EP3229965A2 - Temperierkörper für eine multiwell-platte und verfahren und vorrichtung zum einfrieren und/oder auftauen von biologischen proben - Google Patents

Temperierkörper für eine multiwell-platte und verfahren und vorrichtung zum einfrieren und/oder auftauen von biologischen proben

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EP3229965A2
EP3229965A2 EP15798324.8A EP15798324A EP3229965A2 EP 3229965 A2 EP3229965 A2 EP 3229965A2 EP 15798324 A EP15798324 A EP 15798324A EP 3229965 A2 EP3229965 A2 EP 3229965A2
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EP
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tempering
cavities
fingers
temperature
multiwell plate
Prior art date
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Application number
EP15798324.8A
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Inventor
Günter R. Fuhr
Heiko Zimmermann
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Original Assignee
Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
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Publication date
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    • G01N2035/00346—Heating or cooling arrangements
    • G01N2035/00445—Other cooling arrangements

Definitions

  • the invention relates to a tempering body for a multiwell plate.
  • the invention further relates to an apparatus and a method for freezing biological samples, in particular for cryopreservation, and / or for thawing biological samples, in particular a cryopreserved sample.
  • Such multi-well substrates are also referred to as multi-well plates or microtiter plates.
  • the exact dimensions are 127.76 mm ⁇ 85.48 mm * 14.35 mm according to the ANSI standard recommended by the Society for Biomolecular Screening (SBS).
  • Standards for microtiter plates have been published by the ANSI on the recommendation of the Society of Biomolecular Screening (SBS), in particular concerning the dimensions and positions of the wells in 96, 384 and 1536 well microtiter plates. These are the standards ANSI / SBS 1 to 4 - 2004 and the standard SBS-6 - 2009.
  • cryobiobanks in which the samples, especially living cells and here
  • Stem cells are deposited by animals and humans and fed back into use if needed. This usually takes place via cryopreservation, defined freezing and thawing protocols as well as a storage temperature below minus 140 ° C, however, in individual tubs, straws, individual plastic containers, etc., so that the suspensions contained in the corrugated substrates must be removed and transferred.
  • cryopreservation defined freezing and thawing protocols as well as a storage temperature below minus 140 ° C, however, in individual tubs, straws, individual plastic containers, etc., so that the suspensions contained in the corrugated substrates must be removed and transferred.
  • the quality of a biological sample in particular when cells grow adhering to surfaces, decreases with each transfer, since they have to be detached by enzyme treatment or mechanical treatment and are therefore subject to considerable stress. It is also important that all samples of a corrugated plate, z. B. at 96 wells, treated in the same or predeterminable manner and thus also frozen, stored and thawed.
  • cryo Freezers from Planar Plc with programmable temperature programs or simple cryoboxes, such as the cryobox of the type sold under the name "Mr. Frosty"
  • ThermoFisher Scientific Inc . In particular, in important medical cell types, such as immune cells, stem cells, especially the Induced Pluripotent Stem cells, recently controlled freeze and thaw protocols have proven to be extremely important for the quality of the sample and its vitality. Very good results are achieved with very quick cooling and warming. All this and in particular rapid cooling and heating below 1 ° / sec are not yet available for multiwell substrates, which is why the bioprobes have to be transferred to other vessels. But even in the conventional plastic tubes, due to the thickness of the plastic wall and the arrangement of the volumes, such exact, but above all, rapid temperature profiles can not be achieved.
  • a further object is to provide such a device which is process efficient in automated high throughput methods, e.g. As high-throughput screening method, can be integrated.
  • Samples in particular cryopreserved samples to provide, are overcome with the vitality-affecting disadvantages of conventional techniques and in particular a simplified post-processing of the thawed bi- yogn sample allows.
  • a temperature body is provided for a multi-well plate, for
  • the multiwell plate has, in a manner known per se, a plurality of cavities arranged in rows and columns.
  • the tempering body according to the invention comprises a body which can be flowed through by a tempering fluid, preferably of a thermally conductive material, preferably high heat. mekapaztician, and a plurality of arranged on an upper surface of the body in rows and columns protruding tempering fingers, which are thermally conductively connected to the base body, wherein a grid spacing of the tempering corresponds to a grid spacing of the cavities of the multiwell plate.
  • the distance between adjacent tempering fingers thus corresponds to the distance between adjacent cavities.
  • the invention comprises the general technical teaching to provide a tempering, which is adapted to the matrix-like, regular arrangement of the cavities of the multiwell plate and for this purpose has a corresponding maxtrix shame arrangement of tempering fingers in the pitch of the arrangement of the cavities.
  • the cooling fingers can be brought with their end faces with the bottom plates of the cavities in connection, wherein preferably each tempering finger of a cavity is assigned.
  • the tempering fingers can be made rod-shaped or suppository-type, and the end faces of the tempering fingers are designed such that they form planar supports for the bottoms of the cavities of the multiwell plate.
  • a particular advantage of the invention is therefore that samples for freezing and thawing no longer in Einzeltubes, Straws or special plastic containers, etc. must be transferred, but frozen by means of the tempering according to the invention directly into and with the multiwell plate and subsequently thawed again , This can increase the vitality rate in the cryopreservation of biological samples.
  • Another advantage is that a tempering body designed in this way allows a rapid freezing and / or thawing, since the tempering fingers can be positioned very close to the sample and high cooling and Heating rates can be generated directly in the bioprobe on the bottom wall of the cavities.
  • sample any article which undergoes cryopreservation in the cavity.
  • the sample material typically includes biological material such as cells, tissues, cell components or biological macromolecules and optionally a nutrient solution, reagents, cryoprotectants or other substances.
  • an electrically controllable heating and / or cooling element may be integrated in at least some of the tempering fingers, preferably in all.
  • heating elements can also be microwave or high-frequency elements, which can set a defined heat input with appropriate control against the fluid cooling of the body.
  • This variant offers the advantage that individual tempering fingers or subgroups of tempering fingers, for example individual rows and / or columns, can be tempered differently. As a result, the heat or cold input can be selectively varied via the arrangement of the cavities and adapted to the samples stored in the individual cavities.
  • thermoelectric sensor for monitoring the heat or cold entry into the cavities in the front region of at least one of the tempering fingers a temperature sensor, such as.
  • a thermoelectric sensor is integrated.
  • the temperature sensor may be designed as a flat design of a platinum resistance temperature sensor, such as a PT 100 or PT 1000 sensor.
  • the end faces of the tempering fingers are highly polished, preferably with roughnesses below 20 pm, and / or have a coating of high thermal conductivity, preferably with a thermal conductivity comparable to that of copper or silver, preferably a coating of graphite or diamond.
  • the tempering fingers can be arranged within an area with a length of 127.8 mm and a width of 85.5 mm.
  • the number of tempering fingers may correspond to the number of wells of the multi-well plate and preferably have one of the following values: 6, 8, 12, 16, 24, 48, 96, 384 or 1536.
  • the tempering fingers are preferably made of a material of high heat capacity and high thermal conductivity, preferably of a metallic material.
  • the heat capacity of the tempering fingers is higher than that of a commercially available multiwell plate.
  • the main body of the tempering body comprises at least one line through which a cooling fluid can flow, with a supply connection and an outflow connection for connecting the at least one line to a cooling circuit and / or a heating circuit.
  • the line course of the at least one line is preferably meander-shaped or spiral in order to achieve a desired temperature profile evenly distributed over the base body.
  • An advantageous variant provides in this case that the flow of a tempering fluid through the at least one line is controllable so that predetermined individual tempering fingers and / or at least one predetermined subgroup of Temperierfinger different in temperature compared to the rest of the tempering fingers are tempered.
  • This can be realized, for example, by means of a plurality of fluid lines or line sections which can be connected and disconnected for different regions of the heat sink, in order to temper sub-groups of tempering fingers differently.
  • the end faces of the tempering fingers can be flat or slightly curved.
  • This embodiment is preferably suitable for the tempering of multi-well plates which have cavities with a flat bottom or a slightly curved round bottom.
  • a further variant of this embodiment is characterized by an inclination of the end faces of the tempering fingers, which increases from the middle to two opposite edge regions of the temperature body, with respect to a planar upper side of the base body.
  • the increasing inclination may be formed by an increasing inclination of the tempering fingers arranged on the planar upper side of the main body or by an increasing bevel of the end faces of the tempering fingers.
  • uses that multiwell plates mostly made of plastic, z. B. made of polystyrene or polyvinyl chloride, are manufactured and bend slightly under pressure. This bending can be exploited by the increasingly inclined outwardly embodiment of the end faces of the tem- perierfinger advantageously to determine safe ⁇ that all cavities come into planar contact with the temperature conditioning.
  • a further alternative embodiment provides that an outer wall of the bottoms of the cavities and an end face of the tempering fingers for forming a local positive connection each have a shape-corresponding non-planar surface shape complementary to one another.
  • the end face of the tempering finger according to the key-lock principle is designed as a counter contour to the contour of the underside of the cavities.
  • a surface shape of the end faces of the tempering fingers and a surface shape of the outer walls of the bottoms of the cavities to form a local form fit can be designed as interlocking toothing.
  • This alternative embodiment has the advantage that even with cavities with small diameters, a large surface contact between the cavity and corresponding cooling finger and thus a comparatively large cooling surface and faster temperature control are made possible.
  • the invention further relates to an arrangement of a tempering, as disclosed herein, and a multi-well plate whose pitch of their arranged in rows and columns cavities corresponds to the pitch of the tempering fingers.
  • a temperature control device for freezing samples, in particular for cryopreservation, and / or for thawing samples, in particular particular of a cryopreserved sample.
  • the samples may in particular be biological samples.
  • the tempering device comprises a tempering as disclosed in this document.
  • the temperature control device comprises WEI direct a positioning means for positioning the Tem ⁇ perier stressess a multiwell plate in a predetermined position relative to each other, wherein the pitch of the ⁇ hen in Rei and columns arranged cavities of the multiwell plate correspond to the grid spacing of the Temperierfinger and wherein in the predetermined position, the multi-well plate above the tempering and the cavities are each positioned in alignment with the longitudinal axis of one of the tempering fingers.
  • the tempering device further comprises a device for contacting the tempering fingers of the tempering with the bottoms of the cavities of a positioned in the predetermined position multiwell plate.
  • the device for contacting brings about a pressing body which can be pressed from above onto a multiwell plate positioned above the tempering body, as a result of which the bottoms of the cavities of the multiwell plate are to bring the contact pressure in contact with the end faces of the tempering fingers.
  • the pressing body preferably comprises a contact surface with the multiwell plate of at least the same
  • Length and width as the matrix-like arrangement of the cavities of the multiwell plate.
  • the device for bringing into contact comprises a plurality of electrically controllable actuators, which are designed to indirectly on the top of a positioned above the temperature control multiwell plate, z. B. on the aforementioned Anpress stresses, or directly to attack in order to change a relative distance between the multi-well plate and the tempering when driving the actuators to bring the temperature control fingers and the bottoms of the cavities in contact and / or out of contact.
  • the electrically controllable actuators may be embodied as micromechanical actuators or as piezoelectric actuators.
  • the tempering fingers can all be pressed or returned to the underside of the cavities of the multiwell plate at the same time or in groups, in some cases only a single tempering finger, so that a temperature bridge is established between the bottom of the multiwell plate and the tempering fingers and dissolved, so that the heat can be led out of or into the sample.
  • Another advantage of the embodiment in which the electrically controllable actuators as high-precision micro ⁇ mechanical actuators or piezoelectric actuators are carried out, is that such actuators by a control unit of the device for in-contacting can be controlled so that a sequential in-contact matching, an out-contacting and re-in-contact accommodating multiwell plate and tempering frame within a time can be carried out in the range of 1 ms (milli ⁇ seconds) to 1 s (second ) and this is feasible with a distance ⁇ accuracy ⁇ .
  • the tempering device for handling a multi-well plate the grid spacing of which is arranged in rows and columns cavities corresponds to the grid spacing of the tempering of a tempering of the temperature control executed.
  • the temperature control device may comprise such a multiwell plate.
  • the multiwell plate may be a commercially available multiwell plate. Furthermore, the multiwell plate may differ from commercial multiwell plates and be adapted for use for cryopreservation and for use with the tempering body and / or the tempering device.
  • each one electrically controllable heating and / or cooling element preferably a Peltier element
  • a temperature sensor is integrated in the bottoms of the cavities.
  • the bottoms of the cavities can be made thin and made of a heat-conducting material or be provided with a structure on the underside, resulting in a larger surface contact with the tempering.
  • the tempering device may further comprise, in a manner known per se, a temperature-controlled cooling chamber or housing which can be filled and / or filled with a dry gas and, when cooled, has a vertical temperature stratification in the temperature-control chamber with a lower cold layer and an upper warm layer. and at least one provided on a housing wall of the Temperierkaramer lock for introducing and / or carrying out a multiwell plate.
  • two such locks are provided: a first lock, via which a multiwell plate can be introduced or carried out in the chamber in the warm state, and a second lock, via which a multiwell plate is introduced into the chamber in the cold state or can be executed.
  • the tempering device comprises a tempering body according to the invention.
  • the tempering device may be arranged in the lower cold layer of the temperature control chamber, connected to a cooling circuit first temperature control body for cryopreserving biological samples and / or arranged in the upper warm layer, attached to a heat cycle.
  • a cooling circuit first temperature control body for cryopreserving biological samples and / or arranged in the upper warm layer, attached to a heat cycle.
  • a mounted in the lower cold layer of the temperature-control chamber we ⁇ tendonss containing a thawed sample multiwell plate may be positioned above the second temperature conditioning means of the positioning device.
  • a multi-well plate which is introduced into the temperature-control chamber via the at least one lock and contains at least one sample to be frozen can be positioned above the first temperature-control body by means of the positioning device.
  • the positioning device may have a suitably designed guide mechanism in order to move the multiwell plate within the temperature chamber.
  • a multi-well plate positioned above the first and / or second temperature control body can be lowered or raised in a controlled manner by means of the device for bringing it into contact and / or out of contact with the thermal element to become.
  • the positioning device can also be designed instead to move the or the tempering body toward the multiwell plate.
  • the tempering chamber may be cooled with liquid gases such as LN2, N2 gas or a Sterling engine.
  • liquid gases such as LN2, N2 gas or a Sterling engine.
  • liquid nitrogen in a trough at the bottom of the tempering chamber open or introduced into a spongy material liquid nitrogen can be stored, resulting in the vertical temperature stratification.
  • the vertical Temperaturver ⁇ running is set within the temperature chamber so that the warm layer having a temperature which corresponds essentially to a predetermined starting temperature of a freezing process or a specified target temperature of a thawing process corresponds, while the cold layer has a temperature which Substantially corresponds to a predetermined target temperature of the freezing process or a predetermined starting temperature of the thawing process.
  • a further aspect of the invention relates to a method for freezing biological samples, in particular for cryopreserving, and / or thawing biological samples, in particular cryopreserved samples, using a tempering body as disclosed in this document, and / or a tempering device, as in disclosed in this document.
  • the method comprises applying a substance to a sample stored in a cavity of the multiwell plate.
  • the applied substance is a solution which, when it solidifies, terminates a surface of the cavity contents with respect to the outer space, preferably closes in a gastight manner, so that no lid or the like is required as a closure.
  • the substance may be, for example, a natural or synthetic oil, a liquid or a gel which is immiscible with an aqueous solution, or solid CO 2.
  • the substance is applied to the already frozen sample, wherein the substance after and / or thawing of the sample causes a predetermined reaction or interaction with the sample.
  • a substance is used, from the state of which it can be deduced whether, after freezing the sample, an intermediate thawing has taken place.
  • the substance has a higher density than the nutrient solution surrounding the sample, so that the sequence of the sample and the substance turns over after thawing, so that, for example, floating cells can be easily removed in a nutrient solution.
  • a substance is applied, wherein information about the sample can be derived from the state of the introduced substance and / or the substance causes a predetermined reaction or interaction with the sample during the thawing of the sample.
  • liquids which give rise to a specific pattern during freezing or have a temperature sensor function from which it is possible to detect whether thawing has occurred in the meantime or by which the structure, color, mixture, etc. have been changed.
  • these can also be recrystallization processes which are not visible macroscopically but can easily be detected and quantified by means of scattered light, fluorescence, Raman measurements or the like.
  • the substance may be a diluent and wash solution or antifreeze, act as a differentiation factor with respect to the sample, or be a substance containing antioxidants, anti-apoptotic substances, and / or live-dead dyes.
  • multi-well plates can be used directly for cryopreservation, so that every transfer into new containers is omitted.
  • Figure 1 is a perspective view of a multi-well plate and a tempering according to an embodiment of the invention; an arrangement of a multi-well plate and a tempering, from which a section is enlarged and reproduced in section; a cross section of a multi-well plate and a tempering according to another embodiment of the invention; schematically a tempering and a tempering according to an embodiment of the invention;
  • FIG. 5 schematically shows the application of a substance according to an embodiment of the method
  • FIGS. 6A and 6B show a unit consisting of a tempering finger and a filled cavity
  • FIGS. 7A and 7B show a cross-section of a multi-well plate on a tempering body according to another embodiment.
  • FIGS. 8A and 8B show a cross section of a multiwell plate and a tempering element according to a further embodiment.
  • Figure 1 shows a multiwell plate 1 and a first Auspar tion form of the tempering 4 according to the invention in a perspective view.
  • a commercially available plastic multiwell plate 1 in the standardized 96-well format is shown schematically in an oblique view. shows.
  • the cavities (wells) 2 are arranged side by side in matrix form in eight rows of twelve cavities each and represent depressions for receiving the test pieces) on such a multiwell plate 1.
  • the grid spacing of adjacent cavities is for a 9 mm 96-well multiwell plate.
  • Such multi-well plates 1 can be covered with a plastic lid 3, which can also be omitted in the machine for filling, emptying and other manipulations.
  • the cavities 2 are planarly closed with a thin plastic disc or foil, which generally allows microscope images of adherent cells in their optical quality.
  • the tempering body 4 comprises a cuboid basic body 6, through which a tempering fluid can flow, and a plurality of projecting cylindrical tempering fingers 5 arranged in rows and columns in rows and columns in rows and columns exactly in the pattern of the 96-well multiwell plate.
  • the tempering body 4 is made of one Material made of high heat capacity or good heat conduction. Usually these are metals, such as silver or alloys.
  • tempering fingers 5 are arranged in a matrix-like manner in eight rows of twelve tempering fingers 5 each.
  • the grid spacing of the tempering fingers 5 corresponds to a grid spacing of the cavities 2 of the multiwell plate 1, ie, the distance between adjacent tempering fingers thus corresponds to the spacing of adjacent cavities and is therefore also 9 mm in the present case.
  • the tempering fingers 5 are in each case of essentially the same shape and are regularly divided in two into the contact area with the multi-surface Well plate 1 spanning and substantially perpendicular to each other surface directions each arranged substantially equidistantly.
  • the tempering fingers 5 can be provided in one piece with the main body 6.
  • the Temperierfinger 5 are in very good, usually thermi ⁇ rule contact with the arranged below tempering
  • the base body 6 can be flowed through by at least two openings 7a, 7b with a temperature control gas or a temperature control liquid.
  • a meandering or even spiral course of a fluid guide connecting the two openings is realized in the tempering body 6 so that a uniform or desired temperature profile is achieved, via which the tempering fingers 5 each assume the temperature prevailing at their location.
  • the temperature control fingers 5 have the highest possible heat capacity, which is far greater than that of the bottom regions of the multi-well plates, so that they dominate and determine the temperature of the cavity region with the bioprobe when in contact with them. D. h., The cooling and heating are essentially limited only by the thermal conductivity of the bottom regions of the multiwell plate 1 and the bioprobe.
  • a corresponding This format adapted tempering are used, which then according to 8, 12, 16, 24, 48, 96, 384 or 1536 Temperierfinger 5 whose pitch is adapted to the pitch of the multiwell plate.
  • the principle of cooling a 96-well multiwell plate 1 from room temperature to a target temperature of z. B. minus 150 ° C is explained below using the example of a similar cooling all 96 cavities 2.
  • Tempering fingers 5 heating elements located (not shown) and different temperatures at the individual Temperierfingern 5 can be realized.
  • the pressing body 8 it is also possible to use a piezo-controlled device for bringing the tempering fingers 5 into contact with the bottoms of the cavities 2 for pressure (shown in FIG. 3), which permits contact of the multiwell substrate with the tempering fingers 5 to open by vertical movement and close again. For this only small gaps in the micrometer range are required. By repeated repetition alone on this way a temperature profile of the entire plate can be driven. Additionally or alternatively, the temperature of the gas stream can be changed by the base body 6, which can drive slow T-profiles, as they are also common in the cryopreservation of cells (for example in the range of a few fractions ° C per minute, some ° C per Minute). In the case of heating, the procedure is contrary: Very quickly, the multiwell plate 1 is brought into contact with a temperature control body 4 brought to a high temperature. This can be with a warm or
  • the multi-well plate 1 is also pressed rapidly to the tempering 4.
  • the tempering 4 is brought to 40 ° C to 300 ° C and only as long brought into thermal contact with the multiwell plate 1, until the target temperature is reached. Even during heating, the temperature profiles can be controlled by opening and closing the thermal contact between the tempering fingers 5 and the cavities 2.
  • FIG. 2 shows, in section, in the lower part, a tempering body 24, which in turn has a base body 6, through which a tempering fluid can flow, and a plurality of projecting tempering fingers 25 arranged in rows and columns on the upper side 6a of the base body 6.
  • the grid spacing of the tempering fingers 25 again corresponds to the grid spacing of the cavities 2 of the multiwell plate 1, which is enlarged in the middle in a detail in FIG. 2 and reproduced in section.
  • the multiwell plate 1 is inclined Top view shown with the marked area used as a cut.
  • the multiwell plate 1 is still covered with a cover 3.
  • the tempering fingers 25 are according to this embodiment not vertically standing on the surface 6a of the base 6, but increasingly inclined to the edges of the multiwell plate 1 , This is exaggerated in the figure by the dashed line 5c and the two longitudinal axes 5b of tempering fingers 25 arranged in the outer region, which are tilted outward in comparison with the longitudinal axis 5d of a centrally arranged tempering finger 25. Due to the surface pressure from above or below the multiwell plate 1 is bent a little lenticular, which ensures that all cavities 2 get with their bottom bottom 11 in the same good planar contact with the tempering fingers 25.
  • the surface of the temperature control fingers in particular the end face 25a, as exemplified by an example cylinder in Figure 2, with a good thermal conductivity
  • Layer 9 can be covered, whereby very rapid cooling and heating are possible.
  • heating or cooling elements 10 may be integrated in the tempering fingers 25, via which individual elements are controlled in temperature.
  • tempering 5 temperature sensors 12, z. B. in flat design of a platinum resistance temperature sensor, such as a PT 100 or PT 1000 sensor.
  • a platinum resistance temperature sensor such as a PT 100 or PT 1000 sensor.
  • FIG. 3 shows, in analogy to FIG. 2, a cross section of a multiwell plate 1, which is in contact with the temperature control body 24.
  • the peculiarity of this embodiment is that piezoelectric actuators 30 are fixedly arranged on the cover of the multiwell plate 1, so that over the expansion or shrinkage of the piezoelectric actuators 30 (shown by the arrows), the contact of the cavities 2 to the tempering fingers 25 is made or interrupted. These are deflections in the range of 1 to a few 100 ⁇
  • FIG. 4 shows by way of example a tempering device 40 for the automated and direct cryopreservation of biological samples stored in multi-well plates 1.
  • the device 40 includes fully a temperature-controlled chamber 48, no moisture- ⁇ ness is in the "so that no humidity may condense as ice.
  • the chamber 48 comprises further regions which at least the output temperature of the multiwell plate and the have desired target temperature.
  • a trough 43 in which open or in a sponge-like material, for.
  • a sponge-like material for.
  • liquid nitrogen (LN2) is located at the bottom of the temperature chamber 48.
  • This is covered with a perforated plate 44, which should prevent that parts can fall into the nitrogen lake at a temperature of -196 ° C.
  • two locks 47a and 47b are shown, which are arranged on the housing wall of the temperature-control chamber 48.
  • a multi-well plate 1 Via the lock 47a, a multi-well plate 1 is warmly introduced or carried out in the temperature-control chamber 48.
  • a multiwell plate 1 Via the lock 47b, a multiwell plate 1 can be cold introduced or performed in the temperature control chamber 48. If, due to the introduction or removal of a multi-well plate 1, moist air enters the tempering chamber from the outside
  • Temperature chamber 48 and via the locks 47a, 47b are placed, through which the gaseous dry nitrogen escapes.
  • the overall system 40 is not sealed pressure-tight, but has a siphon-like outlet tube at the top (not shown here).
  • the area of the end faces in the heating temperature control unit 42 of the shrunken multiwell substructure geometry can be adapted at -150 ° C., ie the area the end faces of the tempering 42 for heating are made slightly smaller than the end faces of the tempering 41 for cooling.
  • the device 40 further comprises a positioning device (not shown), by means of which the multiwell plates 1 to be tempered within the chamber 49 can be moved in accordance with the travel paths illustrated by the arrows 45a-c or by the arrows 46a-c, and by means of which the multi-well plates can be positioned in particular exactly aligned above the tempering bodies 41 and 42.
  • the arrows 45a-c show here the temporal and spatial sequence when heating a cryogenic multiwell plate 1.
  • the arrows 46a-c illustrate the course of a cooling of a multiwell plate 1.
  • the paths indicated by the arrows are by means of mechanical elements of the Go through positioning, the drives are preferably outside the temperature control chamber 48 and a conventional guide mechanism, such. As rods, coils, etc. (not shown), the multi-well plates - l - method.
  • a multiwell plate 1 containing bioprobes to be frozen is introduced via the lock 47a into the temperature control chamber 48 (arrow 46a) and moved by means of the positioning device into the cold layer 43a and there above the first, standing on the perforated plate 44 Temperature control 41 positioned (arrow 46b).
  • the positioning takes place in such a way that the cavities of the multi-well plate 1 are each positioned in alignment with the longitudinal axis of one of the temperature control fingers of the temperature-control body 41.
  • the thus positioned multiwell plate by means for contacting (not shown), such as. B. described above in connection with Figure 3, controlled or regulated lowered to be brought into contact with the tempering 41,
  • the multiwell plate 1 can either be stored for storage in the lower cold layer 43a or for further processing via the second
  • FIG. 5 schematically illustrates the application of a substance to the biological samples stored in the cavities 2, and shows a series of cavities 2 with a liquid filling 20 and cells 21 on the cavity bottoms 11 the temperature control fingers 5.
  • a substance 51 with a pipetting 50, z. B. with a pipetting robot, added to the cavities 2.
  • These may be, for example, antifreeze agents, particle suspensions, gels and the like which solidify, which are helpful in freezing, but may also be closure material which, when solidified, seals the surface of the actual cavity contents with respect to the exterior so that there is no cover or other is needed as a closure, which simplifies the automation processes.
  • These can also be recrystallization processes which are not visible macroscopically but can easily be detected and quantified by means of scattered light, fluorescence, Raman measurements or the like.
  • substances in solid or liquid form in the cavities 2, when the contents 20 is already frozen This can be differentiation factors for stem cells that become effective immediately after thawing, protective materials, or genetic material that only binds after thawing with the underlying solution. These can also be diluent media that reduce the concentration of antifreeze after thawing.
  • Figures 6A shows an arrangement of a tempering finger 5 and a cavity 2.
  • a filling which consists of three materials.
  • the culture medium 60 in which the bioprobes (here shown as cells on the bottom plate) are located, is a medium 61 which has been applied after freezing of the medium 60, so that it is not mixed with it , The whole is covered with another medium 62 which provides a gas tight seal to the outside atmosphere.
  • the medium 62 can be a natural or synthetic oil, a liquid-immiscible liquid, a gel, or solid CO 2. The advantage of such arrangements is that they can be optimally adapted to the process of thawing or freezing.
  • the type and arrangement of the media determines the reaction during thawing. Thus, staggered liquefaction takes place at different temperatures. Depending on the composition of the filling media can shift so that a new order arises, as shown in Figure 6B.
  • FIG. 6B shows two different states of an arrangement of a tempering finger 5 and a cavity 2.
  • the arrangement In the first state, designated “I”, the arrangement is in the cold state.
  • the second state designated “II” the arrangement in the warm state in which the nutrient solution 60 has thawed is shown, for example, when frozen, a silicone oil 63 is applied to the solid culture medium 60, which has a higher density than the nutrient solution 60, then this layer will turn over in sequence after the two phases have become liquid as the cells 64 easily detach from the surface during thawing and go into suspension, after thawing, they float in the upward-rising, final-layered nutrient solution 60, which can be easily removed from a vending machine without having to remove a cover
  • Alternative variants can be developed for freezing, for example by using glycerol solutions which remain liquid up to temperatures of -40 ° C and lower or which do not assume a solid state at all
  • a particular advantage of this arrangement and method is the possibility of checking the maintained
  • FIGS. 7A and 7B show two classic corrugated sheets 70, 71 with larger cavities 72, with a diameter of approximately 2 to 3 cm.
  • the corrugated sheets 70, 71 are made as an injection-molded part in a modified form for freezing in the entirety of the multiwell plate.
  • the bottom plate 75 is made of a heat-conducting thin material, for. B. of a polymer, a metal, a metal coating or diamond, so that the heat well above the cooling or
  • Warming room 74 which is located in a stable cooling or heating body 73, can be initiated or initiated.
  • the corrugated sheets 70, 71 are pressed from above onto the tempering unit 73 and can be bent over the cavities 76 in the corrugated sheet by creating a slight negative pressure.
  • This variant of the total cooling of the Multiwellsub- strate is a simplified form that combined with the Temperierkör ⁇ perstepn corresponding to FIGS 1 to 6 who can ⁇ .
  • Such a possibility of the combination is the introduction of the tempering 4, 24 in the space 74. This is traversed by a cooling or heating liquid or the tempering gas, whereby the corresponding temperature profiles are transmitted via the multiwell substrate bottom 75 in the cavities 72.
  • temperature sensors can be integrated, for.
  • FIGS. 8A and 8B show a cross-section of a multi-well plate and a tempering body according to a further embodiment.
  • Figure 8A shows a cross section of an arrangement of a multi-well plate 1 and a tempering 4, both of which are not yet in contact with each other.
  • FIG. 8B shows a single cavity 2 with the tempering cylinder 25 below.

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Abstract

Die Erfindung betrifft einen Temperierkörper (4) für eine Multiwell-Platte (1), die eine Mehrzahl von in Reihen und Spalten angeordnete Kavitäten (2) aufweist, zum Einfrieren und/oder zum Auftauen von biologischen Proben. Der Temperierkörper (4) umfasst einen von einem Temperierfluid durchströmbaren Grundkörper (6) aus einem thermisch leitfähigen Material; und eine Mehrzahl von auf einer Oberseite des Grundkörpers (6) in Reihen und Spalten angeordnete abragende Temperierfinger (5), die thermisch leitend mit dem Grundkörper (6) verbunden sind, wobei ein Rasterabstand der Temperierfinger (5) einem Rasterabstand der Kavitäten (2) der Multiwell-Platte (1) entspricht. Die Erfindung betrifft ferner eine Vorrichtung und Verfahren zum Einfrieren von biologischen Proben, insbesondere zur Kryokonservierung, und/oder zum Auftauen von biologischen Proben, insbesondere einer kryokonservierten Probe.

Description

BESCHREIBUNG
TEMPERIERKÖRPER FÜR EINE MULTIWELL-PLATTE UND VERFAHREN UND VORRICHTUNG ZUM EINFRIEREN UND/ODER AUFTAUEN
VON BIOLOGISCHEN PROBEN
Die Erfindung betrifft einen Temperierkörper für eine Multi- well-Platte. Die Erfindung betrifft ferner eine Vorrichtung und ein Verfahren zum Einfrieren von biologischen Proben, insbesondere zur Kryokonservierung, und/oder zum Auftauen von biologischen Proben, insbesondere einer kryokonservierten Probe .
Die zunehmende Verbreitung institutioneller und kommerzieller Kryobiobanken, insbesondere zur Ablage von lebendem Zellmaterial, mit Probenzahlen von einigen Zehntausend bis zu einigen Millionen erfordert eine Automatisierung der Prozessabläufe. Einmal ist dies erforderlich, um kostengünstige Lagenbedingungen zu erreichen, zum anderen zur konsequenten Umsetzung von SOP-Bedingungen (SOP: Standard Operation Proce- dures) , zur lückenlosen Dokumentation und zum Ausschluss subjektiver Einflüsse durch Laborpersonal, wie er im biomedizinischen Bereich zunehmend gefordert wird.
Im Pharmabereich, in der Medizin und in weiten Teilen der Biotechnologie haben sich automatisierte Probenaufnahmestandards durchgesetzt, die vor allem im Laufe der Entwicklungen des Hochdurchsat z-Screenings („High-Throughput Screenings") entwickelt wurden (sog. SBS-Standard) . Hierbei kommen in der Laborpraxis Multiwell-Substrate von spalten- und zellenförmig angeordneten, eine Rundwabenstruktur bildenden, sehr kleinen Reaktionsräumen, auch Wells, Kavitäten oder Näpfchen genannt, zum Einsatz, in die jeweils kleinste Anteile einer Probe, z. B. Zellmaterial, eine Blutprobe etc., eingebracht werden. Es handelt sich dabei um Multiwell-Substrate, mit 6, 8, 16, 24 bis 96 und mehr Einzelwells in flachen Plastikausführungen. Diese Formate sind inzwischen weltweit standardisiert und werden in Pipettierautomaten, Zell-Kulturautomaten aber auch der Geräteplattform der Analysetechnik sowie Diagnostik eingesetzt .
Derartige Multiwell-Substrate werden auch als Multiwell- Platten oder Mikrotiterplatten bezeichnet. Die genauen Abmessungen (Länge χ Breite χ Höhe) betragen gemäß ANSI-Standard auf Empfehlung der Society for Biomolecular Screening (SBS) 127,76mm χ 85,48mm * 14,35mm. Von der ANSI wurden auf Empfehlung der Society of Biomolecular Screening (SBS) Standards für Mikrotiterplatten veröffentlicht, die insbesondere die Abmessungen und Positionen der Vertiefungen bei Mikrotiterplatten mit 96, 384 und 1536 Vertiefungen betreffen. Hierbei handelt es sich um die Normen ANSI/SBS 1 bis 4 - 2004 und die Norm SBS-6 - 2009.
Zu der Kette der Verarbeitung, Charakterisierung und Handhabung von Proben in der Medizin, Pharmaentwicklung
und Biotechnologie gehören mehr und mehr auch Kryobiobanken, in denen die Proben, insbesondere lebende Zellen und hier
Stammzellen vom Tier und Mensch abgelegt und bei Bedarf wieder einer Nutzung zugeführt werden. Das erfolgt in der Regel über Kryokonservierung, definierte Einfrier- und Auftauprotokolle sowie über eine Lagertemperatur unter minus 140 °C, al- lerdings in Einzeltubes, Straws, einzelnen Plastikcontainern etc., so dass die in den Wellsubstraten befindlichen Suspensionen entnommen und transferiert werden müssen. Wie zahlreiche Experimente gezeigt haben, nimmt die Qualität einer biologischen Probe, insbesondere wenn Zellen an Oberflächen adhäriert wachsen, mit jedem Transfer ab, da diese durch Enzymbehandlung oder mechanische Behandlung abgelöst werden müssen und dadurch einem nicht unerheblichen Stress unterliegen. Auch ist es wichtig, dass alle Proben einer Wellplatte, z. B. bei 96 Wells, in gleicher oder vorgebbarer Weise behandelt und damit auch eingefroren, gelagert und aufgetaut werden können.
Aus der Praxis sind des Weiteren sowohl gesteuerte Kühl- als auch Erwärmungssysteme bekannt, wie beispielsweise die „Cryo Freezers" der Firma Planar Plc mit programmierbaren Temperaturprogrammen oder einfache Kryoboxen, wie beispielsweise die unter der Bezeichnung „Mr. Frosty" angebotene Kryobox der
Firma ThermoFisher Scientific Inc.. Insbesondere bei wichtigen medizinischen Zelltypen, wie Immunzellen, Stammzellen, insbesondere den IPS-Zellen (Induced Pluripotent Stemcells), erweisen sich in letzter Zeit kontrollierte Einfrier- und Auftauprotokolle als außerordentlich wichtig für die Qualität der Probe und deren Vitalität. Dabei werden sehr gute Ergebnisse mit sehr raschen Abkühlungen und Erwärmungen erzielt. Das alles und insbesondere schnelle Abkühlungen und Erwärmungen unter 1 °/sec sind bisher für Multiwell-Substrate nicht verfügbar, weswegen die Bioproben in andere Gefäße transferiert werden müssen. Aber auch in den konventionellen Plas- tiktubes lassen sich aufgrund der Dicke der Plastikwand und Anordnung der Volumina derartig exakte, vor allem aber rasche Temperaturverläufe nicht erreichen.
Es ist somit eine Aufgabe der Erfindung, eine verbesserte Vorrichtung zum Einfrieren von biologischen Proben, insbesondere zur Kryokonservierung, und/oder zum Auftauen von biologischen Proben, insbesondere einer kryokonservierten Probe, bereitzustellen, mit der Nachteile herkömmlicher Techniken vermieden werden und die insbesondere eine Kryokonservierung mit einer schnellen Abkühlung und/oder Erwärmung sowie einer erhöhten Vitalitätsrate ermöglicht. Eine weitere Aufgabe ist es, eine derartige Vorrichtung bereitzustellen, die sich prozesseffizient in automatisierte Hochdurchsatzverfahren, z. B. High-Throughput Screening-Verfahren, integrieren lässt. Des Weiteren ist es eine Aufgabe der Erfindung, ein verbessertes Verfahren zum Einfrieren biologischer Proben, insbesondere zur Kryokonservierung, und/oder zum Auftauen biologischer
Proben, insbesondere kryokonservierter Proben, bereitzustellen, mit dem vitalitätsbeeinflussende Nachteile herkömmlicher Techniken überwunden werden und das insbesondere eine vereinfachte Nachverarbeitung (post-processing) der aufgetauten bi- ologischen Probe ermöglicht.
Diese Aufgaben werden durch Vorrichtungen und Verfahren mit den Merkmalen der unabhängigen Ansprüche gelöst. Vorteilhafte Ausführungsformen und Anwendungen der Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen und werden in der folgenden Beschreibung unter teilweiser Bezugnahme auf die Figuren näher erläutert .
Gemäß einem ersten Gesichtspunkt der Erfindung wird ein Tem- perierkörper für eine Multiwell-Platte bereitgestellt, zum
Einfrieren und/oder zum Auftauen von Proben, insbesondere . biologischen Proben, die sich in den Kavitäten der Multiwell- Platte befinden. Die Multiwell-Platte weist hierbei in an sich bekannter Weise eine Mehrzahl von in Reihen und Spalten angeordnete Kavitäten auf.
Der erfindungsgemäße Temperierkörper umfasst einen von einem Temperierfluid durchströmbaren Grundkörper, vorzugsweise aus einem thermisch leitfähigen Material, vorzugsweise hoher Wär- mekapazität, und eine Mehrzahl von auf einer Oberseite des Grundkörpers in Reihen und Spalten angeordneten abragenden Temperierfingern, die thermisch leitend mit dem Grundkörper verbunden sind, wobei ein Rasterabstand der Temperierfinger einem Rasterabstand der Kavitäten der Multiwell-Platte entspricht. Der Abstand benachbarter Temperierfinger entspricht somit dem Abstand benachbarter Kavitäten.
Die Erfindung umfasst also die allgemeine technische Lehre, einen Temperierkörper bereitzustellen, der an die matrixartige, regelmäßige Anordnung der Kavitäten der Multiwell-Platte angepasst ist und hierzu eine korrespondiere maxtrixartige Anordnung von Temperierfingern im Rastermaß der Anordnung der Kavitäten aufweist. Hierbei können die Kühlfinger mit ihren Stirnseiten mit den Bodenplatten der Kavitäten in Verbindung gebracht werden, wobei vorzugsweise jeweils ein Temperierfinger einer Kavität zuordenbar ist. Hierbei können die Temperierfinger stab- bzw. zäpfchenförmig ausgeführt sein, und die Stirnseiten der Temperierfinger sind so ausgeführt, dass sie flächige Auflagen für die Böden der Kavitäten der Multiwell- Platte bilden.
Ein besonderer Vorzug der Erfindung liegt somit darin, dass Proben zum Einfrieren und Auftauen nicht mehr in Einzeltubes, Straws oder spezielle Plastikcontainer etc. transferiert werden müssen, sondern mittels des erfindungsgemäßen Temperierkörpers direkt in und mit der Multiwell-Platte eingefroren und nachfolgend wieder aufgetaut werden können. Dadurch kann die Vitalitätsrate bei der Kryokonservierung von biologischen Proben erhöht werden. Ein weiterer Vorteil ist, dass ein derartig ausgeführter Temperierkörper ein schnelles Einfrieren und/oder Auftauen ermöglicht, da die Temperierfinger sehr nahe an der Probe positioniert werden können und hohe Kühl- und Erwärmungsraten direkt in der Bioprobe über die Bodenwand der Kavitäten generiert werden können.
Ferner entfällt das zeitaufwändige Transferieren in separate Einfrierbehälter; stattdessen können in einer Prozesskette durchgehend handelsübliche Multiwell-Platten verwendet wer¬ den, so dass die Verarbeitungsgeschwindigkeit und Effizienz, insbesondere für Hochdurchsatzverfahren, gesteigert werden können .
Mit dem Begriff "Probe" wird jeder Gegenstand bezeichnet, welcher in der Kavität der Kryokonservierung unterzogen wird. Das Probenmaterial umfasst typischerweise biologisches Material wie Zellen, Gewebe, Zellbestandteile oder biologische Makromoleküle sowie ggf. eine Nährlösung, Reagenzien, Gefrierschutzmittel oder weitere Substanzen.
Gemäß einer Variante der Erfindung kann ein elektrisch ansteuerbares Heiz- und/oder Kühlelement in zumindest einigen der Temperierfinger, vorzugsweise in allen, integriert sein. Beispiele für derartige Heizelemente können auch Mikrowellenoder Hochfrequenz-Elemente sein, die bei entsprechender An- steuerung gegen die Fluidkühlung des Grundkörpers eine definierte Wärmeeinleitung setzen können. Diese Variante bietet den Vorteil, dass einzelne Temperierfinger oder Teilgruppen von Temperierfingern, beispielsweise einzelne Reihen und/oder Spalten, unterschiedlich temperiert werden können. Dadurch kann der Wärme- oder Kälteeintrag über die Anordnung der Kavitäten gezielt variiert und an die in den einzelnen Kavitä- ten gelagerten Proben angepasst werden.
Gemäß einer weiteren Variante besteht die Möglichkeit, dass zur Überwachung des Wärme- oder Kälteeintrags in die Kavitäten im Stirnbereich von zumindest einem der Temperierfinger ein Temperatursensor, wie z. B. ein thermoelektrischer Sensor, integriert ist. Beispielsweise kann der Temperatursensor als flache Ausführung eines Platinwiderstands-Temperatur- sensors, wie ein PT 100- oder PT 1000-Sensor, ausgeführt sein.
Um ein möglichst schnelles Einfrieren oder Auftauen der Proben zu erreichen, ist es vorteilhaft, wenn die Stirnseiten der Temperierfinger hochpoliert sind, vorzugsweise mit Rauig- keiten unter 20pm, und/oder eine Beschichtung hoher thermischer Leitfähigkeit aufweisen, vorzugsweise mit einer thermischen Leitfähigkeit, die vergleichbar zu der von Kupfer oder Silber ist, vorzugsweise eine Beschichtung aus Graphit oder Diamant .
Entsprechend den Abmessungen handelsüblicher Multiwell- Platten können die Temperierfinger innerhalb einer Fläche mit einer Länge von 127,8 mm und einer Breite von 85,5 mm angeordnet sein. Ferner kann die Anzahl der Temperierfinger der Anzahl der Kavitäten der Multiwell-Platte entsprechen und vorzugsweise einen der folgenden Werte aufweisen: 6, 8, 12, 16, 24, 48, 96, 384 oder 1536. Ferner besteht die Möglichkeit, dass eine davon unterschiedliche Anzahl von Temperierfingern auf dem Grundkörper angeordnet ist, insbesondere ein Vielfaches der vorgenannten Varianten, um beispielsweise mit einem Temperierkörper mehrere Multiwell-Platten gleichzeitig zu temperieren.
Die Temperierfinger sind vorzugsweise aus einem Material ho- her Wärmekapazität und hoher Wärmeleitfähigkeit gefertigt, vorzugsweise aus einem metallischen Werkstoff. Insbesondere ist die Wärmekapazität der Temperierfinger höher als die einer handelsüblichen Multiwell-Platte . Der Grundkörper des Temperierkörpers umfasst wenigstens eine von einem Kühlfluid durchströmbare Leitung, mit einem Zu- flussanschluss und einem Abflussanschluss zur Verbindung der wenigstens einen Leitung mit einem Kühlkreislauf und/oder ei- nem Heizkreislauf. Der Leitungsverlauf der wenigstens einen Leitung ist vorzugsweise mäanderförmig oder spiralförmig, um ein gewünschtes Temperaturprofil gleichmäßig verteilt über den Grundkörper zu erreichen. Eine vorteilhafte Variante sieht hierbei vor, dass der Fluss eines Temperierfluids durch die wenigstens eine Leitung so steuerbar ist, dass vorbestimmte einzelne Temperierfinger und/oder wenigstens eine vorbestimmte Teilgruppe der Temperierfinger unterschiedlich im Vergleich zu den restlichen Temperierfingern temperierbar sind. Dies kann beispielsweise durch mehrere zu- und ab- schaltbare Fluidleitungen oder Leitungsabschnitte für unterschiedliche Bereiche des Kühlkörpers realisiert werden, um Teilgruppen von Temperierfingern unterschiedlich zu temperieren . Die Stirnseiten der Temperierfinger können plan oder leicht gekrümmt ausgeführt sein. Diese Ausführung eignet sich vorzugsweise für die Temperierung von Multiwell-Platten, die Ka- vitäten mit einem Flachboden oder einem leicht gekrümmten Rundboden aufweisen.
Eine weitere Variante dieser Ausgestaltungsform ist durch eine von der Mitte zu zwei gegenüberliegenden Randbereichen des Temperaturkörpers hin zunehmende Neigung der Stirnseiten der Temperierfinger gegenüber einer planen Oberseite des Grund- körpers gekennzeichnet. Die zunehmende Neigung kann durch eine zunehmende Schrägstellung der auf der planen Oberseite des Grundkörpers angeordneten Temperierfinger oder durch eine zunehmende Abschrägung der Stirnseiten der Temperierfinger ausgebildet sein. Gemäß dieser Ausgestaltungform wird ausge- nutzt, dass Multiwell-Platten meist aus Kunststoff, z. B. aus Polystyrol oder Polyvinylchlorid, gefertigt sind und sich bei Druck leicht verbiegen. Diese Verbiegung kann durch die nach außen zunehmend geneigte Ausführung der Stirnseiten der Tem- perierfinger vorteilhafterweise ausgenutzt werden, um sicher¬ zustellen, dass alle Kavitäten in planaren Kontakt mit dem Temperierkörper gelangen.
Eine weitere alternative Ausführungsform sieht vor, dass eine Außenwandung der Böden der Kavitäten und eine Stirnseite der Temperierfinger zur Ausbildung eines lokalen Formschlusses jeweils eine zueinander komplementäre formkorrespondierende nicht-plane Oberflächenform aufweisen. Mit anderen Worten ist die Stirnseite der Temperierfinger gemäß dem Schlüssel- Schloss-Prinzip als Gegenkontur zur Kontur der Unterseite der Kavitäten ausgeführt. Beispielsweise können eine Oberflächenform der Stirnseiten der Temperierfinger und eine Oberflächenform der Außenwandungen der Böden der Kavitäten zur Ausbildung eines lokalen Formschlusses als ineinandergreifende Verzahnung ausgeführt sein. Diese alternative Ausführungsform bietet den Vorzug, dass auch bei Kavitäten mit kleinen Durchmessern ein großer flächiger Kontakt zwischen Kavität und korrespondierendem Kühlfinger und damit eine vergleichsweise große Kühlfläche und schnellere Temperierung ermöglicht werden .
Die Erfindung betrifft ferner eine Anordnung aus einem Temperierkörper, wie hierin offenbart, und einer Multiwell-Platte , deren Rasterabstand ihrer in Reihen und Spalten angeordneten Kavitäten dem Rasterabstand der Temperierfinger entspricht.
Gemäß einem weiteren Gesichtspunkt der Erfindung wird eine Temperiervorrichtung zum Einfrieren von Proben, insbesondere zur Kryokonservierung, und/oder zum Auftauen von Proben, ins- besondere einer kryokonservierten Probe bereitgestellt. Die Proben können insbesondere biologische Proben sein. Die Temperiervorrichtung umfasst einen Temperierkörper wie in diesem Dokument offenbart. Die Temperiervorrichtung umfasst des Wei- teren eine Positioniereinrichtung zum Positionieren des Tem¬ perierkörpers einer Multiwell-Platte in einer vorbestimmten Lage relativ zueinander, wobei der Rasterabstand der in Rei¬ hen und Spalten angeordneten Kavitäten der Multiwell-Platte dem Rasterabstand der Temperierfinger entspricht und wobei in der vorbestimmten Lage die Multiwell-Platte oberhalb des Temperierkörpers und die Kavitäten jeweils zur Längsachse eines der Temperierfinger fluchtend positioniert sind. Die Temperiervorrichtung umfasst des Weiteren eine Einrichtung zum In- Kontakt-Bringen der Temperierfinger des Temperierkörpers mit den Böden der Kavitäten einer in der vorbestimmten Lage positionierten Multiwell-Platte.
Eine Möglichkeit der Realisierung sieht hierbei vor, dass die Einrichtung zum In-Kontakt-Bringen einen Anpresskörper um- fas-st, der von oben auf eine oberhalb des Temperierkörpers positionierte Multiwell-Platte pressbar ist, um die Böden der Kavitäten der Multiwell-Platte infolge des Anpressdrucks in Kontakt mit den Stirnseiten der Temperierfinger zu bringen. Der Anpresskörper umfasst hierbei vorzugsweise eine Kontakt- fläche mit der Multiwell-Platte von wenigstens der gleichen
Länge und Breite wie die matrixartige Anordnung der Kavitäten der Multiwell-Platte.
Bei einer weiteren vorteilhaften Ausführungsvariante der Tem- periervorrichtung umfasst die Einrichtung zum In-Kontakt- Bringen eine Mehrzahl elektrisch ansteuerbarer Stellglieder, die ausgeführt sind, an der Oberseite einer über der Temperiervorrichtung positionierten Multiwell-Platte mittelbar, z. B. über den vorgenannte Anpresskörper, oder unmittelbar anzugreifen, um bei Ansteuerung der Stellglieder einen Relativabstand zwischen der Multiwell-Platte und dem Temperierkörper zu verändern, um die Temperierfinger und die Böden der Kavitäten in Kontakt und/oder außer Kontakt zu bringen. Die elektrisch ansteuerbaren Stellglieder können als mikromechanische Aktoren oder als piezo-elektrische Stellglieder ausgeführt sein.
Es ist weiterhin vorteilhaft, die Temperiervorrichtung so auszuführen, dass die Mehrzahl der elektrisch ansteuerbaren Stellglieder von der Temperiervorrichtung einzeln und/oder in' Teilgruppen ansteuerbar sind, um einzelne Kavitäten und/oder Teilgruppen von Kavitäten, z. B. einzelne Reihen oder Spalten, unabhängig von den anderen Kavitäten in Kontakt und/oder außer Kontakt mit dem Temperierkörper bringen zu können. Diese Ausführungsvariante macht sich wiederum die Verbiegbarkeit von Multiwell-Platten in Plastikausführung zu Nutze, indem durch Ansteuerung nur derjenigen Stellglieder, die in einem ausgewählte Bereich über der Multiwell-Platte angeordnet sind, nur diejenigen Kavitäten in diesem Bereich in Kontakt oder außer Kontakt mit dem Temperierkörper gebracht werden können .
Anders als bei Kryomikroskopen, bei denen die Kühl- und Er- wärmungsrate über die Temperierung eines Kühlmediums gesteuert, wird, erfolgt dies gemäß der Temperiervorrichtung über eine vorzugsweise sehr schnelle Änderung des Kontaktes vortemperierter Kühlkörper zur Multiwell-Platte. Hierbei können die Temperierfinger alle zugleich oder in Gruppen, im Einzel- fall auch nur ein einzelner Temperierfinger, an die Unterseite der Kavitäten der Multiwellplatte angedrückt und zurückgeführt werden, so dass eine Temperaturbrücke zwischen dem Boden der Multiwellplatte und den Temperierfingern hergestellt und gelöst wird, so dass die Wärme aus der Probe heraus oder in sie hineingeführt werden kann.
Ein weiterer Vorteil der Ausführungsvariante, bei der die elektrisch ansteuerbaren Stellglieder als hochpräzise mikro¬ mechanische Aktoren oder als piezo-elektrische Stellglieder ausgeführt sind, liegt darin, dass derartige Stellglieder von einer Steuereinheit der Einrichtung zum In-Kontakt-Bringen so ansteuerbar sind, dass ein aufeinanderfolgendes In-Kontakt- Bringen, ein Außer-Kontakt-Bringen und ein Wieder-in-Kontakt- Bringen von Multiwell-Platte und Temperierkörper innerhalb einer Zeit durchführbar ist, die im Bereich von 1 ms (Milli¬ sekunde) bis 1 s (Sekunde) liegt und dies mit einer Abstands¬ genauigkeit < Ιμπι durchführbar ist. Gemäß einem weiteren As- pekt sind mittels der elektrisch ansteuerbaren Stellglieder Auslenkungen der Multiwell-Platte in Richtung des Temperierkörpers im Bereich von 1 μηι bis 1 mm erzeugbar, Dadurch kön¬ nen nahezu beliebige Temperaturprogramme und Temperaturgradi¬ entenverläufe realisiert werden.
Wie vorstehend bereits ausgeführt, ist die Temperiervorrichtung zur Handhabung einer Multiwell-Platte, deren Rasterabstand ihrer in Reihen und Spalten angeordneten Kavitäten dem Rasterabstand der Temperierfinger eines Temperierkörpers der Temperiervorrichtung entspricht, ausgeführt. Ferner kann die Temperiervorrichtung eine solche Multiwell-Platte umfassen.
Die Multiwell-Platte kann eine handelsübliche Multiwell- Platte sein. Ferner kann die Multiwell-Platte sich von han- delsüblichen Multiwell-Platten unterscheiden und für die Verwendung zur Kryokonservierung und zur Verwendung mit dem Temperierkörper und/oder der Temperiervorrichtung angepasst sein. Hierbei besteht im Rahmen der Erfindung insbesondere die Möglichkeit, dass in die Böden der Kavitäten jeweils ein elektrisch ansteuerbares Heiz- und/oder Kühlelement, vorzugsweise ein Peltier-Element , integriert ist und/oder dass in zumindest einen der Böden der Kavitäten ein Temperatursensor integriert ist. Ferner können die Böden der Kavitäten dünn und aus einem wärmeleitenden Material ausgeführt sein oder mit einer Struktur auf der Unterseite versehen sein, die einen größeren Flächenkontakt zum Temperierkörper ergeben.
Die gemäß den vorstehenden Varianten modifizierte Multiwell- Platte soll ferner auch als eigenständiger Gegenstand offenbart und beanspruchbar sein.
Die Temperiervorrichtung kann ferner in an sich bekannter Weise eine von unten kühlbare Temperierkammer bzw. Hausung, die mit einem trockenem Gas befüllbar ist und/oder befüllt ist und im gekühlten Zustand eine vertikale Temperaturschichtung in der Temperierkammer mit einer unteren Kaltschicht und einer oberen Warmschicht aufweist, sowie wenigstens eine an einer Gehäusewand der Temperierkaramer vorgesehene Schleuse zum Einbringen und/oder Ausführen einer Multiwell-Platte aufweisen. Vorteilhafterweise sind zwei derartige Schleusen vorgesehen: eine erste Schleuse, über die eine Multiwell-Platte im warmen Zustand in die Kammer eingebracht oder ausgeführt werden kann, und eine zweite Schleuse, über die eine Multi- well-Platte im kalten Zustand in die Kammer eingebracht oder ausgeführt werden kann.
Vorstehend wurde bereits festgestellt, dass die Temperiervorrichtung einen erfindungsgemäßen Temperierkörper umfasst. Insbesondere kann die Temperiervorrichtung einen in der unteren Kaltschicht der Temperierkammer angeordneten, an einen Kühlkreislauf angeschlossenen ersten Temperierkörper zur Kryokonservierung biologischer Proben und/oder einen in der oberen Warmschicht angeordneten, an einen Wärmekreislauf ange- schlossenen zweiten Temperierkörper zum Auftauen kryokonser- vierter biologischer Proben umfassen.
Gemäß einem weiteren Gesichtspunkt dieser Variante kann eine in der unteren Kaltschicht der Temperierkammer gelagerte, we¬ nigstens eine aufzutauende Probe enthaltende Multiwell-Platte mittels der Positioniereinrichtung über dem zweiten Temperierkörper positionierbar sein. Ferner kann eine über die wenigstens eine Schleuse in die Temperierkammer eingebrachte, und wenigstens eine zu gefrierende Proben enthaltende Multiwell-Platte mittels der Positioniereinrichtung über dem ersten Temperierkörper positionierbar sein. Hierzu kann die Positioniereinrichtung eine zweckmäßig ausgebildete Führungsmechanik aufweisen, um die Multiwellplatte innerhalb der Tempe- rierkammer zu verfahren. Gemäß diesem Gesichtspunkt kann eine über dem ersten und/oder zweiten Temperierkörper positionierte Multiwell-Platte mittels der Einrichtung zum In-Kontakt- Bringen gesteuert oder geregelt abgesenkt und/oder angehoben werden, um in Kontakt und/oder außer Kontakt mit dem Tempe- rierkörper gebracht zu werden.
Alternativ kann die Positioniereinrichtung auch ausgebildet sein, stattdessen den oder, die Temperierkörper hin zu der Multiwell-Platte zu verfahren.
Gemäß einem weiteren Gesichtspunkt kann die Temperierkammer mit flüssigen Gasen wie LN2, N2-Gas oder einem Sterling-Motor gekühlt sein. Beispielsweise kann in einer Wanne am Boden der Temperierkammer offen oder in ein schwammartiges Material eingebracht flüssiger Stickstoff gelagert werden, wodurch sich die vertikale Temperaturschichtung ergibt.
Ferner ist es vorteilhaft, eine Eisfalle in der Temperierkammer anzuordnen, um eine Eisbildung über die Eisfalle zu er- zwingen, falls feuchte Luft durch das Einbringen oder Ausführen einer Multiwell-Platte von außen in die Temperierkämmer eindringen sollte. Gemäß einem weiteren Aspekt ist der vertikale Temperaturver¬ lauf innerhalb der Temperierkammer so eingestellt, dass die Warmschicht eine Temperatur aufweist, die im Wesentlichen einer vorgegebenen Starttemperatur eines Einfrierprozesses oder einer vorgegebenen Zieltemperatur eines Auftauprozesses ent- spricht, während die Kaltschicht eine Temperatur aufweist, die im Wesentlichen einer vorgegebenen Zieltemperatur des Einfrierprozesses oder einer vorgegebenen Starttemperatur des Auftauprozesses entspricht. Ein weiterer Gesichtspunkt der Erfindung betrifft ein Verfahren zum Einfrieren biologischer Proben, insbesondere zur Kryokonservierung, und/oder zum Auftauen biologischer Proben, insbesondere kryokonservierter Proben, unter Verwendung eines Temperierkörpers, wie in diesem Dokument offenbart, und/oder einer -Temperiervorrichtung, wie in -diesem Dokument offenbart.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren das Aufbringen einer Substanz auf eine in einer Kavität der Multiwell-Platte gelagerte Probe.
Gemäß einer vorteilhaften Variante ist die aufgebrachte Substanz eine Lösung, die beim Festwerden eine Oberfläche des Kavitäteninhaltes gegenüber dem Außenraum abschließt, vorzugsweise gasdicht abschließt, so dass kein Deckel oder Ahn- liches als Verschluss benötigt wird. Die Substanz kann beispielsweise ein natürliches oder synthetische Öl, eine Flüssigkeit oder ein Gel, welche mit einer wässrigen Lösung nicht mischbar sind, oder festes C02 sein. Gemäß einer besonders vorteilhaften Variante wird die Substanz auf die bereits gefrorene Probe aufgebracht wird, wobei die Substanz nach und/oder beim Auftauen der Probe eine vorbestimmte Reaktion oder Interaktion mit der Probe bewirkt. Vorzugsweise wird eine Substanz eingesetzt, aus deren Zustand ableitbar ist, ob nach dem Einfrieren der Probe ein zwischenzeitliches Auftauen erfolgt ist.
Gemäß einer weiteren vorteilhaften Variante weist die Sub- stanz eine höhere Dichte als die eine die Probe umgebende Nährlösung auf, so dass sich die Reihenfolge der Probe und der Substanz nach dem Auftauen umdreht, so dass beispielsweise in einer Nährlösung schwimmende Zellen einfach entnommen werden können.
Gemäß einer weiteren vorteilhaften Variante wird eine Substanz aufgebracht, wobei aus dem Zustand der eingebrachten Substanz eine Information über die Probe ableitbar ist und/oder die Substanz beim Auftauen der Probe eine vorbe- stimmte Reaktion oder Interaktion -mit der Probe bewirkt.
Es können beispielsweise Flüssigkeiten zugegeben werden, die beim Auffrieren ein bestimmtes Muster ergeben oder eine Temperatursensorfunktion besitzen, an der man erkennen kann, ob es zwischenzeitlich ein Auftauen gegeben hat, bzw. durch die die Struktur, Farbe, Mischung etc. verändert wurden. Dabei kann es sich auch um Umkristallisierungsvorgänge handeln, die makroskopisch nicht sichtbar sind, über Streulicht-, Fluoreszenz-, Raman-Messungen oder Ähnliches aber leicht erkannt und quantifiziert werden können. Beispielsweise kann die Substanz eine Verdünnungs- und Waschlösung oder ein Gefrierschutzmittel sein, als Differenzierungsfaktor in Bezug auf die Probe wirken oder eine Substanz sein, die Antioxidantien, Anti- Apoptosesubstanzen und/oder lebend-tot-Farbstoffe enthält. Es wird betont, dass die vorgenannten Verfahrensaspekte betreffend das Aufbringen der Substanz auf eine in der Kavität gelagerte Probe auch unabhängig von der Verwendung der Temperiervorrichtung und/oder des Temperierkörpers möglich sind und daher auch unabhängig von der Verwendung der Temperiervorrichtung und/oder des Temperierkörpers beansprucht werden können .
Zur Vermeidung von Wiederholungen sollen, rein vorrichtungsge- maß offenbarte Merkmale auch als im Rahmen des Herstellungsverfahrens offenbart gelten und beanspruchbar sein.
Zusammengefasst können mit der vorliegenden Erfindung Multi- well-Platten direkt für die Kryokonservierung genutzt werden, so dass jeder Transfer in neue Behältnisse entfällt. Durch
Anpassen des Temperierkörpers an das Format der jeweils verwendeten Multiwell-Platte können prinzipiell Multiwell- Platten beliebiger Kavitätenanzahl direkt zur Kryokonservierung verwendet werden. Dadurch können bekannte Kryotechnolo- gien effizient in die bestehenden Hochdurchsatz-Prozessketten eingebunden werden können, so dass auch im Kryobereich die Automatisierungskette der Multiwell-Platten-basierten Geräteplattformen geschlossen wird. Weitere Einzelheiten und Vorteile der Erfindung werden im Folgenden unter Bezug auf die beigefügten Zeichnungen beschrieben. Es zeigen:
Figur 1 eine perspektivische Ansicht einer Multiwell-Platte und eines Temperierkörpers gemäß einer Ausführungsform der Erfindung; eine Anordnung einer Multiwell-Platte und eines Temperierkörpers, aus welchen ein Ausschnitt vergrößert und im Schnitt wiedergegeben ist; einen Querschnitt einer Multiwell-Platte und eines Temperierkörpers gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung; schematisch eine Temperiervorrichtung und ein Temperierverfahren gemäß einer Ausführungsform der Er findung;
Figur 5 schematisch das Aufbringen einer Substanz gemäß einer Ausführungsform des Verfahrens;
Figuren 6A und 6B eine Einheit aus einem Temperierfinger und einer gefüllten Kavität;
Figuren 7A und 7B einen Querschnitt einer Multiwell-Platte auf einem Temperierkörper gemäß einer weiteren Aus führungsform; und
Figuren 8A und 8B einen Querschnitt einer Multiwellplatte und eines Temperierkörpers gemäß einer weiteren Ausführungsform.
Gleiche Teile sind in den Figuren mit denselben Bezugszeichen versehen .
Figur 1 zeigt eine Multiwell-Platte 1 und eine erste Ausfüh rungsform des erfindungsgemäßen Temperierkörpers 4 in einer perspektivischen Darstellung. Hierbei ist in der Mitte sehe matisch in Schrägansicht eine handelsübliche Plastik- Multiwell-Platte 1 im standardisierten 96-Well-Format ge- zeigt. Die Kavitäten (Wells) 2 liegen dem Standard entsprechend matrixartig in acht Reihen von jeweils zwölf Kavitäten nebeneinander und stellen Vertiefungen zur Aufnahme der Probein) auf einer solchen Multiwell-Platte 1 dar. Gemäß der Norm ANSI/SBS 4 - 2004 beträgt der Rasterabstand benachbarter Kavitäten bei einer Multiwell-Platte im 96-Well-Format 9 mm.
Derartige Multiwell-Platten 1 können mit einem Plastikdeckel 3 abgedeckt sein, der in den Automaten zur Befüllung, Entlee- rung und zu anderen Manipulationen auch weggelassen werden kann. Auf der Unterseite sind die Kavitäten 2 planar mit einer dünnen Plastikscheibe oder -folie abgeschlossen, die in ihrer optischen Qualität in der Regel Mikroskopaufnahmen von adhärierten Zellen zulässt.
Unterhalb des Multiwell-Platte 1 ist in Figur 1 ein beispielhafter Temperierkörper 4 für die Multiwell-Platte 1 gezeigt. Der Temperierkörper 4 umfasst einen von einem Temperierfluid durchströmbaren quaderförmigen Grundkörper 6 und eine Mehr- zahl von auf einer Oberseite des Grundkörpers 6 in Reihen und Spalten exakt im Muster der 96er-Multiwell-Platte 1 angeordneten abragenden zylinderförmigen Temperierfingern 5. Der Temperierkörper 4 ist aus einem Material hoher Wärmekapazität bzw. guter Wärmeleitung gefertigt. In der Regel handelt es sich um Metalle, wie Silber oder Legierungen.
Korrespondierend zu der Multiwell-Platte 1 sind somit ebenfalls 96 Temperierfinger 5 matrixartig in acht Reihen von jeweils zwölf Temperierfingern 5 angeordnet. Der Rasterabstand der Temperierfinger 5 entspricht einem Rasterabstand der Kavitäten 2 der Multiwell-Platte 1, d. h., der Abstand benachbarter Temperierfinger entspricht somit dem Abstand benachbarter Kavitäten und beträgt vorliegend somit ebenfalls 9 mm. Die Temperierfinger 5 sind jeweils im Wesentlichen gleich ge- formt und regelmäßig in zwei die Kontaktfläche mit der Multi- wellplatte 1 aufspannenden und im Wesentlichen rechtwinklig zueinander stehenden Flächenrichtungen jeweils im Wesentlichen äquidistant angeordnet. Die Temperierfinger 5 können, einstückig mit dem Grundkörper 6 bereitgestellt sein. Die Temperierfinger 5 stehen in sehr gutem, in der Regel thermi¬ schen Kontakt mit dem darunter angeordneten Temperierkörper
Der Grundkörper 6 kann über mindestens 2 Öffnungen 7a, 7b mit einem Temperiergas oder einer Temperierflüssigkeit durchströmt werden. Im Temperierkörper 6 ist hierzu ein mäander- förmiger oder auch spiralförmiger Verlauf einer die beiden Öffnungen verbindenden Fluidführung realisiert, so dass ein gleichmäßiges oder gewünschtes Temperaturprofil erreicht wird, über das die Temperierfinger 5 jeweils die an ihrem Ort herrschende Temperatur annehmen.
Die Temperierfinger 5 besitzen eine möglichst hohe Wärmekapazität, die weit größer als die der Bodenbereiche der Multi- - wellplatten ist, - so dass sie bei In-Kontakt—Bringung die Temperatur des Kavitätenbereichs mit der Bioprobe dominieren und bestimmen, d. h., die Abkühlung und Erwärmung werden im Wesentlichen nur noch durch die Wärmeleitfähigkeit der Bodenbereiche der Multiwell-Platte 1 und die der Bioprobe limitiert.
Zur Kühlung und/oder Erwärmung von Bioproben, die in einer Multiwell-Platte mit einem anderen Format gelagert sind, beispielsweise in einer Multiwell-Platte mit 8, 12, 16, 24, 48, 96, 384 oder 1536 Kavitäten, kann ein entsprechend an dieses Format angepasster Temperierkörper verwendet werden, der dann entsprechend 8, 12, 16, 24, 48, 96, 384 oder 1536 Temperierfinger 5 aufweist, deren Rastermaß an das Rastermaß der Multiwell-Platte angepasst ist. Das Prinzip der Kühlung einer 96-er Multiwell-Platte 1 von Raumtemperatur auf eine Zieltemperatur von z. B. minus 150 °C wird im Folgenden am Beispiel einer gleichartigen Abkühlung aller 96 Kavitäten 2 erläutert. Durch verschiedene Temperie- rung der Reihen oder Spalten der Temperierfinger 5 oder über in den
Temperierfingern 5 befindliche Heizelemente (nicht gezeigt) können auch unterschiedliche Temperaturen an den einzelnen Temperierfingern 5 realisiert werden.
Für das Einfrieren einer 96er-Multiwell-Platte 1 wird diese zunächst auf eine Temperatur zwischen 1 °C und 15 °C gebracht, bei der von oben über Pipetten das Gefrierschutzmedium zugegeben wird. In der Zwischenzeit wurde der Temperier- körper 4 über die Durchleitung von Stickstoffgas einer Temperatur von -150 °C bis -195 °C auf die Zieltemperatur gebracht, so dass auch alle Temperierfinger 5 diese Temperatur annehmen. Nun wird über eine nachfolgend im Rahmen von Figur 4 beschriebene Mechanik die 96er-Multiwell-Platte 1 mittels eines flächig von oben aufdrückenden Andruckkörpers 8 so auf den Temperierkörper 4 gepresst, dass die Stirnseiten 5a der Temperierfinger 5 in direkten Materialkontakt zu den einzelnen Böden der 96 Kavitäten 2 der Multiwell-Platte 1 kommen. Statt des Andruckkörpers 8 kann auch eine piezogesteuerte Einrichtung zum In-Kontakt-Bringen der Temperierfinger 5 mit den Böden der Kavitäten 2 zum Andruck genutzt werden (dargestellt in Figur 3) , die es gestattet, den Kontakt des Multi- well-Substrats mit den Temperierfingern 5 durch senkrechte Bewegung zu öffnen und wieder zu schließen. Hierzu sind nur geringe Spalten im Mikrometerbereich erforderlich. Durch vielfache Wiederholung kann allein auf diesem Weg ein Temperaturprofil der gesamten Platte gefahren werden. Zusätzlich oder alternativ kann auch die Temperatur des Gasstromes durch den Grundkörper 6 verändert werden, womit sich langsame T-Profile fahren lassen, wie sie ebenfalls in der Kryokonservierung von Zellen üblich sind (beispielsweise im Bereich weniger Bruchteile °C pro Minute, einige °C pro Minute). Bei der Erwärmung wird konträr verfahren: Sehr schnell wird die Multiwell-Platte 1 mit einem auf eine hohe Temperatur gebrachten Temperierkörper 4 in Kontakt gebracht. Dieser kann mit einem warmen oder
heißen Gas oder aber auch einer entsprechenden Flüssigkeit durchströmt werden, dessen oder deren Temperatur im einfachsten Fall der Zieltemperatur, z. B. 10 °C, entspricht, bei der dann das Gefrierschutzmedium ausgewaschen wird, oder direkt auf 37 °C. Hierbei wird die Multiwell-Platte 1 ebenfalls rasch an den Temperierkörper 4 angedrückt.
Für extrem rasche Erwärmungen, die bei Stammzellen und insbesondere IPS erwünscht sind, wird der Temperierkörper 4 auf 40 °C bis 300 °C gebracht und nur so lange in thermischen Kontakt mit- der Multiwell-Platte 1 gebracht, -bis die Zieltemperatur erreicht ist. Auch bei der Erwärmung lassen sich über Öffnen und Schließen des thermischen Kontakts zwischen den Temperierfingern 5 und den Kavitäten 2 die Temperatur- Verläufe steuern.
Figur 2 zeigt im unteren Teil im Schnitt einen Temperierkörper 24, der wiederum einen von einem Temperierfluid durchströmbaren Grundkörper 6 und eine Mehrzahl von auf der Oberseite 6a des Grundkörpers 6 in Reihen und Spalten angeordne- ten abragenden Temperierfingern 25 aufweist. Der Rasterabstand der Temperierfinger 25 entspricht wieder dem Rasterabstand der Kavitäten 2 der Multiwell-Platte 1, die in Figur 2 mittig in einem Ausschnitt vergrößert und im Schnitt wiedergegeben ist. Darüber ist die Multiwell-Platte 1 in schräger Aufsicht mit dem markierten Bereich gezeigt, der als Schnitt benutzt wird.
In den Kavitäten 2 befindet sich jeweils oben ein Gasraum 23 und die Bioprobe 20 mit adhärierten Zellen 21 an der Obersei¬ te der Bodenplatte 11 der Kavitäten 2. Im Ausführungsbeispiel ist die Multiwell-Platte 1 noch mit einem Deckel 3 abgedeckt.
Um einen guten Andruck und damit thermischen Kontakt zwischen dem Temperierkörper 24 und der Multiwell-Platte 1 zu erreichen, sind die Temperierfinger 25 gemäß dieser Ausführungsvariante nicht senkrecht stehend auf der Oberfläche 6a des Grundkörpers 6, sondern zu den Rändern der Multiwell-Platte 1 zunehmend geneigt. Dies ist in der Figur durch die gestri- chelte Linie 5c und die beiden Längsachsen 5b von im Außenbereich angeordneten Temperierfingern 25, die im Vergleich zu der Längsachse 5d eines mittig angeordneten Temperierfingers 25 nach außen gekippt sind, übertrieben dargestellt. Durch den flächigen Andruck von oben oder unten wird die Multiwell- Platte 1 ein wenig linsenförmig verbogen, wodurch gesichert ist, das alle Kavitäten 2 mit ihrer Bodenunterseite 11 in gleich guten planaren Kontakt mit den Temperierfingern 25 gelangen. Die Oberfläche der Temperierfinger, insbesondere der Stirnseite 25a kann, wie an einem Beispiel zylinder in Figur 2 beispielhaft illustriert, mit einer gut wärmeleitfähigen
Schicht 9 bedeckt sein, wodurch sehr rasche Abkühlungen und Erwärmungen möglich werden. Zusätzlich können Heiz- bzw. Kühlelemente 10 in den Temperierfingern 25 integriert sein, über die einzelne Elemente in der Temperatur gesteuert werden.
Hierzu befinden sich nahe oder auf der Stirnfläche der Temperierfinger 5 Temperatursensoren 12, z. B. in flacher Ausführung eines Platinwiderstands-Temperatursensors , wie ein PT 100- oder PT 1000-Sensor. Zur Vereinfachung der Darstellung sind die vorgenannten Temperatursensoren 12, die Schicht 9 hoher Wärmeleitfähigkeit oder die Heiz- bzw. Kühlelemente 10 schematisch nur für ein bzw. zwei Temperierfinger 25 eingezeichnet, können jedoch an allen Temperierfingern 25 vorgese¬ hen sein.
Figur 3 zeigt in Analogie zu Figur 2 einen Querschnitt einer Multiwell-Platte 1, die sich in Kontakt zum Temperierkörper 24 befindet. Die Besonderheit dieses Ausführungsbeispiels liegt darin, dass piezo-elektrische Stellglieder 30 auf dem Deckel der Multiwell-Platte 1 fest angeordnet sind, so dass über die Ausdehnung oder Schrumpfung der piezo-elektrischen Stellglieder 30 (dargestellt durch die Pfeile) der Kontakt der Kavitäten 2 zu den Temperierfingern 25 hergestellt oder unterbrochen wird. Es handelt sich um Auslenkungen im Bereich von 1 bis einigen 100 μπκ
Figur 4 zeigt beispielhaft eine Temperiervorrichtung 40 zur automatisierten und direkten Kryokonservierung von in Multi- well-Platten 1 gelagerten Bioproben. Die Vorrichtung 40 um- fasst eine temperierte Kammer 48, in der" sich keine Feuchtig¬ keit befindet, damit sich keine Luftfeuchtigkeit als Eis niederschlagen kann. Die Kammer 48 weist des Weiteren Bereiche auf, die mindestens die Ausgangstemperatur der Multiwell- Platte als auch die gewünschte Zieltemperatur besitzen.
Am Boden der Temperierkammer 48 befindet sich hierzu eine Wanne 43, in der sich offen oder in einem schwammartigen Material, z. B. Stahlwolle, poröses Aluminium etc., flüssiger Stickstoff (LN2) befindet. Dieser ist mit einem Lochblech 44 abgedeckt, das verhindern soll, dass Teile in den Stickstoffsee mit einer Temperatur von -196 °C hineinfallen können . Durch die Verdunstung des LN2 entsteht im Innenraum eine tro¬ ckene Stickstoffatmosphäre, die sich in horizontalen Schich¬ ten so strukturiert, dass sich ein nahezu linearer T-Gradient mit einer unteren Kaltschicht 43a bei ca. -196 °C und einer oberen Warmschicht 43b bei ca. 10 °C oder wärmer herausbildet .
Des Weiteren sind zwei Schleusen 47a und 47b dargestellt, die an der Gehäusewand der Temperierkammer 48 angeordnet sind. Über die Schleuse 47a wird eine Multiwell-Platte 1 warm in die Temperierkammer 48 eingebracht oder ausgeführt. Über die Schleuse 47b kann eine Multiwell-Platte 1 kalt in die Temperierkammer 48 eingebracht oder ausgeführt werden. Falls durch das Einbringen oder bei der Entnahme einer Multi- well-Platte 1 von außen feuchte Luft in die Temperierkammer
48 eindringen sollte, wird die Eisbildung über eine Eisfalle
49 erzwungen. Das ist ein gekühlter Körper im warmen Bereich 43b. Um über die Eingriffe keine Feuchtigkeit einzubringen, kann nochmals eine Haube (nicht dargestellt) oben auf die
Temperierkammer 48 und über die Schleusen 47a, 47b aufgesetzt werden, über die der gasförmige trockene Stickstoff entweicht. Das Gesamtsystem 40 ist nicht druckdicht abgeschlossen, sondern besitzt oben ein siphonartiges Auslassrohr (hier nicht dargestellt) .
In der Temperierkammer 48 befindet sich ortsfest ein erster gekühlter Temperierkörper 41 für die Abkühlung von eingebrachten Bioproben bzw. der Multiwellplatte 1 und ein zweiter erwärmter Temperierkörper 42 für die Erwärmung der Bioproben bzw. Multiwellplatten . Beide müssen nicht gleichartig ausgeführt sein. So kann z. B. die Fläche der Stirnseiten bei der Erwärmungstemperiereinheit 42 der geschrumpften Multiwellsub- stratgeometrie bei -150°C angepasst sein, d. h. die Fläche der Stirnseiten des Temperierkörpers 42 für die Erwärmung sind etwas kleiner ausgeführt als die Stirnseiten des Temperierkörpers 41 für die Abkühlung. Die Vorrichtung 40 umfasst ferner eine Positioniereinrichtung (nicht dargestellt) , mittels der die zu temperierenden Multi- well-Platten 1 innerhalb der Kammer 49 gemäß den durch die Pfeile 45a-c oder durch die Pfeile 46a-c illustrierten Ver- fahrwegen verfahren werden können und mittels der die Multi- well-Platten insbesondere exakt ausgerichtet oberhalb der Temperierkörper 41 und 42 positioniert werden können. Die Pfeile 45a-c zeigen hierbei den zeitlichen und räumlichen Ablauf bei einer Erwärmung einer tiefkalten Multiwell-Platte 1. Die Pfeile 46a-c illustrieren den Verlauf bei einer Abkühlung einer Multiwell-Platte 1. Die über die Pfeile angegebenen Wege werden mittels mechanischer Elemente der Positioniereinrichtung durchlaufen, deren Antriebe sich vorzugsweise außerhalb der Temperierkammer 48 befinden und über eine herkömmliche Führungsmechanik, wie z. B. Stangen, Wendeln etc. (nicht dargestellt), die-Multi-well-Platten - l--verfahren .
So wird beispielweise eine Multiwell-Platte 1, die zu gefrierende Bioproben enthält, über die Schleuse 47a in die Temperierkammer 48 eingebracht (Pfeil 46a) und mittels der Positi- oniereinrichtung in die Kaltschicht 43a verfahren und dort oberhalb des ersten, auf der Lochplatte 44 stehenden Temperierkörpers 41 positioniert (Pfeil 46b). Die Positionierung erfolgt derart, dass die Kavitäten der Multiwell-Platte 1 jeweils zur Längsachse eines der Temperierfinger des Temperier- körpers 41 fluchtend positioniert sind. Anschließend wird die so positionierte Multiwell-Platte mittels einer Einrichtung zum In-Kontakt-Bringen (nicht dargestellt), wie z. B. vorstehend im Zusammenhang mit Figur 3 beschrieben, gesteuert oder geregelt abgesenkt, um in Kontakt mit dem Temperierkörper 41 gebracht zu werden,
Nach Erreichung der Zieltemperatur kann die Multiwell-Platte 1 entweder zur Lagerung in der unteren Kaltschicht 43a abgelegt werden oder zur Weiterverarbeitung über die zweite
Schleuse 47a aus der Temperierkämmer 48 herausgeführt werden (Pfeil 46c) . Figur 5 illustriert schematisch das Aufbringen einer Substanz auf die in den Kavitäten 2 gelagerten Bioproben und zeigt hierzu Reihe von Kavitäten 2 mit einer Flüssigkeitsfüllung 20 und Zellen 21 auf den Kavitätenböden 11. Die Reihe der Kavitäten 2 befindet sich mit den Bodenplatten 11 in thermischem Kontakt zu den Temperierfingern 5. Vor, während der Kühlung oder Erwärmung sowie danach im gefrorenen oder aufgetauten Zustand werden weitere Substanzen 51 mit einer Pipettierein- richtung 50, z. B. mit einem Pipettierroboter , in die Kavitäten 2 zugegeben. Das können zum Beispiel Gefrierschutzmittel, Partikelsuspensionen, sich verfestigende Gele und Ähnliches sein, die beim Einfrieren hilfreich sind, es kann sich dabei aber auch um Verschlussmaterial handeln, das beim Festwerden die Oberfläche des eigentlichen Kavitäteninhaltes gegenüber dem Außenraum abschließt, so dass kein Deckel oder anderes als Verschluss benötigt wird, was die Automatisierungsprozesse vereinfacht. Es können aber auch Flüssigkeiten zugegeben werden, die beim Auffrieren ein bestimmtes Muster ergeben o- der eine Temperatursensorfunktion besitzen, an der man erkennen kann, ob es zwischenzeitlich ein Auftauen gegeben hat, bzw. durch die die Struktur, Farbe, Mischung etc. verändert wurde. Dabei kann es sich auch um Umkristallisierungsvorgänge handeln, die makroskopisch nicht sichtbar sind, über Streulicht-, Fluoreszenz-, Raman-Messungen oder Ähnliches aber leicht erkannt und quantifiziert werden können. Von besonderer Bedeutung ist das Aufbringen von Substanzen in fester oder flüssiger Form in die Kavitäten 2, wenn deren Inhalt 20 bereits gefroren ist. Das können Differenzierungsfak- toren für Stammzellen, die nach dem Auftauen sofort wirksam werden, Schutzmaterialien, oder genetisches Material sein, das sich erst nach dem Auftauen mit der darunter befindlichen Lösung verbindet. Das können auch Verdünnungsmedien sein, die nach dem Auftauen die Konzentration der Gefrierschutzmittel verringern.
Figuren 6A zeigt eine Anordnung aus einem Temperierfinger 5 und einer Kavität 2. In der Kavität 2 befindet sich eine Füllung, die aus drei Materialien besteht. Unten am Boden befin- det sich das Kulturmedium 60, in dem sich die Bioproben (hier als Zellen auf der Bodenplatte dargestellt) befinden, darüber ein Medium 61, das nach dem Gefrieren des Mediums 60 aufgebracht wurde, so dass es mit diesem nicht vermischt ist. Das Ganze wird abgedeckt mit einem weiteren Medium 62, das einen gasdichten Abschluss -zur Außenatmosphäre ergibt. Bei dem Medium 62 kann es sich um ein natürliches oder synthetisches Öl, eine mit wässrigen Lösungen nicht mischbare Flüssigkeit, ein Gel oder auch um festes C02 handeln. Der Vorteil derartiger Anordnungen ist, dass sie optimal auf den Vorgang des Auftauens oder Tiefgefrierens angepasst werden können. Die
Art und Anordnung der Medien bestimmt die Reaktion beim Auftauen. So finden gestaffelte Verflüssigungen bei unterschiedlichen Temperaturen statt. Je nach Zusammensetzung der Füllung können sich Medien sich so verlagern, dass eine neue Reihenfolge entsteht, wie in Figur 6B dargestellt.
Figur 6B zeigt zwei unterschiedliche Zustände einer Anordnung aus einem Temperierfinger 5 und einer Kavität 2. Im ersten, mit „I" bezeichneten Zustand ist die Anordnung im kalten Zu- stand gezeigt, in dem Nährmedium 60 gefroren ist, während im zweiten, mit „II" bezeichneten Zustand die Anordnung im warmen Zustand gezeigt ist, in dem die Nährlösung 60 aufgetaut ist. Bringt man zum Beispiel im gefrorenen Zustand ein Sili- konöl 63 auf das feste Nährmedium 60 auf, das eine höhere Dichte als die Nährlösung 60 aufweist, dann wird sich diese Schichtung nach dem Flüssigwerden beider Phasen bei Temperaturerhöhung in der Reihenfolge umdrehen. Da sich beim Auftauen Zellen 64 leicht von der Oberfläche lösen und in Suspensi- on gehen, schwimmen diese nach dem Auftauen in der nach oben steigenden, am Ende überschichteten Nährlösung 60, die sehr einfach, ohne einen Deckel abnehmen zu müssen, in Automaten entnommen werden können. Alternative Varianten lassen sich für das Einfrieren entwickeln, indem z. B. Glyzerinlösungen verwendet werden, die bis zu Temperaturen von -40 °C und tiefer flüssig bleiben oder aber überhaupt keinen festen Zustand einnehmen. Ein besonderer Vorteil dieser Anordnung und Verfahrensweise ist die Mög- lichkeit der Kontrolle der eingehaltenen Tiefkühllagerung von Proben und die Kombination von Materialien in festem und flüssigem Zustand, die bei Normaltemperatur nicht möglich sind . Die Figuren 7A und 7B zeigen zwei klassische Wellplatten 70, 71 mit größeren Kavitäten 72, mit einem Durchmesser von ca. 2 bis 3 cm. Die Wellplatten 70, 71 sind als Spritzgussteil in einer für das Einfrieren in der Gesamtheit der Multiwellplat- te modifizierten Form ausgeführt. Die Bodenplatte 75 besteht aus einem die Wärme gut leitenden dünnen Material, z. B. aus einem Polymer, einem Metall, einer Metallbeschichtung oder auch Diamant, so dass die Wärme gut über den Kühl- oder
Erwärmungsraum 74, der sich in einem stabilen Kühl- oder Erwärmungskörper 73 befindet, ab- oder eingeleitet werden kann. Die Wellplatten 70, 71 werden von oben an die Temperierein¬ heit 73 angedrückt und können durch Erzeugen eines leichten Unterdrucks über die Hohlräume 76 in der Wellplatte gebogen werden. Diese Variante der Gesamtkühlung der Multiwellsub- strate ist eine vereinfachte Form, die mit den Temperierkör¬ pervarianten entsprechend den Figuren 1 bis 6 kombiniert wer¬ den kann. Eine solche Möglichkeit der Kombination ist die Einbringung des Temperierkörpers 4, 24 in den Raum 74. Dieser wird mit einer Kühl- oder Erwärmungsflüssigkeit oder dem Tem- periergas durchströmt, wodurch die entsprechenden Temperaturverläufe über den Multiwellsubstratboden 75 in die Kavitäten 72 übertragen werden. Bei allen Varianten können wiederum Temperatursensoren integriert sein, z. B. in Form von flachen Pt-100- oder Pt-1000-Sensoren, die auf der Bodenplatte 75 o- der in jeder Kavität 72 angeordnet sind. Alternativ kann auch in einer Referenzkavität mit ähnlicher oder gleicher Füllung ein Temperatursensor angeordnet sein, der die Regelwerte für die Steuerung der Temperaturverläufe liefert. Die Figuren 8A und 8B zeigen einen Querschnitt einer Multi- wellplatte und eines Temperierkörpers gemäß einer weiteren Ausführungsform. Hierbei zeigt Figur 8A einen Querschnitt einer Anordnung aus einer Multiwell-Platte 1 und einem Temperierkörper 4, die beide noch nicht in Kontakt miteinander stehen. In Figur 8B ist eine einzelne Kavität 2 mit dem darunter stehenden Temperierzylinder 25 gezeigt. Gekennzeichnet durch die gestrichelten Linien ist in Figur 8B ferner ein stark vergrößerter Ausschnitt des Kavitätenbodenbereichs mit den Zellen 21 zu sehen. Der Kühlkontakt kann nun für schnel- lere Temperatur-Gradienten-Prozesse wesentlich erhöht werden, indem die Topographie der auf der Bodenplatte 11 der Kavitäten 2 befindlichen Schicht 82 mit einem Gegenstück auf dem Temperierkörper nach dem Schlüssel-Schloss-Prinzip ausgeführt wird. Mit anderen Worten weisen die Stirnseiten 25a der Tem- perierzylinder 25 und die untere Bodenseite 11 der Kavitäten 2 zur Ausbildung eines, lokalen Formschlusses jeweils eine zueinander komplementäre formkorrespondierende nicht-plane Oberflächenform 82, 83 auf. Die gezeigte Spitzentopographie ist nur eine beispielhafte Möglichkeit.
Obwohl die Erfindung unter Bezugnahme auf bestimmte Ausführungsbeispiele beschrieben worden ist, ist es für einen Fachmann ersichtlich, dass verschiedene Änderungen ausgeführt werden können und Äquivalente als Ersatz verwendet werden können, ohne den Bereich der Erfindung zu verlassen. Zusätzlich können viele Modifikationen ausgeführt werden, ohne den zugehörigen Bereich zu verlassen. Folglich soll die Erfindung nicht auf die offenbarten Ausführungsbeispiele begrenzt sein, sondern soll alle Ausführungsbeispiele umfassen, die in den Bereich der beigefügten Patentansprüche fallen. Insbesondere beansprucht die Erfindung auch Schutz für den Gegenstand und die Merkmale der Unteransprüche unabhängig von den in Bezug genommenen Ansprüchen.

Claims

ANSPRÜCHE 1. Temperierkörper (4; 24) für eine Multiwell-Platte (1), die eine Mehrzahl von in Reihen und Spalten angeordnete
Kavitäten (2) aufweist, zum Einfrieren und/oder zum Auftauen von biologischen Proben, umfassend
einen von einem Temperierfluid durchströmbaren Grundkörper (6) ; und
eine Mehrzahl von auf einer Oberseite des Grundkörpers (6) in Reihen und Spalten angeordneten abragenden Temperierfingern (5; 25), wobei ein Rasterabstand der Temperierfinger (5; 25) einem Rasterabstand der Kavitäten (2) der Multiwell-Platte (1) entspricht.
2. Temperierkörper (24) gemäß Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, dass ein elektrisch ansteuerbares Heiz- und/oder Kühlelement (10) in zumindest einigen der
Temperierfinger (25) integriert ist.
3. Temperierkörper (24) gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass im Stirnbereich (25a) von zumindest einem der Temperierfinger (25) ein Temperatursensor (9) integriert ist.
4. Temperierkörper gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Stirnseiten (5a; 25a) der Temperierfinger (5; 25)
(a) flächige Auflagen für die Böden (11) der Kavitäten (2) der Multiwell-Platte (1) bilden; und/oder
(b) eine Beschichtung aus Graphit oder Diamant aufweisen.
5. Temperierkörper (4; 24) gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, (a) dass die Temperierfinger (5; 25) innerhalb einer Fläche mit einer Länge von 127,8 mm und einer Breite von 85,5 mm angeordnet sind; und/oder
(b) dass die Anzahl der Temperierfinger (5; 25) der Anzahl der Kavitäten (2) der Multiwell-Platte (1) entspricht und
vorzugsweise einen der folgenden Werte aufweist: 6, 8, 12, 16, 24, 48, 96, 384 oder 1536.
6. Temperierkörper (24) gemäß einem der Ansprüche 1-3 oder 5, dadurch gekennzeichnet,
(a) dass eine Außenwandung der Böden (11) der Kavitäten (2) und eine Stirnseite (25a) der Temperierfinger (5) zur
Ausbildung eines lokalen Formschlusses jeweils eine zueinander komplementäre formkorrespondierende nicht-plane
Oberflächenform (82, 83) aufweisen; und/oder
(b) dass eine Oberflächenform (83) der Stirnseiten (25a) der Temperierfinger (25) und der Außenwandungen (82) der Böden
(11) der Kavitäten (2) zur Ausbildung eines lokalen
Formschlusses als ineinandergreifende Verzahnung ausgeführt sind.
7. Temperierkörper (24) gemäß einem der vorhergehenden
Ansprüche, gekennzeichnet durch eine von der Mitte zu zwei gegenüberliegenden Randbereichen des Temperaturkörpers (24) hin zunehmende Neigung der Stirnseiten (25a) der
Temperierfinger (25) gegenüber einer planen Oberseite (6a) des Grundkörpers (6) .
8. Temperierkörper (24) nach Anspruch 7, dadurch
gekennzeichnet, dass die zunehmende Neigung durch eine
zunehmende Schrägstellung der auf der planen Oberseite (6a) des Grundkörpers (6) angeordneten Temperierfinger (25) oder durch eine zunehmende Abschrägung der Stirnseiten der
Temperierfinger ausgebildet ist.
9. Temperierkörper (4; 24) gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in den Grundkörper (6) wenigstens eine von einem Temperierfluid durchströmbare
Leitung integriert ist, mit einem Zuflussanschluss (7a) und einem Abflussanschluss (7a) zur Verbindung der wenigstens einen Leitung mit einem Kühlkreislauf und/oder einem
Heizkreislauf, wobei der Fluss des Temperierfluids durch die wenigstens eine Leitung steuerbar ist, derart, dass
vorbestimmte einzelne Temperierfinger (5; 25) und/oder
wenigstens eine vorbestimmte Teilgruppe der Temperierfinger (5; 25) unterschiedlich im Vergleich zu den restlichen
Temperierfingern (5; 25) temperierbar sind.
10. Anordnung aus
(a) einem Temperierkörper gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9; und
(b) einer ultiwell-Platte , deren Rasterabstand ihrer in Reihen und Spalten angeordneten Kavitäten dem Rasterabstand der Temperierfinger des Temperierkörpers entspricht.
-
11. Temperiervorrichtung (40) zum Einfrieren von biologischen Proben, insbesondere zur Kryokonservierung, und/oder zum
Auftauen von biologischen Proben, insbesondere einer
kryokonservierten Probe, umfassend
einen Temperierkörper (4; 24; 41, 42) gemäß einem der
Ansprüche 1 bis 9,
eine Positioniereinrichtung zum Positionieren einer
Multiwell-Platte (1), deren Rasterabstand ihrer in Reihen und Spalten angeordneten Kavitäten dem Rasterabstand der
Temperierfinger (5; 25) entspricht, und des Temperierkörpers (4; 24; 41, 42) in einer vorbestimmten Lage relativ
zueinander, wobei in der vorbestimmten Lage die Multiwell- Platte oberhalb des Temperierkörpers (4; 24; 41, 42) und die Kavitäten (2) jeweils zur Längsachse eines der Temperierfinger (5; 25) fluchtend positioniert sind; und eine Einrichtung zum In-Kontakt-Bringen der
Temperierfinger (5) des Temperierkörpers (4; 24; 41, 42) mit den Böden (11) der Kavitäten (2) einer in der vorbestimmten Lage positionierten Multiwell-Platte (1) .
12. Temperiervorrichtung (40) gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Einrichtung zum In-Kontakt-Bringen einen Anpresskörper (8) umfasst, der von oben auf eine
oberhalb des Temperierkörpers (41, 42) positionierte
Multiwell-Platte (1) pressbar ist, um die Böden (11) der
Kavitäten (2) der Multiwell-Platte (1) in Kontakt mit den Stirnseiten (5a) der Temperierfinger (5; 25) zu bringen.
13. Temperiervorrichtung (40) gemäß Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Einrichtung zum In-Kontakt- Bringen eine Mehrzahl elektrisch ansteuerbarer Stellglieder umfasst, die ausgeführt sind, an der Oberseite einer über der Temperiervorrichtung (4; 24; 41, 42) positionierten Multiwell- Platte (1) mittelbar oder unmittelbar anzugreifen, um bei Ansteuerung der Stellglieder einen Relativabstand zwischen der Multiwell-Platte (1) und dem Temperierkörper (4; 24; 41, 42) zu verändern, um die Temperierfinger (5; 25) und die Böden (11) der Kavitäten (2) in Kontakt und/oder außer Kontakt zu bringen .
14. Temperiervorrichtung (40) gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet,
(a) dass die elektrisch ansteuerbaren Stellglieder als mikromechanische Aktoren oder als piezo-elektrische
Stellglieder (30) ausgeführt sind; und/oder
(b) dass die Mehrzahl der elektrisch ansteuerbaren
Stellglieder von der Temperiervorrichtung (4; 24; 41, 42) einzeln und/oder in Teilgruppen ansteuerbar sind, um einzelne Kavitäten (2) und/oder Teilgruppen von Kavitäten (2)
unabhängig von den anderen Kavitäten in Kontakt und/oder außer Kontakt mit dem Temperierkörper (4; 24; 41, 42) zu bringen; und/oder
(c) dass mittels der elektrisch ansteuerbaren Stellglieder eine Auslenkung der Multiwell-Platte (1) in Richtung des
Temperierkörpers (4; 24; 41, 42) im Bereich von 1 μιη bis 1 mm erzeugbar ist;
und/oder
(d) dass die elektrisch ansteuerbaren Stellglieder von einer Steuereinheit der Einrichtung zum In-Kontakt-Bringen so ansteuerbar sind, dass ein aufeinanderfolgendes In-Kontakt- Bringen, ein Außer-Kontakt-Bringen und ein Wieder-In-Kontakt- Bringen von Multiwell-Platte (1) und Temperierkörper (4; 24; 41, 42) innerhalb einer Zeit durchführbar ist, die im Bereich von 1 ms (Millisekunde) bis 1 s (Sekunde) liegt.
15. Temperiervorrichtung gemäß einem der Ansprüche 11 bis 14, umfassend eine Multiwell-Platte (1), deren Rasterabstand ihrer in Reihen und Spalten angeordneten Kavitäten dem Rasterabstand der Temperierfinger (5; 25) entspricht.
. . -
16. Temperiervorrichtung gemäß Anspruch 15, dadurch
gekennzeichnet,
(a) dass in die Böden der Kavitäten (2) jeweils ein elektrisch ansteuerbares Heiz- und/oder Kühlelement, vorzugsweise ein Peltier-Element , integriert ist; und/oder
(b) dass in zumindest einen der Böden der Kavitäten (2) ein Temperatursensor integriert ist; und/oder
(c) dass die Böden der Kavitäten (2) wärmeleitend ausgeführt sind.
17. Temperiervorrichtung (40) gemäß einem der Ansprüche 11 bis 16, gekennzeichnet durch
eine von unten kühlbare Temperierkammer (48), die mit einem trockenem Gas befüllbar ist und/oder befüllt ist und im gekühlten Zustand eine vertikale Temperaturschichtung in der Temperierkammer (48) mit einer unteren Kaltschicht (43a) und einer oberen Warmschicht (43b) aufweist;
wenigstens eine an einer Gehäusewand der Temperierkammer (48) vorgesehene Schleuse (47a, 47b) zum Einbringen und/oder Ausführen einer Multiwell-Platte (1);
einen in der unteren Kaltschicht (43a) angeordneten, an einen Kühlkreislauf angeschlossenen ersten Temperierkörper (41) zur Kryokonservierung biologischer Proben und/oder einen in der oberen Warmschicht (43b) angeordneten, an einen
Wärmekreislauf angeschlossenen zweiten Temperierkörper (42) zum Auftauen kryokonservierter biologischer Proben.
18. Temperiervorrichtung gemäß Anspruch 17, dadurch
gekennzeichnet,
(a) dass eine aufzutauende Proben enthaltende Multiwell-Platte (1) mittels der Positioniereinrichtung über dem zweiten
Temperierkörper (42) positionierbar ist; und
(b) dass eine über die wenigstens eine Schleuse (47a) in die Temperierkammer (48) eingebrachte, zu gefrierende Proben
-enthaltende Multiwell-Platte (1) mittels der
Positioniereinrichtung über dem ersten Temperierkörper (41) positionierbar ist; und
(c) dass eine über dem ersten und/oder zweiten Temperierkörper (41, 42) positionierte Multiwell-Platte (1) mittels der
Einrichtung zum In-Kontakt-Bringen gesteuert oder geregelt abgesenkt und/oder angehoben werden kann, um in Kontakt
und/oder außer Kontakt mit dem Temperierkörper (41, 42) gebracht zu werden.
19. Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet,
(a) dass die Temperierkammer (48) mit Flüssigstickstoff (LN2), Stickstoff (N2)-Gas oder einem Sterling-Motor gekühlt ist;
und/oder (b) dass in der Temperierkammer (48) eine Eisfalle (49) angeordnet ist; und/oder
(c) dass die Warmschicht (43b) eine Temperatur aufweist, die im Wesentlichen einer vorgegebenen Starttemperatur eines
Einfrierprozesses oder einer vorgegebenen Zieltemperatur eines Auftauprozesses entspricht, während die Kaltschicht (43a) eine Temperatur aufweist, die im Wesentlichen einer vorgegebenen Zieltemperatur des Einfrierprozesses oder einer vorgegebenen Starttemperatur des Auftauprozesses entspricht.
20. Verfahren zum Einfrieren biologischer Proben, insbesondere zur Kryokonservierung, und/oder zum Auftauen biologischer Proben, insbesondere kryokonservierter Proben, unter
Verwendung eines Temperierkörpers nach einem der Ansprüche 1 bis 9 und/oder einer Temperiervorrichtung nach einem der
Ansprüche 11 bis 19.
21. Verfahren nach Anspruch 20, gekennzeichnet durch den
Schritt:
-■■ ■ Aufbringen einer Substanz (51, 61, 62, 63) auf eine in einer Kavität (2) der Multiwell-Platte (1) gelagerte Probe (20) .
22. Verfahren gemäß Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet,
(a) dass die aufgebrachte Substanz eine Lösung (62) ist, die beim Festwerden eine Oberfläche des Kavitäteninhaltes
gegenüber dem Außenraum abschließt, vorzugsweise gasdicht abschließt; und/oder
(b) dass die Substanz ein natürliches oder synthetisches Öl, eine Flüssigkeit oder ein Gel, welche mit einer wässrigen
Lösung nicht mischbar sind, oder festes Kohlenstoffdioxid
(C02) ist; und/oder
(c) dass die Substanz (63) eine höhere Dichte als die eine die Probe umgebende Nährlösung (60) aufweist.
23. Verfahren gemäß Anspruch 21 oder 22, dadurch gekennzeichnet,
(a) dass die Substanz beim Auftauen der Probe eine
vorbestimmte Reaktion oder Interaktion mit der Probe bewirkt; und/oder
(b) dass die Substanz eine Verdünnungs- und Waschlösung oder ein Gefrierschutzmittel ist, als Differenzierungsfaktor in Bezug auf die Probe wirkt oder eine Substanz ist, die
Antioxidantien, Anti-Apoptosesubstanzen und/oder lebend-tot- Farbstoffe enthält.
24. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 21 bis 23, dadurch gekennzeichnet,
(a) dass die Substanz (63) auf die bereits gefrorene Probe (60, 64) aufgebracht wird und die Substanz nach und/oder beim
Auftauen der Probe (60, 64) eine vorbestimmte Reaktion oder Interaktion mit der Probe bewirkt (60, 64); und/oder
(b) dass die Substanz eine Substanz (63) ist, aus deren Zustand ableitbar ist, ob nach dem Einfrieren der Probe ein zwischenzeitliches Auftauen erfolgt ist.
* * * * *
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