EP3288396A1 - Utilisation de cysteine endoprotéase pour diminuer le trouble de boissons - Google Patents

Utilisation de cysteine endoprotéase pour diminuer le trouble de boissons

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Publication number
EP3288396A1
EP3288396A1 EP16724303.9A EP16724303A EP3288396A1 EP 3288396 A1 EP3288396 A1 EP 3288396A1 EP 16724303 A EP16724303 A EP 16724303A EP 3288396 A1 EP3288396 A1 EP 3288396A1
Authority
EP
European Patent Office
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cysteine
malt
endoprotease
beverage
fermented
Prior art date
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Application number
EP16724303.9A
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German (de)
English (en)
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EP3288396B1 (fr
Inventor
Michel Lopez
Myriam FLISS
Didier Gilbert MARION
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Malteries Soufflet SAS
Institut National de Recherche pour lAgriculture lAlimentation et lEnvironnement
Original Assignee
Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Malteries Soufflet SAS
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Filing date
Publication date
Application filed by Institut National de la Recherche Agronomique INRA, Malteries Soufflet SAS filed Critical Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Publication of EP3288396A1 publication Critical patent/EP3288396A1/fr
Application granted granted Critical
Publication of EP3288396B1 publication Critical patent/EP3288396B1/fr
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12C—BEER; PREPARATION OF BEER BY FERMENTATION; PREPARATION OF MALT FOR MAKING BEER; PREPARATION OF HOPS FOR MAKING BEER
    • C12C5/00—Other raw materials for the preparation of beer
    • C12C5/004—Enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
    • A23L2/00—Non-alcoholic beverages; Dry compositions or concentrates therefor; Preparation or treatment thereof
    • A23L2/70—Clarifying or fining of non-alcoholic beverages; Removing unwanted matter
    • A23L2/84—Clarifying or fining of non-alcoholic beverages; Removing unwanted matter using microorganisms or biological material, e.g. enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12C—BEER; PREPARATION OF BEER BY FERMENTATION; PREPARATION OF MALT FOR MAKING BEER; PREPARATION OF HOPS FOR MAKING BEER
    • C12C1/00—Preparation of malt
    • C12C1/18—Preparation of malt extract or of special kinds of malt, e.g. caramel, black malt
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12C—BEER; PREPARATION OF BEER BY FERMENTATION; PREPARATION OF MALT FOR MAKING BEER; PREPARATION OF HOPS FOR MAKING BEER
    • C12C11/00—Fermentation processes for beer
    • C12C11/003—Fermentation of beerwort
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6472—Cysteine endopeptidases (3.4.22)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/22—Cysteine endopeptidases (3.4.22)

Definitions

  • the present invention relates to methods for clarifying beverages, particularly beer.
  • Clarification is an essential step in the beverage industry, faced with the formation of a disorder during the storage of beer, wine or fruit juice. Being a major problem, many studies have been conducted on the subject and it is now a well-known phenomenon.
  • the formation of colloidal disorder is due to polyphenol-protein and protein-protein interactions. The disorder depends on the protein-polyphenol ratio present in the must but also on the proline content of the proteins present in the must, the degree of polymerization as well as the number of hydroxyl groups of the polyphenols (Siebert (2006) L 1/1/739 : 987-994).
  • proline-rich proteins such as gelatin
  • polyphenols such as tannic acid
  • silica gels that bind the proline-rich proteins more specifically. These silica gels, however, are not very effective in clarifying polyphenol-rich beverages.
  • PVPP Polyvinylpolypyrrolidone
  • polyphenols have an antioxidant role that can be beneficial.
  • the filtration after a passage at low temperature inducing the formation of the disorder is also used but the latter technique has the disadvantage of being long (several months).
  • Enzymatic means are also used such as the hydrolysis of the protein fraction by a natural protease with a very broad specificity of action, papain, but the latter also degrades the proteins of the foam, which is an undesirable side effect. More recently, the use of a proline-specific endoprotease that more specifically degrades prolamins has been described: Clarex® Brewers, which is a recombinant prolyl endoprotease of the class EC 3.4.21 .26 derived from a filamentous fungus: Aspergillus However, this endoprotease can also degrade the proteins of the foam.
  • proteases hydrolysing the reserve proteins to ensure the development of the seedling.
  • the presence of at least 40 proteases in green malt has been reported by Zhang and Jones (1995) J. Cereal Sci. 21: 145-153. These proteases belong to the 4 existing types: serine, metallo, cysteine and aspartyl proteases. It has been shown, however, that the proteases mainly responsible for the degradation of prolamins during grain germination are cysteine proteases Shi and Xu (2009) J. Integrative Plant Biol. 51: 52-57).
  • the present invention results from the unexpected discovery by the inventors that the malt, in particular a malt extract, contains a protease activity capable of effectively reducing the turbidity of the beer.
  • the inventors have more particularly demonstrated that this protease activity involves cysteine endoproteases, and more particularly, in barley malt, endoproteases A and B.
  • the usefulness of barley endoproteases A and B is all the more surprising since, unlike many proteases, the presence of proline, an amino acid widely present in hordeins, does not seem to penalize their proteolytic activity.
  • Cereal cysteine-endoproteases are able to cleave the N-terminal repeat domains of hordeins and gliadins, rich in proline and glutamine (Bethune et al (2006) Chem Biol 13: 637-647).
  • the present invention thus relates to the use of at least one cysteine endoprotease comprising a sequence at least 55% identical to the sequence SEQ ID NO: 1, to the sequence SEQ ID NO: 2, to the sequence SEQ ID NO: 3 and or at the sequence SEQ ID NO: 4, or a fragment thereof having a cysteine endoprotease activity, for reducing the turbidity of a drink, whether fermented or not, based on cereals.
  • the present invention also relates to the use of a malt extract comprising an endoproteases activity to reduce the disturbance of a drink, fermented or not, based on cereals.
  • Another subject of the invention relates to the use of (i) at least one cysteine endoprotease as defined above or (ii) a malt extract as defined above, in the preparation of a fermented or non-fermented beverage made from cereals.
  • the present invention also relates to a method for preventing or reducing the disorder of a beverage, fermented or not, based on cereals, comprising a step of adding (i) at least one cysteine endoprotease as defined above or (ii) a malt extract as defined above, during the process of manufacturing the beverage.
  • the present invention also relates to the use (i) of at least one cysteine endoprotease as defined above or (ii) a malt extract as defined above, to increase the fermentation yield during the fermentation. manufacture of fermented beverages, made from cereals.
  • the subject of the present invention is also a process for the manufacture of a cereal-based fermented or non-fermented drink, comprising a step of adding, in the must or the juice, (i) at least one cysteine endoprotease such as as defined above or (ii) a malt extract as defined above.
  • Another subject of the invention relates to a cereal-based drink obtainable by one of the processes according to the invention. Detailed description of the invention
  • a beverage is not only a ready-to-drink beverage but also any composition used to make the beverage.
  • a drink in the context of the invention is a drink ready to be consumed.
  • cereal-based drink any drink of which at least one of the raw materials used for its preparation comes from a cereal.
  • the cereal-based beverage obtained in the context of the invention may thus be a barley-based beverage, wheat, in particular wheat, oats, rye, maize, rice, sorghum, millet, pseudo-cereals such as quinoa or buckwheat, or mixtures thereof.
  • the cereal-based beverage obtained in the context of the invention is a barley or wheat beverage.
  • the cereal-based beverage obtained in the context of the invention may be a fermented or non-fermented beverage. Preferably, it is a fermented beverage.
  • the disorder observed during the storage of beverages, whether fermented or not, based on cereals, is generally due to polyphenol-protein and / or protein-protein interactions. Therefore, in a particular embodiment, the cereal-based fermented or non-fermented beverage obtained in the context of the invention comprises proteins and polyphenols.
  • cysteine endoproteases and / or malt extract are particularly effective in preventing or reducing the disorder of beer.
  • the beverage, fermented or not, cereal-based is a liquid used in the production of beer.
  • the drink, whether fermented or not, based on cereals is a beer.
  • Beer means beer obtained from maize prepared from non-malted cereals, from maize prepared from malted cereals, or from maize made from a mixture of malted cereals. and not malted.
  • the terms "haze” and "turbidity” are here used interchangeably.
  • the disorder can be measured by any technique well known to those skilled in the art, typically by means of a turbidimeter, for example included in a Tannometer. Briefly, in a turbidimeter, the radiated light is reflected by the particles (turbidity) existing. The scattered light is then measured by a photodetector arranged at right angles (90 ° C) to the light source. The turbidity is expressed in UTN (Nephelometric Turbidity Unit, NTU in English) or in EBC (European Brewery Convention), 1 UTN equivalent to 0.25 EBC. It is preferably evaluated at a temperature of -8 ° C.
  • Turbidity is preferably measured using the Chapon test described in Chapon et al. (1993) J. Inst. Brew. 99: 49-56, particularly the Alcohol-Chill-Tesf test described in Chapon et al (1993) J. Inst Brew 99: 49-56 Typically, 9.4 ml of sample are mixed with 0 6 ml of ethanol After incubation preferably for at least 30 minutes, for example for 30 minutes or 40 minutes at -8 ° C., the turbidity is measured at -8 ° C. on a turbidimeter, typically on a Tannometer, As marketed by Pfeuffer, the results are typically expressed in EBC units.
  • cysteines endoproteases and the malt extract used in the context of the invention make it possible to reduce the disorder of the drink significantly compared to the same untreated drink.
  • the cysteines endoproteases and the malt extract used in the context of the invention make it possible to reduce the turbidity of the beverage by at least 70% relative to the same untreated beverage, more preferably from least 71%, at least 73%, at least 74%, at least 75%, at least 77%, at least 80%, at least 85%, at least 86%, or more preferably at least 93% at least 94% or at least 95%, especially when the turbidity is measured at -8 ° C, more particularly by means of the Chapon test as described above.
  • the cysteines endoproteases and the malt extract used in the context of the invention make it possible to reduce the drinking disorder by at least 65 EBC units relative to the same untreated beverage, more preferably at least 67 EBC units, at least 68 EBC units, at least 70 EBC units, at least 74 EBC units, at least 75 EBC units, at least 80 EBC units, at least 81 EBC units, at least 87 EBC units, at least 89 EBC units, at least 90 EBC units, at least 94 EBC units, at least 95 EBC units , at least 100 EBC units, at least 102 EBC units or at least 103 EBC units, particularly when the turbidity is measured at -8 ° C, more particularly by means of the Chapon test as described above.
  • the negative controls preferably two negative controls, may be constituted by a must without any addition and a must with addition of crude extract of heat-denatured barley malt, and the positive control may be constituted by a must with addition. from Brewers Clarex®.
  • the monitoring of the fermentation is typically carried out by monitoring the yeast population, and the percentage by mass of dry extract of must, expressed in Plato degrees (denoted ° Plato).
  • 1 ° Plato corresponds to 1 g of soluble dry matter (essentially fermentable sugars) per 100 g of must.
  • the amount of sugar initially included in the must determines the amount of alcohol and carbon dioxide in the beer produced.
  • the Plato degree is typically measured by means of an automatic density meter (Anton-Paar density meter DMA35).
  • cysteines endoproteases and the malt extract used in the context of the invention make it possible to reach a Plato number of at most 1 at O + 8, when they are added during the course of the invention. fermentation stage.
  • the cysteines endoproteases or the malt extract according to the invention increase the fermentation yield so as to reach a Plato 8 days after the start of the fermentation of at most 1, more preferably at most 0.8, at most 0.7, at most 0.6, at most 0.5 or at most 0.2 ° Plato, in particular when the fermentation is carried out at a temperature of approximately 13 ° C and in particular when a must at 1 1 ° Plato is produced by mixing type "EBC congress".
  • Cysteine endoproteases or the malt extract according to the invention increase the fermentation yield so as to reach a Plato 8 days after the start of the fermentation of at most 1, more preferably at most 0.8, at most 0.7, at most 0.6, at most 0.5 or at most 0.2 ° Plato, in particular when the fermentation is carried out at a temperature of approximately 13 ° C and in particular when a must at 1 1 ° Plato is produced by mixing type "EBC congress".
  • cyste endoprotease or “cysteine endopeptidase” is meant here an enzyme of the class EC 3.4.22 whose nucleophilic amino acid residue of the catalytic triad is a cysteine and cleaving the proteins within the peptide chain .
  • the cysteine endoprotease (s) used in the context of the invention comprises, or consists of, a sequence at least 55% identical, more preferably at least 60% identical, at least 65% identical, at least less than 70% identical, not less than 75% identical, not less than 80% identical, not less than 85% identical, not less than 90% identical, not less than 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 or 100 % identical to the sequence SEQ ID NO: 1, the sequence SEQ ID NO: 2, the sequence SEQ ID NO: 3 and / or the sequence SEQ ID NO: 4, or a fragment thereof having an activity cysteine endoprotease.
  • sequence at least x% identical to a reference sequence is meant here that the sequence is identical to the reference sequence or differs from the reference sequence by up to 100-x amino acid alterations for each 100 amino acids of the reference sequence.
  • the amino acid alterations with respect to the reference sequence may be substitutions, deletions and / or insertions of one or more amino acids, and this at positions such that these modifications do not significantly affect the activity. enzymatic enzymes.
  • the substitutions may in particular correspond to conservative substitutions or substitutions of natural amino acids by non-natural amino acids or pseudo-amino acids.
  • the protein sequence differs from the reference sequence only in the presence of conservative substitutions.
  • amino acid substitutions are amino acid substitutions of the same class, such as amino acid substitutions to uncharged side chains (such as asparagine, glutamine, serine, cysteine, and tyrosine), amino acids with basic side chains (such as lysine, arginine, and histidine), amino acids with acid side chains (such as aspartic acid and glutamic acid), chain amino acids apolar side effects (such as alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine and tryptophan).
  • amino acid substitutions to uncharged side chains such as asparagine, glutamine, serine, cysteine, and tyrosine
  • amino acids with basic side chains such as lysine, arginine, and histidine
  • amino acids with acid side chains such as aspartic acid and glutamic acid
  • chain amino acids apolar side effects such as alanine, valine, leucine, isoleucine, proline,
  • sequences SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 correspond to the amino acid sequences of cysteine endoproteases EP-A barley.
  • EP-A barley The cysteine endoprotease EP-A barley is described in Koehler and Ho (1988) Plant Physiol. 87: 95-103.
  • EP-A has an apparent molecular weight of 37 kDa, and has optimum activity at pH 5.0 and a temperature of 45 ° C. It is induced by gibberellic acid. Its cleavage site on recombinant type C hordeins has been characterized in Davy et al. (1998) Plant Physiol. 117: 255-261: EP-A cuts the hordeins after the amino acids arginine and glutamine, with a preference for arginine.
  • REESHTDEL (SEQ ID NO: 2).
  • Different domains have been identified in the protein sequences of EP-A.
  • amino acids 1 to 23 of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 correspond to the signal peptide and amino acids 128 to 365 of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 correspond to the mature chain (sequences SEQ ID NO: 5 and 6).
  • the catalytic site of EP-A has not been characterized.
  • the catalytic site can however be deduced by homology with EP-B as containing the following amino acids: cysteine 29, histidine 164, serine 28, glycine 71, aspartate 163, asparagine 185, glutamine 23 numbered on the basis of the sequence of mature proteins SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 6.
  • sequences SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 correspond to the amino acid sequences of barley EP-B cysteine endoproteases.
  • EP-B barley The cysteine endoprotease EP-B barley is described in Koehler and Ho (1990) Plant Physiol. 94: 251-258.
  • EP-B has an apparent molecular weight of 30 kDa (Davy et al (1998) Plant Physiol 117: 255-261), and exhibits optimum activity at a pH of 4.5 and a temperature of 40 ° C for model protein substrates (azocasein or hemoglobin). Under these optimal conditions, the hordeins are typically cleaved into multiple molecular weight fragments between 2000 and 25000 Daltons.
  • EP-B is induced by gibberellic acid. Its cleavage site on recombinant type C hordeins has been characterized in Davy et al.
  • EP-B cuts the hordeins after the amino acids arginine and glutamine, with a preference for arginine for primary cuts.
  • the presence at the cleavage site of an amino acid such as phenylalanine, leucine or valine before arginine or glutamine promotes hydrolysis.
  • EP-B retains good catalytic activity despite the presence of proline after these two arginine or glutamine residues. Secondary cleavage sites can be demonstrated when the hydrolysis of C-hordein by ⁇ - ⁇ is prolonged.
  • the endoprotease may cleave after glutamine, arginine, tyrosine, glycine, glutamic acid, serine, histidine, leucine. It does not apparently cut in N- or C-terminal proline in the case of C-hordein (Davy et al., 1998) and can not be assimilated to an endoprolidase. Similar results have been obtained for the hydrolysis of ⁇ 2-gliadin by recombinant ⁇ - ⁇ and show a clear preference for C-terminal cleavages of glutamine (Bethune et al., 2006).
  • cysteines endoproteases cereals are also very different from that of other cysteine endoproteases such as papain which is used to reduce the disorder of beer.
  • Papain is in fact relatively non-specific (Kimmel and Smith (1954) J. Biol Chem 207: 515-531).
  • Two variants of the barley EP-B cysteine endoprotease have been identified: they are sequence variants:
  • amino acids 1 to 28 of SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4 correspond to the signal peptide
  • amino acids 29 to 130 of SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4 correspond to the activation propeptide
  • amino acids 131 to 371 of SEQ ID NO: 3 correspond to amino acids 131 to 373 of SEQ ID NO: 4 (sequence SEQ ID NO: 8) correspond to the mature chain.
  • the catalytic site of EP-B has been further characterized.
  • cysteine 158 cyste 28 for the mature protein of sequence SEQ ID NO: 7 or 8
  • histidine 297 histidine 167 for the mature protein of sequence SEQ ID NO: 7 or 8) of SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4.
  • aspartate 296 (aspartate 166 in the mature protein) is involved in the positioning of the substrate with respect to cysteine 158 (cysteine 28 in the mature protein) catalytic (Bethune et al., 2006).
  • the cysteine endoprotease used in the context of the invention may have cysteine endoprotease A or cysteine endoprotease B activity.
  • the cysteine endoprotease (s) used in the context of the invention is (i) a cysteine endoprotease A comprising, or consisting of, a sequence at least 55% identical, or at least 60 , 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 or 100% identical to the sequence SEQ ID NO: 1 and / or SEQ sequence ID NO: 2, and / or a fragment thereof having cysteine endoprotease A activity, and / or (ii) a cysteine endoprotease B comprising, or consisting of, a sequence at least 55% identical, or at least 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 or 100% identical to the sequence SEQ ID NO: 3 and / or the sequence SEQ ID NO: 4, and / or a fragment thereof exhibiting cysteine
  • cysteine endoprotease (s) used in the context of the invention is (i) barley EP-A cysteine endoprotease comprising or consisting of the sequence SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2, and / or (ii) the barley EP-B cysteine endoprotease comprising or consisting of the sequence SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4.
  • fragment of a reference sequence is meant here a sequence which has a size smaller than the reference sequence.
  • the fragments may for example have a size of between 230 and 373 amino acids, from 235 to 371 amino acids, from 236 to 365 amino acids, from 237 to 350 amino acids, from 239 to 300 acids.
  • the fragments contain the active site of the enzyme from which they are derived.
  • the fragments used in the context of the invention may be obtained by enzymatic or non-enzymatic cleavage of the mature enzyme or proprotein from which they are derived, preserving or enhancing the specificity and endoprotease efficiency.
  • fragments used in the context of the present invention exhibit endoprotease cysteine activity. Fragments of the protein sequences defined above having endoprotease cysteine activity can be identified by those skilled in the art by routine techniques. Indeed, as is well known to those skilled in the art, the cysteine endoprotease comprise a peptide signal and the endoprotease cysteine activity is therefore located at the level of the mature cysteine endoprotease chain.
  • the cysteine endoprotease fragment used in the context of the invention comprises, or consists of, a sequence at least 55% identical, or at least 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 or 100% identical to the sequence SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 and / or SEQ ID NO: 8, said fragment having endoprotease cysteine activity.
  • the catalytic site of endoprotease cysteine is located in a pocket containing cysteine and a histidine involved in catalysis and different amino acids involved in the fixation and / or the recognition of the cleavage site as described above for EP-A.
  • Fragments of the protein sequences defined above having endoprotease cysteine activity will thus preferably comprise, or preferably consist of, amino acid residues of the catalytic site of the cysteine endoproteases defined above.
  • the cysteine endoprotease fragment used in the context of the invention comprises, or consists of, a fragment of the preprotein or mature protein or any functional protein fragment containing the amino acid residues. of the catalytic site described above.
  • the techniques for measuring an endoprotease cysteine activity are indeed well known to those skilled in the art. Typically, they comprise colorimetric or fluorimetric techniques using di- or tripeptides with a chromophore or a fluorophore, techniques using cereal reserve proteins (prolamines) or fragments of these proteins coupled to an analysis of the peptides produced by spectrometry. mass.
  • endoproteease cysteine activity can be measured using a fluorescent peptide such as N-CBZ (benzyloxycarbonyl) -Phe (phenylalanine) -Arg (arginine) -MAA (7-amido-4-methyl-coumarin) in a citrate buffer 50 mM (pH 4 containing 2 mM cysteine and 2 mM ⁇ -mercaptoethanol).
  • N-CBZ-Phe-Arg-AMC is solubilized in DMSO at a concentration of 100 ⁇ and 10 ⁇ are added to a quartz cuvette containing 2 ml of the citrate buffer.
  • the at least one cysteine endoprotease used in the context of the invention may be used in isolated or purified form.
  • isolated or “purified” is meant here a cysteine endoprotease taken from its natural environment.
  • cysteine endoprotease produced recombinantly in host cells is considered isolated in the context of the invention, as is a recombinant or native polypeptide that has been substantially purified by any suitable technique.
  • the at least one cysteine endoprotease used in the context of the invention may be in isolated form. It can however be mixed in vehicles or thinners that will not interfere with the desired effect of this enzyme, and will then always be considered isolated.
  • the at least one cysteine endoprotease used in the context of the invention may also be in a more substantially purified form, which will include the at least one cysteine endoprotease in a preparation in which more than 70%, or more than 80%, 90%, 95%, 98% or 99% of the proteins in the preparation is the at least one cysteine endoprotease.
  • the cysteine endoprotease used in the context of the invention may be in the form of a crude or purified natural product, a product obtained by chemical synthesis, a product obtained by a recombinant technique from a eukaryotic or prokaryotic host, such as a bacterial, yeast, fungal, superior plant, insect or mammalian cell.
  • a vector containing a nucleic acid encoding a cysteine endoprotease is preferably transferred into a host cell which is cultured under conditions permitting the expression of the corresponding protein.
  • the enzyme produced can then be recovered and purified.
  • the nucleic acid sequence of interest may be inserted into an expression vector, in which it is operably linked to one or more elements allowing its expression or the regulation of its expression, such as in particular promoters. , activators and / or transcription terminators.
  • the signals controlling the expression of the nucleotide sequences are chosen as a function of the cellular host used.
  • the nucleotide sequences encoding the protein of interest may be inserted into autonomously replicating vectors within the chosen host, or integrative vectors of the chosen host.
  • vectors will be prepared according to methods commonly used by those skilled in the art, and the resulting clones can be introduced into a suitable host by standard methods, such as for example electroporation or calcium phosphate precipitation.
  • host cells include, in particular, human cells such as HEK293, PER.C6, non-human mammalian cells such as CHO, COS, MDCK, insect cells such as SF9 cells, bacteria such as E. coli , fungus and / or yeast strains such as L40 and Y90.
  • the at least one cysteine endoprotease used in the context of the invention can be obtained from plant extracts in which it is naturally produced.
  • the at least one cysteine endoprotease used in the context of the invention can thus be obtained from protoplasts of aleuronic cells or from a cell culture of the aleurone layer.
  • the techniques for culturing the protoplasts of the aleuronic cells or of the aleurone layer are well known to those skilled in the art and described, for example, in Chrispeels & Varner (1967) Plant Physiol 42: 398-406 and Taiz & Jones (1971) Planta 101: 95-100.
  • the cysteine endoproteases being induced by gibberellic acid in a particular embodiment, the cells of the aleurone layer are cultured in the presence of gibberellic acid, preferably at a concentration of approximately 1 ⁇ l.
  • the at least one cysteine endoprotease used in the context of the invention can also be obtained from sprouted cereal grains, in particular from cereal malt, such as described in the "Malt Extract” section below.
  • a cysteine endoprotease used in the context of the invention can be obtained from recombinant cell cultures, from plant cell cultures or from plants or parts of plants, in particular from lysates and cell extracts. of plants or parts of plants, or of the supernatant of the culture medium, by techniques well known to those skilled in the art, used individually or in combination, such as precipitation with ammonium sulphate or with ethanol, acid extraction, chromatographic methods, immunoaffinity techniques using specific mono- or polyclonal antibodies, etc.
  • the at least one cysteine endoprotease is used in the form of a malt extract as defined in the section "malt extract below.
  • malt is meant here a sprouted cereal obtained by a malting process.
  • the malt can be obtained by any malting technique well known to those skilled in the art. Malting typically takes place in 4 stages, including soaking, which moistens the grain, germination in which the seed starts to germinate and gives rise to the "green malt", the kiln, in which the green malt is dried to obtain a dry malt, and the degerming in which the malt is rid of its rootlets.
  • the malt used in the context of the invention is a dry malt.
  • the malt used in the context of the invention is a dry malt obtained after 5 to 1 day of germination.
  • the malt used in the context of the invention is preferably a cereal malt, in particular a malt of barley, rye or wheat, more particularly preferably a malt of barley, more particularly a malt of barley. winter or spring barley malt.
  • the malt used in the context of the invention may be a diastase malt or non-diastase malt.
  • malt extract is meant here a preparation obtained following the extraction of a malt with a suitable solvent such as, for example, water, aqueous buffers, ethanol, a mixture of those or oils or other suitable aqueous buffers well known in the field of plant extractions.
  • a suitable solvent such as, for example, water, aqueous buffers, ethanol, a mixture of those or oils or other suitable aqueous buffers well known in the field of plant extractions.
  • the malt extract used in the context of the invention may in particular be a malt extract, preferably dry malt, optionally concentrated.
  • the malt extract used in the context of the invention may be in freeze-dried form and optionally resuspended before use.
  • the malt extract used in the context of the invention comprises an endoprotease activity.
  • endoprotease activity is meant herein a protease enzyme activity capable of cleaving a protein or peptide within the peptide chain. Techniques for demonstrating endoprotease activity are well known to those skilled in the art and described in the "Cysteine endoprotease” section above.
  • the malt extract comprising an endoprotease activity used in the context of the invention causes a decrease in the turbidity of a fermented or non-fermented beverage based on cereals, as defined in the section "Beverage-based". of cereals "above, in relation to an untreated beverage, not less than 70%, more preferably not less than 75%, not less than 80%, not less than 85%, not less than 90%, or more preferably at least 95%, particularly when the turbidity is measured at -8 ° C, more particularly by means of the Chapon test as described in the section "Reduction of haze" above.
  • the malt extract comprising an endoprotease activity used in the context of the invention causes a decrease in the turbidity of a fermented or non-fermented beverage based on cereals, as defined in the section "Beverage-based".
  • at least 65 EBC units more preferably at least 70 EBC units, at least 75 EBC units, at least minus 80 EBC units, at least 85 EBC units, at least 90 EBC units, at least 95 EBC units, or at least 100 EBC units, particularly when turbidity is measured at -8 ° C, more particularly by means of the Chapon test as described in the section "Reduction of the disorder" above.
  • a malt extract having such characteristics may typically be a crude malt extract obtained by recovering the malt centrifugation supernatant, as defined above, milled suspended in an aqueous solution.
  • a malt extract having such characteristics is a treated malt extract obtained by recovery and centrifugation filtration of a crude malt extract as defined above, treated by differential precipitation with ammonium sulphate, in particular treated between 15% and 20%, preferably 26%, ammonium sulfate saturation, then optionally at least 50%, preferably 89%, saturation with ammonium sulfate, or by any percentage saturation with ammonium sulfate well known to those skilled in the art.
  • a malt extract obtained by one of these techniques makes it possible to reduce the turbidity of a drink, fermented or not, based on cereals, in a proportion according to the one mentioned above.
  • the malt extract used in the context of the invention may however be obtained by any technique comprising additional extraction and / or purification steps well known to those skilled in the art, such as chromatographic exchange chromatography techniques. ions, size exclusion chromatography or hydrophobic interaction chromatography.
  • a malt extract obtained by one of these techniques included an endoprotease cysteine activity.
  • the malt extract used in the context of the invention therefore comprises an endoprotease cysteine activity, as defined in the "Cysteine endoprotease” section above. More preferably, the malt extract used in the context of the invention comprises cysteine endoprotease A and / or cysteine endoprotease B activity, as defined in the "Cysteine endoprotease” section above.
  • the inventors have also shown that a malt extract obtained by one of these techniques makes it possible to increase the fermentation yield during the manufacture of fermented cereal-based beverages.
  • the present invention also relates to a method for preventing or reducing the disturbance of a beverage, whether fermented or not, based on cereals, such as defined in the section "Cereal-based beverage above", comprising a step of adding (i) at least one cysteine endoprotease as defined in the "Cysteine endoprotease” section above or (ii) a malt extract as defined in the "Malf Extract” section above, during the process of making the beverage.
  • the present invention also relates to the use of (i) at least one cysteine endoprotease as defined in the "Cysteine endoprotease” section above or (ii) a malt extract as defined in the section “Extract of malt “above, in the preparation of a cereal-based fermented or non-fermented beverage as defined in the" Cereal Based Beverage "section above.
  • the subject of the present invention is also a process for the manufacture of a cereal-based fermented or non-fermented beverage, as defined in the section "Cereal-based beverage” above, comprising a step of adding (i ) at least one cysteine endoprotease as defined in the section "Cysteine endoprotease” above or (ii) a malt extract as defined in the section "Malf extract above, especially in the juice or the must.
  • steps of a fermented or non fermented cereal-based process are well known to those skilled in the art and may vary depending on the beverage produced, particularly depending on whether the beverage is a fermented beverage or no.
  • the step of adding may be implemented at any stage of the beverage manufacturing process which is not not followed by a step likely to destroy endoprotease activity.
  • Such steps likely to destroy the endoprotease activity are well known to those skilled in the art, and include, for example, treatment steps at elevated temperatures, particularly at temperatures above 62 ° C, in particular above 65 ° C. C, or 68 ° C, such as saccharification or boiling steps.
  • the adding step is carried out after the step of saccharification and / or boiling of the process for manufacturing the beverage.
  • said at least one cysteine endoprotease or said malt extract is added during the fermentation step.
  • fermentation of the beverage manufacturing process preferably at the beginning of the fermentation step of the beverage manufacturing process.
  • several types of fermentations can be used to produce a fermented cereal beverage, especially a beer.
  • said at least one cysteine endoprotease or said malt extract may be added during a low fermentation step, during a high fermentation step or during a spontaneous fermentation step.
  • the beverage being manufactured is thus contacted with said at least one cysteine endoprotease or malt extract for a period of time appropriate to allow the enzymes to degrade the proteins responsible for the disorder.
  • a duration will depend on the incubation conditions of cysteine endoprotease or malt extract with the beverage being manufactured, particularly temperature and pH conditions.
  • the inventors have shown that the usual duration of the fermentation step during the process of manufacturing a beer, whether it is a low or high fermentation, was particularly suitable for obtaining a prevention or a reduction of the disorder. beer as defined in the section "Decrease in Disturbance" above.
  • the drink during manufacture is brought into contact with said at least one cysteine endoprotease or said malt extract for 8 to 12 days, preferably for 10 days, at a temperature of between 10 and 12 ° C, preferably at a temperature of 12 ° C, preferably at a starting pH of 5.3-5.4, the final pH being up to 4.2-4.3 because of the natural evolution of pH during fermentation.
  • the drink during manufacture is brought into contact with said at least one cysteine endoprotease or said malt extract for 4 to 8 days, preferably for 6 days, at a temperature of between 20 and 25 hours. ° C, preferably at a starting pH of 5.3-5.4.
  • the process for producing beer according to the invention comprises the following steps:
  • step b) a step of crushing or grinding the malt obtained in step a),
  • step b) a step of mixing the crushed malt in step b) with water preferably tempered to form a mash
  • step c) a saccharification step of the mash obtained in step c) to form a must, preferably by decoction, step infusion or simple infusion, e) a filtration step to obtain the original must,
  • step g) a step of cooling, seeding and oxygenation of the must, i) a fermentation step, in particular a low, high or spontaneous fermentation step, in the presence of yeasts, during which, preferably at the beginning of which, said at least one cysteine endoprotease or said malt extract is added, j) a step of keeping the fermented product obtained in step g),
  • Steps a) to h) and j) to I) can be carried out conventionally under conditions well known to those skilled in the art.
  • the must is preferably brought into contact with said at least one cysteine endoprotease or said malt extract for 8 to 12 days, preferably for 10 days, at a temperature of between 8 and 14 hours.
  • C. preferably at a temperature of 12 ° C., preferably at a starting pH of 5.3-5.4, or for 4 to 8 days, preferably for 6 days, at a temperature of between 15 and 20 ° C. ° C, preferably at a starting pH of 5.3-5.4.
  • the methods of the invention may further comprise a step of adding an auxiliary enzyme to reduce or prevent the formation of a disorder.
  • auxiliary enzymes to reduce or prevent the formation of a disorder are well known to those skilled in the art, and include, for example, Clarex Brewers ® marketed by DSM, or papain.
  • the beverages obtained by the processes according to the invention differ from the drinks obtained by the manufacturing processes of the state of the art insofar as they contain the cysteine endoprotease or the malt extract introduced during the processes according to the invention. whether the enzymes are inactivated or not, and said cysteine endoprotease or malt extract modifies the peptide and protein composition of the product obtained, allowing the prevention or reduction of the formation of the disorder, usually due to the presence of residual proteins.
  • the present invention therefore also relates to a cereal-based beverage, in particular fermented or not, as defined in the section "Cereal-based beverage” above, preferably beer, obtainable by the processes according to the invention.
  • a cereal-based beverage in particular fermented or not, as defined in the section "Cereal-based beverage” above, preferably beer, obtainable by the processes according to the invention.
  • the present invention will be further illustrated by the figures and examples below.
  • Figure 1 Summary diagram of the protocol for obtaining barley malt extracts implemented in Example 3.
  • Figure 2 Effect on the colloidal disorder of beer (Chapon test) extracts and fractions obtained in Example 3.
  • G unconfined (NR) on a cation exchange column (SP); H: before DEAE column (NR SP dia pH 7.5); I: NR DEAE 42-82; J: NR DEAE 83-95; K: NR DEAE 96-150: L:
  • Figure 3 Chromatogram of the hydrolysis of gliadins with DTT by the enzymes of barley malt and Brewers Clarex® in HPLC on Luna C18 described in Example 3.
  • Figure 4 Zoom of a chromatogram of the hydrolysis of ⁇ -lactoglobulins with DTT by the enzymes of barley malt and the Clarex® Brewers in HPLC on Luna C18 described in Example 3.
  • FIG. 5 Kinetics over 6 h of the hydrolysis of the Z-Gly-Pro-pNA peptide by the enzymes of barley malt and the Clarex® Brewers at pH 4 described in Example 3.
  • Figure 6 Kinetics over 6 h of the hydrolysis of Z-Gly-Pro-pNA peptide by the enzymes of barley malt and Brewers Clarex® at pH 5 described in Example 3.
  • Figure 7 6-hr kinetics of the hydrolysis of Z-Phe-Arg-pNA peptide by the barley malt enzymes and the Clarex® Brewers at pH 4 described in Example 3.
  • Figure 8 Kinetics over 6 h hydrolysis of the Z-Phe-Arg-pNA peptide by the barley malt enzymes and the Clarex® Brewers at pH 5 described in Example 3.
  • Figure 9 Effect on the colloidal disorder of the beer (Chapon test) of the different extracts tested in Example 1.
  • Figure 10 Effect on the colloidal disorder of the beer (Chapon test) of the different extracts tested in Example 2.
  • Figure 11 Chromatogram of the hydrolysis of gliadins by barley malt enzymes and crude malt extract by HPLC on Luna C18 described in Example 4. The absorbance is measured at 214 nm.
  • Figure 12 Effect on the fermentation of the malt extract described in Example 5.
  • This example shows that a malt extract obtained from different types of barley can be used to clarify the beer.
  • 50 g of finished malt of different types of barley were extracted into 200 ml of 0.1 M citrate buffer pH 4.3 stored in the refrigerator at 4 ° C. They were mixed in a blender for 40 seconds at maximum speed, then centrifuged at 3660 rpm for 10 min at 14 ° C. The supernatant was recovered and filtered with filter paper to remove suspended particles.
  • the beer used in this example is 33 cL Fink'bré beer in a can held at room temperature (21 ° C), filtered on filter paper, and degassed for 20 minutes in an ultrasonic bath.
  • T + Positive Control
  • the negative control (T-) corresponds to 4 mL of 0.1 M citrate buffer pH 4.3 + qs 50 mL of unstabilized beer.
  • the tested samples consist of 4 mL of extract + unstabilized beer qs
  • the mixtures were incubated for 17 h in a water bath at 37 ° C.
  • the mixture was incubated for 30 min at -8 ° C in a cryostat bath.
  • Turbidity was measured at the turbidimeter at -8 ° C.
  • Example 2 Decrease in Beer Disturbance with Wheat Malt This example shows that a wheat malt extract can be used to clarify the beer.
  • the beer used in this example is 33 cL Fink'bré beer in a can held at room temperature (21 ° C), filtered on filter paper, and degassed for 20 minutes in an ultrasonic bath.
  • T + Positive Control
  • the negative control (T-) corresponds to 4 mL of 0.1 M citrate buffer pH 4.3 + qs 50 mL of unstabilized beer.
  • barley malt and wheat malt extracts including barley malt and wheat malt extracts: Barley malt Chile 22304 B2BR, Barley malt Arturio 23175 B1 CA, Diastasic barley malt Arturio 231 12 B2BR, Apache Wheat Malt 23086 (Arcis on Aube) and Bagu Wheat Malt (Arcis sur Aube).
  • the tested samples consist of 0.5, 1, 2, 3 or 4 mL of unstabilized extract + beer qs 50 mL.
  • the mixtures were incubated for 17 h in a water bath at 37 ° C.
  • Controls and samples were incubated at 37 ° C for a minimum of 5h.
  • Turbidity was measured at the turbidimeter at -8 ° C.
  • This example shows the effect of malt extracts on the beer disorder and the involvement of cysteine barley endoproteases in this effect.
  • the malt used for the different experiments comes from barley seeds of the variety Beatrix (Hordeum vulgare) malted by Soufflet malting (Nogent sur Seine / Aube) but the enzymes are present in all the varieties of barley they are winter (two or six rows) or spring.
  • the malt was milled in a vibrating feeder L 24 from Fritsch (Germany).
  • the colorimetric protein assay was performed with the BC Assay kit from Uptima Interchim.
  • Ion exchange chromatography was performed on Akta Explorer 100 and Akta Prime FPLCs (GE Healthcare, USA) with 26/10 XK columns and 50 ml Sepharose SP Fast Flow (FF) and Sepharose DEAE FF gels (GE Healthcare). , USA). Separation is also feasible on other types of cation exchange columns and anions.
  • the HPLC analyzes were performed on a Alliance HT Waters 2795 separation module / Waters 2487 Dual ⁇ absorbance detector, and the column used was a Luna 5 ⁇ (C18) 100A (250 x 4.60 mm) (Phenomenex). The detection of the proteins was carried out by spectroscopy at 2 wavelengths: 214 and 280 nm.
  • the centrifuge is a Beckman Avanti (USA) J26 XP (rotor: FiberLite® F10BCI - 6x500y)
  • the turbidity was measured on a Pfeuffer tannometer (Germany) after passing through a Hubert Variostat CC immersion temperature cryothermostat.
  • the unstabilized control beer is a Finkbruu (Lidl) and the positive control is Brewers Clarex® (DSM, The Netherlands).
  • the gliadins (total) as well as the ⁇ -lactoglobulins used for the hydrolysis tests were provided and purified by the Swiss INRA (BIA Angers-Nantes / Loire Atlantique unit).
  • the peptide Z-GP-pNA and the peptide Z-FR-pNA come from Bachem (Switzerland).
  • the reading of the OD was done by an Epoch plate reader (Biotek, USA).
  • the dialysis membranes were visking membranes (Medicell Int.) With cut-off 12-14000 Da. Buffer preparation
  • citrate buffers used they were also prepared with the indicated molarity solutions and adjusted to the desired pH by adding sodium citrate.
  • the 50 mM Tris / HCl pH 7.5 buffer was prepared with 50 mM Tris and adjusted to pH 7.5 by the addition of hydrochloric acid (HCl).
  • the malt grains were ground under liquid nitrogen at 0.5 mm.
  • 48 g of MSi (initial dry matter) of flour were suspended in 200 ml of 0.1 M citrate buffer pH 4.3 with magnetic stirring at 7 ° C. for 30 minutes. After centrifugation at 10,000 rpm for 20 minutes at 7 ° C, the supernatant was collected and filtered on filter paper. It is called "raw extract” (EB).
  • This EB was treated at 26% saturation with ammonium sulphate ((NH 4 ) 2 SO 4 ) (SA) ie 15% w / v with magnetic stirring at 7 ° C for 30 minutes. This was followed by a second centrifugation at 10,000 rpm for 20 minutes at 7 ° C.
  • C65% SA dia pH 5 65% pellet of dialysed ammonium sulfate pH 5
  • AC Before Column
  • Superose column 12 - 1 5 mL (ie 1.75 mg of proteins) of the SP / DEAE fraction containing ⁇ - ⁇ were deposited on the Sephadex S200 column. The fraction was previously concentrated on Amicon Ultra 10KDa 0.5mL cell (Millipore, Ireland). The flow rate was 0.8 mL / min and the buffer used was 50 mM citrate buffer pH 4.5. The fractions collected were 2 mL.
  • Coomassie G250 In the wells, 5 ⁇ l of known molecular weight standards and 20 ⁇ l of sample were deposited, before the samples were prepared as follows: 40 ⁇ l of sample + 20 ⁇ ⁇ - from denaturation solution (50 mM Tris pH 6.8, 20% glycerol, 4% SDS, 0.01% bromophenol blue) + 3 ⁇ l of ⁇ -mercaptoethanol.
  • SDS-Tricine PAGE The SDS-tricine PAGE were made according to the protocol of Schagger and von Jagow (1987) Anal. Biochem. 166: 368-379, on 10% acrylamide gels for separation before band analysis by mass spectrometry or at 16% for the hydrolysis of hordeins. The gels were stained with Coomassie blue G250.
  • the lyophilizate was resuspended in 50% propanol (15 ml / g) at 60 ° C with magnetic stirring for 45 min and then centrifuged at 10,000 rpm for 30 minutes at 12 ° C.
  • the supernatant referred to as "propanol supernatant" was stored at 4 ° C and the pellet was again extracted with 50% propanol.
  • the pellet was then suspended in 50% propanol (15 ml / g) + 2% ⁇ -mercaptoethanol ( ⁇ ) at 60 ° C. with magnetic stirring for 45 minutes. It was then centrifuged at 10,000 rpm for 30 minutes at 12 ° C. The supernatant named "Propanol / ⁇ -mercaptoethanol supernatant" was stored at 4 ° C. The pellet suffered this step twice more.
  • the propanol and propanol / ⁇ supernatants were dialyzed separately against 20 L of distilled water (3 baths of 2 h and overnight) and then centrifuged at 10,000 rpm for 30 minutes at 12 ° C.
  • the pellets and the supernatants were frozen at -20 ° C. and then lyophilized.
  • the lyophilizates were then ground to a fine powder and stored at -20 ° C.
  • Hordéines Propanol HP
  • Hordéines Propanol / ⁇ -mercapto-ethanol ⁇ were obtained (Koehler and Ho (1990) Plant Physiol 94251-258, Wrobel (1992) J. Inst Brew, 98: 471-478, Zhang and Jones (1996) Planta 199: 565-572).
  • HP HP delipidated before analysis.
  • the HP were delipidated according to the following protocol: in a 15 mL glass tube, 0.302 g of HP were weighed and suspended in 10 mL of dichloromethane + 5 mL of acetone. After vortexing for 20 minutes and centrifugation at 4 ° C for 10 minutes at 3000 rpm, the supernatant was removed and the pellet was treated a second time and then dried under vacuum and stored at -20 ° C. The extract obtained is called HPdl.
  • the Luna C18 column (Phenomenex) was equilibrated with the eluent A (H 2 0 milliQ + tri-fluoroacetic acid (TFA) 0.1 1%) and the elution was carried out by a linear gradient from 0 to 50%.
  • eluent B acetonitrile + TFA 0.09%
  • the volume after dialysis was again divided in two.
  • the first portion was stored at -20 ° C pending Chapon test analysis and the second portion was lyophilized.
  • the lyophilizate was suspended in a volume of distilled water equal to the initial volume set to the lyophilizer and analyzed by the Chapon test.
  • the Chapon Test allows by measuring the decrease of the disorder to select the active fractions during the purification.
  • the inventors showed that the activity was retained in the dialyzed SN15% SA and then in the dialysed C65% SA (FIG. 2).
  • the dialysis C15% SA and the dialyzed SN65% SA show no activity.
  • a Chapon test performed by adding equivalent amounts of protein (1 mg) shows a strong increase in activity in C65% SA dia (108 EBC for ⁇ 50.2 EBC for C65% SA dia).
  • the ammonium sulfate treatment allows a first concentration and purification of the enzymes of interest.
  • fraction 31 was composed of several protein bands of which a main group around 35 kDa, a band around 60 kDa and a thinner band around 30 kDa.
  • Fraction 46 contained 2 strips of PM at around 60 and 35 kDa.
  • the zymogram confirmed the presence in fractions 31 and 46/47 of enzymes capable of hydrolyzing proteins rich in pralines (gliadins). The enzymes in these 2 fractions had different mobilities indicating that they were different.
  • the inventors After separation of the enzymes of interest from barley malt by ion exchange chromatography, the inventors used the exclusion-diffusion chromatography (gel filtration) in order to refine the purity of the fractions having the enzymatic activity.
  • the separation of the fraction 31 on the Sephadex S200 column showed a main peak preceded by two shoulders. Chapon and zymogram analysis revealed that the enzyme was present in the C4 fraction corresponding to the main peak.
  • SDS electrophoresis the inventors found that this fraction consisted of several protein bands around 35 kDa.
  • the inventors observed that the enzymatic activity was preserved after lyophilization.
  • the inventors have shown that two enzymatic fractions isolated from barley malt were able to reduce the colloidal disorder of beer and to hydrolyze the prolamines of cereals (hordeins and gliadins). These two enzymatic fractions are enriched, respectively, in two proteases EP-B and EP-A, cysteine proteinases of barley. These two enzymes are very close in terms of their amino acid sequences (primary structure) and their sequences have no identity with that of Brewers Clarex® enzyme.
  • the gliadins are solubilized at 4 mg / ml in 50mM acetic acid and then diluted to 1 mg / ml with 50mM sodium acetate buffer at pH 5 and mixed with various extracts.
  • the mixture of gliadins and acetate buffer represents the control noted T
  • the mixture gliadins and crude extract obtained as described in Example 3 is noted EB
  • the mixture of gliadins and EP-A obtained as described in Example 3 is noted EP-A
  • the mixture of gliadins and EP-B obtained as described in Example 3 is noted EP-B.
  • the mixtures are incubated overnight at 37 ° C. with stirring.
  • the amounts of added enzymes were calculated to obtain a substrate enzyme ratio of 4%.
  • the samples are incubated for 18 hours at 37 ° C. before being analyzed by high performance liquid chromatography (HPLC).
  • Inverted phase column Luna, C 18 , 100A, 5 ⁇ , 250X4,6 mm (Phenomenex)
  • the measurement at 280 nm makes it possible to specifically detect proteins containing aromatic amino acids such as tryptophan.
  • the signal although less specific, is about 10 times larger than at 280 nm.
  • Elution was performed by a linear gradient of 10 to 60% of eluent B in 20 min.
  • Injection volume 40 ⁇ L.
  • the absorbance is recorded at 214 and 280 nm using a Waters 2487 detector. Results
  • the hydrolysis tests are carried out on total gliadins.
  • the 2 main peaks corresponding to gliadins show that the gliadins are partially hydrolysed by the crude extract (EB) and the 2 enzymes.
  • the peaks appearing on the chromatograms after hydrolysis by EP-B and EP-A are different, indicating different cleavage sites (FIG. 11).
  • Hydrolysis by EP-B is more marked than by EP-A, suggesting that smaller peptide chains are released, while EP-A allows more specific hydrolysis, marked by a stronger peak.
  • This example shows the effect of increasing the fermentation yield of the malt extract according to the invention.
  • 2RP Pilsen malt was stored at 4 ° C, then milled on a ZM 200 mill with a 0.5mm grid.
  • the supernatant is heated without stirring until the appearance of the first broths, then the supernatant is centrifuged for 25 min at 8400 rpm at a temperature of 4 ° C and filtered coarsely.
  • the precipitation by addition of ammonium sulfate is carried out under the same conditions as the extraction, with stirring at 250 rpm and at 7 ° C.
  • the mixture is centrifuged for 25 min at 8400 rpm and 4 ° C.
  • the supernatant is recovered and its volume is measured.
  • the pellet is recovered in 600 ml of citrate buffer and then coarsely filtered before filtration on a 0.45 ⁇ m filter.
  • the product obtained is stored at 4 ° C. while waiting for the desalting.
  • the desalting is carried out on a Sephadex G25 gel packed in a column
  • AxiChrom 70 (GE Healthcare).
  • the device used is ⁇ Prime Plus (GE Healthcare).
  • the desalting is carried out at room temperature and the sample is injected with a flow rate of 40 ml / min. Elution is carried out with the 0.1 M citrate buffer pH 4.3. Ion exchange chromatography
  • the gel used is the Sepharose Fast Flow gel, equilibrated with 50 mM citrate buffer pH5, the chromatography is carried out at room temperature. The cysteine endoprotease is in the eluted fraction. Fermentation tests
  • a must at 1 ° Plato is produced by stirring type "EBC congress” heating at 45 ° C for 30 minutes, followed by a rise in temperature at 70 ° C for 60 minutes, then 210 g of malt are paid for 1260 mL of water.
  • the modalities tested correspond respectively to:
  • T- is a crude barley malt extract denatured by heat
  • S15 is a malt extract treated with a 15% ammonium sulfate solution
  • S65 is a crude extract treated with a 15% ammonium sulfate solution, and then the supernatant is treated with a 50% ammonium sulfate solution
  • - 65CH is the modality S65, purified on column SP.
  • the numbers 1, 2 and 3 correspond to 3 volumes of different additions tested: the volumes 1 go from 15 to 30 ml, the volumes 2 are 22.5 and 30 ml, the volume 3 corresponds to 30 or 37.5 ml. .
  • the yeast is purged, then the must is put in cold storage (about 2 ° C, minimum 5 days).
  • the fermented musts are centrifuged (Centrifugation at 4000 rpm, for 10 minutes) and the supernatant is analyzed.

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  • Distillation Of Fermentation Liquor, Processing Of Alcohols, Vinegar And Beer (AREA)

Abstract

La présente invention concerne l'utilisation d'une cystéine endoprotéase ou d'un extrait de malt pour prévenir ou diminuer le trouble d'une boisson, fermentée ou non, à base de céréales.

Description

Utilisation de cysteine endoprotéase pour diminuer le trouble de boissons
La présente invention concerne des procédés de clarification de boissons, en particulier de la bière.
La clarification est une étape indispensable dans l'industrie des boissons, confrontée à la formation d'un trouble au cours du stockage de la bière, du vin ou encore des jus de fruits. Etant un problème majeur, de nombreuses études ont été menées sur le sujet et c'est dorénavant un phénomène bien connu. La formation du trouble colloïdal est due aux interactions polyphénols-protéines et protéines-protéines. Le trouble dépend du ratio protéines-polyphénols présent dans le moût mais aussi de la teneur en proline des protéines présentes dans le moût, du degré de polymérisation ainsi que du nombre de groupements hydroxyles des polyphénols (Siebert (2006) L 1/1/739:987-994).
Plus particulièrement, dans la bière il a été prouvé que les protéines impliquées dans la formation du trouble étaient les hordéines du malt (Steiner et al. (201 1 ) Eur. Food. Res. Technol. 232:191 -204). La plupart des hordéines disparaissent au cours des process de brassage, hydrolysées par les protéases endogènes du malt. L'analyse des protéines constituant la bière a toutefois montré la présence d'hordéines B et γ3 résiduelles (Perrocheau et al. (2005) Proteomics 5:2849-2858, Jin et al. (201 1 ) J. Food Biochem. 35:1522-1527) qui sont responsables de la formation du trouble.
Afin de stabiliser la bière, de nombreuses alternatives ont été mises en œuvre par les brasseurs pour éliminer les composés impliqués dans le trouble. Des moyens physiques peuvent être mis en œuvre tels que l'élimination des protéines par la bentonite mais cette interaction est aspécifique et élimine les protéines aussi bien impliquées dans la formation du trouble que celles de la mousse. Les mêmes inconvénients sont associés à l'utilisation de l'ultrafiltration.
Il a par ailleurs été proposé d'ajouter des protéines riches en proline, telles que la gélatine, ou des polyphénols, tels que l'acide tannique, dans la boisson avant stockage, de manière à favoriser la précipitation et l'élimination du matériel à l'origine de la formation du trouble. Une autre alternative est d'utiliser des gels de silice qui lient les protéines riches en proline de manière plus spécifique. Ces gels de silice sont toutefois assez peu efficaces pour clarifier les boissons riches en polyphénols. Le polyvinylpolypyrrolidone (PVPP) est souvent utilisé pour extraire la fraction polyphénol. Cependant les polyphénols ont un rôle antioxydant qui peut être bénéfique. La filtration après un passage à basse température induisant la formation du trouble est aussi utilisée mais cette dernière technique a le désavantage d'être longue (plusieurs mois). Des moyens enzymatiques sont également utilisés tels que l'hydrolyse de la fraction protéique par une protéase naturelle à spécificité d'action très large, la papaïne, mais cette dernière dégrade également les protéines de la mousse ce qui est un effet secondaire indésirable. Plus récemment, l'utilisation d'une proline-spécifique endoprotéase dégradant plus spécifiquement les prolamines a été décrite : le Brewers Clarex® qui est une prolyl-endoprotéase recombinante de la classe EC 3.4.21 .26 issue d'un champignon filamenteux : Aspergillus niger (US 8,1 19,171J. Néanmoins, cette endoprotéase peut également dégrader les protéines de la mousse.
Il existe donc toujours un besoin important de moyens alternatifs efficaces pour diminuer le trouble des boissons, en particulier de moyens bons marchés, ne nécessitant pas de modification significative des équipements de fabrication des boissons, et ne présentant pas les inconvénients des techniques connues de l'état de la technique, en particulier n'ayant pas d'impact sur la mousse.
Les grains de céréales, au cours de la germination, produisent des protéases hydrolysant les protéines de réserve pour assurer le développement de la plantule. La présence d'au moins une quarantaine de protéases dans le malt vert a été rapportée par Zhang et Jones (1995) J. Cereal Sci. 21 :145-153. Ces protéases appartiennent aux 4 types existants : sérine, métallo, cystéine et aspartyl-protéases. Il a cependant été démontré que les protéases principalement responsables de la dégradation des prolamines pendant la germination des grains sont des cystéines protéases Shi et Xu (2009) J. Integrative Plant Biol. 51 :52-57). Du fait de l'activité de ces protéases sur les prolamines, il a été proposé de les utiliser afin de diminuer la teneur en peptides inducteur de la réponse immunitaire coeliaque dans les produits céréaliers ou au cours de la digestion de ces produits alimentaires (Stenman et al. (2010) Clin. Exp. Immunol. 161 :242-249). L'ajout de protéase EP-B d'orge recombinante a par ailleurs récemment été proposé comme additif alimentaire dans l'alimentation des porcs, pour augmenter la digestibilité des protéines d'orge insolubles (Christensen et al. (2014) J. Agric. Food Chem. 62:8562-8570J. A la connaissance des inventeurs, aucune de ces applications potentielles n'a été mise en œuvre et aucune autre application de ces cystéine endoprotéases n'a été suggérée jusqu'à présent.
La présente invention résulte de la découverte inattendue par les inventeurs que le malt, en particulier un extrait de malt, contient une activité protéasique capable de diminuer efficacement le trouble de la bière. Les inventeurs ont plus particulièrement démontré que cette activité protéasique implique des cystéine endoprotéases, et plus particulièrement, dans le malt d'orge, les endoprotéases A et B. L'utilité des endoprotéases A et B d'orge est d'autant plus surprenante que, contrairement à de nombreuses protéases, la présence de proline, acide aminé largement présent dans les hordéines, ne semble pas pénaliser leur activité protéolytique. Les cystéine-endoprotéases des céréales sont capables de cliver les domaines répétés N- terminaux des hordéines et gliadines, riches en proline et glutamine (Bethune et al. (2006) Chem. Biol. 13:637-647).
Par ailleurs, les inventeurs ont démontré que cette activité protéasique permettait en parallèle, de manière surprenante d'augmenter le rendement de fermentation lors de la fabrication de la bière.
La présente invention concerne donc l'utilisation d'au moins une cystéine endoprotéase comprenant une séquence au moins 55% identique à la séquence SEQ ID NO : 1 , à la séquence SEQ ID NO : 2, à la séquence SEQ ID NO : 3 et/ou à la séquence SEQ ID NO : 4, ou un fragment de celle-ci présentant une activité cystéine endoprotéase, pour diminuer le trouble d'une boisson, fermentée ou non, à base de céréales.
La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un extrait de malt comprenant une activité endoprotéasique pour diminuer le trouble d'une boisson, fermentée ou non, à base de céréales.
Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation (i) d'au moins une cystéine endoprotéase telle que définie ci-dessus ou (ii) d'un extrait de malt tel que défini ci- dessus, dans la préparation d'une boisson, fermentée ou non, à base de céréales.
La présente invention concerne également un procédé de prévention ou de réduction du trouble d'une boisson, fermentée ou non, à base de céréales, comprenant une étape d'ajout (i) d'au moins une cystéine endoprotéase telle que définie ci-dessus ou (ii) d'un extrait de malt tel que défini ci-dessus, au cours du procédé de fabrication de la boisson.
La présente invention concerne également l'utilisation (i) d'au moins une cystéine endoprotéase telle que définie ci-dessus ou (ii) d'un extrait de malt tel que défini ci- dessus, pour augmenter le rendement de fermentation lors de la fabrication de boissons fermentées, à base de céréales.
La présente invention a également pour objet un procédé de fabrication d'une boisson, fermentée ou non, à base de céréales, comprenant une étape d'ajout, dans le moût ou le jus, (i) d'au moins une cystéine endoprotéase telle que définie ci-dessus ou (ii) d'un extrait de malt tel que défini ci-dessus.
Un autre objet de l'invention concerne une boisson à base de céréales susceptible d'être obtenue par l'un des procédés selon l'invention. Description détaillée de l'invention
Boisson à base de céréales
Par "boisson", on entend ici les boissons à tous les stades de leur préparation. Par conséquent, une boisson n'est pas seulement une boisson prête à être consommée mais également n'importe quelle composition utilisée pour préparer la boisson. De préférence, une boisson dans le contexte de l'invention est une boisson prête à être consommée.
Par "boisson à base de céréales", on entend ici toute boisson dont au moins l'une des matières premières utilisées pour sa préparation provient d'une céréale. La boisson à base de céréales obtenue dans le contexte de l'invention peut ainsi être une boisson à base d'orge, de blé, en particulier de froment, d'avoine, de seigle, de maïs, de riz, de sorgho, de millet, de pseudo-céréales telles que le quinoa ou le sarrasin, ou de mélanges de ceux-ci. De préférence, la boisson à base de céréales obtenue dans le contexte de l'invention est une boisson à base d'orge ou de blé.
La boisson à base de céréales obtenue dans le cadre de l'invention peut être une boisson fermentée ou non fermentée. De préférence, il s'agit d'une boisson fermentée.
Le trouble observé lors du stockage des boissons, fermentées ou non, à base de céréales, est généralement dû aux interactions polyphénols-protéines et/ou protéines- protéines. Par conséquent, dans un mode de réalisation particulier, la boisson, fermentée ou non, à base de céréales obtenue dans le cadre de l'invention comprend des protéines et des polyphénols.
Les inventeurs ont montré que les cystéine endoprotéases et/ou l'extrait de malt étaient particulièrement efficaces pour prévenir ou diminuer le trouble de la bière.
Par conséquent, dans un mode de réalisation particulier, la boisson, fermentée ou non, à base de céréales est un liquide utilisé dans la production de la bière. De manière particulièrement préférée, la boisson, fermentée ou non, à base de céréales est une bière.
Par "bière", on entend ici les bières obtenues à partir de maisches préparées à partir de céréales non-maltées, à partir de maisches préparées à partir de céréales maltées, ou à partir de maisches préparées à partir d'un mélange de céréales maltées et non maltées. Le terme "bière" couvre ici les bières de fermentation basse, c'est-à-dire dont la fermentation est mise en œuvre à une température généralement comprise entre 8 et 12°C, les bières de fermentation haute, c'est-à-dire dont la fermentation est mise en œuvre à une température généralement comprise entre 20 et 25°C, les bières de fermentation simple, double ou triple (dont les températures de fermentation sont modifiées en cours de fermentation), les bières à fermentation spontanée, c'est-à-dire dont la fermentation ne nécessite pas d'ajout de levure dans le moût, les bières à fermentation mixte, c'est-à-dire dont la fermentation combine la fermentation avec une levure et une bactérie (de type lactique ou acidifiante) ou avec deux levures, les bières préparées avec des additifs et les bières avec une gamme de taux d'alcool de 0 à 10%. Diminution du trouble
Les termes "trouble" et "turbidité" sont ici utilisés de manière interchangeable. Le trouble peut être mesuré par toute technique bien connue de l'homme du métier, typiquement au moyen d'un turbidimètre, par exemple inclus dans un Tannometer. Brièvement, dans un turbidimètre, la lumière rayonnée est réfléchie par les particules (turbidité) existantes. La lumière diffusée est ensuite mesurée par un photodétecteur disposé en angle droit (90°C) par rapport à la source lumineuse. La turbidité est exprimée en UTN (Unité de Turbidité Néphélométrique, NTU en anglais) ou en EBC (European Brewery Convention), 1 UTN équivalant à 0,25 EBC. Elle est évaluée de préférence à une température de -8°C. La turbidité est de préférence mesurée au moyen du test Chapon décrit dans Chapon et al. (1993) J. Inst. Brew. 99:49-56, en particulier le test "Alcohol- Chill-Tesf décrit dans Chapon et al. (1993) J. Inst. Brew. 99:49-56. Typiquement, 9,4 ml d'échantillon sont mélangés avec 0,6 ml d'éthanol. Après incubation de préférence pendant au moins 30 min, par exemple pendant 30 min ou 40 min, à -8°C, la turbidité est mesurée à -8°C sur un turbidimètre, typiquement sur un Tannometer, tel que commercialisé par la société Pfeuffer. Les résultats sont alors typiquement exprimés en unités EBC.
Les termes "diminution du trouble", "réduction de la turbidité" et "clarification" sont ici utilisés de manière interchangeable. De préférence, les cystéines endoprotéases et l'extrait de malt utilisés dans le cadre de l'invention permettent de réduire le trouble de la boisson de manière significative par rapport à la même boisson non traitée.
De préférence, les cystéines endoprotéases et l'extrait de malt utilisés dans le cadre de l'invention permettent de réduire la turbidité de la boisson d'au moins 70% par rapport à la même boisson non traitée, de manière davantage préférée d'au moins 71 %, au moins 73%, au moins 74%, au moins 75%, au moins 77%, au moins 80%, au moins 85%, au moins 86%, ou de manière encore préférée d'au moins 93%, au moins 94% ou au moins 95%, en particulier lorsque la turbidité est mesurée à -8°C, plus particulièrement au moyen du test Chapon tel que décrit ci-dessus.
De préférence, les cystéines endoprotéases et l'extrait de malt utilisés dans le cadre de l'invention permettent de réduire le trouble de la boisson d'au moins 65 unités EBC par rapport à la même boisson non traitée, de manière davantage préférée d'au moins 67 unités EBC, au moins 68 unités EBC, au moins 70 unités EBC, au moins 74 unités EBC, au moins 75 unités EBC, au moins 80 unités EBC, au moins 81 unités EBC, au moins 87 unités EBC, au moins 89 unités EBC, au moins 90 unités EBC, au moins 94 unités EBC, au moins 95 unités EBC, au moins 100 unités EBC, au moins 102 unités EBC ou au moins 103 unités EBC, en particulier lorsque la turbidité est mesurée à -8°C, plus particulièrement au moyen du test Chapon tel que décrit ci-dessus.
Augmentation du rendement de fermentation
Par « augmentation du rendement de fermentation », on entend ici qu'à durée équivalente de fermentation, il reste moins de sucres fermentescibles encore présents dans le moût par rapport à différents témoins, en particulier positifs et/ou négatifs. Les témoins négatifs, de préférence deux témoins négatifs, peuvent être constitués par un moût sans aucun ajout et un moût avec ajout d'extrait brut de malt d'orge dénaturé par la chaleur, et le témoin positif peut être constitué par un moût avec ajout de Brewers Clarex®.
Le suivi de la fermentation est typiquement effectué par suivi de la population de levure, et du pourcentage en masse d'extrait sec du moût, exprimé en degrés Plato (noté °Plato). 1 °Plato correspond à 1 g de matière sèche soluble (essentiellement les sucres fermentescibles) pour 100 g de moût. La quantité de sucre comprise initialement dans le moût détermine la quantité d'alcool et de dioxyde de carbone dans la bière produite. Le degré Plato se mesure typiquement au moyen d'un densimètre automatique (densimètre Anton-Paar DMA35).
Les inventeurs ont ainsi montré que les cystéines endoprotéases et l'extrait de malt utilisés dans le cadre de l'invention permettent d'atteindre un °Plato d'au plus 1 à JO+8, lorsqu'ils étaient ajoutés au cours de l'étape de fermentation.
Ainsi, de manière préférée, les cystéines endoprotéases ou l'extrait de malt selon l'invention augmentent le rendement de fermentation de manière à atteindre un °Plato 8 jours après le début de la fermentation d'au plus 1 , de manière davantage préférée d'au plus 0,8, au plus 0.7, au plus 0.6, au plus 0.5 ou au plus 0.2 °Plato, en particulier lorsque la fermentation est effectuée à une température d'environ 13°C et en particulier lorsqu'un moût à 1 1 ° Plato est produit par brassage de type « congress EBC». Cystéine endoprotéase
Par "cystéine endoprotéase" ou "cystéine endopeptidase", on entend ici une enzyme de la classe EC 3.4.22 dont le résidu d'acide aminé nucléophile de la triade catalytique est une cystéine et clivant les protéines à l'intérieur de la chaîne peptidique.
La ou les cystéine endoprotéase(s) utilisée(s) dans le cadre de l'invention comprend, ou consiste, en une séquence au moins 55% identique, de manière davantage préférée au moins 60% identique, au moins 65% identique, au moins 70% identique, au moins 75% identique, au moins 80% identique, au moins 85% identique, au moins 90% identique, au moins 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100 % identique à la séquence SEQ ID NO : 1 , à la séquence SEQ ID NO : 2, à la séquence SEQ ID NO : 3 et/ou à la séquence SEQ ID NO : 4, ou un fragment de celle-ci présentant une activité cystéine endoprotéase.
Par "séquence au moins x% identique à une séquence de référence", on entend ici que la séquence est identique à la séquence de référence ou diffère de la séquence de référence par jusqu'à 100-x altérations d'acides aminés pour chaque 100 acides aminés de la séquence de référence. Les altérations d'acides aminés par rapport à la séquence de référence peuvent être des substitutions, délétions et/ou insertions d'un ou de plusieurs acides aminés, et ceci à des positions telles que ces modifications ne portent pas significativement atteinte à l'activité enzymatique des enzymes. Les substitutions peuvent notamment correspondre à des substitutions conservatives ou à des substitutions d'acides aminés naturels par des acides aminés non naturels ou pseudo-acides aminés. Dans un mode de réalisation particulier, la séquence protéique ne diffère de la séquence de référence que par la présence de substitutions conservatives. Les substitutions conservatives sont des substitutions d'acides aminés de même classe, telles que des substitutions d'acides aminés aux chaînes latérales non chargées (tels que l'asparagine, la glutamine, la serine, la cystéine, et la tyrosine), d'acides aminés aux chaînes latérales basiques (tels que la lysine, l'arginine, et l'histidine), d'acides aminés aux chaînes latérales acides (tels que l'acide aspartique et l'acide glutamique), d'acides aminés aux chaînes latérales apolaires (tels que l'alanine, la valine, la leucine, l'isoleucine, la proline, la phénylalanine, la méthionine et le tryptophane).
L'alignement et la détermination du pourcentage d'identité peut être effectué manuellement ou automatiquement en utilisant par exemple le programme Needle qui est basé sur l'algorithme de Needleman et Wunsch, décrit dans Needleman et Wunsch (1970) J. Mol Biol. 48:443-453, avec par exemple les paramètres suivants pour la comparaison de séquences protéiques : matrice de comparaison : BLOSUM62, gap open penalty = 10, gap extend penalty = 0.5, end gap penalty : false, end gap open penalty = 10, end gap extend penalty = 0.5; et les paramètres suivants pour la comparaison de séquences nucléiques : matrice de comparaison : DNAFULL; gap open penalty = 10, gap extend penalty = 0.5, end gap penalty : false, end gap open penalty = 10, end gap extend penalty = 0.5.
Les séquences SEQ ID NO: 1 et SEQ ID NO: 2 correspondent aux séquences d'acides aminés de cystéine endoprotéases EP-A d'orge.
La cystéine endoprotéase EP-A d'orge est décrite dans Koehler et Ho (1988) Plant Physiol. 87:95-103. EP-A a un poids moléculaire apparent de 37 kDa, et présente une activité optimale à pH de 5,0 et une température de 45°C. Elle est induite par l'acide gibbérellique. Son site de coupure sur des hordéines de type C recombinantes a été caractérisé dans Davy et al. (1998) Plant Physiol. 117:255-261 : EP-A coupe les hordéines après les acides aminés arginine et glutamine, avec une préférence pour l'arginine. La présence, au niveau du site de clivage, d'un acide aminé tel que la phénylalanine, la leucine ou la valine avant l'arginine ou la glutamine, favorise l'hydrolyse tandis que la présence de proline avant ou après ces deux résidus diminue significativement son efficacité catalytique mais ne l'inhibe pas. Les spécificités catalytiques d'EP-A sur les prolamines restent peu caractérisées, même s'il est vraisemblable, sur la base de l'identité de séquence d'EP-A et d'EP-B (52% pour les préproprotéines et 60% pour la protéine maturée) et une conservation stricte des acides aminés du site actif, impliqués dans la catalyse et dans l'ancrage du segment peptidique selon la structure cristallographique du complexe EP B-leupeptine décrite par Bethune et al. (2006), que EP-A et EP-B présentent des spécificités catalytiques identiques. Deux variants de la cystéine endoprotéase EP-A d'orge ont été identifiés: il s'agit des variants de séquences :
MWRCILLSAVVVALALAPAPALGVPFTEKDLASEESLRGLYERWRSHYTVSRRGLGADAEERRFNVFKENAR YVHEGNKRDRPFRLALNKFADMTTDEFRRTYAGSRVRHHLSLSGGRRGDGGFRYADADNLPPAVDWRQKG AVTAIKDQGQCGSCWAFSTIVAVEGINKIRTGKLVSLSEQELMDCDNVNNQGCEGGLMDYAFQFIQKNGITTE SNYPYQGEQGSCDQAKENAQAVTI DGYEDVPANDESALQKAVAGQPVSVAIDASGQDFQFYSEGVFTGECS TDLDHGVAAVGYGATRDGTKYWIVKNSWGEDWGEKGYI RMQRGVSQTEGLCGIAMQASYPTKSAPHASTV REGSHTDEL (SEQ ID NO: 1 )
et
MWRCILLSAVVVALALAPAPALGVPFTEKDLASEESLRGLYERWRSHYTVSRRGLGADAEERRFNVFKQNAR YVHEGNKRDMPFRLALNKFADMTTDEFRRTYAGSRVRHHLSLSGGRRGDGGFRYGDADNLPPAVDWRQKG AVTAIKDQGQCGSCWAFSTIVAVEGINKIRTGKLVSLSEQELMDCDNVNNQGCDGGLMDYAFQFIQKNGITTE SNYPYQGEQGSCDQAKENAQAVTI DGYEDVPANDESALQKAVAGQPVSVAIDASGQDFQFYSEGVFTGECS TDLDHGVAAVGYGATRDGTKYWIVKNSWGEDWGEKGYI RMQRGVSQTEGLCGIAMQASYPTKSAPHASTV
REESHTDEL (SEQ ID NO: 2). Différents domaines ont été identifiés dans les séquences protéiques d'EP-A. Ainsi, les acides aminés 1 à 23 de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2 correspondent au peptide signal et les acides aminés 128 à 365 de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2 correspondent à la chaîne mature (séquences SEQ ID NO: 5 et 6). Le site catalytique d'EP-A n'a pas été caractérisé. Le site catalytique peut toutefois être déduit par homologie avec EP-B comme contenant les acides aminés suivants: cystéine 29, histidine 164, sérine 28, glycine 71 , aspartate 163, asparagine 185, glutamine 23 numérotés sur la base de la séquence des protéines matures de séquence SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6.
Les séquences SEQ ID NO: 3 et SEQ ID NO: 4 correspondent aux séquences d'acides aminés de cystéine endoprotéases EP-B d'orge.
La cystéine endoprotéase EP-B d'orge est décrite dans Koehler et Ho (1990) Plant Physiol. 94:251 -258. EP-B a un poids moléculaire apparent de 30 kDa (Davy et al. (1998) Plant Physiol. 117:255-261 ), et présente une activité optimale à un pH de 4,5 et une température de 40°C pour des substrats protéiques modèles (azocaséine ou hémoglobine). Dans ces conditions optimales, les hordéines sont typiquement clivées en de multiples fragments de masse moléculaire comprise entre 2000 et 25000 Daltons. EP- B est induite par l'acide gibbérellique. Son site de coupure sur des hordéines de type C recombinantes a été caractérisé dans Davy et al. (1998) Plant Physiol. 117:255-261 : EP- B coupe les hordéines après les acides aminés arginine et glutamine, avec une préférence pour l'arginine pour les coupures primaires. La présence, au niveau du site de clivage, d'un acide aminé tel que la phénylalanine, la leucine ou la valine avant l'arginine ou la glutamine, favorise l'hydrolyse. Contrairement à EP-A, EP-B conserve une bonne activité catalytique malgré la présence de proline après ces deux résidus arginine ou glutamine. Des sites secondaires de clivage peuvent être mis en évidence quand l'hydrolyse de la C-hordéine par ΙΈΡ-Β est prolongée. L'endoprotéase peut cliver après une glutamine, une arginine, une tyrosine, une glycine, un acide glutamique, une sérine, une histidine, une leucine. Elle ne coupe apparemment pas en N- ou C-terminal d'une proline dans le cas de la C-hordéine (Davy et al., 1998) et ne peut donc être assimilée à une endoprolidase. Des résultats similaires ont été obtenus pour l'hydrolyse d'une a2- gliadine par ΙΈΡ-Β recombinante et montre une nette préférence pour des coupures en C- terminal de glutamine (Bethune et al., 2006). La spécificité de clivage des cystéines endoprotéases de céréales est par ailleurs très différente de celle des autres cystéine endoprotéases comme la papaïne qui est utilisée pour diminuer le trouble de la bière. La papaïne est en effet relativement peu spécifique (Kimmel et Smith (1954) J. Biol. Chem 207:515-531 ). Deux variants de la cystéine endoprotéase EP-B d'orge ont été identifiés: il s'agit des variants de séquences :
MGLLSKKLLVASMVAAVLAVAAVELCSAI PMEDKDLESEEALWDLYERWQSAHRVRRHHAEKHRRFGTFKSN AHFIHSHNKRGDHPYRLHLNRFGDMDQAEFRATFVGDLRRDTPAKPPSVPGFMYAALNVSDLPPSVDWRQK GAVTGVKDQGKCGSCWAFSTVVSVEGINAIRTGSLVSLSEQELIDCDTADNDGCQGGLMDNAFEYIKNNGGLI TEAAYPYRAARGTCNVARAAQNSPVVVHIDGHQDVPANSEEDLARAVANQPVSVAVEASGKAFMFYSEGVF TGDCGTELDHGVAVVGYGVAEDGKAYWTVKNSWGPSWGEQGYIRVEKDSGASGGLCGIAMEASYPVKTYN KPMPRRALGAWESQ (SEQ ID NO: 3)
et
MGLLSKKLLVASMVAAVLAVAAVELCSAI PMEDKDLESEEALWDLYERWQSAHRVRRHHAEKHRRFGTFKSN AHFIHSHNKRGDHPYRLHLNRFGDMDQAEFRATFVGDLRRDTPSKPPSVPGFMYAALNVSDLPPSVDWRQK GAVTGVKDQGKCGSCWAFSTVVSVEGINAIRTGSLVSLSEQELIDCDTADNDGCQGGLMDNAFEYIKNNGGLI TEAAYPYRAARGTCNVARAAQNSPVVVHIDGHQDVPANSEEDLARAVANQPVSVAVEASGKAFMFYSEGVF TGECGTELDHGVAVVGYGVAEDGKAYWTVKNSWGPSWGEQGYIRVEKDSGASGGLCGIAMEASYPVKTYS KPKPTPRRALGARESL (SEQ ID NO: 4).
Différents domaines ont été identifiés dans les séquences protéiques d'EP-B. Ainsi, les acides aminés 1 à 28 de SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4 correspondent au peptide signal, les acides aminés 29 à 130 de SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4 correspondent au propeptide d'activation et les acides aminés 131 à 371 de SEQ ID NO: 3 (séquence SEQ ID NO: 7) ou 131 à 373 de SEQ ID NO: 4 (séquence SEQ ID NO: 8) correspondent à la chaîne mature. Le site catalytique d'EP-B a en outre été caractérisé. Il implique principalement la cystéine 158 (cystéine 28 pour la protéine mature de séquence SEQ ID NO: 7 ou 8) et l'histidine 297 (histidine 167 pour la protéine mature de séquence SEQ ID NO: 7 ou 8) de SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4.
Dans ces deux protéines, l'aspartate 296 (aspartate 166 dans la protéine mature) intervient dans le positionnement du substrat par rapport à la cystéine 158 (cystéine 28 dans la protéine mature) catalytique (Bethune et al., 2006).
La cystéine endoprotéase utilisée dans le cadre de l'invention peut avoir une activité cystéine endoprotéase A ou cystéine endoprotéase B.
De manière particulièrement préférée, la ou les cystéine endoprotéase(s) utilisée(s) dans le cadre de l'invention est (i) une cystéine endoprotéase A comprenant, ou consistant en, une séquence au moins 55% identique, ou au moins 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% identique, à la séquence SEQ ID NO: 1 et/ou à la séquence SEQ ID NO : 2, et/ou un fragment de celle-ci présentant une activité cystéine endoprotéase A, et/ou (ii) une cystéine endoprotéase B comprenant, ou consistant en, une séquence au moins 55% identique, ou au moins 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% identique, à la séquence SEQ ID NO: 3 et/ou à la séquence SEQ ID NO : 4, et/ou un fragment de celle-ci présentant une activité cystéine endoprotéase B.
De manière préférée entre toutes, la ou les cystéine endoprotéase(s) utilisée(s) dans le cadre de l'invention est (i) la cystéine endoprotéase EP-A d'orge comprenant, ou consistant en, la séquence SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2, et/ou (ii) la cystéine endoprotéase EP-B d'orge comprenant, ou consistant en, la séquence SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4.
Par "fragment" d'une séquence de référence, on entend ici une séquence qui a une taille inférieure à la séquence de référence. Dans le cadre de la présente invention, les fragments peuvent par exemple avoir une taille comprise entre 230 et 373 acides aminés, de 235 à 371 acides aminés, de 236 à 365 acides aminés, de 237 à 350 acides aminés, de 239 à 300 acides aminés, de 240 à 290 acides aminés, de 250 à 280 acides aminés ou de 260 à 270 acides aminés. De préférence, dans le cadre de l'invention, les fragments contiennent le site actif de l'enzyme dont ils sont dérivés. Les fragments utilisés dans le cadre de l'invention peuvent être obtenus par clivage enzymatique ou non enzymatique de l'enzyme mature ou de la proprotéine dont ils sont dérivés, conservant ou amplifiant la spécificité et l'efficacité endoprotéasique.
Les fragments utilisés dans le cadre de la présente invention présentent une activité cystéine endoprotéasique. Des fragments des séquences protéiques définies ci- dessus présentant une activité cystéine endoprotéasique peuvent être identifiés par l'homme du métier par des techniques de routine. En effet, comme il est bien connu de l'homme du métier, les cystéine endoprotéase comprennent un signal peptide et l'activité cystéine endoprotéasique est donc située au niveau de la chaîne mature la cystéine endoprotéase.
Ainsi, dans un mode de réalisation particulièrement préféré, le fragment de cystéine endoprotéase utilisé dans le cadre de l'invention comprend, ou consiste, en une séquence au moins 55% identique, ou au moins 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% identique à la séquence SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 et/ou SEQ ID NO: 8, , ledit fragment présentant une activité cystéine endoprotéasique.
Par ailleurs, comme il est bien connu de l'homme du métier le site catalytique des cystéine endoprotéasique est situé au sein d'une poche contenant la cystéine et une histidine impliquées dans la catalyse et différents acides aminés impliqués dans la fixation et/ou la reconnaissance du site de coupure comme décrit ci-dessus pour EP-A. Des fragments des séquences protéiques définies ci-dessus présentant une activité cystéine endoprotéasique comprendront donc de préférence, ou consisteront de préférence en, des résidus d'acides aminés du site catalytique des cystéines endoprotéases définies ci- dessus.
Ainsi, dans un mode de réalisation préféré, le fragment de cystéine endoprotéase utilisé dans le cadre de l'invention comprend, ou consiste, en un fragment de la préprotéine ou de la protéine mature ou tout fragment protéique fonctionnel contenant les résidus d'acides aminés du site catalytique décrit précédemment.
L'homme du métier pourra ensuite vérifier que ces fragments présentent une activité cystéine endoprotéasique en mesurant leur activité par des techniques bien connues de l'état de la technique, par exemple avec l'utilisation d'inhibiteurs spécifiques des cystéine endoprotéases, tel que ΙΈ64 (Trans-epoxysuccinyl-L-leucocylamido-(-4- guanidino)butane).
Les techniques de mesure d'une activité cystéine endoprotéasique sont en effet bien connues de l'homme du métier. Typiquement, elles comprennent des techniques colorimétriques ou fluorimétriques utilisant des di- ou tripeptides avec un chromophore ou un fluorophore, des techniques utilisant des protéines de réserve des céréales (prolamines) ou des fragments de ces protéines couplées à une analyse des peptides produits par spectrométrie de masse. Typiquement, l'activité cystéine endoprotéasique peut être mesurée en utilisant un peptide fluorescent comme le N-CBZ (benzyloxycarbonyl)-Phe (phénylalanine)-Arg (arginine)- AMC (7-amido-4-methyl- coumarine) dans un tampon citrate 50 mM (pH 4 contenant 2 mM cystéine et 2 mM de β- mercaptoéthanol). Le substrat, N-CBZ-Phe-Arg-AMC, est solubilisé dans le DMSO à une concentration de 100 μΜ et 10 μΙ sont ajoutés à une cuvette en quartz contenant 2 mL du tampon citrate. Entre 10 et 30 μΙ de solution enzymatique sont typiquement ajoutées et l'augmentation de fluorescence est mesurée au cours du temps (excitation 360 nm, émission 460 nm) à la température de 20°C. La vitesse initiale de la réaction est déduite de la mesure de pente de la courbe de l'intensité de fluorescence en fonction du temps. La fluorescence totale est mesurée en utilisant une solution de papaïne à 0.2 μΜ.
La au moins une cysteine endoprotéase utilisée dans le cadre de l'invention peut être utilisée sous forme isolée ou purifiée.
Par "isolé" ou "purifié", on entend ici une cystéine endoprotéase prélevée de son environnement naturel. Par exemple, une cystéine endoprotéase produite de manière recombinante dans des cellules hôtes est considérée comme isolée dans le contexte de l'invention, tout comme un polypeptide recombinant ou natif qui a été purifié substantiellement par n'importe quelle technique appropriée.
La au moins une cystéine endoprotéase utilisée dans le cadre de l'invention peut être sous forme isolée. Elle peut toutefois être mélangée dans des véhicules ou diluants qui n'interféreront pas avec l'effet recherché de cette enzyme, et sera alors toujours considérée comme étant isolée.
La au moins une cystéine endoprotéase utilisée dans le cadre de l'invention peut également être sous forme plus substantiellement purifiée, qui inclura la au moins une cystéine endoprotéase dans une préparation dans laquelle plus de 70%, ou plus de 80%, 90%, 95%, 98% ou 99% des protéines dans la préparation est la au moins une cystéine endoprotéase.
La cystéine endoprotéase utilisée dans le cadre de l'invention peut être sous forme d'un produit naturel brut ou purifié, un produit obtenu par synthèse chimique, un produit obtenu par une technique recombinante à partir d'un hôte eucaryote ou procaryote, tel qu'une cellule bactérienne, de levure, fongique, de plante supérieure, d'insecte ou de mammifère.
Dans un procédé de production par une technique recombinante, un vecteur contenant un acide nucléique codant pour une cystéine endoprotéase est de préférence transféré dans une cellule hôte qui est mise en culture dans des conditions permettant l'expression de la protéine correspondante. L'enzyme produite peut ensuite être récupérée et purifiée. La séquence d'acide nucléique d'intérêt peut être insérée dans un vecteur d'expression, dans lequel elle est liée de manière opérante à un ou des élément(s) permettant son expression ou la régulation de son expression, tels que notamment des promoteurs, activateurs et/ou terminateurs de transcription. Les signaux contrôlant l'expression des séquences nucléotidiques (promoteurs, activateurs, séquences de terminaison...) sont choisis en fonction de l'hôte cellulaire utilisé. A cet effet, les séquences nucléotidiques codant la protéine d'intérêt peuvent être insérées dans des vecteurs à réplication autonome au sein de l'hôte choisi, ou des vecteurs intégratifs de l'hôte choisi. De tels vecteurs seront préparés selon les méthodes couramment utilisées par l'homme du métier, et les clones en résultant peuvent être introduits dans un hôte approprié par des méthodes standard, telles que par exemple l'électroporation ou la précipitation au phosphate de calcium. Des exemples de cellules hôtes incluent notamment des cellules humaines telles que HEK293, PER.C6, des cellules de mammifères non humains telles que CHO, COS, MDCK, des cellules d'insectes telles que les cellules SF9, des bactéries telles que E. coli, des souches de champignon et/ou de levures telles que L40 et Y90.
Dans un mode de réalisation particulier, la au moins une cystéine endoprotéase utilisée dans le cadre de l'invention peut être obtenue à partir d'extraits de végétaux dans lesquels elle est naturellement produite. La au moins une cystéine endoprotéase utilisée dans le cadre de l'invention peut ainsi être obtenue à partir de protoplastes de cellules aleuroniques ou d'une culture cellulaire de la couche aleurone. Les techniques de culture des protoplastes des cellules aleuroniques ou de la couche à aleurone sont bien connues de l'homme du métier et décrites par exemple dans Chrispeels & Varner (1967) Plant Physiol 42:398-406 et Taiz & Jones (1971 ) Planta 101 :95-100. Les cystéine endoprotéases étant induites par l'acide gibbérellique, dans un mode de réalisation particulier, les cellules de la couche aleurone sont cultivées en présence d'acide gibbérellique, de préférence à une concentration d'environ 1 μΜ.
La germination des grains de céréales induisant l'expression de cystéine endoprotéases, la au moins une cystéine endoprotéase utilisée dans le cadre de l'invention peut également être obtenue à partir de grains de céréales germés, en particulier à partir de malt de céréale, tel que décrit dans la section "Extrait de malt" ci- dessous.
Une cystéine endoprotéase utilisée dans le contexte de l'invention peut être obtenue à partir de cultures de cellules recombinantes, à partir de cultures de cellules végétales ou à partir de végétaux ou de parties de végétaux, en particulier à partir de lysats et extraits de cellules, de végétaux ou de parties de végétaux, ou du surnageant du milieu de culture, par des techniques bien connues de l'homme du métier, utilisées individuellement ou en combinaison, telles que la précipitation au sulfate d'ammonium ou à l'éthanol, l'extraction acide, des méthodes chromatographiques, des techniques d'immunoaffinité à l'aide d'anticorps mono- ou polyclonaux spécifiques, etc.
Elle peut également être obtenue sous forme brute, par simple extraction à partir de cultures de cellules recombinantes, à partir de cultures de cellules végétales ou à partir de végétaux ou de parties de végétaux, ou du surnageant du milieu de culture.
Ainsi dans un mode de réalisation particulier, la au moins une cystéine endoprotéase est utilisée sous forme d'extrait de malt tel que défini à la section "Extrait de malt ci-dessous.
Extrait de malt
Par "malt", on entend ici une céréale germée obtenue par un procédé de maltage.
Le malt peut être obtenu par toute technique de maltage bien connue de l'homme du métier. Le maltage se déroule typiquement en 4 étapes incluant le trempage qui permet d'humidifier le grain, la germination lors de laquelle le grain commence à germer et qui donne naissance au "malt vert", le touraillage lors duquel le malt vert est séché pour obtenir un malt sec, et le dégermage lors duquel le malt est débarrassé de ses radicelles. De préférence, le malt utilisé dans le cadre de l'invention est un malt sec. De manière particulièrement préférée, le malt utilisé dans le cadre de l'invention est un malt sec obtenu après 5 à 1 1 jours de germination.
Le malt utilisé dans le cadre de l'invention est de préférence un malt de céréale, en particulier un malt d'orge, de seigle ou de blé, de manière plus particulièrement préférée un malt d'orge, plus particulièrement un malt d'orge d'hiver ou un malt d'orge de printemps.
Le malt utilisé dans le cadre de l'invention peut être un malt diastasique ou non- diastasique.
Par "extrait de malt", on entend ici une préparation obtenue suite à l'extraction d'un malt avec un solvant approprié tel que, par exemple, de l'eau, des tampons aqueux, de l'éthanol, un mélange de ceux-ci, des huiles ou d'autres tampons aqueux appropriés bien connus dans le domaine des extractions végétales. L'extrait de malt utilisé dans le cadre de l'invention peut en particulier être un extrait de malt, de préférence de malt sec, éventuellement concentré.
L'extrait de malt utilisé dans le cadre de l'invention peut être sous forme lyophilisée et éventuellement remis en suspension avant utilisation.
L'extrait de malt utilisé dans le cadre de l'invention comprend une activité endoprotéasique.
Par "activité endoprotéasique", on entend ici une activité enzymatique protéasique capable de cliver une protéine ou un peptide à l'intérieur de la chaîne peptidique. Les techniques pour mettre en évidence une activité endoprotéasique sont bien connues de l'homme du métier et décrites dans la section "Cystéine endoprotéase" ci-dessus.
De préférence, l'extrait de malt comprenant une activité endoprotéasique utilisé dans le cadre de l'invention entraine une diminution de la turbidité d'une boisson, fermentée ou non, à base de céréales, telle que définie dans la section "Boisson à base de céréales" ci-dessus, par rapport à une boisson non traitée, d'au moins 70%, de manière davantage préférée d'au moins 75%, au moins 80%, au moins 85%, au moins 90%, ou de manière encore préférée d'au moins 95%, en particulier lorsque la turbidité est mesurée à -8°C, plus particulièrement au moyen du test Chapon tel que décrit dans la section "Diminution du trouble" ci-dessus.
De préférence, l'extrait de malt comprenant une activité endoprotéasique utilisé dans le cadre de l'invention entraine une diminution de la turbidité d'une boisson, fermentée ou non, à base de céréales, telle que définie dans la section "Boisson à base de céréales" ci-dessus, par rapport à une boisson non traitée, d'au moins 65 unités EBC, de manière davantage préférée d'au moins 70 unités EBC, au moins 75 unités EBC, au moins 80 unités EBC, au moins 85 unités EBC, au moins 90 unités EBC, au moins 95 unités EBC, ou au moins 100 unités EBC, en particulier lorsque la turbidité est mesurée à -8°C, plus particulièrement au moyen du test Chapon tel que décrit dans la section "Diminution du trouble" ci-dessus.
Un extrait de malt présentant de telles caractéristiques peut être typiquement un extrait de malt brut obtenu par récupération du surnageant de centrifugation d'un malt, tel que défini ci-dessus, broyé mis en suspension dans une solution aqueuse.
De manière davantage préférée, un extrait de malt présentant de telles caractéristiques est un extrait de malt traité obtenu par récupération et filtration de centrifugation d'un extrait de malt brut tel que défini ci-dessus, traité par précipitation différentielle au sulfate d'ammonium, en particulier traité entre 15% et 20%, de préférence à 26%, de saturation au sulfate d'ammonium, puis éventuellement à au moins 50%, de préférence à 89%, de saturation au sulfate d'ammonium, ou par tout pourcentage de saturation au sulfate d'ammonium bien connu de l'homme du métier.
Comme montré dans les exemples, les inventeurs ont en effet démontré qu'un extrait de malt obtenu par l'une de ces techniques permettait de diminuer le trouble d'une boisson, fermentée ou non, à base de céréales, dans une proportion conforme à celle mentionnée ci-dessus. L'extrait de malt utilisé dans le cadre de l'invention peut toutefois être obtenu par toute technique comprenant des étapes supplémentaires d'extraction et/ou de purification bien connues de l'homme du métier, telles que des techniques de chromatographies échangeuses d'ions, de chromatographie d'exclusion de taille ou de chromatographie d'interaction hydrophobe.
Les inventeurs ont par ailleurs montré qu'un extrait de malt obtenu par l'une de ces techniques comprenait une activité cystéine endoprotéasique.
De préférence, l'extrait de malt utilisé dans le cadre de l'invention comprend donc une activité cystéine endoprotéasique, comme définie à la section "Cystéine endoprotéase" ci-dessus. De manière davantage préférée, l'extrait de malt utilisé dans le cadre de l'invention comprend une activité cystéine endoprotéase A et/ou cystéine endoprotéase B, telle que définie à la section "Cystéine endoprotéase" ci-dessus.
Les inventeurs ont également montré qu'un extrait de malt obtenu par l'une de ces techniques permettait d'augmenter le rendement de fermentation lors de la fabrication de boissons fermentées, à base de céréales.
Procédé de prévention ou de réduction du trouble et procédé de fabrication de boisson La présente invention concerne également un procédé de prévention ou de réduction du trouble d'une boisson, fermentée ou non, à base de céréales, telle que définie à la section "Boisson à base de céréales ci-dessus", comprenant une étape d'ajout (i) d'au moins une cystéine endoprotéase telle que définie dans la section "Cystéine endoprotéase" ci-dessus ou (ii) d'un extrait de malt tel que défini dans la section "Extrait de malf ci-dessus, au cours du procédé de fabrication de la boisson.
La présente invention concerne également l'utilisation (i) d'au moins une cystéine endoprotéase telle que définie dans la section "Cystéine endoprotéase" ci-dessus ou (ii) d'un extrait de malt tel que défini dans la section "Extrait de malt" ci-dessus, dans la préparation d'une boisson, fermentée ou non, à base de céréales, telle que définie dans la section "Boisson à base de céréales" ci-dessus.
La présente invention a également pour objet un procédé de fabrication d'une boisson, fermentée ou non, à base de céréales, telle que définie dans la section "Boisson à base de céréales" ci-dessus, comprenant une étape d'ajout (i) d'au moins une cystéine endoprotéase telle que définie dans la section "Cystéine endoprotéase" ci-dessus ou (ii) d'un extrait de malt tel que défini dans la section "Extrait de malf ci-dessus, en particulier dans le jus ou le moût.
Les étapes d'un procédé de fabrication d'une boisson, fermentée ou non, à base de céréales, sont bien connues de l'homme du métier et peuvent varier selon la boisson fabriquée, en particulier selon que la boisson est une boisson fermentée ou non.
La prévention ou réduction du trouble de la boisson obtenue grâce à la présente invention étant obtenue du fait d'une activité enzymatique, l'étape d'ajout (i) d'au moins une cystéine endoprotéase telle que définie dans la section "Cystéine endoprotéase" ci- dessus ou (ii) d'un extrait de malt tel que défini dans la section "Extrait de malf ci-dessus, peut être mise en œuvre à n'importe quel stade du procédé de fabrication de la boisson qui n'est pas suivi d'une étape susceptible de détruire l'activité endoprotéasique.
De telles étapes susceptibles de détruire l'activité endoprotéasique sont bien connues de l'homme du métier, et incluent par exemple des étapes de traitement à des températures élevées, en particulier à des températures supérieures à 62°C, en particulier supérieures à 65°C, voire 68°C, telles que des étapes de saccharification ou d'ébullition.
Ainsi, dans un mode de réalisation particulier, l'étape d'ajout est mise en œuvre après l'étape de saccharification et/ou d'ébullition du procédé de fabrication de la boisson.
Dans un mode de réalisation particulier, lorsque la boisson fabriquée est une boisson à base de céréales fermentée, en particulier lorsque la boisson fabriquée est une bière, ladite au moins une cystéine endoprotéase ou ledit extrait de malt est ajouté au cours de l'étape de fermentation du procédé de fabrication de la boisson, de préférence au début de l'étape de fermentation du procédé de fabrication de la boisson. Comme il est bien connu de l'homme du métier, plusieurs types de fermentations peuvent être mises en œuvre pour produire une boisson fermentée à base de céréales, en particulier une bière. Ainsi, ladite au moins une cystéine endoprotéase ou ledit extrait de malt peut être ajouté au cours d'une étape de fermentation basse, au cours d'une étape de fermentation haute ou au cours d'une étape de fermentation spontanée.
De préférence, la boisson en cours de fabrication est ainsi mise en contact avec ladite au moins une cystéine endoprotéase ou ledit extrait de malt pendant une durée appropriée pour permettre aux enzymes de dégrader les protéines responsables du trouble. Une telle durée dépendra des conditions d'incubation de la cystéine endoprotéase ou de l'extrait de malt avec la boisson en cours de fabrication, en particulier des conditions de température et de pH.
Les inventeurs ont montré que la durée habituelle de l'étape de fermentation au cours du procédé de fabrication d'une bière, qu'il s'agisse d'une fermentation basse ou haute, était particulièrement appropriée pour obtenir une prévention ou diminution du trouble de la bière telle que définie dans la section "Diminution du trouble" ci-dessus.
Ainsi, dans un mode de réalisation particulier, la boisson en cours de fabrication est mise en contact avec ladite au moins une cystéine endoprotéase ou ledit extrait de malt pendant 8 à 12 jours, de préférence pendant 10 jours, à une température comprise entre 10 et 12°C, de préférence à une température de 12°C, de préférence à un pH de départ de 5,3-5,4, le pH final pouvant atteindre 4,2-4,3 du fait de l'évolution naturelle du pH au cours de la fermentation.
Dans un autre mode de réalisation particulier, la boisson en cours de fabrication est mise en contact avec ladite au moins une cystéine endoprotéase ou ledit extrait de malt pendant 4 à 8 jours, de préférence pendant 6 jours, à une température comprise entre 20 et 25°C, de préférence à un pH de départ de 5,3-5,4.
Typiquement le procédé de fabrication de bière selon l'invention comprend les étapes suivantes :
a) une étape de maltage ou de fourniture du malt,
b) une étape de concassage ou broyage du malt obtenu à l'étape a),
c) une étape de mélange du malt broyé à l'étape b) avec de l'eau de préférence tempérée pour former une maische,
d) une étape de saccharification de la maische obtenue à l'étape c) pour former un moût, de préférence par décoction, infusion par palier ou infusion simple, e) une étape de filtration pour obtenir le moût primitif,
f) une étape d'ébullition comprenant une étape de houblonnage amérisante et aromatisante, g) une étape de séparation tangentielle "whirlpool" ou par centrifugation pour séparer le trouble du moût,
h) une étape de refroidissement, d'ensemencement et d'oxygénation du moût, i) une étape de fermentation, en particulier basse, haute ou spontanée, en présence de levures, au cours de laquelle, de préférence au début de laquelle, ladite au moins une cystéine endoprotéase ou ledit extrait de malt est ajouté, j) une étape de garde du produit fermenté obtenu à l'étape g),
k) une étape de filtration et séparation des levures, et
I) une étape de conditionnement.
Les étapes a) à h) et j) à I) peuvent être mises en œuvre de manière conventionnelle dans des conditions bien connues de l'homme du métier.
Lors de l'étape i) de fermentation, le moût est de préférence mis en contact avec ladite au moins une cystéine endoprotéase ou ledit extrait de malt pendant 8 à 12 jours, de préférence pendant 10 jours, à une température comprise entre 8 et 14°C, de préférence à une température de 12°C, de préférence à un pH de départ de 5,3-5,4, ou pendant 4 à 8 jours, de préférence pendant 6 jours, à une température comprise entre 15 et 20°C, de préférence à un pH de départ de 5,3-5,4.
Les procédés selon l'invention peuvent en outre comprendre une étape d'ajout d'une enzyme auxiliaire permettant de réduire ou de prévenir la formation d'un trouble. De tels enzymes auxiliaires permettant de réduire ou de prévenir la formation d'un trouble sont bien connues de l'homme du métier, et incluent par exemple le Brewers Clarex® commercialisé par DSM, ou la papaïne.
Les boissons obtenues par les procédés selon l'invention diffèrent des boissons obtenues par les procédés de fabrication de l'état de la technique dans la mesure où elles contiennent la cystéine endoprotéase ou l'extrait de malt introduits au cours des procédés selon l'invention, que les enzymes soient inactivées ou pas, et ladite cystéine endoprotéase ou ledit extrait de malt modifient la composition en peptides et protéines du produit obtenu, permettant la prévention ou diminution de la formation du trouble, habituellement dû à la présence de protéines résiduelles.
La présente invention a donc également pour objet une boisson à base de céréales, en particulier fermentée ou non, telle que définie à la section "Boisson à base de céréales" ci-dessus, de préférence une bière, susceptible d'être obtenue par les procédés selon l'invention. La présente invention sera illustrée plus en détail par les figures et exemples ci- dessous.
Brève description des figures
Figure 1 : Schéma récapitulatif du protocole d'obtention des extraits de malt d'orge mis en œuvre dans l'exemple 3.
Figure 2 : Effet sur le trouble colloïdal de la bière (test Chapon) des extraits et fractions obtenues dans l'exemple 3. A : Témoin négatif (1 ml_ de Tp Citrate 0,1 M pH 4,3 + 1 ml_
Tp Tris 50 mM pH 7,5); B : Témoin négatif (1 ml_ Tp Citrate 50 mM pH 5) ; C : Témoin positif (190 μΙ_ de Brewers Clarex® dilué 1/25 + 1 mL Tp Citrate 0,1 M pH 4,3) ; D : extrait brut (EB) ; E : surnageant 15% SA pH 4,3 ; F : C 65% SA dia (Tp Citrate 50 mM pH 5) ;
G : non retenu (NR) sur colonne échangeuse de cations (SP) ; H : avant colonne DEAE (NR SP dia pH 7,5) ; I : NR DEAE 42-82 ; J : NR DEAE 83-95 ; K : NR DEAE 96-150 : L :
NR DEAE 151 -fin ; M : fraction 16 ; N : fraction 21 : O : fraction 25 ; P : fraction 31 ; Q ; fraction 38 ; R : fraction 46 ; S : fraction 55.
Figure 3 : Chromatogramme de l'hydrolyse des gliadines avec DTT par les enzymes du malt d'orge et le Brewers Clarex® en HPLC sur Luna C18 décrite dans l'exemple 3.
Figure 4 : Zoom d'un chromatogramme de l'hydrolyse des β-lactoglobulines avec DTT par les enzymes du malt d'orge et le Brewers Clarex® en HPLC sur Luna C18 décrite dans l'exemple 3.
Figure 5 : Cinétique sur 6 h de l'hydrolyse du peptide Z-Gly-Pro-pNA par les enzymes du malt d'orge et le Brewers Clarex® à pH 4 décrite dans l'exemple 3.
Figure 6 : Cinétique sur 6 h de l'hydrolyse du peptide Z-Gly-Pro-pNA par les enzymes du malt d'orge et le Brewers Clarex® à pH 5 décrite dans l'exemple 3.
Figure 7 : Cinétique sur 6 h de l'hydrolyse du peptide Z-Phe-Arg-pNA par les enzymes du malt d'orge et le Brewers Clarex® à pH 4 décrite dans l'exemple 3. Figure 8 : Cinétique sur 6 h de l'hydrolyse du peptide Z-Phe-Arg-pNA par les enzymes du malt d'orge et le Brewers Clarex® à pH 5 décrite dans l'exemple 3. Figure 9 : Effet sur le trouble colloïdal de la bière (test Chapon) des différents extraits testés dans l'exemple 1 .
Figure 10 : Effet sur le trouble colloïdal de la bière (test Chapon) des différents extraits testés dans l'exemple 2.
Figure 11 : Chromatogramme de l'hydrolyse des gliadines par les enzymes du malt d'orge et l'extrait brut de malt en HPLC sur Luna C18 décrite dans l'exemple 4. L'absorbance est mesurée à 214 nm.
Figure 12 : Effet sur la fermentation de l'extrait de malt décrit dans l'exemple 5.
Description des séquences
Exemples
Exemple 1 : Diminution du trouble de la bière avec différents types de malt d'orge
Cet exemple montre qu'un extrait de malt obtenu de différents types d'orge peut être utilisé pour clarifier la bière.
Matériel et méthodes
Extraction
50 g de malt fini de différents types d'orge ont été extraits dans 200 mL de Tampon citrate 0,1 M pH 4,3 conservé au réfrigérateur à 4°C. Ils ont été mixés dans un blender pendant 40 secondes à vitesse maximale, puis centrifugés à 3660 rpm pendant 10 min à 14°C. Le surnageant a été récupéré et filtré avec un papier filtre pour retirer les particules en suspensions.
Bière non stabilisée
La bière utilisée dans cet exemple est la Bière Fink'bràu 33 cL en cannette conservée à température ambiante (21 °C), filtrée sur papier filtre, et dégazée pendant 20 min dans un bain à ultra-sons.
Echantillons
Le Témoin positif (T+) correspond à 0,75 mL de Brewers Clarex® dilué au 1/25 +
Bière non stabilisée qsp 50 mL.
Le Témoin négatif (T-) correspond à 4 mL de Tampon citrate 0,1 M pH 4,3 + qsp 50 mL de bière non stabilisée.
Les échantillons testés dont des extraits des malts d'orge suivants: Metaxa 3086 Ngt 1 , Metaxa 3352 Ngt 1 , Esterel 23036 B2PI, Esterel 23145 B1 PO, Arturio 23005 B2PR, Arturio 23182 B1 PO, Azurel 23054 B2PR, Azurel 23108 B2PR, Cervoise 23094 Ngt 1 , Cervoise 3453 Ngt 1 , Cartel 2965 Ngt 1 , Cartel 3259 Ngt 1 , Béatrix 23050 B2SA, Béatrix 23189 B2SA, Sébastian 993 Ngt 2, Sébastian 231 19 B2PI, Grâce 23076 B3ST, Grâce 23219 B3ST, Prestige 23077 B3ST, Chili 23151 B3ST, Tipple 23192 B2PR, Tipple 23249 B2SA, Chamonix 404 Ngt 2, Chamonix 3227 Ngt 1 , Charmey 436 Ngt 2, Charmey 897 Ngt 2, Henley 3319 Ngt 1 , Henley 3328 Ngt 1 .
Les échantillons testés sont constitués de 4 mL d'extrait + Bière non stabilisée qsp
50 mL.
Les mélanges ont été incubés pendant 17h au bain-marie à 37°C.
Test Chapon
Les Témoins et les échantillons ont été incubés à 37°C pendant au minimum 5h. Dans des tubes à essai en plastique transparents (polystyrène), 0,6 mL d'éthanol 96% (=6%) ont été mélangés avec qsp 10 mL d'échantillon (x2).
Le mélange a été incubé 30 min à -8°C dans un bain cryostaté.
La turbidité a été mesurée au turbidimètre à -8°C.
Résultats
Les résultats sont présentés dans la Figure 9. Ces résultats montrent qu'une diminution de la turbidité est observée quel que soit le type d'orge à partir duquel l'extrait de malt a été obtenu. Exemple 2 : Diminution du trouble de la bière avec du malt de blé Cet exemple montre qu'un extrait de malt de blé peut être utilisé pour clarifier la bière.
Matériel et méthodes
Extraction
50 g de malt fini de différents types d'orge ont été extraits dans 200 mL de Tampon citrate 0,1 M pH 4,3 conservé au réfrigérateur à 4°C. Ils ont été mixés dans un blender pendant 40 secondes à vitesse maximale, puis centrifugés à 3660 rpm pendant 10 min à 14°C. Le surnageant a été récupéré et filtré avec un papier filtre pour retirer les particules en suspensions. Bière non stabilisée
La bière utilisée dans cet exemple est la Bière Fink'bràu 33 cL en cannette conservée à température ambiante (21 °C), filtrée sur papier filtre, et dégazée pendant 20 min dans un bain à ultra-sons. Echantillons
Le Témoin positif (T+) correspond à 0,75 mL de Brewers Clarex® dilué au 1/25 + Bière non stabilisée qsp 50 mL.
Le Témoin négatif (T-) correspond à 4 mL de Tampon citrate 0,1 M pH 4,3 + qsp 50 mL de bière non stabilisée.
Les échantillons testés dont des extraits de malt d'orge et de blé suivants: Malt d'orge Chili 22304 B2BR, Malt d'orge Arturio 23175 B1 CA, Malt d'orge diastasique Arturio 231 12 B2BR, Malt de Blé Apache 23086 (Arcis sur Aube) et Malt de Blé Bagou (Arcis sur Aube).
Les échantillons testés sont constitués de 0,5, 1 , 2, 3 ou 4 mL d'extrait + Bière non stabilisée qsp 50 mL.
Les mélanges ont été incubés pendant 17h au bain-marie à 37°C.
Test Chapon
Les Témoins et les échantillons ont été incubés à 37°C pendant au minimum 5h. Dans des tubes à essai en plastique transparents (polystyrène), 0,6 mL d'éthanol 96% (=6%) ont été mélangés avec qsp 10 mL d'échantillon (x2). Le mélange a été incubé 30 min à -8°C dans un bain cryostaté.
La turbidité a été mesurée au turbidimètre à -8°C.
Résultats
Les résultats sont présentés dans la Figure 10. Ces résultats montrent qu'une diminution de la turbidité est également observée avec du malt de blé diastasique, ainsi que du malt d'orge diastasique.
Exemple 3 : Identification dans l'extrait de malt d'enzymes responsables de l'effet sur la turbidité
Cet exemple montre l'effet d'extraits de malt sur le trouble de la bière et l'implication de cystéine endoprotéases d'orge dans cet effet.
Matériels et méthodes
Matériels
Le malt utilisé pour les différentes expériences provient de grains d'orge de la variété Beatrix (Hordeum vulgare) maltés par les malteries Soufflet (Nogent sur Seine /Aube) mais les enzymes sont présentes dans toutes les variétés d'orge qu'elles soient d'hiver (deux ou six rangs) ou de printemps.
Le malt a été broyé dans un vibrating feeder L 24 de chez Fritsch (Allemagne).
Les différents produits utilisés pour les tampons et les gels d'électrophorèses proviennent des fournisseurs Alfa Aesar, Carbo Erba et Sigma. L'acrylamide 40% vient de chez Fisher Scientific.
Le dosage colorimétrique des protéines a été réalisé avec le kit BC Assay d'Uptima Interchim.
Les chromatographies échangeuses d'ions ont été faites sur des FPLC Akta explorer 100 et Akta Prime (GE Healthcare, USA) avec des colonnes XK 26/10 et des gels Sepharose SP Fast Flow (FF) 50 ml et Sepharose DEAE FF (GE Healthcare, USA). La séparation est également faisable sur d'autres types de colonnes échangeuses de cations et d'anions.
Les gels filtrations ont été faites sur des FPLC Akta explorer 10 (Amersham Pharmacia Biotech) et Akta explorer 100 (GE Healthcare, USA) avec des colonnes Sephadex HR (High Resolution) S200 (16/60) et Superose 12 (10/30). La détection des protéines a été effectuée par spectroscopie à 3 longueurs d'onde : 215, 260 et 280 nm.
Les analyses en HPLC ont été réalisées sur un appareil Alliance HT Waters 2795 séparation module/ Waters 2487 Dual λ absorbance detector, et la colonne utilisée était une Luna 5μ (C18) 100À (250 x 4,60 mm) (Phenomenex). La détection des protéines a été effectuée par spectroscopie à 2 longueurs d'onde : 214 et 280 nm.
Les échantillons ont été analysés par spectrométrie de masse, après hydrolyse trypsique, sur nano LC-MS/MS ESI ORBITRAP Velos. Les analyses peptidiques ont été réalisées avec le logiciel Mascot 2.2.
La modélisation des enzymes a été réalisée avec le logiciel Modeller 9.14.
La centrifugeuse est une Beckman Avanti (USA) J26 XP (rotor : FiberLite® F10BCI - 6x500y)
Le trouble a été mesuré sur un tannometer Pfeuffer (Allemagne) après passage dans un cryothermostat à immersion Hubert Variostat CC. La bière témoin non stabilisée est une Finkbràu (Lidl) et le témoin positif est le Brewers Clarex® (DSM, Pays-Bas).
Les gliadines (totales) ainsi que les β-lactoglobulines utilisées pour les tests d'hydrolyse ont été fournies et purifiées par l'INRA de Nantes (Unité BIA centre Angers- Nantes / Loire Atlantique).
Le peptide Z-GP-pNA ainsi que le peptide Z-FR-pNA proviennent de chez Bachem (Suisse).
La lecture de la DO a été faite par un lecteur de plaques Epoch (Biotek, USA). Les membranes de dialyse étaient des membranes visking (Medicell Int.) de seuil de coupure 12-14000 Da. Préparation des tampons
Le tampon citrate 0,1 M pH 4,3 a été préparé avec de l'acide citrique 0,1 M (PM = 210,14 g/mol L"1) et ajusté à pH 4,3 par l'ajout de citrate de sodium à 0,1 M (PM = 294,1 g/mol L"1). Pour les autres tampons citrate utilisés, ils ont été préparés également avec les solutions à la molarité indiquée et ajustés au pH voulu par ajout de citrate de sodium.
Le tampon acétate 50 mM pH 4 a été préparé avec de l'acide acétique 50 mM et ajusté à pH 4 par l'ajout d'acétate de sodium à 50 mM (PM = 136,08 g/mol L"1).
Le tampon Tris/HCI 50 mM pH 7,5 a été préparé avec du Tris 50 mM et ajusté à pH 7,5 par l'ajout d'acide chlorhydrique (HCI).
Le tampon acide citrique 0,1 M/ disodium phosphate 0,2 M (PM = 177,99 g/mol L" 1) a été préparé avec de l'acide citrique 0,1 M et ajusté à pH 4 (ou 5) par l'ajout de disodium phosphate 0,2 M. Le tampon pour le test de lyophilisation a été préparé avec du tampon Tris/HCI 100 mM pH 8,5 (PM T5ris = 121 ,14 g/mol L"1) dans lequel a été ajouté de l'EDTA (Ethylene diamine tetra acetic acid) 5 mM (PM = 292,24 g/mol L"1), de la cystéine 2 mM (PM = 121 ,2 g/mol L"1), 4% de mannitol (p/v) et 1 % de saccharose (p/v)
Préparation de l'extrait
Les grains de malt ont été broyés sous azote liquide à 0,5 mm. 48 g de MSi (Matière Sèche initiale) de farine ont été mis en suspension dans 200 mL de tampon citrate 0,1 M pH 4,3 sous agitation magnétique à 7°C pendant 30 minutes. Après centrifugation à 10 000 rpm, pendant 20 minutes à 7°C, le surnageant a été récupéré et filtré sur papier filtre. Il est dénommé « extrait brut » (EB). Cet EB a été traité à 26% de saturation au sulfate d'ammonium ((NH4)2 S04) (SA) soit 15% p/v sous agitation magnétique à 7°C pendant 30 minutes. S'en est suivie une seconde centrifugation à 10 000 rpm, pendant 20 minutes à 7°C. Le surnageant a été récupéré et filtré sur papier filtre. Ainsi le « surnageant traité à 15% de sulfate d'ammonium » (SN-15%-SA) a été obtenu. Du SA a été rajouté au SN-15%-SA de façon à atteindre 89% de saturation soit 65% p/v final. Après 1 H30 à 7°C sous agitation magnétique à 7°C l'extrait a été centrifugé de nouveau à 10 000 rpm, pendant 20 minutes à 7°C. Le surnageant a été éliminé et le culot obtenu a été remis en suspension dans 50 mL de tampon citrate 0,1 M pH 4,3 et dialysé tout d'abord 30 minutes dans 2 L d'eau distillée, suivie de deux bains de 2 h chacun dans 2 L de tampon citrate 50 mM pH 5 puis une nuit contre 5 L de tampon citrate 50 mM pH 5 afin d'obtenir l'extrait final appelé C65%SA dia pH 5 (Culot 65% Sulfate d'ammonium dialysé pH 5) qui est également l'« Avant Colonne » (AC) pour le passage sur la SP Sepharose FF (Figure 1 ).
Test Chapon
L'ensemble des tests d'efficacité de réduction de la turbidité de la bière a été fait via le test Chapon (Chapon (1993) J. Inst. Brew. 99:49-56). 2 mL d'échantillon ont été mélangés à 25 mL qsp de bière non stabilisée puis incubés à 37°C pendant au minimum 5 h dans un bain Marie. Dans des tubes à essai en polystyrène, 9,4 mL d'échantillon incubés ont été prélevés et 0,6 mL d'éthanol 96% ont été ajoutés. Les essais ont été faits en duplicata. Après incubation pendant 30 min à -8°C dans un bain cryostaté la turbidité a été mesurée à -8°C sur un tannometer Pfeuffer. Les résultats sont exprimés en EBC (European Brewery Convention) (0,25 EBC = 1 NTU (Nephelos Turbidity Unit)). Chromatographies échangeuses d'ions
Chromatographie échangeuse de cations - Dans un premier temps, l'extrait (C65%SA dialysées à pH 5) a été déposé sur une colonne (XK 26/10) Sepharose SP FF équilibrée dans du tampon citrate 50 mM pH 5 (= tp A), débit= 13 ml/min (147 cm/h). L'élution a été effectuée en augmentant la force ionique par un gradient linéaire de 0 à 50% de tampon B (tp A + NaCI 1 M) en 25 CV (Volume de Colonne). Après un plateau à 50% de B pendant 2 CV, la colonne a été rincée à 100% B en 7 CV, puis rééquilibrée en tampon A. Des fractions de 15 ml ont été collectées. Seule la fraction « non retenue » active au test Chapon a été récupérée (NR SP).
Chromatographie échangeuse d'anions - Après dialyse deux fois 2 h puis 1 nuit, dans des bains de 5 L de tampon Tris 50 mM pH 7,5 (= tp A2), le NR SP a été déposé sur une colonne Sépharose DEAE FF, équilibrée par le tampon A2, débit = 5 ml/min et l'élution a été effectuée par un gradient linéaire de 0 à 30% de tampon B2 (Tris 50 mM pH 7,5 + NaCI 1 M) en 80 min puis par un palier de 10 min à 30% et un palier de 20 min à 100% de tampon B2. Les fractions collectées étaient de 2 mL.
Gel filtration
Colonne Sephadex S200 - 5 mL (soit 4,4 mg de protéines) de la fraction SP/DEAE contenant ΙΈΡ-Β ont été déposés sur la colonne Sephadex S200. Le débit était à 0,5 mL/min et le tampon utilisé était du tampon citrate 50 mM pH 4,5. Les fractions collectées étaient de 5 mL.
Colonne Superose 12 - 1 ,5 mL (soit 1 ,75 mg de protéines) de la fraction SP/DEAE contenant ΙΈΡ-Α ont été déposés sur la colonne Sephadex S200. La fraction a été préalablement concentrée sur cellule Amicon Ultra 10KDa de 0,5mL (Millipore, Irlande). Le débit était de 0,8 mL/min et le tampon utilisé était du tampon citrate 50 mM pH 4,5. Les fractions collectées étaient de 2 mL.
Electrophorèses (SDS-PAGE, PAGE, zymogrammes, tricine)
SDS-PAGE - Les différents échantillons ont été analysés en SDS-PAGE avec un gel de séparation à 12% d'acrylamide et un gel de concentration à 5% selon la technique de Laemmli (Laemmli (1970) Nature 227:680-685J. La migration a été réalisée à température ambiante dans une cuve à électrophorèse verticale Atto sous 10 mA dans le gel de concentration puis 20 mA dans le gel de séparation. Selon les gels, les colorations ont été faites au bleu de Coomassie R250 ou au bleu de Coomassie G250. Dans les puits, 5 μ\- de standards de poids moléculaires connus et 20 μ\- d'échantillon ont été déposés. Avant dépôt, les échantillons ont été préparés comme suit : 40 μ\- d'échantillon + 20 μ\- de solution de dénaturation (Tris 50 mM pH 6,8, glycérol 20%, SDS 4%, bleu de bromophénol 0,01 %) + 3 μΙ_ de β-mercapto-éthanol.
Native PAGE - Le protocole était le même que pour les gels PAGE excepté la présence du SDS.
SDS-Tricine PAGE - Les SDS-tricine PAGE ont été réalisés selon le protocole de Schàgger et von Jagow (1987) Anal. Biochem. 166:368-379, sur des gels à 10% d'acrylamide pour la séparation avant analyse des bandes par spectrométrie de masse ou à 16% pour l'étude de l'hydrolyse des hordéines. Les gels ont été colorés au bleu de Coomassie G250.
Zymogrammes - Les zymogrammes ont été réalisés sur des gels PAGE 12% dans lesquels ont été incorporées 0,1 % de gliadines selon le protocole de Prabucka et Bielawski (2004) Acta Physiol. Plant. 26:383-391 . Avant coloration au bleu de Coomassie R 250, le gel a été rincé 2 fois 1 h dans du tampon citrate 0,1 M pH 4,3 puis incubé dans du tampon citrate 0,1 M pH 4,3/ 4 mM de cystéine à 40°C durant une nuit.
Analyse en spectrométrie de masse
Après SDS-Tricine-PAGE et coloration au bleu de Coomassie G250, les bandes d'intérêt ont été découpées au cutter en conditions stériles, puis analysées par la plateforme BIBS de l'INRA de Nantes (http://www.bibs.inra.fr).
Hydrolyse des hordéines, gliadines et β-lactoglobulines
Hydrolyse des hordéines : extraction - 25 g de farine de grains d'orge broyés à 0,5 mm ont été mélangés sous agitation magnétique avec 200 mL de NaCI 0,5 M pendant 1 h à température ambiante. Le mélange a ensuite été centrifugé à 10 000 rpm pendant 30 minutes à 12°C. Le surnageant a été éliminé et le culot a été suspendu dans 200 mL de NaCI 0,5 M et mis sous agitation magnétique pendant 1 h à température ambiante. Après avoir été centrifugé à 10 000 rpm pendant 30 minutes à 12°C, le surnageant a été éliminé et le culot a été congelé à -20°C puis lyophilisé.
Le lyophilisât a été remis en suspension dans du propanol à 50% (15 ml_/g) à 60°C sous agitation magnétique pendant 45 min puis centrifugé à 10 000 rpm pendant 30 minutes à 12°C. Le surnageant appelé « surnageant propanol » a été conservé à 4°C et le culot a de nouveau été extrait avec du propanol à 50%.
Le culot a ensuite été mis en suspension dans du propanol 50% (15 ml_/g) + 2% de β-mercapto-éthanol (βΜΕ) à 60°C sous agitation magnétique pendant 45 minutes. Il a ensuite été centrifugé à 10 000 rpm pendant 30 minutes à 12°C. Le surnageant dénommé « surnageant propanol/ β-mercapto-éthanol » a été conservé à 4°C. Le culot a subi cette étape deux fois de plus.
Les surnageants propanol et propanol/ βΜΕ ont été dialysés séparément contre 20 L d'eau distillée (3 bains de 2 h et une nuit) puis centrifugés à 10 000 rpm pendant 30 minutes à 12°C.
Les culots ainsi que les surnageants ont été congelés à -20°C puis lyophilisés. Les lyophilisats ont ensuite été broyés en une fine poudre et stockés à -20°C.
A la fin de l'extraction, les Hordéines Propanol (HP) et les Hordéines Propanol/ β- mercapto-éthanol (ΗΡβΜΕ) ont été obtenues (Koehler et Ho (1990) Plant Physiol. 94251 - 258; Wrobel (1992) J. Inst. Brew. 98:471 -478; Zhang et Jones (1996) Planta 199:565- 572).
Ces extraits étant difficilement solubles, ils ont été délipidés avant analyse. Les HP ont été délipidées selon le protocole suivant : dans un tube en verre de 15 mL, 0,302 g de HP ont été pesés et mises en suspension dans 10 mL de Dichlorométhane + 5 mL d'acétone. Après mélange au vortex pendant 20 minutes et centrifugation à 4°C pendant 10 minutes à 3000 rpm, le surnageant a été éliminé et le culot a été traité une seconde fois puis séché sous vide et conservé à -20°C. L'extrait obtenu est appelé HPdl.
Hydrolyse des hordéines : analyse en SDS-PAGE et HPLC - Après avoir mis en suspension les hordéines (HPdl) (1 mg/mL) dans du tampon sodium-succinate 20 mM pH 4,5 contenant 10 mM de β-mercapto-éthanol, 2 μg de protéines ont été ajoutées pour la fraction contenant ΙΈΡ-Β ainsi que pour le témoin positif (Brewer Clarex®). L'incubation a été faite à 40°C. 20 μ\- du mélange réactionnel ont été prélevés à différents temps (T= 0/5/15/30/60/90min/2h/4h et 24h), dilués dans le tampon de dénaturation, portés à ébullition pour stopper la réaction, puis congelés à -20°C avant analyse sur un gel SDS- Tricine-PAGE 16%. Dans le cas de l'analyse par HPLC en phase réverse 100μΙ de l'extrait 24 h ont été prélevés.
Hydrolyse des gliadines et de la β-lactoglobuline : analyse par HPLC en phase réverse - Dans le cas des gliadines et de la β-lactoglobuline, une solution à 1 mg/mL a été préparée dans du tampon acétate 50 mM pH 4. Des essais ont aussi été effectués en ajoutant du DL-Dithiothreitol (DTT) à une concentration finale de 2 mM avant l'incubation. Pour initier la réaction d'hydrolyse, 2 et 5 μg de protéines (EP-B / EP-A et BC) ont été ajoutés dans 200 μ\- de substrat +/- 4 μ\- de DTT à 0,1 M. Le mélange réactionnel a été incubé à 40°C pendant 20 h. HPLC (High Performance Liquid Chromatography) en phase réverse
La colonne Luna C18 (Phenomenex) a été équilibrée par l'éluant A (H20 milliQ + acide tri-fluoroacétique (TFA) 0,1 1 %) et l'élution a été effectuée par un gradient linéaire de 0 à 50% d'éluant B (acétonitrile + TFA 0,09%) en 54 min à un débit de 1 mL/min pour l'hydrolyse des gliadines et des β-lactoglobulines et un gradient linéaire de 0 à 60% de B en 32 min à un débit de 0,8 mL/min pour l'hydrolyse des hordéines.
50 μ\- d'échantillon ont été injectés. La lecture a été faite à 214 nm et 280 nm et la température de la colonne a été maintenue à 50°C (Marchylo et Kruger (1984) Cereal Chem. 61 :295-301 ; Marchylo et al. (1986) Cereal Chem. 63:219-231 ).
Hydrolyse des peptides Z-Gly-Pro-pNA et Z-Phe-Arg-pNA
Pour chaque peptide testé, l'hydrolyse a été effectuée à pH 4 et pH 5 (Davy et al. (1998) Plant Physiol. 117:255-261 ; Simpson et al. (2001 ) Plant Sci. 161 :825-838). Hydrolyse du peptide Z-Gly-Pro-pNA (Z-GP-pNA) - 17,6 μg de protéines ont été mises à réagir pour chaque enzyme, soit EP-A, EP-B et BC avec qsp 500 μ\- de tampon acide citrique 0,1 M/ disodium phosphate 0,2 M (pH 4 ou 5) et 125 μ\- de substrat 10 mM (solubilisé dans le même tampon + 40% de dioxane). La concentration finale pour le Volume Réactionnel (VR) en substrat était donc de 2 mM et de 8% de dioxane.
Pour chaque échantillon, l'hydrolyse a été faite en duplicata (dépôt de 250 μ\- du
VR dans une micro-plaque de 96 puits).
La libération du pNA a été suivie par lecture de la DO à 410 nm à différents temps (T= 0/ 10/ 20/ 30/ 40/ 50/ 60min et 1 h30/ 2h/ 2h30/ 3h/ 3h30/ 4h/ 4h30/ 5h/ 5h30/ 6h et 24h).
Hydrolyse du peptide Z-Phe-Arg-pNA (Z-FR-pNA) - 17,6 μg de protéines ont été mis à réagir pour chaque enzyme, soit EP-A, EP-B et BC avec qsp 500 μ\- de tampon acétate 50 mM (pH 4 ou 5) + 5% DMSO et 125 μ\- de substrat à 10 mM solubilisé dans le même tampon. La concentration finale pour le Volume Réactionnel (VR) en substrat était donc de 2 mM.
Pour chaque échantillon, l'hydrolyse a été faite en duplicata (dépôt de 250 μ\- du VR dans une micro-plaque de 96 puits).
La libération du pNA a été suivie par lecture de la DO à 410 nm à différents temps (T= 0/ 10/ 20/ 30/ 40/ 50/ 60min et 1 h30/ 2h/ 2h30/ 3h/ 3h30/ 4h/ 4h30/ 5h/ 5h30/ 6h et 24h). Test de lyophilisation
Après passage sur colonnes SP puis DEAE de l'extrait de malt, les fractions correspondant au pic de séparation de l'enzyme EP-B ont été réunies. Le volume final obtenu a été divisé en deux puis dialysé séparément pendant 30 minutes dans de l'eau distillée suivi de deux bains de 2 h puis d'une nuit à 4°C dans du tampon citrate 50 mM pH 4,2 pour l'un et dans du tampon Tris/ HCI/ EDTA Cystéine/ Mannitol/ Saccharose pour l'autre.
Le volume après dialyse a de nouveau été divisé en deux. La première portion a été conservée à -20°C en attente d'analyse au test Chapon et la seconde a été lyophilisée. Le lyophilisât a été mis en suspension dans un volume d'eau distillée égal au volume initial mis au lyophilisateur et a été analysé au test Chapon.
Résultats
Comparaison en Test Chapon de l'efficacité des extraits obtenus à chaque étape de l'extraction des enzymes du malt d'orge
Le Test Chapon permet en mesurant la diminution du trouble de sélectionner les fractions actives au cours de la purification. Ainsi après fractionnement au sulfate d'ammonium, les inventeurs ont montré que l'activité était conservée dans le SN15%SA dialysé puis dans le C65%SA dialysé (Figure 2). Le C15%SA dialysé et le SN65%SA dialysé ne présentent aucune activité. Un test Chapon effectué en ajoutant des quantités équivalentes de protéines (1 mg) montre une forte augmentation de l'activité dans le C65%SA dia (108 EBC pour ΙΈΒ; 50,2 EBC pour le C65%SA dia). Ainsi, le traitement au sulfate d'ammonium permet une première concentration et purification des enzymes d'intérêt.
Séparation des enzymes du malt d'orge par chromatographies échangeuses d'ions
L'analyse par test Chapon des fractions éluées après chromatographie de l'extrait de malt (C65%SA dialysé pH 5) sur une colonne échangeuse de cations (SP) a montré que l'activité enzymatique se trouvait dans la fraction non retenue sur la colonne. Cette fraction a été ensuite séparée sur une colonne échangeuse d'anions (DEAE). Cette deuxième chromatographie a permis d'isoler deux fractions enzymatiques capables de diminuer la turbidité de la bière à 5,2 et 6,1 EBC (Figure 2 : fractions 31 et 46).
Analyse par électrophorèses (SDS-PAGE, PAGE, zymogrammes)
L'analyse par électrophorèse a montré que la fraction 31 était composée de plusieurs bandes protéiques dont un groupe principal aux environs de 35 kDa, une bande aux environs de 60 kDa et une bande plus fine aux environs de 30 kDa. La fraction 46 contenait 2 bandes de PM aux environs de 60 et 35 kDa. Le zymogramme a permis de confirmer la présence dans les fractions 31 et 46/47, d'enzymes capables d'hydrolyser des protéines riches en pralines (gliadines). Les enzymes dans ces 2 fractions avaient des mobilités différentes ce qui indique qu'elles étaient différentes.
Séparation des enzymes du malt d'orge par gel filtration
Après séparation des enzymes d'intérêt du malt d'orge par chromatographies échangeuses d'ions, les inventeurs ont utilisé la chromatographie d'exclusion diffusion (gel filtration) afin d'affiner la pureté des fractions présentant l'activité enzymatique. La séparation de la fraction 31 sur la colonne Sephadex S200 a montré un pic principal précédé de deux épaulements. L'analyse en test Chapon et par zymogramme a révélé que l'enzyme était présente dans la fraction 1 C4 correspondant au pic principal. Par électrophorèse SDS, les inventeurs ont constaté que cette fraction était constituée de plusieurs bandes protéiques aux environs de 35 kDa.
Le chromatogramme de la fraction 47 a montré plusieurs pics mal séparés. L'analyse en test Chapon et par zymogramme a révélé que l'enzyme était présente dans la fraction 5A5 correspondant au premier pic. Caractérisation des enzymes par spectrométrie de masse
Après SDS-PAGE les bandes protéiques des fractions 31 et 46 ont été découpées et analysées par spectrométrie de masse après hydrolyse trypsique. Dans le cas de la fraction 31 , les 2 bandes de PM 30 kDa et 28 kDa correspondent à la forme mature d'une cystéine protéase : EP-B (Référence Uniprot : P25249 (SEQ ID NO: 3) ou P25250 (SEQ ID NO: 4)). Deux variants de cette protéase ont été décrits mais les différences entre ces 2 variants sont trop faibles pour que l'analyse permette de dire quel variant est présent. Les EP-B P25249 et P25250 sont des protéases de PM 25180 et 25318 et de pl 4,77 et 4,96. La fraction 31 contient également des β-amylases (bande de PM 60 000) et des serpines (groupe de bandes aux environs de 35 000).
Dans le cas de la fraction 46, la cystéine protéase a été retrouvée également dans
2 bandes de PM 30 et 28 kDa qui correspondent à la forme mature de la cystéine protéase EP-A (Référence Uniprot : 004675 (SEQ ID NO: 1 ) ou 004677 (SEQID NO: 2)). Comme pour ΙΈΡ-Β, deux variants existent mais l'analyse ne permet pas de dire quel variant est présent. Sur la base des séquences des protéines matures, ces protéases ont des PM respectifs de 25590 et 25648 et des pl de 4,4 et 4,37. Les autres bandes observées sur l'électrophorégramme correspondent aussi à une β-amylase et des serpines.
Un alignement de séquences a montré que les séquences des deux EP-B et celles des deux EP-A présentent respectivement 98% et 99% d'acides aminés identiques. En revanche, les EP-A possèdent 52% d'homologie séquentielle avec les EP-B. Ces deux cystéines protéinases ont une structure semblable et possèdent un site catalytique identique composé de trois acides aminés : cystéine (28), aspartate (162) et histidine (163). Bien qu'ayant un effet similaire sur la diminution du trouble de la bière par rapport à l'enzyme témoin positif (Brewers Clarex®), elles n'en sont pas moins différentes. En effet, elles n'ont que 9 et 1 1 % (respectivement) d'acides aminés identiques avec le Brewers Clarex®. Par ailleurs le nombre important de gap nécessaire à cet alignement montre que ces enzymes ne présentent aucune parenté structurale. Cette absence d'homologie structurale peut également être mise en évidence avec la modélisation 3D de l'enzyme. Hydrolyse des hordéines, gliadines et β-lactoglobulines
Analyse en électrophorèse de l'hydrolyse des hordéines - Le suivi de l'hydrolyse des hordéines par l'analyse en gel SDS-Tricine-PAGE n'a pas permis pas de conclure s'il existait une différence réelle de mécanisme d'action entre ΙΈΡ-Β et le témoin positif, même si ΙΈΡ-Β paraît plus efficace. En effet, il n'y a plus de bandes visibles après 24h de réaction alors que des bandes peuvent encore être observées après 24h en présence de Brewers Clarex.
Analyse en HPLC de l'hydrolyse des hordéines - La fraction enrichie en EP-B (fraction 31 ) est capable d'hydrolyser les hordéines et les dégrade différemment du témoin positif (Brewers Clarex®). En effet, les chromatogrammes ont montré que certains peptides générés étaient différents.
Analyse en HPLC de l'hydrolyse des gliadines - Dans le cas des gliadines, les chromatogrammes ont mis en évidence une action différente entre les enzymes du malt d'orge (EP-B et EP-A) et le témoin positif (Brewers Clarex®). On constate que l'hydrolyse (en présence de DTT) par les cystéines protéinases est totale, contrairement à celle avec le Brewers Clarex (BC). De très nombreux peptides hydrophiles ont été générés par l'hydrolyse par les différentes enzymes rendant difficile la comparaison des chromatogrammes. On peut tout de même voir quelques différences aussi bien entre le Brewers Clarex et les deux protéases du malt d'orge qu'entre les deux protéases (Figure 3). Analyse en HPLC de l'hydrolyse des β-lactoglobulines - Dans le cas de l'hydrolyse des β- lactoglobulines, les chromatogrammes ont également montré une action différente entre les enzymes du malt d'orge (EP-B et EP-A) et le témoin positif (Brewers Clarex®). Cette différence est visible avec ou sans DTT (Figure 4).
Hydrolyse des peptides Z-Gly-Pro-pNA et Z-Phe-Arg-pNA
Hydrolyse du peptide Z-Gly-Pro-pNA - Seul le Brewers Clarex® a été capable d'hydrolyser le peptide Z-GP-pNA dans les tests réalisés (Figures 5 et 6). De plus, le Brewers Clarex est tout aussi efficace à pH 4 qu'à pH 5. Pour les enzymes du malt d'orge : EP-A et EP-B les DO sont nulles et ce même après 24h d'incubation, que la réaction soit faite à pH 4 ou 5.
Cette expérience met en évidence que le site d'action du Brewers Clarex est différent de celui des cystéines protéases EP-A et EP-B.
Hydrolyse du peptide Z-Phe-Arg-pNA - Dans le cas du peptide Z-FR-pNA, l'hydrolyse est uniquement visible avec l'enzyme EP-B. Il n'y a pas de dégradation avec ΙΈΡ-Α ou le Brewers Clarex. De plus, ΙΈΡ-Β est plus efficace à pH 4. En effet, la DO à pH 5 est deux fois moins élevée qu'à pH 4.
Ce test permet de conclure que les enzymes du malt d'orge ont non seulement un site de coupure différent entre-elles mais aussi différent de celui du Brewers Clarex (Figures 7 et 8).
Test lyophilisation
Les inventeurs ont observé que l'activité enzymatique était préservée après lyophilisation.
Les deux tampons testés permettent de conserver l'activité, mais le tampon Tris/EDTA/Cystéine/mannitol/saccharose s'avère être plus efficace. Conclusions
Les inventeurs ont montré que deux fractions enzymatiques isolées du malt d'orge étaient capables de diminuer le trouble colloïdal de la bière et d'hydrolyser les prolamines des céréales (hordéines et gliadines). Ces deux fractions enzymatiques sont enrichies, respectivement en deux protéases EP-B et EP-A, des cystéines protéinases de l'orge. Ces deux enzymes sont très proches au niveau de leurs séquences en acides aminés (structure primaire) et leurs séquences ne présentent aucune identité avec celle de l'enzyme Brewers Clarex®. Enfin l'hydrolyse des prolamines (hordéines, gliadines) ainsi que de la β-lactoglobuline, de même que l'hydrolyse des peptides Z-Gly-Pro-pNA et Z- Phe-Arg-pNA, montrent que ces cystéines protéinases ont des spécificités (sites de clivage) différentes et aussi différentes de celle de l'enzyme Brewers Clarex®.
Exemple 4 : Hydrolyse des gliadines par EP-A, EP-B et l'extrait brut de malt
Cet exemple montre que les enzymes EP-A et EP-B clivent les gliadines de manière différente, suggérant une synergie dans l'action des deux enzymes. - Matériel et méthodes :
Les gliadines sont solubilisées à 4mg/ml dans l'acide acétique 50mM puis diluées à 1 mg/ml avec le tampon acétate de sodium 50mM à pH 5 et mélangées avec différents extraits. Le mélange de gliadines et de tampon acétate représente le témoin noté T, le mélange gliadines et extrait brut obtenu comme décrit dans l'exemple 3 est noté EB, le mélange de gliadines et d'EP-A obtenue comme décrit dans l'exemple 3 est noté EP-A, et le mélange de gliadines et d'EP-B obtenue comme décrit dans l'exemple 3 est noté EP-B. Les mélanges sont incubés 1 nuit à 37°C sous agitation.
Les quantités d'enzymes ajoutées ont été calculées afin d'obtenir un rapport enzyme substrat de 4%. Les échantillons sont incubés 18 heures à 37°C avant d'être analysés par chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC).
- Analyse par HPLC en phase inverse :
Colonne phase inversée : Luna, C18, 100A, 5μηι, 250X4,6 mm (Phenomenex)
Eluant A : H20, TFA 0,1 1 %
Eluant B : Acétonitrile, TFA 0,09%
Débit 1 ml/min ; détection spectrophotomètre à 214 et 280 nm. La mesure à 280 nm permet de détecter spécifiquement les protéines contenant des acides aminés aromatiques tel que le tryptophane. A 214 nm, le signal, bien que moins spécifique, est environ 10 fois plus important qu'à 280 nm.
L'élution a été effectuée par un gradient linéaire de 10 à 60% d'éluant B en 20 min.
Volume d'injection : 40μL. L'absorbance est enregistrée à 214 et 280 nm à l'aide d'un détecteur Waters 2487. Résultats
Les essais d'hydrolyse sont réalisés sur des gliadines totales. Les 2 pics principaux correspondant aux gliadines (temps d'élution 16,1 et 17,5 min) montrent que les gliadines sont partiellement hydrolysées par l'extrait brut (EB) et les 2 enzymes. Les pics apparaissant sur les chromatogrammes après hydrolyse par EP-B et EP-A sont différents, indiquant des sites de coupure différents (Figure 11 ). L'hydrolyse par EP-B est plus marquée que par EP-A, ce qui laisse supposer que de plus petites chaînes peptidiques sont libérées, tandis qu'EP-A permet une hydrolyse plus spécifique, marquée par un pic plus fort.
Exemple 5 : Tests de fermentation en tubes EBC (type « KIRIN »)
Cet exemple montre l'effet d'augmentation du rendement de fermentation de l'extrait de malt selon l'invention.
Protocoles de préparation des extraits de malt d'orge Broyage du malt
Du malt 2RP Pilsen a été stocké à 4°C, puis broyé sur broyeur ZM 200 avec une grille de 0.5mm.
Extraction
Pour chaque extraction, 900 g de Malt sont utilisés avec 3.6 L de Tampon citrate. Elle dure 30 min à 7°C avec une agitation à 250rpm. Les extraits obtenus sont centrifugés durant 25 min à 8400 rpm et à une température de 4°C, avec une accélération et une décélération de 3. Le surnageant est récupéré, et grossièrement filtré sur des filtres Marcherey Nagel 614 1/4 de diamètre 320 mm.
Désactivation pour l'Extrait Brut Dénaturé (EBD)
Le surnageant est chauffé sans agitation jusqu'à l'apparition des premiers bouillons, puis le surnageant est centrifugé durant 25 min à 8400 rpm à une température de 4°C et filtré grossièrement.
Précipitation 15% (w/v) au sulfate d'ammonium (SA)
La précipitation par ajout de sulfate d'ammonium est effectuée dans les mêmes conditions que l'extraction, avec une agitation de 250 rpm et à 7°C. Le mélange est centrifugé durant 25 min à 8400 rpm et à 4°C. Le surnageant est récupéré et son volume est mesuré.
Précipitation 65% (w/v) au SA
Le culot est récupéré dans 600 mL de Tampon citrate, puis filtré grossièrement avant filtration sur un filtre à 0.45μηι. Le produit obtenu est conservé à 4°C en attendant le dessalage.
Dessalage
Le dessalage est effectué sur un gel Sephadex G25 packé dans une colonne
AxiChrom 70 (GE Healthcare). L'appareil utilisé est ΙΆΚΤΑ Prime Plus (GE Healthcare). Le dessalage se fait à température ambiante et l'échantillon est injecté avec un débit de 40 mL/min. L'élution se fait avec le tampon citrate 0.1 M pH 4.3. Chromatographie par échange d'ions
Le gel utilisé est le gel Sepharose Fast Flow, équilibré avec du tampon citrate 50 mM pH5, la chromatographie se fait à température ambiante La cystéine endoprotéase se trouve dans la fraction éluée. Tests de fermentation
Un moût à 1 1 ° Plato est produit par brassage de type « congress EBC» : chauffage à 45°C pendant 30 minutes, suivi d'une montée en température à 70°C pendant 60 minutes, puis 210 g de malt sont versés pour 1260 mL d'eau.
Les différents ajouts (extraits de malt, contrôles...) se font avant ensemencement dans 770mL de moût, sauf le PVPP (40g /HL), qui est ajouté avant centrifugation.
Les modalités testées correspondent respectivement à:
- T- est un extrait brut de malt d'orge dénaturé par la chaleur
- Tpvpp: aucun ajout
- TBC est le témoin positif avec ajout de Brewers Clarex®
- EB est l'extrait brut de malt d'orge
- S15 est un extrait de malt traité par une solution de sulfate d'ammonium à 15% - S65 est un extrait brut traité par une solution de sulfate d'ammonium à 15%, puis le surnageant est traité par une solution de sulfate d'ammonium à 50%
- 65CH est la modalité S65, purifiée sur colonne SP.
Les chiffres 1 , 2 et 3 correspondent à 3 volumes d'ajouts différents testés : les volumes 1 vont de 15 à 30 ml_, les volumes 2 sont de 22,5 et 30 ml_, le volume 3 correspond à 30 ou 37,5 ml_.
Ensemencement :
-pour les fermentations : 720 ml_ avec de la levure sèche
-pour la mesure de l'Atténuation Limite Apparente: 50mL avec de la levure sèche La fermentation / maturation est effectuée à une température de 13°C pendant environ 9 jours.
La levure est purgée, puis le moût est mis en garde au froid (environ 2°C, minimum 5 jours).
En fin de garde, les moûts fermentés sont centrifugés (Centrifugation à 4000 rpm, pendant 10 minutes) et le surnageant est analysé.
Afin de suivre la fermentation, du moût est prélevé, filtré sur Kieselguhr, puis une mesure de pourcentage en masse d'extrait sec du moût est effectuée. Cette mesure est exprimée en degrés Plato (noté °Plato) et mise en œuvre grâce à un densimètre automatique Anton Paar DMA 35. Un suivi de la population de levures est également effectué.
Résultats
La fermentation est accélérée avec l'extrait de malt d'orge. A durée équivalente, dès JO+3, il reste moins de sucres fermentescibles en présence de malt d'orge qu'au cours de la fermentation du témoin constitué par le malt d'orge seul dénaturé par la chaleur, du témoin négatif et du témoin positif avec Brewers Clarex® (Figure 12).

Claims

REVENDICATIONS
1. Utilisation d'au moins une cystéine endoprotéase comprenant une séquence au moins 55% identique à la séquence SEQ ID NO : 1 , à la séquence SEQ ID NO : 2, à la séquence SEQ ID NO : 3 et/ou à la séquence SEQ ID NO : 4, ou un fragment de celle-ci présentant une activité cystéine endoprotéase, pour diminuer le trouble d'une boisson, fermentée ou non, à base de céréales.
2. Utilisation selon la revendication 1 , dans laquelle la au moins une cystéine endoprotéase est utilisée sous forme d'extrait de malt.
3. Utilisation d'un extrait de malt comprenant une activité endoprotéasique pour diminuer le trouble d'une boisson, fermentée ou non, à base de céréales.
4. Utilisation selon la revendication 3, dans laquelle l'extrait de malt comprend une activité cystéine endoprotéase A et/ou cystéine endoprotéase B.
5. Utilisation (i) d'au moins une cystéine endoprotéase telle que définie dans l'une quelconque des revendications 1 à 2 ou (ii) d'un extrait de malt tel que défini dans l'une quelconque des revendications 3 à 4, dans la préparation d'une boisson, fermentée ou non, à base de céréales.
6. Utilisation selon la revendication 1 à 5, dans laquelle la boisson, fermentée ou non, à base de céréales, est une bière.
7. Procédé de prévention ou de réduction du trouble d'une boisson, fermentée ou non, à base de céréales, comprenant une étape d'ajout (i) d'au moins une cystéine endoprotéase telle que définie dans l'une quelconque des revendications 1 à 2 ou (ii) d'un extrait de malt tel que défini dans l'une quelconque des revendications 3 à 4, au cours du procédé de fabrication de la boisson.
8. Procédé selon la revendication 7, dans lequel la boisson est une boisson fermentée, à base de céréales, et ladite au moins une cystéine endoprotéase ou ledit extrait de malt est ajouté au cours de l'étape de fermentation du procédé de fabrication de la boisson.
9. Procédé de fabrication d'une boisson, fermentée ou non, à base de céréales, comprenant une étape d'ajout (i) d'au moins une cystéine endoprotéase telle que définie dans l'une quelconque des revendications 1 à 2 ou (ii) d'un extrait de malt tel que défini dans l'une quelconque des revendications 3 à 4, dans un moût ou un jus.
10. Boisson à base de céréales susceptible d'être obtenue par le procédé selon l'une quelconque des revendications 7 à 9.
11. Utilisation (i) d'au moins une cystéine endoprotéase telle que définie dans l'une quelconque des revendications 1 à 2 ou (ii) d'un extrait de malt tel que défini dans l'une quelconque des revendications 3 à 4, pour augmenter le rendement de fermentation lors de la fabrication d'une boisson fermentée à base de céréales.
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