DE68922716T2

DE68922716T2 - Elektrophoreseplatte und Verfahren zu ihrer Herstellung.

Info

Publication number: DE68922716T2
Application number: DE68922716T
Authority: DE
Inventors: Philip Angelo Guadagno; Subphong Tansamrit
Original assignee: Helena Laboratories Corp
Current assignee: Helena Laboratories Corp
Priority date: 1989-02-22
Filing date: 1989-10-09
Publication date: 1996-01-11
Anticipated expiration: 2009-10-10
Also published as: US4975173A; CA1338209C; EP0384067A2; AU4289689A; AU621670B2; EP0384067B1; DE68922716D1; JP2793292B2; JPH02242147A; EP0384067A3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Elektrophoreseplatten und Verfahren zur Herstellung solcher Platten.
Als Hintergrund ist Elektrophorese ein gut eingeführtes Verfahren zur Trennung von Biochemikalien und ist bei der Analyse von in komplexen physiologischen Flüssigkeiten und Geweben gefundenen Proteinen nützlich. Typischerweise wird eine Elektrophorese in einem Auftrennungsmedium, beispielsweise einem Polymergel, wie Agarose oder Polyacrylamid, durchgeführt. Natürlich wird auch Celluloseacetat als Auftrennungsmedium verwendet.
Bei der Herstellung von Elektrophoreseplatten wird das Elektrophorese- oder Polymergel in Formen gegossen und an ein inertes Substrat befestigt. Beim Elektrophoreseverfahren werden typischerweise zahlreiche Proben auf das Elektrophoresemedium aufgetragen, d.h. das Polymergel. Um die Elektrophoreseauftrennung zu bewirken, wird bezüglich des die Proben enthaltenden Gels ein elektrisches Feld errichtet. Ein allgemeines Verfahren war es, die gegenüberliegenden Enden der Elektrophoreseplatte in einen Behälter mit elektrisch leitenden Puffern einzutauchen, die vorgesehen werden, um den pH-Wert des Elektrophoreseverfahrens aufrechtzuerhalten. Die Puffer werden mit Elektroden verbunden, die Elektroden werden entsprechend mit den positiven und negativen Enden einer Stromversorgung verbunden, und dies baut einen Spannungsgradienten über die Elektrophoreseplatte auf. Als Antwort auf den Spannungsgradienten wandern die Moleküle in den Proben im Verhältnis zu verschiedenen Faktoren, wie der Ladung und Größe der Proteinmoleküle über das Elektrophoresemedium. Alles vorhergehende ist natürlich gut bekannt.
Anstelle die Enden der Elektrophoreseplatte in die Puffer einzutauchen, wurde eine alternative Technik entwickelt, die als "Dochtwirkung" ("wicking") bekannt ist, in der ein absorbierender Docht bzw. Saugdocht oder ein Stück Papier dazu verwendet wird, jeden Puffer mit seinem entsprechenden Ende der Elektrophoreseplatte zu verbinden. Diese Technik ist ebenfalls herkömmlich.
Wenn die Elektrophoreseauftrennung beendet ist, ist es typisch, die elektrophorisierte Probe unter Ultraviolettlicht zu stellen. Normalerweise ist das Gel (wie Agarosegel) im wesentlichen farblos, das inerte Kunststoff (typischerweise Polyester) - oder Glassubstrat ist transparent, und ein Stück dunkles oder schwarzes Papier wird unter das Substrat gelegt, so daß die Fluoreszenz der Probe sichtbar wird. Demnach wurde durch das dunkle Papier ein optischer Kontrast vorgesehen, so daß das Ergebnis der Elektrophorese einfacher bestimmt und interpretiert werden konnte.
Die WO-87/04948 offenbart eine Elektrophoreseplatte, umfassend eine Basisschicht, auf welcher zwei voneinander beabstandete Pufferblöcke angebracht sind, wobei jeder Pufferblock ein Gel umfaßt, das ein elektroendosmotisches Potential aufweist, das, während es während der Herstellung vorausgewählt wird und wahrscheinlich geringer als das elektroendosmotische Potential der Basisschicht ist, durch jeden Pufferblock konstant ist.
Die vorliegende Erfindung liefert zahlreiche Vorteile bezüglich der Elektrophoreseplatte und dem Verfahren zur Herstellung und Verwendung derselben, wie hier nachfolgend beschrieben wird.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine Elektrophoreseplatte einer Art zur Verfügung gestellt, welche ein Substrat, das in bezug auf die elektrophoretische Abtrennung chemisch und elektrisch inert ist, und eine Basisschicht aus einem Elektrophoresemedium umfaßt, wobei das Elektrophoresemedium wenigstens etwas Puffer umfaßt, mit Pufferblöcken, die aus einem auf der Basisschicht aufgebrachten Gel bestehen, und Probenquellen, die auf der Basisschicht zwischen den Pufferblöcken angeordnet sind, umfaßt, dadurch gekennzeichnet, daß jeder der Pufferblöcke ein Elektrophoresemedium mit einem an die Basisschicht angrenzenden elektroendosmotischen Potential des Elektrophoresemediums umfaßt, das gleich oder kleiner als das elektroendosmotische Potential des Elektrophoresemediums der Basisschicht (18) ist, wobei die Pufferblöcke vermindertes oder weiter vermindertes elektroendosmotisches Potential an einer Stelle in einer Richtung, die entweder abgewandt von der Basisschicht oder abgewandt von den Probequellen ist, aufweisen.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Erzeugung einer Elektrophoreseplatte des Typs zur Verfügung gestellt, der ein Substrat, das bezüglich elektrophoretischer Abtrennung chemisch und elektrisch inert ist, umfaßt, umfassend die Schritte der Erzeugung einer Basisschicht aus elektrophoretischem Medium auf dem Substrat, wobei das elektrophoretische Medium mindestens etwas Puffer umfaßt, der Erzeugung von Pufferblöcken, bestehend aus einem Gel, der Bindung der Pufferblöcke an die Basisschicht, und der Erzeugung von Probenquellen in der Basisschicht, dadurch gekennzeichnet, daß jeder der Pufferblöcke ein elektrophoretisches Medium umfaßt, das ein an die Basisschicht angrenzendes elektroendosmotisches Potential aufweist, das gleich oder kleiner als das elektroendosmotische Potential des elektrophoretischen Mediums der Basisschicht ist, wobei die Pufferblöcke vermindertes oder weitervermindertes elektroendosmotisches Potential an einer Stelle in einer Richtung aufweisen, die abgewandt von der Basisschicht oder abgewandt von den Probenquellen liegt.
Bevorzugt sind die Pufferblöcke Gele, welche Puffermaterial plus Wasser (wenn das Puffermaterial Wasser enthält) enthalten, um als ein in sich geschlossenes Pufferreservoir zu wirken.
Die Erfindung wird hierin im weiteren nur durch Beispiele unter Bezugnahme auf die begleitenden Zeichnungen beschrieben, worin:
Fig. 1 eine perspektivische Ansicht einer Elektrophoreseplatte ist, die in Übereinstimmung mit den Prizipien der vorliegenden Erfindung hergestellt ist;
Fig. 2 eine Querschnittsansicht der Elektrophoreseplatte von Fig. 1 in Richtung der Pfeile 2-2 ist;
Fig. 3 eine perspektivische Ansicht einer anderen Elektrophoreseplatte ist, die in Übereinstimmung mit den Prinzipien der vorliegenden Erfindung hergestellt ist;
Fig. 4 eine perspektivische Ansicht einer noch weiteren Elektrophoreseplatte ist, die in Übereinstimmung mit den Prinzipien der vorliegenden Erfindung hergestellt ist;
Fig. 5 eine perspektivische Ansicht einer weiteren Elektrophoreseplatte ist, die in Übereinstimmung mit den Prinzipen der vorliegenden Erfindung hergestellt ist;
Fig. 6 eine perspektivische Ansicht einer noch weiteren Elektrophoreseplatte ist, die in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung hergestellt ist;
Fig. 7 eine schematische Ansicht des Grundierens des inerten Substrates als einem ersten Schritt bei dem Verfahren der Herstellung der Elektrophoreseplatte der vorliegenden Erfindung ist;
Fig. 8 eine schematische Darstellung einer Form ist, die zum Gießen oder Beschichten der Basisschicht auf das Substrat gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann;
Fig. 9 eine Endansicht der Verwendung einer Abdeckform ist, um die Pufferblöcke an die Elektrophoreseplatte gemäß der vorliegenden Erfindung anzufügen;
Fig. 10 eine Aufsicht einer typischen Elektrophoresekammer ist, welche die Elektroden bezüglich der Pufferblöcke durch die Verwendung von Ausrichtungslöchern sauber aufgereiht zeigt;
Fig. 11 eine perspektivische Ansicht einer weiteren Elektrophoreseplatte ist, die in Übereinstimmung mit den Prinzipien der vorliegenden Erfindung hergestellt ist;
Fig. 12 eine Endansicht eines Abschnitts eines Formteils ist, das zur Herstellung der Pufferblöcke der Ausführungsform von Fig. 11 verwendet werden soll;
Fig. 13 eine perspektivische Ansicht einer weiteren Elektrophoreseplatte ist, die in Übereinstimmung mit den Prinzipien der vorliegenden Erfindung hergestellt ist; und
Fig. 14 schematisch ein Verfahren zur Herstellung der Elektrophoreseplatte von Fig. 12 zeigt.
Unter Bezugnahne zunächst auf die Elektrophoreseplatte 10 einer Ausführungsform der Erfindung, wie sie in Fig. 1 dargestellt ist, umfaßt die Platte ein Substrat 12 aus einer Substanz, die sowohl elektrisch als auch chemisch inert ist. Das Substrat kann aus einem von vielen Materialien ausgewählt werden, die herkömmlich als Träger für Elektrophoresegelmedien verwendet werden und den gewünschten Grad der Steifheit besitzen, um das Gel vor Beschädigung während der Handhabung und dem Transport zu unterstützen und zu schützen. Film- bzw. Folienmaterialien, die für diesen Zweck nützlich sind, schließen Polystyrol, Polyethylen und Glas sowie Polyester ein. Ein bevorzugtes Substrat ist eine Polyesterfolie, die durch E.I. duPont DeNemours and Company unter dem Warenzeichen Mylar verkauft wird, und falls die elektrophoresierten Proben Ultraviolettlicht unterworfen werden sollen, ist es wünschenswert, ein dunkles oder schwarzes Mylar zu verwenden. Ein alternatives Substrat, das gleichermaßen zufriedenstellend ist, ist eine thermoplastische Polycarbonatfolie, die durch General Electric unter dem Warenzeichen Lexan verkauft wird. Wieder sollte der Film bzw. die Folie dunkel oder scharz sein, wenn die elektrophoresierte Probe unter Ultraviolettlicht bewertet werden soll.
Die nachfolgende Erklärung wird unter der Annahme gegeben, daß Agarosegel als das Elektrophoresemedium verwendet werden soll. Es ist jedoch festzustellen, daß gemäß den Prinzipien der vorliegenden Erfindung andere Elektrophoresemedien verwendet werden können. Dies schließt ohne Beschränkung die Verwendung von Polyacrylamid, vernetzt oder nicht, ungeachtet ob ein Katalysator vorhanden ist, ein.
Unter Bezugnahme auf die Fig. 1 und 2 wird das Substrat 12 typischerweise hergestellt, indem zunächst eine Primer- bzw. Grundier- oder Gelbindungsschicht 14 auf das Substrat aufgetragen wird. Die Grundierschicht oder der Film 14 würde ein dünner Überzug aus Agarosegel sein. Es ist vorzuziehen, ein oder mehrere Ausrichtungslöcher 16 durch die Platte 10 vorzusehen, so daß die Platte in bezug auf die Elektroden ausgerichtet werden kann, wenn der Spannungsgradient auf die Proben angewendet werden soll. Die Ausrichtungslöcher können entweder vordem oder nachdem das Substrat mit der Grundierschicht 14 beschichtet wird vorgesehen werden. Wenn die Ausrichtungslöcher vorgesehen werden nachdem die Grundierschicht aufgetragen wird, können dann die Ausrichtungslöcher sich durch die Grundierschicht sowie durch das Substrat erstrecken, da die Grundierschicht das gesamte Substrat bedecken kann. Die Ausrichtungslöcher sind so dargestellt, daß sie sich durch die Platte erstrecken und einer Kante der Platte 10 benachbart sind. Die Anzahl der Ausrichtungslöcher und ihre genaue Anordnung kann natürlich innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung variiert werden.
Über der Grundierschicht 14 ist das Elektrophoresegel angeordnet, das im allgemeinen als eine große, dünne, rechteckige Schicht 18 dargestellt ist. Die genaue Form der Gelschicht ist nicht auf ein Rechteck oder Quadrat beschränkt, und demnach dient der Bezug auf eine rechteckige Schicht lediglich veranschaulichenden Zwecken. Die Gelschicht 18 kann als Basisschicht bezeichnet werden.
An jedem der gegenüberliegenden Enden der Basisschicht 18 und in Kontakt mit dieser Basisschicht ist ein Pufferblock 20 vorgesehen. In der bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erstrecken sich die Pufferblöcke bevorzugt wenigstens etwa 2,54 mm (0,100 Inch) über die obere Oberfläche 21 der Basisschicht 18. Diese Pufferblöcke 20 liefern das Pufferreservoir für die Elektrophorese. Die Pufferblöcke alleine oder in Kombination mit der Basisschicht sind Laminate, d.h. es gibt eine Vielzahl von Schichten.
Während des Elektrophoreseverfahrens treten bestimmte Phänomene auf, welche die Elektrophorese stören oder nachteilig beeinflussen. Während des Hitzeaufbaus beispielsweise, der mit dem Spannungsgradienten verbunden ist, neigt im Gel vorliegendes Wasser dazu beweglicher zu werden, und wird dazu neigen zu fließen. Wenn überschüssige Wasserströmung vorhanden ist, tritt eine Verwaschung und Aufweitung der Elektrophoresezonen ein und so eine Störung der Analyse der elektrophoresierten Probe. Ein weiteres Problem, das als ein Ergebnis des Hitzeaufbaus auftritt, ist ein tatsächlicher Zusammenbruch der Pufferblöcke, der als Gelschmelze bezeichnet wird. Dieses sind Probleme bei typischen kommerziellen Agarosegelmedien. Gelschmelze kann sogar auftreten, wenn eine dünne Schicht von Agarosegel auf ein Substrat aufgebracht wird und eine Elektrophoreseabtrennung unter Verwendung der vorstehend erwähnten Dochtwirkungstechnik ohne die Verwendung von Pufferblöcken durchgeführt wird.
Es ist bekannt, daß kommerzielle bzw. technische Agarosegele verschiedene Grade von Verunreinigungen besitzen, wie Sulfate und/oder Pyruvate, die mit dem Grad oder dem Ausmaß der Wasserbewegung in Beantwortung eines Spannungsdifferentials und Hitze korreliert werden können. Die Neigung des Wassers, als Antwort auf feststehende ionisch geladene Moleküle im Gel zu wandern oder sich zu bewegen, wenn ein Spannungsdifferential angelegt wird, wird als Elektroendosmose bezeichnet.
Bei Elektrophoresen, die eine dünne Gelschicht mit entweder Dochten oder ein Eintauchen der Enden der Gelschicht in flüssige Puffer verwenden, ist es wohlbekannt, einen Reguliergrad über das Ausmaß der Elektroendosmose (EEO) durch Verwendung mehr oder weniger reiner Formen des Agarosegels zu erhalten. Ein solches reineres Gel wird unter dem Warenzeichen Isogel verkauft. Während es wünschenswert wäre, ein reineres Produkt zu verwenden, das einen niedrigen EEO-Wert hat, wenn Pufferblöcke auf ein Substrat gegossen oder geformt werden soll, machen die großen Gelvolumen die Kosten für die gesamte Platte zu teuer, da die Kosten des Mediums mit ansteigender Reinheit steigen.
Die vorliegende Erfindung hat die mit den hochgradigen EEO- Gelen verbundenen Probleme überwunden, während alle Vorteile eines Festgel-Pufferblock-Systems aufrechterhalten werden und während die hohen Kosten, die mit der Verwendung nur niederwertiger EEO-Gele verbunden sind, vermieden werden. Gemäß den Prinzipien der vorliegenden Erfindung werden die Pufferblöcke als ein Verbundkörper oder Laminat erzeugt, wobei ein Gel mit niederem EEO-Wert in der Platte im Bereich eines erwarteten Hitzeaufbaues verwendet wird, wie der Bereich der Elektroden, wo die Probleme der Wasserbewegung am akutesten sind. Ein Medium mit niederem EEO-Wert ist auch gegen "Gelschmelze" infolge von Hitzeaufbau bei einer Elektrode widerstandsfähiger als ein Medium mit hohem EEO-Wert. Mit anderen Worten, sogar wenn eine Gelschmelze bei einem Medium mit niedrigem EEO-Wert auftritt, fließt das Wasser im Gel nicht so schnell wie das Wasser in einem Gel mit hohem EEO-Wert. Jedoch wird gemäß den Prinzipien der vorliegenden Erfindung, während ein Gel mit niedrigem EEO-Wert in Bereichen eines erwarteten Hitzeaufbaus verwendet wird, ein Gel mit höherem EEO-Wert im Rest der Pufferblöcke und im Rest der Platte verwendet. Dies unterstützt die Kostenregulierung der Elektrophoreseplatte. Das Medium mit niedrigerem EEO-Wert kann eine reinere Form des Mediums mit höherem EEO-Wert sein, das sonstwo auf der Platte verwendet wird, oder ein vollständig verschiedener Typ von Elektrophoresemedium.
In der in den Fig. 1 und 2 gezeigten Ausführungsform schließt jeder Pufferblock 20 eine untere Schicht 26, welche mit der Basisschicht 18 in Kontakt ist, und eine obere Schicht 28, welche mit der unteren Schicht 26 in Kontakt ist, ein. Infolgedessen kann der wie in den Fig. 1 und 2 dargestellte Pufferblock als ein aus einem Laminat gebildeter Gelblock betrachtet werden. Die Breite der Schichten wird vermindert, in dem Maße wie die Höhe des Pufferblocks über das Substrat zunimmt. Bei der Ausführungsform der Fig. 1 und 2 würde die Schicht 28 den niedrigsten EEO-Wert, und die Schicht 18 würde den höchsten EEO-Wert besitzen, und die Schicht 26 könnte entweder einen dazwischenliegenden EEO-Wert besitzen oder das gleiche Material und die gleiche Reinheit wie die Schicht 18 aufweisen (und infolgedessen den gleichen EEO-Wert). Daher kann der Pufferbereich oder Pufferblock, abhängig von den ausgewählten Gelen, als zweioder dreischichtig betrachtet werden.
In einer in Fig. 3 gezeigten alternativen Ausführungsform ist eine Elektrophoreseplatte, welche eine Gelbasisschicht 118 und Pufferblöcke 120 beinhaltet, auf einer Seite des Substrates 12 dargestellt. Die Gelbasisschicht 118 weist Endabschnitte 126 auf, welche dicker sind als der dazwischenliegende Abschnitt 127 der Basisschicht 118. Infolgedessen erstrecken sich die Basisschichtendabschnitte 126 über die Oberseite des dazwischenliegenden Abschnittes 127 der Basisschicht 118. Das für die Basisschicht 118, einschließlich der erhabenen Endabschnitte 126 verwendete Gel besitzt einen ersten oder höheren EEO-Wert. Bei dieser Ausführungsform ist eine obere Schicht 128 eines Mediums mit niedrigerem EEO-Wert auf der Oberseite der erhabenen Abschnitte 126 angebracht. Infolgedessen sind bei dieser Ausführungsform jede der Pufferblöcke 120 Verbundkörper oder Laminate aus zwei Schichten 126, 128 aus elektrophoretischen Medien. Wenn eine Elektrode, wie die in Fig. 10 dargestellte Art, die Oberseite des Pufferblockes 120 berührt, ist die Elektrode mit der Gelschicht 128 von niedrigerem EEO-Wert in Kontakt. Indem ein Pufferblock 120, in dem ein größerer Abschnitt 126 des Blocks aus dem gleichen Material wie die Gelschicht 118 ist, zur Verfügung gestellt wird, wird weniger des teuren Materials mit niedrigem EEO- Wert verwendet, als wenn der gesamte Gelpufferblock aus einem Gel mit niedrigem EEO-Wert gebildet wurde.
Unter Bezugnahme auf Fig. 4 schließt eine Elektrophoreseplatte ein Substrat 12, eine Basisgelschicht 218 und Pufferblöcke 220 an gegenüberliegenden Seiten der Basisgelschicht ein. Die Blöcke 220 sind mit drei Gellaminaten oder -schichten dargestellt: einer unteren Schicht 226, einer dazwischenliegenden Schicht 228 und einer oberen Schicht 230. Bei dieser Ausführungsform wird der EEO-Wert jeder der Gelschichten niedriger sein als der der unmittelbar vorhergehenden Schicht, in dem Maße, wie die Schichten entfernter vom Substrat liegen. Infolgedessen würde Schicht 230 den niedrigsten EEO-Wert, Schicht 228 den nächstniedrigen EEO- Wert, Schicht 226 den nächstniedrigen EEO-Wert und Schicht 218 den höchsten EEO-Wert besitzen. Dies kann auch als ein Pufferblock erläutert werden, bei dem der EEO-Wert mit zunehmendem Abstand vom Substrat abnimmt (oder wenigstens nicht zunimmt). Wieder nimmt die Breite der Pufferblöcke mit zunehmender Höhe über dem Substrat ab.
In allen schon beschriebenen Ausführungsformen wurde die Grenzfläche zwischen angrenzenden Gelschichten innerhalb des Gelpufferblocks als im allgemeinen parallel zu dem flachen inerten Substrat 12 dargestellt.
Nun auf die in Fig. 5 dargestellte Ausführungsform Bezug nehmend, schließt eine Elektrophoreseplatte ein Substrat 12 ein, auf dem eine Elektrophoresebasisgelschicht 318 aufgebracht ist. An jedem Ende der Schicht 318 befinden sich Pufferblöcke 320. Gemäß den wie in Fig. 5 dargestellten Prinzipien der Erfindung schließt jeder Gelblock 320 eine untere Schicht 326 und eine obere Schicht 328 ein, wobei die obere Schicht aus einem Gel mit einem niedrigeren EEO- Wert als dem EEO-Wert der unteren Schicht 326 gebildet ist. Anstelle einer zu dem Substrat 12 parallelen Grenzfläche zwischen den oberen und unteren Schichten des Gelblocks (wie im Querschnitt gesehen) schließt jedoch die obere Schicht 328 gegenüberliegende schiefe oder abgeschrägte Abschnitte 330 ein, die sich auf gegenüberliegenden Seiten des Pufferblockes 320 abwärts auf das Substrat 318 erstrecken. Die Verwendung einer abgeschrägten oder schiefen oberen Gelschicht erhöht die Menge an Medium mit niedrigem EEO-Wert in dem unmittelbar umgebenden Bereich, in dem eine Elektrode in Kontakt mit dem Pufferblock 320 sein wird.
Es liegt innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung, daß die Konfiguration von Fig. 5 mit einer abgeschrägten oder schiefen Grenzfläche zwischen den Gelschichten in jeder der Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann.
Nun Bezug nehmend auf Fig. 6, schließt die Elektrophoreseplatte ein inertes Substrat 12 (was natürlich ein gemeinsames Merkmal aller Elektrophoreseplatten ist) mit einer Gelbasisschicht 418 darauf ein. An jedem Ende der Gelschicht 418 ist ein Gelpufferblock 420 angebracht. Während die vorhergehenden Ausführungsformen Pufferblockschichten darstellen und beschreiben, welche einen konstanten oder abnehmenden EEO-Wert mit zunehmendem Abstand vom Substrat aufweisen, besitzt die Ausführungsform von Fig. 6 eine leicht verschiedene Konfiguration, während sie immer noch dahingehend wirkt, unerwünschte Wasserströmung zu verhindern, wenn nicht auszuschließen. In der Ausführungsform von Fig. 6 schließt jeder Pufferblock 420 eine Zwischenkomponente 426 eines ersten EEO-Mediums und eine Endkomponente 428, die lateral auswärts von der Zwischenkomponente 426 liegt, ein. Die End- oder Außenkomponenten oder -schichten 428 der Pufferblöcke bestehen aus einem Gelmedium, das einen niedrigeren EEO-Wert als den EEO-Wert des für die Zwischenkomponente oder -schicht 426 verwendeten Gelmediums besitzt. Zur Verdeutlichung und nur zum Zwecke eines Beispiels und nicht Begrenzung ist bei der Ausführungsform von Fig. 6 die Zwischenkomponente 426 des Pufferblocks im Querschnitt im allgemeinen dreieckig, und die Endkomponenten 428 weisen im Querschnitt im allgemeinen Trapezform auf. Die Konfiguration von Fig. 6 basiert auf dem Prinzip, daß wenn Hitzeaufbau an einer anderen Stelle (oder zusätzlich dazu) als dem Kontakt zwischen dem Gel und den Elektroden auftritt, dann ein Gel mit niedrigem EEO-Wert in den Bereichen des Hitzeaufbaus angebracht werden kann, um jeglichen Hitzeaufbau oder Gelschmelze zu kompensieren.
In jeder der vorhergehend dargestellten Ausführungsformen besitzen die Pufferblöcke im Querschnitt im allgemeinen Trapezform, wenn sie von der längeren Seite der Platte aus betrachtet werden. Eine solche Gestalt dient nur zu Veranschaulichungszwecken. Wie genauer in den Fig. 1 und 2 dargestellt ist, weist jeder Pufferblock im allgemeinen Trapezform auf, mit einer oberen kurzen Oberfläche und einer unteren langen Oberfläche, die parallel zueinander sind und mit geneigten oder konisch zulaufenden Seiten dazwischen. Die oberen und unteren Oberflächen sind parallel zum Substrat 12. Die konisch zulaufenden oder geneigten Seiten 30 der Pufferblöcke, die einander gegenüber liegen, stehen bevorzugt unter einem Winkel von wenigstens 135º bezüglich der Oberfläche des Substrates, was in Fig. 2 als Winkel A identifiziert ist, um ein Abbrennen an der schwächsten Kante 32 zu verhindern. Die Kante 32 ist als die Grenzfläche zwischen der Elektrophoreseoberfläche der Gelschicht 18 definiert, wo die Proben einer Elektrophorese unterworfen werden, und der Neigungsfläche 30 des Pufferblockes 20. Ein zusätzlicher Vorteil des Pufferblocks mit konisch zulaufender Konfiguration liegt in der Unterstützung ihrer Entfernung aus einer Form, worin sie, wie beschrieben werden wird, erzeugt oder gegossen werden.
Gemäß den Prinzipien der vorliegenden Erfindung kann die Grundierschicht der Elektrophoreseplatte einige um dick sein, die Elektrophoresebasisschicht 18 kann 4,57 mm (0,18 Inch) dick sein, und die Pufferblöcke sollten zwischen etwa 2,54 mm (0,100 Inch) bis etwa 3,81 mm (0,150 Inch) dick sein, zusätzlich zur Dicke der Gelbasisschicht 18. Natürlich sind diese Abmessungen bezüglich der relativen Größe der Schichten gemäß der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung veranschaulichend und sollten nicht als eine Beschränkung der vorliegenden Erfindung ausgelegt werden.
Die Gelbasisschicht 18 kann auch mit einer Reihe von Probenöffnungen 33 versehen sein. In der in Fig. 1 gezeigten Ausführungsform sind zwei Reihen von Öffnungen vorgesehen. Die Probenöffnungen sind senkrecht zur Längsachse der Platte 10 ausgerichtet und parallel zur Längsachse der Pufferblöcke 20.
Das Substrat ist typischerweise von rechteckiger Form und kann koronabeladen sein, um ein flüssiges Gel anzunehmen. Es sollte beachtet werden, daß das Substrat zunächst chemisch und elektrisch inert ist und infolgedessen die Elektrophoreseschicht keinen geeigneten Überzug oder eine Schicht bilden würde, sondern eher eine Reihe von diskreten Tröpfchen auf der Oberfläche des Substrates bilden würde. Daher ist die Verwendung einer Koronabeladung auf der Oberfläche, um ein Anheften der Elektrophoreseschicht zu gestatten und zu gestatten, daß die Schicht geliert, eine allgemeine Technik, die als Grundieren bzw. Primen des Substrates bezeichnet wird.
So ist unter Bezugnahme auf Fig. 7 ein erster Schritt bei einem Verfahren zur Herstellung der Elektrophoreseplatte der vorliegenden Erfindung, daß die Grundier- bzw. Primerschicht von Gel 14 durch ein Spray 64 aus einem Behälter 66 aufgetragen wird. Die Primerschicht kann das gleiche Elektrophoresemedium wie die nachfolgende Elektrophoresegelschicht sein, obwohl verdünnter. Es muß beachtet werden, daß dies nur schematisch ist und in Fig. 7 der Primer 14 als das Substrat bedeckend dargestellt ist. Es ist üblich, eine Elektrophoreseplatte zu grundieren, wie durch eine Sprühtechnik oder alternativ dazu durch Eintauchen des Substrats in eine verdünnte Gellösung und danach Entfernen überschüssiger Lösung mittels einer Rakel oder dergleichen. Die Primerschicht wird aushärten oder gelieren gelassen. Dann können die Ausrichtlöcher 16 in dem Substrat vorgesehen werden. (Alternativ dazu können die Ausrichtlöcher vor dem Grundieren vorgesehen werden.) Wenn "eingebettete" Elektroden erwünscht werden, können sie vor dem Aufbringen des Primers 14 auf dem Substrat angebracht werden.
Fig. 8 veranschaulicht schematisch die Vorrichtung für den zweiten Schritt in dem bevorzugten Verfahren zur Herstellung der Elektrophoreseplatte der vorliegenden Erfindung. Dieser zweite Schritt kann als die Erzeugung der Basisgelschicht auf dem Substrat in einer geschlossenen Form betrachtet werden. Fig. 8 zeigt erste und zweite Preßformhälften 68 bzw. 68', jede mit im allgemeinen rechteckiger Konfiguration. Ein Paar Stifte 70 erstreckt sich aufwärts von der oberen Oberfläche der zweiten Formhälfte 68', um in den Ausrichtungslöchern 16 der Platte aufgenommen zu werden. Die erste Formhälfte 68 besitzt im allgemeinen eine rechteckige Formvertiefung 72. Die zweite Formhälfte 68' besitzt im allgemeinen eine rechteckige Formvertiefung 76, die mit der Formvertiefung 72 ausgerichtet ist, wenn die Formhälften geschlossen sind. Während ein grundiertes Substrat auf der zweiten Formhälfte 68' angebracht ist, wird die andere Formhälfte 68 auf die Oberfläche des Substrates aufgesetzt, und die Stifte 70 erstrecken sich durch die Ausrichtlöcher 16. Dann wird das Agarosegel in die Form eingefüllt. Zum Zweck der Einführung des Agarosegels in die Form ist eine Vielzahl von Einlässen 40 in der Wand der ersten Formhälfte 68 vorgesehen. Drei solche Einlässe sind in Fig. 8 dargestellt. Oberflächliche bzw. seichte Stifte 42 in der Formvertiefung 72 liefern Öffnungen 33 in der Elektrophoreseschicht 18 während dem Formen, wobei die Öffnungen dazu helfen, die Proben während der Elektrophorese aufzutragen.
Nachdem die Basisgelschicht 18 teilweise aushärtet, werden die Formhälften geöffnet und das Substrat 12 wird auf eine in Fig. 9 im allgemeinen mit 100 bezeichnete Metallplatte gebracht. Eine Abdeckform bzw. abdeckende Form 102 wird über die Basisgelschicht 18 gelegt. Die Abdeckform 102 beinhaltet Vertiefungen 104 für die Pufferblöcke und Einlässe 106, die mit jeder Vertiefung 104 verbunden sind. Dann wird das Gel mit niedrigerem EEO-Wert durch die Einlässe 106 in die Vertiefungen 104 eingeführt. Bei der Erzeugung der Elektrophoreseplatte von Fig. 4 werden beispielsweise Gele mit abnehmendem EEO-Wert aufeinanderfolgend durch die Einlässe 106 eingeführt, um die Schichten 226, 228 bzw. 230 zu erzeugen. Jede Schicht kann teilweise abbinden gelassen werden, bevor die nächste Schicht eingeführt wird. Infolgedessen können die Pufferblöcke als Endkappen auf der Elektrophoreseplatte betrachtet werden. Die Abdeckform 102 wird nachdem der Pufferblock ausreichend ausgehärtet ist entfernt, um seine Form bzw. Konfiguration beizubehalten.
Die vorliegende Erfindung faßt auch die Verbindung der Formhälfte 68 mit der Abdeckform 102 ins Auge, derart, daß das Substrat mit der Basisgelschicht darauf nicht von der Formhälfte 68' entfernt werden muß.
Bei der Verwendung der Elektrophoreseplatte werden die Proben in die Öffnungen 33 gegeben, und der Aufbau wird in eine Elektrophoresekammer gegeben, die etwas schematisch in Fig. 10 gezeigt ist. Die Elektrophoresekammer 44 beinhaltet Ausrichtungsstifte 46, die sich aufwärts von der Basis der Kammer erstrecken, wobei sich die Ausrichtstifte durch die Öffnungen oder Ausrichtlöcher 16 in der Elektrophoreseplatte 10 erstrecken. Bei genau in den Ausrichtlöchern positionierten Ausrichtstiften werden die Pufferblöcke 20 genau unter den Elektroden 48, 50 in der Elektrophoresekammer 44 ausgerichtet. Die Elektroden sind als an einer Wand 52 der Kammer 44 angebracht gezeigt. Während der Elektrophorese wandert Puffergel von einem Block über die Platte zum anderen Block. Mit der genauen Ausrichtung der Elektroden bezüglich der Pufferblöcke bleibt der Potentialgradient über die volle Breite der Elektrophoreseplatte konstant, und über die volle Breite der Platte wird ausreichend Puffer geliefert werden, so daß die Ergebnisse der Elektrophorese ausreichende Zuverlässigkeit besitzen werden. Durch Verwendung der laminierten oder Verbundpufferblöcke gemäß den Prinzipien der vorliegenden Erfindung ergibt sich eine wesentliche Verminderung, wenn nicht Ausschließung, der Bewegung von Wasser aus den Pufferblöcken in den Bereich der Elektroden, wodurch die Zuverlässigkeit der Ergebnisse der Elektrophorese erhöht wird.
Nachdem nun verschiedene Ausführungsformen der Elektrophoreseplatte der vorliegenden Erfindung und ein Verfahren zur Herstellung der Platte gemäß der vorliegenden Erfindung beschrieben wurden, sollte nun auf Fig. 11 Bezug genommen werden, worin eine weitere Ausführungsform der Elektrophoreseplatte beschrieben ist. Die in Fig. 11 gezeigte Elektrophoreseplatte der Erfindung schließt ein Substrat 12 mit einer ersten dünnen Schicht von Gel 518 darauf und Pufferblöcke 520 an gegenüberliegenden Enden der Gelschicht 518 ein. Jeder Pufferblock 520 ist aus einer unteren und oberen Schicht 526 bzw. 528 gebildet, mit einer sägezahnförmigen oder gewellten Grenzfläche 530 dazwischen. Diese Form der Grenzfläche wird den Zusammenhalt zwischen den Schichten innerhalb der Pufferblöcke verbessern. In Übereinstimmung mit den Erläuterungen der anderen Ausführungsformen der Elektrophoreseplatte besitzt die obere Gelschicht 528 einen niedrigeren EEO-Wert als den EEO-Wert der unteren Gelschicht 526.
Um die Pufferblöcke 520 von Fig. 11 herzustellen, sollte Bezug auf Fig. 12 genommen werden, die in einer Endansicht ein Formteil zur Bildung der gewellten Oberfläche zwischen den Gelschichten innerhalb des Pufferblockes zeigt. Nachdem die Gelschicht 526 mit dem höheren EEO-Wert geformt worden ist, wird eine Formplatte 535 mit einer sägezahnförmigen oder gewellten Oberfläche 540 auf die Gelschicht 526 gesetzt. Die Gelschicht 526 wird teilweise aushärten oder abbinden gelassen, dann wird die Formplatte 535 entfernt, und die Gelschicht 528 wird in die Form gegossen. Natürlich erfordert die beschriebene Technik das Öffnen der Abdeckform, um die Formplatte 535 einzuführen (und später zu entfernen).
Die verschiedenen Ausführungsformen der vorliegenden Elektrophoreseplatte wurden beschrieben und veranschaulicht, wenn die Pufferblöcke diskrete Laminat- oder Verbundschichten sind. Die Prinzipien der vorliegenden Erfindung werden erreicht, indem der EEO-Wert des Gelblocks als Funktion des Abstandes von der Substrat- (oder Gelschicht-) oberfläche variiert wird, wo die Proben tatsächlich zur Elektrophorese aufgebracht werden. Diese Prinzipien können dann erreicht werden, wenn die Gelschicht tatsächlich ein Kontinuum sich ändernder EEO-Werte ist. Mit anderen Worten, der Pufferblock kann eher als ein kontinuierliches Gußstück erzeugt sein, denn als diskretes Gußstück, bei denen die EEO-Werte des Geles während des kontinuierlichen Gießverfahrens geändert werden. Eine Elektrophoreseplatte gemäß dieser Ausführungen ist in Fig. 13 gezeigt, in der die Elektrophoreseschicht 618 auf einem Substrat 12 gebildet ist, und die Pufferblöcke 620 an gegenüberliegenden Enden der Elektrophoresebasisschicht erzeugt werden. Die Pufferblöcke 620 sind schattiert, um den fortschreitend sich ändernden EEO- Wert anzugeben. Es liegt innerhalb des Umfangs der Ausführungsform von Fig. 13, daß die Schicht 618 gegossen werden kann, teilweise aushärten gelassen wird, und dann die Pufferblöcke 620 gegossen werden oder alternativ dazu die Pufferblöcke und die Schicht vollständig kontinuierlich gegossen werden.
Eine Vorrichtung zur Erzeugung des Gels als ein kontinuierlicher Gießling wird nun unter Bezugnahme auf Fig. 14 beschrieben werden. Zwei Versorgungstanks 80 und 82 sind vorgesehen, wobei ein Versorgungstank ein Gelmedium mit niederem EEO-Wert und der andere Versorgungstank ein Gelmedium mit hohem EEO-Wert enthält. Der Ausgang jedes Versorgungstankes ist durch Leitungen 84 bzw. 84' mit einem Proportionalmischventil 86 verbunden. Das Proportionalmischventil 86 regelt die relative Menge jedes der Gelmedien, welche durch das Ventil fließen und das Ventil über Leitung 88 verlassen.
Wenn eine Abdeckform für das kontinuierliche Gießen verwendet wird, dann wird die Leitung 88 mit den Einlässen 106 verbunden. Wenn die Basisschicht 618 und die Blöcke 620 als ein kontinuierliches Gußerzeugnis gebildet werden, dann können die Abdeckform 102 und die Formhälfte 68 miteinander verbunden werden. Alternativ dazu kann, wie in der vorhergehend erwähnten gleichzeitig anhängigen Anmeldung beschrieben, ein kontinuierliches Gießen verwendet werden.
Wenn die Abdeckform 102 während dem Formen der Elektrophoreseblöcke 620 verwendet wird, wird das Proportionalmischventil, wenn das Gelmedium beginnt, die vergrößerten Formvertiefungsabschnitte 104 auszufüllen, so eingestellt werden, daß im allgemeinen nur Gel mit höherem EEO-Wert anfänglich durch das Mischventil läuft. Indem sich die vergrößerten Formvertiefungsabschnitte zu füllen beginnen, werden die Anteile von Gelmedien mit niederem und hohem EEO-Wert geändert, um allmählich die Menge an Gel mit hohem EEO-Wert zu vermindern, und allmählich die Menge von Gel mit niederem EEO-Wert zu erhöhen, bis das Gel, welches die Oberseite der Blöcke 620 bilden soll, im allgemeinen insgesamt Gelmedium mit niederem EEO-Wert ist. Auf diese Weise ergibt sich ein Kontinuum oder sich allmählich ändernder Grad des EEO-Wertes vom Substrat bis zur Oberseite des Pufferblockes. So kann verstanden werden, daß die vorliegende Erfindung sowohl allmählich sich ändernde EEO-Werte (ein Kontinuum) sowie diskrete Schichten von verschiedenen EEO-Werten innerhalb der Endkappen (Pufferblöcke) ins Auge faßt.

Claims

1. Eine Elektrophoreseplatte der Art, welche ein Substrat (12), das in bezug auf elektrophoretische Abtrennung chemisch und elektrisch inent ist, und eine Basisschicht (18) eines elektrophoretischen Mediums (18) umfaßt, wobei das elektrophoretische Medium mindestens etwas Puffer umfaßt, mit Pufferblöcken (20), die aus einem auf der Basisschicht (18) aufgebrachten Gel bestehen, und Probenquellen, die auf der Basisschicht (18) zwischen den Pufferblöcken angeordnet sind, dadurch gekennzeichnet, daß jeder der Pufferblöcke (20) ein elektrophoretisches Medium mit, an die Basisschicht (18) angrenzend, einem elektroendosmotischen Potential umfaßt, das gleich oder kleiner als das eleklroendosmotische Potential der Basisschicht (18) ist, wobei die Pufferblöcke (20) vermindertes oder weiter vermindertes elektroendosmotisches Potential an einer Stelle in einer Richtung, die entweder abgewandt von der Basisschicht (18) oder abgewandt von den Probenquellen (33) ist, aufweisen.

2. Elektrophoreseplatte nach Anspruch 1, in der das elektroendosmotische Potential der Pufferblöcke (20) mindestens in zwei diskreten Intervallen in einer Richtung abgewandt von dem Substrat (12) abnimmt.

3. Elektrophoreseplatte nach Ansprnch 1, in der jeder der Pufferblöcke (20) ein Kontinuum elektrophoretischer Medien mit im allgemeinen abnehmendem elektroendosmotischen Potential in einer Richtung abgewandt von der Basisschicht umfaßt.

4. Eleklrophoreseplatte nach Anspruch 1, in der die Pufferblöcke (20) mehrere aufeinanderfolgend angeordnete laminierte Schichten (26,28) von elektrophoretischen Medien umfassen, wobei mindestens eine der laminierten Schichten ein niedrigeres elektroendosmotisches Potential als das elektroendosmotische Potential der Basisschicht aufweist.

5. Elektrophoreseplatte nach Anspruch 4, in der die Schicht (28), die am weitesten von der Basisschicht (18) angeordnet ist, ein niedrigeres elektroendosmotisches Potential als das elektroendosmotische Potential der Basisschicht (18) aufweist.

6. Elektrophoreseplatte nach Anspruch 4, in welcher der Pufferblock eine Zwischenschicht umfaßt, die ein elektroendosmotisches Potential aufweist, das zwischen dem elektroendosmotischen Potential der Basisschicht und der Schicht, die am entferntesten von der Basisschicht angeordnet ist, ist.

7. Elektrophoreseplatte nach Anspruch 4, in der die am weitesten von der Basisschicht (18) entfernte Schicht Polyacrylamid oder Agarose umfaßt.

8. Elektrophoreseplatte nach Anspruch 4, in der die Basisschicht (18) Polyacrylamid oder Agarose umfaßt.

9. Elektrophoreseplatte nach Anspruch 1, in der jeder der Pufferblöcke (20) beabstandete gegenüberliegende Seiten umfaßt, wobei die beabstandeten gegenüberliegenden Seiten derart schräg verlaufen, daß der Abstand zwischen den Pufferblöcken bei der Basisschicht abnimmt.

10. Elektrophoreseplatte nach Anspruch 4, in der benachbarte laminierte Schichten zusammenpassende Riffelungen (30) dazwischen umfassen.

11. Verfahren zur Herstellung einer Elektrophoreseplatte nach Anspruch 1, die ein Substrat (12) umfaßt, das in bezug auf elektrophoretische Abtrennung chemisch und elektrisch inert ist, umfassend die Schritte der Erzeugung einer Basisschicht (18) aus elektrophoretischem Medium auf dem Substrat, wobei das elektrophoretische Medium mindestens etwas Puffer umfaßt, die Erzeugung von Pufferblöcken bestehend aus einem Gel, das die Pufferblöcke (20) an die Basisschicht (18) binden und die Erzeugung von Probenquellen in der Basisschicht (18), dadurch gekennzeichnet, daß jeder der Pufferblöcke ein elektrophoretisches Medium umfaßt, das, an die Basisschicht angrenzend, ein elektroendosmotisches Potential aufweist, das gleich oder kleiner als das elektroendosmotische Potential des elektrophoretischen Mediums der Basisschicht ist, wobei die Pufferblöcke vermindertes oder weiter vermindertes elektroendosmotisches Potential an einer Stelle in einer Richtung aufweisen, die abgewandt von der Basisschicht oder abgewandt von den Probenquellen liegt.