EP2765854A2

EP2765854A2 - Vorrichtung und verfahren zur druck-kryokonservierung einer biologischen probe

Info

Publication number: EP2765854A2
Application number: EP12772885.5A
Authority: EP
Inventors: Günter R. FUHR; Heiko Zimmermann; Frank Stracke; Markus GRABENBAUER; Jan HÜBINGER; Philippe Bastiaens; Frank Wehner
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV; Fraunhofer Gesellschaft zur Foerderung der Angewandten Forschung eV
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV; Fraunhofer Gesellschaft zur Foerderung der Angewandten Forschung eV
Priority date: 2011-10-10
Filing date: 2012-10-10
Publication date: 2014-08-20
Also published as: WO2013053471A3; DE102011115467A1; US20140260346A1; WO2013053471A2

Abstract

Eine Kryokonservierungsvorrichtung (100), die zur Kryokonservierung einer biologischen Probe (1) eingerichtet ist, umfasst einen Druckbehälter (10) mit einer Behälterwand (11) und einem Innenraum (12), der zur Aufnahme der biologischen Probe (1) eingerichtet ist, wobei der Druckbehälter (10) für eine Abkühlung mit einer Absenkung der Temperatur und einer Erhöhung des Druckes im Druckbehälter (10) und für die Kryokonservierung der biologischen Probe (1) konfiguriert mit einer Stelleinrichtung (20) ausgestattet ist, die mit der Behälterwand (11) verbunden ist und mindestens ein Druckeinstellelement (21 - 23, 31) und mindestens eines von mindestens einem Kühlelement (34) und mindestens einem Wärmeleitelement (35 - 38) umfasst, wobei die Stelleinrichtung (20) für eine zeit- und/oder ortsabhängige Einstellung der Temperatur und des Druckes im Druckbehälter (10) konfiguriert ist. Es werden auch Verfahren zur Kryokonservierung einer biologischen Probe (1), umfassend biologische Zellen (2) und ein Konservierungsmedium (3), und Verfahren zur vitalitätserhaltenden Erwärmung der biologischen Probe (1) beschrieben.

Description

Vorrichtung und Verfahren zur Druck-Kryokonservierung

einer biologischen Probe

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Kryokonservierung einer biologischen Probe, umfassend biologische Zellen und ein wässriges Konservierungsmedium, mit einem Druckbehälter. Des Weiteren betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Kryokonservierung der biologischen Probe und die Verwendung einer Stabilisatorsubstanz, mit der eine glasartige Phase von Wasser stabilisierbar ist, bei der Kryokonservierung der biologischen Proben. Des Weiteren betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Erwärmung der kryokonservierten biologischen Probe .

Die Tieftemperaturkonservierung (Kryokonservierung) von Zellen ist bisher die einzige Möglichkeit, Lebensprozesse auf zellulärer Ebene reversibel (vitalitätserhaltend) so anzuhalten, dass sie nach einer Erwärmung auf physiologische Temperaturen wieder anlaufen können. Die Kryokonservierung findet keine Entsprechung in der Natur. Es werden zwar Organismen, wie z. B. Fische, in polaren Regionen im Eis eingebettet gefunden, die ihre Vitalität für eine begrenzte Dauer erhalten. Diese Organismen sind jedoch nicht vollständig durchgefroren, sondern enthalten in ihren Zellen Glycerin und andere gefrierpunktserniedrigende Stoffe, oder sie exprimieren Proteine (sog. Gefrierschutzproteine), welche die Eisstruktur be^¬ einflussen. Eine dauerhafte Konservierung ist in diesem Zu^¬ stand nicht möglich, da auch noch bei Temperaturen unter 0°C Diffusionsprozesse über Wochen und Monate zum Zerfall des biologischen Systems führen. Die dauerhafte Konservierung würde vielmehr eine Abkühlung z. B. auf eine Temperatur von flüssi^¬ gem Stickstoff erfordern, bei der auch die Flüssigkeit in den Zellen gefrieren würde. Dann aber können die Organismen nicht mehr reanimiert werden.

Ein besonderes Problem der Kryokonservierung ist die Kris- talleisbildung (kristalline Phase des Wassers) in und außerhalb der Zellen, die unmittelbar oder mittelbar zu irreversiblen Schädigungen führen. Da die Eisbildung einen der primären Gründe für die Zellschädigung darstellt, werden seit Jahrzehnten so genannte Kryoprotektiva (Gefrierschutzzusätze, Kryoadditiva) gesucht und den obligaten physiologischen Medien beigemengt. Kryoprotektiva umfassen typischerweise klei^¬ ne Moleküle, wie z. B. Dimethylsulfoxid (DMSO) , die in die Zellen eindringen, oder höhermolekulare Substanzen, wie z. B. Zucker, die im Medium außerhalb der Zellen oder an deren Oberfläche verbleiben. Kryoprotektiva sind häufig erst in ho^¬ hen, zum großen Teil unphysiologischen Konzentrationen (10% bis 50%) wirksam. Sie können daher nur bei niedrigeren als physiologischen Temperaturen (um 4°C) zugesetzt werden, müs^¬ sen schnell in die Zellen eindringen und nach dem Auftauen sofort ausgewaschen werden.

Bisherige Entwicklungen in der Kryokonservierung biologischer Proben sind darauf gerichtet, Kryoprotektiva durch physiolo^¬ gisch und osmotisch weniger problematische Substanzen zu er- setzen, ihre Konzentration zu verringern oder ganz ohne sie auszukommen. Im Ergebnis wurden, abgesehen von den Gefrier- schut zproteinen der Organismen selbst, seit der Entdeckung der Gefrierschutzeigenschaften des DMSO und Glycerins sowie einiger Zucker durch Polge und Lovelock nur wenige Stoffgrup- pen gefunden [1,2,3]. Bisher geht man davon aus, dass keine Kryokonservierung von Zellen ohne Zellstress und Zellrepara^¬ turprozesse mit Genexpressionen etc. nach dem Auftauen mög^¬ lich ist, da die Bildung der kristallinen Phase unter physiologischen Bedingungen nicht ganz vermieden werden kann. [1] Polge C, Smith AU, Parkes AS (1949), Nature 164: 666

[2] Lovelock JE (1954), Biochemical Journal 56 (2): 265-270 [3] Lovelock JE, Bishop MWH, 1959, Nature 183: 1394-1395

Der Erfolg der Kryokonservierung kann durch eine Vitalitätsrate (Überlebensrate), z. B. durch den Quotienten der Anzahl lebender Zellen nach und vor der Kryokonservierung, charakterisiert werden. Es ist bekannt, dass die Vitalitätsrate von der Zellart, dem Volumen und verschiedenen anderen, in der

Regel bereits empirisch optimierten Randbedingungen, abhängt. Aufgrund der Notwendigkeit einer schnellen Diffusion der Kry- oprotektiva in die Zellen und der geordneten Wärmeableitung nach außen, versagen die herkömmlichen Kryokonservierungsver- fahren bei makroskopischen Objekten, wie Geweben, Organen und ganzen Organismen bisher ohne Ausnahme. Vielmehr führt die herkömmliche Kryokonservierung unter Zusatz von Kryoprotek- tiva nur bei suspendierten Zellen und kleinsten Gewebestücken (< 0,5 mm³) zu praktikablen Vitalitätsraten. Stark wasserhal- tige Pflanzenzellen, sowie ein Vielzahl großer tierischer

Zellen, wie z. B. die Oozyten der Katzen und anderer Spezies, entziehen sich bisher einer Kryokonservierung vollständig. Andererseits werden mit kryokonservierten Krebszellen Vitalitätsraten von mehr als 90% erreicht.

Der Erfolg der Kryokonservierung hängt insbesondere von den physikalisch-biologischen Randbedingungen, z. B. den Eigenschaften des Wassers und denen der Kryoprotektiva, ab. Bisher wird angenommen, dass Kryoprotektiva durch Diffusion in alle Zellen gelangen müssen und die Wärme in kurzer Zeit (ms bis min) nach außen abgeführt werden muss, da nur von dort ge^¬ kühlt werden kann. Es wird ferner angenommen, dass diese Bedingungen aufgrund der Wärmeleitfähigkeit des auch in den Zellen dominierenden Wassers und der geringen Diffus- ionsgeschwindigkeit von Kryoprotektiva durch die Zellmembra^¬ nen nur bei sehr kleinen Objekten (Zellen suspendiert in einer Nährlösung und unter Zusatz von Gefrierschutzmitteln) erfüllt sind.

Um die Bildung der kristallinen Phase zu vermeiden, wurde in der Praxis versucht, biologische Proben durch schnelle Abkühlung in eine glasartige oder amorphe Phase (vitrifizierter Zustand) zu überführen, was jedoch selbst bei der Verwendung von Kryoprotektiva nur einen beschränkten Erfolg hatte. Allgemein galt daher bis zu einer Veröffentlichung von J. L. . Leunissen et al. [4] die Vorstellung, dass eine Vitrifizie- rung (Vitrifikation) zellulärer Zellsuspensionen ohne Zusätze aus physikalischen Gründen nicht erreichbar wäre.

[4] J. L. M. Leunissen und H. Yi (2009) Journal of Microsco- py, 235: 25-35

Von J. L. M. Leunissen et al. [4] wird für die Kryomikrosko- pie ein Verfahren beschrieben, das eine Vitrifizierung erwarten lässt: wird ein dünnwandiges Kupferröhrchen mit einem Durchmesser von < 1 mm mit einer Zellsuspension gefüllt, an den Enden durch Zusammenquetschen gasfrei geschlossen und anschließend in einer Kühlflüssigkeit, wie Propan, Stickstoff etc., eingefroren, so werden in Tieftemperaturkryoschnitten der Röhrchen ausgezeichnet erhaltene Zellstrukturen gefunden, die eine Vitrifizierung anzeigen. Werden die Tieftempera- turkryoproben erwärmt, zeigt sich jedoch, dass die Zellen den Kühlprozess nicht überlebt haben. Das von J. L. M. Leunissen et al. [4] beschriebene Verfahren ist für eine vitalitätser- haltende Erwärmung der Probe ungeeignet. Bisher wird daher angenommen, dass Verfahren für die Kryomikroskopie keine Revitalisierung durch Rückerwärmung erlauben. Es besteht angesichts der sich entwickelnden regenerativen Medizin und Biotechnologie sowie des Umweltschutzes und der Arterhaltung ein dringendes Interesse, die Nachteile der herkömmlichen Kryokonservierung zu vermindern oder zu überwin- den.

Die Aufgabe der Erfindung ist es, eine verbesserte Kryokon- servierungsvorrichtung bereitzustellen, mit der Nachteile herkömmlicher Techniken überwunden werden und die insbesondere eine Kryokonservierung mit einer erhöhten Vitalitätsrate und/oder von vergrößerten Probenvolumen ermöglicht. Die Aufgabe der Erfindung ist es des Weiteren, ein verbessertes Verfahren zur Kryokonservierung bereitzustellen, mit dem Nachteile herkömmlicher Techniken überwunden werden und das insbesondere erlaubt, beim Abkühlen und/oder Auftauen Verfahrensbedingungen so einzustellen, dass eine erhöhte Vitalitätsrate erzielt wird. Des Weiteren ist es eine Aufgabe der Erfindung, ein verbessertes Verfahren zur Erwärmung einer kryokonservierten biologischen Probe bereitzustellen, mit dem Nachteile herkömmlicher Techniken überwunden werden und das insbesondere erlaubt, eine vitalitätsbeschränkende Beeinflussung der biologischen Proben beim Übergang in einen aufgetauten Zustand zu unterdrücken. Diese Aufgaben werden durch Vorrichtungen und Verfahren mit den Merkmalen der unabhängigen Ansprüche gelöst. Vorteilhafte Ausführungsformen und Anwendungen der Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen. Gemäß einem ersten Gesichtspunkt der Erfindung wird eine

Kryokonservierungsvorrichtung bereitgestellt, die zur Kryokonservierung einer biologischen Probe eingerichtet ist. Die Kryokonservierungsvorrichtung umfasst einen Druckbehälter mit einer Behälterwand und einem Innenraum, der zur Aufnahme der biologischen Probe eingerichtet ist. Der Druckbehälter ist konfiguriert, in einem Kühlbad einer Kühlvorrichtung bis zu einer Kryokonservierungstemperatur, z. B. unterhalb von

- 138°C, abgekühlt zu werden. Des Weiteren ist der Druckbe- hälter konfiguriert, dass der Innenraum des Kühlbehälters mit einem Druck beaufschlagt werden kann, der höher als der umgebende Atmosphärendruck ist. Der Druckbehälter ist für die dauerhafte Kryokonservierung der biologischen Probe und Lage^¬ rung bei der Kryokonservierungstemperatur und unter Aufrecht- erhaltung des erhöhten Drucks im Druckbehälter eingerichtet.

Gemäß der Erfindung umfasst der Druckbehälter eine Stelleinrichtung, die für eine zeit- und/oder ortsabhängige Einstel^¬ lung der Temperatur und des Druckes im Druckbehälter einge- richtet ist. Die Stelleinrichtung ist mit der Behälterwand des Druckbehälters verbunden und geeignet, die Einstellung der Kryokonservierungstemperatur und des Druckes im Innenraum des Druckbehälters zeit- und/oder ortsabhängig zu beeinflus^¬ sen. Die Stelleinrichtung ist dazu eingerichtet, die Abküh- lung und/oder Erwärmung der biologischen Probe entsprechend einer vorbestimmten Temperatur-Zeitfunktion gezielt zu steuern. Des Weiteren ist die Stelleinrichtung geeignet, die Tem^¬ peraturverteilung im Druckbehälter zu beeinflussen. Des Weiteren ist die Stelleinrichtung geeignet, den Druck im Druck- behälter gemäß einer vorbestimmten Druck-Zeitfunktion zu steuern. Die Temperatur- und Druck-Zeitfunktionen können re^¬ lativ zueinander eingestellt werden. Beispielsweise ermöglicht die Stelleinrichtung, gezielt zuerst die biologische Probe abzukühlen und anschließend mit einem erhöhten Druck zu beaufschlagen, die Abkühlung und die Druckerhöhung gleichzeitig auszuführen oder zunächst den Druck zu erhöhen und an^¬ schließend die Kryokonservierungstemperatur einzustellen. Schließlich ist die Stelleinrichtung geeignet, die den Ort der Druckerzeugung im Druckbehälter zu steuern. Gemäß der Erfindung umfasst die Stelleinrichtung mindestens ein Druckeinstellelement, mindestens ein Kühlelement und/oder wenigstens ein Wärmeleitelement. Das Druckeinstellelement ist konfiguriert, die Druck-Zeitfunktion, einen Ort eines primä^¬ ren Druckeintrags und/oder die Höhe des Drucks einzustellen, mit dem der Innenraum des Druckbehälters beaufschlagt wird. Entsprechend sind das Kühlelement und/oder das Wärmeleitelement, ggf. in Verbindung mit der Wirkung der Kühlvorrichtung, eingerichtet, die Temperatur-Zeitfunktion, die räumliche Temperaturverteilung und die Kryokonservierungstemperatur zu steuern .

Die biologische Probe enthält biologische Zellen und ein wässriges Konservierungsmedium. Die biologischen Zellen umfassen einzelne Zellen, wie z. B. einzelne Stammzellen, Vorläuferzellen, Fibroblasten, Keimzellen, Zellgruppen, insbesondere aus den genannten Zelltypen, Gewebestücke oder Organe oder deren Teile. Die biologischen Zellen können sogar komplette Organismen, insbesondere von Kleinstlebewesen, wie Würmer oder Insekten, bilden. Das Konservierungsmedium umfasst ein wässriges physiologisches Medium (Nährmedium, Kultivierungsmedium) , wie es aus der Kultivierung biologischer Zellen bekannt ist.

Gemäß einem zweiten Gesichtspunkt der Erfindung wird ein Verfahren zur Kryokonservierung der biologischen Probe bereitge^¬ stellt, bei dem die biologische Probe in einem Druckbehälter angeordnet und der Druckbehälter in einer Kühlvorrichtung ab^¬ gekühlt wird, bis die biologische Probe in den kryokonser- vierten Zustand in einer zumindest teilweise glasartigen Phase überführt ist. Gemäß der Erfindung erfolgt eine zeit- und/oder ortsabhängige Einstellung der Temperatur und des Druckes im Druckbehälter unter Verwendung einer Stelleinrich- tung mit mindestens einem Druckeinstellelement, mindestens einem Kühlelement und/oder mindestens einem Wärmeleitelement. Vorzugsweise wird zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Kryokonservierung biologischer Proben die Kryo- konservierungsvorrichtung gemäß dem ersten Gesichtspunkt der Erfindung verwendet.

Gemäß einem dritten Gesichtspunkt der Erfindung wird ein Verfahren zur Erwärmung einer biologischen Probe, umfassend bio- logische Zellen und ein Konservierungsmedium in einem gefrorenen Zustand, die in einer glasartigen Phase in einem Druckbehälter angeordnet ist, bereitgestellt. Gemäß der Erfindung wird die Temperatur des Druckbehälters und der biologischen Probe erhöht und während der Temperaturerhöhung im Druckbe- hälter ein erhöhter Druck oberhalb des umgebenden Atmosphärendrucks aufrechterhalten. Vorzugsweise wird das Verfahren zur Erwärmung der biologischen Probe unter Verwendung der Kryokonservierungsvorrichtung gemäß dem ersten Gesichtspunkt der Erfindung ausgeführt.

Gemäß einem vierten Gesichtspunkt der Erfindung wird vorgeschlagen, mindestens eine Stabilisatorsubstanz (d. h. eine einzelne Substanz oder eine Mischung von mehreren Substanzen) bei der Kryokonservierung biologischer Proben als Bestandteil des Konservierungsmediums zu verwenden, die geeignet ist, bei der Erhöhung der Temperatur einer biologischen Probe, umfassend biologische Zellen und ein Konservierungsmedium, vorzugsweise bis zum Übergang in den flüssigen Zustand einen glasartigen Zustand der unterkühlten Schmelze ohne Kristalli- sation zu erhalten.

Die Erfindung basiert auf der Erkenntnis, dass beim Einfrieren wässriger Systeme die Bildung der kristallinen- Phase vermieden und stattdessen die glasartige Phase (amorphe Phase) erzeugt werden kann, indem das wässrige System mit einem Druck beaufschlagt wird. Die Überführung der biologischen Probe in den kryokonservierten Zustand, die Kryokonservierung und/oder die Erwärmung der kryokonservierten Proben erfolgen in einem Bereich des Phasendiagramms des wässrigen Systems, in dem die glasartige Phase bevorzugt gebildet wird. Da die Überlebensrate der biologischen Zellen in der biologischen Probe in der glasartigen Phase erheblich höher als in der kristallinen Phase ist, ermöglicht die Erfindung eine erhöhte Vitalitätsrate der Kryokonservierung.

Bei der herkömmlichen Kryomikroskopie unter Verwendung von druckfesten Probenröhrchen (siehe oben, [4]) wurde im geschlossenen Probenröhrchen bereits ein erhöhter Druck erzeugt. Bei der herkömmlichen Technik besteht jedoch kein Freiheitsgrad, den Druck- oder Temperaturverlauf beim Einfrieren, während der Kryokonservierung oder beim Erwärmen gezielt entsprechend vorgegebenen Zeitfunktionen zu beeinflussen. Die Erfinder haben festgestellt, dass insbesondere beim Auftauen unweigerlich das beim raschen Abkühlen vermiedene Eis mit all seinen negativen Wirkungen auf die Probe entsteht, wodurch die Zellen abgetötet werden. Vorteilhafterweise wird mit der erfindungsgemäßen Bereitstellung der Stelleinrichtung ermöglicht, dass die Druck-Temperatur-Verläufe zeitlich und/oder räumlich so gesteuert werden, dass im Innenraum des Druckbehälters vorrangig die glasartige Phase der biologischen Probe erzeugt und aufrechterhalten wird. Im Unterschied zur herkömmlichen Technik ermöglicht die Stelleinrichtung, Druck- und Temperaturparameter beim Einfrieren und/oder Auftauen gezielt zu variieren, um eine maximale Vitalitätsrate zu erzielen. Vorteilhafterweise wird damit erfindungsgemäß eine echte Kryokonservierung mit der Möglichkeit des Wiederauftauens und der Revitalisierung der Zellen in der biologischen Probe bereitgestellt, während die Technik von J. L. M. Leunissen et al. [4] lediglich eine Kryopräpara tion für mikroskopische Untersuchungen darstellt.

Gemäß dem o. g. dritten Gesichtspunkt der Erfindung wird ins besondere vorgeschlagen, den glasartigen Zustand der Probe, insbesondere des Konservierungsmediums unter Erhaltung des Druckes bis zum Schmelzen des in der Probe enthaltenen Wassers zu erhalten. Vorteilhafterweise wird damit ermöglicht, kryokonservierte biologische Proben, wie z. B. die von J. L. . Leunissen et al. [4] beschriebenen, in extrem guter Struk turerhaltung und vitrifiziert vorliegenden Zellsuspensionen, wieder so aufzutauen, dass lebende Zellen vorhanden sind. Dies ist bisher noch bei keinem Gefrier-Druckschockverfahren wie es für die Kryomikroskopie eingesetzt wird, gelungen. Um die genannte Stabilisierung zu erreichen, wird dem Konservie rungsmedium vorzugsweise mindestens eine Stabilisatorsubstanz, die geeignet ist, bei der Erhöhung der Temperatur der biologischen Probe, vorzugsweise bis zur Schmelze, die glasartige Phase der unterkühlten Schmelze zu stabilisieren. Die erfindungsgemäße Kryokonservierungsvorrichtung ermöglicht vorteilhafterweise eine Beeinflussung des Weges der Probenbe dingungen durch das Phasendiagramm vorbei am Fest-Flüssig- Phasenübergang . Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst die Stelleinrichtung mindestens ein Druckeinstellelement, das mit der Behälterwand und/oder dem Innenraum des Druckbehälters verbunden ist. Vorteilhafterweise sind verschiedene Varianten des Druckeinstellelements möglich, die in Abhängig- keit von der Konservierungsaufgabe und den räumlichen Bedingungen der Kryokonservierung einzeln oder in Kombination gewählt werden können. Gemäß einer ersten Variante kann in der Behälterwand des Druckbehälters mindestens eine Druckschraube vorgesehen sein. Die Behälterwand enthält eine Gewindeöffnung zur flüssigkeitsdichten Aufnahme der Druckschraube. Durch ein Einschrauben der Druckschraube in die Gewindeöffnung kann das freie Volumen des Innenraums im Druckbehälter verringert und entsprechend der Druck im Druckbehälter erhöht werden. Gemäß einer zweiten Variante kann ein Expansionsbereich vorgesehen sein, der mit dem Innenraum des Druckbehälters in Verbindung steht und zur Aufnahme eines flüssigen oder gasförmigen Expansionsmediums eingerichtet ist. Wenn sich das Expansionsmedium im Expansionsbereich ausdehnt, wird entsprechend das freie Volumen im Innenraum verringert und der Druck im Druckbehälter erhöht. Gemäß einer dritten Variante kann das Druckeinstellelement eine Druckklammer umfassen, die von außen auf die Behälterwand wirkt. In diesem Fall ist die Behälterwand aus einem biegsamen Material gebildet, um den von der Druck- klammer ausgeübten mechanischen Druck auf den Innenraum des Druckbehälters zu übertragen. Vorteilhafterweise kann die Druckklammer mit Kühlöffnungen ausgestattet sein, um die Abkühlung des Druckbehälters im Kühlbad der Kühlvorrichtung zu beschleunigen. Des Weiteren kann die Druckklammer für eine mechanische oder elektrische Betätigung ausgelegt sein.

Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst der Expansionsbereich mindestens eine Hohlleitung zur Aufnahme des Expansionsmediums, die mit dem Innen- räum des Druckbehälters kommuniziert und die vom Druckbehälter absteht. Die Hohlleitung enthält z. B. Wasser, eine wäss- rige Lösung oder Teile der biologischen Probe. Durch das Abstehen der Hohlleitung vom Druckbehälter wird das Expansionsmedium in der Hohlleitung räumlich vom Innenraum des Druckbe- hälters getrennt. Dies ermöglicht vorteilhafterweise eine Abkühlung der Hohlleitung im Kühlbad der Kühlvorrichtung, während sich der übrige Druckbehälter noch auf erhöhter Temperatur, z. B. bei Raumtemperatur befindet. In der Hohlleitung kann kristallines Eis erzeugt werden, welches sich hin zum Innenraum ausdehnt, dessen übriges Volumen verringert und somit eine Erhöhung des Druckes im Innenraum bewirkt. Gemäß einer bevorzugten Variante weist die Hohlleitung Verzweigungen auf. Vorteilhafterweise ermöglicht dies eine Vergrößerung des Volumens des Expansionsbereichs im Vergleich zu einer einzelnen, unverzweigten Hohlleitung. Gleichzeitig ermöglicht die verzweigte Hohlleitung eine Beeinflussung der Zeitfunktion der Druckerzeugung im Druckbehälter. Alternativ und zusätzlich können mehrere Hohlleitungen vorgesehen sein, die in verschiedenen Raumrichtungen vom Druckbehälter abstehen. Vorteilhafterweise ermöglicht dies eine Beeinflussung der Druckerzeugung in Abhängigkeit von der Orientierung des Druckbehälters relativ zum Kühlbad der Kühlvorrichtung. Wenn die erfindungsgemäß vorgesehene Stelleinrichtung ein

Kühlelement umfasst, so wird dieses vorzugsweise durch eine Kühlleitung gebildet, die im Druckbehälter angeordnet ist. Die Kühlleitung verläuft durch den Innenraum des Behälters. Sie ist dazu eingerichtet, mit einem Kühlmittel, wie z. B. mit flüssigem Stickstoff, durchströmt zu werden. Vorteilhafterweise ermöglicht die Kühlleitung eine Einstellung des Beginns und der Zeitfunktion der Temperaturabsenkung im Druckbehälter . Wenn die erfindungsgemäß vorgesehene Stelleinrichtung ein

Wärmeleitelement umfasst, so wird dieses vorzugsweise durch ein Außenprofil auf einer Außenseite des Druckbehälters, ein Innenprofil auf einer Innenseite des Druckbehälters und/oder Wärmeleitkörper im Inneren des Druckbehälters gebildet. Diese Varianten von Wärmeleitelementen ermöglichen, bei der Abkühlung des Druckbehälters den Wärmetransport vom Druckbehälter in das Kühlbad zu beschleunigen. Ein weiterer Vorteil der erfindungsgemäßen Kryokonservie- rungsvorrichtung besteht darin, dass der Druckbehälter mit einer Vielzahl geometrischer Formen herstellbar ist. Besonders bevorzugt sind Varianten der Erfindung, bei denen die Behälterwand des Druckbehälters die Gestalt eines Rohres, einer Kugel oder eines Zylinders, z. B. eines flachen Zylinders (Dose), aufweist. Ein rohrförmiger Druckbehälter kann gerade oder gekrümmt gebildet sein. In beiden Fällen kann jeweils die räumliche Verteilung der Temperatur- und Druckeinstellung im Druckbehälter durch dessen Gestalt beeinflusst werden.

Weitere vorteilhafte Merkmale der erfindungsgemäßen Kryokon- servierungsvorrichtung beziehen sich auf die Gestaltung des Innenraums des Druckbehälters. Gemäß einer Variante der Erfindung kann im Innenraum ein Innenbehälter vorgesehen sein, der zur Aufnahme der biologischen Probe eingerichtet ist. In diesem Fall ist die biologische Probe im Innenbehälter vom übrigen Volumen des Innenraums stofflich getrennt. Dies ermöglicht eine Beeinflussung der glasartigen Phase in der unmittelbaren Umgebung der biologischen Probe. Gemäß einer weiteren Variante kann im Innenraum ein Substrat angeordnet sein, das zur adhärenten Aufnahme biologischer Zellen, die Teil der biologischen Probe sind, eingerichtet ist. Das Substrat kann z. B. im Innenbehälter angeordnet sein. Als Substrat sind Substratmaterialien geeignet, die für adhärente Zellkulturen verwendet werden, wie z. B. Kunststoff oder Glas. Gemäß einer weiteren Variante kann eine Segmentierung des Innenraums in Innenraumabschnitte vorgesehen sein. Die Segmentierung ermöglicht vorteilhafterweise die gezielte Einstellung von verschiedenen Druck-Temperatur-Bedingungen in jedem der Innenraumabschnitte. Gemäß einer weiteren Variante kann im Innenraum eine Sensoreinrichtung angeordnet sein, die mindestens einen Temperatursensor und/oder mindestens einen Drucksensor umfasst. Die Sensoreinrichtung ermöglicht vor- teilhafterweise eine Messung der Temperatur und/oder des Dru ckes im Innenraum. In Abhängigkeit von dem mindestens einen Signal der Sensoreinrichtung kann die Kryokonservierung gesteuert werden. Schließlich kann mit einer weiteren Variante der Erfindung im Innenraum ein Substanzreservoir angeordnet sein, das zur Freigabe einer Substanz in den Innenraum einge richtet ist. Das Substanzreservoir umfasst z. B. Hohlkugeln, die unter der Wirkung eines erhöhten Druckes im Innenraum zerstört werden können, um eine Substanz freizusetzen. Die genannten Varianten der Innenraum-Gestaltung können einzeln oder in Kombination vorgesehen sein.

Gemäß einer weiteren, vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung kann die Behälterwand mit einer Optikeinheit ausgestattet sein. Die Optikeinheit umfasst eine abbildende Optik, die für eine optische Beobachtung des Innenraums des Druckbe hälters eingerichtet ist. Die Optikeinheit ermöglicht eine optische Überwachung des Zustands der biologischen Probe wäh rend der Kryokonservierung.

Vorteilhafterweise bestehen verschiedene Varianten der Druck und Temperatureinstellung im Druckbehälter, um auf verschiedenen Wegen im Druck-Temperatur-Zustandsdiagramm der biologi sehen Probe zu den gewünschten Kryokonservierungsbedingungen zu gelangen. Beispielsweise ist es gemäß einer ersten Varian te möglich, zuerst den Druck im Druckbehälter mit dem mindes tens einen Druckeinstellelement zu erhöhen und anschließend die Temperatur im Druckbehälter mit der Kühlvorrichtung abzu senken. Die Druckerhöhung und die Temperaturabsenkung erfolgen jeweils gemäß vorbestimmten, getrennten Zeitfunktionen. Gemäß einer zweiten Variante können die Erhöhung des Druckes und die Absenkung der Temperatur so eingestellt werden, dass sich die jeweiligen Zeitfunktionen überlappen, indem die Absenkung der Temperatur vor Erreichung des Enddruckes oder um gekehrt die Erhöhung des Druckes vor Erreichung der Kryokon- servierungstemperatur gestartet wird. Schließlich ist es gemäß einer weiteren Variante möglich, zunächst die Temperatur im Druckbehälter bis zur Kryokonservierungstemperatur abzu- senken und anschließend den Druck im Druckbehälter zu erhöhen. Welche der genannten Varianten gewählt wird, hängt von den Bedingungen der konkreten Kryokonservierungsaufgäbe , insbesondere vom Aufbau der Kryokonservierungsvorrichtung und der Zusammensetzung der biologischen Probe, ab. Die optimale Variante kann empirisch durch Tests ausgewählt werden, bei denen unter den konkreten Anwendungsbedingungen die Vitalitätsrate der biologischen Probe für die verschiedenen Varianten getestet wird. In gleicher Weise ist es möglich, die Druck- und Temperatur-Zeitfunktionen, insbesondere in Bezug auf die Geschwindigkeit der Druckerhöhung und der Temperaturabsenkung und/oder die Gestalt der Funktion, wie z. B. eine Stufenform, zu wählen.

Wenn das Druckeinstellelement gemäß einer bevorzugten Ausfüh- rungsform der Erfindung einen Expansionsbereich in Gestalt einer vom Druckbehälter abstehenden Hohlleitung umfasst, wird die Druck-Temperatur-Einstellung vereinfacht. Der Druck kann im Druckbehälter erhöht werden, indem zuerst die mindestens eine Hohlleitung in das Kühlbad der Kühlvorrichtung getaucht wird. Ein Expansionsmedium in der mindestens einen Hohlleitung dehnt sich aus, so dass der Druck im übrigen Druckbehälter ansteigt. Anschließend wird auch der übrige Druckbehälter in das Kühlbad der Kühlvorrichtung getaucht, um so für die biologische Probe im Innenraum des Druckbehälters die Kryo- konservierungstemperatur einzustellen.

Vorzugsweise ist eine dauerhafte Lagerung der biologischen Probe unter Aufrechterhaltung des erhöhten Druckes, insbesondere in flüssigem Stickstoff oder im Dampf des flüssigen Stickstoffs vorgesehen. Besonders bevorzugt erfolgt die Lagerung der Probe im Druckbehälter.

Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens zur Kryokonservierung enthält das Konservierungsmedium mindestens eine Stabilisatorsubstanz, die geeignet ist, bei der Erhöhung der Temperatur der biologischen Probe, vorzugsweise bis zu dem Übergang in den flüssigen Zustand, die glasartige Phase der unterkühlten Schmelze zu stabilisieren (erhalten) . Vorteilhafterweise bewirkt die Stabilisatorsubstanz, dass die glasartige Phase bis zu höheren Temperaturen erhalten bleibt, als dies ohne die Stabilisatorsubstanz der Fall wäre. Die glasartige Phase wird beim Auftauen länger aufrecht erhalten, und die Bildung der kristallinen Phase wird vermieden. Des Weiteren ist die Glasübergangstemperatur des Konservierungsmedium durch die Stabilisatorsubstanz erhöht. Die Stabilisatorsubstanz ergibt eine verringerte Zahl von Nuklea- tionskeimen im Konservierungsmedium, so dass die Nukleations- wahrscheinlichkeit verringert und die Eisbildung beim Auftauen minimiert wird.

Gemäß dieser Ausführungsform werden die obigen Aufgaben gelöst, in dem der biologische Probe, z. B. einer Zellsuspension, die mindestens eine Stabilisatorsubstanz zugesetzt wird. Es wird die mindestens eine Stabilisatorsubstanz verwendet, wie sie für die herkömmliche Kryokonservierung nur bedingt oder gar nicht angewendet wurde bzw. erfindungsgemäß ihre Wirkung bei viel geringeren Konzentrationen entfaltet und diese eine andere ist, als die der bekannten Kryoprotektiva . Als Stabilisatorsubstanz werden vorzugsweise Stoffe gewählt, die bei Normaldruck nicht in die Zellen eindringen und daher normalerweise keine Anwendung in der herkömmlichen Kryokonservierung von Zellen und Geweben finden. Das Bemerkenswerte an der Verwendung der Stabilisatorsubstanz ist, dass Experi- mente der Erfinder zeigten, dass bei einem Zusatz von z. B. von Percoll bzw. Ficoll im Bereich von wenigen Prozent Säugerzellen, die Druckschockgefrier- und Auftauprozedur analog zu Publikation [4] mit hoher Überlebensrate (> 97%) überstan^¬ den. Dies ist umso erstaunlicher, da nicht von einem Eindrin^¬ gen in die Zellen auszugehen ist.

Die überraschende Wirkung der Stabilisatorsubstanz ist, dass sie erstmalig beim Auftauen der Probe den Rückweg über die Kombination hoher Druck/schnelles Tiefkühlen und Druckgesteuerte Erwärmung bei nahezu unbeeinflusster Vitalität der Zellen erlaubt. Es ist also die Kombination mindestens einer, im Konservierungsmedium gelösten Substanz, die über die Beeinflussung der Wasserstruktur und des Vorhandenseins von Nu- kleationskeimen die Rückkehr aus dem vitrifizierten Bereich erlaubt .

Die Stabilisatorsubstanz unterscheidet sich stofflich, in ih^¬ rer Wirkung und/oder in Bezug auf die bevorzugt gewählte Konzentration von den herkömmlichen Kryoprotektiva. Im Unterschied zur Stabilisatorsubstanz wird durch herkömmliche

Kryoprotektiva die Zahl der Nukleationskeime gezielt erhöht, um die Bildung einer möglichst großen Anzahl von Eiskristallen beim Einfrieren zu fördern. Mit der Anzahl von Eiskris^¬ tallen verringert sich aber auch deren Chance auf Größen^¬ wachstum, so dass durch herkömmliche Kryoprotektiva große Kristalle verhindert werden. Hierzu wird bei herkömmlichen Kryoprotektiva eine Verteilung und hohe Beweglichkeit im Kon^¬ servierungsmedium bis in die Zellen gewünscht.

Vorzugsweise ist die Stabilisatorsubstanz aus mindestens ei^¬ ner der Substanzgruppen ausgewählt, die langkettige ungeladene Polymere mit einem Molekulargewicht größer als 500 g/mol, insbesondere größer als 1000 g/mol, Monosaccharide, Di- und Oligosaccharide, Polysaccharide, Stärke-Derivate, wie z. B. Stärke-Hydrolyse-Produkte, Zuckeralkohole, wasserlösliche Polymere, Kolloide (Nanopartikeldispersionen) , insbesondere mit Silber-, Gold, Diamant- und/oder Nanotube-Partikeln, Dendri- mere, Polykationen, und Polyanionen umfassen. Als besonders geeignet erwiesen sich langkettige Polysaccharide, insbeson^¬ dere aus Saccharose und Epichlorhydrin hergestellte hydrophi^¬ le Copolymerisate (Ficoll, reg. Name), und/oder Polivinylpyr- rolidone, insbesondere mit Polyvinylpyrrolidon beschichtetes Kieselgel (Percoll, reg. Name), mit einer molekularen Masse zwischen 2.000 und mehreren Mio. g/mol, Nanopartikeldispersi^¬ onen, insbesondere Silber-, Gold, Diamant- und/oder Nanotube- Partikel, sind besonders vorteilhaft, da sie geeignet sind, die Wärmeleitfähigkeit des Konservierungsmediums zu verrin- gern. Vorteilhafterweise ist die Stabilisatorsubstanz biokompatibel, so dass die Zellen in der biologischen Probe durch die Stabilisatorsubstanz nicht ungünstig beeinflusst werden.

Die Konzentration (% = vol.%) der Stabilisatorsubstanz vor- zugsweise geringer als 30 %, besonders bevorzugt geringer als 20 %, insbesondere geringer als 10 %, wie z. B. geringer als 3 % oder geringer als 1 % ist. Eine bevorzugte Mindestkonzentration ist 0,1 %. Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfin^¬ dung ist die Stabilisatorsubstanz im Konservierungsmedium außerhalb der biologischen Zellen angeordnet. Die Zellen bleiben frei von der Stabilisatorsubstanz, was Vorteile für die Vitalität nach dem Auftauen der Probe hat.

Ein weiterer Vorteil der Stabilisatorsubstanz kann darin be^¬ stehen, dass diese unter der Wirkung des erhöhten Druckes und der verringerten Temperatur bei der Kryokonservierung ihre Eigenschaften, insbesondere Struktur und/oder Molekularge- wicht ändert. Beispielsweise können Moleküle der Stabilisatorsubstanz in Bruchstücke zerlegt werden, so dass sie in das Innere der Zellen eindiffundieren können, um dort eine zusätzliche kryoprotektive Wirkung zu erzielen.

Es wird betont, dass bei Zusatz der Stabilisatorsubstanz zum Konservierungsmedium es nicht notwendig ist, dass im Druckbe^¬ hälter ein erhöhter Druck aufrecht erhalten wird, bis die biologische Probe den Übergang von der unterkühlten Schmelze zum flüssigen Zustand erreicht. In diesem Fall kann der Druck bereits vor Erreichen des Übergangs abfallen, insbesondere bis zum Atmosphärendruck reduziert werden.

Gemäß einer bevorzugten Variante des o. g. dritten Gesichtspunkts der Erfindung wird somit ein Verfahren zur Erwärmung einer biologischen Probe, umfassend biologische Zellen und ein Konservierungsmedium in einem vitrifizierten Zustand, die mit einer glasartigen Phase in einem Druckbehälter angeordnet ist, bereitgestellt, wobei die Temperatur des Druckbehälters und der biologischen Probe erhöht wird, bis die biologische Probe einen den flüssigen Zustand erreicht, und wobei das Konservierungsmedium die mindestens eine Stabilisatorsubstanz enthält, die geeignet ist, bei der Erhöhung der Temperatur der biologischen Probe, vorzugsweise bis zu dem Übergang in den flüssigen Zustand, den glasartigen Zustand zu stabilisieren .

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird bei Erreichen des Übergangs vom glasartigen Zustand der un- terkühlten Schmelze hin zum flüssigen Zustand der Druck im Druckbehälter reduziert. Damit wird eine Schädigung der biologischen Probe nach Erreichen des flüssigen Zustands minimiert. Besonders bevorzugt wird der Druck im Druckbehälter instantan, d. h. insbesondere stufenförmig und mit vernachlässigbarer Verzögerung, reduziert.

Die Druckreduzierung kann erzielt werden, indem der Druckbe- hälter freigegeben, z. B. geöffnet, wird, so dass ein Druckausgleich mit einem äußeren atmosphärischen Druck erreicht wird. Vorteilhafterweise ist eine Freigabe des Druckbehälters jedoch nicht zwingend erforderlich. Vielmehr kann die Druckreduzierung auch durch eine Kontraktion der biologischen Pro- be am Übergang von der unterkühlten Schmelze zum flüssigen

Zustand erzeugt werden. Das Volumen der Probe kann sich entsprechend den unten unter Bezug auf die Figuren 1 bis 4 erläuterten Prozesse verringern, so dass der Druck im Druckbehälter abfällt.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung beträgt der erhöhte Druck oberhalb des Atmosphärendrucks mindestens 100 MPa, insbesondere mindestens 150 MPa und/oder höchstens 300 MPa, insbesondere höchstens 250 MPa. Diese Druckbereiche haben sich als besonders vorteilhaft für einen schnellen Übergang vom glasartigen Zustand zum flüssigen Zustand und umgekehrt erwiesen.

Weitere Einzelheiten und Vorteile der Erfindung werden im Folgenden unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen beschrieben. Es zeigen:

Figuren 1 bis 4: Phasendiagramme mit Illustrationen verschiedener Phasen von Wasser, und

Figur 5: Ausführungsformen der erfindungsgemäßen

KryokonservierungsVorrichtung; Figur 6: grafische Darstellungen verschiedener Varianten der Druck- und Temperatur- Zeitfunktionen; Figuren 7 bis 11: experimentelle Ergebnisse, welche die

Wirkung eines Kryoprotektivums oder einer Stabilisatorsubstanz illustrieren; Figur 12: schematische Schnittdarstellungen verschiedener Varianten eines Druckbehälters, der mit Wärmeleit- und/oder Kühlelementen ausgestattet ist;

Figuren 13 bis 19: weitere Ausführungsformen erfindungsgemäßer Kryokonservierungsvorrichtungen und deren Verwendung;

Figuren 20 bis 28: weitere Ausführungsformen erfindungsgemäßer Kryokonservierungsvorrichtungen, bei denen der Druckbehälter die Gestalt eines flachen Zylinders aufweist;

Figur 29: eine schematische Illustration einer Optikeinheit in der Behälterwand eines Druckbehälters ;

Figur 30: eine weitere Ausführungsform der erfindungsgemäßen KryokonservierungsVorrichtung und deren Verwendung;

Figuren 31 bis 35: weitere Ausführungsformen erfindungsgemä^¬ ßer Kryokonservierungsvorrichtungen, bei denen der Druckbehälter die Gestalt einer Kugel oder eines Zylinders aufweist; Figur 36: eine weitere Ausführungsform der erfin- dungsgemäßen Kryokonservierungsvorrich- tung;

Figuren 37 bis 39: weitere Ausführungsformen erfindungsgemäßer Kryokonservierungsvorrichtungen, bei denen im Innenraum des Druckbehälters ein Substrat angeordnet ist;

Figuren 40 und 41: weitere Ausführungsformen erfindungsgemäßer Kryokonservierungsvorrichtungen mit einer Segmentierung des Druckbehälter- Innenraums; und

Figur 42: eine weitere Ausführungsform der erfin- dungsgemäßen Kryokonservierungsvorrich- tung und deren Verwendung. Die Erfindung wird im Folgenden zunächst durch eine Erläute^¬ rung von Erkenntnissen der Erfinder und anschließend durch die Angabe von Einzelheiten der Kryokonservierungsvorrichtung und der Verfahrensführung beschrieben. Es wird betont, dass die folgenden theoretischen Betrachtungen als Ansatz zur Er- klärung der hervorragenden Vitalitätsraten dienen, die mit der erfindungsgemäßen Kryokonservierung erzielt wurden. Die Ausführung der Erfindung ist jedoch nicht an die Vollständigkeit und Richtigkeit der theoretischen Betrachtungen gebunden . Theoretische Betrachtungen der Phasendiagramme wässriger Sys^¬ teme und der Wirkung von Stabilisatorsubstanzen

Die Kryokonservierung wird bisher empirisch und unter verein- fachenden Annahmen beschrieben. Der empirische Ansatz resul^¬ tiert aus der Komplexität der Zusammensetzung des Zytoplasmas der biologischen Zellen. Da das Zytoplasma Hunderte von Proteinen, Nukleotide und eine Vielzahl von Kohlenhydraten, Ionen zahlreicher Elemente, nanoskalige Systeme wie Membranen, Organellen und Strukturelemente, wie das Zytoskelett, und gebundenes Wasser an Oberflächen enthält, sind Phasendiagramme des Wassers nur beschränkt nutzbar. Dennoch wird hier zu Illustrationszwecken bei der Erläuterung der Erkenntnisse der Erfinder auf Phasendiagramme des Wassers Bezug genommen, die in den Figuren 1, 2 und 4 dargestellt sind.

Das Druck-Temperatur-Zustandsdiagramm des Wassers (Figur 1, Quelle: Jackson et al., J. Phys . Chem. (1997), zitiert in www.wikipedia.de, Stichwort Wasser) zeigt, dass bei Abkühlung unter Normaldruck (0,1 MPa = 0,0001 GPa, Linie auf der Ordi- natenachse) so genanntes Ih (hexagonales Eis) entsteht. Dieses nimmt gegenüber der flüssigen Phase ein größeres Volumen ein (ca. 1/10), was in umgrenzten Volumina zu mechanischen Spannungen (Druck) führt. Hinzu kommt bei der Eisbildung eine Entmischung von Vielkomponentenlösungen (Ionen und andere molekulare Bestandteile werden aufkonzentriert ) , die im Zyto^¬ plasma sonst nicht auftritt und daher vermieden werden sollte . Wie das Phasendiagramm der Figur 1 zeigt, existieren weitere Eisstrukturen, von denen man weiß, dass sie bei höherem Druck die genannte Volumenzunahme nicht aufweisen. Es handelt sich dann aber um Drücke (z. B. > 0.1 GPa), unter denen biologi^¬ sche Objekte im ungefrorenen Zustand zerstört werden würden. Figur 2 zeigt in erweiterten Zustandsdiagrammen des Wassers und seiner metastabilen Zustände, dass Möglichkeiten bestehen, die Eisbildung zu beeinflussen. Durch Zugabe von Stoffen kann der Gefrierpunkt z. B. stabil erniedrigt werden (kolli- gative Effekte) . Das ist das Prinzip, das Organismen in der Natur nutzen. Sie gefrieren so erst z. B. bei -10 °C oder 20° C. Des Weiteren kann unter bestimmten Bedingungen eine wässrige Lösung unterkühlt werden. Eis schmilzt bei reinem Wasser und Normaldruck bei 0°C, es gefriert aber nicht bei dieser Temperatur. Dafür ist eine Nukleation erforderlich. Bei so genannter homogener Nukleation ist das Gefrieren ein stochastischer Vorgang, der durch kleinste Störungen ausgelöst wird. In beiden Fällen erweitert sich der Bereich der flüssigen Phase bis hinunter zu -50° bis -70°C. Bei Betrachtung des Druckbereichs bis 300 MPa = 3.000 atm an (Figur 2, rechte Seite) , so ergibt sich:

1. Bis 200 MPa liegt sogenanntes LDL - (Low Density Liquid, unterkühlte Flüssigkeit) Wasser in seinen Aggre- gatszuständen vor, das all die bei Normaldruck auftretenden Anomalien aufweist.

2. Darüber entstehen HDL -(High Density Liquid) Zustände, die möglicherweise für die Kryokonservierung günstiger wären. Es handelt sich aber um unphysiologisch hohe Drücke (in der Tiefsee werden maximal 100 MPa erreicht) .

Bei den metastabilen Zuständen findet man bei einer Temperatur von etwa 136 K = -137 °C eine Grenztemperatur unterhalb der ein Glaszustand des Wassers auch bei physiologischen Drücken eingenommen werden könnte. Wasser erstarrt dann wie Glas, nämlich amorph, d.h. ohne Kristallbildung. Die Wassermoleküle bleiben dann an der Stelle, wo sie sich gerade befinden. Dies ist ein metastabiler Zustand. Ihn zu erreichen, ist der Wunschzustand, den man beim Tieffrieren biologischer Objekte anstrebt. Er wird als „Vitrifizierung" bezeichnet. Die Vitrifizierung setzt bei der raschen Fluktuation der Wassermoleküle eine sehr hohe Abkühlrate (>10⁶ °/s) voraus, die bei der Dimension einer Zelle (>10 μπι) bereits durch die begrenzte Wärmeleitfähigkeit des Wassers nicht mehr erreichbar ist (max. einige 10^4o/s). Mit zunehmender Größe der einzufrierenden Objekte wird der Kühlratenabstand immer dramatischer (viele Zehnerpotenzen) , so dass eine echte Vitrifizie- rung (Bildung einer glasartigen Phase ohne Zusätze) bisher nicht möglich ist.

Die Erfinder haben festgestellt, dass aufgrund der Anomalie des Wassers im LDL-Bereich der Gefrierpunkt allerdings auch über Druckerhöhung erniedrigt werden kann. Dieser Prozess kehrt sich exakt beim Übergang von LDL zu HDL um, so dass et^¬ wa 200 MPa die bevorzugte Druckobergrenze bilden, die für eine Gefrierpunktserniedrigung noch wirksam ist. Danach steigt der Gefrierpunkt, wie in jeder anderen Flüssigkeit normaler- weise, mit steigendem Druck wieder an.

Der Weg in die Vitrifizierung (glasartige Phase) ist bei die^¬ sem Druck der Kürzeste (vgl. Figur 2, rechtes Diagramm, ver^¬ tikale Linie in der Mitte bei 0,2 GPa) , nur noch etwas mehr als 100 Grad müssen rasch durchlaufen werden, weshalb man das Schockgefrieren anwendet. Ein seit langem bestehendes Paradoxon der Kryokonservierung ist, dass bei Druck-Schock- Gefrieren die Strukturen der Zellen am Besten erhalten sind, es aber nach dem Auftauen keine überlebenden Zellen mehr gibt. Andererseits ist bekannt, dass bei langsamer Abkühlung mit selbst mikroskopisch sichtbarer Eisdomänenbildung und Schädigung der Zellen (Membranleckagen) es zu Überlebensraten von über 90% kommen kann. Die Erfinder haben festgestellt, dass der Grund dafür vor allem im Auftauprozess zu suchen ist. Hier durchläuft man nochmals den kritischen Bereich von -137°C bis zum Schmelzpunkt (vielleicht -5 bis -15°C), so dass die beim Einfrieren vermiedene oder verringerte Ih- Eisbildung doch noch erfolgt. Selbst HD-Eis wandelt sich bei niedrigem Druck schnell in die LD-Eisform um. Hinzu kommt noch, dass entsprechend der thermischen Stöße (k*T) ab

-100°C mit steigender Temperatur die Wahrscheinlichkeit des Platzwechsels eines Wassermoleküls auch in der gefrorenen Phase relevant ist. Das führt zum so genannten „migratori- sehen Wachstum" großer Eiskristalle, da diese auf Kosten der kleineren an Größe gewinnen (aufgrund der Oberflächenspannungsdifferenzen) . Deshalb müssen Langzeitlagerungen unterhalb der Glasübergangstemperatur (-137°C) erfolgen. Doch es gibt noch einen weiteren Weg, die Vitrifizierung oder zumindest eine „Pseudo-Vitrifizierung" zu erreichen, in dem man Additiva zugibt, die zu sehr kleinen Eisdomänen führen. Ein wirklich physiologischer Weg ist auch das nicht, aber er wird seit langem beim Einfrieren benutzt und funktioniert auch bei Normaldruck.

Nun besteht prinzipiell noch die Möglichkeit, die Glasübergangstemperatur durch Additiva zu erhöhen. Durch Zugabe von Trehalose lässt sich z. B. die Glasübergangstemperatur bis nahe 0°C verschieben, was für biologische Objekte ideal wäre. Die dafür erforderlichen Konzentrationen der Trehalose liegen jedoch oberhalb jeder physiologischen Verträglichkeit für lebende Zellen. In der Gefrierpunktserniedrigung sind die Gewinne gering (Figur 3, Gefrierpunktserniedrigung und Ver- Schiebung der Glasübergangstemperatur durch Zugabe von Trehalose) , was nahezu für alle derartigen StoffZusätze gilt.

Figur 4 verdeutlicht nochmals, dass man im LD-Bereich beim Abkühlen und Auftauen jeweils einen kritischen Bereich, der in den Diagrammen als „no mans land" bezeichnet wird, durchlaufen muss. Gerade diesen Bereich zu erreichen oder eben die vollständige Vitrifizierung anzustreben, wäre aber die Lösung des Problems gewesen.

Gemäß einem praktischen Beispiel ist vorgesehen, eine biolo^¬ gische Probe in an sich bekannter Weise mit biologischen Zel^¬ len und einem Konservierungsmedium bei Raumtemperatur und un^¬ ter Atmosphärendruck vorzubereiten. Dem Konservierungsmedium wird mindestens eine Stabilisatorsubstanz vorzugsweise mit einer Konzentration kleiner oder gleich 5 % zugesetzt oder dies erfolgt während des Abkühlvorgangs oder auch erst im tiefkalten Zustand bzw. vor dem Auftauen. Es können aber auch höhere Konzentrationen vorgesehen sein.

Geeignete Stoffgruppen für die Stabilisatorsubstanz, insbesondere zur Verwendung mit den unten beschriebenen Ausfüh^¬ rungsformen der Kryokonservierungsvorrichtung und der Verfa ren zum Abkühlen oder zum Erwärmen biologischer Proben, sin

Stoffklasse Substanzbeispiele

Alkohole Ethylenglykol

Monosaccharide Glucose

Fructose

Mannose

Galaktose

Ribose

Xylose

Arabinose

sowie nicht natürl

vorkommende Zucker

Saccharose (Rohrzu-

Di- und Oligosaccharide cker ) Lactose (Milchzucker)

Maltose (Malzzucker)

Trehalose

Cellobiose

Polyether Polyethylenglycol

Molekülmasse 1000 bis

35.000

Polysaccha Cellulose

Hemicellulose

Amylose

Glycogen

Pektine

Dextrane (künstlich)

Alginate

Ficoll, insbesondere

mit einem

Molekulargewicht von

2500 g/mol

bis 2,5 Mio g/mol

Weitere Medien, mit denen unter Verwendung der unten beschriebenen Ausführungsformen der Kryokonservierungsvorrich- tung und der Verfahren zum Abkühlen oder zum Erwärmen biolo- gischer Proben hervorragende experimentelle Ergebnisse erzielt wurden, sind:

Dextran Kryomedium nach Kryomedium nach

Mazur Matsumura

30% Dextran Ethylen glycol 10% Ethylen glycol 20%

(3,23M) (6.5M)

Acetamide 10.7% e-poly-L-Lysine

(3,27M) 10%

Ficoll 70 24%

(3,5mM) Sucrose 10.9% Sucrose 25.7%

(0, 4M) (0.75M)

BSA & Glucose (low

concentrations )

325 mOsm 3.4 Osm 6.7 Osm

In Experimenten der Erfinder hat sich z. B. das Kryomedium nach Mazur mit einem Zusatz von Ethylenglykol und Dextran als vorteilhaft erwiesen.

Ausführungsformen der Kryokonservierungsvorrichtung und der Verfahren zum Abkühlen oder zum Erwärmen biologischer Proben

Die Figuren 5A bis 5C zeigen Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Kryokonservierungsvorrichtung 100, die einen Druckbehälter 10 und eine Stelleinrichtung 20 aufweist. Der Druckbehälter 10 weist eine Behälterwand 11 in Gestalt eines Rohres (Röhrchen) auf, dessen Inneres den Innenraum 12 des Druckbehälters 10 bildet. Die Stelleinrichtung 20 umfasst Druckeinstellelemente, die jeweils durch Druckschrauben 21 an den axialen Enden des Druckbehälters 10 gebildet werden. Eine dritte Druckschraube 21 kann radial abstehend an der Behälterwand 11 z. B. entlang der halben axialen Länge des Druckbehälters 10 vorgesehen sein (Figur 5B) .

Der Druckbehälter 10 hat vorzugsweise einen Außendurchmesser, der kleiner oder gleich 5 mm, besonders bevorzugt kleiner oder gleich 2 mm oder 1 mm, z. B. 0,5 mm beträgt. Die axiale Länge des Druckbehälters 10 ist z. B. im Bereich von 10 mm bis 20 cm gewählt. Die Dicke der Behälterwand 11 beträgt z. B. 1/4 bis 1/10 des Außendurchmessers des Druckbehälters. Die Behälterwand 11 ist z. B. aus Edelstahl, Aluminium, Gold oder Silber hergestellt. Alternativ können weitere Metalle oder Legierungen verwendet werden, die eine hohe Wärmeleitfähig- keit für eine schnelle Abkühlung im Innenraum 12 und eine Druckbeständigkeit für Drucke bis zu z. B. 200 MPa aufweisen. Des Weiteren kann der Druckbehälter aus einem Kunststoff oder einem Kompositmaterial, z. B. Kunststoff-Metall-Komposit , hergestellt sein.

Zur Aufnahme der Druckschrauben 21 weist der Druckbehälter 10 an seinen axialen Enden Innengewinde auf. Für die Aufnahme der radial abstehenden Druckschraube 21 (Figur 5B) ist die Behälterwand 11 mit einem Gewindeansatz versehen. Die Druckschrauben 21 können zusätzlich als Entlüftungsschraube verwendet werden. Abweichend von den Illustrationen der Figur 5 kann als Stelleinrichtung eine einzige Druckschraube 21 vorgesehen sein (siehe z. B. Figur 14A) .

Gemäß Figur 5C kann der Innenraum 12 des Druckbehälters 10 in einzelne Innenraumabschnitte 15 unterteilt sein. Die Segmentierung mit Innenraumabschnitten 15 hat sich als vorteilhaft für die Vitalitätsrate biologischer Zellen erwiesen, die in den mittleren Innenraumabschnitten 15 maximal ist.

Für die Kryokonservierung einer biologischen Probe 1, umfassend z. B. biologische Zellen 2 in einem Konservierungsmedium 3, wird die Probe 1 in den Innenraum 12 des Druckbehälters 10 gefüllt (siehe teilweise durchbrochene Ansicht der Behälterwand 11 in Figur 5A) . Das Konservierungsmedium enthält eine oder mehrere Stabilisatorsubstanzen, wie z. B. Dextran mit einer Konzentration von 30% gemischt mit 10% Ethylenglykol . Wenn der Innenraum 12 vollständig gefüllt ist, werden die Druckschrauben 21 so geschlossen, dass der Innenraum 12 blasenfrei ist. Um den Innenraum blasenfrei zu füllen, muss die Innenseite der Behälterwand 11 von der biologischen Probe 1 vollständig benetzt sein. Hierzu kann die Innenseite der Be^¬ hälterwand 11 hydrophil beschichtet sein. Des Weiteren er- folgt eine Entlüftung über eine der Druckschrauben 21. Durch Eindringen der Druckschrauben 21 kann bei Bedarf schon bei Raumtemperatur ein erhöhter Druck im Innraum 11 des Druckbehälters 10, z. B. im Bereich von 0,1 MPa bis 300 MPa einge- stellt werden. Die Höhe des Druckes kann durch Kalibrierungs^¬ tests oder unter Verwendung einer Sensoreinrichtung 16 (siehe unten) ermittelt werden. Optional kann in oder nach dieser Phase durch ein Zusammenquetschen der Behälterwand 11 die Segmentierung in Innenraumabschnitte 15 (Figur 5C) vorgesehen sein.

Zur Kryokonservierung der biologischen Proben wird die gefüllte Kryokonservierungseinrichtung 100 im Kühlbad einer Kühlvorrichtung (in Figur 5 nicht gezeigt, siehe z. B. Figur 13) abgekühlt. Hierzu wird der Druckbehälter vorzugsweise waagerecht in das Kühlbad eingetaucht, so dass die Abkühlung entlang der gesamten axialen Länge des Druckbehälters 10 im Wesentlichen gleichzeitig erfolgt. Das Kühlbad umfasst z. B. flüssiges Propan, flüssigen Stickstoff oder ein anderes ver- flüssigtes Gas.

Beim Eintauchen in das Kühlbad erfolgt zuerst eine Eisbildung an der Innenseite der Behälterwand 11. Da zuerst die kristalline Phase gebildet wird, erfolgt eine Expansion, die eine Druckerhöhung im Innenraum bis zu einem Enddruck von 200 MPa ergibt. Oberhalb dieses Druckes ist ein weiteres Eiswachstum ausgeschlossen, so dass der Rest der biologischen Probe 1 in einen glasartigen (vitrifizierten) Zustand übergeht oder zu^¬ mindest keine hexagonal kristalline Phase aufweist.

Wenn die Kryokonservierungsvorrichtung 100 im Kühlbad die Kryokonservierungstemperatur , z. B. -197 °C, erreicht hat, kann die weitere Kryokonservierung im Kühlbad oder in einem Lagerbehälter (nicht dargestellt) erfolgen, der durch flüssi- gen Stickstoff oder durch Dampf des flüssigen Stickstoffs auf eine Temperatur von z. B. -140 °C gekühlt ist.

Zur vitalitätserhaltenden Erwärmung der biologischen Probe 1 wird die Kryokonservierungsvorrichtung 100 in ein Heizbad

(Flüssigkeitsbad mit einer Temperatur oberhalb von 0 °C) , umfassend z. B. Wasser, Alkohol oder ein Öl, eingetaucht. Das Eintauchen erfolgt ebenfalls vorzugsweise waagerecht und mit hoher Geschwindigkeit, so dass der erhöhte Druck im Druckbe- hälter 10 so lange erhalten bleibt, bis das gebildete kristalline Eis schmilzt. Anschließend sinkt der Druck sprung^¬ haft auf z. B. 0,1 MPa ab.

Die Figuren 6A bis 6D zeigen vier typische Temperatur- und Druck-Zeitfunktionen, wie sie bei der Kryokonservierung (lin^¬ ker Teil der Kurven) oder bei dem Auftauen (rechter Teil der Kurven) mit der Kryokonservierungsvorrichtung 100 gemäß den hier erläuterten Ausführungsformen der Erfindung realisiert werden können. Figur 6A zeigt beispielsweise, wie beim Ein- frieren zunächst der Druck erhöht wird. Hierzu werden z. B. die Druckschrauben 21 gemäß Figur 5 verwendet. Erst nach Erreichen des Druckes von 200 MPa erfolgt die Absenkung der Temperatur durch das Eintauchen (Einwerfen) der Kryokonservierungsvorrichtung 100 in das Kühlbad. Beim Auftauen kann umgekehrt zunächst eine Druckentlastung und anschließend eine Erwärmung der biologischen Probe auf Raumtemperatur vorgese^¬ hen sein. Figur 6B zeigt die entgegengesetzte Variante, bei der bei der Kryokonservierung zunächst die Temperatur abgesenkt und anschließend der Druck aufgebaut wird. In diesem Fall werden die Druckschrauben 21 erst nach Erreichen der Kryokonservierungstemperatur von z. B. - 200 °C betätigt. Beim Auftauen kann eine Druckentlastung während des Tempera^¬ turanstiegs vorgesehen sein. Figur 6C zeigt eine kompliziertere Temperatur-Zeitfunktion, die in Abhängigkeit von den konkreten Konservierungsbedingungen gewählt werden kann. Mit der erfindungsgemäßen Kryokonservierungsvorrichtung 100 lässt sich auch ein Druck-Temperatur-Verlauf realisieren, wie er mit einer Kryokonservierungsvorrichtung ohne Stelleinrichtung gegeben wäre (Figur 6D) , wobei der Druckaufbau unmittelbar nach Unterschreiten des Gefrierpunkts durch die Bildung der kristallinen Phase von Eis in der biologischen Probe gestartet wird. Mit der erfindungsgemäß verwendeten Stelleinrichtung wird die Gestalt der Zeitfunktionen beeinflusst. Gemäß einer weiteren Variante einer Temperatur- und Druck- Zeitfunktion (nicht dargestellt) kann vorgesehen sein, dass während der gesamten Konservierungszeit durchgehend der erhöhte Druck eingestellt ist. Figur 7 zeigt eine Folge von Mikroskopbildern eines Ausschnitts der Probe 1 mit Zellen 2 bei Raumtemperatur, nachdem dem Konservierungsmedium 3 ein Kryoprotektivum zugesetzt wurde. Die Zeitangabe (in Sekunden, s) zeigt die Zeitabhängigkeit nach Zugabe der Stabilisatorsubstanz zu der Probe 1. Es wird deutlich, dass ein erheblicher Schrumpfungsprozess in einer kurzen Zeit erfolgt. Die Erfinder haben gefunden, dass diese Schrumpfung für das Erreichen hoher Vitalitätsraten von Vorteil sein kann. Die Figuren 8 und 9 verdeutlichen die dramatische Schrumpfung der Zellen (hier HeLa-Zellen) nahezu auf das osmotische Restvolumen, die für hohe Vitalitätsraten von Vorteil ist. Die runde Form der Zellen (Figuren 9A bis 9C, links oben) geht vollständig verloren (Figuren 9A bis 9C, rechts und unten) . Die Abnahme des Durchmessers der Zellen wurde mit einem In- vitrogen-Messsystem ermittelt (Diagramm in Figur 8), reflek^¬ tiert aber nicht vollständig das osmotische Schrumpfen, da der Anteil der Abweichung von der Kugelform nicht berücksich- tigt wird. Die Zellen schrumpfen folglich stärker als aus dem Diagrammzahlenwert hervorgeht.

Figur 10 zeigt die geschrumpften Zellen im elektronenmikro- skopischen Schnitt. Man erkennt die extrem starke Schrumpfung, die im Kryomedium mit einer der oben genannten Zusammensetzungen erreicht wird, so dass das Zellmembransystem stark gefaltet vorliegt. In Figur 11 sind die strukturellen Änderungen adhärenter Zellen (HeLa) gezeigt. Auch hier treten sehr schnell (nach Sekunden) die osmotischen Schrumpfungen auf .

Fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen mit einer unterschiedlichen Darstellung der Zellkerne und des Golgi- Apparates (hier nicht gezeigt) haben ergeben, dass das

Schrumpfen lediglich die Zytoplasmakomponenten verdichtet, nicht jedoch die Zellkerne und andere wichtige Zell- Organellen beeinflusst, was für das vitalitätserhaltende Einfrieren und Auftauen von großem Vorteil ist.

Figur 12 zeigt Varianten erfindungemäß vorgesehener ärme- leit- und/oder Kühlelemente. Zu Vergleichszwecken zeigt zunächst Figur 12A den kreisförmigen Querschnitt des rohrförmi- gen Druckbehälters 10 (siehe Figur 5) . Die Figuren 12B bis 121 zeigen Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Kryokon- servierungsvorrichtung in schematischer Schnittansicht des Druckbehälters 10, bei denen die Stelleinrichtung für eine Einstellung der Temperatur unter Verwendung von mindestens einem Wärmeleitelement oder mindestens einem Kühlelement ein- gerichtet ist. Gemäß Figur 12B umfassen Wärmeleitelemente Außenprofile 35, die auf einer Außenseite der Behälterwand 11 radial abstehend angeordnet sind. Die Außenprofile 35 beschleunigen die Abkühlung oder Erwärmung des Druckbehälters 10 beim Eintauchen in das Kühlbad oder das warme Flüssig- keitsbad. Gemäß Figur 12C sind Innenprofile 36 auf einer Innenseite der Behälterwand 11 angeordnet. Die Innenprofile 36 unterstützen ebenfalls den Wärmetransport von oder zu der biologischen Probe im Druckbehälter 10.

Die Figuren 12D bis 12G illustrieren einen Druckbehälter 10 mit einem sechseckigen, hexagonalen Querschnitt. Die Außenseite der Behälterwand 11 bildet das Außenprofil 35, das eine große Oberfläche für die Benetzung mit einem Kühlmittel oder einem Auftaumittel bietet und somit geeignet ist, die Temperatur-Zeitfunktion bei der Abkühlung oder beim Auftauen zu beeinflussen. Gemäß den Figuren 12E, 12F und 12G sind zusätzlich im Innenraum des Druckbehälters 10 Wärmeleitkörper 37 in Gestalt von Trennwänden (Figur 12E) , eingelegten Filamenten oder Kugeln (Figur 12F) oder kolloidalen Partikeln (Figur

12G) vorgesehen. Die kolloidalen Partikel 37 gemäß Figur 12G sind schematisch vergrößert dargestellt, können aber in der Praxis Dimensionen im Sub- ikrometer-Bereich aufweisen. Mit den Außenprofilen 35, Innenprofilen 36 und/oder Wärmeleitkör- pern 37 können vorteilhafterweise die Kühl- oder Auftaugeschwindigkeiten erhöht werden. Die Wärmeleitelemente sind vorzugsweise aus Silber oder Gold oder anderen Substanzen mit hoher Wärmeleitfähigkeit hergestellt. Gemäß weiteren Varianten kann die Wärmeleitung zwischen dem Innenraum 12 und der äußeren Umgebung des Druckbehälters 10 durch eine Beschich- tung der Behälterwand 11 auf deren Innen- und/oder Außenseite, z. B. mit Diamant oder anderen Substanzen mit hoher Wärmeleitung beeinflusst werden. Figur 12H zeigt eine Variante der Erfindung, bei der im Innenraum 12 des Druckbehälters 10 als Kühlelement eine Kühlleitung 34 verläuft. Die Kühlleitung 34 ist mit einem Kühlme^¬ dium-Reservoir verbunden und eingerichtet, von einem Kühlmedium, wie z. B. flüssigem Stickstoff oder einem Kühlgas, durchströmt zu werden. Alternativ kann eine Kühlleitung 34 benachbart zum Innenraum 12 verlaufen, wie schematisch in Figur 121 gezeigt ist. Figur 13 zeigt eine weiter Ausführungsform der erfindungsgemäßen Kryokonservierungsvorrichtung 100 (Figur 13A) und deren Verwendung bei der Abkühlung (Figur 13B) und dem Auftauen (Figur 13C) der biologischen Probe mit Zellen 2 im Konservierungsmedium 3. Bei dieser Ausführungsform der Erfindung ent- hält die Stelleinrichtung zur zeit- und/oder ortsabhängigen Einstellung der Temperatur und des Druckes im Druckbehälter 10 drei Druckeinstellelemente, umfassend Druckschrauben 21 und einen Expansionsbereich 22. Die Druckschrauben 21 sind zur Erzeugung des Druckes und/oder zur Entlüftung des Innen- räum 12 des Druckbehälters 10 vorgesehen (siehe Figur 5) . Der Expansionsbereich 22 umfasst eine radial vom Druckbehälter 10 abstehende Hohlleitung, die an einem Ende über eine Öffnung in der Behälterwand 12 mit dem Innenraum 12 des Druckbehälters 10 in Verbindung steht und deren entgegengesetztes, freies Ende geschlossen ist. Zwischen dem Innenraum 12 und dem Expansionsbereich 22 kann ein Filter 29 vorgesehen sein, um das Eindringen von biologischen Zellen in den Expansionsbereich 22 zu unterbinden. Der Expansionsbereich 22 ist z. B. aus dem selben Material hergestellt wie die Behälterwand 12 des Druckbehälters 10. Der Expansionsbereich 22 ist eingerichtet, ein flüssiges Ex^¬ pansionsmedium aufzunehmen, das sich bei Abkühlung ausdehnt. Das Expansionsmedium umfasst z. B. das wässrige Konservie- rungsmedium der biologischen Probe oder alternativ eine andere wässrige Flüssigkeit, die zur Bildung der kristallinen Phase von Wasser geeignet ist. Die Dimensionen (Länge, Innendurchmesser, Außendurchmesser) des Expansionsbereiches 22 können vom Anwender in Abhängigkeit von den konkreten Konservierungsbedingungen gewählt werden.

Der Expansionsbereich 22 erlaubt eine schnelle Bildung der kristallinen Phase, wenn die Temperatur des Expansionsbereiches 22 unter den Gefrierpunkt von Wasser gesenkt wird. Vorteilhafterweise kann die Abkühlung des Expansionsbereichs 22 zeitlich von der Abkühlung des übrigen Druckbehälters 10 entkoppelt werden, wie in Figur 13B illustriert ist. Für die Ab- kühlung ist eine schematisch gezeigte Kühlvorrichtung 200 mit einem Kühlbad 210 vorgesehen. Die Kühlvorrichtung 200 umfasst zum Beispiel ein Gefäß, in welches das Kühlbad 210, z. B. aus flüssigem Stickstoff, gefüllt und das mit einem Kühlmedium- Reservoir verbunden ist.

Zur Kryokonservierung der biologischen Probe 1 wird die Kryo- konservierungsvorrichtung 100 zunächst ausschließlich mit dem Expansionsbereich 22 in das Kühlbad 210 eingetaucht (Eintauchtiefe Dl) , während sich der übrige Druckbehälter noch außerhalb des Kühlbades befindet. In dieser Phase wird im Expansionsbereich 22 kristallines Eis gebildet, das sich ausdehnt, so dass im Innenraum 12 des Druckbehälters 10 der Druck steigt. Die Dauer der Druckerzeugung mit dem Expansionsbereich 22 wird z. B. im Bereich von Millisekunden, Sekun- den oder Minuten gewählt. Anschließend wird die Kryokonser- vierungsvorrichtung 100 vollständig in das Kühlbad 210 eingetaucht, so dass die gewünschte Kryokonservierungstemperatur von z. B. - 195,7 °C erreicht wird. Hierzu wird die Kryokon- servierungsvorrichtung 100 bis zu einer zweiten Eintauchtiefe D2 abgesenkt.

Die Erwärmung zur Wiedergewinnung der biologischen Probe erfolgt gemäß Figur 13C in umgekehrter Weise. Zum Aufrechterhalten des Druckes im Druckbehälter 10 wird zunächst der In- nenraum mit der biologischen Probe in ein Heizbad 310 einer Auftauvorrichtung 300 eingetaucht (Eintauchtiefe Dl) , während der Expansionsbereich 22 noch nicht abgekühlt wird. Nach dem Auftauen der biologischen Probe 1 im Druckbehälter 10 erfolgt die Absenkung bis zur Eintauchtiefe D2, so dass auch der Druck im Druckbehälter 10 reduziert wird.

Figur 14A illustriert eine Ausführungsform der erfindungsgemäßen Kryokonservierungsvorrichtung 100, bei der im Innenraum 12 des Druckbehälters 10 ein Innenbehälter 13 angeordnet ist. Der Innenbehälter 13 ist zur Aufnahme der biologischen Probe 1 vorgesehen und umfasst ein blasenfrei gefülltes Rohr aus einem biegsamen Material. Der Innenbehälter 13 ist z. B. aus dem gleichen Material hergestellt, wie die Behälterwand 12 des Druckbehälters 10. Die Bereitstellung des Innenbehälters 13 hat den Vorteil, dass die Bildung der kristallinen Phase auf der Innenseite der Behälterwand 12 von der biologischen Probe 1 getrennt wird. Des Weiteren können im Innenraum 12 außerhalb des Innenbehälters 13 einerseits und im Innenbehäl- ter 13 andererseits verschiedene Flüssigkeiten vorgesehen sein. Beispielsweise kann außerhalb des Innenbehälters 13 reines Wasser oder eine wässrige Zusammensetzung aus Wasser mit einem Salz, Glycerin und/oder einem Alkohol vorgesehen sein. Die wässrige Zusammensetzung hat den Vorteil einer Ge- frierpunktabsenkung, so dass eingestellt werden kann, bei welcher Temperatur unterhalb des Gefrierpunkts von reinem Wasser der Druck in dem Druckbehälter 10 erzeugt werden soll.

Der Innenbehälter 13 erstreckt sich nicht über die gesamte Länge des Innenraums 12. Dadurch wird am geschlossenen Ende 12.1 des Druckbehälters 10 ein relativ großer Raum geschaf^¬ fen, in dem sich keine biologische Probe 1 befindet und in dem bevorzugt die kristalline Phase von Wasser erzeugt werden kann. Damit wird innerhalb des Druckbehälters 10 ein Expansi- onsbereich als Teil der erfindungsgemäß verwendeten Stelleinrichtung geschaffen, der sich vorteilhaft auf die Abkühlung und auf die Erwärmung der Kryokonservierungsvorrichtung 100 auswirken kann (siehe insbesondere Figur 14C) .

Die Außenform des Innenbehälters 13 kann gleich der Innenform des Druckbehälters 10 sein. Alternativ zu der gezeigten zylindrischen Form können andere Querschnitte der Außen- und/oder Innenformen vorgesehen sein, wie z. B. quadratisch, hexagonal, oktagonal oder sämtliche Kombinationen davon. Es können insbesondere verschiedene Querschnittsformen der Außen- und Innenformen vorgesehen sein.

Figur 14B illustriert schematisch die Abkühlung der Kryokon- servierungsvorrichtung 100 in einer Kühlvorrichtung 200, die in diesem Fall zwei übereinander geschichtete Kühlbäder 210 mit flüssigem Stickstoff und 220 mit flüssigem Propan enthält. Die Verwendung von flüssigem Propan hat den Vorteil, dass dieses die Außenseite des Druckbehälters 10 leichter be- netzt und damit die Abkühlung beschleunigt.

Zur Erwärmung der biologischen Probe 1 im Druckbehälter 10 wird dieser gemäß Figur 14C in ein Heizbad 310 getaucht. Der Druckbehälter 10 kann so ausgerichtet sein, dass die gesamte Länge des Druckbehälters 10 gleichzeitig in das Heizbad 310 taucht (horizontale Ausrichtung) . In diesem Fall erfolgt zunächst eine Erhöhung der Temperatur der biologischen Probe 1 und, sobald das kristalline Eis aufgetaut ist, auch die Reduzierung des Druckes im Druckbehälter 10. Alternativ kann zu- erst das geschlossene Ende 12.1 mit dem Expansionsbereich in das Wasserbad 310 eingetaucht werden, so dass zuerst die kristalline Phase geschmolzen und der Druck im Druckbehälter 10 reduziert und anschließend die übrige biologische Probe 1 erwärmt wird (vertikale Ausrichtung des Druckbehälters 10) . Figur 15 illustriert schematisch, dass die Anwendung der erfindungsgemäßen Kryokonservierungsvorrichtung 100 nicht auf die Konservierung von Zellsuspensionen beschränkt ist. Viel- mehr kann die biologische Probe 1 Zellgruppen, Zellaggregate, Organe 4 biologischer Organismen oder komplette biologische Organismen 5, wie z. B. Nematoden, Würmer oder Arthropoden enthalten. Hierzu weist der Innenraum 12 des Druckbehälters 10 einen Innendurchmesser im Bereich von mindestens 5 mm, vorzugsweise mindestens 10 mm auf. Vorzugsweise ist der Innendurchmesser des Innenraums 11 geringer als 5 cm, besonders bevorzugt geringer als 3 cm. Wie in Figur 14 ist ein Innenbehälter 13 zur Aufnahme der biologischen Probe 1 vorgesehen, der optional in einzelne Kammern unterteilt sein kann.

Die Kryokonservierung der biologischen Probe 1 erfolgt auch bei der Ausführungsform gemäß Figur 15, indem der Druckbehälter 10 in mindestens ein Flüssigkeitsbad der Kühlvorrichtung 200 eingetaucht wird. Gemäß Figur 15C erfolgt zuerst ein Ein- tauchen des Druckbehälters 10 mit horizontaler Ausrichtung zuerst in das Flüssigkeitsbad 220 aus flüssigem Propan und anschließend in das Flüssigkeitsbad 210 mit flüssigem Stickstoff. Mit der Wahl der Ausrichtung der Druckschraube 21 relativ zum Flüssigkeitsbad 220, 210, kann die Zeitfunktion der Druckerzeugung relativ zur Zeitfunktion der Abkühlung eingestellt werden. Die Erwärmung erfolgt gemäß Figur 15D entsprechend in umgekehrter Reihenfolge, indem zunächst der Druckbehälter 10 in ein Heizbad 310 eingetaucht wird, bis die biologische Probe 1 aufgetaut ist. Anschließend erfolgt die voll- ständige Absenkung der Kryokonservierungsvorrichtung 100 in das Heizbad 310.

Die Figuren 16 und 17 zeigen weitere Ausführungsformen der Kryokonservierungsvorrichtung 100, die mit einem Expansions- bereich 22 ausgestattet ist. Der Expansionsbereich 22 umfasst wie in Figur 13 eine Hohlleitung, die bei den illustrierten Varianten Verzweigungen aufweist. Gemäß Figur 16A weist der Expansionsbereich 22 eine T-Gestalt mit seitlichen Auslegern auf. Der Expansionsbereich 22 kann zuerst in das Kühlbad 210 getaucht werden (Eintauchtiefe Dl), so dass die Flüssigkeit in seinem Inneren gefriert, hexagonales Eis bildet und den Druck erhöht. Erst danach wird das System ganz versenkt (Eintauchtiefe D2) und vollständig tiefgekühlt (Figur 16B) . Beim Erwärmen verfährt man umgekehrt, oder man hat die Möglichkeit, in zwei Lagen (Ausleger zuerst in die warme Phase oder wie hier dargestellt zuletzt) in das Heizbad 310 zu tauchen (Figur 16C) . Nach letzterem Prinzip bleibt der Druck durch das vorhandene Eis bis zum Auftauen bei Werten von etwa 200 MPa erhalten.

Figur 17 zeigt eine weitere Ausführung des Expansionsbereiches 22 mit Verzweigungen, die ein gefächertes Auslegersystem bilden. Im Ergebnis werden ein größeres Innenvolumen und eine größere Oberfläche als zum Beispiel in Figur 16 bereitgestellt, so dass der Druck schneller erhöht werden kann.

Figur 18 zeigt Ausführungsformen der Kryokonservierungsvor- richtung 100 mit einem kugelförmigen Druckbehälter 10 und ei- nem mehrere, in verschiedene Raumachsen (Raumrichtungen) abstehende Hohlleitungen umfassenden Expansionsbereich 22. Der Druckbehälter 10 umfasst eine Hohlkugel zur Aufnahme der biologischen Probe. Die Hohlkugel ist z. B. aus Edelstahl herge^¬ stellt und weist einen Innendurchmesser von 10 mm und einen Außendurchmesser von 12 mm auf. Die Hohlleitungen bilden von der Hohlkugel abstehende Stichleitungen. Die Zahl, geometri^¬ sche Dimensionierung und Orientierung der Hohlleitungen kann in Abhängigkeit von den konkreten Anwendungsbedingungen ge^¬ wählt werden (siehe Beispiele in den Figuren 18A bis 18C) . Die Befüllung der Hohlkugel erfolgt durch eine verschließbare Öffnung (nicht dargestellt) in der Behälterwand oder durch eine der Hohlleitungen, die in diesem Fall mit einem Verschlusselement ausgestattet ist. Auch bei diesen Ausführungs- formen gestattet die geometrische Orientierung des Druckbe^¬ hälters 10 beim Eintauchen bis zu den Eintauchtiefen Dl und D2 in ein Kühlbad 210 (Figur 18D) oder in ein Heizbad 310 (Figur 18E) eine Einstellung, wann der Druck im Druckbehälter 10 ansteigen und abfallen soll.

Die Figuren 19A und 19B zeigen Ausführungsformen der Kryokon- servierungsvorrichtung 100, bei denen die Behälterwand 11 des Druckbehälters 10 die Gestalt eines gekrümmten Rohres mit einer Einfachkrümmung (Figur 19A) oder einer Mehrfachkrümmung (Figur 19B) aufweist. In beiden Fällen ist der Druckbehälter 10 in einer Krümmungsebene gekrümmt, so dass die örtliche Temperaturverteilung beim Eintauchen in ein Kühlbad in Abhängigkeit von der Ausrichtung des Druckbehälters 10 relativ zum Kühlbad eingestellt werden kann (siehe Figur 19C, 19D) . Figur 19A zeigt beispielhaft Varianten von Druckeinstellelementen, umfassend Druckschrauben 21 und einen Expansionsbereich 22, die einzeln oder wie dargestellt in Kombination vorgesehen sein können. Die Druckschrauben 21 sind gebildet, wie oben unter Bezug auf Figur 5 beschrieben ist. Der Expansionsbe- reich 22 umfasst eine Vielzahl von Hohlleitungen, die in der Krümmungsebene des Druckbehälters 10 und jeweils mit dem In^¬ nenraum des Druckbehälters 10 kommunizierend angeordnet sind. Die Druckeinstellelemente können auch bei der Variante gemäß Figur 19B vorgesehen sein. Die Mehrfachkrümmung gemäß Figur 19B kann eine Wellenform mit mehr als den gezeigten drei Ex- trema gebildet sein.

Die örtlichen Verteilungen und Zeitfunktionen der Druckerzeugung und der Temperaturabsenkung in der Kryokonservierungs- Vorrichtung 100 hängen von der Ausrichtung des Druckbehälters 10 beim Eintauchen in das Kühlbad 210 ab. Figur 19C zeigt beispielhaft ein Eintauchen mit der Krümmungsebene zum senkrecht oder parallel zur Oberfläche des Kühlbades 210. Mit der senkrechten Ausrichtung erfolgen die Druckerzeugung und die Temperaturabsenkung zuerst in den Extrema der Mehrfachkrümmung, die in das Kühlbad ragen. Mit der parallelen Ausrichtung hingegen erfolgen die Druckerzeugung und die Temperaturabsenkung im gesamten Druckbehälter 10 gleichzeitig. Abwei- chend von der Illustration kann ein Eintauchen mit anderen Ausrichtungen in die Flüssigkeiten vorgesehen sein, woraus eine erweiterte Variabilität der Einstellung der Druck- und Temperatur-Zeitfunktionen folgt. Die örtlichen Verteilungen und Zeitfunktionen der Druckreduzierung und der Temperaturerhöhung in der Kryokonservierungs- vorrichtung 100 hängen ebenfalls von der Ausrichtung des Druckbehälters 10 beim Eintauchen in ein Heizbad 310 ab (Figur 19D) .

Figur 20 zeigt eine Ausführungsform der Kryokonservierungs- vorrichtung 100, bei der die Behälterwand 11 des Druckbehäl^¬ ters 10 die Gestalt eines flachen oder scheibenförmigen Zy^¬ linders aufweist. Diese Ausführungsform der Erfindung hat den Vorteil, dass beim Eintauchen in ein Kühlbad eine relative große Fläche gekühlt wird. Daher wird auf der Innenseite des Behälterwand 11 eine dünne Schicht der kristallinen Phase ge^¬ bildet, die ausreicht, um den gewünschten Druck im Druckbe^¬ hälter 10 zu erzeugen, und gleichzeitig relativ viel Raum für die glasartige Phase lässt. Der Druckbehälter 10 gemäß Figur 20A hat einen Durchmesser von z. B. 1 cm bis 10 cm und Dicke von z. B. 1 mm bis 1 cm. Er ist z. B. aus Edelstahl, Aluminium, Gold oder Silber hergestellt. Gemäß Figur 20B umfasst die Stelleinrichtung zur zeit- und/oder ortsabhängigen Einstellung der Temperatur und des Druckes im Druckbehälter 10 eine Druckklammer 23. Die Druckklammer 23 umfasst zwei Klammerplatten 24, die über ein

Scharnier 25 (Achsenscharnier) verschwenkbar sind. Mit einer Klammerschraube 26 (Stellschraube) kann der Abstand zwischen den Klammerplatten 24 eingestellt werden. Die Druckklammer 23 ist geeignet, den Druckbehälter 10 mit einem im Vergleich zum Atmosphärendruck erhöhten Druck zu beaufschlagen, bevor die Kryokonservierungsvorrichtung 100 durch ein Tauchen in ein

Kühlbad (siehe Figur 24) abgekühlt wird. Des weiteren ermög^¬ licht die Druckklammer 23 vorteilhafterweise eine Stabilisie^¬ rung des Druckbehälters 10. Die Figuren 20C bis 20D zeigen Varianten des zylinderförmigen Druckbehälters 10, der mit einem verstärkten Umfangsbereich (perspektivische Schnittansicht in Figur 20C) und/oder einer beidseitig (Schnittansicht in Figur 20D) oder einseitig

(Schnittansicht in Figur 20E) elastisch deformierbaren Behäl- terwand 11 ausgestattet sein kann. Im letzteren Fall ist ein^¬ seitig eine stabile Bodenwand 11.3 vorgesehen.

Die Figuren 21 bis 24 zeigen weitere Varianten der Druckklammer 23, bei denen die Klammerplatten 24 mit Löchern 27 und auf ihren zum Druckbehälter 10 weisenden Innenseiten mit Profilen 28 ausgestattet sind, im geöffneten Zustand und im ge^¬ schlossenen Zustand (zusammengebauten Zustand) der Druckklam^¬ mer 23. Im geschlossenen Zustand der Druckklammer 23 wird über die Klammerplatten 24 mechanischer Druck auf die Behäl- terwand 11 des Druckbehälters 10 ausgeübt. Figur 23 zeigt ei^¬ ne Draufsicht auf die Druckklammer 23 mit einer der Klammer^¬ platten 24, dem Scharnier 25, der Klammerschraube 26 und den Löchern 27. Die Löcher 27 erlauben einen direkten Kontakt von einer Kühlflüssigkeit, z. B. von flüssigem Stickstoff oder Propanol, oder von eine Heizflüssigkeit, z. B. von Wasser, mit dem Druckbehälter 10 und somit eine Beschleunigung der Abkühlung oder Erwärmung des Druckbehälters 10. Die Profile 28 sind vorgesehen, um am Druckbehälter 10 lokal verschiedene Drucke zu erzeugen. Des Weiteren ist gezeigt, dass der zylinderförmige Druckbehälter 10 mit einem Entlüftungsstutzen 30 ausgestattet sein kann.

Figur 25 zeigt eine Variante der Erfindung, bei der die Kryo- konservierungsvorrichtung 100 nur einseitig in eine Flüssigkeit (Kühlbad 210 oder Heizbad) getaucht wird. Die Druckklammer 23 weist in diesem Fall nur auf der unteren, zur Flüssig- keit weisenden Klammerplatte 24 Löcher 27 auf. Dies ist be^¬ sonders vorteilhaft ,_. wenn adhärente Zellen auf der unteren Seite des Druckbehälters 10 wachsen oder die Zellen dorthin sedimentieren .

Figur 26 illustriert schematisch eine Variante der Erfindung, bei der die Entlüftung des Druckbehälters 10 und die mechani^¬ sche Druckerzeugung mit den Kammerplatten 24 mit elektrische Antriebselementen 32, 33 gesteuert werden. Diese Ausführungsform der Erfindung ist insbesondere für eine Automatisierung der Kryokonservierung von Vorteil.

Bei einer abgewandelten, in Figur 27 gezeigten Ausführungs^¬ form der Kryokonservierungsvorrichtung 100, bei der die Be^¬ hälterwand 11 des Druckbehälters 10 die Gestalt eines Zylin- ders aufweist, ist als Druckeinstellelement keine Klammer sondern eine Druckschraube 21 vorgesehen. Mit der Druck^¬ schraube 21 ist der Druck im Innenraum 12 des Druckbehälters 10 vor oder nach Beginn der Kühlung oder Erwärmung im Kühloder Heizbad (nicht dargestellt) vorgesehen. Im Innenraum 12 sind mehrere Innenbehälter 13 angeordnet, die jeweils gasfrei mit biologischen Proben, z. B. Zellsuspensionen gefüllt und z. B. stapeiförmig übereinander angeordnet sind. Die Wanddi^¬ cke der Innenbehälter 13 kann extrem dünn gewählt werden, z. B. geringer als 400 μπι, da sie keinem Druck oder entsprechen^¬ den mechanischen Kräften ausgesetzt werden.

Gemäß Figur 27 ist im Innenraum 12 des Druckbehälters 10 eine Sensoreinrichtung, umfassend einen Drucksensor 16.1, angeord- net. Der Drucksensor 16.1 liefert ein Sensorsignal, das zur Steuerung des Druckes unter Verwendung der Druckschraube 21, ggf. mit einem elektrischen Steuerelement (z. B. Piezoele- ment, nicht dargestellt) verwendet werden kann. Es kann ein vorbestimmter Außendruck erzeugt werden, der im Innenraum 12 auf die Innenbehälter 13 beim Einfrieren und Auftauen wirkt.

Eine abgewandelte Variante des Druckbehälters 10 mit Druckschraube 21 ist in Figur 28 gezeigt. In diesem Fall wird der Innenbehälter 13 durch einen flexiblen Beutel gebildet, der die biologische Probe, z. B. eine Zellsuspension oder eine

Blutprobe, aufnimmt. Der Innenbehälter 13 umfasst z. B. einen Blutbeutel, wie er für Blutspendezwecke verwendet wird.

Figur 29 illustriert schematisch einen vergrößerten Aus- schnitt der Behälterwand 11 eines Druckbehälters 10. Die Behälterwand 11 enthält eine Optikeinheit 60, die für eine optische, insbesondere mikroskopische Beobachtung des Innenraums 12 des Druckbehälters 10 eingerichtet ist. Es ist z. B. möglich, dass Zellen 2 auf einer optischen Linse 61 adhärent wachsen. Die optische Linse 61 kann z. B. für eine mikrosko^¬ pische Abbildung der Zellen 2 konfiguriert sein.

Figur 30 zeigt eine weitere Ausführungsform der Erfindung, bei der die Kryokonservierungsvorrichtung 100 eine Röhrchen- anordnung mit externer Druckerzeugung (hydrostatisch, siehe Pfeil) über ein T-Element umfasst. Die Röhrchenanordnung ist mit einem Drucksensor 16.1 und einem Temperatursensor 16.2 ausgestattet, mit deren Sensorsignalen sowohl die Druck- als auch die Temperatur-Zeitfunktionen regelbar sind.

Die Figuren 31 und 32 zeigen Ausführungsformen der Kryokon- servierungsvorrichtung 100, bei denen die Behälterwand 11 des Druckbehälters 10 die Gestalt einer Kugel aufweist. Der

Druckbehälter 10 ist aus zwei Halbkugeln 11.2 zusammengesetzt, die in der Mitte des Druckbehälters 10 miteinander verschraubt sind. Die Kugel besitzt einen Durchmesser im Bereich von z. B. 5 mm bis 10 cm. Gemäß Figur 31A ist der

Druckbehälter 10 mit einer Druckschraube 21 ausgestattet, die zur Befüllung des Druckbehälters 10, Entlüftung des Druckbehälters 10 und Erzeugung des Druckes im Innenraum des Druck^¬ behälters 10 verwendet wird. Figur 31B illustriert zusätzlich optional vorgesehene Teile, wie eine Sensoreinrichtung 16 und eine vom Druckbehälter 10 entkoppelbare Füll-Leitung 11.1. Die Figuren 31C und 31D illustrieren analog zu den oben beschriebenen Verfahren die Abkühlung und Erwärmung der Kryo- konservierungsvorrichtung 100.

Der kugelförmige Druckbehälter 10 kann alternativ oder zusätzlich mit einem Druckeinstellelement in Gestalt eines Ex^¬ pansionsbereichs 22 ausgestattet sein (Figur 32) . Der Expansionsbereich 22 umfasst einen Zylinderstutzen, der wie oben beschrieben zur Aufnahme eines Expansionsmediums und zur Dru^¬ ckerzeugung bei Abkühlung konfiguriert ist. Die Figuren 32C und 32D illustrieren analog zu den oben beschriebenen Verfah^¬ ren die Abkühlung und Erwärmung der Kryokonservierungsvor- richtung 100. Die erfindungsgemäße Kryokonservierung biologischer Proben, die Organe 4 oder ganze Organismen 5 umfassen, ist schematisch in den Figuren 33 bis 35 illustriert. Insbesondere bei diesen Anwendungen der Erfindung ist die biologische Probe vorzugsweise mit der Stabilisatorsubstanz versetzt. Gemäß Fi^¬ gur 33A ist als Druckbehälter 10 ein zylindrisches Gefäß vorgesehen, das beim dargestellten Beispiel für die Aufnahme eines Fischembryos dimensioniert ist. In den Figuren 33C und 33D sind zwei Tauchyarianten zur Druck-Temperatur-Steuerung beim Einfrieren der Kryokonservierungsvorrichtung 100 illustriert. Gemäß den Figuren 34A und 34B ist entsprechend als Druckbehälter 10 ein kugelförmiges Gefäß gezeigt, das für die Aufnahme eines Organs 4, mit einem Innendurchmesser des

Druckbehälters 10 im Bereich von z. B. 10 cm bis 30 cm, di- mensioniert ist. Gemäß Figur 34B ist das Organ 4 in einem Innenbehälter 13 angeordnet. Figur 35 zeigt als Druckbehälter 10 ein kugelförmiges Gefäß, in dem sich Gewebe, Organismen 5 oder Organe in einem Innenbehälter 13, z. B. einem Beutel oder einem dünnwandigen Gefäß, befinden, so dass die Außenlö- sung zum Beutelinnenmedium verschieden gewählt werden kann (z. B. außen Öl, innen Nährlösung mit der Stabilisatorsubstanz) .

Figur 36 zeigt eine Ausführungsform der Kryokonservierungs- Vorrichtung 100, bei der Druck nicht durch die Expansion ei^¬ nes gefrierenden Expansionsmedium, sondern durch ein dampfförmiges Expansionsmedium, z. B. verdampfenden flüssigen Stickstoff gebildet wird. Der Expansionsbereich 22, der den flüssigen Stickstoff enthält, ist über eine Druckleitung 39 mit dem Druckbehälter 10 verbunden. Der verdampfende flüssige Stickstoff wird kontinuierlich oder in Portionen vom Expansionsbereich 22 in den Druckbehälter 10 injiziert. Die Figuren 37 bis 39 zeigen Ausführungsformen der Kryokon- servierungsvorrichtung 100, die durch die Bereitstellung mindestens eines Substrats 14 im Innenraum 12 des Druckbehälters 10 für die Kryokonservierung adhärenter Zellen 2 konfiguriert sind. Gemäß den in den Figuren 37A bis 37C gezeigten Varianten befindet sich das Substrat 14 in Gestalt eines langgestreckten Streifens (Zunge) in einem rohrförmigen Druckbehälter 10, der ein- oder beidseitig mit einer Druckschraube 21 und/oder mit einer radial abstehenden Druckschraube 21 ver- schlössen ist. Die Zellen 2 befinden sich im adhärentem Zustand ein- oder beidseitig auf dem Substrat 14, das in geeigneter Weise funktionalisiert sein kann (z. B. durch eine Be- schichtung mit Fibronektin, Polylysin und/oder Wachstumsfaktoren) . Im übrigen ist der Innenraum 12 des Druckbehälters 10 mit dem Konservierungsmedium, ggf. mit der Stabilisatorsubstanz gefüllt.

Figur 37C zeigt zusätzlich ein Substanzreservoir 17, das im Innenraum 12 des Druckbehälters 10 angeordnet ist. Das Sub- Stanzreservoir 17 ist für eine Einführung von mindestens einer Zusatzsubstanz in den Innenraum 12 eingerichtet. Beispielsweise können aus dem Substanzreservoir 17 während des Gefrier- oder Auftauverfahrens Substanzen in den Innenraum 12 diffundieren. Das Substanzreservoir 17 kann eine unter der Wirkung des Druckes im Innenraum 12 zerstörbare Reservoirwand, z. B. aus einem Kunststoff aufweisen. Vorteilhafterweise ermöglicht dies, dass die Zusatzsubstanz erst bei Erreichen eines bestimmten Druckes im Innenraum 12 freigesetzt wird .

Anstelle des langgestreckten Streifens sind kompliziertere Formen des Substrats 14 verwendbar, wie beispielhaft in Figur 38 gezeigt ist. Gemäß Figur 38A ist ein Substrat 14 mit einem kreuzförmigen Querschnitt illustriert, wobei vorgesehen sein kann, dass Zellen 2 auf allen oder nur einigen Flächen des Substrats 14 angeordnet sind. Gemäß Figur 38B ist ein Sub^¬ strat 14 in Gestalt eines Hohlzylinders gezeigt, in dessen Inneren sich die Zellen 2 befinden. Der Hohlzylinder kann aus z. B. aus Keramik, Kunststoff, Zellulose oder Chitin mit ei^¬ ner extrem geringen Wanddicke, insbesondere geringer als 250 μπι, hergestellt sein. Vorteilhafterweise ermöglicht dies wie die Verwendung der oben beschriebenen Innenbehälter, dass die Zellen 2 im Inneren anderen Randbedingungen und Lösungen ausgesetzt werden als außerhalb des Substrats 14. Gemäß wei^¬ teren Varianten der Erfindung kann das Substrat 14 einen Körper mit einer nano- oder mikrostrukturierten Oberfläche um^¬ fassen, die optional mit Wachstums- oder Differenzierungsfaktoren in Gradienten ausgestattet sind.

Die Figuren 39A bis 39E zeigen beispielhaft, dass das Sub^¬ strat 14 als separate Komponente (Schiffchen) konfiguriert sein kann, die in den Druckbehälter einschiebbar ist. Die Schiffchen können insbesondere mit einer geschlossenen oder einer offenen Form gebildet sein.

Die Figuren 39A und 40 illustriert ferner eine Variante einer erfindungemäß vorgesehenen Stelleinrichtung zur Steuerung des Druckes im Druckbehälter 10. Als Druckeinstellelement ist bei dieser Variante an mindestens einem Ende des rohrförmigen Druckbehälters 10 ein Wickelabschnitt 31 vorgesehen. Durch ein Eindrehen des Wickelabschnitts 31 am gasfrei mit der biologischen Probe gefüllten Druckbehälter 10 kann in diesem vor der Temperaturabsenkung der Druck erhöht werden.

In Figur 40A ist ein rohrförmiger Druckbehälter 10 mit Wickelabschnitten 31 gezeigt. Im Innenraum 12 des Druckbehäl^¬ ters 10 befindet sich die biologische Probe 1 mit dem Konservierungsmedium 3. Das Konservierungsmedium 3, in dem sich Zellen 2 befinden, kann die Stabilisatorsubstanz in Form eines Gradienten (z. B. Ficoll oder Percoll verschiedener Konzentration und/oder Molekulargewichtes) enthalten. Gemäß Fi^¬ gur 40B können im Innenraum 12 zusätzlich Trennwände 18 vor- gesehen sein, die ein schnelles Vermischen der biologischen Probe 1 und z. B. einen Abbau des genannten Gradienten verhindern und eine Trennung der Zellen in Kompartimente erlauben. Optional können, wie in Figur 40C gezeigt ist, im Innen^¬ raum zusätzlich Substanzreservoire in Gestalt von Hohlkugeln 19 vorgesehen sein, die im Konservierungsmedium 3 suspendiert sind und eingerichtet sind, bei einem vorbestimmten Druck zerstört zu werden und ihren Inhalt freisetzen. So können zum Beispiel weitere Gefrierschutz- und Vitrifizierungssubstanzen oder Medien, die die Zellen beim Auftauen unterstützen, frei- gesetzt werden. In Figur 40D ist illustriert, dass im Druck^¬ behälter zwei nicht mischbare Lösungen übereinander geschich^¬ tet angeordnet sein können. In der ersten Lösung befinden sich die Zellen 2. Über das Gefrierverhalten der Lösungen lassen sich die Druckverhältnisse bei Temperaturänderung ein- stellen.

Figur 41 illustriert einen rohrförmigen Druckbehälter 10, der einseitig mit einer Druckschraube 21 und einseitig mit einem Wickelabschnitt 31 verschlossen ist. Im Innenraum befindet sich das Konservierungsmedium 3 in Form aufgeschichteter Lösungen (z. B. Ficoll als Gradient oder Überschichtungen ver^¬ schiedener Molekulargewichte, d. h. Lösungen mit unterschied^¬ licher Dichte) , wie sie bei der Dichtegradientenzentrifuga- tion von Zellen verwendet werden. Die Zellen 2 werden einsei- tig in den Gradienten gegeben (Figur 41A) . Der Druckbehälter 10 wird in senkrechter Form mit den Zellen 2 zentrifugiert , so dass sich verschiedene Zelltypen an den Dichtegrenzflächen sammeln (Figur 41B) . In dieser Anordnung erfolgt dann die Kryokonservierung . In den Figuren 42A und 42B ist eine weitere Ausführungsform der erfindungsgemäßen Kryokonservierungsvorrichtung 100 und deren Anwendung schematisch illustriert. Die Kryokonservie- rungsvorrichtung 100 umfasst einen einseitig mit einer Druckschraube 21 verschlossenen Druckbehälter 10, in dessen Innenraum 12 das Substrat 14 zur adhärenten Aufnahme biologischer Zellen 2 angeordnet ist. Die Druckschraube 21 ist des Weiteren mit einem Wärmeleitelement in Gestalt eines Kühldrahtes 38 ausgestattet, der druckdicht in die Druckschraube 21 integriert ist und sich vom Innenraum 12 bis in die Umgebung des Druckbehälters 10 erstreckt. Der Kühldraht 38 ist ein Me^¬ talldraht, z. B. aus Silber. Außerhalb des Druckbehälters 10 ist der Kühldraht 38 zu einem kompakten Bündel, z. B. in Form einer Spirale, eines Knäuels, eines Zylinder oder einer Kugel konzentriert. Beim Einfrieren kann der Kühldraht 38 zuerst in das Kühlbad 210, z. B. aus flüssigem Stickstoff getaucht werden, wodurch sich im Inneren des Rohres Eis nicht an der Behälterwand 11, sondern dem Kühldraht 38 bildet und zur Druck- erhöhung führt. Danach folgt das vollständige Eintauchen des Systems in das Kühlbad 210.

Die in der vorstehenden Beschreibung, den Zeichnungen und den Ansprüchen offenbarten Merkmale der Erfindung können einzeln oder auch in Kombination für die Verwirklichung der Erfindung in ihren verschiedenen Ausgestaltungen von Bedeutung sein.

Claims

ANSPRÜCHE 1. Kryokonservierungsvorrichtung (100), die zur Kryokonser^¬ vierung einer biologischen Probe (1) eingerichtet ist, umfassend :

- einen Druckbehälter (10) mit einer Behälterwand (11) und einem Innenraum (12) , der zur Aufnahme der biologischen Probe (1) eingerichtet ist, wobei

- der Druckbehälter (10) für eine Abkühlung mit einer Absen^¬ kung der Temperatur und einer Erhöhung des Druckes im Druckbehälter (10) und für die Kryokonservierung der biologischen Probe (1) konfiguriert ist,

- der Druckbehälter (10) mit einer Stelleinrichtung (20) ausgestattet ist, die mit der Behälterwand (11) verbunden ist und mindestens ein Druckeinstellelement (21 - 23, 31) und mindestens eines von mindestens einem Kühlelement (34) und mindestens einem Wärmeleitelement (35 - 38) umfasst, und - die Stelleinrichtung (20) für eine zeit- und/oder ortsabhängige Einstellung der Temperatur und des Druckes im Druck^¬ behälter (10) konfiguriert ist,

dadurch gekennzeichnet dass

- das Druckeinstellelement mindestens eines von einer Druck- schraube (21) in der Behälterwand (11), einem Expansionsbereich (22), der zur Aufnahme eines flüssigen oder gasförmigen Expansionsmediums eingerichtet ist und mit dem Innenraum (12) kommuniziert, und einer Druckklammer (23), die von außen auf die Behälterwand (11) wirkt, umfasst.

2. Kryokonservierungsvorrichtung gemäß Anspruch 1, bei der - das Druckeinstellelement einen Wickelabschnitt (31) um^¬ fasst, der auf ein Ende des Druckbehälters (10) wirkt.

3. Kryokonservierungsvorrichtung gemäß Anspruch 2, bei der

- der Expansionsbereich (22) mindestens eine Hohlleitung um- fasst, die vom Druckbehälter (10) absteht.

4. Kryokonservierungsvorrichtung gemäß Anspruch 3, bei der

- die mindestens eine Hohlleitung Verzweigungen aufweist und/oder in verschiedenen Raumrichtungen vom Druckbehälter (10) absteht.

5. Kryokonservierungsvorrichtung gemäß einem der vorherge- henden Ansprüche, bei der

- das Kühlelement eine Kühlleitung (34) umfasst, die im Druckbehälter (10) angeordnet ist.

6. Kryokonservierungsvorrichtung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei der

- das Wärmeleitelement (35 - 38) mindestens eines von einem Profil auf einer Außenseite des Druckbehälters (10), einem Profil auf einer Innenseite des Druckbehälters (10) und Wärmeleitkörpern im Inneren des Druckbehälters (10) umfasst.

7. Kryokonservierungsvorrichtung gemäß einem der vorherge^¬ henden Ansprüche, bei der

- die Behälterwand (11) des Druckbehälters (10) die Gestalt eines Rohres, einer Kugel oder eines flachen Zylinders aufweist .

8. Kryokonservierungsvorrichtung gemäß Anspruch 7, bei der - die Behälterwand (11) des Druckbehälters (10) die Gestalt eines gekrümmten Rohres aufweist.

9. Kryokonservierungsvorrichtung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei der im Innenraum (12) des Druckbehälters (10) vorgesehen ist

- ein Innenbehälter (13), der zur Aufnahme der biologischen Probe (1) eingerichtet ist,

- ein Substrat (14), das zur adhärenten Aufnahme biologischer Zellen in der biologischen Probe (1) eingerichtet ist,

- eine Segmentierung des Innenraums (12) in Innenraumab- schnitte ( 15 ) ,

- eine Sensoreinrichtung (16) mit mindestens einem von einem Drucksensor (16.1) und einem Temperatursensor (16.2), und/oder

- ein Substanzreservoir (17, 19), das zur Freigabe einer Substanz in den Innenraum (12) eingerichtet ist.

10. Kryokonservierungsvorrichtung gemäß Anspruch 9, bei der

- das Substanzreservoir Hohlkugeln (19) aus einem druckempfindlichen Material umfasst, die im Innenraum (12) verteilt angeordnet sind.

11. Kryokonservierungsvorrichtung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei der

- die Behälterwand (11) eine Optikeinheit (60) enthält, die für eine optische Beobachtung des Innenraums (12) des Druck- behälters (10) eingerichtet ist.

12. Verfahren zur Kryokonservierung einer biologischen Probe (1), umfassend biologische Zellen (2) und ein Konservierungsmedium (3) , mit den Schritten:

- Bereitstellung der biologischen Probe (1) in einem Druckbehälter (10) mit einer Behälterwand (11) und einem Innenraum (12), und

- Abkühlung des Druckbehälters (10) in einer Kühlvorrichtung (200) mit einer Absenkung der Temperatur und einer Erhöhung des Druckes im Druckbehälter (10) , wobei die biologische Probe (1) zumindest teilweise in einen kryokonservierten Zustand in einer glasartige Phase überführt wird,

- der Druckbehälter (10) mit einer Stelleinrichtung (20) aus- gestattet ist, die mindestens ein Druckeinstellelement (21 -

23, 31) und mindestens eines von mindestens einem Kühlelement (34) und mindestens einem Wärmeleitelement (35 - 38) umfasst, und

- eine zeit- und/oder ortsabhängige Einstellung der Tempera- tur und des Druckes im Druckbehälter (10) unter Verwendung der Stelleinrichtung (20) vorgesehen ist

dadurch gekennzeichnet dass

- der Druck im Druckbehälter (10) unter Verwendung einer Druckschraube (21) in der Behälterwand (11), eines Expansi- onsbereiches (22), der zur Aufnahme eines flüssigen oder gasförmigen Expansionsmediums eingerichtet ist und mit dem Innenraum (12) kommuniziert, und/oder einer Druckklammer (23) , die von außen auf die Behälterwand (11) wirkt, eingestellt wird .

13. Verfahren gemäß Anspruch 12, bei dem die Einstellung der Temperatur und des Druckes im Druckbehälter (10) die Schritte umfasst :

- Erhöhung des Druckes im Druckbehälter (10) mit dem Druck- einstellelement (21 - 23, 31), und anschließend

- Absenkung der Temperatur im Druckbehälter (10) mit der Kühlvorrichtung .

14. Verfahren gemäß Anspruch 13, bei dem

- der Druck im Druckbehälter (10) unter Verwendung eines Wickelabschnitts (31), der auf ein Ende des Druckbehälters (10) wirkt, erhöht wird.

15. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 12 bis 14, bei dem - der Expansionsbereich (22) mindestens eine Hohlleitung um- fasst, die vom Druckbehälter (10) absteht, und

- der Druck im Druckbehälter (10) erhöht wird, indem zuerst die mindestens eine Hohlleitung und anschließend der übrige Druckbehälter (10) in ein Kühlbad (210, 220) der Kühlvorrichtung (200) getaucht wird.

16. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 12 bis 15, bei dem die Einstellung der Temperatur und des Druckes im Druckbehälter (10) die Schritte umfasst:

- Absenkung der Temperatur im Druckbehälter (10) mit der Kühlvorrichtung, und anschließend

- Erhöhung des Druckes im Druckbehälter (10) mit dem Druckeinstellelement (21 - 23, 31) .

17. Verfahren gemäß Anspruch 16, bei dem

- das Konservierungsmedium eine Stabilisatorsubstanz enthält, die geeignet ist, bei einer Erhöhung der Temperatur der biologischen Probe (1), vorzugsweise bis zu einem Übergang zu einem flüssigen Zustand, die glasartige Phase der unterkühlten Schmelze zu stabilisieren.

18. Verfahren gemäß Anspruch 16 oder 17, bei dem die Stabilisatorsubstanz aus mindestens einer der Substanzgruppen aus- gewählt ist, die umfassen:

- langkettige ungeladene Polymere mit einem Molekulargewicht größer als 500 g/mol, insbesondere größer als 1000 g/mol,

- Monosaccharide,

- Ethylenglykol ,

- Di- und Oligosaccharide,

- Polysaccharide,

- Stärke-Derivate, wie z. B. Stärke-Hydrolyse-Produkte,

- Zuckeralkohole,

- wasserlösliche Polymere - Kolloide (Nanopartikeldispersionen) , insbesondere mit Silber-, Gold, Diamant- und/oder Nanotube-Partikeln,

- Dendrimere,

- Polykationen, und

- Polyanionen.

19. Verfahren gemäß Anspruch 18, bei dem die Stabilisator- Substanz von mindestens einer der Substanzen ausgewählt ist, die umfassen:

- Saccharose-Epichlorhydrin-Copolymer (Ficoll, reg. Name), und

- mit Polyvinylpyrrolidon beschichtetes Kieselgel, wie z. B. Percoll (reg. Name) .

20. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 12 bis 19, bei dem

- die Stabilisatorsubstanz im Konservierungsmedium eine Konzentration aufweist, die geringer als 10 %, insbesondere geringer als 8 %, insbesondere geringer als 5 %, insbesondere geringer als 3 %, insbesondere geringer als 1 % ist.

21. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 12 bis 20, bei dem

- die Stabilisatorsubstanz im Konservierungsmedium (3) außerhalb der biologischen Zellen (2) angeordnet ist.

22. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 12 bis 21, bei dem

- die Kryokonservierungsvorrichtung (100) gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 verwendet wird.

23. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 12 bis 22, mit dem Schritt:

- Lagerung der biologischen Probe (1) unter Aufrechterhaltung des erhöhten Druckes.

24. Verfahren zur Vitalitätserhaltenden Erwärmung einer bio^¬ logischen Probe (1), umfassend biologische Zellen (1) und ein Konservierungsmedium (3) in einem gefrorenen Zustand, die in einer glasartigen Phase in einem Druckbehälter (10) angeord- net ist, wobei die Temperatur des Druckbehälters (10) und der biologischen Probe (1) erhöht und gleichzeitig im Druckbehälter (10) ein erhöhter Druck oberhalb des Atmosphärendrucks aufrecht erhalten wird.

25. Verfahren gemäß Anspruch 24, bei dem

- im Druckbehälter (10) der erhöhte Druck oberhalb des Atmosphärendrucks aufrecht erhalten wird, bis die biologische Probe (1) einen Übergang vom gefrorenen oder vitrifizierten zum flüssigen Zustand erreicht.

26. Verfahren gemäß Anspruch 25, bei dem

- beim Übergang vom gefrorenen oder vitrifizierten zum flüssigen Zustand der Druck im Druckbehälter (10) reduziert wird.

27. Verfahren gemäß Anspruch 26, bei dem

- beim Übergang vom gefrorenen oder vitrifizierten zum flüssigen Zustand der Druck im Druckbehälter (10) instantan reduziert wird. ^'

28. Verfahren gemäß Anspruch 26 oder 27, bei dem

- der Druck im Druckbehälter (10) durch eine Kontraktion der biologischen Probe (1) am Übergang vom gefrorenen oder vitri- fizierten zum flüssigen Zustand reduziert wird.

29. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 24 bis 28, bei dem

- der erhöhte Druck mindestens 100 MPa, insbesondere mindes^¬ tens 150 MPa und/oder höchstens 300 MPa, insbesondere höchstens 250 MPa beträgt.

30. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 24 bis 29, bei dem

- das Konservierungsmedium (3) eine Stabilisatorsubstanz enthält, die geeignet ist, bei der Erhöhung der Temperatur der biologischen Probe (1), vorzugsweise bis zu dem Übergang, die glasartige Phase der unterkühlten Schmelze zu stabilisieren.

31. Verwendung einer Stabilisatorsubstanz, die geeignet ist, bei der Erhöhung der Temperatur einer biologischen Probe (1), umfassend biologische Zellen und ein Konservierungsmedium, bis zu einem Übergang zum flüssigen Zustand eine glasartige Phase zu erhalten, bei der Kryokonservierung biologischer Proben ( 1 ) .