intersection de la droite avec l'axe des abscisses, indiquant la plus faible concentration de peptide pour laquelle aucune inhibition n'est détectée. Pour chaque souche bactérienne, au minimum quatre mesures indépendantes identiques de l'activité antibactérienne ont été effectuées. Le MSI-94, un variant de magainine affichant un large spectre antimicrobien, est utilisé comme témoin positif.

L'effet de l'héparine sur l'activité antibactérienne de l'AvBDll et des peptides AvBDll[l-40] et AvBDll[41-82] (seuls ou combinés) a été testé en utilisant les molécules à une concentration finale de 12 μΜ en présence d'héparine (H3149, Sigma-Aldrich, St Quentin Fallavier, France) à 0, 20 et 100 ng/μι dans un tampon TBS (50 mM Tris-HCI, 150 mM NaCI, pH 7,4). Les échantillons ont été analysés comme précédemment contre Listeria monocytogenes et Salmonella enterica Enteritidis.

Effet antiparasitaire

Les tests antiparasitaires ont été réalisés contre des parasites d'Eimeria tenella. La souche Et-YFP est une souche recombinante, exprimant de façon stable le marqueur de fluorescence YFP (Yellow Fluorescent Protein) (1). Les parasites (5.10⁵) en suspension dans 20 pL d'une solution saline tamponnée au phosphate 10 mM (PBS), pH 7,4 contenant l'AvBDll, le peptide AvBDll[l-40], le peptide AvBDll[41-82] ou les 2 peptides en mélange (concentration finale de 0, 1.25, 2.5, 5, 10 pM) ont été incubés 1 h à 41°C (température correspondant à la température corporelle du poulet et de la poule). A la fin de l'incubation, la viabilité des parasites a été évaluée par coloration au bleu d'Evans aqueux (vol / vol). Les parasites vivants (verts) et morts (rouges) ont été comptés en utilisant un microscope Zeiss Axiovert 200. Les résultats sont exprimés sous forme de pourcentage de viabilité par rapport aux parasites incubés en PBS seul. Les résultats représentent la moyenne de 2 réplicats techniques réalisés dans 3 expérimentations indépendantes. La compétition avec l'héparine a été réalisée pour l'AvBDll entière à 10 μΜ, en présence d'héparine à 100 pg/mL, dans les conditions décrites précédemment. Deux expérimentations indépendantes avec 2 réplicats par condition ont été réalisées.

Microscopie électronique à balayage

Après incubation avec les peptides, les parasites ont été fixés pendant 24 h dans du paraformaldehyde à 4%, du glutaraldéhyde à 1% dans du tampon phosphate 0,1 M (pH 7,2). Ils ont ensuite été lavés dans du PBS et post-fixés par incubation avec 2% de tétroxyde d'osmium pendant 1 h. Les échantillons ont ensuite été entièrement déshydratés dans une série graduée de solutions d'éthanol et séchés dans de l'hexaméthyldisilazane (HMDS, Sigma, St-Louis, MO, USA). Les parasites ont été observés au microscope électronique à balayage Zeiss Ultra plus FEG-SEM (Oberkochen, Allemagne) à la Plateforme IBiSA de Microscopie Electronique (Université François Rabelais de Tours, France).

Effet antiviral

Les activités antivirales de AvBDll, AvBDll[l-40], AvBDll[41-82] et AvBDll[l-40] + AvBDll[41-82] ont été testées dans un modèle d'infection par un virus influenza aviaire utilisant une lignée cellulaire épithéliale pulmonaire de poule (CLEC213) (Esnault et al., 2011, Virus Research, 159, 32-42). Des cellules CLEC213 ont été cultivées dans du milieu DMEM-F12 (Dulbecco's modified Eagle medium/Nutrient F-12 Ham) (Gibco) complété avec 7,5% de sérum de veau fœtal (SVF), 100 U/ml de pénicilline et 100 pg/ml de streptomycine à 41°C et 5% de CO2. La souche virale A/Mallard/Marquenterre/Z237/83 (H1N1-MZ) utilisée pour les expériences d'infection des cellules CLEC213 a été récupérée par génétique inverse et amplifiée dans des cellules MDCK (Madin Darby canine kidney) comme décrit précédemment (Munier et al., 2010, J. Virol., 84, 940-952). Le titre (PFU/ml) du stock viral a été déterminé par un test de plaque standard dans des cellules MDCK. L'ampleur de l'effet cytopathique induit par des dilutions en série du virus H1N1-MZ dans les cellules CLEC213 a été déterminée en utilisant le test viral ToxGIo™ (Promega), un test de luminescence mesurant ΓΑΤΡ en tant que substitut de la viabilité cellulaire ou de la cytopathogénicité virale (Noah et al., 2007, Antiviral Research, 73, 50-59). A cette fin, les cellules CLEC213 ont été ensemencées dans des plaques à 96 puits (5 x 10³ cellules par puits) et cultivées pendant 16-18 h dans un milieu complet à 4TC et 5% de C0₂. Les cellules ont ensuite été lavées avec du PBS et infectées avec des dilutions de 1/2 log du stock viral dans du DMEM-F12 sans SVF (8 puits par dilution). Les cellules témoins non infectées ont été recouvertes de DMEM-F12 sans SVF (8 puits). A 48 heures post-infection (hpi), les cellules ont été lavées, recouvertes avec 100 pl d'ATP Detection Reagent (Promega) et incubées pendant 20 min à température ambiante. Les signaux de luminescence (RLU - relative light units) ont été mesurés à l'aide d'un système de détection GloMax®-Multi (Promega) et la TCIDso (50% tissue culture infectious dose, c'est à dire la dilution du stock viral à laquelle les RLU ont diminué jusqu'à 50% des valeurs des témoins) a été calculée à partir des valeurs des RLU moyennes en utilisant GraphPad Prism v6.07 (GraphPad Software Inc.). Les mêmes conditions de culture et lecture ont été utilisées pour tester les effets cytotoxiques et / ou antiviraux des traitements des cellules CLEC213 avec AvBDll et les deux peptides synthétiques AvBDll[l-40] et AvBDll[41-82], Les cellules (6 puits par condition) ont été non traitées (témoins) ou traitées avec 0,31-5,00 μΜ de AvBDll, AvBDll[l-40], AvBDll[41-82] ou AvBDll[l-40] + AvBDll[41-82] dans du milieu DMEM-F12 et les valeurs de luminescence ont été déterminées à 48 heures post-traitement (hpt). Pour tester les effets antiviraux, AvBDll, AvBDll[l-40], AvBDll[41-82] et AvBDll[l-40] + AvBDll[41-82] à 0,31-5,00 μΜ (concentration finale) ont été mélangés avec 25 x TCID50 de H1N1-MZ (soit environ 5 χ 10³ PFU) et co-incubés pendant 30 min à température ambiante. Les mélanges, ainsi qu'une préparation de virus non mélangés (témoins non traités), ont été ajoutés sur les cellules CLEC213 (6 puits par condition) et les valeurs de luminescence ont été déterminées à 48 hpi. Les valeurs de la production d'ATP relative ont été calculées pour les cellules (non) infectées et traitées par rapport aux valeurs des RLU moyennes obtenues pour les témoins (cellules non traitées). Les effets du traitement par l'héparine sur les activités cytotoxiques et / ou antivirales de AvBDll ont été évalués en utilisant le protocole décrit cidessus, avec les modifications suivantes: AvBDll à une concentration finale de 0,50 μΜ ou 5,00 μΜ a été co-incubée (15 min à température ambiante) avec 100 pg / ml (concentration finale) de l'héparine (Sigma) dissous dans de l'eau stérile ou avec un volume égal d'eau (34 héparine) avant d'être mélangée avec le virus H1N1-MZ ou être ajoutée directement sur les cellules CLEC213.

Effet anticancéreux

Cultures cellulaires. Les cellulestumorales bronchiques NCI-H460 (HTB-177TM), issues d'une effusion pleurale d'un cancer bronchique non à petites cellules ont été utilisées pour évaluer les capacités anti-invasives de la protéine entière AvBDll et des peptides synthétiques AvBDll[l-40] et AvBDll[41-82], Les cellules NCI-H460 ont été cultivées en milieu RPMI1640 (Invitrogen, Cergy Pontoise, France) additionné de 2 mM de L-glutamine, 10 mM d'HEPES, 1 mM de pyruvate de sodium, 25 mM de bicarbonate de sodium, 2 mM glucose, 100 unités/mL de pénicilline, 100 pg/mL de streptomycine et 10 % de sérum de veau fœtal dépourvu d'endotoxines (SVF, Lonza, Basel, Switzerland). Les flacons de culture ont été placés à 37°C en atmosphère humide contenant 5% de CO2. Les surnageants de culture ont été testés régulièrement afin de détecter la présence de mycoplasmes (PlasmoTest mycoplasma detection kit, InvivoGen, Toulouse, France).

Test d'invasion. Le test utilisé est basé sur le modèle de chambre de Boyden modifiée. Des inserts de culture ayant des pores de 8 pm de diamètre (BD Falcon Cell, BD Biosciences, Le Pont de Claix, France) sont recouverts de 25 pg de Matrigel™ (BD Biosciences) selon les instructions du fournisseur. Les cellules (2.10⁵) en suspension dans 300 pLde milieu RPMI sans SVF et contenant soit l'AvBDll, soit le peptide AvBDll[l-40] ou AvBDll[41-82] ou soit les deux peptides combinés (concentration finale de 0, 2, 4, 6, 8 pM) ont été déposées dans chacun des inserts. Les inserts ont ensuite été placés dans des puits d'une plaque 24 puits contenant 700 pL de milieu RPMI contenant 10 % de SVF utilisé comme chimioattractant. Les plaques ont alors été incubées 48 heures à 37°C en atmosphère humide contenant 5% de CO2. Les cellules ayant migré sous l’insert et celles adhérées à la surface du puits ont été détachées à l'aide d'une solution de 0,05% trypsine/0,02% EDTA puis dénombrées à l'aide d'un hématimètre de Malassez. Deux réplicats techniques ont été réalisés pour les cellules incubées avec les différentes molécules et 3 réplicats pour les cellules contrôles. Les résultats sont exprimés sous forme de pourcentage d'invasion par rapport aux cellules qui ont migré en l'absence de molécule. Les résultats représentent la médiane +/- 1er quartile/3ème quartile de 5 expérimentations indépendantes.

Test MTS de viabilité cellulaire. La viabilité cellulaire a été évaluée à l'aide d'un test MTS (CelITiter 96® Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay, Promega, Charbonnières, France). Pour le test MTS effectué en parallèle du test d'invasion, 10⁴ cellules NCI-H460 par puits ont été déposées dans une plaque 96 puits et cultivées dans 100 pL de milieu sans sérum contenant soit l'AvBDll, soit le peptide AvBDll[l-40] ou AvBDll[41-82], ou les deux peptides combinés à une concentration finale de 0, 2, 4, 6, 8 pM. Les cellules ont ensuite été incubées pendant 1 heure avec le réactif MTS puis la formation de formazan, proportionnelle au nombre de cellules viables, a été quantifiée par mesure de l'absorbance à 490 nm, en suivant les instructions du fournisseur. La médiane des absorbances obtenues avec les cellules seules correspond à la valeur de référence 100% de viabilité cellulaire. Cinq expérimentations indépendantes avec 2 réplicats par condition ont été réalisées pour les tests MTS réalisés en parallèle de l'invasion. Trois expérimentations indépendantes avec 8 réplicats par condition ont été réalisées pour les tests MTS réalisés en parallèle de la quantification des cytokines.

Test en présence d'héparine. L'AvBDll ou le peptide AvBDll[l-40] à 6 pM ont été préincubés avec de l'héparine à 100 pg/mL pendant 5 minutes avant addition aux cellules. Les tests d'invasion ou de viabilité ont été réalisés selon le protocole décrit précédemment. Trois expérimentations indépendantes avec 2 réplicats par condition ont été réalisées pour chacune des techniques.

Analyses statistiques. Les résultats représentent la médiane +/- 1er quartile/3ème quartile. Le test de Kruskal-Wallis et de Dunn a été utilisé pour les comparaisons multiples et le test de Mann Whitney dans le cas de comparaison de 2 groupes. Les tests statistiques ont été réalisés à l'aide du logiciel Graphpad Prism version 6.0 pour Mac. Les différents seuils de significativité des données sont * p < 0.05 ; ** p < 0.01 ; *** p < 0.0001 ; **** p < 0.0001.

Claims (12)

1- Molécule peptidique comprenant une séquence choisie parmi les séquences suivantes :

C1XXXXGXC2XXXXXC3PXPFXXFGTC4XXXXXTC5C6 (SEQ ID NO 4) ;

DTXXC1XXXXGXC2XXXXXC3PXPFXXFGTC4XXXXXTC5C6 (SEQ ID NO 5) ; et

XXXDTXXC1XXXXGXC2XXXXXC3PXPFXXFGTC4XXXXXTC5C6X (SEQ ID NO 6) dans lesquelles X est un quelconque acide aminé, différent ou identique, le peptide comprenant au plus 70 acides aminés ;

le peptide ne consistant pas en les séquences

LSLPRDTSRCVGYHGYCIRSKVCPKPFAAFGTCSWRQKTCCV (SEQ ID NO 10)

LSLPRDTSRCVGYHGYCICSKVCPKPFAAFGTCSWRQKTCCV (SEQ ID NO 11).

2- Molécule peptidique selon la revendication 1, dans lequel X est choisi dans le groupe consistant en Ala, Arg, Asp, Asn, Gin, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr et Val.

3- Molécule peptidique selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, comprenant une séquence choisie parmi les séquences suivantes :

- Ci-[V/L]-[G/A/R/E]-[Y/H]-[H/E]-G-[Y/F/H]-C2-[F/Y/L/I]-[R/Q/H]-[S/L/P]-[K/R][SZT/A/V]-C3-P-X-P-F-[A/T/V]-[A/S]-F-G-T-C4-[S/F/Y/A]-[W/Q/E/R]-[R/H/G]-[Q/R/H][K/R/E]-T-Cs-C6 (SEQ ID NO 7), avec X étant un quelconque acide aminé à l'exclusion d'une cystéine, de préférence choisi dans le groupe consistant en K, P, E, G, D, R, et A ; ou

- D-T-[L/S/Q]-[R/H]-Ci-[V/Ll-[G/A/R/E]-[Y/H]-[H/E]-G-[Y/F/H]-C2-[F/Y/L/I]-[R/Q/H][S/L/P]-[K/R]-[SA/A/V]-C₃-P-X-P-F-[A/r/V]-[A/S]-F-G-T-C4-[S/FA/A]-[W/Q/E/R][R/H/Gl-[Q/R/H]-[K/R/E]-T-Cs-C6 (SEQ ID NO 8) X étant un quelconque acide aminé à l'exclusion d'une cystéine, de préférence choisi dans le groupe consistant en K, P, E, G, D, R, et A ; ou “ [L/M]-[P/S]-[K/R/T]-D-T-[L/S/Q]-[R/H]-C₁-[V/L]-[G/A/R/E]-[Y/H]-[H/E]-G-[Y/F/H]-C2[FA/L/l]-[R/Q/H]-[S/L/P]-[K/R]-[SZr/A/V]-C₃-P-X-P-F-[AA/Vj-[A/S]-F-G-T-C₄-[S/FA/A][W/Q/E/R]-[R/H/G]-[Q/R/H]-[K/R/E]-T-C₅-Cs-[V/I/L] (SEQ ID NO 9) X étant un quelconque acide aminé à l'exclusion d'une cystéine, de préférence choisi dans le groupe consistant en K, P, E, G, D, R, et A.

4- Molécule peptidique selon l'une quelconque des revendications 1-3, comprenant trois ponts disulfures, les ponts disulfures étant de préférence les suivants : C1-C5, C2-C4 et C3C₆.

5- Molécule peptidique selon l'une quelconque des revendications 1-4, comprenant l'une des séquences suivantes :

LPRDTSRCVGYHGYCIRSKVCPKPFAAFGTCSWRQKTCCV (SEQ ID NO 2)

CVGYHGYC1RSKVCPKPFAAFGTCSWRQKTCC (SEQ ID NO 12) et

DTSRCVGYHGYCIRSKVCPKPFAAFGTCSWRQKTCC (SEQ ID NO 13).

6- Molécule peptidique selon l'une quelconque des revendications 1-5 ou peptide consistant en la séquence SEQ ID NO 10 ou 11 pour son utilisation en tant que médicament.

7- Molécule peptidique pour son utilisation selon ta revendication 6 en tant qu'agent antibactérien, antiparasitaire et/ou anti-invasif.

8- Composition pharmaceutique ou vétérinaire comprenant une molécule peptidique selon l'une quelconque des revendications 1-5, et facultativement un autre composé d'intérêt thérapeutique.

9- Composition pharmaceutique ou vétérinaire selon la revendication 8 pour son utilisation pour le traitement ou la prévention d'une infection bactérienne, le traitement ou la prévention d'une infection par un parasite, de préférence une coccidiose le parasite étant Eimeria, ou pour le traitement d'un cancer.

10- Molécule peptidique pour son utilisation selon la revendication 6 ou 7 pour traiter ou prévenir une coccidiose, le parasite étant Eimeria.

11- Utilisation d'une molécule peptidique selon l'une quelconque des revendications 1-5 ou peptide consistant en la séquence SEQ ID NO 10 ou 11 comme conservateur alimentaire.

12- Utilisation d'une molécule peptidique selon l'une quelconque des revendications 1-5 ou peptide consistant en la séquence SEQ ID NO 10 ou 11 comme additif alimentaire.