DE10323069A1

DE10323069A1 - Verfahren zur chemischen und/oder physikalisch-chemischen Behandlung von mit inerten Stoffen umhüllten reaktionsempfindlichen chemischen und/oder natürlichen Materialien und Vorrichtung zur Durchführung dieses Verfahrens

Info

Publication number: DE10323069A1
Application number: DE2003123069
Authority: DE
Inventors: Heiko Mixtacki
Original assignee: BIOSTEP LABOR und SYSTEMTECHNI; BIOSTEP LABOR- und SYSTEMTECHNIK GmbH
Current assignee: TECHNE GMBH, DE
Priority date: 2003-05-17
Filing date: 2003-05-17
Publication date: 2004-12-16
Anticipated expiration: 2023-05-18
Also published as: DE10323069B4

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur chemischen und/oder physikalisch-chemischen Behandlung von mit inerten Stoffen umhüllten reaktionsempfindlichen chemischen und/oder natürlichen Materialien und eine Vorrichtung zur Durchführung dieses Verfahrens. DOLLAR A Eine solche inerte Umhüllung bietet bei reaktionsempfindlichen chemischen und/oder natürlichen Materialien die Möglichkeit, diese Materialien gezielt und ohne Nebenreaktionen chemisch und/oder physikalisch-chemisch zu bearbeiten und wird insbesondere in der Analytik von natürlichen Materialien häufig eingesetzt. DOLLAR A Der Erfindung liegt das Problem zugrunde, ein die bekannten mechanischen Belastungen ausschließendes und zeitlich schneller durchführbares Verfahren und eine Vorrichtung zur Durchführung dieses Verfahrens bereitzustellen. Dabei sollen auch die dem beanspruchten Verfahren vor- und nachgeschalteten bekannten Verfahrensschritte durch Vorrichtungsdetails rationalisiert werden. DOLLAR A Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass ein Hüllprodukt 1 mechanisch stabilisiert 2 und mit einer zumindest zeitweisen Handhabungshilfe 3 versehen den bekannten nachfolgenden Reaktionsschritten unterzogen wird und dass diese bekannten nachfolgenden Reaktionsschritte durch zumindest zeitweise Intensivierung des Stoffaustausches nach dem bekannten Gegenstromprinzip zwischen Hüllprodukt 1 und einer jeweiligen Reaktionslösung 4 bis 4-(n-1) ausgeführt werden. DOLLAR A Die Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens zur chemischen und/oder ...

Description

Die Neuerung bezieht sich auf ein Verfahren zur chemischen und/oder physikalisch-chemischen Behandlung von mit inerten Stoffen umhüllten reaktionsempfindlichen chemischen und/oder natürlichen Materialien sowie auf eine entsprechende Vorrichtung zur Durchführung dieses Verfahrens.
Eine solche inerte Umhüllung bietet bei reaktionsempfindlichen chemischen und/oder natürlichen Materialien die Möglichkeit, diese Materialien gezielt und ohne Nebenreaktionen chemisch und/oder physikalisch-chemisch zu bearbeiten und wird insbesondere in der Analytik von natürlichen Materialien häufig eingesetzt.
Als ein solches Verfahren ist bereits das Einhüllen von Bakterien in Agar (verschiedenste Firmen bieten dazu Produkte unter dem Namen „low melt agarose gel" an) bekannt, bevor deren Genmaterial, die DNA im Zellkern, analysiert wird. Dazu werden die Bakterien nach Anzüchtung in einem Puffer suspendiert. Diese Suspension wird mit weiterem Puffer unter Kontrolle durch ein Densitometergerät oder durch visuelle Schätzung auf eine bestimmte Keimzahldichte eingestellt und anschließend in flüssigen warmen Agar eingerührt. Dieser wird danach in Formen, z.B. Blöcke, gegossen, erstarren gelassen und aus den Formen herauspräpariert. Um die anschließenden Reaktionen effizient durchführen zu können, werden nunmehr möglichst dünne Blöckchen geschnitten, wenn nicht gleich in solchen dünnen Blöckchenformen abgeformt wurde. Da aber in der nachfolgenden Behandlung in üblichen Laborgefäßen, wie Röhrchen oder Cups, die Agarblöckchen in den Lösungen geschüttelt, gerührt oder anderweitig mechanisch beansprucht werden, können derzeit diese Agarblöckchen nicht dünner als 1,2 mm präpariert werden, obwohl dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt ist, dass je dünner die Agarschicht ist desto schneller und vollständiger die jeweiligen chemischen und/oder physikalisch-chemischen Reaktionen mit dem Hüllprodukt (Keim in Agarblöckchen) erfolgen können. Ebenso ist dem Fachmann bekannt, dass durch Schütteln oder Rühren in ein und derselben Lösung diese Lösung durch die Reaktion selbst bis zur Einstellung eines Gleichgewichtes verbraucht wird und dass nur durch Wechsel der verbrauchten Lösung gegen unverbrauchte Lösung eine weitere Reaktion bzw. Verschiebung des Gleichgewichtes möglich ist. Die so gewonnenen Agarblöckchen werden in o.g. Laborgefäßen mit Pufferlösung gewaschen, mit Lysyspuffern und Deproteinisierungslösungen die DNA aus der Zellhülle des Bakteriums befreit und anschließend mit Restriktionsenzymen in einer Pufferlösung an charakteristischen Stellen geschnitten. Die so vorbereiteten Agarblöckchen werden danach in ein Laufgel eingegossen und der Pulsed-Field-Elektrophorese, im folgenden Text als PFGE abgekürzt, zur Typenbestimmung unterzogen. Es können aber nur die Bilder von Agarblöckchen auch ausgewertet werden, die durch die mechanische Belastung in der beschriebenen Vorbehandlung nicht gebrochen sind, verformt wurden oder Scherkräften ausgesetzt waren. Das Verfahren wird ohne Hilfe einer speziellen Vorrichtung mit den üblichen Laborgeräten durchgeführt.
Dieses sehr zeitaufwändige aber auch sehr exakte Verfahren ist schon seit 1986 bekannt („Separation of chromosomal DNA molecules from C. albicans by pulsed field gel electrphoresis", Nucleic Acids Res. 1986 Jun 11; 14 (11):4401-6) und wird seitdem unverändert manuell durchgeführt. Es erlaubt die exakte Bestimmung ausnahmslos aller aufgespaltenen Bruchstücke der zu untersuchenden DNA. Nachteilig an dem obigen Verfahren ist der benötigte Zeitaufwand bis zum Erhalt des Analyseergebnisses (z.B. nach Bannermann bis 3 Tage) und der zwingende Einsatz von geschultem und erfahrenem Fachpersonal zur Durchführung des Verfahrens.
Resultierend aus den genannten Nachteilen ist dieses sehr exakte Verfahren auf Speziallaboratorien im wissenschaftlichen Bereich bisher beschränkt geblieben und für die Serienanalysen (Massenproben) nicht zugänglich geworden. Vielmehr hat man sich mit weniger exakten bzw. weniger aussagekräftigen Verfahren bei Serienanalysen behelfen müssen, meist einem PCR-Verfahren. Da die PCR (Polimerase Chain Reaction) je nach Wahl der Primer immer nur einen Teil des DNA-Materials der Bakterien amplifiziert (vervielfältigt) und untersucht, sind die PCR-Untersuchungen weniger aussagekräftig als eine PFGE-Untersuchung. Deshalb gilt die PFGE nach wie vor als die beste Methode unter diesen Genotypisierungsmethoden bei Bakterien. Mit der PFGE können oft noch Keime unterschieden werden, die aber in der PCR-Methode fälschlich als identisch erscheinen. Diese Verwechslung kann aber zu sehr schwerwiegenden Folgen führen.

Der Erfindung liegt damit das Problem zugrunde, ein die bekannten mechanischen Belastungen ausschließendes und zeitlich schneller durchführbares Verfahren zur chemischen und/oder physikalisch-chemischen Behandlung von mit inerten Stoffen umhüllten reaktionsempfindlichen chemischen und/oder natürlichen Materialien, wie von Bakterien nach Einhüllen in Agar, und eine Vorrichtung zur Durchführung dieses Verfahrens bereitzustellen. Dabei sollen auch die dem beanspruchten Verfahren vor- und nachgeschalteten bekannten Verfahrensschritte durch Vorrichtungsdetails rationalisiert werden.

Gemäß der Erfindung wird diese Aufgabe mit den Merkmalen des Verfahrenshauptanspruches und des Vorrichtungshauptanspruches gelöst. Weitere Merkmale der Erfindung sind Gegenstand der Unteransprüche.

Die mit der Erfindung erzielten Vorteile bestehen nach dem Verfahrenshauptanspruch und Vorrichtungshauptanspruch insbesondere darin, dass ein Hüllprodukt mechanisch stabilisiert dem intensivierten Stoffaustausch nach dem Gegenstromprinzip nunmehr unterworfen werden kann und eine mechanische Beschädigung und damit Unbrauchbarkeit für die weiteren Untersuchungen nicht mehr zu befürchten ist. Gleichzeitig werden für die weiteren Untersuchungen besser handhabbare Proben bereitgestellt.

Eine vorteilhafte Ausgestaltung der Erfindung ist im Patentanspruch 2 angegeben. Dabei wird die Wandstärke des Hüllproduktes für die folgenden Reaktionen optimiert. Dies erfolgt entweder durch die Bildung einer Lamelle mittels Tauchen oder einer möglichst dünnen Schicht durch Auftropfen oder Eintropfen. Diese Lamellenbildung war wissenschaftlich bei Agar nicht zu erwarten und wurde überraschend gefunden. Da bisher solche Lamellenbildungen, auch ähnlicher Stoffklassen, nicht in der Literatur erwähnt sind, wird diese sprunghafte Weiterentwicklung als indirektes Beweisanzeichen für erfinderische Leistung beansprucht. Da aber schon die Stabilisierung der bekannten Agarblöckchen den Stand der Technik wesentlich verbessert, wurde dies, wenn auch als verschlechterte Ausführungsform, mit beansprucht.

Eine vorteilhafte Ausgestaltung der Erfindung ist im Patentanspruch 3 angegeben. Dabei wird der Stoffaustausch zwischen Hüllprodukt und Reaktionslösung nach dem Gegenstromprinzip, kontinuierlich oder diskontinuierlich, intensiviert.

Eine vorteilhafte Ausgestaltung der Erfindung für den speziellen Anwendungsfall, Behandlung von Bakterien nach Einhüllen in Agar, ist im Patentanspruch 4 in Kombination mit Patentanspruch 6 angegeben. Damit kann ein seit vielen Jahren bekanntes exaktes Verfahren in der Analysezeit so verkürzt und in der Analysedurchführung so vorrichtungsmäßig rationalisiert werden, dass es für die Untersuchung von großen Probenmengen nunmehr eingesetzt werden kann und der bisherige Behelf mit weniger exakten Analysemethoden entfallen kann.

Eine vorteilhafte Ausgestaltung der Erfindung ist im Patentanspruch 7 bezüglich der Form und des Materials der Stabilisierung bezüglich der weiteren vorgesehenen Reaktionsschritte vorgeschlagen. Dabei wird auch durch Teilbarkeit der Stabilisierung diese vor den weiteren Untersuchungen teilweise entfernbar ausgebildet, insbesondere ist eine untere Querspange der Stabilisierung entfernbar.

Darüber hinaus ist es nach Patentanspruch 8 vorteilhaft, wenn eine dauerhafte und über den gesamten Probenzeitraum unveränderte Identifikation der jeweiligen Probe an der Handhabungshilfe oder Stabilisierung ständig ablesbar ist, damit Verwechslungen von Proben ausgeschlossen werden können.

Nach Patentanspruch 9 sind unterschiedliche Kaskadengrößen (Gefäßanzahl) korrespondierend mit der angefallen Probenmenge vorteilhaft, da der Materialverbrauch für die jeweiligen Reaktionsschritte dann optimiert werden kann.

Nach Patentanspruch 10 ist eine Aufteilung des Reaktionsgefäßes in zwei zu umströmende Teilkammern durch die Probe selbst vorgesehen, was zu identischer Ausbildung der zwischen dem ersten und dem letzten Reaktionsgefäß angeordneten Reaktionsgefäße und ihrer Verbindungsfenster führt.

Nach Patentanspruch 11 wird eine automatisierte Durchführung unter Kontrolle einer Steuereinheit beansprucht. Die nachfolgenden diesem Anspruch untergeordneten Ansprüche 12 bis 17 stellen besonders bevorzugte Ausführungsformen eines solchen Behandlungsautomaten dar.

Die Erfindung soll nachfolgend an einem bevorzugten Ausführungsbeispiel näher erläutert werden.

Es zeigen

1: Hüllprodukt in Reaktionsgefäß mit manuellem Wechsel der Reaktionslösung

2: Erzeugung der Lamelle des Hüllproduktes und verschiedenste Formen der Stabilisierung mit Handhabungshilfe

3: Auftropfen des flüssigen Hüllproduktes auf eine netzartige Stabilisierung, dargestellt auf einer Unterlage aufliegend

4: Auftropfen des flüssigen Hüllproduktes auf eine mit semipermeabler Membran versehene Stabilisierung, dargestellt auf einer Unterlage aufliegend

5: Auftropfen des flüssigen Hüllproduktes auf eine auf einer Unterlage aufliegenden rahmenartigen Stabilisierung

6: A: Eintropfen des flüssigen Hüllproduktes in eine einseitig offene Stabilisierung zwischen zwei Objektträgern als Begrenzung B: Mehrfachanordnung zu A

7: Hüllprodukte in als Kaskade angeordneten Reaktionsgefäßen mit Wechsel der Reaktionslösung im Gegenstromprinzip

8: Densitometerpipette

9: Stabilisierung, mit Vorschlägen für Teilungsebenen

10: Prinzip einer automatisierten Vorrichtung

Aus dem Stand der Technik ist bereits als ein solches Verfahren das Einhüllen von Bakterien in Agar bekannt, bevor deren Genmaterial, die DNA im Zellkern, analysiert wird.

Dazu werden Bakterien nach Anzüchtung in einem Puffer auf eine bestimmte Keimzahldichte mit diesem Puffer unter Kontrolle derselben mittels der erfindungsgemäßen Densitometerpipette, in 8 dargestellt, dadurch eingestellt, dass bei Aufziehen der Pipette und gewünschter Trübung als Indikator für die Keimzahldichte die untere Markierung scharf abgebildet wird, was durch farblose Pufferzugabe und mehrfaches Aufziehen der Densitometerpipette erreicht wird. Anschließend wird in flüssigen warmen low-melt Agar 1:1 verrührt, um ein unspezifisches Zerbrechen der in Agarumhüllung frei zu präparierenden DNA zu vermeiden bevor diese gezielt aufgebrochen werden kann und die Bruchstücke identifiziert werden können. In diese vorbereitete Suspension, flüssiges Hüllprodukt 1-1, aus zu untersuchenden Keimen und Agar wird, wie in 2 dargestellt, als eine Stabilisierung 2 ein Tauchrahmen verschiedenster Form, wie in 2 ebenfalls dargestellt, mit einem Griff als Handhabungshilfe 3 eingetaucht. Dieser Tauchrahmen wird danach mit anhaftender und überraschenderweise eine Lamelle 1-2 bildender Suspension aus dem flüssigen Hüllprodukt 1-1 herausgehoben, wonach die Lamelle 1-2 bekanntermaßen wie andere Agarblöckchen an der Luft bei Zimmertemperatur in den festen Aggregatzustand übergeht. Als eine verschlechterte Ausführungsform der Erfindung können aber auch die dickeren Agarblöckchen mit Stabilisierung 2, wie diese durch Auftropfen gemäß 3 bis 5 in die Stabilisierung 2, auch als netzartige Stabilisierung 2-1 oder als mit semipermeabler Membran versehene Stabilisierung 2-2, auch auf einer Unterlage 7 aufliegend zu erhalten sind, eingesetzt werden. Ebenso kann eine nur dreiseitige Stabilisierung 2 gemäß 6 (A und B) mit obiger Suspension gefüllt werden. Das getrocknete Hüllprodukt 1, als Lamelle 1-2 oder Agarblöckchen, wird mit dem Griff des Tauchrahmens für die weiteren Verfahrensschritte in der jeweiligen Reaktionslösung 4 gehandhabt und, wie in 1 dargestellt, in einem Reaktionsgefäß 6 unter Wechsel der Reaktionslösung 5 mit Pufferlösung gewaschen, mit Lysyspuffern und Deproteinisierungslösungen die DNA aus der Zellhülle des Bakteriums befreit und anschließend mit Restriktionsenzymen in einer Pufferlösung an charakteristischen Stellen geschnitten. Abschließend wird das so behandelte Hüllprodukt 1 mitsamt seiner, bei Störung der weiteren Untersuchung nur dreiseitig ausgebildeten, Stabilisierung 2 in ein bekanntes Laufgel eingegossen und in bekannter Weise zum Nachweis aller Bruchstücke der DNA der PFGE unterzogen.

Sämtliche bisherige Arbeitsschritte können manuell, wie in 1 dargestellt, mit durch Tauchen erzeugten Lamellen 1-2 aber auch mit Agarblöckchen herkömmlicher Wandstärke, gemäß 3 bis 6, mit der erfindungsgemäßen Stabilisierung 2 durchgeführt werden, was bereits gegenüber dem Stand der Technik den Vorteil der leichteren Handhabung gegenüber den bisherigen frei in Laborgefäßen behandelten Agarblöckchen und die Vermeidung der bisherigen Möglichkeit der mechanischen Beschädigung dieser Agarblöckchen hätte.

Sollte bei den weiteren Untersuchungen die Stabilisierung 2 stören, so kann, insbesondere die untere Querspange 2-3, davor entfernt werden. Dazu werden die Stabilisierungen 2 mittels bekannter technischer Mittel in wenigstens einer der in 9 vorgesehenen Teilungsebenen teilbar ausgebildet.

Zur weiteren Rationalisierung dieser Arbeitsschritte wird, wie in 7 dargestellt, die Zusammenschaltung mehrerer Reaktionsgefäße 6-1 bis 6-n zu einer Kaskade 8 vorgeschlagen. Dabei erfolgt im ersten Reaktionsgefäß 6-1 jeweils der Zufluss neuer Reaktionslösung 5-1, die danach über ein Verbindungsfenster zwischen zwei benachbarten Reaktionsgefäßen 5-2 als weniger verbrauchte Reaktionslösung (aus erstem Reaktionsgefäß) 4-1 in das zweite Reaktionsgefäß 6-2 gelangt. Aus diesem zweiten Reaktionsgefäß 6-2 gelangt die Reaktionslösung 4 nunmehr über ein weiteres Verbindungsfenster zwischen zwei benachbarten Reaktionsgefäßen 5-2 als weniger verbrauchte Reaktionslösung (aus zweitem Reaktionsgefäß) 4-2 in das nächste Reaktionsgefäß. Dies wird bis zum letzten Reaktionsgefäß 6-n fortgesetzt, in das die Reaktionslösung 4 als weniger verbrauchte Reaktionslösung (aus vorletztem Reaktionsgefäß) 4-(n-1) einströmt und daraus über den Abfluss verbrauchter Reaktionslösung 5-n abfließt. Dabei wird die räumliche Lage der Verbindungsfenster 5-2 untereinander und zum Zufluss neuer Reaktionslösung 5-1 und zum Abfluss verbrauchter Reaktionslösung 5-n jeweils so angeordnet, dass ein Umströmen der Probe erzwungen wird. Dies ermöglicht eine halbautomatische Analysendurchführung mittels dafür optimierter Reaktionslösungen beim Verbleiben der jeweiligen Proben in den Kaskadenteilen über dem gesamten Zeitraum im Gegenstromprinzip, wobei immer mit der nächsten Reaktionslösung die vorhergehende ausgespült wir. Bei langen Verweilzeiten der Proben ist durch bekannte Maßnahmen, wie Schütteln, Umwälzen u.ä., auch eine Intensivierung der Reaktionen möglich.

Eine weitergehende Rationalisierung der Arbeit bei großen Probenanfall erlaubt der nachfolgend beschriebene Behandlungsautomat auf Basis der erfindungsgemäßen Verfahrensschritte und Vorrichtungsdetails gemäß 10. Dabei dient eine Steuereinheit 9 zur Dosierung nach Art und Menge der einzelnen Reaktions- oder Waschlösungen und der Verweildauer derselben in der Kaskade 8. Bevorzugt besitzt dazu jedes der Vorratsgefäße 10-1 bis 10-X eine eigene anzusteuernde Pumpe 11-1 bis 11-X zum rückflussfreien dosieren. Auch das Abflussventil 13 wird über die Steuereinheit angesteuert.

Da viele Reaktionen nur bei bestimmten Temperaturen optimal ablaufen, ist eine entsprechende Temperaturführung sowohl der Vorratsgefäße 10-1 bis 10-X als auch der Kaskade 8 oder wenigstens ihrer Reaktionsgefäße 6-1 bis 6-n vorgesehen. Laufen die Reaktionen aber sehr langsam ab, so kann eine Durchmischung der in den Reaktionsgefäßen 6-1 bis 6-n befindlichen Lösung sinnvoll sein. Dazu kann das Abflussventil 13 als 2-Wege-Ventil ausgebildet werden und mittels einer Umwälzpumpe 14 und eines Kreislaufkurzschlusses 12-1 zwischen diesem 2-Wege-Ventil 13 und dem ursprünglich nur als Zufluss der 1. bis X. Reaktions- oder Waschlösungen benutzten Anschluss an den Zufluss 12 eine Umwälzung erfolgen.

Der Ausführung mit mehreren Pumpen ist für den Fachmann ohne weiteres eine Ausführung mit nur einer Pumpe äquivalent, wenn entsprechend separat anzusteuernde Verbindungen zwischen dem Eingang dieser einzigen Pumpe und dem Vorratsgefäß mit der jeweils gerade benötigten 1. bis X. Reaktions- oder Waschlösung 10-1 bis 10-X oder aber für den Kreislauf mit dem als 2-Wege-Ventil ausgebildeten Abflussventil 13 hergestellt werden.

Ebenso sinnvoll ist die Anordnung von mehr Vorratsgefäßen als für die im Augenblick durchgeführte Behandlung benötigt, wenn ständig verschiedene wechselnde Behandlungen durchgeführt werden. Gleichwirkend ist dazu die, auch teilweise, Austauschbarkeit der Vorratsgefäßen untereinander.

Je nach Anforderung an die Behandlung kann diese mit kontinuierlichen langsamen Zulauf und gleichzeitigem Ablauf oder aber auch mit periodisch gesteuerten Zulauf/Ablauf unter Einhaltung geforderter Verweilzeiten durchgeführt werden.

1: Hüllprodukt
1-1: flüssiges Hüllprodukt
1-2: Lamelle
2: Stabilisierung
2-1: netzartige Stabilisierung
2-2: mit semipermeabler Membran versehene Stabilisierung
2-3: untere Querspange
3: Handhabungshilfe
4: Reaktionslösung
4-1: weniger verbrauchte Reaktionslösung (aus erstem Reaktionsgefäß)
4-2: weniger verbrauchte Reaktionslösung (aus zweitem Reaktionsgefäß)
4-(n-1): weniger verbrauchte Reaktionslösung (aus vorletztem Reaktionsgefäß)
5: Wechsel der Reaktionslösung
5-1: Zufluss neuer Reaktionslösung
5-2: Verbindungsfenster zwischen zwei benachbarten Reaktionsgefäßen
5-n: Abfluss verbrauchter Reaktionslösung
6: Reaktionsgefäß
6-1: erstes Reaktionsgefäß (einer Kaskade)
6-2: zweites Reaktionsgefäß (einer Kaskade)
6-n: letztes Reaktionsgefäß (einer Kaskade)
7: Unterlage
8: Kaskade
9: Steuereinheit
10-1: Vorratsgefäß für 1. Reaktions- oder Waschlösung
10-2: Vorratsgefäß für 2. Reaktions- oder Waschlösung
10-3: Vorratsgefäß für 3. Reaktions- oder Waschlösung
10-X: Vorratsgefäß für X. Reaktions- oder Waschlösung
11-1: Pumpe für 1. Reaktions- oder Waschlösung
11-2: Pumpe für 2. Reaktions- oder Waschlösung
11-3: Pumpe für 3. Reaktions- oder Waschlösung
11-X: Pumpe für X. Reaktions- oder Waschlösung
12: Anschluss an Zufluss
12-1: Kreislaufkurzschluss
13: Abflussventil
14: Umwälzpumpe

Claims

Verfahren zur chemischen und/oder physikalisch-chemischen Behandlung von mit inerten Stoffen umhüllten reaktionsempfindlichen chemischen und/oder natürlichen Materialien, wie von Bakterien nach Einhüllen in Agar, nach vorbereitenden Arbeiten, wie Keimzüchtung und Dichteeinstellung, mittels bekannter nachfolgender Reaktionsschritte mit diesem Hüllprodukt in ebenfalls bekannten Reaktionslösungen, dadurch gekennzeichnet, dass ein Hüllprodukt (1) mechanisch stabilisiert (2) und mit einer zumindest zeitweisen Handhabungshilfe (3) versehen den bekannten nachfolgenden Reaktionsschritten unterzogen wird und das diese bekannten nachfolgenden Reaktionsschritte durch zumindest zeitweise Intensivierung des Stoffaustausches nach dem bekannten Gegenstromprinzip zwischen Hüllprodukt (1) und einer jeweiligen Reaktionslösung (4) ausgeführt werden.
Verfahren nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass unter Ausnutzung des Wechsel des Aggregatzustandes des Hüllproduktes (1) von flüssig nach fest in das noch flüssige Hüllprodukt (1-1) eine Stabilisierung (2), auch mit Ausbildung als netzartige Stabilisierung (2-1) oder mit Ausbildung als mit semipermeabler Membran versehener Stabilisierung (2-2), getaucht und mit einer anhaftenden Lamelle (1-2) des Hüllproduktes (1) aus dem noch flüssigen Hüllprodukt (1-1) gehoben wird, wobei das aus dem flüssigen Hüllprodukt (1-1) ragende Ende der Stabilisierung (2) eine Handhabungshilfe (3) selbst ausbildet, oder zumindest für die Aufnahme einer Handhabungshilfe (3) geeignete Mittel bereitstellt, oder das noch flüssige Hüllprodukt (1-1) auf eine nicht zwingend auf einer Unterlage (7) aufliegende netzartige Stabilisierung (2-1) oder mit einer semipermeablen Membran versehenen Stabilisierung (2-2) oder zwingend auf einer Unterlage (7) aufliegende rahmenartige Stabilisierung (2) jeweils mit entsprechender Handhabungshilfe (3) tropfenweise aufgebracht wird bzw. bei offener Ausbildung der Stabilisierung (2) in diese zwischen zwei Begrenzungen, wie Objektträgern, tropfenweise in den gebildeten Freiraum von oben eingebracht wird und, nach erfolgtem Wechsel des Aggregatzustandes nach fest, dieses mit Stabilisierung (2) und Handhabungshilfe (3) versehene Hüllprodukt (1) nunmehr den bekannten nachfolgenden Reaktionsschritten unterzogen wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass eine Intensivierung des Stoffaustausches nach dem Gegenstromprinzip, kontinuierlich oder diskontinuierlich erfolgt durch – Umströmen des in einem Reaktionsgefäß (6) befindlichen mit Stabilisierung (2) und Handhabungshilfe (3) versehenen Hüllproduktes (1) oder einer Vielzahl davon, nach Arretierung mittels seiner Handhabungshilfe (3) in dem Reaktionsgefäß (6), mit einer jeweils immer weniger verbrauchten Reaktionslösung (4-(n-1) bis 4-2, 4-1) und zuletzt unverbrauchten Reaktionslösung (4) durch Wechsel dieser Reaktionslösung (5) oder – Eintauchen eines oder mehrerer mit Stabilisierung (2) und Handhabungshilfe (3) versehener Hüllprodukte (1) mittels ihrer Handhabungshilfe (3) in eine jeweils immer weniger verbrauchte Reaktionslösung (4-(n-1) bis 4-2, 4-1) und zuletzt unverbrauchte Reaktionslösung (4) in Reaktionsgefäßen (6).
Verfahren nach einem oder mehreren der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass – als Hüllprodukt (1) in eine bekanntermaßen vorbereitete Suspension aus zu untersuchenden Keimen und Agar nach bekannter Dichteeinstellung als Stabilisierung (2) ein zumindest drei Seiten ausbildender Tauchrahmen mit einem Griff als Handhabungshilfe (3) eingetaucht wird, – dieser Tauchrahmen mit nunmehr anhaftender und überraschenderweise eine Lamelle (1-2) bildender Suspension aus der Suspension herausgehoben wird, – diese Suspension bekanntermaßen an der Luft bei Zimmertemperatur in den festen Aggregatzustand übergeht, – die gebildete Lamelle (1-2) mit dem Griff des Tauchrahmens für die weiteren Verfahrensschritte, Arretierung in einem Reaktionsgefäß (6) oder Eintauchen in und Herausheben aus Reaktionsgefäße (6) gehandhabt wird – als Einzelprobe oder Probenmenge aus gleicher vorbereiteter Suspension oder aus mehreren verschiedenen vorbereiteten Suspensionen den bekannten Reaktionen mittels einer jeweils immer weniger verbrauchte Reaktionslösung (4-(n-1) bis 4-2, 4-1) und zuletzt unverbrauchte Reaktionslösung (4) in einer Richtung des Konzentrationsgefälles im Gegenstromprinzip unterworfen wird, – mitsamt dreiseitig ausgebildetem Tauchrahmen in ein bekanntes Laufgel eingegossen wird, – nur bei Störung der weiteren Untersuchungen dieser dreiseitig ausgebildete Tauchrahmen vor diesen weiteren Untersuchungen entfernt wird und – der PFGE als einer der möglichen weiteren Untersuchungen in bekannter Weise zum Nachweis aller Bruchstücke der DNA unterzogen wird.
Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens zur chemischen und/oder physikalisch-chemischen Behandlung von mit inerten Stoffen umhüllten reaktionsempfindlichen chemischen und/oder natürlichen Materialien, wie von Bakterien nach Einhüllen in Agar, nach vorbereitenden Arbeiten, wie Keimzüchtung und Dichteeinstellung, mittels bekannter nachfolgender Reaktionsschritte mit diesem Hüllprodukt in ebenfalls bekannten Reaktionslösungen, dadurch gekennzeichnet, dass – einzelne oder mehrere mit Stabilisierung (2) und Handhabungshilfe (3) versehene Hüllprodukte (1) mittels ihrer jeweiligen Handhabungshilfe (3) in jeweils einem von mehreren Reaktionsgefäßen (6-1 bis 6-n) mittels bekannter Mittel arretiert angeordnet werden, – alle Reaktionsgefäße (6-1 bis 6-n) als Kaskade (8) durch jeweils ein Verbindungsfenster zwischen zwei benachbarten Reaktionsgefäßen (5-2) verbunden angeordnet sind, – in dem ersten Reaktionsgefäß (6-1) ein Zufluss neuer Reaktionslösung (5-1) oben angeordnet ist, in dem letzten Reaktionsgefäß (6-n) ein Abfluss verbrauchter Reaktionslösung (5-n) oben angeordnet ist und jeweils unten die Verbindungsfenster zum zweiten bzw. vorletzten Reaktionsgefäß (5-2) angeordnet, – alle weiteren Verbindungsfenster zwischen zwei Reaktionsgefäßen (5-2) als Zwangsführung der jeweiligen Reaktionslösung (4 bis 4-(n-1)) wechselseitig oben oder unten angeordnet sind.
Vorrichtung nach Anspruch 5 dadurch gekennzeichnet, dass – die vorbereitende Arbeit Dichteeinstellung mittels einer Densitometerpipette ausgeführt wird, an deren konischem Bereich drei höhenversetzte gleich intensive Markierungen bei unterschiedlichen Durchmessern oder in ihrer Intensität ungleiche Markierungen bei konstantem Durchmesser rückseitig angeordnet sind, – als mit Stabilisierung (2) und Handhabungshilfe (3) versehenes Hüllprodukt (1) eine Lamelle (1-2) mit einem zumindest temporär nur drei Seiten ausbildenden Tauchrahmen mit Griff angeordnet ist und – in jeweils einem von mehreren Reaktionsgefäßen (6-1 bis 6-n) nur eine Lamelle (1-2) mittels bekannter Mittel arretiert wird.
Vorrichtung nach Anspruch 5 oder 6 dadurch gekennzeichnet, dass die Stabilisierung (2) auf die nachfolgenden Reaktionsschritte und Reaktionslösungen abgestimmt in unterschiedlicher Geometrie, vorzugsweise einfache geometrische Formen wie Rechteck u.a., und unterschiedlichem Material, vorzugsweise inerter Kunststoff, ausgeführt ist, wobei auch, wenn bei den weiteren Reaktionen störend, Teile davon, bevorzugt eine untere Querspange (2-3), entfernbar ausgebildet sind.
Vorrichtung nach einem oder mehreren der Ansprüche 5 bis 7 dadurch gekennzeichnet, dass bei dauerhaft mit der jeweiligen Stabilisierung (2) verbundenen Handhabungshilfen (3) an den Handhabungshilfen (3) oder bei Teilbarkeit der Stabilisierung (2) von der Handhabungshilfe (3) an ungeteilt an der Probe verbleibender Stabilisierung (2) Probenidentifikationsflächen angeordnet sind, die während aller Verfahrensschritte unverändert erhalten und ablesbar bleiben.
Vorrichtung nach einem oder mehreren der Ansprüche 5 bis 8 dadurch gekennzeichnet, dass abhängig von der jeweils anfallenden Probenmenge die Kaskade (8) aus einer unterschiedlichen Anzahl Reaktionsgefäße (6-1 bis 6-n) gebildet wird.
Vorrichtung nach einem oder mehreren der Ansprüche 5 bis 9 dadurch gekennzeichnet, dass ein mit Stabilisierung (2) und Handhabungshilfe (3) versehenes Hüllprodukte (1) mittels seiner Handhabungshilfe (3) in jeweils einem von mehreren Reaktionsgefäßen (6-1 bis 6-n) mit seiner Stabilisierung (2) und der Wandung des jeweiligen Reaktionsgefäßes (6-1 bis 6-n) abdichtend aber zum Boden des Reaktionsgefäßes (6-1 bis 6-n) eine Überströmraum ausbildend und dadurch zwei zu umströmende Teilkammern bildend arretiert angeordnet ist.
Vorrichtung nach einem oder mehreren der Ansprüche 5 bis 10 dadurch gekennzeichnet, dass zur automatisierten Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahrensschritte die Vorrichtung folgende Ausbildung erhält: eine programmierbare Steuereinheit (9) ist zur Steuerung der Art und Menge des Zufluss, des Abfluss und der Verweildauer der Reaktions- oder Waschlösungen sowohl mit je einer Pumpe (11-1 bis 11-X) für jedes der Vorratsgefäße für 1. bis X. Reaktions- oder Waschlösung (10-1 bis 10-X) in rückflussfreier Wirkverbindung als auch mit dem Abflussventil (13) in Wirkverbindung, über einen Anschluss an den Zufluss (12) der Kaskade (8) ist die gesteuerte Verbindung zwischen der jeweiligen benötigten Reaktions- oder Waschlösung und dem ersten bis letzten Reaktionsgefäß (6-1 bis 6-n) angeordnet.
Vorrichtung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorratsgefäße für 1. bis X. Reaktions- oder Waschlösung (10-1 bis 10-X) heiz-, kühl oder thermostatisierbar und thermisch isoliert ausgebildet sind und dazu mit der Steuereinheit (9) in Wirkverbindung stehen.
Vorrichtung nach Anspruch 11 und/oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass bei sehr langsam ablaufenden Reaktionen mit der daraus entstandenen Notwendigkeit der Vermischung der in den Reaktionsgefäßen (6-1 bis 6-n) lange Zeit befindlichen jeweiligen Reaktionslösung (4) das Abflussventil (13) als 2-Wege-Ventil ausgebildet ist und als ein Kreislaufkurzschluss (12-1) zwischen dem 2-Wege-Ventil (13) und dem Anschluss an den Zufluss (12) mit einer Umwälzpumpe (14) zur Umwälzung der jeweiligen Reaktionslösung (4) durch die gesamte Kaskade (8) unter Steuerung durch die Steuereinheit (9) angeordnet ist.
Vorrichtung nach einem oder mehreren der Ansprüche 11 bis 13 dadurch gekennzeichnet, dass statt der Pumpen für 1. bis X. Reaktions- oder Waschlösung (11-1 bis 11-X) und der Umwälzpumpe (14) in der Vorrichtung nur eine einzige Pumpe, bevorzugt mit ihrem Ausgang in der Nähe des Zufluss neuer Reaktionslösung (5-1), angeordnet ist, wobei die Steuereinheit (9) die jeweilige benötigte Verbindung zwischen dem Eingang dieser Pumpe und dem Vorratsgefäß mit der jeweils benötigten 1. bis X. Reaktions- oder Waschlösung (10-1 bis 10-X) oder dem Abflussventil (13) bereitstellt.
Vorrichtung nach einem oder mehreren der Ansprüche 11 bis 14 dadurch gekennzeichnet, dass die Vorratsgefäße für 1. bis X. Reaktions- oder Waschlösung (10-1 bis 10-X) für mehr als die eine gerade ablaufende Behandlung ständig angeordnet sind oder zumindest ein Teil der Vorratsgefäße für 1. bis X. Reaktions- oder Waschlösung (10-1 bis 10-X) austauschbar angeordnet ist.
Vorrichtung nach einem oder mehreren der Ansprüche 11 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Kaskade (8) oder zumindest die in ihr enthaltenen Reaktionsgefäße (6-1 bis 6-n), heiz-, kühl oder thermostatisierbar und thermisch isoliert ausgebildet sind und dazu mit der Steuereinheit (9) in Wirkverbindung steht.
Vorrichtung nach einem oder mehreren der Ansprüche 11 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass der Zufluss neuer Reaktionslösung (5-1) und der gleichzeitige Abfluss verbrauchter Reaktionslösung (5-n) kontinuierlich, insbesondere als Dauertropf, oder diskontinuierlich über die Steuereinheit (9) angeordnet ist.