KR20170093173A - 멀티웰 플레이트용 온도제어요소와 생물학적 시료의 냉동 및/또는 해동을 위한 방법 및 장치 - Google Patents

멀티웰 플레이트용 온도제어요소와 생물학적 시료의 냉동 및/또는 해동을 위한 방법 및 장치 Download PDF

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Abstract

본 발명은 생물학적 시료의 냉동 및/또는 해동을 위해, 행과 열로 배열된 복수의 캐비티(2)를 포함하는, 멀티웰 플레이트(1)용 온도제어요소(4)에 관한 것이다. 온도제어요소(4)는 온도조절 유체가 흐를 수 있고, 바람직하게는 열전도성 물질로 만들어진 베이스체(6)와, 베이스체(6)의 상부면에 베이스체(6)와 열전도 방식으로 연결되고 행과 열로 배치된 복수의 돌출된 온도제어 핑거(5)를 포함하며, 온도제어 핑거의 그리드 간격은 멀티웰 플레이트(1)의 캐비티(2)의 그리드 간격과 상응한다. 본 발명은 또한 생물학적 시료의 냉동, 상세하게는 냉동보존 및/또는 생물학적 시료, 상세하게는 냉동보존된 시료의 해동을 위한 장치 및 방법에 관한 것이다.

Description

멀티웰 플레이트용 온도제어요소와 생물학적 시료의 냉동 및/또는 해동을 위한 방법 및 장치{Temperature-control element for a multiwell plate and method and device for freezing and/or thawing biological samples}
본 발명은 멀티웰(multiwell) 플레이트용 온도제어요소에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 생물학적 시료의 냉동, 상세하게는 냉동보존, 및/또는 생물학적 시료, 상세하게는 냉동보존된 시료의 해동을 위한 장치 및 방법에 관한 것이다.
기관 및 상업용 냉동 저장기의 보급이 증가함에 따라, 특히 수만에서 수백만 개의 시료 번호를 가진 살아있는 세포 물질의 저장을 위해서는 공정 순서의 자동화가 필요하다. 한편으로 이는 비용효율적인 저장 조건을 달성하기 위함이고, 다른 한편으로는, 현재 생체의학 분야에서 점점 더 요구되고 있듯이, SOP 조건(SOP:표준 작동 절차)의 체계적인 시행, 원활한 문서화, 실험실 인력에 의한 주관적 영향의 배제를 위함이다.
제약 분야, 의학 및 생명공학 분야의 많은 부분에서 자동화된 시료 수령 기준이 수립되었고 이는 고처리량 스크리닝(소위 말하는 SBS 표준) 개발 과정에서 주로 발생했다. 여기서, 실험실 실습에 사용되는 것은 웰(well), 캐비티(cavity), 컵(cup)으로도 알려진 반응 공간을 형성하는 매우 작고 둥근 빗 구조의 멀티웰 기판이며, 행과 열로 배열되어 시료, 예를 들면 세포 물질, 혈액 시료 등의 가장 작은 부분이 투입된다. 이들은 6, 8, 16, 24에서 96개 이상의 개별 웰이 있는 평면 플라스틱 멀티웰 기판이다. 이러한 형태는 그동안 세계적으로 표준화되어 왔으며 피펫팅(pipetting)기, 세포 배양기에 쓰이고 또한 진단 뿐 아니라 분석 기술의 장치 플랫폼에서도 사용된다.
이러한 멀티웰 기판은 멀티웰 플레이트 또는 마이크로타이터(microtitre) 플레이트로도 알려져 있다. Society for Biomolecular Screening(SBS)에서 권장하는 ANSI 표준에 따라, 정확한 치수(길이 x 너비 x 높이)는 127.76mm x 85.48mm x 14.35mm이다. Society for Biomolecular Screening(SBS)의 권고에 따라, ANSI는, 특히 96, 384 그리고 1536개의 리세스가 있는 마이크로타이터 플레이트 상의 리세스의 크기와 위치와 관련한, 마이크로타이터 플레이트의 표준을 발표했다. 이는 표준 ANSI/SBS 1 내지 4 - 2004 및 표준 SBS-6-2009이다.
점점 더 의학, 의약품 개발 및 생명공학 분야에서 시료를 처리, 특성화, 취급하는 일련의 과정을 구성하는 것은 시료, 특히 동물과 인간의 살아있는 세포와 줄기 세포가 저장되고, 필요한 경우, 다시 활용되는 냉동 저장기이다. 이는 일반적으로, 저장 온도 -140℃ 이하뿐 아니라 냉동 및 해동 프로토콜로 정의되는, 냉동보존에 의해 개별 튜브, 빨대, 개별 플라스틱 용기 등에서 일어나 웰 기판 내에 위치한 서스펜션(suspension)이 제거되고 이송되어야 한다.
많은 실험 들이 보여 주듯이, 생물학적 시료의 질은 이송될 때마다 떨어지는데, 특히 세포가 표면에 달라붙어 성장하면, 이들은 효소 처리 또는 기계적 처리를 통해 방출되어야 하기 때문에, 적지 않은 스트레스를 받는다. 또한, 예를 들면 96개의 웰을 가진, 웰 플레이트의 모든 시료는 동일한 또는 미리 정해진 방식으로 취급되고 따라서, 또한 냉동, 저장 그리고 해동될 수 있는 것이 중요하다.
실제에서는, 제어 냉각 그리고 또한 난방 시스템이 모두 알려져 있는데, Planar Plc 사의 프로그램 가능한 온도 프로그램이 있는 “Cyro Freezers” 또는 ThermoFischer Scientific Inc. 사의 “Mr. Frosty” 크라이오박스(cryobox)와 같은 단순한 크라이오박스가 그 예이다. 특히 면역 세포, 줄기 세포, 특히 IPS 세포(유도 만능 줄기 세포)와 같은 중요한 의학 세포 유형의 경우, 제어 냉각 및 해동 프로토콜은 시료의 품질과 그 활력에 있어 매우 중요한 것이 입증되었다. 여기서 매우 빠른 냉각 및 가열을 통해 매우 우수한 결과를 얻었다. 이 모든 것, 특히 1℃/초 이하의 냉각 및 가열은 아직까지는 멀티웰 기판에 대해서는 사용이 불가능하여, 생물학적 시료가 다른 용기로 이송되어야 하는 이유가 된다. 그러나 종래의 플라스틱 튜브에서, 플라스틱 벽의 두께 및 볼륨의 배열로 인해, 정확하게는, 그러나 모든 급격한 온도 경로도 마찬가지로 달성될 수 없다.
따라서 본 발명의 목적은 생물학적 시료의 냉동, 특히 냉동보존, 및/또는 생물학적 시료, 특히 냉동보존된 시료의 해동을 위한 개선된 장치를 제공하여 종래의 기술의 단점을 피하고 활력율의 증가를 가능하게 할 뿐 아니라 급격한 냉각 및/또는 가열이 가능한 냉동보존을 제공하는 것이다. 또 다른 목적은, 자동화된 고처리량 공정, 예를 들면 고처리량 스크리닝 공정으로 공정효율적인 방식으로 통합될 수 있는 장치를 제공하는 것이다. 또한, 본 발명의 목적은 생물학적 시료, 특히 냉동보존을 위한 시료의 냉동 및/또는 생물학적 시료, 특히 냉동보존된 시료의 해동의 개선된 방법을 제공하여, 종래의 기술의 활력에 영향을 끼치는 단점을 극복하고 특히, 해동된 생물학적 시료의 간단한 후처리를 가능하게 하는 것이다.
이러한 목적은 독립항의 특징을 갖는 장치 및 방법에 의해 달성된다. 본 발명의 유리한 실시예 및 적용은 종속항에 개시되어 있으며, 도면을 부분적으로 참조하여 이하의 설명에서 보다 상세히 설명된다.
본 발명의 첫 번째 태양에 따르면, 멀티웰 플레이트용 온도제어요소는 시료, 상세하게는 멀티웰 플레이트 상의 캐비티에 위치한 생물학적 시료의 냉동 및/또는 해동을 위해 제공된다. 공지된 바와 같이, 멀티웰 플레이트는 행과 열로 배열된 복수의 캐비티를 갖는다.
본 발명에 따른 온도제어요소는 바람직하게는 열전도성 물질로 만들어지고, 바람직하게는 높은 열용량을 가진 온도조절 유체가 흐를 수 있는 베이스체(base body)와 베이스체의 상부에 행과 열로 배열된 돌출된 온도제어 핑거를 포함하는데, 여기서 온도제어 핑거의 그리드(grid) 간격은 멀티웰 플레이트의 캐비티의 그리드 간격과 일치한다. 따라서 인접한 온도제어 핑거 사이의 간격은 인접한 캐비티 사이의 간격과 일치한다.
따라서 본 발명은 멀티웰 플레이트의 캐비티의 매트리스와 같은 규칙적인 배치에 적합한 온도제어요소를 제공하는 일반적인 기술 교시를 포함하며 이를 위해 캐비티의 배치의 그리드 치수 내에 온도제어 핑거의 상응하는 매트리스와 같은 배치를 포함한다. 여기서, 냉각 핑거의 끝면은 캐비티의 베이스 플레이트와 연결되도록 옮겨질 수 있으며, 여기서 한 온도제어 핑거가 한 캐비티에 할당되는 것이 바람직하다. 온도제어 핑거는 막대 또는 못형이며 온도제어 핑거의 끝면은 멀티웰 플레이트의 캐비티의 베이스에 평평한 지지대를 형성하도록 설계되었다.
따라서 본 발명의 특정 이점은 냉동 및 해동을 위해 시료가 더 이상 개별 튜브, 빨대 또는 특수 플라스틱 용기 등으로 이동되지 않아도 되며, 본 발명에 따른 온도제어요소를 통해 직접 멀티웰 플레이트 내에서 그리고 함께 냉동되고 다시 해동될 수 있다는 사실이다. 이를 통해 생물학적 시료의 냉동보존에서의 활력율이 상승할 수 있다. 또 다른 이점은 이러한 방식으로 설계된 온도제어요소는 온도제어 핑거가 시료에 매우 가깝게 위치할 수 있고 높은 냉각 및 가열율이 캐비티의 저벽을 통해 생물학적 시료에서 바로 생성될 수 있기 때문에 급격한 냉동 및/또는 해동을 가능하게 한다는 것이다.
시간이 소요되는 별도의 냉동 컨테이너로의 이송 또한 생략되며, 대신, 하나의 공정 체인에서 상업적으로 이용가능한 멀티웰 플레이트가 계속 사용될 수 있어 처리 속도 및 효율, 특히 고처리량 방법의 효율이 향상될 수 있다.
용어 '시료'는 캐비티에서 냉동보존을 당하는 모든 대상을 의미한다. 시료 물질은 전형적으로 세포, 조직, 세포 성분 또는 생물학적 거대분자와 같은 생물학적 물질뿐 아니라, 해당되는 경우, 영양 용액, 시약, 동결방지제 또는 기타 물질도 포함한다.
본 발명의 변형에 따르면, 전기적으로 제어가능한 가열 및/또는 냉각 요소는 적어도 온도제어 핑거의 일부, 바람직하게는 모두에 통합될 수 있다. 이러한 가열 요소의 예로는 마이크로파 또는 적절히 제어될 때 베이스체의 유체 냉각에 대한 열의 한정된 투입을 가져올 수 있는 고주파를 들 수 있다. 이 변형은 개별 온도제어 핑거 또는 온도제어 핑거의 부분적인 그룹, 예를 들면, 개별 행 및/또는 열이 다르게 온도조절 될 수 있다는 이점을 제공한다. 이를 통해 열 또는 냉 투입량은 캐비티의 배열을 통해 구체적으로 변경될 수 있으며, 개별 캐비티 내에 저장된 시료들에 적용될 수 있다.
또 다른 변형에 따르면, 캐비티 내로의 열 또는 냉 투입량을 모니터링하기 위해, 열전 센서와 같은, 온도 센서가 적어도 하나의 온도제어 핑거의 끝면에 통합될 가능성이 있다. 예를 들면 온도 센서는 PT 100 또는 PT 1000 센서와 같은 백금저항 온도센서의 일반 버전으로 설계될 수 있다.
가능한 한 빠른 시료의 냉각 및 해동을 달성하기 위해 온도제어 핑거의 끝면이 고도로 연마되고, 바람직하게는 20μm 미만의 거칠기로 연마되고 및/또는 높은 열전도성을 갖는 코팅을 갖고, 바람직하게는 구리 또는 은의 그것과 동등한 열 전도성을 갖고, 바람직하게는 흑연 또는 다이아몬드의 코팅을 갖는 것이 유리하다.
상업적으로 이용 가능한 멀티웰 플레이트의 치수에 따라, 온도제어 핑거는 길이 127.8mm 및 폭 85.5mm의 영역 내에 배열될 수 있다. 온도제어 핑거의 수는 멀티웰 플레이트의 캐비티의 수에 상응할 수 있으며 바람직하게는 6, 8, 12, 16, 24, 48, 96, 384 또는 1536 중 하나의 값을 갖는다. 또한, 특히, 다수의 상기 언급된 변형에서, 예를 들면, 하나의 온도제어요소로 다수의 멀티웰 플레이트의 온도를 조절하기 위해, 상이한 개수의 온도제어 핑거가 베이스체 상에 배열될 수 있다.
온도제어 핑거는 바람직하게는 높은 열용량 및 높은 열전도성의 재료, 바람직하게는 금속 재료로 제조된다. 특히, 온도제어 핑거의 열용량은 종래의 상업용 멀티웰 플레이트보다 크다.
온도제어요소의 베이스체는, 적어도 하나의 라인을 냉각 회로 및/또는 가열 회로와 연결하기 위한 유입 연결부 및 유출 연결부와 함께, 냉각 유체가 흐를 수 있는 적어도 하나의 라인을 포함한다. 적어도 하나의 라인의 라인 경로는 베이스체 상에 균일하게 분포된 원하는 온도 분포를 달성하기 위해 구불구불하거나 나선형인 것이 바람직하다. 유리한 변형은 적어도 하나의 라인을 통한 온도조절 유체의 흐름이 설정된 개별 온도제어 핑거 및/또는 적어도 하나의 설정된 온도제어 핑거의 부분적인 그룹이 나머지 온도제어 핑거와 다르게 제어되는 방식으로 제어되는 것을 제공한다. 예를 들어, 이는 온도제어 핑거의 부분적인 그룹을 다르게 온도조절 하기 위해 스위치를 켜거나 스위치를 끌 수 있는 여러 유체 라인 또는 라인 부분을 통해 달성될 수 있다.
온도제어 핑거의 끝면은 평평하거나 약간 구부러질 수 있다. 이 구성은 평평한 베이스 또는 약간 구부러진 원형 베이스를 갖는 캐비티를 갖는 멀티웰 플레이트의 온도조절에 유리하게 적합하다.
이 실시예의 또 다른 변형은 중간에서부터 온도제어요소의 두 맞은편의 끝 부분까지 증가하는 베이스체의 평평한 면에 대한 온도제어 핑거의 끝면의 경사도를 특징으로 한다. 증가하는 경사도는 베이스체의 평평한 상부면에 배치된 온도제어 핑거의 증가하는 경사의 위치 또는 온도제어 핑거의 끝면의 증가하는 경사면에 의해 형성될 수 있다. 이 실시예에 따르면 사실은 멀티웰 플레이트는 일반적으로 플라스틱, 예를 들면 폴리스티렌 또는 폴리염화비닐로 만들어지며, 압력 하에서 쉽게 구부려진다. 이 구부림은 모든 캐비티가 온도제어요소와 평면 접촉하도록 하기 위해서 온도제어 핑거의 끝면이 바깥쪽으로 점점 더 기울어지도록 유리하게 이용될 수 있다.
다른 대안적인 실시예는 캐비티의 베이스의 외벽과 온도제어 핑거의 끝면이 국부형태의 적합을 생성하기 위해 상호보완적인 상응하는 형태의 비평면 표면 형상을 갖는 것을 제공한다. 즉, 온도제어 핑거의 끝면은 캐비티의 아래쪽 윤곽에 대한 반대의 윤곽으로 열쇠와 자물쇠 이론에 따라 설계되어 있다. 예를 들어 온도제어 핑거의 끝면의 표면 형상 및 캐비티의 베이스의 외벽의 표면 형상은 국부형태의 적합을 생성하기 위해 맞물림 이음으로서 설계된다. 이러한 대안적인 실시예는 작은 직경을 갖는 캐비티의 경우에도 캐비티와 상응하는 냉각 핑거 사이에 큰 면적이 접촉하고 이에 따라 비교적 큰 냉각 표면과 더 빠른 온도조절이 가능해진다는 이점을 제공한다.
본 발명은 또한, 여기에 개시된 바와 같이, 온도제어요소의 배열과 멀티웰 플레이트, 온도제어 핑거의 그리드 간격과 상응하여 열과 행으로 배열된 캐비티의 그리드 간격에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 태양에 따르면 시료를 냉동하기 위한, 특히 냉동보존하기 위한, 및/또는 시료, 특히 냉동보존된 시료를 해동하기 위한, 온도조절 장치가 제공된다. 이 시료들은, 상세하게는, 생물학적 시료이다. 온도조절 장치는 본 명세서에 개시된 온도제어요소를 포함한다. 온도조절 장치는 또한 서로에 대해 미리 정해진된 위치에 멀티웰 플레이트의 온도제어요소를 위치시키기 위한 위치설정 장치를 포함하며 여기서 행과 열로 배열된 캐비티의 그리드 간격은 온도제어 핑거의 그리드 간격에 상응하고 여기서 미리 정해진된 위치에서 멀티웰 플레이트는 온도제어요소 위에 위치되며 캐비티는 각각 온도제어 핑거 중 하나의 세로축과 같은 높이에 위치한다. 온도조절 장치는 또한 온도제어요소의 온도제어 핑거를 미리 정해진된 위치에 위치한 멀티웰 플레이트의 캐비티의 베이스와 접촉시키기 위한 장치를 포함한다.
가능한 구현예는 접촉시키기 위한 장치가 멀티웰 플레이트의 캐비티의 베이스를 온도제어 핑거의 끝면에 압력을 가하는 효과를 통해 접촉시키기 위해 온도제어요소의 위에 위치한 멀티웰 플레이트 위로 가압될 수 있는 가압체를 포함하는 것을 제공한다. 가압체는 멀티웰 플레이트의 캐비티의 매트릭스와 같은 배열과 적어도 동일한 길이 및 폭의 멀티웰 플레이트와의 접촉면을 포함하는 것이 바람직하다.
온도조절 장치의 또 다른 바람직한 실시예의 변형에서, 접촉시키기 위한 장치가 온도조절 장치의 위에 간접적으로, 예를 들면 상기 언급한 가압체의 방식으로, 또는 작동기의 작동 시, 멀티웰 플레이트와 온도제어요소 사이의 상대 거리를 변경하여 온도제어 핑거와 캐비티의 베이스를 접촉 상태로 및/또는 비접촉 상태로 이동시키기 위해, 직접적으로, 위치한 멀티웰 플레이트의 상부면 상에서 작동하도록 설계된 복수의 전기로 제어가능한 작동기를 포함한다.
또한 온도조절 장치를 복수의 전기로 제어가능한 작동기가 온도조절 장치에 의해 개별적으로 및/또는 부분적인 그룹으로 제어되어 개별 캐비티 및/또는 캐비티의 부분적인 그룹, 예를 들면 개별 행 또는 열을, 다른 캐비티와 관계없이, 온도제어요소와 접촉 상태로 및/또는 비접촉상태로 만들도록 설계하는 것이 유리하다. 이 실시예의 변형은 다시 단지 멀티웰 플레이트 위의 선택된 영역에 배열된 작동기를 제어함으로써 플라스틱 멀티웰 플레이트의 굽힘성형성을 이용하고 오직 이 영역의 그 캐비티만이 온도제어요소와 접촉 상태 및 비접촉 상태로 이동될 수 있다.
냉각 및 가열 속도가 냉각 매체의 온도조절에 의해 제어되는 저온 현미경과 대조적으로, 온도조절 장치에 따라, 이는 사전온도제어요소와 멀티웰 플레이트와의 접촉에서 바람직하게는 매우 급격한 변화를 통해 일어난다. 여기서, 온도제어 핑거는 모두 동시에 또는 그룹으로, 그리고 개별적인 경우에는 오직 하나의 개별 온도제어 핑거만이 멀티웰 플레이트의 캐비티의 아래쪽으로 눌러지고 다시 수축되어 온도 브리지가 멀티웰 플레이트와 온도제어 핑거 사이에서 생성되고 실행취소되어 열이 또한 시료에서 제거되거나 또는 시료로 유입될 수 있게 할 수 있다.
전기적으로 제어가능한 작동기가 고정밀 미소역학적 작동기 또는 압전 작동기인 실시예의 변형의 또 다른 이점은 그러한 작동기가 멀티웰 플레이트로의 연속적으로 접촉하는 방식의 접촉, 접촉 해제 그리고 다시 접촉하기 위한 장치의 제어유닛에 의해 제어될 수 있다는 것과 온도제어요소가 1ms(밀리세컨드) 내지 1s(초)의 범위 내의 시간 내에 수행되고 1μm 미만의 간격 정확도로 수행될 수 있다는 사실에 있다. 또 다른 태양에 따르면, 전기적으로 제어가능한 작동기에 의해 온도제어요소의 방향으로 1μm 내지 1mm의 범위 내에서 멀티웰 플레이트의 변위가 제공될 수 있다. 이를 통해 거의 모든 온도 프로그램과 온도 변화 경로가 구현될 수 있다.
이미 언급한 바와 같이, 온도조절 장치는 멀티웰 플레이트를 취급하고 캐비티가 행과 열로 배열된 그리드 간격은 온도조절 장치의 온도제어요소의 온도제어 핑거의 그리드 간격에 대응한다. 또한, 온도조절 장치는 그러한 멀티웰 플레이트를 포함할 수 있다.
멀티웰 플레이트는 상업적으로 이용가능한 멀티웰 플레이트일 수 있다. 멀티웰 플레이트는 또한 상업적으로 이용가능한 멀티웰 플레이트와 상이할 수 있으며 냉동보존용으로 사용되거나 온도제어요소 및/또는 온도조절 장치와 함께 사용될 수 있다. 본 발명의 범위 내에서, 특히, 각 캐비티의 베이스에 통합될 가능성이 있고, 전기적으로 제어가능한 가열 및/또는 냉각 요소, 바람직하게는 펠티에 소자(Peltier element) 및/또는 온도 센서가 적어도 하나의 캐비티의 베이스에 통합된 것이 있다. 또한, 캐비티의 베이스는 얇을 수 있고 열전도성 물질로 이루어지거나 온도제어요소와 더 큰 접촉면을 생성하는 밑면에 구조가 제공될 수 있다.
후자의 변형에 따라 변형된 멀티웰 플레이트는 또한 별도의 주제로서 개시되고 청구될 수 있다.
또한 온도조절 장치는 또한 공지된 방식으로 아래에서 냉각이 가능하고, 충전이 가능하고 및/또는 건조 가스로 충전되고 냉각된 상태에서 온도조절 챔버 내에 하부의 저온층과 상부의 고온층의 수직 온도층을 가지며 뿐만 아니라 멀티웰 플레이트를 투입 및 제거하기 위한 온도조절 챔버의 하우징 벽 상에 적어도 하나의 잠금장치가 제공되는 온도조절 챔버(chamber) 또는 하우징(housing)을 포함할 수 있다.
유리하게는 이러한 두 잠금장치가 제공된다 : 즉, 멀티웰 플레이트가 따뜻한 상태에서 챔버에 투입되거나 혹은 제거되는 제1잠금장치, 그리고 멀티웰 플레이트가 차가운 상태에서 챔버에 투입되거나 혹은 제거되는 제2잠금장치가 제공된다.
온도조절 장치가 본 발명에 따른 온도제어요소를 포함한다는 것은 이미 언급되었다. 특히 온도조절 장치는 온도조절 챔버의 하부 저온층 내에 배열되고 냉각 회로에 연결된 생물학적 시료의 냉동보존을 위한 제1온도제어요소 및/또는 상부 고온층에 배열되고 가열 회로에 연결된 냉동보존된 생물학적 시료의 해동을 위한 제2온도제어요소를 포함할 수 있다.
이 변형의 또 다른 태양에 따르면, 온도조절 챔버의 하부 저온층에 저장된 해동될 적어도 하나의 시료를 포함하는 멀티웰 플레이트는 위치설정 장치에 의해 제2 온도제어요소 위에 위치될 수 있다. 또한 냉동되고 적어도 하나의 잠금장치를 통해 온도조절 챔버로 투입될 적어도 하나의 시료를 포함하는 멀티웰 플레이트는 위치설정 장치에 의해 제1 온도제어요소 위에 위치될 수 있다. 이를 위해 위치설정 장치는 멀티웰 플레이트를 온도조절 챔버 내에서 이동시키기 위해 적절하게 설계된 가이드기구를 포함할 수 있다. 이 태양에 따르면 제1 및/또는 제2 온도제어요소 위에 위치된 멀티웰 플레이트는 온도제어요소에 접촉 및/또는 비접촉될 수 있도록 접촉을 위한 장치에 의해 제어된 또는 통제된 방식으로 낮춰지고 및/또는 들어올려질 수 있다.
대안적으로 위치설정 장치는 또한 온도제어요소를 대신 멀티웰 플레이트를 향해 이동시키도록 설계될 수 있다.
또 다른 태양에 따르면, 온도조절 챔버는 LN2, N2 가스와 같은 액체 가스 또는 스털링 모터로 냉각될 수 있다. 예를 들면, 온도조절 챔버의 베이스의 수조에서 액체 질소는 공개적으로 저장되고 수직 온도층이 형성되는 스펀지형 물질로 투입될 수 있다.
습한 공기가 멀티웰 플레이트의 투입 또는 제거를 통해 외부로부터 온도조절 챔버로 침투해야 하는 경우 아이스트랩(ice trap)을 통한 얼음의 형성을 강제하기 위해 온도조절 챔버 내에 아이스트랩을 배열하는 것이 또한 유리하다.
또 다른 태양에 따르면, 온도조절 챔버 내의 수직 온도 변화는 고온층이 냉동 공정의 미리 정해진 시작 온도 또는 해동 공정의 미리 정해진 목표 온도와 필수적으로 대응하는 온도를 가지는 반면, 저온층이 냉동 공정의 미리 정해진 목표 온도 또는 해동 공정의 미리 정해진 시작 온도와 필수적으로 대응하는 온도를 가지도록 설정된다.
본 발명의 또 다른 태양은, 본 명세서에 개시된 온도제어요소 및/또는 본 명세서에 개시된 온도조절 장치를 이용하여, 생물학적 시료를 냉동하는, 특히 냉동보존하는 방법 및/또는 생물학적 시료, 특히 냉동보존된 시료의 해동 방법에 관한 것이다.
바람직한 실시예에 따르면, 그 방법은 멀티웰 플레이트의 캐비티에 저장된 시료 상에 물질을 도포하는 단계를 포함한다.
유리한 변형에 따라, 도포된 물질은 경화시에 외부로부터 캐비티 내용물의 표면을 막는 용액으로, 바람직하게는 기밀 방식으로 마감으로서 덮개 또는 이와 유사한 것이 요구되지 않는다. 그 물질은 천연 또는 합성 오일, 수용액과 혼합될 수 없는 액체 또는 겔일 수 있고, 또는 고체 CO2이다.
특히 유리한 변형에 따르면, 그 물질은 이미 냉동된 시료에 도포되며 여기서 시료의 해동 후 및/또는 중에 물질은 시료와 미리 정해진된 반응 또는 상호 반응을 일으킨다. 바람직하게는, 시료가 냉동된 뒤에 그 동안 해동이 이루어졌는지 여부를 파악할 수 있는 조건에서 물질이 사용된다.
또 다른 유리한 변형에 따르면, 물질은 시료를 둘러싼 배양액보다 높은 밀도를 가져, 해동 후 시료와 물질의 순서가 바뀌어, 예를 들면, 배양액에 부유하는 세포를 간단하게 제거할 수 있다.
또 다른 유리한 변형에 따르면, 물질이 도포되고, 여기서 도포된 물질의 상태로부터 시료에 대한 정보가 얻어질 수 있거나 및/또는 시료의 해동에서, 물질은 시료와 미리 정해진된 반응 또는 상호 반응을 일으킨다. 예를 들면, 냉동 시 특정 패턴을 생성하거나 그동안 해동이 발생했는지 및 구조, 색상, 혼합물 등이 변경되었는지 여부를 확인할 수 있는 온도 센서 기능이 있는 유체가 또한 추가될 수 있다. 이는 거시적으로 가시적이지 않은 재결정화 공정을 포함할 수 있지만, 산란된 광 측정, 형광 발광 측정, 라만 측정 또는 유사한 것을 통해 쉽게 인식되고 수량화 될 수 있다. 예를 들면, 그 물질은 희석액 또는 세척 용액 또는 동결방지제일 수 있으며, 시료와 관련하여 분화 인자로서 시료 상에서 작용하거나 항산화제, 항세포자멸 물질 또는 살아있는/죽은 염색제를 함유하는 물질일 수 있다.
캐비티 안에 저장된 시료에의 물질의 도포와 관련한 상기 절차적 태양은 또한 온도조절 장치의 및/또는 온도제어요소의 사용과는 독립적으로 가능하며 따라서 온도조절 장치 및/또는 온도제어요소의 사용과는 독립적으로 청구될 수 있다.
반복을 피하기 위해, 전적으로 장치에 따라 개시된 특징은 또한 제조방법의 범위 내에서 개시되고 청구 가능한 바와 같이 적용한다.
요약하면, 본 발명으로 멀티웰 플레이트는 냉동보존에 직접 사용되어 새로운 용기로의 각각의 이동은 생략될 수 있다. 원칙적으로, 온도제어요소를 각각 사용된 멀티웰 플레이트의 형식으로 조정함으로써, 몇 개의 캐비티를 갖는 멀티웰 플레이트도 냉동보존에 직접 사용될 수 있다. 결과적으로, 공지된 저온 기술은 기존의 고효율 공정 체인에 효율적으로 포함될 수 있어 멀티웰 플레이트 기반의 장치 플랫폼의 자동화 체인도 저온 분야에서 폐쇄된다.
본 발명의 추가적인 세부사항 및 이점은 첨부된 도면을 참조하여 아래에서 설명된다.
본 발명의 특정 이점은 냉동 및 해동을 위해 시료가 더 이상 개별 튜브, 빨대 또는 특수 플라스틱 용기 등으로 이동되지 않아도 되며, 본 발명에 따른 온도제어요소를 통해 직접 멀티웰 플레이트 내에서 그리고 함께 냉동되고 다시 해동될 수 있다. 이를 통해 생물학적 시료의 냉동보존에서의 활력율이 상승할 수 있다. 또 다른 이점은 이러한 방식으로 설계된 온도제어요소는 온도제어 핑거가 시료에 매우 가깝게 위치할 수 있고 높은 냉각 및 가열율이 캐비티의 저벽을 통해 생물학적 시료에서 바로 생성될 수 있기 때문에 급격한 냉동 및/또는 해동을 가능하게 한다.
시간이 소요되는 별도의 냉동 컨테이너로의 이송 또한 생략되며, 대신, 하나의 공정 체인에서 상업적으로 이용가능한 멀티웰 플레이트가 계속 사용될 수 있어 처리 속도 및 효율, 특히 고처리량 방법의 효율이 향상될 수 있다.
도1은 본 발명의 일 실시예에 따른 멀티웰 플레이트와 온도제어요소의 사시도,
도2는 횡단면으로 확대되어 도시된 멀티웰 플레이트와 온도제어요소의 구성,
도3은 본 발명의 다른 실시예에 따른 멀티웰 플레이트와 온도제어요소의 단면도,
도4는 본 발명의 실시예에 따른 온도조절 장치 및 온도조절 방법의 개략도,
도5는 그 방법의 실시예에 따른 물질의 도포의 개략도,
도6a 및 도6b는 온도제어 핑거 및 충전된 캐비티를 포함하는 유닛,
도7a 및 도7b는 다른 실시예에 따른 온도제어요소 상의 멀티웰 플레이트의 단면도, 및
도8a 및 도8b는 다른 실시예에 따른 멀티웰 플레이트의 단면도.
동일한 구성품은 도면에서 동일한 참조 번호가 부여된다.
도1은 멀티웰 플레이트(1)와 본 발명에 따른 온도제어요소(4)의 제1 실시예의 사시도를 도시한다. 중간에 개략적인 사시도는 상업적으로 이용가능한 플라스틱 멀티웰 플레이트(1)를 표준화된 96웰 형식으로 보여준다. 이 표준에 따르면 캐비티(웰)(2)는 각각 12개의 캐비티의 8개의 열에서 매트릭스 형으로 나란히 배열되고 이러한 멀티웰 플레이트(1) 상에 시료(들)을 수용하기 위한 리세스를 구성한다. 표준 ANSI/SBS4-2004에 따라 96웰 형식 멀티웰 플레이트 내에서 인접한 캐비티의 그리드 간격은 9mm이다.
이러한 멀티웰 플레이트(1)는 플라스틱 덮개로 덮어질 수 있으며, 이는 충전, 배출 또는 다른 조작을 위해 기계의 경우에 또한 생략될 수 있다. 밑면에서 캐비티(2)는 광학적인 특성 면에서 일반적으로 부착된 세포의 현미경상을 허용하는 얇은 플라스틱 시트 또는 필름으로 평면 방식으로 차단된다.
도1의 멀티웰 플레이트(1) 아래에 도시된 것은 멀티웰 플레이트(1)를 위한 예시적인 온도제어요소(4)이다. 온도제어요소(4)는 온도조절 유체가 흐를 수 있는 직육면체 베이스체(6)와 베이스체(6)의 상부면에 96웰 멀티웰 플레이트(1)의 패턴과 정확하게 일치하게 행과 열로 배열된 복수의 돌출된 원통형 온도제어 핑거(5)를 포함한다. 온도제어요소(4)는 열용량이 크고 열전도율이 좋은 물질로 만들어진다. 일반적으로, 은 또는 합금과 같은 금속이 사용된다.
멀티웰 플레이트(1)에 대응하여, 따라서 96개의 온도제어 핑거(5)는 또한 각각 12개의 온도제어 핑거(5)의 8개의 열에서 매트리스 형으로 배열된다. 따라서 온도제어 핑거(5)의 그리드 간격은 멀티웰 플레이트(1)의 캐비티(2)의 그리드 간격과 상응한다. 즉, 인접한 온도제어 핑거 사이의 거리는 인접한 캐비티의 간격과 상응하고 따라서 이 경우에 이는 또한 9mm이다. 온도제어 핑거(5)는 각각 기본적으로 동일하게 형성되고 멀티웰 플레이트(1)와의 접촉면에 걸치면서 서로에게 수직으로 기본적으로 등거리에 규칙적으로 배열된다. 온도제어 핑거(5)는 베이스체(6)와 일체로 제공될 수 있다. 온도제어 핑거(5)는 아래에 배열된 온도제어요소(6)와 매우 양호하고 일반적으로 열 접촉한다.
적어도 2개의 개구부(7a, 7b)를 통해, 온도조절 가스 또는 온도조절 액체가 베이스체(6)를 흐를 수 있다. 이를 위해 온도제어요소(6) 내에서 두 개구부를 연결하는 유체 가이드의 구불구불하거나 또는 나선형 경로가 제공되어 균일한 또는 바람직한 온도 프로파일이 달성되고, 이를 통해 온도제어 핑거는 각각 그 위치에서 우세한 온도를 취한다.
온도제어 핑거(5)는 멀티웰 플레이트의 베이스 영역의 그것보다 더 큰, 가능한 한 높은 열용량을 가져 접촉하는 동안 생물학적 시료로 캐비티 영역의 온도를 지배하고 결정한다. 즉, 냉각과 가열은 기본적으로 현재 오직 멀티웰 플레이트(1)와 생물학적 시료의 베이스 영역의 열전도성에 의해서만 제한된다.
상이한 형식을 가진 멀티웰 플레이트에 저장된 생물학적 시료를 냉각하고 및/또는 가열하기 위해, 예를 들면 8, 12, 16, 24, 48, 96, 384 또는 1536개의 캐비티를 가진 멀티웰 플레이트 내에서 이 형식에 적절하게 적용된, 8, 12, 16, 24, 48, 96, 384 또는 1536개의 온도제어 핑거(5)를 가지는, 온도제어요소가 사용 될 수 있고 그 그리드 간격은 멀티웰 플레이트의 그리드 간격과 일치한다.
96웰 멀티웰 플레이트(1)를 상온에서 목표 온도로, 예를 들면 -150℃로 냉각시키는 원리는 모든 96개의 캐비티(2)의 동일한 냉각의 예의 방식으로 아래에 설명될 것이다. 온도제어 핑거의 행 또는 열의 상이한 온도 조절을 통해 또는 온도제어 핑거(5)의 가열 요소(도시되지 않음)를 통해 개별 온도제어 핑거(5) 상에 다른 온도가 발생하게 될 수 있다.
96웰 멀티웰 플레이트(1)의 냉동을 위해, 처음에는 1℃와 15℃ 사이의 온도로 가열한 후, 동결방지 매체를 피펫을 통해 위에서 첨가한다. 한편, 온도제어요소(4)는 -150 ℃ 내지 -195℃의 온도에서 질소 가스를 통과시킴으로써 목표 온도가 되어 모든 온도제어 핑거(5) 또한 이 온도를 취하게 된다. 도4와 관련하여 후술되는 기구에 의해 96웰 멀티웰 플레이트(1)는 평평한 가압체(8)에 의해 온도제어요소(4) 상으로 위에서부터 가압되어 온도제어 핑거(5)의 끝면(5a)은 멀티웰 플레이트(1)의 96개의 캐비티(2)의 개별 베이스와 직접적으로 물질 접촉하게 된다. 가압체(8) 대신에 압조절 장치 또한 온도제어 핑거를 캐비티(2)(도3에 도시됨)의 베이스와 접촉하게 하는 데에 사용될 수 있고, 이는 멀티웰 기판과 온도제어 핑거(5)의 접촉이 수직 운동을 통해 다시 개폐할 수 있게 한다. 이를 위해서는 단지 마이크로미터 범위의 작은 간격만이 필요하다. 다중 반복을 통해, 오직 이 방식으로 전체 플레이트의 온도 프로파일을 수행할 수 있다.
부가적으로 또는 대안적으로 베이스체(6)를 통한 가스 흐름의 온도는 변경될 수 있고, 이를 통해 더 느린 T 프로파일이 세포의 냉동보존에서의 평상시(예를 들면 분당 몇 분수의 ℃, 분당 몇 ℃의 범위)처럼 실행될 수 있다. 가열의 경우, 절차는 역전된다 : 멀티웰 플레이트(1)는 고온으로 가열된 온도제어요소(4)와 매우 신속하게 접촉하게 된다. 따뜻하거나 또는 고온의 가스 또는 상응하는 액체는 이를 통해 흘러, 가장 단순한 경우의 이의 온도는 목표 온도, 예를 들면 동결방지 매체가 씻겨져 나갈 수 있는 10℃, 또는 37℃와 직접적으로 상응한다. 여기서 멀티웰 플레이트(1)는 또한 온도제어요소(4)로 빠르게 가압된다.
줄기 세포 및 특히 IPS의 경우 요구되는 매우 급격한 가열의 경우, 온도제어요소(4)는 40℃ 내지 300℃가 되고 목표 온도에 도달할 때까지 멀티웰 플레이트(1)와 단지 열적으로만 접촉하게 된다. 온도제어 핑거(5)와 캐비티(2) 사이의 열 접촉을 개폐함으로써 가열 중의 온도의 경로를 또한 제어할 수 있다.
하부에서 도2는 온도조절 유체가 흐를 수 있는 베이스체(6)와 베이스체(6)의 상부에 행과열로 배열된 복수의 돌출된 온도제어 핑거(25)를 가지는 온도제어요소(24)의 단면도를 도시한다. 온도제어 핑거(25)의 그리드 간격은 다시 멀티웰 플레이트(1)의 캐비티(2)의 그리드 간격과 상응하며, 이는 도2의 중간에서 부분적으로 확대되고 단면으로 도시된다. 위에 도시된 것은 표시된 영역이 도시된 단면으로 사용된 멀티웰 플레이트를 비스듬하게 본 것이다.
각각의 캐비티(2)에는 상부에 기체 공간(23)과 캐비티(2)의 베이스 플레이트(11)의 상부에 세포(21)가 부착된 생물학적 시료(20)이 있다. 이 실시예에서 멀티웰 플레이트(1)는 여전히 덮개(3)로 덮여 있다.
온도제어요소(24)와 멀티웰 플레이트(1) 사이의 양호한 가압 및 그로 인한 열 접촉을 달성하기 위해, 실시예의 이 변형에서 온도제어 핑거(25)는 베이스체(6)의 표면(6a)에서 수직으로 직립하지는 않지만 멀티웰 플레이트(1)의 모서리를 향해 점점 기울어진다. 이는 도면에서 파선(5c)과 외부 영역에 배열된 온도제어 핑거(25)의 2개의 세로축(5b)에 의해 과장된 방식으로 도시되어 있고, 이는 중앙에 배열된 온도제어 핑거(25)의 세로축(5d)과 비교하여 바깥쪽으로 기울어져 있다. 상부 또는 하부로부터의 평평한 압력에 의해 멀티웰 플레이트(1)는 렌즈 형상으로 약간 구부러지고, 이는 그들의 베이스 태양(11)으로 모든 캐비티(2)가 온도제어 핑거(25)와 동등하게 양호한 평면 접촉이 되도록 한다. 온도제어 핑거의 상부면, 특히 끝면(25a)은, 도2의 예시적인 원통형에 의해 도시된 바와 같이, 이를 통해 매우 빠른 냉각 및 가열이 가능해지는 웰 열전도층(9)으로 덮일 수 있다. 가열/냉각 요소(10)는 추가로 이를 통해 개발 요소의 온도가 제어될 수 있는 온도제어 핑거(25)로 통합될 수 있다. 이를 위하여, 온도제어 핑거(25)의 근처 또는 끝면 상에 온도 센서(12)가 제공되고, 예를 들면 PT 100 또는 PT 1000 센서와 같은 백금 저항 온도 센서의 평평한 구성이 제공된다. 설명을 단순화 하기 위해서, 전술한 온도 센서(12), 더 높은 열전도도의 층(9) 또는 가열/냉각 요소(10)는 하나 또는 두 온도제어 핑거(25)에 대해 오직 개략적으로만 도시되지만, 모든 온도제어 핑거(25)에 제공될 수 있다.
도2와 유사하게, 도3은 온도제어요소(24)와 접촉하는 멀티웰 플레이트(1)의 단면도를 도시한다. 이 실시예의 특별한 특징은 압전 작동기(30)가 멀티웰 플레이트(1)의 덮개 상에 단단히 배치되어 있어 압전 작동기(30)(화살표로 도시됨)의 팽창 또는 수축을 통해 캐비티(2)와 온도제어 핑거(25) 사이의 접촉이 설정되거나 중단될 수 있다. 이는 1에서 수백μm 범위 내의 움직임을 포함한다.
도4는 멀티웰 플레이트(1) 내에 저장된 생물학적 시료의 자동 및 직접 냉동보존을 위한 온도조절 장치(40)의 예를 도시한다. 이 장치(40)는 내부에 수분이 없어 공기의 상대 습도가 얼음처럼 침전될 수 없는 온도조절 챔버(4)를 포함한다. 또한 챔버(48)는 필요한 목표 온도 뿐만 아니라 적어도 멀티웰 플레이트의 초기 온도에 있는 영역을 갖는다.
온도조절 챔버(48)의 베이스에는 공개적으로 또는 스펀지형 물질, 예를 들면 강모(steel wool)다공성 알루미늄 등 안에 액체 질소(LN2)가 들어있는 수조(43)가 있다. 이것은 -196℃의 온도에서 부품이 질소 풀(pool)로 떨어지는 것을 방지하기 위한 구멍이 뚫린 금속 시트(44)로 덮여 있다.
LN2의 증발에 의해 건조 질소 대기가 내부에 형성되며 이는 약 -196℃의 하부의 저온층(43a)와 약 10℃ 또는 더 따뜻한 상부의 고온층(43b)이 형성된 거의 선형의 T-경사도의 방식의 수평층으로 구성된다.
또한 두 개의 잠금장치(47a 및 47b)는 온도조절 챔버(48)의 하우징 벽 상에 배치되어 도시된다. 잠금장치(47a)를 통해 멀티웰 플레이트(1)는 온도조절 챔버(48)에 투입되거나 또는 따뜻할 때 제거된다. 잠금장치(47b)를 통해 멀티웰 플레이트(1)는 온도조절 챔버(48)에 투입되거나 또는 추울 때 제거된다.
멀티웰 플레이트(1)의 투입 또는 제거를 통해 습윤한 공기가 온도조절 챔버(48)로 침투하면, 얼음 형성이 아이스트랩(9)에 의해 강제된다. 이는 따뜻한 영역(43b)에서 냉각된 본체이다. 절차 중 습기를 들여오지 않기 위해, 덮개(도시되지 않음)는 온도조절 챔버(48)의 상부 및 이를 통해 가스 건조 질소가 배출되는 잠금장치(47a, 47b) 위에 다시 배치될 수 있다. 전체 시스템(40)은 압력 밀폐형으로 폐쇄되진 않지만 사이펀 형태의 배출 파이프(여기에 도시되지 않음)를 갖는다.
온도조절 챔버(28)에는 투입된 생물학적 시료 또는 멀티웰 플레이트(1)를 냉각시키기 위한 고정된 제1냉각온도제어요소(41)와 생물학적 시료 또는 멀티웰 플레이트를 가열하기 위한 제2 가열온도제어요소(42)가 있다. 둘 다 동일하게 설계될 필요는 없다. 따라서, 예를 들면, 가열 온도 유닛(42)의 끝면의 표면은 -150 ℃에서 수축된 멀티웰 기판의 구조에 맞춰질 수 있다. 즉, 가열을 위한 온도제어요소(42)의 끝면의 표면은 냉각을 위한 온도제어요소(41)의 끝면에 비해 약간 작을 수 있다.
장치(40)는 또한 이를 이용해 온도조절 될 멀티웰 플레이트(1)가 화살표(45a-c) 또는 화살표(46a-c)로 도시된 변위 경로에 따라 챔버(49) 내에서 이동될 수 있고 특히, 멀티웰 플레이트가 온도제어요소(41 및 42) 상에서 정확히 정렬된 방식으로 위치될 수 있는 위치설정 장치(도시되지 않음)를 포함할 수 있다. 화살표(45a-c)는 극저온 멀티웰 플레이트(1)를 가열할 때의 시간 및 공간 순서를 나타낸다. 화살표(46a-c)는 멀티웰 플레이트(1)를 냉각할 때의 순서를 나타낸다. 화살표로 표시된 경로는 그 구동장치가 바람직하게는 온도조절 챔버(48)의 외부에 위치하는 위치설정 장치의 기계적인 요소에 의해 횡단되며 멀티웰 플레이트(1)는 종래의 가이드 시스템, 예를 들면, 막대, 코일 등(도시되지 않음)에 의해 이동된다.
예를 들면, 냉동 될 생물학적 시료를 함유하는 멀티웰 플레이트(1)는 잠금장치(47a)(화살표(46a))를 통해 온도조절 챔버(48) 내로 투입되고 위치설정 장치에 의해 저온층(46a) 내로 이동되고 구멍이 뚫린 플레이트(44)(화살표(46b)) 상에 세워진 제1온도제어요소(41) 위에 위치된다. 위치설정은 멀티웰 플레이트(1)의 캐비티가 온도제어요소(41)의 한 온도제어 핑거의 세로축과 각각 일직선으로 위치되도록 한 방식으로 이루어진다. 그 뒤에 이와 같이 위치된 멀티웰 플레이트는, 도3과 관련하여 상술한 바와 같이, 온도제어요소(41)과 접촉시키기 위해 접촉시키기 위한 장치(도시되지 않음)에 의해 제어된 또는 통제된 방식으로 하강된다.
목표 온도에 도달한 후에, 멀티웰 플레이트(1)는 저장을 위해 하단의 저온층(43a)에 위치되거나 추가 처리를 위해 제2잠금장치(47a)(화살표(46c))를 통해 온도조절 챔버(48)에서 제거될 수 있다.
도5는 캐비티(2) 내에 저장된 생물학적 시료 상의 물질의 도포를 개략적으로 도시하며 이를 위해 유체 충전재(20)와 캐비티 베이스(11) 상의 세포(21)를 갖는 캐비티(2)의 열과 도시한다. 캐비티(2)의 열에서 베이스 플레이트(11)는 온도제어 핑거(5)와 열 접촉한다. 냉동 또는 해동된 상태에서의 냉각 또는 가열 전 또는 하는 동안 뿐만 아니라 후에, 다른 물질(51)이 피펫팅 장치(5), 예를 들면 피펫팅 로봇으로 캐비티(2)에 첨가된다. 예를 들면, 이는 동결방지제, 입자 현탁액, 고형화 겔 및 유사한 것일 수 있으며, 이들은 냉동 시 유용하지만, 또한 응고 시 외부로부터 실제 캐비티 내용물의 표면을 차단하는 마감 재료로 사용될 수 있어 마감으로서 덮개 또는 다른 물체가 필요하지 않고, 이는 자동차 공정을 단순화한다. 그러나, 냉동 시 특정 패턴을 생성하거나 그동안 해동이 발생했는지 및 구조, 색상, 혼합물 등이 변경되었는지 여부를 확인할 수 있는 온도 센서 기능이 있는 유체가 또한 추가될 수 있다. 이는 거시적으로 가시적이지 않은 재결정화 공정을 포함할 수 있지만, 산란된 광 측정, 형광 발광 측정, 라만 측정 또는 유사한 것을 통해 쉽게 인식되고 수량화 될 수 있다.
특히 중요한 것은, 그 내용물(20)이 이미 냉동된 경우 고체 또는 액체 형태의 물질을 캐비티(2)에 도포하는 것이다. 이는 해동 후에 바로 활성화 되는 줄기세포, 보호 물질 또는 해동 후 그 아래에 있는 용액과만 결합하는 유전 물질에 있어서 차별화 요소가 될 수 있다. 그들은 또한 해동 후 부동액의 농도를 감소시키는 희석 매체가 될 수 있다.
도6a는 온도제어 핑거(5) 및 캐비티(2)의 배열을 도시한다. 캐비티(2)에는 3개의 재료로 이루어진 충전재가 있다. 베이스의 바닥에는 생물학적 시료(여기서는 베이스 플레이트 상에 세포로 도시됨)가 위치하는 배양 배지(60)가 있고, 그 위에 배지(60)의 냉동 후에 도포되는 배지(61)가 있어 그와 섞이지 않는다. 이는 외부 대기에 대해 기밀식 마감을 생성하는 추가 배지(62)로 모두 덮여있다. 배지(62)는 천연 또는 합성 오일, 수용액, 겔 또는 또한 고체 CO2와 혼합될 수 없는 유체일 수 있다. 이러한 배치의 이점은 그들이 해동 공정 또는 심층 냉동에 최적으로 맞춰질 수 있다는 것이다. 배지의 유형과 배열은 해동시의 반응을 결정한다. 따라서 시차제 액화는 다른 온도에서 수행된다. 충전재의 조성에 따라, 배지는, 도6b에 도시된 바와 같이, 새로운 순서가 생기는 방식으로 이동될 수 있다.
도6b는 온도제어 핑거(5)와 캐비티(2)의 배열의 2개의 상이한 형태를 도시한다. “I”로 표시된 제1형태에서 배열은 영양 배지(60)가 냉동된 저온 상태로 도시되고, “II”로 표시된 제2형태에서 배열은 영양 배지(60)가 해동된 고온 상태로 도시된다. 예를 들면, 냉동 상태에서 실리콘 오일(63)이 영양액(60)보다 높은 밀도를 가지는 고체의 영양 배지에 도포되면, 이 층의 순서는 온도를 올리면서 두 단계 다 액체가 된 후에 변화할 것이다. 해동하는 동안, 세포(64)는 쉽게 표면에서 분리되고 현탁액으로 통과하여, 해동 후 상승하여 궁극적으로는 상부층이 되는 영양액(60)에 부유하고, 이는 자동 시스템에서 덮개를 벗길 필요 없이 매우 쉽게 제거될 수 있다.
예를 들면, -40℃ 이하의 온도에서 액체 상태를 유치하거나 또는 전혀 고체 상태를 취하지 않는 글리세린 용액을 사용하여 냉동을 위한 대안적인 변형이 개발될 수 있다. 이 배열 및 방법의 특별한 이점은 시료의 관측된 극저온 저장 및 상온에서 가능하지 않은 고체 및 액체 상태의 물질의 조합의 모니터링의 가능성이다.
도7a 및 7b는 약 2 내지 3cm의 직경을 갖는 더 큰 캐비티(72)를 갖는 2개의 전형적인 웰 플레이트(70, 71)를 도시한다. 웰 플레이트(70, 71)는 멀티웰 플레이트를 전체로서 냉동시키기 위해 수정된 형태의 사출성형 구성품으로서 설계된다. 베이스 플레이트(75)는 열을 잘 전도시키는 얇은 물질, 예를 들면, 중합체, 금속, 금속 코팅 또는 또한 다이아몬드로 이루어져, 안정된 냉각 또는 보온체(73)에 위치한 냉각 및 보온 공간(74)을 통해 열을 쉽게 제거하고 투입할 수 있다. 웰 플레이트(70, 71)는 온도조절 유닛(72) 위로 위에서부터 가압되고 공동(76) 위에 약간의 부압의 발생을 통해 웰 플레이트에서 구부러질 수 있다. 멀티웰 기판의 전체 냉각의 이러한 변형은 도1 내지 도6에 따른 온도제어요소 변형과 조합될 수 있는 단순화 된 형태이다. 온도제어요소(4, 24)의 공간(74)에의 도입은 그러한 조합 가능성 중 하나이다. 냉각 또는 가열 유체 또는 온도조절 가스는 이 공간을 통해 흐르고, 여기서 대응하는 온도 경로는 멀티웰 기판 베이스(75)를 통해 캐비티(72)로 전달된다. 모든 변형에서 온도 센서는 예를 들면 베이스 플레이트(75) 또는 각 캐비티(72) 상에 배열된 평평한 Pt-100 또는 Pt-1000 센서의 형태에 통합될 수 있다. 대안적으로, 온도 센서는 온도 경로를 제어하기 위한 조절 값을 제공하는 유사하거나 또는 동일한 충전재를 갖는 기준 캐비티 내에 배열될 수 있다.
도8a 및 8b는 또 다른 실시예에 따른 멀티웰 플레이트 및 온도제어요소를 관통하는 단면을 도시한다. 여기서, 도8a는 멀티웰 플레이트(1)와 온도제어요소(4)의 배열의 단면을 도시하며, 이들은 모두 서로 접촉하지 않는다. 도8b에 도시된 것은 그 아래에 온도조절 원통(25)이 있는 개별 캐비티(2)이다. 도8b의 파선으로 특징지어지는 바와 같이 세포(21)를 갖는 캐비티 베이스 영역의 크게 확대된 부분이 보여질 수 있다. 냉각 접촉은 이제 열쇠와 자물쇠 이론에 기초하여 온도제어요소 상의 카운터피스(counter-piece)로 설계된 캐비티(2)의 베이스 플레이트(11) 상에 위치한 층(82)의 지형에서 보다 빠른 온도 경사도 공정을 위해 상당히 증가될 수 있다. 환언하면, 온도조절 원통(25)의 끝면(25a)와 캐비티(2)의 하부 베이스 태양(11)은 국부형태의 적합을 유발하기 위해 각각 서로 모양이 상응하는 비평면의 표면형(82, 83)을 가진다. 도시된 지형도는 단지 가능한 예일 뿐이다.
본 발명은 실시예의 특정 예를 참조하여 설명되었지만, 당업자에게는 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 다른 변형이 수행될 수 있으며 균등물이 대체물로서 사용될 수 있음이 명백하다. 또한, 관련 영역을 벗어나지 않고도 많은 수정작업이 수행될 수 있다. 결과적으로 본 발명은 개시된 실시예에 한정되지 않고, 첨부된 특허 청구범위의 범주에 있는 실시예의 모든 예를 포함해야 한다. 특히, 본 발명은 또한 참조가 이루어진 청구 범위에 관계없이 본 발명의 요지 및 특징에 대한 보호를 청구한다.
1 : 멀티웰 플레이트 2 : 캐비티
4, 24 : 온도제어요소 5, 25 : 온도제어 핑거

Claims (24)

  1. 행과 열로 배열된 복수의 캐비티(2)를 포함하는, 생물학적 시료의 냉동 및/또는 해동을 위한 멀티웰 플레이트(1)용 온도제어요소(4; 24)가,
    온도조절 유체가 흐를 수 있는 베이스체(6)를 포함하고,
    베이스체(6)의 상부에 행과 열로 배열된 복수의 돌출된 온도제어 핑거(5; 25)를 포함하며, 온도제어 핑거(5; 25)의 그리드 간격은 멀티웰 플레이트(1)의 캐비티(2)의 그리드 간격과 일치하는 것을 특징으로 하는 온도제어요소(4; 24).
  2. 제1항에 있어서,
    전기적으로 제어가능한 가열 및/또는 냉각 요소(10)는 적어도 온도제어 핑거(25)의 일부에 통합되는 것을 특징으로 하는 온도제어요소(24).
  3. 제1항 또는 제2항 중 어느 한 항에 있어서,
    온도 센서(9)가 적어도 하나의 온도제어 핑거(25)의 단면(25a)에 통합되는 것을 특징으로 하는 온도제어요소(24).
  4. 전술한 항들 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 온도제어 핑거(5; 25)의 끝면(5a; 25a)이 멀티웰 플레이트(1)의 캐비티(2)의 베이스(11)에 대해 평평한 지지대를 형성하고; 및/또는
    (b) 흑연 또는 다이아몬드의 코팅을 포함하는 것을 특징으로 하는 온도제어요소.
  5. 전술한 항들 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 온도제어 핑거(5; 25)는 길이 127.8mm 및 폭 85.5mm의 영역 내에 배열될 수 있고; 및/또는
    (b) 온도제어 핑거(5; 25)의 수는 멀티웰 플레이트(1)의 캐비티(2)의 수에 상응하고, 바람직하게는 6,8,12,16,24,48,96,384 또는 1536 중의 하나인 것을 특징으로 하는 온도제어요소(4; 24).
  6. 제1항 내지 제3항 또는 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 캐비티(2)의 베이스(11)의 외벽과 온도제어 핑거(5)의 끝면(25a)이 국부형태의 적합을 생성하기 위해 각각 상호보완적인 형태의 비평면 표면 형상을 포함하고; 및/또는
    (b) 온도제어 핑거(25)의 끝면(25a)의 표면 형상 및 캐비티(2)의 베이스(11)의 외벽(82)은 국부형태의 적합을 생성하기 위해 맞물림 이음으로 설계된 것을 특징으로 하는 온도제어요소(24).
  7. 전술한 항들 중 어느 한 항에 있어서,
    베이스체(6)의 평평한 면(6a)에 대한 온도제어요소의 끝면의 경사는 중간에서부터 온도제어요소(24)의 두 맞은편의 끝 부분까지 증가하는 것을 특징으로 하는 온도제어요소(24).
  8. 제7항에 있어서,
    증가하는 경사도는 베이스체(6)의 평평한 상부면(6a)에 배치된 온도제어 핑거(25)의 증가하는 경사의 위치 또는 온도제어 핑거의 끝면의 증가하는 경사면에 의해 형성되는 것을 특징으로 하는 온도제어요소(24).
  9. 전술한 항들 중 어느 한 항에 있어서,
    베이스체(6)에 통합된 것은 적어도 하나의 라인으로서, 냉각 회로 및/또는 가열 회로와 연결하기 위한 유입 연결부(7a) 및 유출연결부(7a)와 함께, 베이스체(6)에 온도조절 유체가 흐를 수 있고, 적어도 하나의 라인을 통한 온도조절 유체의 흐름은 설정된, 개별 온도제어 핑거(5; 25) 및/또는 적어도 하나의 설정된 온도제어 핑거(5; 25)의 부분적인 그룹이 나머지 온도제어 핑거(5; 25)와 다르게 제어되는 방식으로 제어될 수 있는 것을 특징으로 하는 온도제어요소(4; 24).
  10. (a) 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 온도제어요소; 및
    (b) 캐비티가 행과 열로 배열된, 그리드 간격이 온도제어요소의 온도제어 핑거의 그리드 간격과 상응하는 멀티웰 플레이트을 포함하는 장치.
  11. 생물학적 시료의 냉동, 상세하게는 냉동보존, 및/또는 생물학적 시료, 상세하게는 냉동보존된 시료의 해동을 위한 온도조절 장치(40)가,
    제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 온도제어요소(4; 24; 41; 42),
    캐비티가 행과 열로 배열된, 그리드 간격이 온도제어 핑거(5; 25)의 그리드 간격과 상응하는 멀티웰 플레이트(1), 서로에 대해 미리 정해진 위치에 있는 온도제어요소(4; 24; 41; 42), 미리 정해진 위치에서 멀티웰 플레이트는 온도제어요소(4; 24; 41; 42)의 위에 위치되며 캐비티(2)는 각각 온도제어 핑거(5; 25)의 세로축과 같은 높이에 위치하도록 하는 위치조정 장치; 및
    온도제어요소(4; 24; 41; 42)의 온도제어 핑거(5)를 미리 정해진 위치에 위치한 멀티웰 플레이트(1)의 캐비티(2)의 베이스(11)와 접촉시키기 위한 접촉장치를 포함하는 것을 특징으로 하는 온도조절 장치(40).
  12. 제11항에 있어서,
    접촉장치가 멀티웰 플레이트(1)의 캐비티(2)의 베이스(11)를 온도제어 핑거(5; 25)의 끝면(5a)에 접촉시키기 위해 온도제어요소(41, 42) 위에 위치한 멀티웰 플레이트(1) 위로 가압될 수 있는 가압체(8)를 포함하는 것을 특징으로 하는 온도조절 장치(40).
  13. 제11항 또는 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    접촉장치가 온도제어요소(4; 24; 41; 42) 위에 위치한 멀티웰 플레이트(1)의 상부면에 직접적으로 또는 간접적으로 작동하도록 설계된 복수의 전기로 제어가능한 작동기를 포함하며, 작동기는 멀티웰 플레이트(1)와 온도제어요소(4; 24; 41; 42) 사이의 상대 거리를 변경하여 온도제어 핑거(5; 25)와 캐비티(2)의 베이스(11)를 접촉 및/또는 비접촉 상태로 이동시키는 것을 특징으로 하는 온도조절 장치(40).
  14. 제13항에 있어서,
    (a) 전기적으로 제어가능한 작동기가 미소역학적 작동기 또는 압전 작동기(30)로 설계되고; 및/또는
    (b) 복수의 전기적으로 제어가능한 작동기는 개별 캐비티(2) 및/또는 캐비티의 부분적인 그룹을, 다른 캐비티와 관계없이, 온도제어요소(4; 24; 41; 42)와 접촉 상태 및/또는 비접촉상태로 만들기 위해 온도조절 장치(4; 24; 41; 42)에 의해 개별적으로 및/또는 그룹으로 제어될 수 있고; 및/또는
    (c) 전기적으로 제어가능한 작동기에 의해 1μm 내지 1mm 범위에서 온도조절 요소(4; 24; 41; 42)의 방향으로의 멀티웰 플레이트(1)의 변위가 생성될 수 있고; 및/또는
    (d) 전기적으로 제어가능한 작동기가 멀티웰 플레이트(1)로의 연속적인 접촉, 접촉 해제 그리고 다시 접촉하는 방식으로 접촉시키기 위한 장치의 제어유닛에 의해 제어될 수 있고 그리고 온도제어요소(4; 24; 41; 42)가 1ms(밀리세컨드) 내지 1s(초)의 범위 내의 시간 내에 수행될 수 있는 것을 특징으로 하는 온도조절 장치(40).
  15. 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    캐비티가 행과 열로 배열된, 그리드 간격이 온도제어 핑거(5; 25)의 그리드 간격과 상응하는 멀티웰 플레이트(1)를 포함하는 것을 특징으로 하는 온도조절 장치.
  16. 제15항에 있어서,
    (a) 전기적으로 제어가능한 가열 및/또는 냉각 요소, 바람직하게는 펠티에 소자가 각 캐비티(2)의 베이스에 통합되고; 및/또는
    (b) 적어도 하나의 캐비티(2)의 베이스에 온도 센서가 통합되고; 및/또는
    (c) 캐비티(2)의 베이스가 열전도성을 갖도록 설계된 것을 특징으로 하는 온도조절 장치.
  17. 제11항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    온도조절 챔버(48)가 아래에서 냉각이 가능하고, 충전이 가능하고 및/또는 건조 가스로 충전되고 냉각된 상태에서 온도조절 챔버(48) 내에 하부의 저온층(43a)과 상부의 고온층(43b)의 수직 온도층을 가지며 ;
    적어도 하나의 잠금장치(47a, 47b)가 멀티웰 플레이트(1)를 투입 및 제거하기 위한 온도조절 챔버(48)의 하우징 벽 상에 제공되고;
    제1 온도제어요소(41)가 하부 저온층(43a)에 배열되고, 냉각 회로에 연결되어 생물학적 시료의 냉동보존을 위하고, 및/또는 제2 온도제어요소(42)가 상부 고온층(43b)에 배열되고, 가열 회로에 연결된 냉동보존된 생물학적 시료의 해동을 위한 것을 특징으로 하는 온도조절 장치(40).
  18. 제17항에 있어서,
    (a) 해동될 시료를 포함하는 멀티웰 플레이트(1)가 위치설정 장치에 의해 제2 온도제어요소(42) 위에 위치될 수 있고; 및
    (b) 냉동되고 적어도 하나의 잠금장치를 통해 온도조절 챔버(48)로 투입될 시료를 포함하는 멀티웰 플레이트(1)가 위치설정 장치에 의해 제1 온도제어요소(41) 위에 위치될 수 있고; 및
    (c) 제1 및/또는 제2 온도제어요소(41, 42) 위에 위치한 멀티웰 플레이트(1)가 온도제어요소(41, 42)에 접촉 및/또는 비접촉될 수 있도록 접촉을 위한 장치에 의해 제어된 또는 통제된 방식으로 낮춰지고 및/또는 들어올려질 수 있는 것을 특징으로 하는 온도조절 장치.
  19. 제17항 또는 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 온도조절 챔버(48)가 액체질소(LN2), 질소(N2) 가스 또는 스털링 모터로 냉각되고; 및/또는
    (b) 아이스트랩(49)이 온도조절 챔버 내에 배열되고; 및/또는
    (c) 고온층이 냉동 공정의 미리 정해진 시작 온도 또는 해동 공정의 미리 정해진 목표 온도와 필수적으로 대응하는 온도 변화를 가지는 반면, 저온층은 냉동 공정의 미리 정해진 목표 온도 또는 해동 공정의 미리 정해진 시작 온도와 필수적으로 대응하는 온도를 갖는 것을 특징으로 하는 온도조절 장치.
  20. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 온도제어요소 및/또는 제11항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 온도조절 장치를 이용하여, 생물학적 시료를 냉동하는, 상세하게는 냉동보존하는 방법, 및/또는 생물학적 시료, 특히 냉동보존된 시료의 해동 방법.
  21. 제20항에 있어서,
    멀티웰 플레이트(1)의 캐비티(2)에 저장된 시료에 물질(51, 61, 62, 63)을 도포하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 냉동 및/또는 해동 방법.
  22. 제21항에 있어서,
    (a) 도포된 물질은 경화시 외부로부터 캐비티 내용물의 표면을, 바람직하게는 기밀 방식으로 막는 용액(62)이고; 및/또는
    (b) 그 물질은 천연 또는 합성 오일, 수용액과 혼합될 수 없는 액체 또는 겔, 또는 고체 이산화탄소(CO2)이고; 및/또는
    (c) 그 물질(63)은 시료를 둘러싼 배양액(60)보다 높은 밀도를 가지는 것을 특징으로 하는 냉동 및/또는 해동 방법.
  23. 제21항 또는 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 시료의 해동에서 물질은 시료와 미리 정해진 반응 또는 상호 반응을 일으키고; 및/또는
    (b) 물질은, 시료와 관련하여 분화 인자로서 시료 상에서 작용하는, 희석액 또는 세척 용액 또는 동결방지제, 또는 항산화제, 항세포자멸 물질 또는 살아있는/죽은 염색제를 함유하는 물질인 것을 특징으로 하는 냉동 및/또는 해동 방법.
  24. 제21항 내지 23항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 물질(63)은 이미 냉동된 시료(60, 64)에 도포되며, 시료(60, 64)의 해동 후 및/또는 중에 물질은 시료(60, 64)와 미리 정해진된 반응 또는 상호 반응을 일으키고, 및/또는
    (b) 물질은 시료의 냉동 후, 해동이 그동안 이루어졌는지 여부를 파악할 수 있는 상태의 물질(63)인 것을 특징으로 하는 냉동 및/또는 해동 방법.

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