CN107257710B - 用于多孔板的温度控制体及用于冷冻和/或解冻生物样本的方法和设备 - Google Patents

用于多孔板的温度控制体及用于冷冻和/或解冻生物样本的方法和设备 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于多孔板(1)以用于冷冻和/或解冻生物样本的温度控制体(4)，所述多孔板包括布置成行和列的多个腔(2)。所述温度控制体(4)包括：基体(6)，温度控制流体能够流动通过所述基体，基体优选地由导热的材料制成；以及在基体(6)的上侧上布置成行和列的突出的多个温度控制指(5)，温度控制指以导热的方式连接至基体(6)，其中，温度控制指(5)的网格间距对应于多孔板(1)的腔(2)的网格间距。本发明还涉及用于冷冻生物样本、特别是用于低温保存的和/或用于解冻生物样本、特别是低温保存的样本的设备和方法。

Description

用于多孔板的温度控制体及用于冷冻和/或解冻生物样本的 方法和设备
技术领域
本发明涉及一种用于多孔板的温度控制体。此外，本发明还涉及用于冷冻生物样本、特别是用于低温保存的和/或用于解冻生物样本、特别是低温保存的样本的设备和方法。
背景技术
特别是用于样本数量从几万到数百万的活细胞材料的储存的机构和商业冷库的日益扩大，需要自动化工艺步骤。一方面，为了实现低成本的储存条件，另一方面如目前在生物医学领域越来越需要的那样，为了系统地实施SOP条件(SOP：标准操作程序)、为了无缝文档以及为了通过实验室人员排除主观影响，这是必要的。
在医药行业、在医学方面和在大部分生物技术方面，已经建立自动化样本接收程序，这主要是在高通量筛选(所谓的SBS标准)的发展过程中形成。在此，非常小的圆形梳结构的多孔基底用于实验室的实践中，从而形成布置成行和列的反应空间、也被称为孔、腔或杯，样本的最小部分、例如细胞材料、血液样本等被引入所述反应空间中。这些是具有6、8、16、24至96个及以上的单独孔的扁平塑料多孔基板。这些格式同时被全球标准化，并被用于移液机、细胞培养机以及分析技术和诊断方面的设备平台。
这种多孔基板也称为多孔板或微滴定板。根据生物分子筛选学会(SBS)推荐的ANSI标准，精确尺寸(长×宽×高)为127.76mm×85.48mm×14.35mm。根据生物分子筛选学会(SBS)的建议，ANSI公布了微滴定板的标准，所述标准特别地涉及具有96、384和1536凹部的微滴定板的凹部的尺寸和位置。这些是ANSI/SBS1至4-2004标准和SBS-6-2009标准。
低温数据库越来越多地在医学、药学发展中形成加工、表征和处理样本的链的一部分，样本、特别是来自动物和人类的活细胞和干细胞储存在所述低温数据库中，并且在需要时被再次利用。这通常借助于低温保存、限定的冷冻和解冻协议以及低于-140℃的储存温度来进行，然而在单独的管、吸管、单独的塑料容器等中，使得位于孔基板中的悬浮液必须被去除并转移。
如许多实验已经显示的那样，生物样本的质量随着每次转移而降低，特别是在细胞生长粘附在表面上的情况下，因为这些细胞必须通过酶处理或机械处理释放，由此遭受不可忽视的压力。同样重要的是，孔板、例如具有96个孔的孔板的所有样本以相同的或可预先定义的方式处理，还可由此被冷冻、储存和解冻。
受控的冷却和加热系统都从实践已知，例如Planar Plc公司的具有可编程温度程序的“Cyro冷冻机”，或简单的低温箱、例如Thermo Fischer Scientific有限公司的“Mr.Frosty”低温箱。特别是在重要的医学细胞类型、如免疫细胞、干细胞、特别是IPS细胞(诱导多能干细胞)的情况下，受控的冷冻和解冻协议进而被证明对于样本的质量及其活力而言是非常重要的。在此，非常快速的冷却和加热已经取得了非常好的效果。所有这一切，特别是低于1°/秒的冷却和加热迄今为止不能用于多孔基板，因此生物样本必须转移到其他容器。但是在传统的塑料管中，由于塑料壁的厚度和体积的布置，无法实现这种精确的、最重要地快速的温度变化过程。
发明内容
因此，本发明的目的在于提供一种用于冷冻生物样本、特别是用于低温保存和/或用于解冻生物样本、特别是低温保存的样本的改进的设备，利用所述设备避免常规技术的缺点，所述设备使得可进行具有快速冷却和/或加热以及增大的活力率的低温保存。另一个目标在于提供下述设备，所述设备可以以过程高效的方式集成到自动化的高通量过程、例如高通量筛选过程中。本发明的另一个目的是提供一种冷冻生物样本、特别是用于低温保存和/或解冻生物样本、特别是低温保存的样本的改进的方法，利用所述方法克服常规技术的影响活力的缺陷，所述方法特别地使得可进行被解冻的生物样本的简单的后处理。
这些目标通过具有本发明的特征的设备和方法来实现。本发明的有利实施例和应用将部分地参照附图在下面的说明中更详细地描述。
根据本发明的第一方面，提供了一种用于多孔板的温度控制体，以用于冷冻和/或解冻位于多孔板的腔中的样本、特别是生物样本。正如所知的那样，多孔板具有布置成行和列的多个腔。
根据本发明的温度控制体包括温度控制流体可流过的基体以及在基体的上侧上布置成行和列的多个突出的温度控制指，所述基体优选地由导热材料制成，优选地具有高热容量，其中，温度控制指的网格间距对应于多孔板的腔的网格间距。相邻的温度控制指之间的间距由此与相邻的腔之间的间距相对应。
因此，本发明包括设置温度控制体的一般技术教导，所述温度控制体适于多孔板的腔的矩阵式规则布置，并为此包括温度控制指的成腔的布置的网格尺寸的相应的矩阵式布置。在此，冷却指的表面端可与腔的底板相连接，其中，优选地一个温度控制指可分配给一个腔。温度控制指是杆形或栓形的，温度控制指的表面端设计成能够为多孔板的腔的基底形成平坦的支撑。
由此，本发明的一个特别的优点是，对于冷冻和解冻样本，不再需要将样本转移到单独的管、吸管或特殊的塑料容器等中，而是可借助于根据本发明的温度控制体直接在多孔板中并利用多孔板被冷冻然后再次解冻。由此，可提高生物样本的低温保存中的活力率。另一个优点是，以这种方式设计的温度控制体使得能够快速冷冻和/或解冻，因为温度控制指可定位成非常靠近样本，并且可经由腔的底壁直接在生物样本中形成高的冷却和加热速率。
还省去了耗时地转移至分开的冷冻容器中，相反，在一个工艺链中可始终使用市售的多孔板，从而特别是对于高通量方法，可提高处理速度和效率。
术语“样本”表示在腔中经受低温保存的任何物体。样本材料通常包括生物材料、例如细胞、组织、细胞组分或生物大分子，以及在适用的情况下的营养液、试剂、低温保护剂或其它物质。
根据本发明的一变型例，可电控制的加热和/或冷却元件可集成至温度控制指中的至少一些中，优选地集成至所有的温度控制指中。这种加热元件的示例也可以是在被适当地控制时可对基体的流体冷却产生限定的热量引入的微波或高频元件。该变型例提供了单独的温度控制指或温度控制指的部分组、例如各行和/或列可被不同地控制温度的优点。由此，热或冷输入可经由腔的布置而特定地变化并适应储存在各个腔中的样本。
根据另一变型例，为了监测至腔内的热或冷输入，温度传感器、例如热电传感器可集成到温度控制指中的至少一个的端面中。例如，温度传感器可设计为平版型的铂电阻温度传感器，例如PT100或PT1000传感器。
为了实现样本的尽可能快速的冷冻和解冻，下述是有利的：温度控制指的端面优选地以低于20μm的粗糙度被高度抛光，和/或具有高导热性的优选地热导率与铜或银相当的涂层、优选地具有石墨或金刚石涂层。
根据市售的多孔板的尺寸，温度控制指可布置在长度为127.8mm、宽度为85.5mm的区域内。温度控制指的数量可对应于多孔板的腔的数量，优选地具有以下值中的一个：6、8、12、16、24、48、96、384或1536。此外，可在特别是上述变体的若干倍的基体上布置不同数量的温度控制指，以便例如用一个温度控制体控制多个多孔板的温度。
温度控制指优选地由高热容量、高导热性的材料制成，优选地由金属材料制成。特别地，温度控制指的热容量大于传统市售多孔板的热容量。
所述管路具有用于连接至少一条线路与冷却回路和/或加热回路的流入连接件和流出连接件，其中，通过至少一条线路的温度控制流体的流动能够被控制，使得预定的单独的温度控制指和/或温度控制指的至少一个预定部分组能够相对于其余温度控制指不同地被控制温度。
温度控制体的基体包括冷却流体可流过的至少一条管路，所述管路具有用于连接所述至少一条管路与冷却回路和/或加热回路的流入连接件和流出连接件。所述至少一条管路的管路路线优选地具有曲折的或螺旋的形状，以便实现均匀分布在基体上的期望的温度分布。一有利的变型例提出流过所述至少一条管路的温度控制流体的流动可被控制，使得预定的单独的温度控制指和/或温度控制指的至少一个预定的部分组可与其余温度控制指不同地被控制温度。这可例如通过多个流体管路或管路区段来实现，这些流体管路或管路区段可被接通或断开，以便不同地控制温度控制指的部分组的温度。
温度控制指的端面可以是平坦的或稍微弯曲的。该结构有利地适用于具有带有平坦基底或稍微弯曲的圆形基底的腔的多孔板的温度控制。
该实施例的另一变型的特征在于，温度控制指的端面相对于基体的平坦上侧的倾斜从温度控制体的中间向两个相反的边缘区域增大。增大的倾斜度可通过布置在基体的平坦的上侧上的温度控制指的增大的倾斜位置或温度控制指的端面的增大的斜角来形成。根据该实施例，多孔板通常由塑料制成，例如聚苯乙烯或聚氯乙烯，并且在压力下容易弯曲。可有利地通过温度控制指的端部向外逐渐倾斜来利用该弯曲，以便确保所有腔与温度控制体形成平面接触。
另一替代性实施例提出腔的基底的外壁和温度控制指的端面具有互补形状——对应的非平面表面形状，以便形成局部形状配合。换句话说，温度控制指的端面根据钥匙与锁原理设计成与腔的下侧的轮廓相匹配的轮廓。例如，温度控制指的端面的表面形状和腔的基底的外壁的表面形状被设计为互锁的齿，以便形成局部形状配合。该替代性实施例提供下述优点：即使在具有小直径的腔的情况下，仍然使腔与相应的冷却指之间的大面积接触和进而的相当大的冷却表面和更快的温度控制成为可能。
本发明还涉及如本文所公开的温度控制体和多孔板的布置，多孔板的布置成行和列的腔的网格间距对应于温度控制指的网格间距。
根据本发明的另一方面，提出一种用于冷冻样本、特别是用于低温保存和/或用于解冻样本、特别是低温保存的样本的温度控制设备。这些样本特别地可以是生物样本。温度控制设备包括本文件所公开的温度控制体。温度控制设备还包括定位装置，用于将多孔板的温度控制体相对于彼此定位在预定位置，其中，布置成行和列的腔的网格间距对应于温度控制指的网格间距，其中在所述预定位置，多孔板位于温度控制体的上方，腔分别定位成与温度控制指中的一个的纵向轴线齐平。温度控制设备还包括用于使温度控制体的温度控制指与位于预定位置的多孔板的腔的基底相接触的装置。
一个可能的实施方式提出，用于形成接触的所述装置包括按压体，所述按压体可从上方按压到位于温度控制体上方的多孔板上，以便通过按压压力的效果使多孔板的腔的基底与温度控制指的端面相接触。按压体优选地包括具有至少与多孔板的腔的矩阵状布置相同的长度和宽度的与多孔板的接触表面。
在温度控制设备的另一有利的实施例变型中，用于形成接触的装置包括多个可电动控制的致动器，所述致动器设计成例如通过上述按压体间接地或者直接地作用在位于温度控制设备上方的多孔板的上侧上，以便在操作致动器时，改变多孔板与温度控制体之间的相对距离，以将温度控制指和腔的基底移动形成接触和/或脱离接触。可电动控制的致动器可设计为微机械致动器或压电致动器。
下述也是有利的：将温度控制设备设计成使得所述多个可电动控制的致动器可通过温度控制设备单独地和/或以部分组控制，以便使单独的腔和/或部分组的腔、例如单独的行或列与温度控制体形成和/或脱离接触，而不论其他腔如何。该实施例变型再次利用塑料多孔板的弯曲性，其中，通过仅控制布置在位于多孔板上方的选定区域中的那些致动器，仅该区域中的那些腔可移动至与温度控制体形成接触和脱离接触。
与通过冷却介质的温度控制来控制冷却和加热速率的低温显微镜不同，根据温度控制设备，这经由预温度控制体与多孔板的接触中的优选地非常快速的变化来进行。在此，温度控制指可全部同时地或分组地以及在个别情况下只有一个温度控制指可压在多孔板的腔的下侧上并再次缩回，从而在多孔板与温度控制指之间产生和消除温度桥，使得热量也可被从样本去除或被引入样本中。
可电动控制的致动器是高精度微机械致动器或压电致动器的实施例变型的另一优点在于下述事实：这种致动器可被用于形成接触的装置的控制单元控制，使得可在1ms(毫秒)至1s(秒)的范围内的时间内执行使多孔板与温度控制体相继地形成接触、脱离接触以及再次形成接触，并且这可以以<1μm的间隔精度执行。根据另一方面，借助于可电动控制的致动器，可提供多孔板向温度控制体的方向的在1μm到1mm范围内的位移。由此，几乎可实施任何温度程序和温度梯度过程。
如已经说明的那样，温度控制设备构造成用于处理多孔板，多孔板的布置成行和列的腔的网格间距对应于温度控制设备的温度控制体的温度控制指的网格间距。此外，温度控制设备可包括这种多孔板。
多孔板可以是市售的多孔板。多孔板也可以与市售的多孔板不同，并适用于低温保存以及与温度控制体和/或温度控制设备一起使用。在本发明的框架内，特别地，可电控制的加热和/或冷却元件/优选地珀尔帖元件可集成至每个腔的基底中，和/或温度传感器可集成至腔的基底中的至少一个中。此外，腔的基底可以是薄的并由导热材料制成，或者在下侧上设有与温度控制体产生更大接触面的结构。
根据后一种变型而修改的多孔板也将作为单独的主题公开和要求保护。
温度控制设备也可以以已知的方式包括可从下方冷却的温度控制室或壳体，所述温度控制室或壳体可填充和/或被填充有干燥气体，在冷却状态下具有温度控制室中的包括较低的冷层和较高的暖层的竖直温度分层，温度控制设备还可以以已知的方式包括设在温度控制室的壳体壁上的至少一个锁定件，以用于引入和移除多孔板。有利地，设置两个这种锁定件：第一锁定件和第二锁定件，多孔板经由第一锁定件在温暖状态下被引入室中或从室移出，多孔板经由第二锁定件在冷却状态下被引入室中或从室移出。
已经说明了温度控制设备包括根据本发明的温度控制体。特别地，温度控制设备可包括第一温度控制体和/或第二温度控制体，第一温度控制体布置在温度控制室的较低的冷层中并连接至冷却回路，以用于生物样本的低温保存，第二温度控制体布置在较高的暖层中并连接至加热回路，以用于解冻低温保存的生物样本。
根据该变型例的另一方面，容纳存储在温度控制室的较低的冷层中的待解冻的至少一个样本的多孔板可借助于定位装置定位在第二温度控制体之上。另外，容纳待冷冻的至少一个样本并经由所述至少一个锁定件被引入温度控制室中的多孔板可借助于定位装置定位在第一温度控制体的上方。为此，定位装置可包括适当设计的引导机构，以用于在温度控制室内移动多孔板。根据这一方面，位于第一和/或第二温度控制体上方的多孔板可借助于用于形成接触的装置以受控制或受调节的方式降低和/或升高，以便与温度控制体形成接触和/或脱离接触。
或者，定位装置也可替代地设计成能够将温度控制体移向多孔板。
根据另一方面，温度控制室可用例如是LN2的液态气体、N2气体或斯特林发动机冷却。例如，在温度控制室底部处的槽中，液氮可开放地储存或被引入海绵状材料中，由此产生竖直温度分层。
下述也是有利的：在温度控制室中布置冰槽，以便在潮湿的空气经由多孔板的引入或移除而从外部渗入温度控制室的情况下，迫使经由冰槽形成冰。
根据另一方面，温度控制室内的竖直温度梯度被设定为使暖层的温度基本上对应于冷冻过程的预定起始温度或解冻过程的预定目标温度，而冷层的温度基本上对应于冷冻过程的预定目标温度或解冻过程的预定起始温度。
本发明的另一方面涉及一种冷冻生物样本、特别是用于低温保存和/或解冻生物样本、特别是低温保存的样本的方法，所述方法使用本文件中公开的温度控制体和/或本文件中公开的温度控制设备。
根据一优选实施例，所述方法包括将物质施加到储存在多孔板的腔中的样本上。
根据一有利的变型例，所施加的物质是一种溶液，所述溶液在硬化时从外侧优选地以气密的方式封闭腔内容物的表面，使得不需要盖或类似物作为封闭件。该物质可以是天然的或合成的油、不能与水溶液混合的液体或凝胶，或是固体CO2。
根据一特别有利的变型例，物质被施加到已经冷冻的样本上，其中，在解冻样本之后和/或期间，所述物质发生预定的反应或与样本的相互作用。优选地，利用从其状态可得出在冷冻样本之后是否发生解冻的物质。
根据另一有利的变型例，所述物质的密度高于围绕样本的营养液的密度，使得在解冻之后样本和所述物质的顺序逆转，从而例如漂浮在营养液中的细胞可被简单地移除。
根据另一有利的变型例，施加物质，其中，从所施加的物质的状态可得出关于样本的信息，和/或在解冻样本时物质发生预定的反应或与样本的相互作用。例如，也可添加在冷冻时产生特定模式或具有温度传感器功能的液体，借助于所述液体可看出是否同时发生解冻以及结构、颜色、混合物等是否发生变化。这可能涉及非宏观可见但是可经由散射光测量、荧光测量、拉曼测量或类似方法容易地识别和量化的再结晶过程。例如，所述物质可以是稀释溶液或洗涤溶液或低温保护剂，作为相对于样本的分化因子作用在样本上，或者是作为含有抗氧化剂、抗凋亡物质或活/死染色剂的物质。
要强调的是，与将物质施加至储存在腔中的样本相关的上述程序方面也可以独立于使用温度控制设备和/或温度控制体而实现，因此也可独立于使用温度控制设备和/或温度控制体而要求保护。
为了避免重复，纯粹根据该装置而公开的特征，也适于在制造方法的框架内被公开和要求保护。
总之，利用本发明，多孔板可直接用于低温保存，从而可省去分别转移到新的容器中。原则上，通过将温度控制体调整成适于相应地使用的多孔板的格式，具有任何数量的腔的多孔板可直接用于低温保存。因此，已知的低温技术可高效地包括在现有的高通量工艺链中，使得基于多孔板的装置平台的自动化链在低温区中也封闭。
附图说明
下面将参照附图描述本发明的另外的细节和优点。附图中示出了：
图1示出多孔板和根据本发明的一实施例的温度控制体的透视图；
图2示出多孔板和温度控制体的布置，其中一部分被放大并以剖视图示出；
图3示出多孔板和根据本发明的另一实施例的温度控制体的剖视图；
图4示意性地示出根据本发明的一实施例的温度控制设备和温度控制方法；
图5示意性地示出根据该方法的一实施例施加物质；
图6A和6B示出包括温度控制指和被填充的腔的单元；
图7A和7B示出根据另一实施例的温度控制体上的多孔板的剖视图；
以及
图8A和8B示出根据另一实施例的多孔板的剖视图。
具体实施方式
附图中相同的部件具有相同的附图标记。
图1示出了多孔板1和根据本发明的温度控制体4、24、41、42的第一实施例的透视图。在中间，示意性斜视图示出了呈标准96孔格式的市售塑料多孔板1。根据标准，腔(孔)2以矩阵状方式呈八行每行十二个腔彼此相邻地布置，并且构成用于在这种多孔板1上容纳样本的凹部。根据标准ANSI/SBS 4-2004，96孔格式多孔板中的相邻腔的网格间距为9mm。
这种多孔板1可用塑料盖覆盖，所述塑料盖在用于填充、排空或其他操作的机器的情况下也可以省略。在下侧上，腔2以平面的方式用在光学质量方面通常允许粘附细胞的显微图像的薄塑料片或膜封闭。
用于多孔板1的示例性温度控制体4、24、41、42在图1中被示为位于多孔板1的下方。温度控制体4、24、41、42包括温度控制流体可流过的长方体基体6和在基体6的上侧布置成行和列的准确地匹配96孔多孔板1的样式的突出的圆柱形的多个温度控制指5、25。温度控制体4、24、41、42由具有高热容量和良好导热性的材料制成。通常使用金属、例如银或合金。
与多孔板1相对应地，96个温度控制指5、25由此也以矩阵状的方式设置成八行每行十二个温度控制指5、25。温度控制指5、25的网格间距由此对应于多孔板1的腔2的网格间距，即相邻的温度控制指之间的距离对应于相邻的腔之间的间距，并且在这种情况下由此也是9mm。温度控制指5、25分别基本相同地形成并且规律地沿彼此成直角的区域方向基本上等距地布置成遍布与多孔板1的接触表面。温度控制指5、25可与基体6一体地设置。温控控制指5与布置在下方的温度控制体4、24、41、42非常好地、通常热接触。
经由至少2个开口7a、7b，温度控制气体或温度控制液体可流过基体6。为此，在温度控制体4、24、41、42中，设置连接所述两个开口的流体引导的曲折的或螺旋形路线，从而实现均匀的或期望的温度分布，由此，温度控制指分别承担其位置处的温度。
温度控制指5、25具有比多孔板的基底区域的热容量大得多的尽可能高的热容量，使得在接触期间，温度控制指主导和确定腔区域与生物样本的温度，即冷却和加热基本上在此仅受多孔板1的基底区域和生物样本的热导性的限制。
用于冷却和/或加热存储在具有不同格式的多孔板中、例如在具有8、12、16、24、48、96、384或1536个腔的多孔板中的生物样本，可使用适当地调整成适于该格式的温度控制体，所述温度控制体进而具有8、12、16、24、48、96、384或1536个温度控制指5、25，温度控制指5、25的网格间距与多孔板的网格间距相匹配。
下文以所有96个腔2的相同的冷却为例说明将96孔多孔板1从室温冷却到目标温度、例如-150℃的原理。通过温度控制指的行或列的不同温度控制或经由温度控制指中的加热元件(未示出)，也可在各温度控制指5、25上实现不同的温度。
对于96孔多孔板1的冷冻，首先使多孔板的温度在1℃至15℃之间，在该温度下，经由移液管从上方加入低温保护介质。同时，温度控制体4、24、41、42已经通过经过-150℃至-195℃的温度下的氮气而达到目标温度，使得所有温度控制指5、25也具有该温度。借助于下文在图4的内容中描述的机构，96孔多孔板1在此通过平坦的按压体8从上方压到温度控制体4、24、41、42上，使得温度控制指5、25的端面5a、25a与多孔板1的96个腔2的各基底进行直接的材料接触。也可使用压电控制装置代替按压体8使温度控制指5、25与腔2的基部(图3所示)相接触，这使得多孔基板与温度控制指5、25的接触能够通过垂直运动而再次打开和关闭。为此，只需要微米范围内的小间隙。通过多次重复，可仅以这种方式实行整个板的温度分布。
附加地或替代地，可改变流过基体6的气体的温度，通过该温度，可以像通常在细胞低温保存中那样实行更慢的T分布(例如，在几分之几℃每分钟，若干℃每分钟范围内)。在加热的情况下，该过程是相反的：多孔板1非常快速地与加热到高温的温度控制体4、24、41、42相接触。温暖的或热的气体或相应的液体可流过它，其温度在最简单的情况下对应于例如10℃的目标温度或直接对应于37℃，低温保护介质可在10℃的温度下被冲走。在此，多孔板1也被快速地按压至温度控制体4、24、41、42。
为了如在干细胞、特别是IPS的情况下所需要的那样进行非常快速的加热，温度控制体4、24、41、42达到40℃至300℃，并且仅与多孔板1热接触，直到达到目标温度。经由开启和断开温度控制指5、25与腔2之间的热接触，也可控制加热期间的温度变化过程。
在下面的部分中，图2示出了温度控制体4、24、41、42的剖视图，温度控制体4、24、41、42具有温度控制流体可流过的基体6以及在基体6的上侧上布置成行和列的突出的多个温度控制指5、25。温度控制指5、25的网格间距再次对应于多孔板1的腔2的网格间距，多孔板1部分地在图2的中间部分放大地以剖视图示出。在其上方以斜视图示出多孔板1，标记区域用作示出的剖视图。
在腔2中的每一个中，顶部处具有气体空间23和具有位于腔2的底板11的上侧上的粘附细胞21的生物样本20。在该实施例中，多孔板1仍然用盖3覆盖。
为了在温度控制体4、24、41、42与多孔板1之间实现良好的按压和进而的热接触，在该实施例的变型例中，温度控制指5、25不垂直地直立在基体6的表面6a上，而是向多孔板1的边缘逐渐倾斜。这在图中通过虚线5c和布置在外部区域中的温度控制指5、25的两个纵向轴线52b以夸张的方式示出，所述两个纵向轴线52b与居中布置的温度控制指5、25的纵向轴线5d相比向外倾斜。通过从上方或下方的平的压力，多孔板1以透镜状的方式稍微弯曲，这确保了所有的腔2以其底侧11与温度控制指5、25进行同样良好的平面接触。如图2中的示例性圆柱体所示，温度控制指的上表面、特别是端面5a、25a可用良好的导热层9覆盖，通过所述导热层可非常快速地冷却和加热。加热/冷却元件10可附加地被集成到温度控制指5、25中，经由所述加热/冷却元件10可控制各个元件的温度。为此，例如利用铂电阻温度传感器、例如PT100或PT1000传感器的扁平构造，温度传感器12设置在温度控制指5、25的端面附近或端面上。为了简化说明，上述温度传感器12、较高热导率的层9或加热/冷却元件10仅示意性地针对一个或两个温度控制指5、25示出，但也可设置在所有温度控制指5、25上。
类似于图2，图3示出了与温度控制体4、24、41、42接触的多孔板1的剖视图。该实施例的特别特征在于，压电致动器30牢固地布置在多孔板1的盖上，使得通过压电致动器30的膨胀或收缩(由箭头示出)，可建立或中断腔2与温度控制指5、25之间的接触。这涉及从1到数百μm的范围内的运动。
图4示例性地示出了用于存储在多孔板1中的生物样本的自动的且直接的低温保存的温度控制设备40。设备40包括温度控制室48，所述温度控制室48中没有湿气，使得不会有空气的湿气冷凝成冰。室48还具有至少在多孔板的初始温度以及期望的目标温度下的区域。
在温度控制室48的基底处设有开放地或以海绵状材料、例如钢丝绒、多孔铝等容纳液氮(LN2)的槽43。槽43用穿孔的金属片44覆盖，金属片旨在防止部件落入温度为-196℃的氮池中。
通过LN2的蒸发，在内部空间中产生干燥的氮气气氛，其构造成水平层，从而形成具有在约-196℃的较低的冷层43a和约10℃或更暖的较高的暖层43b的几乎线性的T梯度。
此外，示出了布置在温度控制室48的壳体壁上的两个锁定件47a和47b。经由锁定件47a，多孔板1在温暖时被引入温度控制室48中或被移除。经由锁定件47b，多孔板1可在冷却时被引入温度控制室48中或被移除。
如果潮湿的空气通过引入或移除多孔板1而进入温度控制室48中，则借助于冰槽49强制地形成冰。这是温暖区域43b中的冷却体。为了不经由这些过程带入湿气，可将罩(未示出)再次放置在温度控制室48的顶部上以及在锁定件47a、47b之上，气态干燥氮气经由所述锁定件逸出。整个系统40不以压力密封的方式封闭，而是在顶部处具有虹吸式出口管(此处未示出)。
在温度控制室28中，存在用于冷却被引入的生物样本或多孔板1的固定的冷却的第一温度控制体和用于加热生物样本或多孔板的加热的第二温度控制体。两者不一定要相同地设计。由此，例如，加热温度单元42的端面的表面可适应于-150℃的收缩的多孔基板几何形状，即，用于加热的温度控制体4、24、41、42的端面的表面可略小于用于冷却的温度控制体4、24、41、42的端面。
装置40还包括定位装置(未示出)，借助于所述定位装置，将被控制温度的多孔板1可根据由箭头45a-c或箭头46a-c所示的位移路径在室48内移动，多孔板可借此特别地以精确对准的方式定位在温度控制体4、24、41、42上方。箭头45a-c示出了加热低温多孔板1时的时间和空间顺序。箭头46a-c示出冷却多孔板1时的顺序。由箭头指示的路径被定位装置的机械元件穿过，定位装置的驱动器优选地位于温度控制室48之外，多孔板1借助于常规的引导系统、例如杆、圈等(未示出)移动。
例如，容纳待冷冻的生物样本的多孔板1经由锁定件47a被引入温度控制室48中(箭头46a)，并借助于定位装置移动到冷层43a中并在此定位在位于穿孔的板44上的第一温度控制体的上方(箭头46b)。以下述方式进行定位：多孔板1的腔分别与温度控制体4、24、41、42的温度控制指中的一个的纵向轴线对准地定位。然后，由此定位的多孔板借助于用于形成接触的装置(未示出)以受控或受调节的方式降低，如上文结合图3所述，以便与温度控制体4、24、41、42相接触。
在达到目标温度之后，多孔板1可被放置以储存在较低的冷层43a中，或者经由第二锁定件47a从温度控制室48移除以用于另外的处理(箭头46c)。
图5示意性地示出了在储存于腔2中的生物样本上施加物质，并且为此示出了成行的在腔底11上具有流体填充物20和细胞21的腔2，。在成行的腔2中，底板11与温度控制指5、25热接触。之前在冷却或加热期间，以及之后在被冷冻或被解冻状态，用移液装置50、例如用移液机器人将其它物质51、61、62、63加到腔2中。例如，物质51、61、62、63可以是在冷冻期间有用的低温保护剂、颗粒悬浮液、固化凝胶和类似物，但也可以是封闭材料，其在固化时从外侧封闭实际腔内容物的表面，使得无需盖或其它物体作为封闭件，这简化了自动化过程。然而，也可添加在冷冻时形成特定模式或具有温度传感器功能的流体，借助于所述流体可看出，是否同时发生解冻以及结构、颜色、混合物等是否发生改变。这可能涉及非宏观可见但可通过散射光测量、荧光测量、拉曼测量或类似方法容易地识别和量化的再结晶过程。
如果腔的内容物20已被冷冻，则特别重要的是将成固体或液体形式的物质施加到腔2中。这些可以是干细胞、保护性材料或基因材料的分化因子，干细胞在解冻后立即变得活跃，基因材料在解冻后仅与其下方的溶液结合。它们也可以是在解冻后降低防冻剂的浓度的稀释介质。
图6A示出了温度控制指5、25和腔2的布置。在腔2中设有由三种材料组成的填充物。培养基60在基底上的底部处，生物样本(在此显示为底板上的细胞)位于培养基中，介质61在培养基的上方，在冷冻培养基60之后施加介质61，使介质不与培养基混合。这都用相对于外部气氛形成气密的封闭的另外的介质62覆盖。介质62可以是天然的或合成的油、不能与水溶液混合的液体、凝胶或固体CO2。这种布置的优点是它们可以最佳地适应解冻过程或深度冷冻。介质的性质和布置决定了解冻时的反应。因此，交错的液化在不同的温度下进行。根据填充物的组成，介质可移位，从而形成新的序列，如图6B所示。
图6B示出了温度控制指5、25和腔2的布置的两种不同状态。在第一状态下，以“I”表示的是在培养基60被冷冻的冷却状态下的布置，而在第二状态下，以“II”表示的是培养基60被解冻的温暖状态下的布置。例如，如果在冷冻状态下，将硅油63施加到与营养液60相比具有更高的密度的固体营养基上，则在提高温度时两相都变成液体后，该分层的顺序将发生变化。由于在解冻过程中，细胞64容易从表面脱离并进入悬浮液中，因此，解冻后，它们浮在营养液60中，营养液60上升并最终变成上层，这在自动系统中可非常容易地被移除，而不必取下盖。
可开发用于冷冻的替代变型例，其中例如使用甘油溶液，甘油溶液在低至-40℃的温度下保持液体，或者根本不呈现固态。该布置和方法的特别的优点是可监测样本的被观察的低温储存以及固态和液态的材料的组合，这在常温下是不可能的。
图7A和7B示出具有较大的腔72的两个经典的孔板70、71，腔72的直径约为2至3cm。孔板70、71整体地以针对冷冻多孔板而修改的形式被设计为注射成型部件。底板75包括良好地传导热量的薄材料、例如聚合物、金属、金属涂层或金刚石，使得热量可容易地经由位于稳定的冷却或加温体73中的冷却和加温空间74被移除和引入。孔板70、71从上方被压到温度控制单元72上，并且通过在中空空间76之上产生轻微的负压可在孔板中弯曲。多孔基板的总体冷却的该变型例是简化的形式，其可与根据图1至图6的温度控制体变型例组合。温度控制体4、24、41、42被引入空间74中是这种组合的一种可能方案。冷却或加热流体或者温度控制气体流过该空间，其中，相应的温度变化过程经由多孔基底75转移到腔72中。在所有变型例中，温度传感器都可集成在一起，例如以布置在底板75上或每个腔72中的扁平Pt-100或Pt-1000传感器的形式。替代地，温度传感器可布置在具有类似或相同填充物的参照腔中，这提供用于控制温度变化过程的调节值。
图8A和8B示出了通过根据另一实施例的多孔板和温度控制体的剖视图。在此，图8A示出了多孔板1和温度控制体4、24、41、42的布置的剖视图，两者还未相互接触。图8B示出单独的腔2与位于其下方的温度控制圆柱体25。通过图8B中的虚线表示，可看到具有细胞21的腔基底区域的大大放大的一部分。现在可显著提高冷却接触，以实现更快速的温度梯度处理，因为位于腔2的底板11上的层的形貌被设计成在温度控制体上基于钥匙和锁的原理具有匹配件。换句话说，温度控制圆柱体25的端面5a、25a和腔2的下底侧11分别具有彼此形状对应的非平面表面形状82、83，以便形成局部的形状配合。所示的尖端形貌只是一个示例性可能方案。
虽然参照实施例的特定示例描述了本发明，但是对于本领域技术人员来说，显然可进行不同的修改并且可用等同物作为替代物，而不脱离本发明的范围。此外，可进行许多修改，而不脱离相关领域。因此，本发明不限于所公开的实施例的示例，而应涵盖属于所附专利权利要求的范围的所有实施例的示例。特别地，无论所引用的权利要求如何，本发明还要求对从属权利要求的主题以及特征的保护。

Claims (27)

1.一种用于低温保存和/或用于解冻低温保存的生物样本的温度控制设备(40)，包括：
a)用于多孔板(1)以用于低温保存和/或解冻低温保存的生物样本的温度控制体(4；24；41；42)，所述多孔板包括布置成行和列的多个腔(2)，所述温度控制体包括：
基体(6)，温度控制流体能够流通所述基体；以及
在基体(6)的上侧上布置成行和列的突出的多个温度控制指(5；25)，其中，所述温度控制指(5；25)的网格间距对应于多孔板(1)的腔(2)的网格间距；
b)用于使多孔板(1)和温度控制体(4；24；41；42)以预定的位置相对于彼此定位的定位装置，其中，在所述预定的位置，多孔板定位在温度控制体(4；24；41；42)的上方，所述腔(2)分别定位成与温度控制指(5；25)中的一个的纵向轴线齐平；和
c)用于使温度控制体(4；24；41；42)的温度控制指(5；25)与位于预定的位置的多孔板(1)的腔(2)的基底(11)形成接触的装置，其中，用于形成接触的所述装置包括按压体(8)，所述按压体(8)能够从上方压到位于温度控制体(4；24；41；42)的上方的多孔板(1)上，以便使多孔板(1)的腔(2)的基底(11)与温度控制指(5；25)的端面(5a；25a)相接触。
2.根据权利要求1所述的温度控制设备(40)，包括多孔板，所述多孔板的布置成行和列的腔的网格间距对应于所述温度控制体的温度控制指的网格间距。
3.根据权利要求1或2所述的温度控制设备(40)，其特征在于，温度传感器(9)集成在温度控制指(5；25)中的至少一个的端面(5a；25a)中。
4.根据权利要求1或2所述的温度控制设备(40)，其特征在于，所述温度控制指(5；25)的端面(5a；25a)
(a)为多孔板(1)的腔(2)的基底(11)形成平坦的支撑表面；和/或
(b)包括石墨或金刚石涂层。
5.根据权利要求1或2所述的温度控制设备(40)，其特征在于，
(a)温度控制指(5；25)能够布置在长度为127.8mm且宽度为85.5mm的区域内；和/或
(b)温度控制指(5；25)的数量对应于多孔板(1)的腔(2)的数量。
6.根据权利要求1或2所述的温度控制设备(40)，其特征在于，
(a)为了形成局部形状配合，腔(2)的基底(11)的外壁和温度控制指(5；25)的端面(5a；25a)分别包括形状上互补的非平面表面形状；或
(b)温度控制指(5；25)的端面(5a；25a)的表面形状和腔(2)的基底(11)的外壁设计为互锁的齿，以便形成局部形状配合。
7.根据权利要求1或2所述的温度控制设备(40)，其特征在于，温度控制指(5；25)的端面(5a；25a)相对于基体(6)的平坦上侧(6a)的倾斜度从温度控制体(4；24；41；42)的中间向两个相反的边缘区域增大。
8.根据权利要求7所述的温度控制设备(40)，其特征在于，增大的倾斜度通过增大布置在基体(6)的平坦上侧(6a)上的温度控制指(5；25)的倾斜位置或增大温度控制指的端面的斜角来形成。
9.根据权利要求1或2所述的温度控制设备(40)，其特征在于，至少一条管路集成在基体(6)中，温度控制流体能够流过所述管路，所述管路具有用于连接至少一条管路与冷却回路和/或加热回路的流入连接件和流出连接件，其中，流过所述至少一条管路的温度控制流体的流动能够被控制，使得预定的单独的温度控制指(5；25)和/或温度控制指(5；25)的至少一个预定部分组能够相对于其余温度控制指(5；25)不同地被控制温度。
10.根据权利要求1所述的温度控制设备(40)，其特征在于，用于形成接触的所述装置包括多个可电动控制的致动器，所述致动器设计成能够直接或间接地作用在位于温度控制体(4；24；41；42)的上方的多孔板(1)的上侧上，以便在控制致动器时改变多孔板(1)与温度控制体(4；24；41；42)之间的相对距离，从而使温度控制指(5；25)与腔(2)的基底(11)形成接触和/或脱离接触。
11.根据权利要求10所述的温度控制设备(40)，其特征在于，
(a)可电动控制的致动器设计为微机械致动器或压电致动器(30)；和/或
(b)所述多个可电动控制的致动器能够被温度控制设备(40)分别地和/或分组地控制，以便使单独的腔(2)和/或腔(2)的部分组与温度控制体(4；24；41；42)形成接触和/或脱离接触，而不论其他腔如何；和/或
(c)借助于可电动控制的致动器，能够形成多孔板(1)向温度控制体(4；24；41；42)的方向在1μm至1mm范围内的位移；
和/或
(d)可电动控制的致动器能够被用于形成接触的所述装置的控制单元控制，使得能够在1ms(毫秒)至1s(秒)的时间内执行多孔板(1)与温度控制体(4；24；41；42)的相继的形成接触、脱离接触和再形成接触。
12.根据权利要求10所述的温度控制设备，其特征在于，所述温度控制设备包括多孔板(1)，多孔板的布置成行和列的腔的网格间距对应于温度控制指(5；25)的网格间距。
13.根据权利要求12所述的温度控制设备，其特征在于，
(a)可电控制的加热和/或冷却元件集成到每个腔(2)的基底中；和/或
(b)温度传感器集成在腔(2)的基底中的至少一个中；和/或
(c)腔(2)的基底设计为导热的。
14.根据权利要求1或2所述的温度控制设备(40)，其特征在于，所述温度控制设备包括：
能够从下方冷却的温度控制室(48)，其能够填充和/或被填充有干燥气体，并且在冷却状态下在温度控制室(48)中具有包括较低的冷层(43a)和较高的暖层(43b)的竖直温度分层；
设置在温度控制室(48)的壳体壁上的用于引入和/或取出多孔板(1)的至少一个锁定件(47a，47b)；
第一温度控制体和/或第二温度控制体，第一温度控制体布置在较低的冷层(43a)中并连接到冷却回路，以用于生物样本的低温保存，第二温度控制体布置在较高的暖层(43b)中并连接到加热回路，以用于解冻低温保存的生物样本。
15.根据权利要求14所述的温度控制设备，其特征在于，
(a)容纳待解冻的样本的多孔板(1)能够借助于定位装置被定位在第二温度控制体的上方；以及
(b)容纳待冷冻的样本并经由所述至少一个锁定件被引入温度控制室(48)的多孔板(1)能够借助于定位装置被定位在第一温度控制体的上方；以及
(c)定位在第一和/或第二温度控制体上方的多孔板(1)能够借助于用于形成接触的所述装置以受控或受调节的方式降低和/或升高，以便与温度控制体(4；24；41；42)形成接触和/或脱离接触。
16.根据权利要求14所述的温度控制设备，其特征在于，
(a)温度控制室(48)用液氮(LN2)、氮气(N2)或斯特林发动机冷却；和/或
(b)冰槽(49)布置在温度控制室中；和/或
(c)暖层(43b)的温度基本上对应于冷冻过程的预定起始温度或解冻过程的预定目标温度，冷层(43a)的温度基本上对应于冷冻过程的预定目标温度或解冻过程的预定起始温度。
17.根据权利要求5所述的温度控制设备(40)，其特征在于，所述温度控制指(5；25)的数量具有下述值中的一个：6、8、12、16、24、48、96、384或1536。
18.根据权利要求13所述的温度控制设备(40)，其特征在于，将珀尔帖元件集成到每个腔(2)的基底中。
19.根据权利要求1所述的温度控制设备(40)，其特征在于，所述温度控制设备用于冷冻生物样本。
20.一种用于低温保存和/或解冻低温保存的生物样本的方法，所述方法利用根据权利要求1-19中任一项所述的温度控制设备。
21.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
将物质(51、61、62、63)施加至储存在多孔板(1)的腔(2)中的样本(20)。
22.根据权利要求21所述的方法，其特征在于，
(a)所施加的物质是一种溶液，所述溶液在硬化时从外侧封闭腔内容物的表面；和/或
(b)所述物质是不能与水溶液混合的液体或凝胶，或是固体二氧化碳(CO2)；和/或
(c)所述物质(51、61、62、63)与围绕样本的营养液(60)相比具有更大的密度。
23.根据权利要求21或22所述的方法，其特征在于，
(a)在解冻样本时，所述物质发生预定的反应或与样本的相互作用；和/或
(b)所述物质是稀释溶液或低温保护剂，作为相对于样本的分化因子作用于样本，或者是含有抗氧化剂、抗凋亡物质或活/死染色剂的物质。
24.根据权利要求21或22所述的方法，其特征在于，
(a)将所述物质(51、61、62、63)施加至已被冷冻的样本，在样本解冻之后和/或在样本解冻期间，物质发生预定的反应或与样本相互作用，和/或
(b)所述物质是从其状态能够得出在冻结样本之后是否发生解冻的物质(51、61、62、63)。
25.根据权利要求22所述的方法，其特征在于，所述溶液在硬化时以气密的方式从外侧封闭腔内容物的表面。
26.根据权利要求22所述的方法，其特征在于，所述物质是天然的或合成的油。
27.根据权利要求23所述的方法，其特征在于，所述物质是洗涤溶液。
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