EP3475437A1 - Verfahren zur herstellung von d-xylonat und coryneformes bakterium - Google Patents

Verfahren zur herstellung von d-xylonat und coryneformes bakterium

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EP3475437A1
EP3475437A1 EP17745964.1A EP17745964A EP3475437A1 EP 3475437 A1 EP3475437 A1 EP 3475437A1 EP 17745964 A EP17745964 A EP 17745964A EP 3475437 A1 EP3475437 A1 EP 3475437A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
gene
corynebacterium
lolr
brevibacterium
xylonate
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP17745964.1A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Stephan Noack
Andreas RADEK
Jan Marienhagen
Karin Krumbach
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Forschungszentrum Juelich GmbH
Original Assignee
Forschungszentrum Juelich GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Forschungszentrum Juelich GmbH filed Critical Forschungszentrum Juelich GmbH
Publication of EP3475437A1 publication Critical patent/EP3475437A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/58—Aldonic, ketoaldonic or saccharic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/34—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Corynebacterium (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/36—Adaptation or attenuation of cells

Definitions

  • the invention relates to a process for the preparation of D-xylonate and a coryneform bacterium.
  • D-xylonic acid (C5H10O6) is an organic acid which, as described by Toivari et al. in Appl Microbiol Biotechnol, 2012, 96 (1): 1-8, can serve as a precursor for polyamides, polyesters, and 1, 2,4-butanetriol, and thus has broad application potential in the pharmaceutical, food, and pharmaceutical industries chemical industry up.
  • the following explanations refer to D-xylonate, the salt of D-xylonic acid.
  • D-xylonate is among the top 30 most potentially high-quality, second-generation renewable resources, e.g. Pentose-containing hemicellulose-based, precursor chemicals.
  • D-xylonate is similar to D-gluconate (C6H1 107), which has a global market of 80 kt / yr.
  • D-xylonate is naturally produced in some bacteria via a two-step reaction.
  • D-xylose is oxidized to D-xylonolactone, where specific dehydrogenases are catalytically active depending on the organism.
  • the D-xylonolactone can then be converted to D-xylonate either by specific lactonases or spontaneously, without enzyme catalyst.
  • D-xylonate production strains e.g., yeast of the species Saccharomyces cerevisiae, bacteria of the species Escherichia coli and fungi of the species Aspergillus niger
  • yeast of the species Saccharomyces cerevisiae bacteria of the species Escherichia coli and fungi of the species Aspergillus niger
  • D-xylose dehydrogenases e.g. From Caulobacter crescentus, as described by (Liu et al., Bioresour Technol, 2012, 1 15: 244-248, Richard et al., 2012, US20120005788 A1 (US 13 / 256,559), Toivari et al., Metab Eng, 2012, 14 (4): 427-436).
  • D-xylonate can be electrochemically (Jokic et al., Journal of Applied Electrochemistry, 21 (4): 321-326), enzymatically (Pezzotti et al., Carbohydr Res, 2006, 341 (13): 2290-2292 ) or by chemical oxidation (Isbell et al., Bureau of
  • organic acids or their salts can be prepared by fermentation of strains of coryneform bacteria, in particular Corynebacterium glutamicum.
  • Non-natural D-xylonate producers are genetically modified organisms within the meaning of the Genetic Engineering Act (GenTG) ⁇ 3, according to which an organism is genetically modified if it is capable of heterologous expression or for this organism contains foreign genes, that is, recombinantly altered, among others different yeasts, mushrooms and bacteria. This creates a disadvantage for use in certain industrial areas, such. B. Food and pharmaceutical industry as a result of complex approval procedures.
  • a microorganism and a method which can be used in industrial applications, in particular in the food industry, the pharmaceutical and chemical industries and readily meet the conditions of approval for use in the food and pharmaceutical and chemical industries .
  • the disadvantages associated with genetically modified organisms within the meaning of the law governing genetic engineering ⁇ 3, in particular recombinantly modified organisms, should preferably be avoided.
  • simple and inexpensive media for cultivation should be used, which are inexpensive and easy to use.
  • the microorganisms used should have high growth rates on defined media, achieve high biomass yields and simplify subsequent product processing.
  • the object is achieved according to the invention in the characterizing part of the claims specified characteristics.
  • the microorganism according to the invention With the microorganism according to the invention, its genome and the preparation process according to the invention, it is now possible to produce D-xylonate in a high yield, for example> 0.5 g of D-xylonate / g D-xylose, with an enantiomeric purity of 100%.
  • the microorganisms according to the invention are well suited for industrial use and, in a preferred embodiment, overcome the approval criteria for use in the food industry and the pharmaceutical and chemical industries; in particular, they are regarded as non-recombinantly modified according to the Genetic Engineering Act.
  • the microorganisms according to the invention achieve high growth rates and high biomass yields on defined media and enable simple product workup.
  • the disadvantages of the prior art are overcome.
  • the defined media are cheaper and less expensive to use.
  • the growth of production organisms is more reproducible than with undefined media.
  • the complexity of the media is low and thus reduces the number of necessary process steps for product processing.
  • the invention therefore relates to a coryneform bacterium in which the activity of the lolR gene against wild-type or a wild-type mutant, preferably a non-recombinant mutant containing this gene, diminished or completely eliminated or in which the lolR gene is at least partially deleted and a process for the production of D-xylonate with a coryneform bacterium, in which the lolR gene is reduced in its activity or completely eliminated or in which the lolR gene is at least partially deleted.
  • the coryneform bacteria modified according to the invention can be derived from the wild form or from a genetically modified form which is preferably not recombinantly modified in comparison to the wild form.
  • the wild-type strains are particularly preferred for the pharmaceutical and food industries because they are particularly easy to produce.
  • the wild form contains as starting strain of the method according to the invention a natural lolR gene.
  • the genetically modified strains also contain a natural lolR gene in their initial form.
  • a genetically modified strain is to be understood as meaning, for example, a strain which is genetically modified in such a way that targets or target genes of the regulator IOR are increasingly expressed.
  • all or part of the genes relevant in myo-inositol metabolism which code for the enzymes of myo-inositol metabolism, can be overexpressed.
  • genes can be integrated into the genome, which code for these enzymes and allow an increased expression of these genes.
  • the genes can also be introduced chromosomally.
  • coryneform bacteria of the species Corynebacterium, Brevibacterium, in particular Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium acetoglutamicum, Corynebacterium thermoaminogenes, Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum or Brevibacterium divaricatum can be used.
  • coryneform bacteria which, according to the invention, are altered starting from the wild form, for example the wild forms
  • Brevibacterium divaricatum ATCC 14020 used. The list is not limiting, but exemplary.
  • Corynebacterium glutamicum as a production organism offers special advantages, because i) it is a "Generally Recognized As Safe” (GRAS) organism that can be used in all industrial sectors;
  • This preferred embodiment has the advantage that it does not undergo any authorization restrictions in the chemical, pharmaceutical or food production as wild species changed according to the invention.
  • the lolR gene is completely switched off.
  • Complete inactivation of the lolR gene can also be carried out by other measures known to the person skilled in the art.
  • the appropriate culture guide e.g. by the use of myo-inositol as substrate / inducer of loIR, insertion of another DNA sequence into the gene region of the lolR gene, in particular the lolR gene cg0196.
  • a gene region is to be understood as a region in which the change still has an influence on the activity of the lolR gene. This region may be located before, after or in the open reading frame of the lolR gene.
  • Complete inactivation can also be achieved by completely eliminating the gene expression of loIR by genetically altering (mutating) the signal structures of gene expression.
  • Signaling structures of gene expression include repressor genes, activator genes, operators, promoters, attenuators, ribosome binding sites, the start codon, and terminators. Information on this is the expert z.
  • Knippers Knippers "Molekulare Genetik", 8th Edition, 2001, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Germany) or reviews (Pokala et al., J Struct Biol, 2001, 134 (2-3): 269-281, Jaenicke et al., Angew Chem Int Ed Engl, 2003, 42 (2): 140-142, Lily, EMBO Rep, 2003, 4 (4): 346 -351, Pei et al., Proc Natl Acad Sci USA, 2003, 100 (20): 1 1361-1 1366, Dokholyan, Proteins, 2004, 54 (4): 622-628, Tramontano, Angew Chem Int Ed Engl, 2004, 43 (25): 3222-3223).
  • the corneiform bacteria produced in this way have no lolR gene activity and lead to a high yield of enantiomerically pure D-xylonate. It is the best embodiment of the invention, in particular the complete deletion is preferred.
  • the activity of the lolR gene is reduced.
  • Partial inactivation of the lolR gene may also be accomplished by other means known to those skilled in the art.
  • the appropriate culture guide e.g. by the use of myo-inositol as substrate / inducer of loIR, insertion of another DNA sequence into the gene region of the lolR gene, in particular the lolR gene cg0196.
  • a gene region is to be understood as a region in which the change still has an influence on the activity of the lolR gene. This region may be located before, after or in the open reading frame of the lolR gene.
  • Partial inactivation can also be achieved by partially eliminating the gene expression of loIR by genetically altering (mutating) the signal structures of gene expression.
  • Signal structures of gene expression are, for example, repressor genes, activator genes, operators, promoters, attenuators, ribosome binding sites, the start codon and terminators. In principle, the same procedures can be used as for the complete deletion.
  • Mutations that lead to a change in the functional properties of loIR, in particular to an altered substrate specificity, can also lead to a partial elimination of the activity of the lolR gene. Mutations include transitions, transversions, insertions and deletions, as well as directed evolutionary methods. Again, the above methods can be used.
  • the lolR gene cg0196 is given in Sequence Listing No. 1.
  • a lolR gene of an open reading frame coryneform bacterium ATCC13032 is shown in Sequence No. 2.
  • the organisms of coryneform bacteria modified according to the invention produce D-xylonate or D-xylonic acid 100% enantiopure with a high yield.
  • the genome of the invention produced in this way enables coryneform bacteria to produce D-xylonate or D-xylonic acid with a high yield and an enantiomeric purity of 100%.
  • D-xylonate with the coryneform bacteria according to the invention can be carried out with known fermentative processes customary in laboratories or in production.
  • the microorganisms produced according to the invention can be cultivated continuously or discontinuously in batch process (batch cultivation) or in fed-batch (feed process) or repeated-fed batch (repetitive feed process) for the purpose of D-xylonate production.
  • batch cultivation or in fed-batch (feed process) or repeated-fed batch (repetitive feed process) for the purpose of D-xylonate production.
  • Storhas Bioreactors and Peripheral Facilities (Vieweg Verlag, Braunschweig / Wiesbaden, 1994)
  • the culture medium to be used must suitably satisfy the requirements of the respective microorganisms. Descriptions of culture media of various microorganisms are contained in the Manual of Methods for General Bacteriology of the American Society for Bacteriology (Washington DC, USA, 1981).
  • sugars and carbohydrates such as e.g. Glucose, sucrose, lactose, fructose, maltose, molasses, starch and cellulose, oils and fats such as e.g. As soybean oil, sunflower oil, peanut oil and coconut oil, fatty acids such. As palmitic acid, stearic acid and linoleic acid, alcohols such. As glycerol and ethanol and organic acids such. As acetic acid can be used. These substances can be used individually or as a mixture.
  • the CGXII medium (Unthan et al., Biotechnol Bioeng, 2014, 11 (1) (2): 359-371) with D-xylose and D-glucose as carbon and energy sources. This makes it possible to achieve high specific growth rates for Corynebacte with glutamicum ATCC13032 of up to 0.61 h -1 . Moreover, the use of the CGXII medium ensures simple removal of the target product D-xylonate from the culture supernatant, for example by ethanol precipitation followed by vacuum drying (Liu et al., Bioresource Technology, 2012, 1 15: 244-248) The simple medium is part of the task to be solved.
  • the nitrogen source there may be used organic nitrogen-containing compounds such as peptones, yeast extract, meat extract, malt extract, corn steep liquor, soybean meal and urea, or inorganic compounds such as ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium carbonate and ammonium nitrate.
  • organic nitrogen-containing compounds such as peptones, yeast extract, meat extract, malt extract, corn steep liquor, soybean meal and urea
  • inorganic compounds such as ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium carbonate and ammonium nitrate.
  • the nitrogen sources can be used singly or as a mixture.
  • potassium dihydrogen phosphate or dipotassium hydrogen phosphate or the corresponding sodium-containing salts can be used as the phosphorus source.
  • the culture medium should contain salts of metals, e.g. Magnesium sulfate or iron sulfate necessary for growth.
  • salts of metals e.g. Magnesium sulfate or iron sulfate necessary for growth.
  • essential growth substances such as amino acids and vitamins can be used in addition to the above-mentioned substances.
  • the said starting materials can be added to the culture in the form of a one-time batch or fed in during the cultivation in a suitable manner.
  • basic compounds such as sodium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia or acidic compounds such as hydrochloric acid, phosphoric acid g or sulfuric acid are used in a suitable manner.
  • a preferred pH range for cell growth is between 6 and 8.
  • antifoams such as e.g. Fatty acid polyglycol esters.
  • oxygen or oxygen-containing gas mixtures e.g. Air entered into the culture.
  • the temperature of the culture is usually 20 ° C to 45 ° C, and preferably 25 ° C to 40 ° C.
  • the culture is preferably continued until a maximum of D-xylonate has formed. This goal is usually reached within 10 hours to 160 hours.
  • Fig.2 GC-ToF-MS spectrum of a purified precipitate
  • FIG. 1 shows the culturing processes for the strain Corynebacterium glutamicum AloIR in subfigures A) and B).
  • the abscissas of the graphics in all subfigures are the time in hours h.
  • the ordinates of the first row indicate the amount of D-xylose and D-glucose in millimolar [mM].
  • the ordinates of the second row mean the biomass in grams per liter [g / L] and the ordinates of the third row mean the amount of D-xylonate in millimolar [mM].
  • Part 1 B shows the cultivation process for the strain C. glutamicum AloIR in the fed-batch process. A final titer of D-xylonate of 20.0 ⁇ 1.0 g / L was achieved.
  • Figure 2 shows the spectrum of the purified precipitate, which was generated by GC-ToF-MS analysis (Paczia et al., Microbial Cell Factories, 2012, 11). The relative peak intensity in the ordinate is plotted against the chromatographic transit time as the abscissa.
  • the gene "loIR” was deleted in-frame ("in-frame") so as not to affect the expression of downstream genes as far as possible.
  • a cross-over PCR was performed. In two first PCRs, two 400 bp downstream and upstream flanking DNA regions of the gene to be deleted were separately amplified.
  • the olive gonukleotide used for this purpose (iolR_DF1_for CCCAAGCTTGAGGTACTTGCCGAAAGATTG (HindIII), i- olR_DF1_rev CTCGATTACTTGGCCGGAGGGCTACTTGGAAGTAGAGG, iolR_DF2_for TCCGGCCAAGTAATCGAG, iolR_DF2_rev CGGGATCCATCGCGTTGGCATTCTTC (Bam Hl)) was modified so that the resulting PCR fragments at the 5 'end of long, each with a 18 nucleotide homologous sequence that was complementary to each other in the fragments.
  • the products of the first PCRs were used as a DNA template, with annealing taking place over the complementary region during the reaction.
  • the deletion construct was generated, which was cloned into the vector pK19mobsacB.
  • clones were isolated in which the plasmid was integrated into the chromosome by homologous recombination.
  • glutamicum was carried out via the PCR with which were complementary to an area outside the gene (K_DiolR_for GCACGTTATGACCTGCAAACTC, K_DiolR_rev TACGGTCTGGCTATCTACATCC).
  • the strain C. glutamicum AloIR produced in this way was cultivated in a batch and fed-batch process in 1.5 l bioreactors (DASGIP AG, Juelich, Germany) at 30 ° C. and a constant gassing rate of 1 vvm. Throughout aerobic conditions (> 30% dissolved oxygen) were achieved via the oxygen input with adjustment of the stirrer speed (400 - 1200 rpm). The pH in the culture medium was constantly adjusted to pH 7.1 with 5 MH 3 PO4 and 5 M NH 4 OH.
  • the batch process was performed in two independent reactors from an overnight preculture on CGXII medium (Unthan et al., Biotechnol Bioeng, 2014, 11 (2): 359-371) with 40 g / L D-glucose to an OD of 1 in CGXII medium without urea and inoculated with 10 g / L D-glucose and 30 g / L D-xylose.
  • the fed-batch process was carried out in two independent reactors from an overnight preculture on CGXII medium with 40 g / L D-glucose to an OD of 1 in CGXII medium without urea and with 20 g / L D-glucose and 40 g / L D-xylose inoculated.
  • a continuous feed was started with 100 g / L D-glucose and a rate of 2.5 ml / h (reactor 1) or 5 mUh (reactor 2). All cultivations were sampled at regular intervals, the samples were centrifuged, and the resulting cell-free supernatant was used for substrate and product analysis.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von D-Xylonat sowie ein coryneformes Bakterium. Erfindungsgemäß wurde gefunden, dass mit coryneformen Bakterien, bei denen die Aktivität des Gens loIR, kodierend für einen Regulator des myo-lnositol Stoffwechsels, nachfolgend lolR-Gen genannt, gemindert oder ausgeschaltet bzw. bei denen das lolR-Gen mindestens teilweise deletiert ist, ausgehend von D-Xylonat als Substrat eine sehr hohe Ausbeute von enantiomerenreinem D-Xylonat erzielt werden kann. Erfindungsgemäß wird daher ein Verfahren zur Herstellung von D-Xylonat sowie ein coryneformes Bakterium als Produktionsstamm zur Verfügung gestellt, bei dem die Aktivität des lol-R Gens im Produktionsstamm gegenüber der Wildform oder einer Mutante der Wildform vermindert oder ausgeschaltet ist bzw. wobei das lolR-Gen teilweise oder komplett deletiert ist.

Description

B e s c h r e i b u n g Verfahren zur Herstellung von D-Xylonat und coryneformes Bakterium
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von D-Xylonat sowie ein coryneformes Bakterium.
D-Xylonsäure (C5H10O6) ist eine organische Säure, die, wie von Toivari et al. in Appl Microbiol Biotechnol, 2012, 96(1 ): 1-8 dargelegt wurde, als Vorstufe für Polyamide, Polyester und 1 ,2,4-butantriol dienen kann und weist somit ein breites Anwendungspotenzial in der pharmazeutischen Industrie, der Lebensmittelindustrie und in der chemischen Industrie auf. Die nachfolgenden Erläuterungen beziehen sich auf D-Xylonat, dem Salz der D-Xylonsäure. D-Xylonat zählt zu den Top 30 der potenziell hochwertigen, auf nachwachsenden Rohstoffen der 2. Generation, z.B. Pentose-haltige Hemicellulosen basierenden, Vorstufen-Chemikalien. D-Xylonat hat Ähnlichkeit zu D-Gluconat (C6H1 107), welches einen globalen Markt von 80 kt/Jahr besitzt.
D-Xylonat wird natürlicherweise in einigen Bakterien über eine zweistufige Reaktion gebildet. In der ersten Reaktion wird D-Xylose zu D-Xylonolacton oxidiert, wobei hier je nach Organismus spezifische Dehydrogenasen katalytisch aktiv sind. Das D-Xylonolacton kann anschließend entweder durch spezifische Lactonasen oder spontan, ohne Enzymkatalysator, zum D-Xylonat umgewandelt werden. Zum Beispiel für die Spezies Gluconobacter oxydans und Pseudomonas fragi werden hohe Produkttiter an D-Xylonat berichtet, (Buchert et al., Applied Microbiology and Biotechnology, 27(4): 333-336, Toivari et al., Appl Microbiol Biotechnol, 2012, 96(1): 1-8) beschrieben wurde.
Darüber hinaus wurden alternative D-Xylonat-Produktionsstämme (z. B. Hefe der Spezies Saccharomyces cerevisiae, Bakterien der Spezies Escherichia coli und Pilze der Spezies Aspergillus niger) durch eine heterologe Expression von D-Xylose-Dehydrogenasen, z. B. aus Caulobacter crescentus, erzeugt, wie von (Liu et al., Bioresour Technol, 2012, 1 15: 244- 248, Richard et al., 2012, US20120005788 A1 (US 13/256,559), Toivari et al., Metab Eng, 2012, 14(4): 427-436) dargelegt.
Neben der mikrobiellen Produktion kann D-Xylonat elektrochemisch (Jokic et al., Journal of Applied Electrochemistry, 21 (4): 321-326), enzymatisch (Pezzotti et al., Carbohydr Res, 2006, 341 (13): 2290-2292) oder durch chemische Oxidation (Isbell et al., Bureau of
Standards Journal of Research, 1932, 8(3): 327-338) hergestellt werden. Es ist bekannt, dass organische Säuren, bzw. deren Salze, durch Fermentation von Stämmen coryneformer Bakterien, insbesondere Corynebacterium glutamicum, hergestellt werden können.
Die Schrift US 2013/0295621 A1 offenbart ein Verfahren zur Herstellung von D-Xylonsäure durch gentechnisch veränderte Bakterien.
Die nach dem Stand der Technik bekannten Produktionsstämme mit endogener D-Xylonat- Synthesekapazität, wie z. B. Gluconobacter oxydans, benötigen nicht definierte Medien für ihr Wachstum, wodurch die D-Xylonat-Produktion deutlich aufwendiger, teurer und damit unwirtschaftlicher wird.
Alle bisher beschriebenen "nicht-natürlichen" D-Xylonat-Produzenten sind gentechnisch veränderte Organismen im Sinne des Gesetzes zur Regelung der Gentechnik (GenTG) §3 wonach ein Organismus gentechnisch verändert ist, wenn er zur heterologen Expression befähigt ist, bzw. für diesen Organismus fremde Gene enthält, also rekombinant verändert ist, u.a. verschiedene Hefe, Pilze und Bakterien. Dadurch entsteht ein Nachteil für die Verwendung in bestimmten industriellen Bereichen, wie z. B. Lebensmittel- und Pharmaindustrie infolge aufwändiger Genehmigungsverfahren.
Es besteht der Bedarf, ein Verfahren und einen Mikroorganismus zur Verfügung zu stellen, mit denen D-Xylonat und damit D-Xylonsäure in hoher Enantiomerenreinheit und hoher Ausbeute hergestellt werden kann. Insbesondere soll ein Mikroorganismus und ein Verfahren zur Verfügung gestellt werden, welche in der industriellen Anwendung, insbesondere in der Lebensmittelindustrie, der pharmazeutischen und der chemischen Industrie angewendet werden können und ohne weiteres die Zulassungsbedingungen für den Einsatz in der Lebensmittelindustrie und pharmazeutischen- sowie chemischen Industrie erfüllen. Die mit genetisch veränderten Organismen im Sinne des Gesetzes zur Regelung der Gentechnik §3 verbundenen Nachteile, insbesondere rekombinant veränderten Organismen, verbundenen Nachteile sollen vorzugsweise vermieden werden. Insbesondere sollen einfache und kostengünstige Medien für die Kultivierung eingesetzt werden können, die preiswert und leicht einsetzbar sind. Die eingesetzten Mikroorganismen sollen auf definierten Medien hohe Wachstumsraten besitzen, hohe Biomasseerträge erzielen und die anschließende Produktaufarbeitung vereinfachen.
Ausgehend vom Oberbegriff des Anspruchs 1 und der nebengeordneten Ansprüche wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst mit denen im kennzeichnenden Teil der Ansprüche angegebenen Merkmalen. Mit dem erfindungsgemäßen Mikroorganismus, seinem Genom und dem erfindungsgemäßen Herstellungsverfahren ist es nunmehr möglich, D-Xylonat in einer hohen Ausbeute, beispielsweise > 0,5 g D-Xylonat / g D-Xylose, bei einer Enantiomerenreinheit von 100 % herzustellen. Die erfindungsgemäßen Mikroorganismen sind für den industriellen Einsatz gut geeignet und überwinden in einer bevorzugten Ausführungsform die Zulassungskriterien für den Gebrauch in der Lebensmittelindustrie und der pharmazeutischen und chemischen Industrie, insbesondere gelten sie nach dem Gentechnikgesetz als nicht rekombinant verändert. Die erfindungsgemäßen Mikroorganismen erzielen auf definierten Medien hohe Wachstumsraten und hohe Biomasseausbeuten und ermöglichen eine einfache Produktaufarbeitung. Die Nachteile des Standes der Technik werden überwunden. Die definierten Medien sind preisgünstiger und weniger aufwändig in der Verwendung. Das Wachstum der Produktionsorganismen ist reproduzierbarer als bei nicht definierten Medien. Die Komplexität der Medien ist gering und reduziert damit die Anzahl notwendiger Verfahrensschritte zur Produktaufarbeitung.
Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung sind in den Unteransprüchen angegeben.
Im Folgenden wird die Erfindung in ihrer allgemeinen Form beschrieben ohne dass es einschränkend auszulegen ist.
Überraschenderweise wurde gefunden, dass mit coryneformen Bakterien, bei denen die Aktivität des Gens loIR, kodierend für einen Regulator des myo-lnositol Stoffwechsels, nachfolgend lolR-Gen genannt, gemindert oder ausgeschaltet bzw. bei denen das lolR-Gen mindestens teilweise deletiert ist, ausgehend von D-Xylonat als Substrat eine sehr hohe Ausbeute von enantiomerenreinem D-Xylonat erzielt werden kann.
Gegenstand der Erfindung ist daher ein coryneformes Bakterium bei dem die Aktivität des lolR-Gens gegenüber der Wildform oder einer Mutante der Wildform, vorzugsweise einer nicht rekombinanten Mutante die dieses Gen enthält, vermindert oder komplett ausgeschaltet bzw. bei denen das lolR-Gen mindestens teilweise deletiert ist, sowie ein Verfahren zur Herstellung von D-Xylonat mit einem coryneformen Bakterium , bei dem das lolR-Gen in seiner Aktivität vermindert oder komplett ausgeschaltet bzw. bei denen das lolR-Gen mindestens teilweise deletiert ist.
Die erfindungsgemäß veränderten coryneformen Bakterien können von der Wildform abstammen oder von einer gegenüber der Wildform genetisch veränderten Form die vorzugsweise nicht rekombinant verändert ist. Die Stämme, die von der Wildform ausgehen sind für die pharmazeutische und Lebensmittelindustrie besonders bevorzugt, da sie besonders leicht zur Produktion zugelassen werden. Die Wildform enthält als Ausgangsstamm des erfindungsgemäßen Verfahrens ein natürliches lolR-Gen.
Die genetisch veränderten Stämme beinhalten in ihrer Ausgangsform ebenfalls ein natürliches lolR-Gen. Unter einem genetisch veränderten Stamm im Sinne der Erfindung ist beispielsweise ein Stamm zu verstehen, der genetisch so verändert ist, dass Targets bzw. Zielgene des Regulators loIR vermehrt exprimiert werden. So können alle oder ein Teil der im myo-lnositol Stoffwechsel relevanten Gene, die für die Enzyme des myo-lnositol Stoffwechsel kodieren, überexprimiert werden. Hierzu können beispielsweise Gene ins Genom integriert werden, die für diese Enzyme kodieren und eine gesteigerte Expression dieser Gene erlauben. Die Gene können auch chromosomal eingeführt werden. Denkbar sind auch andere Aktivierungsmechanismen für die gesteigerte Expression von Enzymen des myo- lnositol Stoffwechsels, beispielsweise das Einbringen von stärkeren Promotoren und die Modulation der Translationseffizienz. Darüber hinaus kann auch die Stabilität von Enzymen des myo-lnositol Stoffwechsels erhöht sein.
Insbesondere können coryneforme Bakterien der Art Corynebacterium, Brevibacterium, insbesondere Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium acetoglutamicum, Corynebacterium thermoaminogenes, Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum oder Brevibacterium divaricatum eingesetzt werden.
Bevorzugt sind coryneforme Bakterien, die ausgehend von der Wildform erfindungsgemäß verändert sind, beispielsweise werden die Wildformen
Corynebacterium glutamicum ATCC 13032
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870
Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539
Brevibacterium flavum ATCC 14067
Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 und
Brevibacterium divaricatum ATCC 14020. eingesetzt. Die Aufzählung ist nicht einschränkend, sondern beispielhaft.
Besondere Vorteile bietet die Verwendung von Corynebacterium glutamicum als Produktionsorganismus, denn i) es handelt sich um einen„Generally Recognized As Safe" (GRAS)-Organismus, welcher in allen industriellen Bereichen eingesetzt werden kann;
ii) auf definierten Medien werden damit hohe Wachstumsraten und Biomasseerträge erreicht (Unthan et al., Biotechnol Bioeng, 2014, 1 11 (2): 359-371 ) und
iii) es existieren umfangreiche Erfahrung im industriellen Einsatz (Becker et al., Curr Opin Biotechnol, 2012, 23(4): 631 -640).
Die Teilinaktivierung, Inaktivierung oder die Teildeletion oder die komplette Deletion des myo-lnositol Stoffwechsel-Regulators loIR, insbesondere loIR (cg0196) in coryneformen Bakterien, vorzugsweise Corynebacterium glutamicum ATCC13032, bewirkt die Bildung von D-Xylonat aus D-Xylose. Diese bevorzugte Ausführungsform hat den Vorteil, dass sie als erfindungsgemäß veränderte Wildform keine Zulassungsbeschränkungen in der chemischen, pharmazeutischen oder Lebensmittelproduktion erfährt.
In der bevorzugten Ausführungsform ist das lolR-Gen komplett ausgeschaltet.
Dies kann vorzugsweise durch die komplette Deletion des lolR-Gens geschehen. Sofern die Inaktivierung des lolR-Gens komplett ist, kann dies auch durch Teildeletion bewirkt werden.
Eine komplette Inaktivierung des lolR-Gens kann auch durch andere, dem Fachmann bekannte Maßnahmen erfolgen. Beispielhaft können die geeignete Kulturführung, z.B. durch die Verwendung von myo-lnositol als Substrat/Induktor von loIR, Einfügen einer anderen DNA-Sequenz in den Genbereich vom lolR-Gen, insbesondere dem lolR-Gen cg0196, genannt werden. Als Genbereich im Sinne der Erfindung ist ein Bereich zu verstehen, in dem die Veränderung noch Einfluss auf die Aktivität des lolR-Gens hat. Dieser Bereich kann vor, nach oder im offenen Leseraster des lolR-Gens lokalisiert sein.
Eine komplette Inaktivierung kann auch durch eine komplette Ausschaltung der Genexpression von loIR durch genetische Veränderung (Mutation) der Signalstrukturen der Genexpression erfolgen. Signalstrukturen der Genexpression sind beispielsweise Repressorgene, Aktivatorgene, Operatoren, Promotoren, Attenuatoren, Ribosomenbindungsstellen, das Startkodon und Terminatoren. Angaben hierzu findet der Fachmann z. B. in der Patentanmeldung WO 96/15246, bei Boyd und Murphy (Boyd et al., J Bacteriol, 1988, 170(12): 5949- 5952), bei Voskuil und Chambliss (Voskuil et al., Nucleic Acids Research, 1998, 26(15): 3584-3590), bei Jensen und Hammer (Jensen et al., Biotechnol Bioeng, 1998, 58(2-3): 191- 195), bei Patek et al. (Patek et al., Microbiology, 1996, 142 ( Pt 5): 1297-1309) und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie wie z. B. dem Lehrbuch von Knip- pers („Molekulare Genetik", 8. Auflage, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland, 2001 ) oder dem von Winnacker („Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland, 1990).
Mutationen, die zu einer Veränderung der funktionellen Eigenschaften von loIR führen, insbesondere zu einer veränderten Substratspezifität können ebenfalls zu einer kompletten Ausschaltung der Aktivität des lolR-Gens führen. Als Mutationen kommen Transitionen, Transversionen, Insertionen und Deletionen in Betracht, sowie Methoden der gerichteten Evolution. Anleitungen zur Erzeugung derartiger Mutationen und Proteine gehören zum Stand der Technik und können bekannten Lehrbüchern (R. Knippers„Molekulare Genetik", 8. Auflage, 2001 , Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland), oder Übersichtsartikeln (Pokala et al., J Struct Biol, 2001 , 134(2-3): 269-281 , Jaenicke et al., Angew Chem Int Ed Engl, 2003, 42(2): 140-142, Lilie, EMBO Rep, 2003, 4(4): 346-351 , Pei et al., Proc Natl Acad Sei U S A, 2003, 100(20): 1 1361-1 1366, Dokholyan, Proteins, 2004, 54(4): 622-628, Tramontano, Angew Chem Int Ed Engl, 2004, 43(25): 3222-3223) entnommen werden.
Die auf diese Weise erzeugten cor neformen Bakterien haben keinerlei lolR-Gen Aktivität und führen zu einer Produktion von enantiomerenreinem D-Xylonat einer hohen Ausbeute. Es handelt sich um die beste Ausführungsform der Erfindung, insbesondere die Komplett- deletion ist bevorzugt.
Bei Corynebacterium glutamicum ATCC13032 AloIR ist das loIR Gen cg0196 komplett dele- tiert.
In einer anderen Ausführungsform ist die Aktivität des lolR-Gens gemindert.
Dies kann auch durch Teildeletion bewirkt werden, sofern die Aktivität dadurch nicht komplett ausgeschaltet wird.
Eine teilweise Inaktivierung des lolR-Gens kann auch durch andere, dem Fachmann bekannte Maßnahmen erfolgen. Beispielhaft können die geeignete Kulturführung, z.B. durch die Verwendung von myo-lnositol als Substrat/Induktor von loIR, Einfügen einer anderen DNA-Sequenz in den Genbereich des lolR-Gens, insbesondere des lolR-Gens cg0196 genannt werden. Als Genbereich im Sinne der Erfindung ist ein Bereich zu verstehen, in dem die Veränderung noch Einfluss auf die Aktivität des lolR-Gens hat. Dieser Bereich kann vor, nach oder im offenen Leseraster des lolR-Gens lokalisiert sein.
Eine teilweise Inaktivierung kann auch durch eine teilweise Ausschaltung der Genexpression von loIR durch genetische Veränderung (Mutation) der Signalstrukturen der Genexpression erfolgen. Signalstrukturen der Genexpression sind beispielsweise Repressorgene, Aktivatorgene, Operatoren, Promotoren, Attenuatoren, Ribosomenbindungsstellen, das Startkodon und Terminatoren. Hierzu können grundsätzlich die gleichen Verfahren angewendet werden, wie bei der Komplettdeletion.
Mutationen, die zu einer Veränderung der funktionellen Eigenschaften von loIR führen, insbesondere zu einer veränderten Substratspezifität können ebenfalls zu einer teilweisen Ausschaltung der Aktivität des lolR-Gens führen. Als Mutationen kommen Transitionen, Transversionen, Insertionen und Deletionen in Betracht, sowie Methoden der gerichteten Evolution. Auch hier können die oben genannten Methoden eingesetzt werden.
Die angegebenen erfindungsgemäßen genetischen Veränderungen führen zu den erfindungsgemäßen coryneformen Bakterien sowie bei Isolation zu dem erfindungsgemäßen Genom.
Das lolR-Gen cg0196 ist im Sequenzprotokoll Nr.1 angegeben.
Ein lolR-Gen eines coryneformen Bakteriums ATCC13032 mit offenem Leseraster ist in Sequenz Nr. 2 dargestellt.
Überraschenderweise bewirkt die Inaktivierung des lolR-Gens auf definiertem Medium mit einer Kohlenstoff- und Energiequelle für Wachstum, z.B. D-Glucose, und D-Xylose als weitere Kohlenstoff- und Energiequelle die Bildung von D-Xylonat. Dieses kann von coryneformen Bakterien natürlicherweise nicht verstoffwechselt werden, akkumuliert daher im Medium und kann anschließend aus diesem aufgereinigt werden.
Die erfindungsgemäß veränderten Organismen von coryneformen Bakterien produzieren D- Xylonat bzw. D-Xylonsäure zu 100 % enantiomerenrein bei einer hohen Ausbeute. Das auf diesem Weg erzeugte erfindungsgemäße Genom befähigt coryneforme Bakterien D-Xylonat bzw. D-Xylonsäure mit einer hohen Ausbeute und einer Enantiomerenreinheit von 100 % herzustellen.
Die Produktion des D-Xylonats mit den erfindungsgemäßen coryneformen Bakterien kann mit bekannten, im Labor oder in der Produktion üblichen fermentativen Verfahren durchgeführt werden.
Die erfindungsgemäß hergestellten Mikroorganismen können kontinuierlich oder diskontinuierlich im Batch-Verfahren (Satzkultivierung) oder im Fed-Batch (Zulaufverfahren) oder Repeated-Fed-Batch (repetitives Zulaufverfahren) zum Zwecke der D-Xylonat-Produktion kultiviert werden. Eine Zusammenfassung über bekannte Kultivierungsmethoden sind im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991 )) oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) beschrieben. Das zu verwendende Kulturmedium muss in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Mikroorganismen genügen. Beschreibungen von Kulturmedien verschiedenner Mikroorganismen sind im Handbuch "Manual of Methods for General Bacteriology" der American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981 ) enthalten.
Neben D-Xylose als Ausgangssubstrat der D-Xylonatbildung können als Kohlenstoffquelle für Wachstum Zucker und Kohlenhydrate wie z.B. Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke und Cellulose, öle und Fette wie z. B. Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnussöl und Kokosfett, Fettsäuren wie z. B. Palmitinsäure, Stearinsäure und Linolsäure, Alkohole wie z. B. Glycerin und Ethanol und organische Säuren wie z. B. Essigsäure verwendet werden. Diese Stoffe können einzeln oder als Mischung verwendet werden.
Besonders bevorzugt ist das CGXII Medium (Unthan et al., Biotechnol Bioeng, 2014, 1 1 1 (2): 359-371 ) mit D-Xylose und D-Glucose als Kohlenstoff- und Energiequellen. Damit können hohe spezifische Wachstumsraten für Corynebacte um glutamicum ATCC13032 von bis zu 0.61 h"1 erreicht werden. Darüber hinaus gewährleistet der Einsatz des CGXII Mediums eine einfache Abtrennung des Zielproduktes D-Xylonat aus dem Kulturüberstand, z. B. durch eine Ethanolfällung mit anschließender Vakuumtrocknung (Liu et al., Bioresource Technology, 2012, 1 15: 244-248). Das einfache Medium ist Bestandteil der Aufgabe, die zu lösen ist.
Als Stickstoffquelle können organische, stickstoffhaltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden.
Als Phosphorquelle können Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden natriumhaltigen Salze verwendet werden.
Weiterhin sollte das Kulturmedium Salze von Metallen enthalten wie z.B. Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum notwendig sind.
Schließlich können essentielle Wuchsstoffe, wie Aminosäuren und Vitamine zusätzlich zu den oben genannten Stoffen eingesetzt werden.
Die genannten Einsatzstoffe können zur Kultur in Form eines einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in geeigneter weise während der Kultivierung zugefüttert werden.
Zur pH - Kontrolle der Kultur können basische Verbindungen wie beispielsweise Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak oder saure Verbindungen wie Salzsäure, Phosphorsäure g oder Schwefelsäure in geeigneter Weise eingesetzt werden. Ein bevorzugter pH-Bereich für das Zellwachstum liegt zwischen 6 und 8.
Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel wie z.B. Fettsäurepolyglyko- lester eingesetzt werden.
Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten werden vorzugsweise Sauerstoff oder sauerstoffhaltige Gasmischungen wie z.B. Luft in die Kultur eingetragen.
Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 20°C bis 45°C und vorzugsweise bei 25°C bis 40°C.
Die Kultur wird vorzugsweise solange fortgesetzt, bis sich ein Maximum an D-Xylonat gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht.
Die Figuren zeigen experimentelle Ergebnisse aus den Beispielen, die die erfindungsgemäßen Vorteile belegen.
Es zeigt:
Fig: 1 Kultivierungsverläufe für den Stamm Corynebacterium glutamicum AloIR
Fig.2: GC-ToF-MS Spektrum eines aufgereinigten Präzipitats
In Figur 1 sind die Kultivierungsverläufe für den Stamm Corynebacterium glutamicum AloIR in den Teilfiguren A) und B) dargestellt. Dabei sind die Abszissen der Graphiken in allen Teilfiguren die Zeit in Stunden h. Die Ordinaten der ersten Reihe bedeuten die Menge von D-Xylose sowie D-Glucose in Millimolar [mM].
Die Ordinaten der zweiten Reihe bedeuten die Biomasse in Gramm pro Liter [g/L] und die Ordinaten der dritten Reihe bedeuten die Menge von D-Xylonat in Millimolar [mM].
Teilfigur 1 A zeigt die Kultivierungsverläufe für den Stamm C. glutamicum AloIR im Batch- Prozess. Es wurde ein finaler Titer an D-Xylonat von 9.2 ± 0.6 g/L erreicht. Die spezifische Ausbeute sowie Produktionsrate betragen YP/S = 0.49 ± 0.01 g D-Xylonat g D-Xylose bzw. 0.30 ± 0.02 g/(L h). Teilfigur 1 B zeigt die Kultivierungsverläufe für den Stamm C. glutamicum AloIR im Fed-Batch-Prozess. Es wurde ein finaler Titer an D-Xylonat von 20.0 ± 1.0 g/L erreicht. Die spezifische Ausbeute sowie Produktionsrate betragen YP S = 0.51 ± 0.02 g D- Xylonat/ g D-Xylose bzw. 0.45 ± 0.02 g/(L h). Figur 2 zeigt das Spektrum des aufgereinigten Präzipitat^, welches mittels GC-ToF-MS- Analyse erzeugt wurde (Paczia et al., Microbial Cell Factories, 2012, 1 1 ). In ihr ist in der Ordinate die relative Peakintensität gegen die chromatographische Laufzeit als Abszisse aufgetragen.
Beispiele:
Im Folgenden werden experimentelle Belege als Beispiele angeführt, die nicht einschränkend auszulegen sind.
Zur Generierung des Stammes C. glutamicum AloIR wurde das Gen loIR im Leseraster („in- frame') deletiert, um die Expression stromabwärts liegender Gene möglichst nicht zu beeinträchtigen. Dazu wurde zunächst eine cross-over PCR durchgeführt. In zwei ersten PCRs wurden zwei jeweils 400 bp lange stromabwärts und stromaufwärts liegende, flankierende DNA-Bereiche des zu deletierenden Gens getrennt amplifiziert. Die dazu verwendeten Oli- gonukleotide (iolR_DF1_for CCCAAGCTTGAGGTACTTGCCGAAAGATTG (Hindill), i- olR_DF1_rev CTCGATTACTTGGCCGGAGGGCTACTTGGAAGTAGAGG, iolR_DF2_for TCCGGCCAAGTAATCGAG, iolR_DF2_rev CGGGATCCATCGCGTTGGCATTCTTC (Bam- Hl)) wurden so modifiziert, dass die entstandenen PCR-Fragmente am 5'-Ende jeweils mit einer 18 Nukleotid langen homologen Sequenz verbunden waren, die bei den Fragmenten zueinander komplementär war. Zur cross-over PCR fanden die Produkte der ersten PCRs als DNA-Matrize Verwendung, wobei über den komplementären Bereich während der Reaktion eine Anlagerung stattfand. Durch Einsatz der äußeren Primer entstand so das Deletions- konstrukt, das in den Vektor pK19mobsacB kloniert wurde. Nach Transformation dieses nicht frei replizierbaren Vektors in C. glutamicum und anschließender Selektion auf die durch pK 9mobsacB-AiolR2 vermittelte Kanamycinresistenz wurden Klone isoliert, in denen das Plasmid durch homologe Rekombination in das Chromosom integriert war. Durch Kultivierung dieser Zellen in Vollmedium ohne Kanamycin konnte ein zweites Rekombinationsereignis über die jetzt im Chromosom doppelt vorliegenden DNA-Bereiche erfolgen. Die Bakterienkultur wurde in verschiedenen Verdünnungen auf LB-Medium mit 10 % Saccharose ausplattiert. Aufgrund der durch sacB auf pK19mobsacB-AiolR2 kodierten Levan-Sucrase wurde Saccharose zu Levan polymerisiert. Dieses Polymer wiederum führte zur Letalität. So konnten nur solche Klone wachsen, die das Plasmid durch die zweite Rekombination verloren hatten. Bei den dann Saccharose-resistenten und Kanamycin-sensitiven Klonen war entweder die genetische Wildtyp-Situation wieder hergestellt oder das gewünschte Gen deletiert. Die Bestätigung der Deletion im Genom von C. glutamicum erfolgte über die PCR mit Pri- mern, die zu einem Bereich außerhalb des Gens komplementär waren (K_DiolR_for GCACGTTATGACCTGCAAACTC, K_DiolR_rev TACGGTCTGGCTATCTACATCC).
Der auf diese Weise erzeugte Stamm C. glutamicum AloIR wurde im Batch und Fed-Batch- Verfahren in 1.5 L Bioreaktoren (DASGIP AG, Jülich, Germany) bei 30°C und einem konstanten Begasungsrate von 1 vvm kultiviert. Durchgehend aerobe Bedingungen (>30 % Gelöst-Sauerstoff) wurden über den Sauerstoffeintrag mit Anpassung der Rührerdrehzahl (400 - 1200 rpm) erreicht. Der pH-Wert im Kultivierungsmedium wurde konstant auf pH 7.1 mit 5 M H3PO4 und 5 M NH4OH geregelt. Der Batch-Prozess wurde in zwei unabhängigen Reaktoren aus einer Übernacht-Vorkultur auf CGXII Medium (Unthan et al., Biotechnol Bioeng, 2014, 1 11 (2): 359-371 ) mit 40 g/L D-Glucose auf eine OD von 1 in CGXII-Medium ohne Harnstoff und mit 10 g/L D-Glukose sowie 30 g/L D-Xylose angeimpft. Der Fed-Batch- Prozess wurde in zwei unabhängigen Reaktoren aus einer Übernacht-Vorkultur auf CGXII Medium mit 40 g/L D-Glucose auf eine OD von 1 in CGXII-Medium ohne Harnstoff und mit 20 g/L D-Glukose sowie 40 g/L D-Xylose angeimpft. Nach einer Prozesszeit von 20 h mit Einsetzen der Glucose-Limitation wurde ein kontinuierlicher Feed mit 100 g/L D-Glucose und einer Rate von 2.5 mL/h (Reaktor 1 ) bzw. 5 mUh (Reaktor 2) gestartet. Alle Kultivierungen wurden in regelmäßigen Abständen beprobt, die Proben wurden zentrifugiert und der resultierende zellfreie Überstand wurde für die Substrat- und Produktanalytik verwendet. Für die Substratanalytik (D-Glucose bzw. D-Xylose) wurden zwei enzymatische Assays angewendet (Unthan et al., Microb Cell Fact, 2015, 14: 32) und das Produkt (D-Xylonat) wurde mittels HPLC (300 x 8 mm Organische Säure Säule, CS Chromatographie, Langerwehe, Germany) bei 80°C und einer isokratischen Elution mit 0.1 M H2S0 und einer Flussrate von
0.6 mL/min über einen DAD-Detektor (Agilent, Santa Clara, CA, USA) quantifiziert.
Am Ende der Fed-Batch-Kultivierung wurde ein Reaktor komplett zur Produktaufreinigung und -analyse abgeerntet. Für die Produktaufreinigung wurde ein bestehendes Protokoll (Liu et al., Bioresource Technology, 2012, 115: 244-248) wie folgt angewendet: 1. Zellabtrennung mittels Zentrifugation (4500 rpm für 10 min bei 4°C); 2. Entkolorisierung des resultierenden Überstandes in aktiviertem Kohlenstoff (AC); 3. Filtration des AC-behandelten Überstandes (0.22 μιτι) und Aufkonzentrierung mittels Rotationsverdampfer (100 mbar, 60°C Wasserbad); 4. Filtration des Konzentrats (0.22 pm) und Präzipitation von D-Xylonat durch Zugabe von EtOH (3:1 , v/v); Vakuumtrocknung des Produktes für mindestens 12 h bei -10°C.
Gensequenz von loIR mit offenem Leseraster (fett) sowie 250 bp up und downstream. CCCTCGCTTTGGAAGGTGCGGGGTTAACAAAGTTGCACGTTATGACCTGCAAAC
TCTGCCCTTTTCACTAAGTTTCGCTACTCATTCCCTAATGCAAGTGATAATGTCA
GATCAATAAAAGCCCTGGATGACACAAAAGTCCTGCATGAACACGGATTTACCA
AGACCACCACCCGCAACTCAGTTACATTGTTCAAATGTCCTAACACATTTACATG
AGCTTGTTGGGTGGGCAACGAAAGGAGACATCATGACCACCGAAGCTCCCATT
TGGCCAGCCGAACTCTTCGAAGACCTCGACCGCAACGGACCAATCCCCCTCT
ACTTCCAAGTAGCCCAACGCCTCGAAGACGGCATCCGCAGCGGAGTCCTCCC
ACCCGGAGCACGCCTAGAAAACGAGATCTCCGTGGCGAAACACCTCAACGTA
TCCCGCCCCACCGTCCGACGCGCCATCCAAGAAGTCGTAGACAAAGGCCTCT
TAGTTCGCCGCCGCGGTGTTGGCACCCAGGTCGTCCAAAGCCACGTCACCCG
CCCAGTCGAACTGACCAGTTTCTTCAACGACCTCAAAAACGCCAACCTGGACC
CCAAAACCCGAGTCCTCGAGCACCGCCTCCTTGCAGCAAGTTCCGCCATCGC
AGAAAAACTCGGAGTTTCCGCAGGTGACGAAGTCCTCCTCATCCGCCGCCTC
CGCTCCACCGGAGACATCCCCGTAGCGATCCTGGAAAACTACCTCCCCCCAG
CGTTCAACGACGTCTCCCTCGACGAACTAGAAAAGGGTGGACTCTACGATGC
GCTGCGCAGCCGAGGTGTTGTCTTAAAAATCGCCAACCAGAAAATCGGTGCG
CGCCGAGCAGTCGGTGAAGAAAGCACCCTCCTCGACATCGAAGACGGCGGA
CCACTTCTCACCGTCGAACGCGTTGCATTGGATAATTCCGGCCAAGTAATCGA
GTTGGGAAGCCACTGCTACCGCCCAGATATGTACAACTTTGAAACCACTCTGG
TGGCCAGGTAAGAAATAAACCAAAGAGCCCTTCTGAACTGGAGCTCTTGGTCTG
ATATGGCATTTTCAAGGCTGGAAAACTGCTCTATCAGACCAAACGGATGCTGAA
TTTCAGGGTCTTTGGTCTGGATATGCAGCAGCGCTCCAAGGCGTCGAGTTTCTC
AAACGAGCATTGGTATCGATGACACCCTGAAAGGCCCTTAGAAGCGATTCTGTG
AGGTCGAGTTCCCAGGGTTTGAGTGCAAG I I I I I I ACGTGAA

Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e
1. Verfahren zur mikrobellen Herstellung von D-Xylonat aus D-Xylose,
dadurch gekennzeichnet,
dass D-Xylose von einem coryneformen Bakterium, bei dem die Aktivität des lolR- Gens gegenüber der Wildform oder einer Mutante der Wildform vermindert oder komplett ausgeschaltet ist oder das lolR-Gen komplett oder teilweise deletiert ist, zu D-Xylonat umgesetzt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1 ,
dadurch gekennzeichnet,
dass ein coryneformes Bakterium eingesetzt wird, welches nicht rekombinant verändert ist.
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2,
dadurch gekennzeichnet,
dass ein coryneformes Bakterium aus der Gruppe Corynebacterium, Brevibacterium, insbesondere Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium acetoglutamicum, Corynebacterium thermoaminogenes, Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermen- tum oder Brevibacterium divaricatum eingesetzt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 3,
dadurch gekennzeichnet,
dass ein coryneformes Bakterium aus der Gruppe bestehend aus
Corynebacterium glutamicum ATCC13032
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870
Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539
Brevibacterium flavum ATCC 14067
Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 und
Brevibacterium divaricatum ATCC 14020
eingesetzt wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4,
dadurch gekennzeichnet,
dass eine teilweise oder komplette Inaktivierung des lolR-Gens durch die Verwendung von myo-lnositol als Substrat/Induktor von loIR, Einfügen eines Vektors, oder einer anderen Gensequenz in den Genbereich des lolR-Gens in dem die Veränderung Einfluss auf die Aktivität des lolR-Gens hat, Veränderung der Signalstrukturen der Genexpression, wie Repressorgene, Aktivatorgene, Operatoren, Promotoren, Attenuatoren, Ribo- somenbindungsstellen, Startkodons, Terminatoren, Mutationen in Form von Transitionen, Transversionen, Insertionen oder Deletionen erfolgt.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5,
dadurch gekennzeichnet,
dass die Herstellung von D-Xylonat auf einem definierten D-Xylose haltigem Medium durchgeführt wird.
7. Coryneformes Bakterium,
dadurch gekennzeichnet,
dass die Aktivität des lolR-Gens gegenüber der Wildform oder einer Mutante des Wildform vermindert oder komplett ausgeschaltet ist oder das lolR-Gen komplett oder teilweise deletiert ist.
8. Coryneformes Bakterium nach Anspruch 7,
dadurch gekennzeichnet,
dass es nicht rekombinant verändert ist.
9. Coryneformes Bakterium nach Anspruch 7 oder 8,
dadurch gekennzeichnet,
dass das coryneforme Bakterium ein Organismus aus der Gruppe Corynebacterium, Brevibacterium, insbesondere Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium aceto- glutamicum, Corynebacterium thermoaminogenes, Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum oder Brevibacterium divaricatum ist.
10. Coryneformes Bakterium nach einem der Ansprüche 7 bis 9,
dadurch gekennzeichnet,
dass das coryneforme Bakterium ein Organismus aus der Gruppe bestehend aus Corynebacterium glutamicum ATCC 13032
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870
Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539
Brevibacterium flavum ATCC14067 Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 und
Brevibacterium divaricatum ATCC1 020 ist. 1. Coryneformes Bakterium nach einem der Ansprüche 7 bis10,
dadurch gekennzeichnet,
dass in dem coryneformen Bakterium eine teilweise oder komplette Inaktivierung des lolR-Gens durch die Verwendung von myo-lnositol als Substrat/Induktor von loIR, Einfügen eines Vektors, oder einer anderen Sequenz in den Genbereich des lolR-Gens, Veränderung der Signalstrukturen der Genexpression, wie Repressorgene, Aktivatorgene, Operatoren, Promotoren, Attenuatoren, Ribosomenbindungsstellen, Startkodons, Terminatoren, Mutaionen in Form von Transitionen, Transversionen, Insertionen oder Deletionen vorhanden ist.
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